KR20210010888A - 바이러스 및 항원 정제 및 접합 - Google Patents

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조슈아 모턴
그렉 포그
배리 브라처
휴 에이 헤이든
캐리 에이 심슨
닉 파테인
존 더블유 쉐퍼드
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Abstract

본 발명은 바이러스 정제, 항원 정제, 및 면역학적 작용제 및 다른 치료제의 전달을 위한 백신을 형성시키기 위한 바이러스 및 단백질(예를 들어 항원)의 접합(이의 예시적인 태양은 소스 유기체로부터 바이러스 및 항원 물질을 수확함을 포함할 수 있다); 상기 바이러스 및 단백질(예를 들어 인플루엔자 헤마글루티닌 항원을 포함한 항원) 물질로부터 오염물질, 찌꺼기 및 불순물의 제거를 위한 화학적 분리 및 크기-차이 분리뿐만 아니라 그의 농축 및 수집을 포함하는 정제 플랫폼; 및 상기 바이러스 및 상기 단백질간의 결합률 및 결합 성향을 증가시키는 pH에서 상기 바이러스의 활성화를 제공하는 접합 플랫폼과 관련된 방법 및 예시적인 조성물에 관한 것이고, 여기에서 상기 접합 플랫폼과 관련된 실시태양은 바이러스 대 단백질의 비를 조절함을 포함한다.

Description

바이러스 및 항원 정제 및 접합
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2018년 6월 12일자 출원된 미국 가출원 제 62/683,865 호를 우선권 주장하며, 그 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
기술분야
본 명세서에 기술된 실시태양은 고도로 정제된 재조합 바이러스를 항원 담체로서 생성시키기 위한 다중-세트 공정의 용도를 포함하며, 더욱 추가의 다양한 실시태양은 정제된 바이러스 및 정제된 항원을 사용하는 백신 생성에 관한 것이다.
바이러스는 단백질 코트 내에 핵산 분자를 가지고, 다른 유기체의 살아있는 세포 내에서만 복제된다. 종종 유해한 것으로서 생각하면, 광범위하게 다양한 바이러스가 인간, 가축 및 식물과 같은 모든 종류의 생명 형태를 감염시킬 수 있다. 그러나 긍정적인 면에서는, 비제한적으로 백신 생성, 유전자 요법 및 암 치료 등을 포함하여, 다수의 치료 목적을 위한 바이러스 용도에 관심이 점점 더 커지고 있다. 그러나, 바이러스를 연구하고, 그의 구조를 이해하고, 분자 도구 및 질병 치료 벡터 및 담체에 바이러스를 적응시키기 위해서, 바이러스를 먼저 정제하여 임의의 세포 찌꺼기, 거대-분자 섬유, 세포소기관, 지질, 및 바이러스의 의도된 기능을 방해할 수 있는 다른 불순물을 제거해야 한다.
바이러스는 일단 정제되면, 다수의 용도에 적합하다. 본 개시내용과 관련된 하나는 바이러스에 대한 유전적 전략의 연구 및 개발에 바이러스(이 상황에서 병원체로 간주됨)를 사용하는 전통적인 개념이다. 그러나, 백신을 제조하기 위한 항원 담체로서 정제된 바이러스의 용도는 본 개시내용에서 보다 더 길게 논의된다. 항원은, 유기체에 적합하게 전달될 때, 항원의 분자 구조와 일치하는 유기체 내 항체와의 결합을 통해 항체의 생성을 자극함으로써, 상기 유기체에서 면역 반응을 일으킬 수 있다. 재조합 항원은 재조합 DNA로부터 생성되며, 상기 재조합 DNA는 공지의 기술을 통해 세균, 포유동물 세포, 효모 세포 및 식물 세포와 같은 특정 숙주 세포내로 도입되는 벡터내로 클로닝된다. 이어서, 상기 재조합 항원은 숙주 세포의 번역 기구를 사용하여 발현된다. 발현 후, 상기 재조합 항원은 접합으로서 공지된 과정을 통해 수확되고, 공유 결합을 통해 바이러스에 의해 부착될 수 있다. 상기 바이러스에 대한 항원의 접합후에, 상기 바이러스는 상기 항원을 유기체로 전달하고 면역 시스템 반응을 활성화시키는 담체로서 작용할 수 있다. 이러한 방식으로, 바이러스-항원 접합체는 치료 용도를 제공할 수 있다. 소스 유기체의 숙주 세포에서 항체를 생성시키는 면역 반응을 활성화시키기 위해 항원에 대한 적합한 바이러스-항원 접합이 필요하다. 바이러스 및 항원 모두의 정제는 이러한 적합한 접합을 발전시킨다.
바이러스를 정제하기 위한 현재의 방법은 일반적으로 작은 생화학적 양, 예를 들어 나노g 내지 mg 정도의 용도로 제한되며, g 내지 kg 정도의 산업적 양에서는 입증되지 않았다. 예를 들어, "조 감염 세포 용해물"로서 공지된 이전에 사용된 방법은 바이러스-감염된 세포로부터의 조 세포 용해물 또는 세포 배양 배지를 사용한다. 감염된 포유동물 세포는 동결-해동 또는 다른 공지된 방법에 의해 용해되며, 찌꺼기는 저속 원심분리에 의해 제거되고, 이어서 상등액은 실험에 사용된다. 온전한 감염된 유기체는 물리적으로 파열되거나 분쇄되고, 생성되는 추출물은 원심분리 또는 여과를 사용하여 정제되어 조 바이러스 제제를 생성시킨다. 그러나, 이러한 방법은 실험을 수행하고 바이러스를 조작하는 능력에 영향을 미치는 다수의 비-바이러스 인자에 의해 높은 오염을 유발한다.
종래 정제 단계의 두 번째 예는 고속 한외여과이며, 상기 방법은 바이러스를 펠렛화하거나, 저-밀도 슈크로스 용액을 통해 또는 다양한 밀도의 슈크로스 용액 사이에의 현탁을 통해 추가로 정제한다. 상기 방법에 대한 제한은 고속 분리의 제한된 크기 및 확장성으로 인한, 단지 적은 양의 정제된 바이러스의 생성, 및 종종 바이러스 샘플과 함께 정제되는 추가적인 숙주 단백질로 인한 불량한 바이러스 순도를 포함한다.
바이러스 순도를 향상시키기 위해 이전에 사용된 세 번째 방법은 밀도 구배 한외원심분리이다. 상기 방법에서, 염화 세슘, 슈크로스, 요오딕사놀 또는 다른 용액의 구배가, 조립된 바이러스 입자의 분리를 위해 또는 유전자 함량이 부족한 입자의 제거를 위해 사용된다. 상기 방법의 제한은 바이러스를 정제하는데 필요한 시간(종종 2 내지 3일), 제한된 수의 샘플, 한 번에 분석될 수 있는 샘플의 양(일반적으로 로터당 6개), 및 정제될 수 있는 소량의 바이러스(일반적으로 μg 내지 mg의 최종 생성물)를 포함한다.
유기 추출 및 폴리-에틸렌 글리콜 침전이 또한, 예를 들어 지질 및 엽록체 제거와 같이, 식물 바이러스를 포함한 바이러스의 정제에 사용된다. 그러나, 또한 이러한 공지된 방법은 불량한 순도를 가지고, 전형적으로 여전히 생성물에 숙주 단백질, 핵산, 지질 및 당이 부착되어, 생성되는 바이러스 생성물의 상당한 응집을 발생시킨다. 이러한 제한은 미국 식품의약품 안전청(FDA)에 의해 시행되는 현행 제조 및 품질 관리기준(cGMP) 규정에 부합하기 위한 최종 제품의 유용성을 감소시킨다.
FDA에 의해 공표된 현행 cGMP 규정은 약물 제품의 제조, 가공 및 패킹에 사용되는 방법, 시설 및 통제에 대한 최소 요건을 포함한다. 이러한 규정은 제품의 안전성을 목표로 하고, 청구된 성분 및 강도를 갖는 것을 보장한다. 따라서, 백신 생성, 유전자 요법, 암 치료 및 다른 임상적 상황에 사용될 수 있는 바이러스의 경우, 최종 바이러스 생성물은 cGMP 규정을 따라야 한다. 최종 바이러스 생성물이 폴리-에틸렌 글리콜 침전 방법으로부터의 생성물과 같이, cGMP에 따르지 않는다면,임상 상황에서 사용하기 위한 그의 유용성은 존재하지 않거나 크게 감소된다.
확장성(scalability)은 제품의 양이 증가함에 따라, 예를 들어 실험적 규모(<1 제곱미터)에서 적어도 >20 제곱미터의 시스템으로 감에 따라 동일한 제품을 일관되고 재현가능하게 생산하는 프로세스를 지칭한다. 상기에 나타낸 바와 같은 앞서 사용된 방법들은 모두 일관성의 부족, 낮은 확장성(즉 생성물을 단지 생화학적 양으로만 생성시킨다), 및 cGMP 규정 준수의 결여가 문제가 된다.
대규모 생산에 관하여, 식물-기반 생산은, 그의 용도에 현저한 제한이 존재하지만, 관심을 받아오고 있다. 식물-기반 생산 시스템은 중국 햄스터 난소(CHO)와 같은 동물 세포 생산 시스템보다 훨신 적은 비용으로 산업적인 규모의 수율을 생성시킬 수 있다. 그러나, 비-식물 바이러스에 대한 일부 규모에서 적합했던 몇몇 통상적인 정제 방법은 식물에서 만들어진 바이러스 및 항원에 대해 작용하지 않을 것이다. 이러한 제한은 동물 세포 배양물로부터의 바이러스의 정제와 대조적으로, 식물 바이러스의 정제에 있어서의 무수한 차이로 인해 발생한다. 동물 세포가 1차 단백질 및 핵산 불순물을 생성시키는 반면, 식물은 또한 동물 세포에서 발견되지 않는 유의적이고 및 추가적인 불순물의 소스이다. 이들 중 일부는 엽록체 막 및 액포 막의 지질 조성물, 단순하고 복잡한 탄수화물 불순물, 및 나노-미립자 세포소기관 불순물을 포함한다. 실제로, 조 식물 추출물은 종종, 예를 들어 장비 또는 배지층의 분리막상의 불순물의 축적으로 인해, 식물로부터 수득된 바이러스 및 항원 물질의 가공 및 정제에 사용되는 장비를 오염시킬 것이다. 상기와 같은 오염은 불가피하게 압력 흐름 장애, 불량한 여과 및 궁극적으로 제품의 불량한 수율을 도출한다. 또 다른 문제는, 이들 불순물이 식물 유래의 임의의 단백질, 바이러스 또는 다른 "생성물" 내에서 응집되고 함께-정제될 수 있게 되는 경향이 있다는 것이다. 따라서, 현행 바이러스 정제 방법은, 비제한적으로 식물 추출물에서 발견되는 불순물을 포함하여, 모든 또는 심지어 충분한 양의 불순물을 적합하게 제거할 수 없고, 정제된 바이러스를 적합하게 생성시키는 것으로 입증되지 않았다.
따라서, 상업적 규모로, 즉 g 내지 kg 및 그 이상으로, 및 cGMP 규정을 준수하는 방식으로 고도로 정제된 바이러스를 일관되게 생성시킬 수 있는 바이러스 및 항원 정제 플랫폼에 대한 상당한 요구가 존재한다. 상기와 같은 개선은 백신 생성, 유전자 요법 및 암 치료에 대한 도구를 사용하기 위한 임상적 개발을 허용할 것이다. 본 명세서에 개략된 다른 특징 및 장점과 함께, 다수의 실시태양 및 대안에 따른 본 명세서에 기재된 플랫폼은 이러한 요구 및 다른 요구를 충족시킨다.
본 개시내용에 따른 일부 실시태양에서, 바이러스 정제 방법은 소스 유기체로부터 하나 이상의 바이러스를 함유하는 바이러스 물질을 수확하고; 상기 하나 이상의 바이러스로부터 세포 찌꺼기를 제거하고, 이에 의해 상기 하나 이상의 바이러스의 구조물을 정화(clarifying)하고; 상기 분리되고 정화된 바이러스를 농축시키고(이는 일부 실시태양에서 사용자에 의해 선택된 바와 같은 미리 정해진 한계를 초과하지 않는 크기의 기공을 갖는 멤브레인을 포함하는 여과 장치로 수행된다); 상기 농축된 바이러스를, 일련의 분리 과정을 가하여 처리하고; 상기 바이러스를 각각의 분리 과정후에 수집함을 포함하는 다중-세트 공정에 관한 것이며, 여기에서 하나 이상의 분리 과정은 상기 바이러스로부터 숙주 세포 오염물질을 분리시키는 이온-교환 크로마토그래피를 포함하고, 하나 이상의 분리 과정은 적어도 상기 바이러스와 불순물간의 크기 차이, 및 상기 불순물과 하나 이상의 크로마토그래피 리간드 사이에서 발생하는 화학적 상호작용을 근거로 상기 바이러스로부터 잔류 불순물을 분리시키는 다중-모드 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시태양에서, 식물은 바이러스의 재조합 발현을 겪는 소스 유기체이며, 비제한적인 예로서 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 및 렘나 미노르(Lemna minor)가 있다. 상기 소스 유기체가 식물인 경우, 수확은 종자 생성 및 하기에 논의되는 바와 같은, 목적하는 단백질을 형성시키기 위한 일시적인 유전자 발현의 유인에 의한 식물 발아를 포함할 수 있다. 한편으로, 바이러스의 재조합 발현을 겪는 소스 유기체는 비-식물 숙주, 예를 들어 비제한적으로 세균, 조류, 효모, 곤충, 또는 포유동물 유기체이다.
추가로, 본 명세서에 기재된 다수의 실시태양의 다양한 태양은 바이러스와 접합될 수 있는 항원의 생성 또는 정제, 또는 이 둘 모두에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 식물은 항원의 재조합 발현을 겪는 소스 유기체이며; 한편으로 상기 항원의 재조합 발현을 겪는 소스 유기체는 비-식물 숙주, 예를 들어 비제한적으로 세균, 조류, 효모, 곤충 또는 포유동물 유기체이다.
유리하게, 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양에 따라 실행된 다중-세트 공정은 고도로 정제된 바이러스 또는 재조합 항원, 또는 이 둘 모두를 상업적인 규모로 생성시킨다. 다양한 단계를 사용하여 상류 정제 공정, 예를 들어 식물 바이러스 농축을 개선시킨다. 일부 실시태양은 정제된 재조합 바이러스 및 재조합 항원의 생성을 위해서 크기 배제 크로마토그래피뿐만 아니라 다른 특징들을 사용한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양은 접합된 바이러스 및 항원의 하나 이상의 백신의 제조에 적합한 하나 이상의 바이러스 및 하나 이상의 항원을 제공한다.
