TW201311896A - 製備病毒抗原及疫苗之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於醫藥工業領域且係關於製備源自被膜病毒之病毒抗原之方法，該方法包含以下步驟：提供包含被膜病毒之流體、澄清包含該被膜病毒之該流體、減少所獲得液體採集物之體積、使該被膜病毒增溶，及純化病毒抗原。本發明另外係關於該方法用於製備疫苗製劑之用途。

Description

製備病毒抗原及疫苗之方法
本發明屬於醫藥工業領域且係關於製備包含源自被膜病毒之病毒抗原之醫藥組合物之方法。
目前，用於製備諸如疫苗製劑或其中間體等醫藥組合物之病毒係在基於卵或基於細胞之培養系統中繁殖。獨立於所用各別系統，處理來自每一培養系統之病毒抗原係諸如疫苗製劑等醫藥組合物之製備中至關重要且關鍵之步驟。關於基於卵之系統，處理之主要要求係充分移除受精卵蛋白質(例如卵白蛋白)；且關於基於細胞之系統，處理必須滿足諸如顯著減少宿主細胞DNA及宿主細胞蛋白質等要求。此外，必須實質上清除非產物病毒。
對於病毒蛋白之純化，EP 1 982 727 A1揭示病毒膜蛋白之純化方法，其包含以下步驟：藉由沉降自培養基分離細胞、微載體及細胞聚結物，使該沉降物化學去活化且使該沉降物增溶，添加膽酸鈉，將混合物離心，藉由安柏萊特(Amberlite)處理減少清潔劑之量及實施親和層析，之後溶析靶蛋白。
US 2011/0014230 A1闡述製備疫苗抗原之方法，其尤其包含以下步驟：使經純化病毒粒子去活化，之後用清潔劑分裂該等病毒粒子。
US 2009/0060950 A1揭示產生病毒疫苗之方法，其包含以下步驟：在細胞中繁殖病毒，收集細胞上清液中之該病 毒，使該病毒去活化，藉由密度梯度超速離心純化該病毒及用清潔劑處理該病毒。
US 4,327,182揭示使用膜過濾技術製備經純化流行性感冒次單元疫苗之方法。
US 6,048,537係關於製備經純化流行性感冒抗原之方法，其包含濃縮、純化及片段化步驟。
其他涉及純化方法之文件係US 2010/0119552 A1；US 2010/0158944 A1；Kalbfuss等人，2007,Biotech&Bioeng.第96卷，第5冊，第932-944頁；Onions等人，2010,Biologicals，第38卷，第544-551頁；US 2008/0118970；WO 03/097797；Goerke等人，2005,Biotechnology and Bioengeneering，第91卷，第1冊，第12-21頁；Krober等人，Chem.Eng.Technology 2010，第33卷，第941-959頁；及WO 2010/052214 A2。
儘管有上述方法，但業內仍需要製備病毒抗原、尤其病毒抗原製劑且具體而言諸如疫苗等醫藥組合物之改良方法，且因此以其為目標。具體而言，業內需要一種製備方法，其以相對較低生產成本達成高產物回收率，其具有病毒株獨立性，且僅需要最少量之步驟，同時滿足宿主細胞DNA及蛋白質及外源因素含量低之嚴格要求。
本發明提供以下態樣、標的物及較佳實施例，其分別單獨或組合使用以有助於達成本發明之目標：(1)一種製備源自被膜病毒之病毒抗原之方法，其以所 示順序包含以下步驟：a)提供包含被膜病毒之流體，b)澄清包含該被膜病毒之該流體，從而獲得包含該被膜病毒之液體採集物，c)減少在步驟b)後獲得之該液體採集物之體積以獲得經濃縮液體採集物，d)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑或由其組成之清潔劑混合物添加至在步驟c)中獲得之該經濃縮液體採集物中來使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶，e)自在步驟d)後獲得之該組合物分離病毒核心，f)視情況自在步驟e)後獲得之該組合物移除陽離子型清潔劑，及g)純化病毒抗原，其中在步驟c)後直接進行步驟d)。
在較佳實施例中，在步驟e)之前不實施主要純化步驟，尤其不實施旨在純化被膜病毒之主要純化步驟，較佳不實施層析。在步驟e)後，實施主要純化步驟。在步驟e)後實施之此主要純化步驟旨在純化病毒抗原。其並非旨在分別純化完整病毒或完整病毒粒子。對於術語「主要純化步驟」(或分別「主要純化方法」)之定義，參見本文其他地方之定義。
在另一較佳實施例中，所實施之唯一層析步驟係在步驟g)中實施。
在另一較佳實施例中，在步驟e)之前不實施密度梯度離心(例如密度梯度超速離心，例如蔗糖梯度超速離心)。
在另一實施例中，可應用另一病毒去活化步驟(例如化學去活化步驟)及/或另一病毒清除步驟。然而，藉由實施本發明，很可能不需要使用該另一病毒去活化步驟及/或另一病毒清除步驟即可使任何病原體充分去活化及充分清除(即為了達成滿足各別法規之去活化及清除)。此係優點，此乃因省略該另一病毒去活化及/或另一病毒清除步驟進一步有助於在(例如)使期望病毒抗原所暴露之應力降至最低及/或縮短製程方面改良製程。然而，若實施另一病毒去活化步驟(例如化學去活化)及/或另一病毒清除步驟，則此步驟不在步驟c)及步驟d)之間進行：如其他地方所揭示，在步驟c)之後直接進行步驟d)尤其有助於提高病毒抗原之回收率。在另一態樣中，不在步驟e)之前實施該另一去活化及/或另一清除步驟。在另一實施例中，該另一去活化及/或另一清除步驟係在(例如)步驟g)之後實施。此外，若實施該另一病毒去活化步驟及/或另一病毒清除步驟，則獲得滿足法規之最終產物所需及所使用之化學物質之濃度低於傳統上獲得滿足法規之最終產物所需及所使用之化學物質之濃度。此在(例如)減少病毒抗原之所暴露應力及化學修飾方面可係有利的。其可另外有益於產品效能且可能有益於穩定性。
在本發明之含義內，術語「純化病毒抗原」表示主要純化方法或主要純化步驟，例如層析或密度梯度超速離心純 化方法。在一實施例中，主要純化方法不包含選擇性膜過濾。所用層析可係離子交換層析、疏水相互作用層析、混合模式層析、偽親和層析、親和層析、液液層析及諸如此類。在本發明之含義內，術語「主要純化方法」或「主要純化步驟」係指作為用於純化(最終)期望產物之主要純化方法之方法。換言之，主要純化方法/步驟旨在特定地純化(最終)期望產物。例如，在本發明中，該(最終)期望產物係欲在增溶之前純化之病毒抗原，但並非完整被膜病毒。其他並非「主要純化方法」之方法可滿足不同目的，例如澄清目的、濃縮目的或沈澱目的，且有時伴隨另外純化期望(最終)產物之效應。此一並非「主要純化步驟」或「主要純化方法」之方法步驟之結果係，在已實施此一方法/步驟後對期望(最終)產物之純化效應低於在已實施「主要純化步驟/方法」時達成之純化效應。在已實施主要純化步驟後，較佳不實施其他純化步驟(例如，為了滿足關於仍存於組合物中之雜質之法規)。鑒於此，清除及去活化步驟(例如化學去活化步驟)不視為主要純化步驟。根據本發明，在步驟e)之前不實施該等「主要純化步驟/方法」。
(2)如第(1)項之方法，其中在步驟d)之後及在步驟g)之前，移除已在步驟d)中添加之清潔劑。
在一實施例中，不使用層析步驟來移除該清潔劑。
(3)如第(1)或(2)項之方法，其中將步驟c)中之該體積減少至少3/4，較佳至少4/5。
在較佳實施例中，將該體積減少至少3/4，較佳至少4/5，或至少8/9，更佳至少11/12，甚至更佳至少12/13，或至少14/15，且最佳至少19/20，或至少24/25。最大體積降低通常係29/30、34/35、39/40或44/45。
