MXPA06013633A - Inactivacion de un patogeno en una muestra a traves de un tratamiento con formalina y luz ultravioleta. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para inactivar virus en una muestra tratando una muestra que contiene un virus con una concentracion efectiva de formalina y tratando la muestra con una dosis efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado.

Description

INACTIVACIÓN DE UN PATÓGENO EN UNA MUESTRA A TRAVÉS DE UN TRATAMIENTO CON FORMALINA Y LUZ ULTRAVIOLETA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para inactivar virus tratando una muestra que contiene virus con una concentración efectiva de formalina y tratando la muestra con una dosis efectiva de luz UV (ultravioleta) en un aparato de flujo pasado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inactivación efectiva de patógenos en productos médicos ha sido una preocupación de salud pública, ya que se descubrió que las enfermedades previamente desconocidas pueden ser diseminadas rápidamente a través de la administración de terapias. Por lo tanto, los productos biotecnológicos están viniendo bajo estándares altamente severos destinados a reducir el riesgo de transmitir a agentes a través de su uso. Los contaminantes potenciales no sólo son un problema en la fabricación de productos de sangre, sino que también en la producción de vacunas de seguridad. Uno de los pasos más críticos en la producción de vacunas contra patógenos, en particular vacunas virales, es la inactivación viral. En el caso de inactivación del virus, la formalina es el agente de inactivación más frecuente utilizado en la fabricación de vacunas. El paso de inactivación con formalina ha sido validado con procedimientos analíticos establecidos. Sin embargo, la introducción de pruebas de control de calidad altamente severas, tales como pruebas de cultivo de célula de mamífero, Por ejemplo, la prueba de seguridad Vero ha demostrado evidencia de infección residual en algunos casos. En un esfuerzo para eliminar esta interrupción mecánica de infección residual de agregados y/o filtración se ha vuelto no exitosa. Como una alternativa al tratamiento con formalina, la inactivación mediante rallos ultravioleta, UV, se ha considerado para integrarse en procedimiento de fabricación. El uso de inactivación con irradiación ultravioleta para vacunas humanas se ha demostrado anteriormente. Milzer et al. (Am. J. Pub. Health (1954) 44:26-33 y Wolf et al. (JAMA (1956) 161:775-81) han reportado en resultados de ¡nmunogenicidad de estudios en seres humanos en donde utilizaron vacuna de poliomielitis inactivada con UV. El virus de la polio es un picornavirus no envuelto, con un genoma de ANR de estructura de cadena individual positivo en un segmento individual. Ya que el genoma viral es más susceptible a daño por UV que los antígenos de superficie viral, en el caso de proteínas de capsida de poli y virales, la inactivación con UV mostró tener poco efecto negativo en las características bioquímicas o inmunogenicidad del producto. Los objetivos para la inactivación mediante UV son principalmente ácidos nucleicos en contraste a proteínas que son activadas mediante formalina. Al combinar formalina e inactivación UV los científicos trataron de superar las limitaciones de la inactivación con UV o inactivación con formalina aislada, respectivamente, cuando se inactiva el virus de poli particularmente elástico. Ver, por ejemplo, Malean, et al., "Experiences in the Production of Poliovirus Vaccines, "Prog. Med. Virol., vol 1, pp. 122-164 (1958.) Las tecnologías de radiación UV tienen una amplia escala de aplicación en alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos e industria de bebidas, y agua para beber. La desinfección con UV es un procedimiento físico-químico, en donde los enlaces covalentes de las moléculas cíclicas de las bases de purina y pirimidina son interrumpidas a través de la energía de excitación de la radiación de longitud de onda UV, dañando los ácidos nucleicos y la información genética que codifican. Los microorganismos tales como bacterias y levadura, etc., así como virus que son expuestos a radiación UVC efectiva (100 a 280 nm) son inactivados en segundo. Consecuentemente, la desinfección exitosa depende de la dosis de irradiación equivalente de reducción. La dosis de irradiación microbicida media expresada en J/m2 se mide en la zona de irradiación utilizando un biodosímetro. Sin embargo, la activación con UV no sólo es adecuada para producir una vacuna segura y efectiva. Taylor et al. (J. Immunol. (1957) 79:265-75) describen la inactivación del virus de poliomielitis con una combinación de formalina y ultravioleta. Molner et al. (Am. J. Pub. Health (1958) 48:590-8) describen la formación de un nivel medible de anticuerpos en circulación en la sangre de sujetos vacunados con vacuna de poliomielitis inactivada con ultravioleta-formalina. Truffelli et al.

(Appl. Microbiol. (1967) 15.516-27) reportan la inactivación del Adenovirus y Tumorigenicidad del virus 40 de Simio en hamsters a través de un procedimiento de inactivación de tres etapas consistiendo de formalina, luz UV y ß-propiolactona. Miyamae (Microbiol. Immunol. (1986) 30:213-13) describe la preparación de inmunogenos del virus Sendai a través de un tratamiento con rayos ultravioleta y formalina. Ninguno de los conceptos descritos anteriormente a un ácido adoptado para uso general en la producción de vacunas, aunque hay una necesidad presente existente para la producción de vacunas seguras y eficaces a una escala industrial. Además, ninguno de los estudios citados empleo una prueba de seguridad para determinar la infección residual de los "virus inactivados" que es tan sensible como la prueba de seguridad de Vero utilizada en el estudio de la presente. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que una combinación de pasos de inactivación de formalina y UV puede ser utilizada para inactivar totalmente virus en una producción a granel de virus en un sistema de producción de alto volumen para la fabricación de virus inactivados para la preparación de vacunas a una escala industrial. Estos también han sido mostrados con una preparación viral concentrada de alta titulación como se utiliza en los ejemplos, en donde no se detecta ninguna actividad viral residual utilizando la prueba de cultivo de célula Vero muy sensible. Los inventores sorprendentemente también han demostrado que este método trabaja particularmente bien para virus en vueltos, tales como ortomixovirus, según comparados con los virus no envueltos, tales como el picornavirus de polio. Este descubrimiento tiene implicaciones importantes para la rápida producción de vacunas seguras, altamente inumogénicas para dar y cambiar rápidamente enfermedades virales tales como cepas de influenza interpandémicas y pandémicas BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar un método que permita una inactivación segura y altamente eficiente de un virus contenido en una muestra mientras se retiene una alta antigenicidad e inmunogenicidad del virus inactivado. En particular, el método de la presente invención utiliza un paso de inactivación de formalina junto con un paso de inactivación con UV, en un sistema de producción de alto volumen para producir una preparación viral a granel segura, de alto contenido de antígeno, para utilizarse en la fabricación de vacunas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la invención, el objeto se resuelve proporcionando un método para inactivar un virus contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (ii) someter la muestra con una dosis efectiva de luz ultravioleta, UV, en un aparato de flujo pasado, en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii) o viceversa. Preferiblemente, la velocidad de flujo de la muestra a través del aparato es de aproximadamente 50 litros por hora a aproximadamente 1000 litros por hora. En otro aspecto preferido del método para inactivar el virus que será inactivado es un virus envuelto o un virus de ARN envuelto respectivamente, y el virus envuelto o el virus de ARN envuelto, respectivamente, es totalmente inactivado. De acuerdo con otro aspectos, se proporciona un método para inactivar un virus contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (¡i) someter la muestra con una dosis efectiva de luz UV en una aparato de flujo pasado, que comprende una lámpara UV y una cámara de capa delgada en el aparato que es sustancialmente perpendicular al diámetro de la lámpara UV en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii), o viceversa, en donde la muestra se hace pasar a través de la cámara de capa delgada del aparato en el paso (ii). En una modalidad preferida de la invención, la muestra es tratada con una dosis efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado después de que ha sido tratada con una concentración efectiva de formalina. Aunque los inventores no están unidos por ninguna teoría, se piensa que los efectos de entrelazamiento de la formalina sobre las moléculas de superficie del virion estabiliza el virus para los rigores de la dinámica de fluido de alto volumen del aparato de flujo pasado de inactivación con UV.