바이러스에 관하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 바이러스 정제 플랫폼의 일부 실시태양의 실시를 통해, 막대-모양 식물 바이러스(예를 들어 담배 모자이크 바이러스, 즉 "TMV") 및 정이십면체 식물 바이러스(예를 들어 적색 클로버 모자이크 바이러스)의 정제가 성취되었다. 본 명세서의 다수의 실시태양에 따라, TMV 및 적색 클로버 모자이크 바이러스의 정제가 성취되었으며, 이는 크기 및 구조면에서 2개의 구조적으로 상이한 바이러스를 나타낸다. 예를 들어, 적색 클로버 모자이크 바이러스와 같은 보다 작은 정이십면체 바이러스는 T=3 대칭, 대략 31 내지 34 ㎚의 치수, 및 대략 180 캡시드 단백질을 갖는다. 환언하면, TMV는 직경이 대략 18 nm이고, 길이가 300 ㎚이며, 2160 캡시드 단백질을 함유한다. 이러한 다양성을 고려하여, 본 발명의 공정은 불필요한 세포 찌꺼기는 유지시키면서 바이러스는 투과물로 통과되게 하는 2개의 구조적으로 상이한 바이러스에 기반하여 실행되었다. 사용시, 조작 매개변수를, 엽록소/세포 찌꺼기는 유지시키면서 모든 유형의 바이러스는 투과물로 통과되도록 조절할 수 있으며, 접선흐름(TFF) 시스템은 과도하거나 시기적으로 부적절한 오염 없이 계속해서 효율적으로 작동한다. 추가적인 TFF 단계를, 보다 작은 단백질은 투과물로 통과되게 하면서 바이러스는 유지하도록 설계하고, 이중 크로마토그래피 단계를, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 내독소 및 식물 폴리페놀류를 포획하면서 크고 작은 바이러스를 모두 배제하도록 조절한다.
적색 클로버 모자이크 바이러스 및 TMV의 성공적인 정제에 기반하여, 다수의 실시태양 및 대안에 따른 바이러스 정제 플랫폼이 하기를 포함한 광범위하게 다양한 바이러스를 성공적으로 정제시킬 수 있음이 예상된다: 일련의 유전 물질(예를 들어 이중- 및 단일-가닥 DNA 바이러스, 및 RNA 바이러스), 기하학적 구조(예를 들어 막대-모양, 가요성 막대, 및 정이십면체), 및 과(카울리모비리다에(Caulimoviridae), 제미니비리다에(Geminiviridae), 브로모비리다에(Bromoviridae), 클로스테로비리다에(Closteroviridae), 코모비리다에(Comoviridae), 포티비리다에(Potyviridae), 세퀴비리다에(Sequiviridae), 톰부스비리다에(Tombusviridae))를 포함하는 바이러스.
본 명세서에 기재된 실시태양이 성공할 것으로 예상되는 비제한적인 바이러스는 바드나비루스(Badnavirus)(예를 들어 코멜리나 황색 모틀병 바이러스); 카울리모비루스(Caulimovirus)(예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스); SbCMV-유사 바이러스(예를 들어 대두 백화된 모틀병 바이러스); CsVMV-유사 바이러스(예를 들어 카사바 입맥 모자이크 바이러스); RTBV-유사 바이러스(예를 들어 벼 퉁그로 바실리포름 바이러스); 페튜니아 입맥 투화-유사 바이러스(예를 들어 페튜니아 입맥 투화 바이러스); 마스트레비루스(Mastrevirus)(서브그룹 I 제미니바이러스)(예를 들어 옥수수 위축 바이러스) 및 쿠르토비루스(Curtovirus)(서브그룹 II 제미니바이러스)(예를 들어 비트 컬리 탑 바이러스) 및 베고모비루스(Begomovirus)(서브그룹 III 제미니바이러스)(예를 들어 빈 골든 모자이크 바이러스); 알파모비루스(Alfamovirus)(예를 들어 알팔파 모자이크 바이러스); 일라르비루스(Ilarvirus)(예를 들어 담배 위축 바이러스); 브로모비루스(Bromovirus)(예를 들어 브롬 모자이크 바이러스); 쿠쿠모비루스(Cucumovirus)(예를 들어 오이 모자이크 바이러스); 클로스테로비루스(Closterovirus)(예를 들어 비트 황색 바이러스); 크리니비루스(Crinivirus)(예를 들어 상추 감염성 황색 바이러스); 코모비루스(Comovirus)(예를 들어 동부 모자이크 바이러스); 파바비루스(Fabavirus)(예를 들어 잠두 위조 바이러스 1); 네포비루스(Nepovirus)(예를 들어 담배 둥근무늬 바이러스); 포티비루스(Potyvirus)(예를 들어 감자 바이러스 Y); 라이모비루스(Rymovirus)(예를 들어 라이그라스 모자이크 바이러스); 바이모비루스(Bymovirus)(예를 들어 보리 황색 모자이크 바이러스); 세퀴비루스(예를 들어 파스닙 황색 얼룩 바이러스); 와이카비루스(Waikavirus)(예를 들어 벼 퉁그로 구형 바이러스); 카르모비루스(Carmovirus)(예를 들어 카네이션 모틀병 바이러스); 디안토비루스(Dianthovirus)(예를 들어 카네이션 둥근무늬 바이러스); 마클로모비루스(Machlomovirus)(예를 들어 옥수수 황백화 모틀병 바이러스); 네크로비루스(Necrovirus)(예를 들어 담배 괴사 바이러스); 톰부스비루스(Tombusvirus)(토마토 덤불 위축 바이러스); 카필로비루스(Capillovirus)(예를 들어 사과줄기홈 바이러스); 카를라비루스(Carlavirus)(예를 들어 카네이션 잠복 바이러스); 에나모비루스(Enamovirus)(예를 들어 완두 돌출 모자이크 바이러스); 퓨로비루스(Furovirus)(예를 들어 토양-전염 밀 모자이크 바이러스); 호르데이비루스(Hordeivirus)(예를 들어 보리 줄무늬 모자이크 바이러스); 이다에오비루스(Idaeovirus)(예를 들어 라즈베리 덤불 왜소 바이러스); 루테오비루스(Luteovirus)(예를 들어 보리 황색 왜소 바이러스); 마라피비루스(Marafivirus)(예를 들어 옥수수 줄무늬 바이러스); 포텍스비루스(Potexvirus)(예를 들어 감자 바이러스 X 및 클로버 모자이크 바이러스); 소베모비루스(Sobemovirus)(예를 들어 남부 빈 모자이크 바이러스); 테누이비루스(Tenuivirus)(예를 들어 벼 줄무늬 바이러스); 토바모비루스(Tobamovirus)(예를 들어 담배 모자이크 바이러스); 토브라비루스(Tobravirus)(예를 들어 담배 래틀 바이러스); 트리코비루스(Trichovirus)(예를 들어 사과 황백화 잎 반점 바이러스); 타이모비루스(Tymovirus)(예를 들어 순무 황색 모자이크 바이러스); 및 움브라비루스(Umbravirus)(예를 들어 당근 모틀병 바이러스) 속의 바이러스를 포함한다.
성공적인 바이러스 정제를 상업적인 규모로, cGMP 규정을 준수하는 방식으로 수행하였다. 일부 실시태양에서, 소스 유기체는 식물이나, 본 실시태양의 일부 변형은 식물-계 바이러스의 생성을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 실시태양은 식물 중 바이러스의 제조 또는 정제로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 바이러스 정제 플랫폼은, 식물을 조절된 생장실에서 생육시키고, 상기 식물을 바이러스 복제로 감염시키고, 세포를 붕해기로 파열시킴으로써 상기 바이러스를 회수하고 스크류 프레스를 통해 액체로부터 식물 섬유를 제거함으로써 시작한다.
일부 실시태양에서, 식물-계 및 비-식물 바이러스를 모두 포함하여, 정제 단계는 접선흐름 시스템을 사용하여 정화된 추출물을 농축시킴을 포함하며, 여기에서 카세트 기공 크기, 막관통 압력, 및 멤브레인 표면적 1 m2 당 정화된 추출물의 부하를 조절한다. 막관통 압력(TMP)은 분리 멤브레인의 상류 및 하류면간의 압력차이며 하기의 식에 기초하여 계산된다: ((공급물 압력 + 체류물 압력)/2) - 투과물 압력. 세라믹을 통한 바이러스의 통과가 정화된 추출물을 생성시키는 것을 보장하기 위해서, 일부 실시태양에서, 공급물 압력, 체류물 압력 및 투과물 압력을 적합한 TMP가 획득되도록 각각 조절한다. 상기 정화된 추출물을 이온-교환 컬럼 부피로 추가로 농축시키고 이온-교환 크로마토그래피 평형 완충제로 세척한다. 일부 실시태양에서, 캡토(Capto) Q 이온-교환 컬럼을 평형화시키고 공급물을 부하하고 관통 분획을 수집한다. 이어서 상기 컬럼을 기준선까지 세척하고 숙주 세포 오염물질을 상기 컬럼으로부터 고염으로 스트립핑한다.
식물-계 바이러스와 관련된 일부 실시태양에서, 추출 완충제를, 접선흐름 세라믹 여과를 사용하여 엽록소 및 다른 큰 세포 찌꺼기, 예를 들어 거대-분자 섬유, 세포소기관, 지질 등을 제거하기 전에 첨가한다. 일부 실시태양에서, 세라믹 여과는 바이러스 통과를 최적화하면서 식물 숙주로부터의 엽록소, 세포 찌꺼기 및 다른 불순물의 체류를 촉진한다. 식물-계든지 비-식물 바이러스든지 간에, 상기 접근법[여기에서 바람직한 물질(바이러스 또는 항원)은 투과물로서 관통하고 불순물은 체류물로서 유지된다]은 공정의 확장성을 촉진한다. 추가로, 막관통 압력, 세라믹 기공 크기, 및 1 m2 당 부하된 바이오매스와 같은 매개변수는 모두 상기 세라믹을 통한 바이러스의 통과가 정제된 추출물을 생성시키도록 조절된다. 세라믹 TFF 시스템은 대단히 확장성이며 TMP, 직교류 속도, 기공 크기, 및 표면적과 같은 매개변수를 보다 많은 양의 바이오매스를 수용하도록 쉽게 확장시킬 수 있다. 추가적인 세라믹 모듈을 상기 시스템에 쉽게 추가한다. 공급물, 체류물, 및 투과물 압력을 또한 효율적인 직교류 속도를 유지하도록 조절하여, 시스템의 오염을 거의 내지 전혀 없게 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 교차 속도 및 압력차를, 대략 10 내지 20 psi의 TMP를 생성시켜 보다 작은 및 보다 큰 규모로 바이러스의 효율적인 통과를 허용하도록 설정하고 조절한다. 세라믹 TFF 시스템은 매우 효율적인 세척 화학물질, 예를 들어 질산, 표백제, 및 수산화 나트륨의 사용이 가능하여, GMP 요건을 다루는 세척 연구를 수행할 수 있게 한다.
식물-계든지 비-식물 바이러스든지 간에, 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 및 달리 확장가능하고 대량-처리가능한 바이러스 정제 방법의 개발과 일치하는 정제 방법은, 적어도 바이러스와 불순물간의 크기 차이 및 불순물과 하나 이상의 크로마토그래피 리간드간에 발생하는 화학적 상호작용을 근거로, 바이러스로부터 잔류 불순물을 분리시키는 다중-모드 크로마토그래피를 사용하는 하나 이상의 분리 과정을 사용한다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 분리 과정을 캡토(등록상표) 코어 700 크로마토그래피 수지(지이 헬쓰케어 바이오 사이언시즈(GE Healthcare Bio-Sciences))로 수행하는 것은 실시태양의 범위내에 포함된다. 상기 캡토(등록상표) 코어 700 "비드"는 일정 크기, 예를 들어 700 킬로달톤(kDa) 이하의 분자를 포집하는 소수성 및 양으로 하전된 성질을 모두 갖도록 설계된 옥틸아민 리간드를 포함한다. 몇몇 바이러스는 매우 크고(예를 들어 700 kDa을 초과하고), 상기 비드 외부는 불활성이기 때문에, 캡토(등록상표) 코어 700은 크기 배제에 의한 바이러스의 정제를 허용하며, 여기에서 바람직한 물질(바이러스 또는 항원)이 투과물로서 통과하고 불순물은 체류물로서 유지된다.
일부 실시태양에서, 다시 식물-계 및 비-식물 바이러스는 비슷하게, 다중-모드 크로마토그래피 컬럼에 앞서, 5 컬럼 부피의 평형 완충제로 평형을 수행한다. 일부 실시태양에서, 캡토 Q 이온-교환 크로마토그래피로부터 합쳐진 관통 및 세척 분획을 상기 다중-모드 크로마토그래피 컬럼상에 부하하며 바이러스가 상기 컬럼의 공극 부피 중에 수집된다. 상기 컬럼을 기준선까지 세척하고 고 전도성 수산화 나트륨으로 스트립핑한다. 일부 실시태양의 태양은 상기 단계 동안 부하 비, 컬럼층 높이, 체류 시간, 및 크로마토그래피 완충제의 조절을 제공한다.
상기 정제된 바이러스를 예를 들어 정용여과로 멸균 여과하고, 보관한다.
항원에 관하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항원 정제 플랫폼의 일부 실시태양의 실시를 통해, 재조합 항원 H5 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(rHA), H7 rHA, 웨스트 나일 바이러스의 도메인 III(WNV rDIII), 및 라싸열 바이러스 재조합 단백질 1/2(LFV rGP1/2)를 생성시키고 정제하였다. 본 명세서의 다양한 실시태양을 위한 항원은 다수의 소스로부터 유래할 수 있으며, 세균, 효모, 곤충, 포유동물 또는 식물-기반 발현 접근법을 포함한 전통적인 재조합 단백질 제조 전략을 사용하여 생성될 수 있다.
일부 실시태양에서, 항원 제조 플랫폼은 식물을 조절된 생장실에서 생육시키고, 상기 식물을 재조합 항원 복제를 위해 감염시키고, 이어서 붕해기를 사용하여 항원을 회수한 다음 스크류 프레스를 통해 수성 액체로부터 섬유를 제거함으로써 시작한다. 추출 완충제를 가하여 여과에 의한 엽록소(식물 상황에서) 및 큰 세포 찌꺼기의 제거를 지원한다. 식물-계든 비-식물 항원이든 간에, 공급물 압력, 여과물 기공 크기, 정화제, 및 멤브레인 표면 1 m2 당 부하되는 바이오매스를 조절하여 필터를 통한 항원의 통과를 촉진시킨다. 대규모 바이러스 및 항원 정제를 성취하기에 적합한 다양한 공정제어(in-process control)에 대한 설명(비제한적인)을 실시예 섹션에 추가로 상세히 나타낸다.