在一實施例中，步驟c)中之該體積之降低係在一個單一步驟中進行。在本發明之含義內，表述「一個單一步驟」表示僅實施一個體積降低步驟，且不重複此單一體積降低步驟。
(4)如第(1)至(3)項中任一項之方法，其中該陽離子型清潔劑之最終濃度為至少約2000 μg/ml，亦較佳至少約2500 μg/ml，亦較佳至少約3000 μg/ml，亦較佳至少約3500 μg/ml，亦較佳至少約4000 μg/ml，亦較佳至少約4500 μg/ml，亦較佳至少約5000 μg/ml，亦較佳至少約5500 μg/ml，且亦較佳至少約6000 μg/ml。
(5)如前述各項中任一項之方法，其中該陽離子型清潔劑係基於四級銨陽離子(例如溴化十六烷基三甲基銨或其他烷基三甲基銨鹽)、烷基銨鹽(例如硬脂醯基胺乙酸鹽或椰子烷基胺乙酸鹽)、氯化苄烷銨及溴化苄烷銨(例如氯化苄甲乙氧銨或甲基氯化苄甲乙氧銨)、硬脂醯基胺聚二醇醚或油醯基胺聚二醇醚，陽離子型清潔劑較佳係溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)。
在另一實施例中，該清潔劑係清潔劑混合物，其中該混合物包含以下清潔劑：如本文所述之陽離子型清潔劑(較佳係CTAB)及如本文所述之非離子型清潔劑(較佳係Tween 家族之成員，較佳係Tween-80)。
(6)如前述各項中任一項之方法，其中在步驟b)之後直接進行步驟c)，此後直接進行步驟d)。
在另一實施例中，在步驟d)之後直接進行步驟e)。
(7)如前述各項中任一項之方法，其中不更換清潔劑。
(8)如前述各項中任一項之方法，其中在步驟d)中不添加核酸酶或其他DNA消化酶(較佳不添加Benzonase®)，較佳在該製程之任何階段皆不添加核酸酶。
(9)如前述各項中任一項之方法，其中該被膜病毒選自由以下組成之群：被膜RNA病毒、被膜DNA病毒或被膜反轉錄病毒，其中被膜RNA病毒包含黃病毒、披衣病毒、冠狀病毒、D型肝炎病毒、絲狀病毒、棒狀病毒、崩芽病毒(bunyavirus)、正黏液病毒、副黏液病毒及沙粒狀病毒，且被膜DNA病毒包含肝DNA病毒、皰疹病毒及痘病毒，該被膜病毒較佳選自被膜RNA病毒，該被膜病毒更佳係正黏液病毒，最佳係流行性感冒病毒，例如流行性感冒病毒A、B或C。
(10)如前述各項中任一項之方法，其中步驟a)中之該流體源自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物或基於卵之被膜病毒繁殖培養物。
(11)如第(10)項之方法，其中該基於細胞之被膜病毒繁殖培養物包含哺乳動物細胞系、較佳動物細胞系之細胞。
(12)如第(10)或(11)項中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞系之該等細胞選自由以下組成之群：Vero、PerC6、 BHK、293、COS、PCK、MRC-5、MDCK、MDBK及WI-38，該等細胞較佳係MDCK細胞。
(13)如第(10)至(12)項中任一項之方法，其中該等細胞係作為黏附細胞來培養。
(14)如第(10)項之方法，其中該基於卵之被膜病毒繁殖培養物包含雞卵。
(15)如前述各項中任一項之方法，其中步驟a)中之該流體係藉由使用拋棄式生物反應器來產生。
使用拋棄式生物反應器可進一步有助於與習用方法相比在(例如)所獲得產物自身方面(例如在品質及/或純度方面)改良本發明方法。若大規模(例如以工業規模)實施該方法，則此尤其有益。
(16)如前述各項中任一項之方法，其中澄清步驟b)係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：離心、切向流過濾及深層過濾。
在一實施例中，離心條件係(例如)等於或低於10000 g之RCF(相對離心力)持續短於2 min，較佳等於或低於3000 g之RCF持續等於或短於2 min，更佳等於或低於500 g之RCF持續等於或短於2 min，甚至更佳等於或低於300 g之RCF持續等於或短於2 min。在本發明之含義內，「g」係指在地表處由重力產生之標準加速度。
在一實施例中，對於切向流過濾，微濾膜之孔徑係(例如)至少0.2 μm，較佳至少0.45 μm，且甚至更佳至少0.65 μm。
在一實施例中，對於深層過濾，使用(例如)0.2 μm-7 μm過濾器。另外，為進一步提高產物回收率及/或防止過濾器阻塞，可使用預濾器。
(17)如前述各項中任一項之方法，其中濃縮步驟c)係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：切向流過濾(TFF)、超速離心及沈澱。TFF係TFF超濾或一步式TFF超濾及滲濾(TFF超濾/滲濾)。
在一實施例中，在使用切向流過濾進行步驟c)時，超濾膜之截留分子量可(例如)等於或低於1000 kDa，較佳等於或低於750 kDa，更佳等於或低於500 kDa，甚至更佳等於或低於300 kDa，且最佳係100-300 kDa。在較佳實施例中，超濾膜之截留分子量不低於50 kDa。
當在步驟c)中應用切向流過濾時，在較佳實施例中，體積降低在4/5至39/40範圍內，體積降低較佳超過9/10，體積降低更佳超過14/15。體積降低較佳不超過29/30。此可改良以下處理步驟之結果。
在一實施例中，在使用超速離心進行步驟c)時，超速離心之條件可係(例如)30.000 g-200.000 g持續超過10 min。當在步驟c)中應用超速離心時，在較佳實施例中，超速離心之體積降低超過9/10，較佳超過19/20，更佳超過29/30，甚至更佳超過39/40。
在一實施例中，若藉由應用沈澱來實施濃縮，則適宜化學物質為熟習此項技術者已知且可係(例如)分別具有適宜濃度之鹽、甲基及乙基醇及聚乙二醇。適宜濃度之適宜化 學物質使產物(例如含有病毒抗原之顆粒)沈澱，但對該等病毒抗原無負面效應或具有最小負面效應。化學物質經選擇以使得其不與(最終)期望產物(例如病毒抗原)反應。當在步驟c)中應用沈澱時，在較佳實施例中，體積降低超過9/10，較佳超過19/20，更佳超過29/30，甚至更佳超過39/40。
(18)如前述各項中任一項之方法，其中在步驟d)中，在足夠高溫度下增溶足夠長時間段以使基本上所有存於液體採集物中之被膜病毒增溶。
一般而言，足以使基本上所有被膜病毒增溶之時間段及溫度可由熟習此項技術者來確定。在一實施例中，該時間段在高於0℃下、較佳在2℃至30℃之溫度下介於0.2 h至20 h之間，該時間段在2-25℃之溫度下、且更佳在2-8℃之溫度下較佳介於0.5 h與6.0 h之間。
(19)如前述各項中任一項之方法，其中若實施步驟e)，則其係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：超速離心及切向流過濾。
在一實施例中，當在步驟e)中使用超速離心時，超速離心之沈澱條件較佳係30.000 g-200.000 g持續超過10 min.，較佳超過60.000 g持續超過30 min.，更佳超過90.000 g持續超過30 min.，甚至更佳超過120.000 g持續超過30min.。
在一實施例中，當在步驟e)中使用切向流過濾時，超濾膜之截留分子量較佳超過100 kDa且更佳超過300kDa。此外，膜之截留分子量較佳不大於500kD。