El método para inactivar, de acuerdo con la invención, es efectivo y seguro como ha sido demostrado en el ejemplo 2 y 4 (A).

Además, el método para inactivar permite la producción de vacuna con alta antigenicidad e inmunogenicidad que producen una respuesta inmune protectora como se muestra en el ejemplo 4 (B). El término "muestra" como se utiliza aquí, incluye cualquier muestra que contiene un patógeno o una parte del mismo tal como cualquier fluido, tal como fluidos biológicos o soluciones que se originan de un procedimiento de cultivo de célula para preparar productos biológicos, médicos o farmacéuticos, tales como productos o vacunas de sangre. Puede ser una muestra que comprenda un fluido biológico, tal como sangre o plasma. También puede ser un fluido que contenga componentes cosechados de un cultivo de célula (por ejemplo, una fracción de medios de célula o cultivo, del cultivo). En una modalidad preferida, la muestra es un fluido utilizado en la fabricación de un agente terapéutico, por ejemplo, en la producción de una vacuna, en donde el virus inactivado o una porción del mismo es el agente terapéutico. En modalidades particularmente preferidas, los componentes de células son separados de la muestra antes del método de inactivación, por ejemplo, a través de filtración o centrifugación. En una modalidad preferida de la presente invención, el virus es producido a partir de una cosecha de un cultivo de célula, que consiste del sobrenadante y la célula, que además se utiliza para la preparación de un producto médico, por ejemplo, una vacuna. En una modalidad, más de la presente invención, las células de dicho cultivo de célula han sido infectadas con el patógeno. Las células pueden ser células primarias o cualquier línea de célula cultivada adecuada para la producción del virus. Ejemplos de células que pueden ser utilizadas incluyen células de mamífero (por ejemplo, células CHO, BHK, VERO, HELA), células de aves (por ejemplo, fibroblasto de embrión de pollo, o líneas de células continuas de un ave) y células de insecto (por ejemplo, células Sf9). En modalidades preferidas de la invención, las células y el desperdicio de células de la producción de cultivo de célula del volumen viral se separan del volumen viral antes del paso de inactivación química (formalina) y/o el paso de inactivación con irradiación UV. En la presente invención, los virus que serán ¡nactivados son virus de ADN o ARN envueltos o no envueltos, con genomas de estructura de cadena individual o doble (ADN), de sentido o antisentido, continuos o segmentados. Los virus pueden ser seleccionados del grupo que consiste de baculovirus, poxvirus, adenovirus, papovavirus, parvovirus, hepadnavirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, astrovirus, picornavirus, retrovirus, ortomixovirus, filovirus, paramixovirus, rabdovirus, arenavirus, y buniavirus. En modalidades preferidas de la invención, los virus se seleccionan del grupo de virus envueltos, que incluye flavívirus, togavirus, retrovirus, coronavirus, filovirus, rabdovirus, buniavirus, ortomixovirus, paramixovirus, arenavirus, hepadnavirus, herpesvirus, y poxvirus. Como se demuestra en los ejemplos 6 y 7, los métodos de inactivación de la invención son particularmente efectivos en virus envueltos tales como virus de influenza y de Ross River según comparados con los adenovirus y virus de polio no envuelto. En otras modalidades preferidas de la invención, los virus se seleccionan del grupo de virus de ARN envueltos, incluyendo flavivirus, togavirus, retrovirus, coronavirus, filovirus, rabdovirus, buniavirus, ortomixovirus, paramixovirus, y arenavirus. En una modalidad particularmente preferida, el virus se selecciona de ortomixovirus, por ejemplo, una sepa de virus de influenza: las sepas de virus de influenza pueden tener combinaciones variables de proteínas de superficie, hemaglutianina y neuraminidasa. En otro ejemplo particularmente preferido, el virus se selecciona de los togavirus, por ejemplo, un alfavirus tal como el virus de Ross River (RRV). Otro grupo preferido de virus para utilizarse como la solución viral a granel son los coronavirus, incluyendo los virus asociados con Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS). Otro grupo de virus preferidos son los flavivirus, que incluyen Encefalitis Japonesa, encefalitis de tifoidea transmitida por garrapata (TBE), virus de fiebre de Dengue, virus de fiebre amarilla, y virus de fiebre hemorrágica. Otro grupo preferido de virus son los poxvirus, incluyendo los ortopoxvirus (tales como virus de vacuna o de Ankara de vacuna modificada), y avipoxvirus. Las partes de un patógeno viral inactivado también están abarcadas por la presente invención. En una modalidad preferida de la presente invención, dichas partes pueden servir como un epítopo en una en un inmunógeno. Este epítopo puede ser utilizado para producir una respuesta inmune contra el patógeno. En una modalidad preferida de la presente invención, las partes de un patógeno se utilizan como una vacuna contra el patógeno. En una modalidad especialmente preferida, dichas partes de un patógeno son viriones de división, los cuales pueden ser inactivados antes o después de ser divididos. Dentro del significado de la presente invención, el método para inactivar de acuerdo con la invención se considera seguro, o totalmente inactivado, cuando el virus inactivado producido utilizando el método pasa una prueba de cultivo de célula de mamífero, por ejemplo, la prueba de seguridad descrita con detalle en el ejemplo 2. Como se demuestra, estas pruebas son más sensibles que las otras pruebas utilizadas, por ejemplo, la prueba del huevo. Los criterios de paso/falla preferidos de la prueba de seguridad se detallan en los ejemplos 1 y 2. En una modalidad preferida de la presente invención, la reducción de titulación del virus debido a la inactivación del virus en la muestra es por lo menos aproximadamente 1 x 105, en una modalidad más preferida, por lo menos 1 x 107, en una modalidad muy preferida por lo menos aproximadamente 1 x 1010, y en una modalidad muy preferida por lo menos aproximadamente 1 x 1014. En una modalidad preferida de la presente invención, la muestra se trata con una concentración efectiva de formalina durante aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas. En modalidades muy preferidas, la muestra es tratada con una concentración efectiva de formalina durante 24 horas a aproximadamente 48 horas, y muy preferiblemente de aproximadamente 24 a aproximadamente 30 horas. En una modalidad especialmente preferida de la presente invención, la muestra es tratada con una concentración efectiva de formalina durante aproximadamente 24 a aproximadamente 24.5 horas. En una modalidad más, el paso de tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina se realiza de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 °C. En una modalidad especialmente preferida de la presente invención, el paso de tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina se realiza a aproximadamente 32 °C. Una modalidad preferida de la presente invención incluye el tratamiento de la muestra con una concentración efectiva de formalina, en donde la concentración efectiva de formalina varía preferiblemente de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 1% (p/p), de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.1%, muy preferiblemente alrededor de entre 0.025% y 0.1%, que corresponde a aproximadamente 92 mg/l y aproximadamente 368 mg/l de formalina, respectivamente, cuando se utiliza una solución de formalina al 37% para ajustar la concentración efectiva. En la presente solicitud, el término "luz UV" significa radiación ultravioleta que tiene una longitud de onda de 100 a 400 nm. La luz UV se puede seleccionar del grupo que consiste de UVC (100a 280 nm), UVB(280 a 320 nm), y UVA (320 A 400 nm). Los agentes de fotosensibilizacíón como aquellos que se intercalan en el ADN y son activados por luz UV, por ejemplo, psoralenos, se pueden utilizar para mejorar el efecto de inactivación de la radiación UV. En una modalidad preferida de la presente invención la luz UV es UVC que tiene una longitud de onda de aproximadamente 100 a aproximadamente 280 nm. En una modalidad muy preferida de la presente invención, la luz UV tiene una longitud de onda de aproximadamente 240 a aproximadamente 290 nm. En una modalidad especialmente preferida de la presente invención, alrededor del 85% o más de la luz UV tiene una longitud de onda de aproximadamente 254 nm. La emisión de luz UV puede ser una forma continua