일부 실시태양에서, 이어서 식물-계 및 비-식물 바이러스 모두 비슷하게, 정제된 추출물을 접선흐름 시스템으로 농축시킨다. 상기 선택적인 단계 동안, 카세트 기공 크기, 막관통 압력, 및 멤브레인 표면 1 m2 당 정화된 추출물의 부하를 포함한 요인들을 제어한다. 일부 실시태양에서, 상기 선택적인 단계를 완전히 건너뛴다. 이후에, 정화된 추출물을 농축시키고 이온-교환 크로마토그래피 평형 완충제로 세척한다. 상기 단계를 착수하는 한 가지 방식은 평형화된 캡토 Q 이온-교환 컬럼상에 공급물을 부하한 다음, 평형 완충제로 세척하고, 염으로 용출/스트립핑함에 의한다. 이어서 항원 분획을 용출 중에 수집하고 코발트 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 준비한다. 상기 IMAC를 평형화시키고, 공급물을 부하하고, 이어서 평형 완충제로 세척하고 용출시킨다. 상기 용출 분획을 희석하고 pH를 검사하고, 이어서 다중-모드 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT) 크로마토그래피 컬럼상에 부하한다. 상기 CHT 수지를 평형 완충제로 평형화하고 항원을 용출시킨다. 조절되는 요인 중에는 부하 비, 컬럼층 높이, 체류 시간 및 크로마토그래피 완충제가 있다. 마지막으로, 항원을 농축시키고 염수 완충제로 정용여과한다. 재조합 항원을 멸균 여과하고 이어서 보관한다.
더욱 더, 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양에 따라, H7 rHA 및 TMV, H1N1(인플루엔자 A/미시간) 대 TMV, H3N2(인플루엔자 A/싱가포르) 대 TMV, 및 TMV 대 2개의 인플루엔자 B 바이러스(B/콜로라도 및 B/푸켓)가 성공적으로 접합되었다. 일부 실시태양에서, 상기 단백질은, 바이러스에 접합되어 백신을 생성시킬 수 있고, 이어서 소스 유기체로 전달되어 다수의 실시태양 및 대안에 따른 면역 반응을 생성시킬 수 있는 임의의 유형의 치료제로 이루어진다. 따라서, 본 명세서의 개시내용은 바이러스-항원 접합체를 포함하여, 다수의 바이러스-단백질 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 선택되는 바이러스는 TMV, 또는 본 명세서의 교시에 의해 식별되고/되거나 지시된 다수의 바이러스 중 어느 하나이다. 추가로, 일부 실시태양에서 상기 단백질은 항원, 예를 들어 비제한적으로 인플루엔자 헤마글루티닌 항원(HA), 예를 들어 비제한적으로 본 단락에 나열된 것들일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 HA는 적어도 약 50%의 삼량체 형성을 나타낸다. HA는, 유기체가 생산하는 몇몇 항체에 의해 인식되는 경향이 있기 때문에 임상적으로 중요하며, 다양한 인플루엔자 감염에 대한 주된 보호 추진력을 제공한다. HA 항원성 및 따라서 HA 면역원성은 입체형태에 결부되기 때문에, HA 삼량체가 면역 반응의 촉발면에서 단량체 형태보다 유리하다.
일부 실시태양에서, 접합은 정제된 항원 및 바이러스의 농축 및 약산성 완충제 내로의 정용여과에 의해 시작된다. 이어서 상기 항원 및 바이러스를 몰농도를 기준으로 병용하고 혼합한다. 새로 제조된 수용성 카보다이이미드, 예를 들어 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(또한 EDC로서 공지됨)를, 몰농도를 기준으로 혼합하면서 상기 혼합물에 가한다. 이어서 카복실기를 아민 반응성 N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르, 예를 들어 써모피셔(ThermoFisher)의 설포-NHS로 전환시키는 화학적 시약을 몰농도를 기준으로 가한다. 미리 정하는 중지 시간까지 상기 반응을 계속한다. 이어서 상기 반응을 급냉시키고(일례로, 아민기(예를 들어 유리 아민을 함유하는 액체)의 첨가를 수반한다) 상기 반응의 촉진에 사용되는 임의의 화학적 링커(들)(예를 들어 EDC, 설포-NHS)를 다중-모드 크로마토그래피 단계 또는 정용여과를 통해 제거하며, 이어서 혼합물을 표적 농도로 희석한다. 일부 실시태양에서, 단백질과 항원으로 장식된 상기 접합되고 정제된 바이러스 입자를 백신 및/또는 진단 도구에 사용할 수 있다. 이들 입자는 숙주 유기체에서 항원을 추적하는 능력으로 인해 진단 도구로서 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 정제된 바이러스-항원 융합은 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양외에, 유전자 융합으로부터 유도될 수 있다. 상기 항원 및 바이러스 구조 단백질(코트 중에 위치함)은 단일의 연속적인 개방 판독 프레임을 형성한다. 일부 실시태양에서, 상기 판독 프레임은 코트 단백질이 바이러스 입자로 스스로 조립되도록 식물에서 항원-코트 단백질을 생성시킨다. 이어서, 식물 물질을 수확하고 바이러스 입자를 본 명세서에 개시된 실시태양에 따라 정제시킨다. 이어서 상기 융합-코트 단백질로 장식된 바이러스 입자를 개시된 다양한 실시태양에 따라 백신 및/또는 진단 도구로서 사용할 수 있다.
일부 바이러스(예를 들어 비제한적인 예로서 정이십면체 바이러스)는 몇몇 pH 조건하에서 팽창하며 일부 실시태양에서 상기 "팽창"은 접합에 사용될 수 있다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 정제된 바이러스를, 상기 바이러스 구조물에 상기 바이러스의 "팽창"을 야기하는 산성 pH 조건을 가하여 치료제에 접합시킬 수 있다. 상기 바이러스 구조물을 중성 pH 조건으로 처리함으로써, 상기 바이러스 구조물이 이완하고 상기 바이러스의 오량체 또는 다른 구조 서브유닛들간에 기공이 생성된다. 이어서, 치료제(예를 들어 화학요법제)를 완충제에 가하고 상기 치료제는 상기 이완된 바이러스 입자내로 확산하게 된다. pH를 다시 변화시킴으로써, 상기 바이러스 입자는 팽팽해지고 기공 구조가 제거되어 상기 오량체 또는 구조 서브유닛이 함께 패킹되고, 따라서 상기 바이러스 입자의 안팍으로의 화학적 확산이 방지된다. 이어서, 식물 물질을 수확하고, 상기 바이러스 입자를 정제시키고, 치료제를 함유하는 바이러스 입자를 본 명세서에 개시된 실시태양에 따라 약물 전달에 사용한다.
따라서, 다수의 실시태양 및 대안은 하나 이상의 고도로 정제된 바이러스의 생성을 포함한다. 더욱 더, 다수의 실시태양 및 대안은 재조합 항원의 생성 또는 정제 또는 이 둘 모두를 포함한다. 더욱 더, 다수의 실시태양 및 대안은 백신으로서 사용하기 위한 정제된 항원 및 바이러스의 접합을 포함한다. 바이러스의 정제를 본 실시태양에 따라 단독으로 실행할 수 있다. 마찬가지로, 재조합 항원의 생성 또는 정제를 본 발명의 실시태양에 따라 단독으로 수행할 수 있다. 임의로, 또한, 이들 다수의 실시태양의 상이한 태양을 병행할 수 있으며, 여기에서 병행 실시태양은 이들 실시태양을 실시하는 다른 방법들 중에서도, 하나 이상의 바이러스 및 하나 이상의 항원을 생성시키는 하나 이상의 소스 유기체로 출발하여, 상기와 같은 바이러스 및 항원을 정제시키고, 이어서 하나 이상의 항원과 하나 이상의 바이러스간의 접합체인 백신을 형성시킴을 포함한다.
본 명세서에 기재된 도면 및 실시태양은 본 명세서에 개시된 다수의 실시태양 및 대안의 다수의 대체 구조, 태양 및 특징을 예시하며, 이들 도면 및 실시태양을 이들 실시태양 및 대안 중 어느 하나의 범위를 제한하는 것으로서 이해해서는 안 된다. 본 명세서에 기재되고 제공된 도면은 축척으로 나타낸 것이 아니며, 상기 실시태양들은 도시된 정확한 배열, 묘사, 및 수단으로 제한되지 않음이 또한 이해될 것이다.
도 1은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 본 개시내용의 범위내의 몇몇 바이러스 정제 플랫폼의 단계들을 도시하는 흐름도이다.
도 2는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 정제된 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스이다.
도 3은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스의 정제에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 4는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 정제된 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스이다.
도 5는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스의 정제에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 6은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 정제된 막대-모양 담배 모자이크 바이러스이다.
도 7은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 막대-모양 담배 모자이크 바이러스의 정제에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 8은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원 제조 플랫폼의 단계들을 도시하는 흐름도이다.
도 9는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원 제조 플랫폼의 단계들 중 일부에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 10은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원 제조 플랫폼의 단계들 중 일부에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 11은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원 제조 플랫폼의 단계들 중 일부에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 12는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원 제조 플랫폼을 통한 다양한 항원의 정제에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 13은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 재조합 항원의 바이러스에의 접합의 예시이다.
도 14는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원의 바이러스에의 접합에 대한 SDS-PAGE 분석이다.
도 15는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원의 바이러스에의 접합에 대한 SDS-PAGE 분석이다.
도 16은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원의 바이러스에의 접합에 대한 SDS-PAGE 분석이다.
도 17은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 유리 TMV 생성물의 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)의 리포트이다.
도 18은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스와 항원 사이의 15분 동안의 접합에 대한 SES-HPLC의 리포트이다.
도 19는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스와 항원 사이의 2시간의 접합에 대한 SES-HPLC의 리포트이다.
도 20은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스와 항원 사이의 접합에 대한 웨스턴 블럿 분석이다.
도 21은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 다양한 수준의 UV 조사로 처리된 바이러스의 감염력을 예시하는 그래프이다.
도 22는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스에 대한 재조합 항원의 접합 플랫폼의 단계들 중 일부의 예시이다.
도 23은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원의 바이러스에의 접합에 대한 SES-PAGE 분석이다.
도 24는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 재조합 항원의 음성 염색 투과 전자현미경분석(TEM) 상이다.
도 25는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스의 음성 염색 TEM 상이다.
도 26은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스가 추가된 또 다른 재조합 항원에 접합된 재조합 항원의 음성 염색 TEM 상이다.
도 27은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 1:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 음성 염색 TEM 상이다.
도 28은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 1:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 음성 염색 TEM 상이다.
도 29는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 4:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 음성 염색 TEM 상이다.
도 30은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 16:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 음성 염색 TEM 상이다.
도 31은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 32는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 바이러스의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 33은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 1:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 34는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 1:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 35는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 1:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 36은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 4:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 37은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 16:1의 바이러스 대 재조합 항원 비에서 바이러스에 접합된 재조합 항원의 표준화된 침강계수 분포이다.
도 38은 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 다양한 바이러스 대 재조합체 비에서 바이러스-항원 생성물의 투여에 따른 소스 유기체 중의 항원-관련 역가의 산포도이다.
도 39는 다수의 실시태양 및 대안에 따른, 다양한 바이러스 대 재조합체 비에서 바이러스-항원 생성물의 투여에 따른 소스 유기체 중의 항원-관련 역가를 예시하는 기하평균 시험이다.
본 명세서의 다수의 실시태양 및 대안에 따른 다중-세트 공정은 상류 정제 공정을 개선시키며, 이는 식물 바이러스를 더욱 농축시키고, 바이러스 및 항원의 접합을 촉진하여 백신을 형성시킨다. 다수의 실시태양 및 대안에 따른 바이러스의 생성 및 정제 단계를 표 1 및 도 1과 관련하여 나열하고 논의한다. 마찬가지로, 항원의 생성 및 정제 단계를 표 2와 관련하여 나열하고 논의한다. 다양한 플랫폼들이 상기에 대해 하기에 기재된 특정한 실시태양을 갖지만, 본 명세서에 함유된 실시태양들의 범위는 임의의 하나의 특정한 실시태양으로 제한되지 않는다.
바이러스 생성 및 정제
표 1 및 도 1은 다수의 실시태양 및 대안에 따른 바이러스 정제 플랫폼의 단계들을 예시한다.
[표 1]
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본 정제 플랫폼은 상업적인 확장성과 cGMP 규정의 준수를 위해 설계되며 전 정제 공정 전체를 통해 하나의 완충제를 사용한다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 상기 바이러스 정제 플랫폼의 단계를 식물 발현과 관련하여 제공한다. 그러나, 하기에 기재하는 바와 같은 대기 중 조직 수확 및 세포 파열후의 단계들을 또한 비-식물 바이러스(문맥상 식물과 명백하게 관련된 경우, 예를 들어 식물 섬유의 제거와 관련된 경우 제외)에도 적용할 것이다.
본 명세서에 기재된 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 바이러스 발현을 특정 숙주에 적합한 방법을 통해 수행한다. 일부 실시태양에서, 유전자의 식물 숙주로의 바이러스-기반 전달은 담배 식물이 상기 바이러스를 재조합적으로 형성시키게 하는 변형된 TMV 발현 벡터로 수행된다. 하나의 상기와 같은 이용 가능한 대안은 미국특허 제 7,939,318 호("유연한 백신 조립 및 백신 전달 플랫폼")에 기재된 GENEWARE(등록상표) 플랫폼이다. 상기 특허에 기재된 이러한 일시적인 식물-기반 발현 플랫폼은, 단기간의 접종후 수확시간(예를 들어 21일 미만)에 다양한 바이러스를 발현하는 식물 단백질 생성 기구를 활용하기 위해 식물 바이러스 TMV를 사용한다. 바이러스 유전자가 접종된 담배 식물은 감염된 세포에서 특정 바이러스를 발현하며, 수확시 상기 바이러스를 추출한다. 접종은 본 명세서에 기재된 방법의 사용자에 의해 선택되는 예로서, 잎 표면의 손에 의한 접종, 식물층의 기계적 접종, 잎의 고압 분무, 또는 진공 침투에 의해 발생한다.
니코티아나 벤타미아나 외에, 발명의 요약에서 언급된 것들을 포함하여 다른 식물 및 비-식물 숙주가 본 개시내용에 의해 고려된다. GENEWARE(등록상표) 플랫폼 외에, 다른 전략을 사용하여 유전자를 식물(비제한적인 예로서 개구리밥 또는 좀개구리밥) 및 비-식물 유기체(비제한적인 예로서 조류)로 전달할 수 있다. 이들 다른 전략은 아그로(Agro)-침투를 포함하며, 이는 바이러스 유전자를 아그로박테리움 세균 벡터를 통해, 형질감염된 식물 전체를 통한 다수의 세포에 도입시킨다. 또 다른 것은 숙주의 세포막 중의 기공을 개방시켜 바이러스 및 항원, 예를 들어 비제한적으로 하기 실시예 1 및 3에 기재된 것들을 재조합적으로 생성시키는 유전자를 도입시키는 전기영동이다. 또 다른 것은 TMV RNA-기반 과발현(TRBO) 벡터로, 상기 벡터는 문헌[John Lindbo, "TRBO: A High-Efficiency Tobacco Mosaic Virus RNA-Based Overexpression Vector," Plant Physiol. Vol 145, 2007]에 기재된 바와 같이, TMV 코트 단백질 유전자 서열이 없는 35S 프로모터-구동된 TMV 복제단위를 사용한다.
일부 실시태양에서, 니코티아나 벤타미아나 야생형 식물의 생육은 조절된 생장실에서 일어난다. 식물 생육을 관주, 빛, 및 비료 주기를 통해 조절한다. 식물을 무토양 배지에서 생육시키고 온도를 공정 전체를 통해 조절한다.