(20)如前述各項中任一項之方法，其中步驟f)係藉由應用層析來實施，該層析較佳選自由以下組成之群：離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析、混合模式層析、偽親和層析、液液層析及尺寸排除層析，該層析更佳選自由以下組成之群：離子交換層析、疏水相互作用層析、偽親和層析、親和層析及尺寸排除層析。
(21)如前述各項中任一項之方法，其中該病毒抗原係被膜病毒之一部分，該病毒抗原較佳係病毒蛋白，且該病毒抗原更佳係諸如病毒表面蛋白等病毒蛋白。
(22)如前述各項中任一項之方法，其中該病毒蛋白係來自流行性感冒病毒之病毒表面蛋白HA及/或NA。
在另一實施例中，該病毒蛋白係來自流行性感冒病毒之M蛋白。
(23)如前述各項中任一項之方法，其包含將所獲得病毒抗原調配為醫藥組合物之另一步驟。
(24)如第(23)項之方法，其中該醫藥組合物係疫苗製劑或其中間體，該醫藥組合物較佳係被膜病毒疫苗，醫藥組合物更佳係流行性感冒病毒疫苗。
(25)如前述各項中任一項之方法，其中步驟g)包含使用當參照25℃時具有如下電導率之組合物：在介於等於或超過3.0至低於5.0 mS/cm之間之範圍內，較佳介於等於或超過3.5至等於或低於4.7 mS/cm之間，甚至更佳在介於等於或超過3.6與等於或低於4.65 mS/cm之間之範圍內。
在較佳實施例中，步驟g)包含層析步驟(例如離子交換 層析)，且該具有上文所定義電導率之組合物係適合與所用各別層析方法組合使用之緩衝液(例如包含鹽之加載緩衝液及/或平衡緩衝液)。
該組合物之電導率可根據熟習此項技術者已知之任一適宜方法來量測，例如藉由使用諸如電導率計等電子工具來量測。
(26)如前述各項中任一項之方法，其中步驟g)包含使用當參照25℃時具有如下莫耳濃度之組合物：在介於等於或超過1.0 M至等於或低於3.5 M之間之範圍內，較佳在介於等於或超過1.0 M至等於或低於3.0 M之間之範圍內，更佳在介於等於或超過1.5 M至等於或低於3.0 M之間之範圍內，且甚至更佳在介於等於或超過1.5 M至等於或低於2.6 M之間之範圍內。
在較佳實施例中，步驟g)包含層析步驟(例如疏水相互作用層析)，且該具有上文所定義莫耳濃度之組合物係適合與所用各別層析方法組合使用之緩衝液(例如包含鹽之加載緩衝液及/或平衡緩衝液)。
該莫耳濃度可藉由熟習此項技術者已知之任一適宜方法來量測。
使用如第(25)及/或(26)項所定義之組合物可甚至進一步有助於尤其在病毒抗原回收率方面改良產生病毒抗原之方法。
(27)一種方法用於製造含有源自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之病毒抗原之疫苗製劑之用途，該方法以所示順 序包含以下步驟：i)減少含有得自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之被膜病毒之液體採集物之體積，由此獲得經濃縮液體採集物，及ii)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑之清潔劑混合物添加至在步驟i)中獲得之該經濃縮液體採集物中來使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶，其中在步驟i)之後直接進行步驟ii)，且其中存於該疫苗製劑中之宿主細胞DNA減少至少2.5 log，較佳至少3.0 log，更佳至少3.5 log，甚至更佳至少4.0 log。
該疫苗製劑中之該宿主細胞DNA之至少2.5 log之減少係藉由僅步驟i)及ii)、至多另外與第(1)項之步驟b)、e)、f)及/或g)之組合來達成。在任一情形下，不需要或甚至完全不需要實施其他DNA專一性步驟(具體而言DNA消化酶處理步驟及DNA移除層析(親和層析、凝膠層析及諸如此類))及/或去活化步驟來達成上文所界定之宿主細胞DNA之減少。若實施其他DNA專一性步驟及/或去活化步驟，則該等步驟(且因此整個方法)可以在(例如)製程經濟方面顯著改良之方式來實施，此乃因(例如)需要顯著較低量之DNA消化酶或去活化組合物來達成上述宿主細胞減少。
對於術語「疫苗製劑」、「病毒抗原」、「基於細胞」、「液體採集物」、「被膜病毒」及「清潔劑」，參見說明書。
在較佳實施例中，在步驟i)之前，自該含有被膜病毒之液體採集物移除細胞碎片及/或微載體。
(28)如第(27)之用途，其中步驟i)及ii)對應於上述各項中所定義之步驟c)及d)。
(29)如第(27)或(28)項之用途，其中在步驟i)之前實施如上述各項中所定義之步驟a)及b)，且在步驟ii)之後實施如上述各項中所定義之步驟e)、f)及/或g)。
現在藉由較佳實施例及實例更詳細地闡述本發明，然而，該等實施例及實例僅用於說明性目的且不應理解為以任何方式限制本發明之範圍。
用於產生諸如疫苗製劑或其中間體等醫藥組合物之病毒可在基於細胞或基於卵之系統中繁殖。端視所用各別系統，該等醫藥組合物通常分類為基於卵或基於細胞之組合物。對於疫苗製劑或疫苗而言，處理之主要要求係充分移除雜質(例如，在基於卵之病毒繁殖系統之情形下係受精卵蛋白質，例如卵白蛋白)以及移除非產物病毒，且在基於細胞之病毒繁殖系統之情形下，在處理期間必須滿足其他要求，例如顯著減少宿主細胞DNA及宿主細胞蛋白質。
在本發明之背景下，已意外地發現，以所界定順序實施之特定製程步驟之組合提供與習用方法相比在(例如)製程自身方面(例如在簡化整體製程方面)及/或在所獲得產物方面(例如在品質、產率及/或純度方面)經改良之方法。藉由實施本發明方法，可獲得該等令人驚訝之有益效應，前提係該製程包含含有所繁殖病毒之液體採集物之體積降低步驟，從而濃縮該液體採集物中之病毒(亦稱作病毒顆粒)及 其他成份；以及增溶步驟，其使存於體積降低之液體採集物中之病毒增溶。具體而言，且不同於先前技術製程，存於本發明方法中之純化步驟僅在增溶步驟已完成後進行，且此外，該純化步驟係關於病毒抗原而非關於完整病毒顆粒。因此，藉由應用本發明製程，可省略意欲用於且靶向在增溶之前之完整病毒顆粒純化之高產物損失、費力、時間及成本密集型純化步驟，但仍可獲得具有令人滿意之純度及產率之組合物。此外，增溶步驟係在體積降低步驟後直接進行。不期望受限於任何理論，假定該等步驟(即在體積降低步驟之後直接進行之增溶步驟)可有助於有益效應，此乃因濃縮步驟c)可提高宿主細胞DNA之濃度，繼而可對沈澱效率有益。
令人驚訝地，且不同於產生醫藥組合物(例如包含病毒抗原之疫苗)之習用方法，本發明製程代表與習用製程相比容許獲得提高之產物回收率，同時僅需要數目減少之製程步驟之經改良穩健製程。此減少之所需製程步驟之數目進一步有助於增強制程之穩健性，以及有助於減少傳統上產生疫苗組合物所需之生產成本及時間。此尤其可用於諸如流行性感冒等病毒感染之大流行性爆發或季節性爆發之情形，此乃因需要快速生產大流行性或季節性疫苗並將其發放至市場，且在使用基於卵之病毒繁殖培養系統(已知其極為費時)生產疫苗時愈發有用。
另外，隨著應用於醫藥組合物之製程步驟之數目減少，強加於所存在病毒及病毒抗原上之應力降低，此可改良最 終產物(例如疫苗)及其中間體之效能及穩定性。