de emisión de luz UV, por ejemplo, tecnología de lámpara de mercurio, o luz UV pulsada, por ejemplo, tecnología de láser monocromático. La intensidad UV deseada puede ser generada combinando dos o más lámparas. En una modalidad preferida, la luz UV es emitida continuamente a través de una lámpara de aproximadamente 110 W. En una modalidad preferida, ilustrada en los ejemplos, la lámpara UV tiene una longitud de aproximadamente un metro, como la lámpara utilizada en los ejemplos (950 nm). La materia objeto de la invención abarca cualquier dosis efectiva de luz UV, es decir, cualquier dosis de luz UV que inactive con seguridad un virus dado cuando se combine con un tratamiento con formalina como se describe anteriormente. La dosis efectiva puede depender de una variedad de factores que generalmente son conocidos en el campo, por ejemplo, los parámetros físicos de las cámaras de inactivación UV tales como tamaño y diámetro de la lámpara y la cámara, distancia entre el medio que contiene el virus y la fuente de luz UV, la absorción de luz y propiedades de reflexión del material de la cámara. A través de la misma señal, la longitud de onda y la intensidad de la luz UVC así como el tiempo de contacto en el que el virus queda expuesto a la luz UV también es crítica para la dosis efectiva. Además, la dosis efectiva también se ve influenciada por el mismo virus, El medio que contiene el virus y sus propiedades de absorción de luz. De preferencia, la dosis efectiva es suficiente para aniquilar por lo menos 99.99% del virus contenido en la muestra. Muy preferiblemente inactivar el virus en una nivel en donde no se detecte ningún virus activo en una prueba de cultivo de célula de mamífero, preferiblemente la prueba de acuerdo con el ejemplo 2, o totalmente inactivado. En una modalidad preferida, que utiliza luz UVC una muestra que contiene el virus es expuesta a una dosis efectiva que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mJ/cm2. En una modalidad preferida, la dosis efectiva está en la escala de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mJ/cm2, y en otras modalidades preferidas, la dosis efectiva está en la escala de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 mJ/cm2. Como una comparación, la dosis efectiva para aniquilar un 99.99% de los patógenos presentes en agua para beber es de aproximadamente = 40 mJ/cm2. En una modalidad preferida, la dosis efectiva reduce una titulación de virus inicial por 1 por 105. En la activación de vacuna a granel, la dosis efectiva debe ser suficiente para eliminar cualquier virus vivo residual, que pueda estar presente después del paso de inactivación química inicial (formalina). Como se ilustra en los ejemplos, esto se puede determinar a través de prueba de infección de cultivo de células de mamífero muy sensibles, tales como la prueba de cultivo de célula Vero, ya descrita. Otras modalidades preferidas de la invención y en particular de la cámara de luz UV se proporcionan en los ejemplos. En otra modalidad preferida de la presente invención, el tiempo de contacto de la muestra con la luz UV está en escala de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 segundos, de preferencia de aproximadamente 1.4 a aproximadamente 14 segundos. El tiempo de contacto de preferencia se calcula basándose en una muestra que tiene un espesor de aproximadamente 1 mm a lo largo de la tangente hacia la fuente de luz, y el vatiaje de la lámpara UV es de aproximadamente 110 W. Como un experto en la técnica apreciará, las profundidades de muestra más gruesas y la fuente de luz de menor energía (vatiaje) podrían incrementar el tiempo de exposición, y viceversa. En una modalidad muy preferida de la presente invención, el tiempo de contacto de la muestra con la luz UV es de aproximadamente 1.4 a aproximadamente 7 segundos, y en una modalidad especialmente preferida de la presente invención, el tiempo de contacto de la muestra con la luz UV es de aproximadamente 2.8 a aproximadamente 4.2 segundos. Con el fin de probar si una determinación dada del método de acuerdo con la invención que emplea una dosis de luz UV dada efectivamente inactiva un patógeno de acuerdo con la invención, se debe probar el virus inactivado para actividad viral residual. Esto se puede lograr utilizando una prueba de cultivo de célula de mamífero, por ejemplo, la prueba de seguridad Vero preferiblemente aplicando los criterios detallados en los ejemplos 1 y 2. De acuerdo con la presente invención, el tratamiento de la muestra con una dosis efectiva de luz UV se realiza en un aparato de flujo pasado, de preferencia como se especifica en el Cuadro 1 y Figura 1. En una modalidad preferida de la presente invención, el aparato de flujo pasado contiene una cámara de capa delgada, El espesor mínimo de la cámara debe permitir un flujo suficiente de la solución viral a granel para permitir el procesamiento rápido razonable, y para prevenir la interrupción del virus para vacunas de virus inactivadas enteras. De esta manera, preferiblemente, la capa delgada tiene un espesor de por lo menos aproximadamente 0.1 mm para la producción del virus inactivado entero. También, debido a la absorbancia de la radiación UV a través de la solución viral a granel, y la necesidad de asegurar una suficiente irradiación de todos los virus en la solución, el espesor máximo no debe permitir que ningún virion pase a través del aparato sin ser suficientemente irradiado. De esta manera, la capa delgada no debe ser más gruesa que aproximadamente 1 cm. La capa delgada de preferencia tiene un espesor de 0.5 mm a 3 mm, y muy preferiblemente alrededor de 1 mm, de manera que la distancia máxima entre la lámpara UV y el patógeno que será inactivado es menor que aproximadamente 1 mm. Alternativamente, la muestra puede hacerse pasar a través de la lámpara paralela a la longitud de la lámpara, de manera que la muestra es irradiada desde el diámetro externo, En lugar del diámetro interno, de la cámara de muestra. Similarmente, una lámpara dentro de una cámara de muestra dentro de una lámpara (o círculo de lámpara) se puede utilizar como una configuración, irradiando la cámara de muestra a partir tanto de los diámetros internos como externos. Además, la cámara de preferencia se diseña de manera que el flujo de la muestra a través de la cámara no es estrictamente laminar, sin que más bien es turbio. Esto ayudará al mezclado del virus a través del medio de muestra, asegurando una exposición uniforme a la radiación UV. En otra modalidad preferida de la presente invención, el aparato de flujo pasado contiene una cámara de inactivación UV, en donde la lámpara UV tiene un diámetro de aproximadamente 30 mm y la cámara que rodea la lámpara UV a través de la cual la muestra fluye tiene un diámetro de aproximadamente 32 mm. En una modalidad preferida de la presente invención, la cámara tiene un volumen total de aproximadamente 92 ml. La muestra que será irradiada puede hacerse pasar a través del aparato. En una modalidad preferida, la muestra es enfriada mientras pasa en la cámara de irradiación UV. En una modalidad más de la presente invención, la muestra que pasa en la cámara de irradiación UV tiene una temperatura de aproximadamente 2 a aproximadamente 32°C, muy preferiblemente de alrededor de 2 a 8°C. De preferencia, la velocidad de flujo de la muestra en el aparato de flujo pasado está en la escala de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 litros por hora, más preferiblemente alrededor de 230 a 480 litros. En una modalidad especialmente preferida, la velocidad de flujo de la muestra en el aparato de flujo está en la escala de aproximadamente 230 a aproximadamente 250 litros por hora, muy preferiblemente alrededor de 240 litros por hora. Estas velocidades de flujo preferidas, ilustradas en los ejemplos, permiten el procesamiento de UV a gran escala económico de la solución viral a granel. En una modalidad preferida, el tiempo de contacto depende de la longitud de la cámara de muestra en donde la muestra es expuesta a la radiación UV, y la velocidad de flujo de la muestra a través de la cámara. De esta manera, la dosis efectiva que simplemente puede ser ajustada incrementando el número de lámparas UV dispuestas en el aparato de flujo pasado, incrementando la longitud efectiva de la cámara de muestra expuesta a la radicación UV. Alternativamente, al utilizar un mismo número de cámaras de lámpara más grandes se incrementará la dosis efectiva, como así al utilizar un número mayor de cámaras de lámpara más pequeñas que puede ser equivalente a la misma dosis efectiva.