적합한 수의 파종후 일수(DPS), 예를 들어 23 내지 25 DPS 후에, 식물을 바이러스 복제로 감염시킨다. 감염후에, 상기 식물을 오직 물만 관주하고, 바이러스의 유형에 따라 일정한 수의 감염후 일수(DPI) 동안 명 주기 및 온도를 통해 조절한다.
식물을 키, 감염 증상에 대해 검사하고, 대기 중 조직을 수확한다.
바이러스 회수/세포 파열은 최적화된 블레이드/스크린 크기로 구성된 붕해기(disintegrator)에 이은 수성 액체로부터 잔류 셀룰로스 식물 섬유의 제거(예를 들어 일례로서 스크류 프레스를 통해)를 수반한다.
적합한 추출 완충제(예를 들어 200 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0; 비제한적인 예로서 도 1의 단계(201))를 생성 추출물에 1:1 완충제:조직 비로 가한다. 파일럿 규모의 엽록소 및 큰 세포 찌꺼기의 제거는 접선흐름(TFF) 세라믹 여과(1.4 μm/5.0 μm)의 사용을 수반한다. 막관통 압력, 세라믹 기공 크기 및 멤브레인 표면 1 m2 당 부하된 바이오매스를 모두, 상기 세라믹을 통한 바이러스의 통과가 보장되도록 조절한다. 일부 실시태양에서, 공급물 압력, 체류물 압력 및 투과물 압력을 약 1.5 내지 2 Bar TMP 범위의 막관통 압력이 생성되도록 설정하고 조절한다.
세라믹 투과물을 유리섬유 깊이 여과의 사용을 통해 추가로 정화시킨다(비제한적인 예로서 도 1의 단계(203)).
정화된 추출물을 TFF 시스템(사르토리우스 아게(Sartorius AG)로부터 입수할 수 있음)으로 농축시킨다. 카세트 기공 크기(100 내지 300 kDa), 본 명세서에 기재된 바와 같은 적합한 TMP, 및 멤브레인 표면적 1 m2 당 정화된 추출물의 부하를 조절한다.
상기 정화된 추출물을 NMT 2X 이온-교환 컬럼 부피로 농축시키고 이온-교환 크로마토그래피 평형화 완충제(200 ㎚ 나트륨 아세테이트, pH 5.0, 비제한적인 예로서 도 1의 단계(204))로 7X 세척한다. 캡토 Q 이온-교환 컬럼을 200 ㎚ 나트륨 아세테이트, pH 5.0(비제한적인 예로서 도 1의 단계(205))으로 5 컬럼 부피 동안 평형화시키고, 공급물을 부하하고 관통 분획을 수집한다. 상기 컬럼을 기준선까지 세척하고 숙주 세포 오염물질을 고염으로 상기 컬럼으로부터 스트립핑한다.
상기 관통 및 세척 분획을 수집하고, 합하고, 다중-모드 캡토(등록상표) 코어 700 크로마토그래피를 준비한다. 상기 다중-모드 크로마토그래피 컬럼을 5 컬럼 부피의 평형화 완충제(200 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0; 비제한적인 예로서 도 1의 단계(206))로 평형화시킨다.
상기 캡토 Q 이온-교환 크로마토그래피로부터 합한 관통 및 세척 분획을 상기 컬럼상에 부하하고 바이러스를 상기 컬럼의 공극 부피 중에 수집한다. 상기 컬럼을 기준선까지 세척하고 고 전도성 수산화 나트륨으로 스트립핑한다. 부하 비, 컬럼층 높이, 체류 시간 및 크로마토그래피 완충제를 모두 조절한다. 바이러스의 제형화 및 농축(도 2, 단계(208))을 일부 실시태양에서 TFF 시스템(예를 들어 사토리우스 아게 시스템)으로 수행한다. 기공 크기(30 내지 300 kDa), 본 명세서에 기재된 바와 같은 적합한 TMP, 멤브레인 표면적 1 m2 당 부하 및 기공 물질을 모두 조절한다. 바이러스를 적합한 농도, 예를 들어 10 ㎎/㎖로 농축시키고, 일부 실시태양에서 적합한 완충제, 예를 들어 나트륨 포스페이트로 정용여과한다. 제형화된 바이러스를 적합하게 멸균시키고 보관한다. 일부 실시태양에서, 멸균은 PES 필터를 통해 제공된다.
본 명세서에 제공된 모든 실시예는 모든 바이러스 생성, 바이러스 정제, 항원 생성, 항원 정제, 및 바이러스-항원 접합에 대한 다수의 실시태양 및 대안의 다양한 태양의 예시를 의미한다. 이들 실시예는 비제한적이며 단지 본 명세서의 다수의 대안의 실시태양의 특징일 뿐이다.
실시예 1 - 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스의 정제
혼합물 중에서 다양한 단백질을 검출하기 위한 공지된 기법으로서, 도 3에 제공된 웨스턴 블럿은 도 2에 예시된 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스의 성공적인 정제를 도시한다. 유사하게, 도 5의 웨스턴 블럿은 도 4에 예시된 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스의 성공적인 정제를 도시한다. 상기 두 바이러스를 모두 본 명세서에 기재된 실시태양에 따라 정제하였다. 공지된 검출 기법에 따라, 표적 단백질을 상기 조직으로부터 추출하였다. 이어서 상기 샘플의 단백질을 그들의 등전점, 분자량, 전기전하, 또는 이들 요인의 다양한 조합을 근거로 젤 전기영동을 사용하여 분리시켰다. 이어서 샘플을 상기 젤 중의 다양한 레인에 부하하였으며, 이때 레인은 한정된 분자량을 갖는 공지된 단백질들의 혼합물을 함유하는 "사다리"용으로 마련되었다. 예를 들어, 도 3에서, 레인 12는 상기 사다리로서 작용한다. 이어서 상기 젤에 전압을 인가하여, 다양한 단백질들이 상기 언급한 요인에 근거한 상이한 속도로 상기 젤을 통해 이동하게 한다. 각 레인내에서 상기 상이한 단백질들의 가시적인 밴드로의 분리가 각각 도 3 및 5에 제공된 바와 같이 발생하였다. 웨스턴 블럿의 경우, 보다 순수한 생성물은 투명하고 가시적인 밴드를 특징으로 하며, 상기 도면들에서 그대로 특성화된다.
도 3 및 5는 정이십면체 적색 클로버 모자이크 바이러스를 성공적으로 정제하는 바이러스 정제 플랫폼을 예시한다. 웨스턴 블럿의 각 레인은 상기 바이러스 정제 플랫폼에서 상이한 단계의 마무리 후에 상기 바이러스의 순도를 나타낸다. 도 3에서, 상기 레인들은 레인 1 - 녹색 즙, 레인 2 - TFF 세라믹 정화 체류물, 레인 3 - TFF 세라믹 정화 투과물, 레인 4 - TFF 카세트 체류물, 레인 5 - TFF 카세트 투과물, 레인 6 - 이온 교환, 레인 7 - 이온 교환, 레인 8 - 다중모드, 레인 9 - 다중모드, 레인 10 - 30K TFF 투과물, 레인 11 - 30K 체류물, 레인 12 - 마커를 포함한다. 도 5에서, 웨스턴 블럿의 레인은 하기를 포함한다: 레인 1 - 녹색 즙, 레인 3 - TFF 세라믹 정화 체류물, 레인 5 - TFF 세라믹 정화 투과물, 레인 7 - TFF 카세트 체류물, 레인 9 - TFF 카세트 투과물, 레인 11 - 이온 교환, 레인 13 - 다중모드, 및 레인 14 - 마커.
일단 최종 단계가 바이러스 정제 플랫폼에서 발생하였으면, 생성되는 바이러스 생성물은, 도 3의 레인 11 및 도 5의 레인 13에서 가시적인 밴드에 의해 도시된 바와 같이, 고도로 정제된다.
실시예 2 - 막대-모양 TMV의 정제
도 6은 정제된 막대-모양 TMV를 도시하고, 도 7은 본 명세서에 개시된 다수의 실시태양 및 대안의 범위내에서, 상기 정제된 TMV의 성취에 사용된 바이러스 정제 플랫폼을 예시한다. 도 3 및 5와 유사하게, 도 7은 현재 바이러스 정제 플랫폼의 다양한 단계의 마무리 후에 상기 바이러스 생성물의 정제를 예시한다. 최종 정제 단계 후에, 생성되는 생성물은 도 7의 레인 13에서 투명하고 가시적인 밴드와 일치하는 고도로 정제된 바이러스 생성물이다.
따라서, 본 발명의 바이러스 정제 플랫폼은 발명자가 정이십면체 바이러스 및 막대-모양 바이러스를 모두 포함하여 상기 방법을 적용한 모든 바이러스를 성공적으로 정제시켰으며, 상기 플랫폼은 사실상 임의의 유형(모든 유형은 아니지만)의 바이러스를 상업적인 규모로 재현가능하고 일관되게 정제시킬 것으로 예상된다.
재조합 항원의 생성 및 정제
표 2 및 도 8은 다수의 실시태양 및 대안에 따른 항원 정제 플랫폼의 단계를 예시한다.
[표 2]
Figure pct00002
본 정제 플랫폼은 상업적인 확장성과 cGMP 규정의 준수를 위해 설계되며 전 정제 공정 전체를 통해 하나의 완충제를 사용한다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 상기 항원 정제 플랫폼의 단계는 하기와 같다:
니코티아나 벤타미아나 야생형 식물의 생육은 조절된 생장실에서 일어난다. 식물 생육을 관주, 빛, 및 비료 주기를 통해 조절한다. 식물을 무토양 배지에서 생육시키고 온도를 공정 전체를 통해 조절한다. 적합한 수의 DPS, 예를 들어 23 내지 25 후에, 식물을 선택된 항원의 단백질 복제를 위해 감염시킨다. 일단 태그되면, 상기 단백질은 트랜스제닉 식물 세포의 ER에 체류하기에 충분하다. 감염후에, 식물을 오직 물만 관주하고, 항원의 유형에 따라 일정한 수의 감염후 일수, 예를 들어 7 내지 14일 동안 명 주기 및 온도를 통해 조절한다. 식물을 키 및 감염 증상에 대해 검사하고, 대기 중 조직을 수확한다.
상기 식물에 의해 생성된 항원의 회수는 최적화된 블레이드/스크린 크기로 구성된 붕해기에 이은 수성 액체로부터 잔류 셀룰로스 식물 섬유의 제거(예를 들어 일례로서 스크류 프레스를 통해)를 수반한다.
적합한 추출 완충제를 생성 추출물에 적합한 비, 예를 들어 1:1 완충제:조직 비 또는 2:1 완충제:조직 비로 가한다. 일부 실시태양에서, 상기 추출 완충제는 50 내지 100 mM 나트륨 포스페이트 + 2 mM EDTA + 250 mM NaCl + 0.1% 트윈80, pH 8.5일 수 있다. 엽록소 및 큰 세포 찌꺼기의 제거는 여과의 사용을 수반한다. 셀퓨어(Celpure)300을 33 g/L의 비로 가하고 15분간 혼합한다. 공급물 압력(<30 PSI), 여과물 기공 크기(0.3 μm), 정화제(셀퓨어300) 및 멤브레인 표면 1 m2 당 부하된 바이오매스를 모두 항원의 통과가 보장되도록 조절한다.
정화된 추출물을 TFF 시스템(예를 들어 사르토리우스 아게 시스템)으로 농축시킨다. 일부 실시태양에서, 카세트 기공 크기(예를 들어 30 kDa), 본 명세서에 기재된 바와 같은 적합한 TMP, 및 멤브레인 표면적 1 m2 당 정화된 추출물의 부하를 조절한다.
상기 정화된 추출물을 농축시키고 적합한 이온-교환 크로마토그래피 평형화 완충제(예를 들어 50 mM 나트륨 포스페이트 + 75 mM NaCl, pH 6.5)로 7X 세척한다. 캡토 Q 이온-교환 컬럼을 50 mM 나트륨 포스페이트 + 75 mM NaCl, pH 6.5로 5 컬럼 부피 동안 평형화시키고, 공급물을 부하하고, 평형화 완충제로 세척하고, 상기 컬럼을 고염으로 용출/스트립핑한다.
항원 분획을 코발트 IMAC 크로마토그래피 준비를 위해 용출시 수집한다. IMAC를 50 mM 나트륨 포스페이트 + 500 mM 염화 나트륨, pH 8.0으로 5 컬럼 부피 동안 평형화시키고, 공급물을 부하하고, 평형화 완충제로 세척하고, 이미다졸을 사용하여 용출시킨다.
용출 분획을 전도성으로 희석하고, pH를 검사하고, 다중-모드 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT) 크로마토그래피 컬럼상에 부하한다. 상기 CHT 수지를 5 컬럼 부피의 평형화 완충제(5 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5)로 평형화시킨다. 항원을 포스페이트 및 NaCl의 구배를 사용하여 용출시킨다. 부하 비, 컬럼층 높이, 체류 시간 및 크로마토그래피 완충제를 모두 조절한다. 항원의 제형화 및 농축을 TFF 시스템(예를 들어 사르토리우스 아게 시스템)을 사용하여 수행한다. 기공 크기(kDa), TMP, 멤브레인 표면적 1 m2 당 부하 및 기공 물질을 모두 본 명세서에 논의된 바와 같이 조절한다.
이어서 항원을 적합한 농도, 예를 들어 3 ㎎/㎖로 농축시키고, 적합한 완충제(예를 들어 포스레이트 완충된 염수, pH 7.4)로 정용여과한다. 제형화된 항원을 적합하게 멸균시키고 보관한다. 일부 실시태양에서, 멸균은 PES 필터를 통해 제공된다.
도 9, 10 및 11은 다수의 실시태양 및 대안에 따른 항원 정제 플랫폼의 다양한 단계들을 예시한다. 도 9는 캡토 Q 크로마토그래피 단계를 마무리한 후의 항원 생성물의 순도를 도시하고, 도 10은 친화성 크로마토그래피 단계후의 항원 생성물의 순도를 도시하며, 도 11은 CHT 크로마토그래피 컬럼후의 순도를 도시한다.
실시예 3, 4, 5 및 6 - H5 rHA, H7 rhA, WNV rDIII, 및 LFV rGP1/2
도 12에 도시된 바와 같이, 다수의 실시태양 및 대안에 따른 항원 정제 플랫폼은 성공적으로 정제된 H5 rHA, H7 rhA, WNV rDIII, 및 LFV rGP1/2를 갖는다. 도 12는 상기 항원 정제 플랫폼의 마무리로부터 촬영한 2개의 상을 함유한다: 좌측의 상은 바이러스 벡터 TMV NtK(여기에서 NtK는 N-말단 리신에 대한 약어이다) 및 인플루엔자 항원에 대한 순도를 가리키는 SDS Page 젤을 함유하고, 우측의 상은 웨스트 나일 및 라싸열 항원에 대한 면역반응성을 가리키는 웨스턴 블럿을 함유한다. 도 12에서 투명하고 가시적인 밴드에 의해 도시된 바와 같이, 각각의 항원 생성물은 매우 순수하다. 따라서, 다수의 실시태양 및 대안에 따른 항원 정제 플랫폼은 cGMP 규정을 또한 준수하는 방식으로 사용된 각각의 유형의 항원을 상업적인 규모로 일관되게 정제시켰다. 동일한 방식으로, 상기 플랫폼은 임의의 유형(모든 유형은 아니지만)의 항원을 사실상 재현가능하게 정제시킬 것으로 예상된다.