此外，藉由應用本發明方法，儘管製程步驟之數目與習用製程相比有所減少，但仍可製造滿足關於蛋白質及DNA污染物之最大耐受量之特殊行政要求之疫苗製劑。例如，對於流行性感冒疫苗製劑，目前(2011)耐受污染物之最大量係120 μg非血球凝集素(HA)蛋白/劑量及10 ng DNA/劑量(在該基準中，1劑量對應於500 μl疫苗製劑)。本發明製程之另一優點在於，其應用與病毒係在基於細胞或基於卵之系統中繁殖無關。因此，例如，若使用基於細胞之系統進行病毒繁殖，則本發明方法可顯著減少宿主細胞DNA污染物，且若使用基於卵之系統進行病毒繁殖，則該方法可減少源自卵培養之污染物。
由於所產生病毒抗原之回收率提高，故每一生產批次可製備之疫苗劑量數增加。此可(例如)在對疫苗製劑有高需求之情形中尤其有益，如(例如)在季節性流行性感冒爆發中即係如此。
作為典型有益疫苗，疫苗係流行性感冒疫苗，具體而言次單元疫苗。
此外，本發明製程可應對病毒株之變體，此意味著該製程之株系依賴性較低。此在使用不斷展現基因組漂變及轉變之病毒(例如流行性感冒病毒)時尤其有用。
總而言之，本發明方法可提供在穩健性、產物回收率、生產時間及成本以及存於最終產物或其中間體中之污染物方面顯著改良之方法。
因此，在一態樣中，本發明係關於製備源自被膜病毒之病毒抗原之方法，其以此順序包含以下步驟：a)提供包含被膜病毒之流體，b)澄清包含該被膜病毒之該流體，從而獲得包含該被膜病毒之液體採集物，c)減少在步驟b)後獲得之該液體採集物之體積以獲得經濃縮液體採集物，d)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑之清潔劑混合物添加至在步驟c)中獲得之經濃縮液體採集物中來使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶，e)自在步驟d)後獲得之該組合物分離病毒核心，f)視情況自在步驟e)後獲得之該組合物移除陽離子型清潔劑，及g)純化病毒抗原，其中在步驟c)後直接進行步驟d)。
病毒抗原源自被膜病毒。該等被膜病毒可係任何被膜DNA或RNA病毒，其具有有義或反義、連續或分段之單鏈或雙鏈基因組。例如，該等病毒選自被膜RNA病毒、被膜DNA病毒或反轉錄病毒之群，其中被膜RNA病毒之群包含黃病毒、披衣病毒、冠狀病毒、D型肝炎病毒、絲狀病毒、棒狀病毒、崩芽病毒、正黏液病毒、副黏液病毒及沙粒狀病毒，且其中被膜DNA病毒之群包含肝DNA病毒、皰疹病毒及痘病毒。在較佳實施例中，該等病毒選自被膜 RNA病毒之群(包含D型肝炎病毒、正黏液病毒及副黏液病毒)，被膜RNA病毒尤佳係正黏液病毒，例如流行性感冒A、流行性感冒B或流行性感冒C。
在本發明方法之步驟a)中，提供包含上述被膜病毒之流體。此流體源自基於細胞之病毒繁殖培養物或基於卵之病毒繁殖培養物。如熟習此項技術者已知，病毒(例如上文所定義之被膜病毒)可在基於細胞之培養系統中或在基於卵之培養系統中繁殖。用於生長病毒(例如流行性感冒病毒)之適宜細胞系通常具有哺乳動物來源，且因此代表哺乳動物細胞系、較佳動物細胞系。適宜動物細胞系為熟習此項技術者已知且可包括倉鼠、牛、靈長類(包括人類及猴)及犬來源之細胞系。在某些實施例中，哺乳動物細胞系之細胞選自由以下組成之群：Vero、PerC6、BHK、293、COS、PCK、MRC-5、MDCK、MDBK及WI-38，該等細胞較佳係MDCK細胞。病毒可根據熟習此項技術者已知之任一適宜方法在細胞上生長。例如，病毒可在黏附細胞培養或在懸浮細胞培養中生長。在一實施例中，細胞係在微載體上生長。在另一實施例中，細胞亦可適於懸浮生長。對於基於細胞之培養系統，可使用任何適宜培養基。在較佳實施例中，細胞係在無血清及/或無蛋白質培養基中培養。對於基於細胞之病毒繁殖，通常將病毒或活病毒製劑分別接種至使其倍增之細胞培養中。病毒繁殖可以分批方式、或進料-批次方式、或灌流方式來進行。通常在25-37℃下2-5天後，病毒繁殖停止。可將含於病毒繁殖生 物反應器中之含有病毒之流體直接進給至其純化製程中或轉移至單獨容器中。然後將單獨容器中含有病毒之流體進給至疫苗純化製程中。
或者，病毒可在基於卵之系統中繁殖。在基於卵之製造中，通常將實用種病毒注射至受精雞卵中。病毒開始在卵之尿囊液(卵白)中繁殖以增加病毒數量。在培育2-3天後，將卵冷凍至2-8℃且使用人工或自動化真空採集系統採集並彙集個別卵之尿囊液。所收集含有病毒之尿囊液係包含病毒之基於卵之流體且在後續純化製程中進一步處理。
端視用於病毒繁殖之培養系統，包含所繁殖病毒顆粒之流體可含有不同污染物。例如，可能存於基於卵之培養物中之污染物係基於卵之蛋白質(例如卵白蛋白)或抗生素，而存於基於細胞之培養物中之典型污染物係殘留宿主細胞DNA。有利地，本發明方法在用於病毒繁殖之系統方面不受限制；相反，在使用包含在基於細胞之培養系統及基於卵之培養系統中繁殖之病毒之流體時，亦可達成有益效應。
步驟a)中之流體可藉由使用拋棄式生物反應器來產生。藉由使用此一拋棄式生物反應器，例如可在(例如)品質及/或純度方面改良所獲得產物自身。若大規模(例如以工業規模)實施該方法，則此尤其有益。
對包含被膜病毒之流體實施澄清步驟。對包含病毒顆粒之流體實施澄清步驟，然而不對經沉降或以其他方式沈澱之物質實施。在本發明之含義內，此澄清步驟之目的係自 該流體移除微粒物質，例如細胞碎片、蛋白質雜質及/或用於生長細胞之載體材料(例如微載體)。在本發明之含義內，澄清步驟(例如)自流體移除微粒物質，但保留超過80%之被膜病毒之病毒抗原。蛋白質雜質可(例如)係尿囊素、膠原及/或白蛋白(例如卵白蛋白)。對於澄清，可使用熟習此項技術者已知之任何適宜手段或方法。具體而言，可應用切向流過濾(TFF)、深層過濾或離心。因此，所應用各別澄清手段(TFF、深層過濾、離心)中之每一者之設定係以可達成上文所示目的之方式經選擇。一般而言，且慮及此目的，各別手段中每一者之該等設定為熟習此項技術者已知。在本發明較佳實施例中，在應用離心時，可應用等於或低於10000 g之離心力達等於或短於2分鐘(min.)之時間段。在此澄清步驟中應用較低離心力(例如等於或低於1000 g，較佳等於或低於500 g，更佳等於或低於300 g)達等於或短於2分鐘之時間段甚至更有助於本發明之有益效應，例如其可有助於進一步提高病毒抗原之回收率。關於應用離心時之其他參數，以及關於切向流過濾或深層過濾之參數，參見本說明書中之其他地方。
在本發明之含義內，所獲得經澄清流體表示為「液體採集物」。
本發明方法之一關鍵態樣係降低含有所繁殖病毒顆粒之經澄清流體之體積，之後直接進行存於體積降低之經濃縮液體採集物中之病毒顆粒之增溶/清潔劑處理步驟。已令人驚訝地發現，在此體積降低後直接用如本文其他地方所 述之清潔劑處理病毒顆粒可提高病毒抗原之回收率且由此提高其產率。此外，已令人驚訝地發現，若已使用基於細胞之系統實施病毒繁殖，則可意外地促進宿主細胞DNA之減少。
在本發明之含義內，術語「之後直接進行」表示在步驟c)與d)之間不實施(例如)處理步驟或特別主動純化步驟。此意味著在步驟c)與d)之間不對液體採集物實施處理步驟，例如不實施去活化或純化步驟。此亦意味著在步驟c)及步驟d)之間不自液體採集物獲取其他試劑或將其他試劑添加至該液體採集物中。在另一態樣中，在步驟b)後直接進行步驟c)，此後直接進行步驟d)。此可進一步有助於在(例如)簡化方面或在時間效率及成本降低方面改良本發明方法，同時仍保留高產物(病毒抗原)回收率、產率及/或純度。