En una modalidad adicional preferida de la presente invención, el paso de someter la muestra a una dosis efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado se repite en una forma cíclica o en serie. Se puede repetir durante 2 a aproximadamente 10 veces. En una modalidad preferida de la presente invención, el paso de someter la muestra a una dosis efectiva de luz UV en una aparato de flujo pasado se repite durante aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, y en una modalidad muy preferida de la presente invención se repite durante aproximadamente 2 a aproximadamente 3 veces. Un beneficio agregado para utilizar cámara de lámpara múltiples en flujo en serie o recirculado a través de la misma lámpara, es que la muestra puede ser concienzudamente mezclada entre las cámaras o ciclos para asegurar una exposición uniforme del virus a la radiación UV. Después de que el virus en la muestra ha sido inactivado, el virus inactivado entonces puede ser purificado para utilizarse en varias aplicaciones, incluyendo vacunas y otras composiciones farmacéuticas. De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el método de inactivación además comprende un paso de purificar el virus inactivado en la muestra a la pureza farmacéutica y formular el virus purificado a una composición farmacéutica para utilizarse como una vacuna. La purificación puede lograrse a través de medios conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, filtración o diafiltración, cromatografía (por ejemplo, exclusión de tamaño, intercambio de iones, inmunoafinidad, y similares), o centrifugación. Alternativamente, el virus puede ser purificado antes de la inactivación a través del los métodos de la invención. De acuerdo con otra modalidad preferida de la invención, el método de inactivación además comprende un paso de purificación, es decir la muestra es sometida a un paso de purificación para remover formalina residual en la muestra. Dicha purificación es útil si los niveles de formalina permanecen más altos que los niveles farmacéuticamente aceptables. El virus inactivado, después de pasos de purificación opcionales, entonces puede ser formulado a una composición farmacéutica. Las formulaciones opcionalmente pueden incluir vehículos (por ejemplo, salina fisiológica o reguladores de pH), excipientes, estabilizadores (por ejemplo, albúmina, sacáridos, y/o aminoácidos), sales, y/o auxiliares (por ejemplo, alumbre). Alternativamente, el virus inactivado además puede ser modificado para uso farmacéutico, por ejemplo, a través de encapsulación en liposomas. La presente invención se ilustrará más en lo siguientes ejemplos, sin ninguna limitación a los mismos. Habiendo descrito la invención con detalle, será evidente que son posibles modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención definido en las reivindicaciones anexas.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una cámara de capa delgada UV que se puede utilizar para el paso de inactivación con UV de la presente invención. La Figura 2 muestra un sistema de inactivación UV equipado con un sensor UV. El sensor UV y el medidor de flujos son aspectos opcionales. En una modalidad más de la presente invención, la bomba y/o el medidor de flujo pueden ser instalados en el tubo de salida. La Figura 3 muestra un sistema de inactivación UV que utiliza varias cámaras de capa delgada UV (reactor UV) conectadas entre sí para el sometimiento repetido de la muestra a una dosis efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado. El número de cámaras de capa delgada UV puede variar entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10. El sensor UV y el medidor de flujo son aspectos opcionales. En una modalidad adiciona de la presente invención, la bomba y/o el medidor de flujo pueden ser instalados en el tubo de salida. Un generador UV continuo con cámaras de inactivación conectadas en serie se puede utilizar en un procedimiento de fabricación a gran escala, permitiendo así la alta producción de una muestra.