재조합 항원-바이러스 접합체의 생성
표 3은 다수의 실시태양 및 대안에 따른 재조합 항원의 접합 단계를 예시한다.
[표 3]
Figure pct00003
하나의 실시태양에서, 접합 플랫폼의 단계는 하기와 같다:
정제된 항원 및 바이러스를 별도로 농축시키고 약산성 완충제, 예를 들어 NaCl을 함유하는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충제로 정용여과한다.
수용성 카보다이이미드, 예를 들어 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC로서 공지됨)를 0.5 M의 몰농도로 정제수 중에서 제형화한다.
카복실기를 아민 반응성 N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르, 예를 들어 써모피셔의 설포-NHS로 전환시키는 화학적 시약을 0.1 M의 몰농도로 정제수 중에서 제형화한다.
항원 및 바이러스를 중량 또는 몰농도를 기준으로 합하고 균일하게 혼합한다(예를 들어 1:1 ㎎:㎎ 첨가).
새로 제조된 수용성 카보다이이미드(예를 들어 EDC)를 몰농도를 기준으로 혼합하면서 혼합물에 가한다.
카복실기를 아민 반응성 에스테르(예를 들어 설포-NHS)로 전환시키기 위한 화학적 시약을 EDC 첨가 1분 이내에 몰농도를 기준으로 가한다. 접합 반응을 시작하고 미리 정한 혼합 정지 시간, 예를 들어 4시간까지 계속하고, 실온을 조절한다.
유리 아민을 가하여 상기 반응을 급냉시키고, 화학적 링커(예를 들어 EDC 및 설포-NHS)를 다중-모드 크로마토그래피 단계, 예를 들어 캡토(등록상표) 코어 700, 또는 포스페이트 완충된 염수내로의 정용여과를 통해 제거한다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 잔류 불순물을, 체류물로서 불순물과 투과물로서 접합체 혼합물 사이의 크기 차이에 근거하여 상기 접합체 혼합물로부터 제거한다.
상기 접합체 혼합물을 표적 농도로 희석한다. 이 시점에서, 바이러스-항원 접합체를 정제된 백신/약물 물질로서 사용하기 위해 제조한다. 상기 백신의 적합한 전달 기전은, 프로젝트 주사를 위해 생리학적 완충으로 환원되는 바이알 또는 동결건조된 물질을 포함할 것이다. 주사는 근육내 또는 피하일 수 있다. 다른 전달 방법, 비제한적으로 비내가 고려된다.
실시예 7 - H7 rhA의 TMV에의 접합
도 13은 재조합 항원("백신 항원"으로 표시됨)의 바이러스에의 접합에 대한 예시를 제공하며, 이때 보다 밝은- 및 보다 어두운-음영의 타원은 상기 예에서 묘사된 백신 항원에 대한 접합 정도를 나타낸다. 보다 밝은 음영은 유리 바이러스를 나타내는 반면, 보다 어두운 음영은 상기 바이러스의 단백질 코트에 접합된 항원을 나타낸다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 일부 바이러스는 RNA 게놈 둘레에 위치한 코트 단백질을 함유한다. 예를 들어, 바이러스 벡터 TMV NtK는 상기 코트 단백질에 대한 연결점으로서 작용하는 N-말단 리신을 포함한다. 일부 실시태양에서, N-말단 리신 잔기와 결합된 바이러스의 부분을 재조합 항원의 결합을 위한 제시를 향상시키기 위해 변형시키며, 상기 결합은 단백질, 예를 들어 항원의 바이러스에의 아민-표적화된 접합을 제공한다. 본 명세서에서 반경 측정의 논의와 관련하여, 바이러스 반경은 상기 재조합 항원의 바이러스 코트 단백질에의 접합에 따라 크게 증가한다. 일부 실시태양에서, 외막으로 둘러싸인 바이러스가 그의 잔기의 향상된 제시를 허용하기 위해 변화될 때 변형을 수행한다.
도 14 내지 20에 도시된 바와 같이, 재조합 항원의 바이러스에의 접합 플랫폼은 H7 rHA의 TMV에의 성공적인 접합을 갖는다. 도 14 내지 16은 pH 5.50에서 H7 rHA와 TMV간의 접합의 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동("SDS-PAGE")에 기반한 분석을 도시한다. 이들 도면에 예시된 바와 같이, 거의 모든 H7 rHA가 2시간 이내에 TMV에 접합되었다. 상기 rHA 단백질 밴드의 소멸 및 200 kDa 이상 마커를 염색하는 복합체의 동시적인 출현은 복합체 형성을 가리킨다. HA-특이성 항체와의 밴드의 반응성이 이러한 결론을 추가로 확립시킨다.
SEC-HPLC 리포트는 또한 상기 접합 플랫폼의 현재 실시태양에 따라 H7 rHA의 TMV에의 성공적인 접합을 나타내었다. 도 17은 유리 TMV 생성물의 SEC-HPLC 리포트를 도시한다. 도 17에서, 상기 유리 TMV 생성물의 SEC-HPLC 리포트는 하기 표 4에 상세히 나타낸 신호 데이터를 생성시켰다.
[표 4]
Figure pct00004
도 18은 H7 rHA를 접합 플랫폼의 현재 실시태양에 따라 15분 동안 TMV에 접합시킨 후의 SEC-HPLC 리포트를 도시한다. 도 18에서, H7 rHA를 15분 동안 TMV에 접합시킨 후의 SEC-HPLC 리포트는 표 5에 상세히 나타낸 신호 데이터를 생성시켰다.
[표 5]
Figure pct00005
도 19는 H7 rHA를 접합 플랫폼의 현재 실시태양에 따라 2시간 동안 TMV에 접합시킨 후의 SEC-HPLC 리포트를 도시한다. 도 19에서, H7 rHA를 상기 접합 플랫폼의 현재 실시태양에 따라 2시간 동안 TMV에 접합시킨 후에 취한 SEC-HPLC 리포트는 하기 표 6에 상세히 나타낸 신호 데이터를 생성시켰다.
[표 6]
Figure pct00006
도 19 및 20에 예시된 바와 같이, SEC-HPLC 리포트는 모든 TMV 막대가 15분 동안 접합 후에 약간의 H7 rhA로 코팅되었고, 2시간 이하 동안 상기 막대에 더 많은 H7 rhA가 부가됨을 나타내었다. 2시간 후에, 추가적인 접합은 검출되지 않았다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, SEC-HPLC 리포트는 상기 접합 반응이 접합되지 않은 고유 분자량의 바이러스 코트 단백질에서 적어도 약 50% 감소를 성취하며 4시간 동안 접합이 발생한 후에 대략 3%의 유리 TMV가 남았음을 나타낸다.
도 20에 예시된 바와 같이, 접합체 생성물의 웨스턴 블럿 분석은 공유 부착을 통한 H7 rhA의 TMV에의 성공적인 접합을 나타내었다. 도 20은 현재 실시태양에 따른 접합 플랫폼의 다양한 단계에 대한 웨스턴 블럿 분석을 도시하며, 여기에서 모든 샘플을 10 ㎕로 부하하였다. 다양한 레인들은 항원과 바이러스간의 상이한 접합 반응시간을 예시한다. 레인 14 및 13은 모든 TMV 막대가 15분 후에 항원으로 코팅되었음을 나타낸다. 2시간 후에, 레인 6 내지 9는 추가적인 접합이 발생하지 않았음을 예시한다.
실시예 8 - TMV NtK의 UV 불활성화
생물약학적 생성물의 바이러스 오염을 피하기 위해서, 바이러스가 더 이상 감염성이지 않도록 상기 바이러스를 불활성화(또는 멸균)시키는 것이 종종 필요하다. 또한, 다수의 규제 당국은 바이러스 제품의 정제 공정에서 하나 이상의 유효 불활성화 단계를 요하는 규칙(예를 들어 cGMP 규정)을 제정하였다. UV-C 방사선이 수년간 수처리 시스템에 사용되어 왔지만, 생물약학적 제품에서의 그의 사용은 검토되지 않은 채이며 바이러스를 유효하게 불활성화시키는 그의 능력에 관해 제한된 연구가 존재한다.
따라서, 바이러스 생성 및 정제 다음에, 그러나 재조합 항원과의 접합에 앞서, 다양한 UV-C 조건(즉 에너지 밀도 및 파장) 및 다양한 TMV 농도를, TMV NtK의 유효 불활성화 및 멸균을 위해 평가하였다. 다수의 에너지 밀도가 시험되었지만, 오직 보다 높은 수준의 에너지 밀도만이 TMV NtK를 성공적으로 불활성화시켰다. 또한, 성공적인 바이러스 불활성화는, 상기 TMV 용액이 적합한 농도로 희석되지 않는 경우 UV-C 조사가 샘플 중의 모든 바이러스를 유효하게 멸균시키지 않으므로, 농도 의존적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 TMV 용액을, 상기 UV-C 조사가 각각의 바이러스와 상호작용하고 상기 바이러스를 유효하게 불활성화할 수 있도록 적합하게 희석해야 한다.
도 21에 도시된 바와 같이, 다양한 양의 UV-C 조사(300 J/㎡ 내지 2400 J/㎡)를 니코티아나 타바쿰 식물상에서 시험하여 감염성을 평가하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, 2400 J/㎡의 UV-C 에너지 투여 후에 병변이 0으로 감소하였으며, 따라서 이는 상기 바이러스의 성공적인 불활성화를 암시한다. 또한, 훨씬 더 높은 수준의 에너지 투여량을 또한 시험하였으며, TMV NtK의 성공적인 불활성화가 또한 4800 J/㎡ 내지 5142 J/㎡ 범위의 에너지 밀도에서 발생하는 것으로 밝혀졌다.
다수의 실시태양 및 대안에 따라, 바이러스 불활성화 단계(정제 다음이지만 접합 이전의)는 하기와 같다:
A260에 의해 측정된 바와 같이(샘플을 UV광에 260 ㎚의 파장에서 노출시키고 상기 샘플을 통과하는 빛의 양을 측정함으로써 핵산을 정량분석하는 통상적인 방법이다), TMV NtK 용액을 50 μg/㎖ 미만의 농도로 희석;
세균 및 UV 가시선을 방해할 수도 있는 임의의 다른 큰 종을 제거하기 위해 TMV 용액의 0.45 μm 여과;
바이러스를 약 2400 J/㎡ 내지 5142 J/㎡의 에너지 밀도를 갖는 UV 스펙트럼의 빛에 노출시킴에 의한 TMV NtK의 불활성화.
일부 실시태양에서, 상기 UV 선의 에너지 밀도는 약 4800 J/㎡ 내지 약 5142 J/㎡이다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 상기 UV 선의 파장은 254 ㎚이다.
이어서, 상기 불활성화된 TMV NtK는 재조합 항원에 접합될 준비가 되어 있다.
이들 바이러스 불활성화 단계는 상업적인 확장성 및 cGMP 규정 준수를 위해 설계된다.
실시예 9 - 접합의 pH 의존성
바이러스를 산성 pH에서 배양하는 것이 양질의 접합을 생성시키는지의 여부를 평가하기 위해서, 단지 바이러스의 제형을 변화시키는 것만 제외하고, 동일한 배치의 바이러스, 항원, 완충제 및 에스테르를 사용하여 실험을 수행하였다. 반응 1에서, TMV를 다수의 실시태양 및 대안에 따라, pH 5.50에서 3.1 ㎎/㎖의 농도로 1X MES 접합 완충제로 제형화하였다. 반응 2에서, TMV를 포스페이트 완충제 중에서 11.0 ㎎/㎖로 농축시키고, 15%의 접합 반응 부피로서 직접 가하였다. 이들 단계 후에, 접합 공정을 SEC에 의해 모니터링하였으며, 여기에서 0분째(T=0로 표시됨)로부터 유리 TMV의 정렬된 감소는 성공적인 접합을 가리킬 것이다.
표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 반응 1은 성공적인 접합(0분째부터 유리 TMV의 정렬된 감소로 인해)을 나타낸 반면, 반응 2는 남은 유리 TMV의 퍼센트에 의해 나타난 바와 같이 성공적이지 못하였다.
[표 7]
Figure pct00007
[표 8]
Figure pct00008
따라서, 표 7에 나타낸 바와 같이, 산성 pH에서 바이러스의 배양은 90%를 초과하는 접합을 생성시킨다. 상기 산성 pH 배양 단계가 일어나지 않은 경우, 접합 퍼센트는 50% 미만으로 남는다(표 8에 나타낸 바와 같이).
상기 실험에 기반하여, 접합 모델(도 22에 도시된)이 개발되었다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 정제된 바이러스 및 정제된 항원 사이의 접합(도 22에서 "rHA"로 표시됨)이, 항원과 맞물리기 위한(본 명세서에서 "활성화하는", "활성화" 또는 "활성화하다"로서 지칭됨) 바이러스의 화학적 준비도(readiness)를 개선시킴으로써 크게 개선된다. 일부 실시태양에서, 바이러스 활성화는 양전하가 바이러스 표면상에 집적되도록 상기 바이러스를 접합 반응에 앞서 산성 pH에서 제형화함으로써 발생한다. 일부 실시태양에서, 상기 활성화 단계는 상기 바이러스를 활성화에 충분한 기간 동안 약 5.5 이하의 pH에 노출시킴을 수반한다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 기간은 약 18 내지 72시간이다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 상기 정제된 바이러스의 산성 pH에서의 처리는 코트 단백질 리신을 하전시킴으로써 상기 바이러스를 활성화시킨다. 이러한 활성화 단계의 결과로서, 양전하가 아민기의 클러스터링을 통해 바이러스 표면상에 집적하고(도 22에 도시된 바와 같이) 상기 바이러스는 재조합 항원의 카복실 단부와 접합할 준비가 된다.
상기 바이러스 활성화 단계는 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 일반적으로 바이러스를 보관하는 pH를 중성 또는 중성에 가까운 pH에서 유지시키는 전통적인 접근법과 대조적이다. 도 22에 도시된 바와 같이, 상기 전통적인 접근법은 양전하를 바이러스 표면상에 집적시키지 않으며, 그 결과 접합 퍼센트가 50% 미만으로 남는다(표 8을 참조하시오). 더욱 또한, 통상적인 접근법은 유리한 표면 전하를 갖는 댓가로 용해도를 촉진시키는 포스페이트 완충제를 사용한다.