去活化導致移除病毒之感染性且通常係藉由用有效量之以下化學手段中之一或多者處理病毒來實施：清潔劑、甲醛、β-丙內酯、亞甲藍、補骨脂素、羧基富勒烯(carboxyfullerene，C60)、二元乙胺、乙醯基乙烯亞胺或其組合。其他去活化方法為熟習此項技術者已知且包含(例如)用物理手段(例如γ輻照及/或UV光)處理病毒。
在本發明之某些實施例中，不實施藉由應用用於使被膜病毒增溶(步驟d))之相同清潔劑來去活化。
在本發明之其他實施例中，在步驟d)中不實施去活化，尤其不實施包括用甲醛、β-丙內酯及/或UV光(例如UV-C)、 較佳用甲醛及/或β-丙內酯處理病毒之去活化。在另一態樣中，可能在被膜病毒之增溶步驟後(即在步驟d)後)應用病毒之去活化步驟。在另一態樣中，在步驟a)至f)期間完全不實施去活化步驟。此可進一步有助於在(例如)成本及/或工作方面改良本發明方法。有時，若已在基於細胞之系統中實施病毒繁殖，亦使用β-丙內酯對可能存在之殘留宿主細胞DNA進行去活化。然而，β-丙內酯係不僅使DNA烷基化且亦使產物抗原(病毒抗原)烷基化之烷基化劑，且因此可能對該等抗原之品質(例如在穩定性及/或免疫原性方面)造成負面影響。因此，本發明方法之優點在於，令人驚訝地，儘管省略了諸如β-丙內酯等去活化劑，但仍可符合宿主細胞DNA雜質在最終產物(例如疫苗製劑)中之最大允許限值。
液體採集物在步驟c)中之濃縮可藉由適宜方法來達成。該等方法旨在降低液體採集物之體積。此步驟之目的並非特定地純化病毒顆粒，即此步驟並非主要純化步驟。相反，此步驟旨在降低包含被膜病毒顆粒之液體採集物之體積以獲得經濃縮液體採集物。
在降低體積之步驟期間，可能自液體病毒採集物分離微小雜質。微小雜質係任何物質，例如分子、顆粒或培養基組份，其大小低於被膜病毒之大小，較佳低於約1000 kDa，更佳低於約500 kDa，甚至更佳低於約300 kDa。微小雜質之此分離(若發生)僅係基於所分離雜質之大小，但不基於該等雜質之密度。在實施包含梯度之純化方法(例 如梯度離心)時，雜質發生不僅基於該等雜質之大小且亦基於該等雜質之密度之分離。梯度離心之實例係蔗糖梯度超速離心。降低體積之步驟有助於(例如)提高病毒抗原之回收率及/或促進宿主細胞DNA之移除。
在較佳實施例中，可藉由應用TFF超濾或一步式TFF超濾及滲濾(TFF超濾/滲濾)、超速離心或沈澱來降低體積，較佳使用TFF超濾以降低體積。因此，所應用各別濃縮手段(TFF、TFF超濾/滲濾、超速離心或沈澱)中之每一者之設定係以可達成上文所示目的(即降低體積並濃縮病毒顆粒)之方式經選擇。在本發明較佳實施例中，體積降低係藉由使用50 kDa-1000 kDa截止膜、較佳100 kDa-300 kDa截止膜(且較佳不小於50 kDa)應用TFF超濾/滲濾來達成。
在一實施例中，在使用超速離心來降低體積時，超速離心之條件可係(例如)30.000 g-200.000 g之RCF持續超過10 min。
在一實施例中，若藉由應用沈澱來實施濃縮，則適宜化學物質為熟習此項技術者已知且可係(例如)分別具有適宜濃度之鹽、甲基及乙基醇及聚乙二醇。適宜濃度之適宜化學物質使產物(例如含有病毒抗原之顆粒)沈澱，但對該等病毒抗原無負面效應或具有最小負面效應。化學物質經選擇以使得其不與期望抗原(例如病毒抗原)反應且不改變期望抗原之免疫原性。
同樣較佳地，步驟c)中降低體積之步驟並非藉由使用密度梯度離心方法(例如蔗糖梯度超速離心)來實施。梯度超 速離心係高成本勞動密集型製程步驟，其需要高等級維護且作業昂貴。因此，藉由省略梯度超速離心步驟，可在(例如)減少生產成本及勞動方面改良製程。
在一實施例中，體積減少至少3/4，較佳至少4/5，或至少8/9，亦較佳至少11/12，亦較佳至少12/13，或至少14/15，且亦較佳至少19/20，或至少24/25。最大體積降低通常係29/30、34/35、39/40或44/45。在本發明中已發現，將體積降低本文所示之因子，尤其與下文所示濃度之清潔劑組合，進一步有助於提高病毒抗原之回收率。另外，若使用基於細胞之系統進行病毒繁殖，則可意外地促進宿主細胞DNA之減少，例如減少至少2.5 log。
對此經減少及濃縮之包含被膜病毒顆粒之體積直接實施增溶步驟。病毒抗原可以不同形式存在，例如呈聚集體及/或附著至細胞及細胞碎片之大顆粒、線狀病毒、完整游離球狀病毒顆粒、病毒片段及非病毒相關性鬆散病毒抗原。實施增溶步驟以自不同結構釋放病毒抗原。
使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶係藉由將清潔劑或清潔劑混合物(包含陽離子型清潔劑或由其組成)添加至在步驟c)獲得之液體採集物來實施。陽離子型清潔劑為熟習此項技術者已知且係(例如)基於四級銨陽離子(例如溴化十六烷基三甲基銨或其他烷基三甲基銨鹽)、烷基銨鹽(例如硬脂醯基胺乙酸鹽或椰子烷基胺乙酸鹽)、氯化苄烷銨及溴化苄烷銨(例如氯化苄甲乙氧銨或甲基氯化苄甲乙氧銨)、硬脂醯基胺聚二醇醚或油醯基胺聚二醇醚，其中 CTAB(溴化十六烷基三甲基銨)較佳。更佳地，使用至少兩種清潔劑之混合物。較佳地，清潔劑混合物包含陽離子型及非離子型清潔劑或由其組成。較佳地，清潔劑混合物包含陽離子型清潔劑(較佳CTAB)及非離子型清潔劑(例如烷基聚環氧乙烷、烷基多糖苷(包括：辛基糖苷及癸基麥芽糖苷))或由其組成，例如nonidet P10或nonidet P40表面活性劑、MEGA-8、-9或-10、Triton X 100及相關清潔劑或聚山梨醇酯，例如Tween家族之清潔劑(例如Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80)、APO-10、APO-12、C8E6、C10E6、C12E6、C12E8、C12E9、C12E10、C16E12、C16E21、庚烷-1,2,3-三醇、lubrol PX、genapol家族、正十二烷基-b-D-葡萄吡喃糖苷、thesit、pluronic家族等；較佳使用聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80。
在本發明之較佳實施例中，以預混合物形式(意指其存於混合物中)或單獨(但同時或直接逐一添加)添加多種清潔劑。較佳不更換清潔劑，其中移除第一清潔劑，之後添加第二清潔劑。
陽離子型清潔劑、較佳CTAB之總量(即最終濃度)較高，此意指該總量高於通常用於增溶目的之最終量。因此，最終濃度係至少約2000 μg/ml，亦較佳至少約2500 μg/ml，亦較佳至少約3000 μg/ml，亦較佳至少約3500 μg/ml，亦較佳至少約4000 μg/ml，亦較佳至少約4500 μg/ml，亦較佳至少約5000 μg/ml，亦較佳至少約5500 μg/ml，且亦較佳至少約6000 μg/ml。陽離子型清潔劑之可能之最大量係 約8000 μg/ml，亦較佳約7000 μg/ml，亦較佳約6000 μg/ml。尤佳範圍係約4000 μg/ml-約6000 μg/ml，約4500 μg/ml-約6000 μg/ml，約4000 μg/m l-約5000 μg/ml，約4500 μg/ml-約5000 μg/ml。