EJEMPLOS Ejemplo : Principio de la prueba de seguridad de huevo estándar Se utilizó una prueba de seguridad de huevo estándar para probar la infectividad residual de sepas de influenza inactivadas. Un producto a granel monovalente, es decir, un antígeno de virus purificado después de centrifugación y ultra-diafiltración de gradiente de sacarosa, se inyectó en 10 huevos (0.2 ml/huevo). Después de incubar durante 3 días a 32°C, los huevos se cosecharon, se combinaron y se inyectaron de nuevo a 10 huevos (0.2 ml/huevo). Después de otro paso de incubación durante 3 días a 32°C, los huevo se cosecharon, se combinaron y se probaron para hemaglutinina (HA). La prueba de HA se basa en el hecho de que los virus de influenza puede unir eritrocitos utilizando su proteína de superficie, hemaglutinina. La prueba se realizó en una ambiente estéril. Una suspensión de virus de influenza con una titulación definida de HA sirvió como un control positivo y una solución de NaCI al 0.9% sirvió como un control negativo. Se proporcionaron 50 µl de una dilución 1:2 en NaCI al 0.9% de una muestra que será probada, en una cavidad de una placa de 96 cavidades. A cada cavidad, se agregaron 50 µl de una solución conteniendo eritrocito de pollo. Subsecuentemente, las placas se incubaron durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Después, la hemaglutinación se determinó visualmente, en donde, si cinco cavidades conteniendo la misma muestra no presentaron ninguna hemaglutinación, la muestra pasa la prueba HA.

Ejemplo 2: Principio de la prueba de seguridad Vero estándar La prueba de seguridad Vero estándar es una prueba de calidad altamente severa para la infectividad residual de sepas de influenza inactivadas. La prueba también es aplicable a otros virus. Un producto a granel monovalente, es decir, un antígeno de virus purificado después de centrifugación y ultra-diafiltración de gradiente de sacarosa, se agregó a 5 matraces Roux (4 ml/matras) después de incubar durante 7 días a 32°C en el medio de cultivo de Vero, los cultivos de celda se cosecharon, se combinaron y se agregaron a 5 matraces Roux (10 ml/matras). Después de otro paso de incubación durante 7 días a 32°C, los cultivos de célula se cosecharon, se combinaron y se probaron para hemaglutinina (HA) como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Inactivación con formalina El primer paso de inactivación con formalina se realizó en una cosecha de virus monovalente infeccioso, libre de célula, es decir, una cosecha de birreactor después de clarificación a través de centrifugación. Después de la recolección de 30 a 34°C, la cosecha de virus monovalente se trató con aproximadamente 0.9 a aproximadamente 1.1 U/ml de Benzonase de 30 a 34°C durante 4 a 8 horas. Después esto se trató con < 92 mg/l formalina durante 24 a 24.5 horas a 32 ± 2 horas.

Ejemplo 4: Experimento de inactivación con lámpara UV de 65 Vatios Se realizó un número de experimento de inactivación con virus inactivados con formalina utilizando una cámara de inactivación con una lámpara UV de 65 W y una cámara de capa delgada. Auque toda la inactivación de la cosecha del virus monovalente se pudo demostrar cuando se utilizaron velocidades de flujo de 100 por hora durante tres ciclos, esta determinación no permitió la medición en línea de la señal UV. El medio de cultivo de célula Vero utilizado para la producción de influenza contiene varios compuestos orgánicos que son responsables de la absorción de la señal UV. Por lo tanto, el sistema está equipado con una lámpara de 110 W permitiendo una verificación continua de la señal UV durante el tratamiento de cosecha del virus monovalente.

Ejemplo 5: Experimento de inactivación con un lámpara UV de 110 Vatios. Se utilizó una cosecha de Panamá de influenza monovalente tratada con formalina como un sustrato modelo para los estudios de inactivación. Para la inactivación continua con tecnología UV de capa delgada, se utilizó un sistema WEDECO VISA (Alemania) equipado con una lámpara VISA (110 W/4 V). La cámara de capa delgada UV es un dispositivo 1.4435 de acero inoxidable con un tubo de cuarzo con un diámetro de 30 mm (cf Cuadro 1). Un sensor UV calibrado permite el control en línea de la señal UV. La cámara de capa delgada UV se operó a una velocidad de flujo de 240 ± 10 litro por hora a temperatura ambiente. Las condiciones de velocidad de flujo de control a través de un medidor de flujo calibrado (cf. Figura 2). Cuadro 1 Características de la cámara de inactivación UV La cosecha monovalente se expuso a 10 ciclos UV, después de cada ciclos, se removieron 20 litros de la cosecha monovalente tratada con UV y además se purificaron a través de una purificación de gradiente de sacarosa utilizando condiciones de ultracentrifugación continuas con un gradiente de sacarosa al 42% extendido en 20 mM de regulador de pH Tris y una cosecha monovalente definida (PMVH) de 48% a 36% de sacarosa utilizando una centrífuga de Sorvall CC40 sin un pre-aclarador (Hitachi Kaki Co, LTD., Tokio, Japón).

Cuadro 2 Resumen de operaciones de ultracentrifugación de Panamá Influenza tratada con formalina y con UV.

(A) Rendimiento v pureza del antíqeno El rendimiento del antígeno y la pureza se compararon basándose en el contenido de hemaglutinina (HA), proteína total y proteína Vero (proteína de célula huésped). El virus purificado se comparó con base en la relación de HA/proteína, relación de proteína de célula huésped/HA y seguridad de virus (cf. Cuadro 3). Para todas las cosechas tratadas con UV, no se detectó ningún crecimiento viral. De lo contrario, el virus purificado derivado del procedimiento de inactivación con formalina estándar (sin radiación UV aplicada) pudo ser amplificado en el cultivo de célula Vero. Aunque una ligera reducción en la relación de HA/proteína se pudo ver después del ciclo 7 y 10, no se detectó ninguna diferencia importante del producto inactivado con formalina y doble con respecto a la pureza de antígeno medida como la relación de HA/proteína y proteína de célula huésped/HA.

Cuadro 3 Virus Panamá purificado con gradiente de sacarosa después del tratamiento con formalina y UV. Comparación de la relación HA/proteína, relación de proteína de célula huésped/HA y seguridad después de los ciclos de UV 0 a 10 Se realizaron otros estudios para caracterizar el efecto de la inactivación con UV sobre la antigenicidad e inmunogenicidad en cobayos y ratones a través de un análisis de inhibición de hemaglutinina (HAI).