TMV를 수반하는 성공적인 접합을 연구하는 동안, 상기 바이러스의 동적 광산란(DLS)-측정된 반경이 상기 활성화 단계 동안 적어도 2.75의 인자까지 증가할 때 일반적으로 성공적인 접합이 발생하는 것으로 관찰되었다(표 9B와 비교하여, 표 9A를 참조하시오). 일반적으로, 성공적인 TMV 접합(예를 들어 표 9C에 논의된 바와 같은)은 이들 표에 나타낸 바와 같이, 약 70 ㎚ 내지 약 195 ㎚ 이상의 DLS 반경의 증가를 특징으로 하였다.
상기 바이러스 활성화를 사용한 성공적인 접합에 기반하여, 정제된 항원을 정제된 바이러스에 접합시키기 위한 플랫폼이 개발되었다. 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 접합을 위한 정제된 항원의 제조 단계는 하기와 같다:
접합 반응의 pH 조절을 확실히 하기 위해서, 정제된 항원을 반응 개시 직전에 반응 완충제로 제형화한다.
접합에 앞서, 정제된 항원을 중성 내지 약염기성 pH의 포스페이트 완충된 염수에 보관한다.
항원 pH 표적은 분자의 성질에 따라, 전형적으로 5.50 내지 6.50이다.
바이러스에의 접합을 촉진하기 위해서, 보관 완충제를 한외여과를 사용하여 산성 pH의 MES/NaCl 완충제로 교체한다. 단백질 농도를 또한 3 ㎎/㎖를 초과하여 증가시킨다.
이어서 접합 반응을 항원 제시 완료 4시간 이내에 개시시켜 단백질 구조의 탈안정화를 방지한다.
다수의 실시태양 및 대안에 따라, 접합을 위한 정제된 바이러스의 제조 단계는 하기와 같다:
중성 pH에서 보관 후, 바이러스를 접합에 앞서 산성 pH에서 활성화시킨다. 성공적인 반응을 위해서, 상기 바이러스를 접합 반응 개시에 앞서 최소 약 18시간에서 최대 약 72시간 동안 pH 7.4의 포스페이트 완충제에서 pH 5.50의 아세테이트 완충제로 제형화한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이러스를 접합 반응 개시에 앞서 최소 약 18시간에서 최대 72시간 동안 pH 7.4의 포스페이트 완충제에서 pH 4.50의 아세테이트 완충제로 제형화한다. 산성 pH에서 72시간을 초과하여 바이러스를 보관하는 것은, 바이러스 불용성을 야기하고 접합 효율을 억제하는 바이러스들간의 자기-결합을 발생시키는 것으로 관찰되었다.
표 9A 및 9B는 DLS에 의해 측정된 바와 같은 바이러스(이 경우에, TMV)의 반경 증가의 면에서 활성화 단계를 추가로 설명한다. 구체적으로, 표 9A는 우측 컬럼에 나열된 항원에 의한, 활성화후 및 성공적인 접합이 발생하기 전 TMV의 DLS 반경 증가에 대한 데이터를 제공한다. "반경을 증가시킨 인자"는 활성화후의 TMV 반경을 중성 pH에서 전형적인 TMV 반경(약 70 ㎚이다)으로 나눈다. 환언하면, 표 9B는 우측 컬럼에 나열된 항원에 의한, 성공적이지 못한 접합 시도에 앞서, 활성화 단계 시작후 TMV의 DLS 반경 증가에 대한 데이터를 제공한다. 표 9A 및 9B에서, 좌측 컬럼은 중성 pH 및 일반적인 보관 조건하에서, 즉 임의의 활성화 발생 전에, TMV 막대의 표준 반경을 나타낸다.
[표 9A]
Figure pct00009
[표 9B]
Figure pct00010
상기 제조 단계에 이어서, 항원 및 바이러스 반응물을 혼합하고 접합 공정을 DLS 및 SDS-PAGE 방법을 사용하여 모니터링하였다. 표 9C는 바이러스를 산성 pH를 사용하여 활성화시킨 후에 DLS를 사용하여 시간에 따른 접합 반응의 평균 분자 반경을 예시한다. 표 9C에 나타낸 바와 같이, 분자 반경은 항원 분자에 의한 바이러스 막대의 성공적인 코팅의 한 가지 지표이다.
[표 9C]
Figure pct00011
차례로, 도 23은 다수의 실시태양 및 대안에 따른 활성화된 TMV NtK와 정제된 항원간 접합의 SDS-PAGE에 기반한 분석을 도시한다. 도 23에 도시된 바와 같이, >200 kDa의 단백질 밴드의 출현과 결합된, 시간에 따른 유리 TMV NtK 및 유리 항원의 정렬된 감소는 성공적인 접합을 나타낸다.
실시예 10 - 접합에 대한 정제된 바이러스 대 정제된 항원의 상이한 비의 TEM 영상화
정제된 바이러스와 정제된 항원 사이의 목적하는 접합 반응을 하기 반응식 1에 의해 나타낸다:
[반응식 1]
바이러스 + 항원 → 바이러스-항원
그러나, 항원은 자기-접합되기 쉬우며 하기 반응식 2에 의해 나타나는 바와 같이 목적하는 반응을 획득할 수 없는 것으로 주지되어 있다:
[반응식 2]
바이러스 + 항원 → 바이러스-항원 + 항원-항원
상기 정제된 항원의 자기-접합은 항원-항원 접합체가 크기 크로마토그래피 단계 중에 제거되지 않으며 그 결과는 최소화되거나 감소된 면역 반응이므로 백신의 성공적인 개발에 문제가 된다.
이러한 자기-접합 문제를 다루기 위해서, 다양한 실험을 수행하여 반응하지 않은 항원 및 항원 접합체를 어떻게 소모시킬 것인지를 밝혔다. 먼저, 항원을 자기-접합을 억제하는 시약에 노출시킴으로써 캡핑하였다. 이러한 전통적인 접근법은 성공적일 것으로 예상되었지만, 상기 접근법은 반응이 너무 빨리 발생하기 때문에 실패하였다.
다음으로, 바이러스 대 항원 비를 조절하여 적합한 접합비를 결정하였다. 표 10 및 11 및 도 24 내지 30에 나타낸 바와 같이, 7개의 상이한 샘플을 음성 염색 투과 전자현미경분석(TEM) 영상화에 의해 분석하였다. 샘플 1 내지 3은 대조군이고 샘플 4 내지 7은 상이한 헤마글루티닌(HA) 대 TMV 비를 함유하였다(표 3의 조작 단계 5에 나타낸 바와 같이, 접합 플랫폼의 혼합 단계에서).
[표 10]
Figure pct00012
[표 11]
Figure pct00013
도 24는 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 1(유리 HA, 로트 19UL-SG-001)의 TEM 상이다. 도 24에서, 상기 샘플은 작은 구형 화살표(화살표 A로 표시됨) 및 약 5 ㎚ 내지 약 9 ㎚ 크기 범위인 연신된 입자(화살표 B로 표시됨)를 함유하였다. 이들 입자의 외관은 고유의 삼량체 입체형태를 유지하면서 HA의 정렬된 응집과 일치하는 규칙적인 구조를 나타낸다. 또한, 상기 입자는 최소의 군집 사례와 함께 잘 분산되었다.
도 25는 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 2(TMV NtK 단독, 로트 18HA-NTK-001)의 TEM 상이다. 도 25에서, 막대-모양 입자(화살표 A)가 약 125 ㎚ 내지 약 700 ㎚의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위의 크기로 관찰되었다. 이들 치수는 TMV 입자의 크기 및 모양과 일치한다. 또한, 가운데 약 4 ㎚ 채널이 막대 중에서 관찰되었으며(화살표 B), 이는 TMV의 공지된 특징이다. 다수의 막대가 흔히 그의 긴 축에 평행하게 정렬되었으며 상기 막대의 표면은 일반적으로 매끄러웠다. 때때로, 상기 막대의 표면과 결합하고 배경 중에 막대-모양 입자와 결합하지 않은, 약 8 ㎚ 내지 약 10 ㎚의 작은 구형 입자(화살표 C)가 관찰되었다. 이러한 구형 입자(화살표 C)는 개별적인 HA 삼량체를 닮지 않았다.
도 26은 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 3(HA:TMV NtK가 추가된 HA 자기-접합체)의 TEM 상이다. 도 26에서, 막대-모양 입자가 약 25 ㎚ 내지 약 885 ㎚의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위(화살표 A) 및 가운데 약 4 ㎚ 내부 채널(화살표 B)로 관찰되었다. 상기 막대는 다양한 크기 및 모양의 작은 단백질성 입자로 거의 또는 전혀 장식되지 않았다(화살표 C). 상기 작은 단백질성 입자 중 일부가 또한, 상기 막대와 결합되지 않고 배경 중에서 관찰되었다(화살표 D). 도 26은 HA 입자의 큰 무리를 예시하지만, TMV는 예상된 바와 같이 접합되지 않은 TMV(도 25에 도시된)와 동일하게 보인다.
도 27은 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 4(1:1 비의 TMV:HA, 로트 18TAP-SG-002)의 TEM 상이다. 도 27에서, 막대-모양 입자가 약 50 ㎚ 내지 약 1000 ㎚ 초과의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위의 크기(화살표 A) 및 가운데 약 4 ㎚ 내부 채널(화살표 B)로 관찰되었다. 상기 입자 막대는, 대부분의 막대가 그의 표면이 작은 단백질성 밀도로 심하게 장식된 것을 제외하고, 도 28에서 관찰된 접합된 TMV와 크기 및 모양이 유사하였다(화살표 C). 상기 작은 단백질성 입자 중 일부가 또한, 상기 막대와 결합되지 않고 배경 중에서 관찰되었다(화살표 D). 도 27에 도시된 샘플 5는 다른 TEM 상들보다 우수하게 보이는데, 이는 가장 있음직하게는 접합에 앞서 바이러스 처리의 차이로 인한 것 같다. 상기 배치에 대해서, 상기 바이러스를 pH 5.50에서 제형화하고, 이어서 pH를 15분간 4.50으로 감소시키고, 접합 반응의 출발시에 다시 pH 5.50으로 복귀시켰다. 도 28 내지 30에 도시된 배치의 경우, 바이러스를 직접 pH 4.50으로 제형화하고 접합전에 밤새 유지시켰다.
도 28은 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 5(1:1 비의 TMV:HA, 로트 19UL-SG-001)의 TEM 상이다. 도 28에서, 다수의 막대-모양 입자가 약 65 ㎚ 내지 약 720 ㎚의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위(화살표 A) 및 가운데 약 4 ㎚ 내부 채널(화살표 B)로 관찰되었다. 상기 입자 막대는 크기 및 모양이 도 25에서 관찰된 유리 TMV NtK(샘플 2)와 유사하였다. 그러나, 도 25에 도시된 접합되지 않은 바이러스와 대조적으로, 도 28에서 관찰된 입자 막대는 단백질성 밀도로 보통으로 장식되었다(화살표 C). 상기 밀도는 모양 및 크기가 불규칙하였으며, 명백한 패턴없이 막대의 표면과 무작위로 결합하는 것으로 보였다. 상기 작은 단백질성 입자 중 일부가 또한, 상기 막대와 결합되지 않고 배경 중에서 관찰되었다(화살표 D).
도 29는 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 6(4:1 비의 TMV:HA, 로트 19UL-SG-002)의 TEM 상이다. 도 29에서, 막대-모양 입자가 약 25 ㎚ 내지 약 1000 ㎚ 초과의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위의 크기(화살표 A) 및 가운데 약 4 ㎚ 내부 채널(화살표 B)로 관찰되었다. 도 29에서 관찰된 상기 입자 막대는 치수가 앞서 접합된 샘플과 유사하였지만, 작은 단백질성 밀도(화살표 C)의 표면 장식 수준은 보통 내지 드문 범위였다. 상기 작은 단백질성 입자 중 일부가 또한, 상기 막대와 결합되지 않고 배경 중에서 관찰되었다(화살표 D).
도 30은 52,000x의 배율 및 200 ㎚의 스케일 바에서 샘플 7(16:1 비의 TMV:HA, 로트 19UL-SG-003)의 TEM 상이다. 도 30에서, 막대-모양 입자가 약 30 ㎚ 내지 약 1000 ㎚ 초과의 길이 및 약 18 ㎚ 내지 약 20.5 ㎚ 너비 범위의 크기(화살표 A) 및 가운데 약 4 ㎚ 내부 채널(화살표 B)로 관찰되었다. 도 30에서 관찰된 상기 입자 막대는 앞서 접합된 샘플과 전체적인 형태가 유사하였다. 그러나, 상기 막대는 단백질로 단지 드물게 장식되었거나(화살표 C) 전혀 장식되지 않았다. 단지 몇 개의 작은 단백질성 입자만이, 상기 막대와 결합되지 않고 배경 중에서 관찰되었다(화살표 D).
도 24 내지 30은 상기 1:1 비는 완전한 막대 장식을 나타내었고, 상기 4:1 비는 보통의 장식을 나타내었으며, 상기 16:1 비는 드문 장식을 나타내었음을 예시한다. 다르게 서술하자면, 상기 1:1 비는 심한 항원 장식(즉 보다 큰 밀도)의 HA 항원을 갖는 바이러스 막대를 생성시킨 반면, 상기 16:1 비는 각각의 막대상에 적은 항원 장식(즉 보다 작은 밀도)의 HA 항원을 갖는 바이러스 막대를 생성시켰다. 상기 접합 반응의 부산물로서, HA-HA 자기-접합체가, 주로 상기 1:1 비 반응에서 관찰되었다. 더욱 또한, 상기 1:1 반응과 비교하여, TEM 상뿐만 아니라 SDS-PAGE 반응 분석(데이터 도시 안 됨)에서, 상기 4:1 반응에서 보다 적은 및 상기 16:1 반응에서 훨씬 더 적은 유리 HA 또는 HA-HA 접합체가 나타났다. 즉, 상기 16:1 비에서 전체적으로 TMV 단독 막대에 대해 더 높은 HA의 접합 효율이 존재하였으나, 상기 1:1 반응보다는 막대당 적은 밀도의 HA가 존재하였다.
실시예 11 - 상이한 접합 조건의 침강 속도 분석
분석학적 원심분리("AUC")에서 측정된 바와 같은 침강 속도("SV")는 단백질 이종성 및 응집의 결합 상태에 관한 정보를 획득하는데 이상적인 방법이다. 구체적으로, 응집체 또는 상이한 올리고머를 상이한 침강 계수를 근거로 검출할 수 있다. 상기 방법은 또한 1 중량% 미만 수준의 응집체 또는 다른 부수적인 성분을 검출한다. 더욱 또한, SV는 상대적인 양의 종들의 양질의 정량분석을 제공하며 임의의 응집체에 대해 정확한 침강 계수를 제공한다.
자기-접합된 및 반응하지 않은 HA의 양뿐만 아니라 상이한 접합 조건을 갖는 TMV NtK상의 HA 점유량을 측정하기 위해서, 유리 항원, 유리 바이러스, 및 다양한 TMV:HA 비의 침강과 관련된 전체 신호를 SV-AUC를 사용하여 측정하였다. 하기의 샘플 및 설명을 표 12에 제공한다:
[표 12]
Figure pct00014
상기 스톡을 저온(동결시키지 않고) 출하하고 분석시까지 후속적으로 2 내지 8℃에서 보관하였다. 코닝(Corning)으로부터의 1X PBS를 샘플 희석을 위해서 및 참조 블랭크로서 사용하였다. 1X PBS로 샘플 1을 1:1 희석하고, 샘플 2 내지 7을 1:3 희석하여 침강속도 샘플을 생성시켰다. 상기 희석을, 샘플의 전체 흡광도가 흡광도 검출 시스템의 선형 범위내에 있도록 수행하였다.