非離子型清潔劑、較佳聚山梨醇酯之總量(即最終濃度)係至少約300 μg/ml，亦較佳至少約500 μg/ml，亦較佳至少約800 μg/ml，亦較佳至少約900 μg/ml，亦較佳至少約1000 μg/ml，亦較佳至少約1200 μg/ml，亦較佳至少約1400 μg/ml，亦較佳至少約1800 μg/ml。非離子型清潔劑之較佳最大量係約4000 μg/ml，亦較佳約3000 μg/ml，亦較佳約2000 μg/ml。尤佳範圍係約300 μg/ml-約1500 μg/ml，約300 μg/ml-約1100 μg/ml，約900 μg/ml-約1500 μg/ml，約900 μg/ml-約1200 μg/ml。
在另一實施例中，在最終濃度為至少5000 μg/ml之陽離子型清潔劑存在下使液體病毒採集物減少至少19/20，或在最終濃度為至少4000 μg/ml之陽離子型清潔劑存在下使採集物減少至少14/15，或在最終濃度為至少2500 μg/ml之陽離子型清潔劑存在下使採集物減少至少9/10。
藉由應用該等條件，可達成關於產物回收率之尤其有益之結果。另外，若使用基於細胞之系統進行病毒繁殖，則除了提高產物回收率以外，可促進宿主細胞DNA雜質之減少。
可在適於使基本上所有(較佳所有)存於經濃縮液體採集物中之病毒顆粒達成增溶之條件下實施增溶。在較佳實施 例中，藉由在以下條件下培育經濃縮病毒採集物來實施增溶：在高於0℃下、較佳在2℃至30℃溫度下介於0.2 h至20 h之間，較佳在2-25℃溫度下、更佳在2-8℃溫度下介於0.5 h與6.0 h之間。
在使用基於細胞之系統進行病毒繁殖時，在步驟d)之前或在所有步驟a)至f)期間較佳不添加核酸酶(例如DNase，例如Benzonase®)。在先前技術中，用核酸酶及/或藉由β-丙內酯(BPL)及/或藉由區帶超速離心及/或藉由實施層析步驟來處理包含病毒之流體或液體採集物，以降解及/或移除宿主細胞之核酸，且由此使宿主細胞DNA雜質減至最少。例如，對於基於流行性感冒病毒之純化製程，通常必須使宿主細胞DNA減少超過4 log以滿足行政法規。現已令人驚訝地發現，藉由應用本發明方法，即使不使用核酸酶處理(例如Benzonase®處理)亦可使宿主細胞DNA降低足夠高以滿足行政法規。此在成本效率及時間方面顯著改良該製程。此外，不需要BPL處理且該處理限於期望情形(若存在)。在某些實施例中，在步驟d)之前不實施BPL處理，在某些實施例中，完全不實施BPL處理。
在步驟d)之後，可實施自組合物分離在步驟d)之後獲得之病毒核心之步驟e)。病毒核心之分離可藉由達成該期望分離之任一適宜方法來實施。
在本發明之實施例中，此分離步驟係藉由沈澱出病毒核心(例如藉由超速離心，但在較佳實施例中並非藉由密度梯度超速離心)來實施。病毒表面蛋白(例如流行性感冒病 毒(表面)蛋白，例如HA、NA(神經胺糖酸酶)或M蛋白)停留於上清液中，且可對其實施其他製程步驟以最終獲得次單元病毒疫苗。舉例而言，經選擇以沈澱出病毒核心之離心條件為熟習此項技術者已知。例如，超速離心可呈分批方式或以連續方式，且所用超速離心條件係分別在適宜溫度下(例如在2-25℃下，更佳在2-8℃下)自30.000 g持續超過10分鐘(min.)至200.000 g持續超過10 min.。在一實施例中，用於沈澱出所獲得病毒核心之超速離心條件係在2-8℃之溫度範圍內以100.000 g持續30 min.。
在另一實施例中，在步驟d)之後及在步驟g)之前，可移除源自步驟d)之清潔劑。此清潔劑移除可藉由適於此目的之任一方法來實施，例如藉由安柏萊特處理或TFF來實施。在使用安柏萊特處理時，且在已實施步驟e)之後，在較佳實施例中，以約100：1之安柏萊特之質量與陽離子型清潔劑之質量之比將安柏萊特添加至在已沈澱出病毒核心後收集之上清液中，在適宜溫度(例如在介於2-8℃之間之範圍內之溫度)下培育適宜時間(例如8至24小時，適宜地16小時)。然後，藉由熟習此項技術者已知之任何適宜方法移除安柏萊特，例如藉由使用習用流式過濾/死端過濾、篩或TFF來移除。在使用過濾器時，其應以能保留大於5 μm或大於7 μm之顆粒之方式來選擇。此外，可藉由使用篩來移除安柏萊特。適宜篩之孔在30-200 μm範圍內，較佳小於150 μm，更佳小於100 μm，甚至更佳為約50 μm。在一實施例中，不使用層析來移除清潔劑。
最後，在分別代表主要純化步驟或主要純化方法之步驟g)中，純化病毒抗原。在本發明之含義內，術語「病毒抗原」表示病毒(較佳被膜病毒)之一部分，其可在個體中誘導針對該抗原之免疫反應。較佳地，病毒抗原係病毒蛋白。較佳地，病毒膜蛋白係諸如HA、NA或M蛋白等膜蛋白，病毒膜蛋白較佳係HA及/或NA。
病毒抗原之純化可藉由適於自在步驟e)之後或(若已實施步驟f))在步驟f)之後獲得之組合物特定地純化病毒抗原之任一方法來實施。較佳純化方法係諸如層析方法等純化方法，例如離子交換層析、疏水相互作用層析、偽親和層析、親和層析、尺寸排除層析、液液層析及諸如此類。在一實施例中，較佳純化方法係離子交換層析及疏水相互作用層析。
本發明方法可用作製備病毒疫苗製劑、較佳病毒疫苗、更佳流行性感冒病毒疫苗、例如次單元疫苗之整體生產製程之一部分。
本發明另外係關於本發明方法，其中該方法用於產生疫苗，較佳用於產生流行性感冒疫苗。所產生疫苗可係次單元疫苗。
本發明另外係關於本文所述方法，其進一步包含將所獲得經純化病毒抗原調配為醫藥組合物之額外步驟，其中該醫藥組合物較佳係疫苗製劑或其中間體。在尤佳實施例中，醫藥組合物係流行性感冒疫苗。此額外步驟係可能必須實施以獲得醫藥組合物之步驟。該步驟可係(例如)病毒 去活化步驟，例如輻照步驟，例如UVC輻照步驟。一般而言，此一步驟確保病毒抗原已去活化且不含活性污染物病毒。為使微生物污染降至最低，可能必須實施生物負荷降低性過濾。此外，例如若必須將病毒抗原調配為病毒疫苗，則可能必須以某一濃度添加佐劑。另一額外步驟可係添加另一病毒抗原，例如源自另一病毒株之病毒抗原。另一額外步驟可係添加緩衝液及/或引入防腐劑。另一額外步驟可係清除步驟或無菌過濾步驟。
在本發明之含義內，術語「醫藥組合物」表示可用於體內或體表以預防、診斷、減輕、治療或治癒人類或動物之疾病之組合物。較佳地，此一醫藥組合物係疫苗製劑或其中間產物，更佳係被膜病毒疫苗製劑，例如流行性感冒病毒疫苗製劑，包括(例如)季節性、大流行性或流行性流行性感冒病毒疫苗製劑。大流行性或流行性流行性感冒病毒疫苗製劑之實例係禽類、人類或豬流行性感冒病毒疫苗製劑。
本發明亦係關於方法用於製造含有源自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之病毒抗原之疫苗製劑之用途，該方法以所示順序包含以下步驟：i)減少含有得自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之被膜病毒之液體採集物之體積，由此獲得經濃縮液體採集物，及ii)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑之清潔劑混合物添加至在步驟a)中獲得之經濃縮液體採集物中來使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶， 其中在步驟i)之後直接進行步驟ii)，且其中存於疫苗製劑中之宿主細胞DNA減少至少2.5 log，較佳至少3.0 log，更佳至少3.5 log。
對於術語「疫苗製劑」、「病毒抗原」、「基於細胞」、「液體採集物」、「被膜病毒」及「清潔劑」，參見說明書。
已令人驚訝地發現，藉由在疫苗製劑製造中使用上述方法，可顯著減少宿主細胞DNA污染物。
在較佳實施例中，步驟i)及ii)對應於如在通篇說明書中定義之步驟c)及d)。