(B) antiqenicidad La antigenicidad se utilizó a través del ensayo HAI contra antisueros específicos Panamá. Aunque el tiempo de contacto con UV incrementado dio como resultado una ligera pérdida de HA, no se mostró ningún efecto negativo para la titulación de HAI (cf. Cuadro 4).

Cuadro 4 Virus de Panamá purificado con gradiente de sacarosa después del tratamiento con formalina y UV. Comparación del antigenicidad basándose en la titulación HA y HAI con antisueros específicos Panamá después de 0 a 10 ciclos UV (C) Inmunogenicidad La inmunogenicidad se analizó inmunizando cobayos y ratones con diferentes con diferentes alícuotas de las Cosechas de Virus Monovalente Purificados seguido por un refuerzo tres semanas después de la primera inmunización. Los sueros de los animales inmunizados se recogieron y se combinaron después de tres y seis semanas y se analizaron a través de un ensayo HAI contra antígenos derivados de huevo y derivados de Vero. La inmunogenicidad se probó en cobayos y ratones después de tres y seis semanas dando resultados muy prometedores, sin ninguna diferencia importante para el virus inactivado doble contra el virus tratado con formalina estándar (cf. Cuadro 5).

Cuadro 5 Virus de Panamá purificado con gradiente de sacarosa después de tratamiento con formalina y UV (0 a 10 ciclos). Comparación de la inmunogenicidad probada en cobayos y ratones. A) después de tres semanas, B) después de 6 semanas. HAI con antígeno de influenza derivado de huevo y Vero. A B Los resultados resumidos en el Cuadro 4 y en el Cuadro 5 muestran que el tratamiento con UV no dio como resultado diferencias importantes en las titulaciones de HAI, demostrando que la antigenicidad y de esta manera la inmunogenicidad del producto no se ve afectada. En todos los experimentos de inactivación dobles, la seguridad total pudo ser demostrada aún después de un ciclo de tratamiento con UV. Las investigaciones detalladas en laboratorio y a escala final demostraron la efectividad del paso de irradiación con UV cuando se combinó con tratamiento con formalina. La caracterización inmunológica del antígeno del virus purificado después del tratamiento con UV produjo resultados comparables con aquellos que obtenidos con un producto no tratado sin UV. Ningún efecto negativo en las características bioquímicas ni en la inmunogenicidad del producto viral pudo ser detectado.

Ejemplo 6: Reducción de Titulación de virus con inactivación con formalina y/o UV La reducción de titulación de virus a través del tratamiento combinado de la muestra con una concentración efectiva de formalina y una concentración efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado se probó con diferentes virus. La inactivación con formalina se realizó a 32°C durante 24 horas con una concentración de formalina final de 0.0255 (p/v). La inactivación UV en el aparato de flujo pasado se realizó durante 3 ciclos a una velocidad de flujo de 240 l/hora. El tiempo de contacto de la muestra con la luz UV pro ciclo fue de 1.4 segundos.

Cuadro 6 Reducción de titulación de virus con inactivación con formalina y/o UV.

Los resultados muestran que a través de un tratamiento combinado con formalina y UV de los virus, se obtiene una reducción drástica de las titulaciones respectivas de los virus.

Ejemplo 7: Inactivación mediante UV de una vacuna candidata del virus de Ross River (RRV) El virus Ross River (RRV) es un alfavirus portado por mosquitos, el cual ocasiona una enfermedad en seres unamos conocidas como poliartritis epidémica (EPA). Los síntomas incluyen artritis, particularmente en las rodillas y en las articulaciones pequeñas de las manos y pies, por lo regular acompañada por fiebre, comezón y otros cambios constitucionales no específicos. Los síntomas de artritis comúnmente duran 30-40 semanas y 35% de los pacientes siguen teniendo síntomas residuales durante 1 año después del inicio. Es endémica en Australia, con más de 8000 casos cada año, y a través de la región del pacífico. En 1979/80 también ocurrieron epidemias de infección por virus Ross River en Fíji, Samoa, y las islas Cook y Nueva Celedonia. Actualmente no hay vacuna existente.

(A) Inoculación del RRV de Microportador Libre de Suero a Base de 1200 Litros de Cultivos de Fermentador de Célula Vero en Inactivación con Formalina. Se inocularon el cultivo de fermentador de 1200 litros de microportador a base de células Vero libre de suero con virus de producción Ross River. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 37°C. Las muestras se retiraron cada día para titulación. En el día 3, cuando el 100% de las células se destruyeron a través de CPE (efecto citopático) el virus se cosechó. Después de la separación del desperdicio de célula y microportadores de la cosecha de virus infeccioso y un primer paso de filtración (1.2 µm/0.2 µm), se agregó benzonasa para degradación de ácidos nucleicos (ADN/ARN). La inactivación de formalina se realizó con 0.1% (p/v) de formalina y una concentración de ocho días. Se realizaron un segundo y tercer paso de filtración después de dos horas y 24 horas, respectivamente. Se agregó benzonasa una segunda vez a 24 horas para la remoción de ácidos nucleicos residuales. Las muestras se retiraron para la titulación de virus = dosis infecciosa de cultivo de tejido 50 (TCID50/ml) en células Vero y prueba de seguridad en células C6-36 y células Vero de acuerdo con el Cuadro 7. Un día después de la inoculación de un fermentador de 1200 litros con RRV, se pudo demostrar una titulación de virus de log TCID50/ml de 5.8, la cual se incrementó al 7.8 (día 2), 8.1 (día 3 antes de la cosecha) y 8.0 después de la cosecha del virus. Después de la separación, la primera filtración y la adición de benzonasa, las titulaciones del virus cayeron a 7.5, 7.2, y 7.4, respectivamente. Después de la adición de formalina, las titulaciones se determinaron después de la remoción de la suspensión de formalina citotóxica a través de centrifugación y re-suspensión de la pella de virus (Cuadro 7, columna: TCID50/ml TL 100). Después de 15 minutos se agregó formalina a la cosecha de virus, las titulaciones cayeron dramáticamente a 1.6 12 h después de la inactivación con formalina, y no se demostró ninguna titulación de virus. Después de 24 horas del inicio de la inactivación con formalina, las muestras se presentaron en pruebas de seguridad en células C6-36 y células Vero. Mientras que después de 24 h y 26 h después de la inactivación, se pudieron demostrar muestras positivas 1 (CPE) y negativas 4 en células Vero, se obtuvieron muestras 4 positivas y 1 negativas con la línea de células C-6-36 mucho más sensible A partir del día 2 hacia delante, todas las muestras fueron negativas en células Vero La línea de células C6-36 siguió mostrando CPE con una muestra en los día 2 y 3, y 4 muestras negativas, respectivamente En los días 4 y 5, todas las muestras probaron ser negativas en células C6-36, pero en los días 6 y 7, una muestra otra vez mostró CPE Después del día 8, no más muestras positivas se pudieron mostrar ni en células Vero ni en células C6-36 Cuadro 7 Resultado de Seguridad de una Cosecha de Virus Ross Ríver de un Fermentador de 1200 Litros.