방법 - 상기 희석된 샘플을 12 ㎜ 광학 경로길이를 갖는 2-채널 목탄-에폰 센터피스를 갖는 셀에 부하하였다. 1X PBS를 각 셀의 참조 채널에 부하하였다. 상기 부하된 셀을 분석 로터에 놓고, 분석용 한외원심분리기에 부하하고, 20℃가 되게 하였다. 이어서 상기 로터를 3000 rpm이 되게 하고 샘플을 스캐닝하여(280 ㎚에서) 적합한 셀 부하를 확인하였다. 샘플 2 내지 7의 경우, 상기 로터를 9,000 rpm의 최종 실행 속도가 되게 하였다. 스캔을 약 11시간 동안 가능한 한 빨리(3분마다) 상기 로터 속도에서 기록하였다(각 샘플에 대해 총 250 스캔). 샘플 1(유리 HA)의 경우, 상기 로터를 35,000 rpm이 되게 하고 스캔을 5.3시간 동안 4분마다 기록하였다. 이어서 데이터를 문헌[Schuck, P. (2000), "Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling," Biophys. J. 78, 1606-1619]에 기재된 c(s) 방법을 사용하여 분석하였다. 상기 방법을 사용하여, 분해능을 향상시키기 위해 상기 데이터에 대한 확산의 영향을 모델링하면서 원(raw) 스캔을 직접 적합시켜 침강 계수의 분포를 유도하였다.
결과 및 논의 - 샘플 1 내지 7에 대한 고해상 침강 계수 분포를 도 31 내지 37에 도시한다. 이들 도면에서, 수직 축은 농도를 제공하며 수평 축은 침강 계수에 기초한 분리를 제공한다. 각각의 분포를, 각 피크 아래 면적이 그 종의 분획을 제공하도록 전체 곡선 아래 면적을 1.0(100%)으로 설정함으로써 표준화하였다. 샘플 2 내지 7은 광범위한 침강 계수에 걸쳐 침강하는 물질을 함유하므로, 데이터 분석은 2000 Svedburg 단위(S)만큼 빠르게 침강하는 종을 포함하도록 촉구되었으며, 따라서 수평축은 로그 스케일이다. 로그 스케일이 피크의 가시적인 면적을 왜곡할 수도 있는 효과를 보상하기 위해서, 수직 축에 침강 계수를 곱하였으며, 상기 계수는 상대적인 피크 면적을 정확하게 스케일링한다. 샘플 1(유리 HA)에 대한 데이터는 전통적으로 선형 침강 계수 스케일을 사용하여 제시된다.
도 31은 샘플 1(HA 단독, 로트 19S-G-001)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이다. 유리 항원은 바이러스보다 크기가 훨씬 더 작기 때문에, 상기 샘플을, 크기 분포를 적합하게 특성화하기 위해서, 샘플 2 내지 7(9,000 RPM)보다 훨씬 더 빠른 로터 속도(35,000 rpm)로 분석하였다. 도 31에 도시된 바와 같이, 샘플 1은 어느 정도 동종성이며, 8.967 S에서 73.3% 주 피크를 제공한다. 상기는 HA 항원-단독 샘플에 대해 예상된 결과였다. 주 경계의 너비와 함께 상기 침강 계수는 상기 주 피크 종이 약 222 kDa의 몰 질량을 가짐을 암시하며, 이는 상기 주 피크가 대충 예상된 약 70 kDa 단량체의 HA 삼량체에 상응함을 가리킬 수 있다. 상기 침강 계수가 단량체에 상응할 물리적인 가능성은 없으며; 대신에 상기 주 피크는 단량체보다 큰 올리고머 상태에 상응한다. 하기 표 13, HA3 싱가포르 방출에 대한 SEC HPLC 데이터에 나타낸 바와 같이, >90%의 HA가 삼량체 상태로 식별되었으며, 이때 4개의 샘플 중 3개는 50% 초과의 삼량체화를 가졌다.
[표 13]
Figure pct00015
도 31에 또한 도시된 바와 같이, 주 피크보다 더 빠르게 침강하는 7개의 작은 피크가 검출되었으며, 이들은 함께 전체 침강 흡광도의 6.2%를 나타낸다. 추정상 상기 2개의 피크는 고분자량 불순물이라기 보다는 생성물 응집체를 나타낸다. 12.4 S(4.25%)에서 주요 응집체 종은 단량체보다 1.4배(이는 이량체에 대해 통상적으로 관찰되는 1.4 내지 1.5의 범위 내에 있는 비이다) 더 빠르게 침강한다. 상기 비는 상기 종이 주 피크 물질의 이량체(가능하게는 약 70 kDa 단량체의 육량체)임을 암시하지만, 그의 침강 계수는 상기가 주 피크 물질의 고도로 연장된 또는 부분적으로-풀린 삼량체(가능하게는 약 70 kDa 단량체의 구량체)임을 또한 암시할 수 있다.
도 31에서, 15.3 S(0.96%)의 다음 피크는 단량체보다 1.7x 더 빠르게 침강하며, 이는 주 피크 물질의 삼량체를 암시한다. 30.9 S보다 큰 어떠한 침강 계수에 대한 흡광도도 검출되지 않았다. 또한, 상기 주 피크보다 더 느리게 침강하는 3개의 부 피크가 또한 2.8 S(2.81%), 4.5 S(12.44%), 및 6.0 S(4.94%)에서 검출되었다. 이들 부 피크 중에서, 4.5 S의 피크가 가장 항원 단량체에 상응하는 듯하다.
도 32는 샘플 2(유리 TMV NtK, 로트 18HA-NTK-001)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이다. 도 32에 도시된 바와 같이, 약 60 S 미만에서 침강 물질은 검출되지 않았다. 상기 샘플은 매우 이종성인 것으로 보였으며, 229 S(30.9%)에서 침강하는 피크가 가장 풍부하였다. 두 번째로 가장 풍부한 피크는 191 S(28.7%)에서 검출되었다. 피크가 완전히 조립된 바이러스에 상응하는지는 명확하지 않다. 또한, 전체 신호의 25.3%가 229 S 내지 2,000 S에서 침강하는 것으로 관찰되었으며, 이때 가장 큰 침강 계수가 본 실시예 11에서 허용되었다. 약 60 S 내지 2000 S의 부분-분해된 피크가 무엇을 나타내는지는 명확하지 않다.
도 33 내지 37은 바이러스-항원 접합체에 대한 표준화된 침강 계수 분포를 도시한다. 이들 각각의 도면은 침강하지 않은 약 0.15 OD의 유의적인 흡광도를 나타낸다. 이는 모든 남아있는 물질을 펠릿화하기 위해서, 각 실행의 완료후에 로터 속도를 35,000 RPM으로 증가시킴으로써 확립되었다. 상기 물질은 유리 항원에서도 유리 TMV NtK 샘플에서도 관찰되지 않았다. 그러나, 상기 물질은 침강하지 않았기 때문에, 측정된 크기 분포의 결과에 영향을 미치지 않았다.
도 33은 샘플 3(1:1 비의 TMV 대 HA, 로트 19UL-SG-004)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이다. 도 33에 예시된 바와 같이, 침강 계수의 결과는 약 40 S 내지 2000 S의 범위이며, 유리 바이러스에 대해 관찰된 경우와 유사하다(도 33에 도시됨). 3개의 피크가 또한 1의 침강 계수 범위에서 관찰되었다: 40 S: 9.9 S(28.3%), 18.7 S(7.8%), 및 34.5 S(1.0%). 9.9 S에서 관찰된 피크는 유리 HA 샘플에서 관찰된 주 피크에 상응할 수 있다(도 32에 도시됨). 보다 작은 피크의 다양성은 HA-HA 자기-접합 사건을 반영할 수 있다.
도 34는 샘플 4(1:1 비의 TMV 대 HA, 로트 18TAP-SG-002)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이고, 도 35는 샘플 5(1:1 비의 TMV 대 HA, 로트 19UL-SG-001)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이다. 도 34 및 35에 도시된 결과는 샘플 3에 대해 논의된(및 도 33에 도시된) 결과와 유사하다. 그러나, 일부 현저한 차이가 관찰되었다. 먼저, 상기 로터 속도에서 불량한 분해능으로 인해 유리 항원 샘플(1 내지 40 S로부터)에 대한 차이에 대해 언급하기 어렵다. 그럼에도 불구하고, 도 34 및 35는 샘플 3보다 더 많은 전체 신호가 40 S 내지 2,000 S(바이러스 결합된 물질을 가리킨다)로부터 제시됨을 나타낸다.
도 36은 샘플 6(4:1 비의 TMV 대 HA, 로트 19UL-SG-002)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이고, 도 37은 샘플 7(16:1 비의 TMV 대 HA, 로트 19UL-SG-003)에 대한 표준화된 침강 계수 분포이다. 도 36은 91.1%의 전체 바이러스-결합된 물질(즉 바이러스-항원 접합체)을 도시하고 도 37은 99.4%의 바이러스-결합된 물질(즉 바이러스-항원 접합체)을 도시한다.
도 33 내지 37에 도시된 바와 같은, 바이러스-항원 표준화된 침강 계수 분포에 대한 결과를 표 14에 제시한다. 앞서 나타낸 바와 같이, 다수의 실시태양 및 대안에 따라, 1 내지 40 S 사이의 분획들은 HA 단량체/삼량체 퍼센트를 가리키고, 40 내지 2000 S 사이의 분획은 TMV NtK-HA 접합체 퍼센트를 가리킨다.
[표 14]
Figure pct00016
표 14의 결과는 1:1 비가 4:1 및 16:1 비에 비해, HA 및 HA 생성물의 보다 많은 자기-접합을 가짐을 나타낸다. 또한, TMV:HA 비의 증가는 TMV-접합 사건에서 HA 생성물의 사실상 완전한 관여를 생성시킨다(샘플 7에서 거의 100% 접합에 접근한다).
다수의 실시태양 및 대안에 따라, TMV NtK 대 HA 비를 1:1에서 16:1로 증가시킴으로써, 접합 반응에서 HA의 양을 감소시킨 결과 (1) 실시예 10 및 도 24 내지 30에 의해 관찰된 바와 같이, 각각의 TMV 막대상의 HA 항원의 응집이 감소되고; (2) 도 31 내지 37 및 표 14에 도시된 바와 같이, 자기-접합 및 반응하지 않은 HA 사건의 양이 거의 0으로 감소하며; (3) 도 31 내지 37 및 표 14에 도시된 바와 같이, 자기-접합 및 반응하지 않은 HA 사건에 비해, HA의 TMV에의 결합(백분율로서)이 증가한다.
실시예 12 - 마우스에서 면역 반응
본 발명의 바이러스-항원 접합체의 투여에 따른 면역 반응을 측정하기 위해서, 마우스에게 근육내 주사를 통해 백신으로서 상기 접합체를 투여하였다. 각각의 백신은, 연구 0 및 14일째에 동물의 대부분에게 투여된(대조용 동물은 완충제 단독, TMV 단독, 또는 HA 단독이 투여되었다) 본 명세서에 기재된 바와 같이 1:1(TMV:HA)의 비로 생성된 TMV:HA 접합체였다. 상기 투여된 백신은 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, 15, 7.5 또는 3.75 mcg(μg)의 항원을 수용하였다. 하나의 코호트는 7일째에 샘플을 수령하였고, 또 다른 코호트는 14일 및 21일째에, 세 번째 코호트는 28, 42 및 90일째에 수령하였으며, 이때 상기 샘플들은 헤마글루틴화 억제(HAI) 분석이 수행되었다.
상기 분석을 근거로, 7일 또는 14일째에 어떠한 백신에 대해서도 임의의 동물로부터 측정 가능한 반응이 발생하지 않았다. 그러나, 초기 반응이 21일째에 일부 동물에서 관찰되었다. 구체적으로, 10/27 동물이 H1N1 백신(인플루엔자 A/미시간/45/2015(H1N1pdm09))에 대해 낮은 수준의 반응(상기 중 단지 한 마리만이 >80 HAI 역가)을 나타내었다. 또한, 22/27은 H3N2 백신(인플루엔자 A/싱가포르/INFIMH-16-0019/2016)에 대해서 낮은 수준의 반응(상기 중 단지 2마리만이 >80)을 나타내었다. 28일째에, H1N1 백신에 대해 측정 가능하게 반응하는 상기 코호트내 동물의 수는 8/29였으며, 이때 단일 동물이 80 HAI 역가였고 다른 모두는 보다 작았다. H3N2 백신의 경우, 측정가능하게 반응하는 수는 14/29였으며, 이때 또한 단일 동물이 80 HAI 역가였고 다른 모두는 보다 작았다.
가장 현저한 결과는 42일 및 90일째에 채취한 혈액 샘플로부터 관찰되었으며, 이를 하기 표 15에 나타낸다. 상기 표에서, 평균의 표준 오차(SEM)를 평균 및 반응하는 동물의 분획(Fr.Resp.)과 함께 제공한다. 각각의 코호트에서, 마우스의 일부는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 백신(각각 B/콜로라도/06/2017(V) 및 B/푸켓/3073/2013(Y))을 수령하였다. B-형 인플루엔자 바이러스 및 상응하는 HA 면역원은 A형 HA 면역원만큼의 효율 및 유효성으로 마우스에서 HAI 역가를 생성시키지 않는 것으로 공지되어 있기 때문에, 예상된 바와 같이 상기 날들 중 어느 날에도 상기 동물에서 반응이 검출되지 않았다.
[표 15]
Figure pct00017
앞서 기재된 면역 반응 연구와 별도로, 및 적합한 바이러스 대 항원 비의 면에서 본 발명의 시스템을 추가로 평가하기 위해, 마우스에서의 체액 면역 반응을 하기에 나타내는 바와 같이 대조용과 함께 다양한 TMV:HA 접합체 비(즉 1:1, 4:1, 16:1)의 인플루엔자 A 항원 및 인플루엔자 B 항원 모두의 백신화에 이어서 평가하였다. 이러한 방식으로, 다양한 접합 비 및 면역 반응에 대한 그의 효과를 연구하였다. 백신접종을 수용한 마우스에게 연구 0일 및 14일째에 주사를 통해 등의 피하 부위에 15 mcg HA를 투여하였다. 이어서 상기 백신화에 대한 혈청 항체 반응을 HA-특이 활성에 대해 분석하였다. 표 15(포획 단백질로서 H3 인플루엔자 바이러스 사용됨) 및 16(포획 단백질로서 재조합 H3 단백질 사용됨)은 마우스의 그룹(그룹당 12마리 마우스), 및 투여된 작용제를 나타내며, 이때 각 표의 우측 컬럼은 ELISA 항체(Ab) 역가 결과를 제시한다.