在另一實施例中，在步驟i)之前實施如在通篇說明書中定義之步驟a)及b)，且在步驟ii)之後實施如在通篇說明書中定義之步驟e)及f)。
實例 實例1
此實例展示如何以最小產物損失及超過3 log之宿主細胞DNA減少將流行性感冒病毒採集物處理為病毒表面抗原血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)之部分純化中間體。所獲得中間體將藉由使用層析進一步純化。
製程步驟之總體概述闡述於以下工作流程中：
流行性感冒病毒係在MDCK細胞中繁殖。藉由以3220 g離心8 min來使採集物澄清。藉由TFF使用100 KD-300 kD卡匣將經澄清採集物濃縮約4-13.7倍。在2-8℃下使用2400-3000 μg/ml CTAB及600-90 μg/ml Tween-80使經澄清及濃縮之採集物增溶。在2-8℃下將經澄清、濃縮及增溶之採集物以100.000 g離心30 min。收集上清液。以100：1之安柏萊特之質量與CTAB之質量之比將安柏萊特添加至所收集上清液中。在2-8℃下培育16 h後，藉由經5 μm過濾器過濾懸浮液來移除所添加安柏萊特。濾液係病毒表面抗原血球凝集素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)之部分純化中間體。HA係藉由單向輻射狀免疫擴散(SRD)來量測且DNA係藉由定量即時聚合酶鏈式反應(qPCR)來量測。
結果展示於下文中：A/Uruguay X-175C之HA回收率，以3220 g澄清8 min，使用300 kDa卡匣濃縮10×，以900 μg/ml Tween-80及3000 μg/ml CTAB增溶，以100.000 g離心30 min，且用安柏萊特處理採集物。在針對增溶期間引入之稀釋校正後，總體濃度因子係4×：
B/Malysia/2506/2004WT之HA回收率，澄清條件：300 g持續2 min.，使用100 kDa卡匣濃縮4×，以600 μg/ml Tween-80及2400 μg/ml CTAB增溶，以100.000 g離心30 min，且用安柏萊特處理採集物。在針對增溶期間引入之稀釋校正後，總體濃度因子係1.8×。
A/California X-179A之HA回收率，澄清條件：300 g持續2 min，使用100 kDa卡匣濃縮13.7×，增溶：900 μg/ml Tween-80及3000 μg/ml CTAB，以100.000 g離心30 min，且用安柏萊特處理採集物。在針對增溶期間引入之稀釋校正後，總體濃度因子係4.8×。：
實例2
實例2顯示，經澄清、濃縮、增溶、安柏萊特處理之採 集物之濾液中之HA及NA抗原可藉由離子交換層析充分純化，從而使其總蛋白(TP)/100 μg HA低於240 μg/100 μg HA，且其宿主細胞DNA低於20 ng/100 μg HA。NA抗原係與HA抗原一起共純化。
流行性感冒病毒係在MDCK細胞中繁殖。藉由以300 g離心2 min或以3220 g離心8 min來使採集物澄清。藉由TFF使用300 kD卡匣將經澄清採集物濃縮約10倍。在2-8℃下使用3000 μg/ml CTAB及900 μg/ml Tween-80使經澄清及濃縮之採集物增溶。在2-8℃下將經澄清、濃縮及增溶之採集物以100.000 g離心30 min.。收集上清液。以100：1之安柏萊特之質量與CTAB之質量之比將安柏萊特添加至所收集上清液中。在2-8℃下培育16 h後，藉由使懸浮液經過5 μm深層過濾器來移除所添加安柏萊特。將濾液條件化後加載至Capto® Q層析管柱上。在用加載緩衝液洗滌後，溶析HA及NA抗原。將流出物、洗滌液及溶析液進行劃分。基於UV信號，選擇若干流份以供HA-SRD、NA、DNA、總蛋白分析。結果顯示於下文中：
Capto Q
如上文所示，A/California之HA回收率受電導率影響。當電導率在3.6-4.65 mS/cm範圍內時，HA回收率介於85%-92%之間。慮及層析步驟之加載物之準備、澄清、濃縮、增溶及安柏萊特步驟的HA回收率，對於A/California，HA之總回收率可為約80%。NA係與HA抗原一起共純化。宿主細胞DNA及TP之含量滿足其規範。
對於A/Uruguay，在pH 7.3下電導率為5 mS/cm時，HA回收率係55%。慮及層析步驟之加載之製備的HA回收率以及澄清、濃縮、增溶及安柏萊特步驟，對於A/Uruguay，HA之總回收率可為約50%。未量測NA抗原。TP之含量滿足其規範。未量測宿主細胞DNA。藉由如A/California降低電導率，預期A/Uruguay之HA回收率亦會提高。
實例3
實例3顯示，經澄清、濃縮、增溶、安柏萊特處理之採集物之濾液中之HA及NA抗原可藉由疏水相互作用層析充分純化，從而使其總蛋白/100 μg HA低於240 μg/ml，且其宿主細胞DNA含量低於20 ng/100μg HA。NA抗原係與HA抗原一起共純化。
經澄清、濃縮、增溶、安柏萊特處理之採集物之製備與實例2相同。將濾液條件化後加載至疏水相互作用層析(HIC)管柱上。在用加載緩衝液洗滌後，溶析HA及NA抗原。將流出物、洗滌液及溶析液進行劃分。基於UV信號，選擇若干流份以供HA-SRD、NA、DNA、總蛋白分析。結果顯示於下文中：
HIC
如上文所示，在測試條件下，疏水相互作用層析之A/California之HA回收率係68%-91%。鹽濃度影響HA回收率。慮及層析步驟之加載之製備的HA回收率以及澄清、濃縮、增溶及安柏萊特步驟，對於A/California，HA之總回收率介於60-80%之間。NA係與HA抗原一起共純化。宿主細胞DNA及TP之含量滿足其規範。
對於B/Malaysia，在pH 7.4下，在所用鹽濃度為1.5-2.0 M時，HA回收率為約70%。慮及層析步驟之加載之製備的HA回收率以及澄清、濃縮、增溶及安柏萊特步驟，對於B/Malaysia，HA之總回收率為60%。NA抗原係與HA抗原一起共純化。宿主細胞DNA及TP之含量滿足其規範。
實例4 方法及材料
流行性感冒病毒係在MDCK細胞中繁殖。藉由以300 g離心2 min或以3220 g離心8 min來使採集物澄清。藉由TFF使用100-300 kDa卡匣將經澄清採集物濃縮不同倍數。在 2-8℃下使用600-3000 μg/ml CTAB及300-900 μg/ml Tween-80來使經澄清及濃縮之採集物增溶。在2-8℃下將經澄清、濃縮及增溶之採集物以100.000 g離心30 min.。收集上清液。以100：1之安柏萊特之質量與CTAB之質量之比將安柏萊特添加至所收集上清液中。在2-8℃下培育16 h後，藉由使懸浮液經過5 μm深層過濾器來移除所添加安柏萊特。針對HA-SRD(單向輻射狀免疫擴散分析)、NA、DNA對濾液進行量測且實施總蛋白分析。
實例4.1
此實例顯示，高濃度因子與高濃度陽離子型清潔劑之組合對抗原之回收率及宿主細胞DNA之移除二者皆較佳。所用株系為B/Brisbane。在澄清及濃縮後，在清潔劑存在下在不同條件中培育採集物。改變清潔劑之濃度、培育時間及濃度因子。CTAB之濃度及濃度因子對主要表面抗原HA之回收率及DNA減少之效應展示於圖1及圖2中。如圖可見，陽離子型清潔劑之濃度及濃度因子之增加對產物之回收率(圖1)及宿主細胞DNA之減少(圖2)二者皆有益。