(B) Experimento de Transfección e Infección con ARN de RRV Los resultados de las pruebas de seguridad antes mencionadas desarrollaron sospechas de que el ARN de RRV genómico puede ser liberado durante el procedimiento de inactivación Esto a su vez puede conducir a la incorporación de ARN de RRV genómico en las células respectivas Aunque el tratamiento con benzonasa debe conducir a una completa degradación de ARN, la formación de liposoma u otros mecanismos como enmascaramiento de la ARN RRV genómico con desperdicio de proteína, puede explicar la estrategia de escape del ARN intacto Se aisló el ARN genómico de RRV de vipones purificados con gradientes A través de RT-PCR, se puedo determinar el número de equivalente de partículas. En un primer experimento (Cuadro 8, No. 1) se diluyeron equivalentes de partículas (ARN geonómicos) en pasos de 10 veces tanto en un medio de transfección (es decir, transfección) como en un medio regular (es decir, infección). Con ambas mezclas, se inocularon células C6-36 y células Vero. Después de un intercambio de medio, los cultivos de células se incubaron durante varios días. Las muestras de los sobre nadantes respectivos se utilizaron para de titulación de virus y determinación de HA. Los experimentos de infección con ARN genómico se realizaron varias veces (Cuadro 8, Nos. 1-5). Los experimentos de transfección mostraron resultados positivos en TCID50 tanto en células C6-36 como en células Vero. Los sobrenadantes de células Vero también exhibieron titulaciones HA. La infección de células Vero con un alto número de equivalentes de partículas (108) mostró una titulación de virus de 6, 8 log TCID50/ml y tuvo una titulación de HA de 128, pero falló para infectar células C6-36. Después del experimento de infección con ARN genómico con RRV (No. 4) dio como resultado tanto células C6-36 como células Vero infectadas, con titulaciones de 8.4 y 6.6 log TCID50/ml, respectivamente. Los intentos de infección 2, 3 y 5 no proporcionaron resultados positivos en células Vero. El intento de infección No. 3 proporcionó una titulación baja de 1.6 log TCID5o/ml en células C6-36. Aunque no todos los intentos infectan células con ARN genómico RRV mostraron resultados positivos, parece que el ARN genómico a altas concentraciones es capaz de infectar células aleatoriamente. Todos los experimentos que utilizaron un reactivo de transfección liposómico, mostraron resultados positivos. De esta manera, el enmascaramiento de proteína de mecanismo de formación de ARN o liposoma explicará las pruebas de seguridad positivas después de inactivación con formalina y degradación con benzonasa del ADN/ARN libre en el Cuadro 7.

NJ o C? Oí Cuadro 8 Experimento de Transfección e Infección con ARN de RRV PA: equivalentes de partículas infecciosas n.d.: no realizado (C) Inactivación mediante UV de RRV Infeccioso Para las condiciones antes mencionadas, se realizaron experimentos a pequeña escala para inactivar RRV mediante irradiación UV. Los sobrenadantes de RRV PV se irradiaron con UV durante diferentes cantidades de tiempo con dos intensidades de UV: 2.1 mW/cm2 (muestras 1-10) y 3.3 mW/cm2 (muestras 11-20). Subsecuentemente, estas muestras se sometieron a titulación de virus, titulación de antígeno (EIA) y la titulación de hemaglutinina se determinó. Las muestras, que se irradiaron durante más de 3 minutos (Nos. 6-10 y 14-19), también se sometieron a prueba de seguridad en célula C6-36 (Cuadro 9). Las titulaciones de virus cayeron después de 10 minutos de irradiación con UV de 7.4 log TCID50/ml (control, muestra #1) a 1.5 log TCID50/ml con ambas intensidades UV. La hemaglutinación permaneció estable durante 15 minutos a una intensidad de UV de 2.1 mW/cm2 con una titulación HA de 9, pero cayó a 8 a una intensidad de UV de 3.3 mW/cm2. Las titulaciones de antígenos (EIA) también permanecieron estables durante 15 minutos de irradiación, dentro de una escala de entre 640-1280. Las pruebas de seguridad, realizadas con muestras irradiadas durante 3 y 5 minutos a una intensidad UV de 2.1 mW/cm2 (número de muestra 6 y 7), también siguió mostrándose CPE en el cultivo de células y proporcionó titulaciones de virus de 8.2 y 8.6 log TCID50/ml, respectivamente. Las pruebas de seguridad, realizadas con muestras irradiadas durante 2, 3 y 5 minutos a la intensidad UV más alta de 3.3. mW/cm2 (número de muestra 6 y 7), siguió mostrándose CPE en el cultivo de célula y dio como resultado titulaciones de virus de 8.2, 8.6 y 8.7 log TCID5o/ml, respectivamente. Después de 10 minutos de irradiación, todas las pruebas de seguridad fueron negativas. La irradiación con UV a intensidades tanto de 2.1 mW/cm2 como 3.3 mW/cm2 durante más de 10 minutos inactivo completamente preparaciones de RRV. La antigenicidad, como se muestra en las Pruebas HA y EIA, permaneció sin cambio a ambas intensidades de irradiación durante 15 minutos. Después de 30 minutos, la antigenicidad se vio afectada.

NJ NJ n o n cn Cuadro 9 Inactivación Mediante UV Virus Infeccioso o (D) Inactivación Mediante UV de una Cosecha de Fermentador de 1200 Litros Inactivada con Formalina Una alícuota de una cosecha de virus de fermentador de 1200 litros tratada con formalina se irradió con UV con 3 ciclos a una velocidad de flujo de 300 l/h, 3 ciclos a 150 l/h y 3 ciclos a 75 l/h. Una segunda alícuota de una cosecha de virus de fermentador de 1200 litros tratada con formalina se irradió con UV con 10 ciclos a una velocidad de flujo de 300 l/h, pero este tiempo después de diafiltración, para remover altas concentraciones de pequeñas proteínas restantes. Se determinaron las titulaciones de HA, titulaciones de antígeno-ElA, titulaciones de virus y seguridad (CPE) después de cada operación (Cuadro 10). Las titulaciones de virus en el primer experimento (sin diafiltración) cayeron después de un ciclo de irradiación UV a una velocidad de flujo de 150 l/h de 6.13 log TCID50/ml por abajo del límite de detección. Las pruebas de seguridad tampoco mostraron nada de CPE. Sin embargo, después de 3 ciclos de irradiación UV a una velocidad de flujo de 150 l/h, las pruebas de seguridad en el cultivo de célula mostraron resultados positivos y también fueron positivas en titulación del virus. (6.7 log TCID50/ml). 3 ciclos de irradiación UV a una velocidad de flujo de 75 l/h permanecieron negativos en ambas pruebas de titulación de virus y seguridad. En el segundo experimento, las pruebas de seguridad y la titulación de virus permanecieron negativas después de 5 y más ciclos de irradiación. En el primer experimento, todas las dosis de irradiación no influenciaron las titulaciones de HA y EIA con 11 y 1:320, respectivamente. En un segundo experimento, todas las titulaciones HA y EIA fueron de 10 y 1:320, respectivamente, con la excepción de 6 ciclos de irradiación, que dieron como resultado una titulación EIA de 1:640. La doble inactivación de una cosecha de fermentador de RRV con formalina y cinco o más ciclos de irradiación UV a una velocidad de flujo de 300 l/h es suficiente para destruir completamente la infectividad sin dañar la antigenicidad.

Cuadro 10 Inactivación Mediante UV de una Cosecha de Fermentador de 1200 litros de RRV (E) Eficacia de Preparaciones Dobles de Vacuna Candidatos RRV sin Activadas Dosis Efectiva (EDRA Dosis Protectora (PDsn) y Titulaciones de ELISA en Ratones Inmunizados Una vacuna candidato RRV inactivada con formalina inactivada doblemente (formalina + irradiación UV) se ajustó a 10 µg por dosis, y después se diluyó en pasos de 4 veces. Cada dilución se sometió en un grupo de 10 ratones. Después de 3 semanas, los ratones fueron reforzados con la cantidad correspondiente de la vacuna. Se tomaron muestras de sangre en la semana 3, antes del refuerzo, y en la semana 6, 3 semanas después del refuerzo. Los sueros se analizaron a través de ELISA de anticuerpo RRV. La dosis efectiva 50 (ED50), esta es la dosis de antígeno que es suficiente para reducir la seroconversión en un 50% de los ratones inmunizados, después del cálculo. En la semana 3, entes del refuerzo, la ED50 del grupo inactivado con formalina fue de 635 ng y del grupo con la inactivación doble con formalina y UV, 202 ng. Después del refuerzo, los valores de ED50 fueron de 33 ng y 10 ng, respectivamente. El análisis de las titulaciones mediante ELISA, sin embargo, demostraron que el grupo con la doble inactivación tuvo titulaciones de anticuerpo aún mayores, por ejemplo, en la semana 3, 9 ratones con titulación ELISA de 1,000 contra 16 ratones con 1,000 en el grupo de inactivación doble, y ningún ratón con 10,000 en el grupo de formalina contra 4 ratones con 10,000 en el grupo de inactivación doble. Después del refuerzo, otra vez las titulaciones del grupo de inactivación doble fueron superiores: 8 ratones en el grupo de formalina comparado con 11 ratones en el grupo de inactivación doble con 100,000, y 4 ratones más con una titulación de ELISA de 1 millón en el grupo de inactivación doble (Cuadro 11). En la semana 6, 3 semanas después del refuerzo, los ratones fueron infectados intravenosamente con 106 TCID50/ml (dosis infecciosa de cultivo de tejido 50) de Virus Ross River vivo (sepa T48). En los días, 1, 2,3 y 4, se tomaron muestras de sangre p.i. y se determinó subsecuentemente la TCID50 del suero. La dosis protectora 50 (PD50), esta es la dosis de antígeno a la cual 50% de los ratones infectados no mostraron viremía, se calculó. La PD50 de 78 ng fue idéntica para ambas preparaciones de antígeno, la ¡nactivada con formalina así como la inactivada doble (formalina + irradiación con UV) del antígeno.

Cuadro 11 Dosis Efectivas (ED50), Dosis Protectora (PD50) y Titulaciones de ELISA en Ratones Inmunizados Titulación ELISA De la efectividad residual encontrada principalmente en la línea de célula C6-36 muy sensible después del tratamiento con formalina sola, muy probablemente ocasionada por ARN RRV infeccioso. La introducción de un segundo paso de inactivación de virus adicional (irradiación UV), afectando el genoma del virus después del tratamiento con formalina, dio como resultado preparaciones de vacunas que candidato RRV totalmente inactivadas y seguras sin afectar la inmunogenicidad y eficacia en un modelo de ratón.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para inactivar un virus contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (ii) someter la muestra con una dosis efectiva de luz UV, en un aparato de flujo pasado, en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii) o viceversa, en donde la velocidad de flujo de la muestra a través del aparato es de aproximadamente 50 litros por hora a aproximadamente 1000 litros por hora.

2. Un método para inactivar un virus envuelto contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (ii) someter la muestra con una dosis efectiva de luz UV, en un aparato de flujo pasado, en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii) o viceversa, en donde el virus envuelto está totalmente inactivado.

3. Un método para inactivar un virus ARN envuelto contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (ii) someter la muestra con una dosis efectiva de luz UV, en un aparato de flujo pasado, en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii) o viceversa, en donde el virus envuelto está totalmente inactivado.

4. Un método para inactivar un virus contenido en una muestra, que comprende los pasos de (i) tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina, y (ii) someter la muestra con una dosis efectiva de luz UV, en un aparato de flujo pasado, que comprende una lámpara UV y una cámara de capa delgada en el aparato que es sustancialmente perpendicular al diámetro de la lámpara UV, en donde el paso (i) se realiza antes del paso (ii) o viceversa, en donde la muestra se hace pasar a través de la cámara de capa delgada del aparato en el paso (ii).

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la reducción de titulación de virus debido a la inactivación del virus en la muestra es por lo menos aproximadamente 1 x 105, o por lo menos aproximadamente 1 x 107, o por lo menos aproximadamente 1 x 1010, o por lo menos aproximadamente 1 x 1014.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el paso de tratar la muestra con una concentración efectiva de formalina se realiza durante 12 a aproximadamente 96 horas.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la concentración efectiva de formalina es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1%

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la luz UV es UVC con una longitud de onda de aproximadamente 100 a aproximadamente 280 nm.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la dosis de luz UV es de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mJ/cm2.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tiempo de contacto de la muestra con la luz UV es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 segundos.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la velocidad de flujo en el aparato de flujo pasado es de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 litros por hora.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el aparato de flujo pasado contiene una cámara de capa delgada.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el flujo de la muestra a través de la cámara de capa delgada es turbio.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en donde la capa delgada de la cámara de capa delgada tiene un espesor de aproximadamente 1 mm.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el paso de someter la muestra a una dosis efectiva de luz UV en un aparato de flujo pasado se repite durante aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de fluidos biológicos o soluciones que se originan de un procedimiento de cultivo de célula para preparar productos biológicos, médicos o farmacéuticos.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende además el paso de someter la muestra a un paso de purificación para remover la formalina residual en la muestra.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende además purificar el virus inactivado en la muestra a una pureza farmacéutica, y formular el virus purificado a una composición farmacéutica para utilizarse como una vacuna.