實例4.2
此實例顯示，B/Florida/4/2006之高產物回收率及宿主細胞DNA之顯著減少二者皆可藉由使用3000 μg/ml CTAB及900 μg/ml Tween-80且隨後以100.000 g離心30 min來實現。
實例4.3
此實例顯示，A/Wisconsin之高產物回收率及宿主細胞DNA之顯著減少二者皆可藉由使用3000 μg/ml CTAB及900 μg/ml Tween-80且隨後以100.000 g離心30 min來實現。
實例4.4
此實例顯示，A/Victoria之高產物回收率及宿主細胞DNA之顯著減少二者皆可藉由使用3000 μg/ml CTAB及900 μg/ml Tween-80且隨後以100.000 g離心30 min來實現。
實例4.5
此實例顯示，A/California之高產物回收率及宿主細胞DNA之顯著減少二者皆可藉由使用3000 μg/ml CTAB及900 μg/ml Tween-80且隨後以100.000 g離心30 min來實現。
圖1：此圖顯示CTAB之濃度及總體濃度因子(即在已添加清潔劑CTAB後之採集物之最終濃度)對主要表面抗原HA之回收率之效應。圖1代表多個結果及圖表之實例。
圖2：此圖顯示CTAB之濃度及總體濃度因子(即在已添加清潔劑CTAB後之採集物之最終濃度)對DNA減少之效應。圖2代表多個結果及圖表之實例。

Claims (28)

  1. 一種製備源自被膜病毒之病毒抗原之方法，其以所示順序包含以下步驟：a)提供包含被膜病毒之流體，b)澄清包含該被膜病毒之該流體，從而獲得包含該被膜病毒之液體採集物，c)減少在步驟b)後獲得之該液體採集物之體積以獲得經濃縮液體採集物，d)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑之清潔劑混合物添加至在步驟c)中獲得之該經濃縮液體採集物中來使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶，e)自在步驟d)後獲得之該組合物分離病毒核心，及f)視情況自在步驟e)後獲得之該組合物移除陽離子型清潔劑，及g)純化病毒抗原，其中在步驟c)後直接進行步驟d)。
  2. 如請求項1之方法，其中在步驟d)之前不實施旨在特定地純化被膜病毒之純化步驟。
  3. 如請求項1或2之方法，其中所實施之唯一層析步驟係在步驟g)中實施。
  4. 如請求項1或2之方法，其中在步驟d)之前不實施密度梯度超速離心及/或層析。
  5. 如請求項1或2之方法，其中實施去活化步驟及/或病毒清 除步驟。
  6. 如請求項1或2之方法，其中使步驟c)中之該體積減少至少3/4，較佳至少4/5。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該陽離子型清潔劑之最終濃度係至少2000 μg/ml。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該陽離子型清潔劑係基於四級銨陽離子。
  9. 如請求項1或2之方法，其中在步驟b)後直接進行步驟c)，此後直接進行步驟d)。
  10. 如請求項1或2之方法，其中不更換清潔劑。
  11. 如請求項1或2之方法，其中在步驟d)之前不添加核酸酶或其他DNA消化酶，較佳在該方法之任一階段皆不添加核酸酶。
  12. 如請求項1或2之方法，其中該被膜病毒選自由以下組成之群：被膜RNA病毒、被膜DNA病毒或被膜反轉錄病毒，其中被膜RNA病毒包含黃病毒、披衣病毒、冠狀病毒、D型肝炎病毒、絲狀病毒、棒狀病毒、崩芽病毒(bunyavirus)、正黏液病毒、副黏液病毒及沙粒狀病毒，且被膜DNA病毒包含肝DNA病毒、皰疹病毒及痘病毒，該被膜病毒較佳選自被膜RNA病毒，該被膜病毒更佳係正黏液病毒，最佳係流行性感冒病毒，例如流行性感冒病毒A、B或C。
  13. 如請求項1或2之方法，其中步驟a)中之該流體源自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物或基於卵之被膜病毒繁殖培 養物。
  14. 如請求項13之方法，其中該基於細胞之被膜病毒繁殖培養物包含哺乳動物細胞系、較佳動物細胞系之細胞。
  15. 如請求項14之方法，其中該等細胞係作為黏附細胞來培養。
  16. 如請求項13之方法，其中該基於卵之被膜病毒繁殖培養物包含雞卵。
  17. 如請求項1或2之方法，其中步驟a)中之該流體係藉由使用拋棄式生物反應器來產生。
  18. 如請求項1或2之方法，其中步驟b)係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：離心、切向流過濾及深層過濾。
  19. 如請求項1或2之方法，其中步驟c)係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：切向流過濾、超速離心及沈澱。
  20. 如請求項1或2之方法，其中步驟e)係藉由應用選自由以下組成之群之方法來實施：超速離心及切向流過濾。
  21. 如請求項1或2之方法，其中步驟g)係藉由應用層析來實施，該層析較佳選自由以下組成之群：離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析及尺寸排除層析。
  22. 如請求項1或2之方法，其中該病毒抗原係被膜病毒之一部分，該病毒抗原較佳係病毒蛋白。
  23. 如請求項22之方法，其中該病毒蛋白係來自流行性感冒病毒之HA及/或NA。
  24. 如請求項1或2之方法，其包含將所獲得病毒抗原調配成醫藥組合物之額外步驟。
  25. 如請求項24之方法，其中該醫藥組合物係疫苗製劑或其中間體，該醫藥組合物較佳係流行性感冒疫苗。
  26. 如請求項1或2之方法，其中步驟g)包含使用當參照25℃時具有如下電導率之組合物：在介於等於或超過3.0至低於5.0 mS/cm之間之範圍內，較佳介於等於或超過3.5至等於或低於4.7 mS/cm，甚至更佳在介於等於或超過3.6與等於或低於4.65 mS/cm之間之範圍內。
  27. 如請求項1或2之方法，其中步驟g)包含使用當參照25℃時具有如下莫耳濃度之組合物：在介於等於或超過1.0 M至等於或低於3.5 M之間之範圍內，較佳在介於等於或超過1.0 M至等於或低於3.0 M之間之範圍內，更佳在介於等於或超過1.5 M至等於或低於3.0 M之間之範圍內，且甚至更佳在介於等於或超過1.5 M至等於或低於2.6 M之間之範圍內。
  28. 一種方法用於製造含有源自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之病毒抗原之疫苗製劑之用途，該方法以所示順序包含以下步驟：i)減少含有得自基於細胞之被膜病毒繁殖培養物之被膜病毒之液體採集物之體積，由此獲得經濃縮液體採集物，及ii)藉由將清潔劑或包含陽離子型清潔劑之清潔劑混合物添加至在步驟i)中獲得之該經濃縮液體採集物中來 使存於該液體採集物中之該被膜病毒增溶，其中在步驟i)之後直接進行步驟ii)，且其中存於該疫苗製劑中之宿主細胞DNA減少至少2.5 log。
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