[표 16]
Figure pct00018
도 38은 표 16과 관련된 산포도이며, 0, 1:1, 4:1 및 16:1(TMV:HA)의 비에서 백신 투여에 따른 H3:HA Ab 역가의 그래프 분석을 제공한다. 도 39는 또한 코팅제로서 재조합 H3 항원(표 17) 또는 항 인플루엔자 A H3 항원 항체와 결합하는 포획 단백질로서 포획 H3 바이러스(표 17)를 사용하여, 항원-관련 Ab 역가의 기하평균 시험 결과를 그래프에 의해 예시한다. 밀도(HA에 의해 점유된 TMV의 표면적)에 관하여, 상기 3개 비의 추세는 TEM 및 AUC 분석에 의해 입증된 바와 같이, 1:1(가장 치밀함)>4:1>16:1(최저로 치밀함)로 진행한다. H3 항원에 의해 획득된 ELISA 결과를 제시하는 상기 도면에서, 최고의 면역 반응은 최저로 치밀한 접합에 의해서 관찰되었다. 즉, 면역 반응의 추세는 16:1>4:1>1:1이었으며, 상기 밀도의 추세와 역으로 진행하였다. 따라서, 놀랍게도 상기 TMV:HA의 비에서, 보다 적은 접합 밀도는 보다 양호한 면역 반응을 제공하게 되는 것으로 밝혀졌다. 항원성이 최대의 HA 접합 사건과 상관이 없다는 상기 놀라운 발견에 대해 가능한 설명은 하기를 포함한다: (1) 밀도가 비교적 더 낮을 때 보다 균일한 항원이 반응하지 않은 또는 자기-접합된 단백질을 덜 갖거나 갖지 않고; (2) 접합된 항원의 보다 효율적인 가공 및 보다 보존된/균일한 항원 입체형태가 존재할 수 있었으며; (3) TMV 막대(예로서)는 보다 많은 항원 제시 세포가 주사 부위로 이동하도록 자극하고, 부착된 항원, 또는 상기 요인들의 일부 조합의 가공을 자극할 수 있다. 그러나, 단지 TMV 입자의 존재만이 접합에 대한 필요성을 대체하는 것은 아님에 유의한다(예를 들어 표 14 및 15를 참조하시오).
인플루엔자 A H3 항원 외에, 인플루엔자 B 항원을 또한, 재조합 인플루엔자 B 푸켓 항원 및 그의 상응하는 항체의 결합 성향을 사용하여 연구하였다(B-푸켓 HA). 하기 표 17은 평균 ELISA Ab 역가의 결과를 근거로 16:1>4:1>1:1을 나타내는 것이 명확하지 않다는 이 부분의 연구 결과를 제시한다.
[표 17]
Figure pct00019
그렇기는 하지만, 상기 16:1 비는 가장 높은 평균 항체 역가를 나타내었다. 따라서, 발명자는 밀도와 면역 반응간의 동일한 관계를 인플루엔자 B 항원(B-푸켓 HA)의 연구에 적용함을 예견하는 것이 합리적인 것이라 여긴다. 즉, H3 항원의 결과에서와 같이, 면역 반응은 덜 치밀한 형태의 접합체의 경우 더 높을 것이다. 추가로, 4:1 비에 대한 접합 반응이 접합 중 있을 수 있는 이상으로 인해 다른 비에 대한 반응처럼 진행하지 않았을 것으로 여겨지는 이유와, 전자 현미경분석도 한외원심분리 분석도 상기 샘플상에서 수행되지 않았다는 사실에 대한 이유가 존재한다. 어쨌든, 여기에서 데이터는 3개의 비 모두에서 면역 반응을 나타낸다. 면역 반응이 다수의 비에서 성취되었다는 사실은 상기 시스템의 확고성이 어느 하나의 특정한 비로 묶이지 않음을 분명히 보여준다. 특정한 TMV-접합된 백신에 의해 나타나는 바와 같은 이러한 유연성은 아마도 상기 시스템이 상기 연구에 포함된 H3 및 H1 항원 외에 다른 항원을 TMV에 접합시키는 경우뿐만 아니라 TMV 외에 다른 바이러스 담체가 상기 담체에 사용되는 경우 모두 잘 작용할 것이라는 추가적인 암시를 제공한다.
임상적 유용성에 관하여, 본 명세서에 기재된 다수의 실시태양 및 대안 중 어느 하나에 따라 접합된 생성물은, 정제된 항원을 정제된 바이러스를 통해, 예를 들어 비제한적으로 실시예 7, 9, 10, 11 및 12에 기재된 바이러스-항원 접합체를 통해 전달함으로써 백신으로서 사용될 수 있다. 더욱 추가로, 본 개시내용의 실시태양은, 임의의 바이러스-단백질 접합체 조성물(그의 접합은 본 명세서에 제공된다)로부터 제조되는, 적합한 완충제 및 첨가제와 함께 임의의 수의 형태(예를 들어 바이알)로 패키징된 임의의 백신 생성물을 포함한다. 이에 관하여, 실시태양은 상기와 같은 백신 생성물을 인간 또는 동물 환자에게 제공되는 단위 용량의 형태로, 예를 들어 비제한적으로, 임상적으로 나타내는 한, 피하, 근육내, 피내 투여, 및 코를 포함한 경로를 통한 주사기 또는 분무에 의한 투여뿐만 아니라, 입에 의한 경구 및/또는 국소 투여로 전달할 수 있는 것들을 포함한다. 비제한적인 예로서, 본 명세서의 실시태양의 폭 및 범위로부터 이탈됨 없이, TMV의 크기(전형적으로 18 ㎚ x 300 ㎚) 및 그의 막대-같은 모양은 항원제시세포(APC)에 의한 항원 흡수를 촉진하며, 따라서 T 세포(예를 들어 Th1 및 Th2)의 면역성을 향상시키는 작용을 하고 표면 접합된 서브유닛 단백질에 항원보강제 활성을 제공한다. 상기 활성은 또한 바이러스 RNA/TLR7 상호작용을 통해 자극된다. 결과적으로, 백신 흡수의 병용 효과는 APC의 활성화를 직접 자극한다. 체액 면역은 전형적으로 피하 및 비내 전달을 통해 IgG1과 IgG2 하위부류간에 균형을 이룬다. 점막 백신 전달시, 반응은 또한 상당한 전신 및 점막 IgA를 포함한다. 세포 면역성은 또한 매우 확고하여, 생 바이러스 감염 반응과 유사한 항원-특이적 분비를 유도한다. 전항원 융합은 인간 백혈구 항원(HLA) 변화량에 대한 우려없이, 고유의 세포독성 T 림프구(CTL) 에피토프 가공을 허용한다.
현재 실시태양에 따른 다중-세트 정제 플랫폼과 관련된 광범위하고(체액 및 세포) 증대된(진폭 및 유효성) 면역 반응은, TMV 접합 없이 시험된 서브유닛 단백질(세포 또는 체액 면역을 거의 또는 전혀 유도하지 않는다)과 첨예하게 대조된다. 이들 면역 반응의 영향은 현재 실시태양에 따른 다중-세트 플랫폼을 통해 생성된 백신이 단일 용량 백신으로서 매우 보호성인 반응을 촉진하고 다른 통상적인 백신 플랫폼에 의해서 제공되지 않는 속도 및 안전성을 제공하는 것이다. 실제로, 상기 접합 플랫폼은 광범위한 비내에서 병용되는 다양한 바이러스 및 단백질(항원 포함)에 대해 작용하는 것으로 나타났으며 다양한 용량으로 성공적으로 투여된다(이는 다시 상기 시스템의 강건성을 가리킨다). 현재 실시태양에서 백신 생성을 위한 다중-세트 플랫폼의 추가적인 장점은 하기를 포함한다: 병원체 공격에 대한 전신 면역 보호를 위한 주도적인 항원-자극 접근법인 상기 플랫폼은 질병 병원체(바이러스 당단백질 또는 분비되지 않은 병원체 항원 포함)로부터 항원 도메인을 생성시키기에 매우 적합할 수 있으며, 상기 플랫폼은 바이러스 및 세균 병원체 모두에 대한 효능 있는 백신 플랫폼으로서 작용한다.
백신 적용에 관한 장점 외에, 현재 실시태양에 따른 다중-세트 플랫폼을 통해 정제된 식물 바이러스 입자를 다양한 약물 전달 목적을 위해 제형화할 수 있다. 이러한 상이한 목적은 하기를 포함할 수 있다: 1) 면역 요법 - 치료학적 항체의 바이러스 입자 표면에의 접합 및 그의 전달을 통해 세포독성 효과를 향상시킨다; 2) 유전자 요법 - 유전자 변형을 위한 특정 세포 유형내로의 도입을 위해 특정 핵산의 부하를 통해, 및 3) 약물 전달 - 표적화된 종양 전달을 위해 바이러스 입자내로의 화학요법제의 부하를 통해.
본 명세서에 논의된 방법의 다수의 장점의 간단한 예로서, 다수의 실시태양에 따른 다중-세트 플랫폼을, 먼저 정제된 바이러스를 상기에 논의된 바와 같이 pH 이동에 노출시킴으로써 팽창을 야기하여 약물 전달 도구로서 사용할 수 있었다. 후속적으로, 상기 조건의 바이러스를 농축된 화학요법제, 예를 들어 독소루비신의 용액과 함께 배양시킬 것이며, 이어서 pH를 중성으로 복귀시켜 상기 바이러스가 그의 팽창-전 상태로 복귀되게 하고 이에 의해 상기 화학요법 분자를 포집한다. 다음에, 상기 바이러스 입자를, 비제한적으로 종양의 표적화된 치료를 위한 주사를 포함하는 그룹 중에서 선택된 전달 기전에 의해 유기체로 전달할 수 있었다.
추가로, 본 명세서에 함유된 실시태양은 단백질 또는 항원으로부터의 숙주 세포 오염물질의 분리를 이온-교환 크로마토그래피 또는 다른 화학적 분리 단계에 의해 수행하는 것들을 포함하며, 어느 하나의 단백질, 항원 또는 바이러스에 특별하게 관련된 분리 방법은 없다. 방법 및 조성물 모두에 관한 본 명세서의 실시태양은 상기 바이러스가 적색 클로버 모자이크 바이러스; 코멜리나 황색 모틀병 바이러스, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 대두 백화된 모틀병 바이러스, 카사바 입맥 모자이크 바이러스, 벼 퉁그로 바실리포름 바이러스, 페튜니아 입맥 투화 바이러스, 옥수수 위축 바이러스, 비트 컬리 탑 바이러스, 빈 골든 모자이크 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스, 담배 위축 바이러스, 브롬 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 비트 황색 바이러스, 상추 감염성 황색 바이러스, 동부 모자이크 바이러스, 잠두 위조 바이러스 1, 담배 둥근무늬 바이러스, 감자 바이러스 Y, 라이그라스 모자이크 바이러스, 보리 황색 모자이크 바이러스, 파스닙 황색 얼룩 바이러스, 벼 퉁그로 구형 바이러스, 카네이션 모틀병 바이러스, 카네이션 둥근무늬 바이러스, 옥수수 황백화 모틀병 바이러스, 담배 괴사 바이러스, 토마토 덤불 위축 바이러스, 사과줄기홈 바이러스, 카네이션 잠복 바이러스, 완두 돌출 모자이크 바이러스, 토양-전염 밀 모자이크 바이러스, 보리 줄무늬 모자이크 바이러스, 라즈베리 덤불 왜소 바이러스, 보리 황색 왜소 바이러스, 옥수수 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 클로버 모자이크 바이러스, 남부 빈 모자이크 바이러스, 벼 줄무늬 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 담배 래틀 바이러스, 사과 황백화 잎 반점 바이러스, 순무 황색 모자이크 바이러스, 당근 모틀병 바이러스로 이루어진 군 중에서 선택되는 것들을 포함한다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 반경을 갖는 TMV인 바이러스의 경우, 상기 단백질은 항원(비제한적으로 HA를 포함하여)일 수 있으며, 상기 바이러스와 항원을 혼합하는 단계를, 상기 TMV 반경을 활성화 단계 동안 적어도 2.75의 인자까지 증가시킨 후에 수행한다. 한편으로, 다시 비제한적으로, 상기 바이러스와 항원을 혼합하는 단계를, 상기 TMV 반경을 활성화 단계 동안 적어도 195 ㎚까지 증가시킨 후에 수행한다. 간단히, 방법, 조성물, 및 백신 생성물의 목적을 위해서, 모든 가능한 조합, 변화 및 대안이 본 개시내용 내에 포함된다.
따라서, 상기 설명은 (i) 바이러스의 식물-기반 제조 및 정제; (ii) 항원의 식물-기반 제조 및 정제; 및 (iii) 백신 및 항원 담체로서 치료학적으로 이로운 식물 밖에서 바이러스-항원 접합체의 형성; 및 (iv) 정제된 바이러스 및 정제된 항원을 포함하는 치료학적 백신의 전달을 위한 다수의 실시태양 및 다수의 대안의 접근법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 실시태양은, 제시되거나 첨부된 도면에 예시된 바와 같은 교시 및 기재의 세부사항에 대한 그의 적용으로 제한되지 않음을 알 것이다. 오히려, 본 명세서에 기재되고 청구된 바와 같은 본 발명의 실시태양 및 대안은 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있음을 알 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 단어 및 어구는 기재를 위한 것이며 제한으로서 간주되어서는 안 됨을 알아야 한다. 본 명세서에서 "포함하는", "구성하는", "예를 들어", "함유하는" 또는 "갖는" 및 이들 단어의 변형의 사용은 그 뒤에 나열된 항목, 및 그의 균등물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포함함을 의미한다.
따라서, 상기 다수의 실시태양 및 대안의 기재는 본 명세서에 개시된 것의 범위에 대한 제한으로서 제공되기 보다는 오히려 예시를 의미한다. 본 명세서의 기재는 총 망라를 의도하는 것도 아니고, 상기 실시태양의 이해를 개시된 정확한 형태로 제한하고자 하는 것도 아니다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 이들 실시태양의 변형 및 변화가 상기 교시 및 기재에 비추어 합리적으로 가능함을 알 것이다.

Claims (15)

  1. 바이러스를 약 5.5 이하의 pH 환경에 위치시킴으로써 상기 바이러스를 활성화시키는 단계; 및
    상기 활성화 단계 후에 상기 바이러스 및 단백질을 접합 반응으로 혼합하여 접합체 혼합물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 단백질 및 바이러스의 접합 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    바이러스 활성화 단계가 상기 바이러스상의 표면-노출된 리신 잔기를 화학적으로 변형시켜 단백질의 아민-표적화된 접합을 촉진시킴을 또한 포함하고, 상기 바이러스 활성화 단계가 약 18시간 내지 약 72시간의 기간 동안 완충제 중에서 수행되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단백질이 항원인 방법으로서, 상기 항원을 정제시키고 상기 항원을 혼합 단계에 앞서 약 6.5 이하의 pH에 노출시키는 하위-단계에 의해 상기 항원을 제조함을 또한 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    소스 항원으로부터 항원을 수확함을 또한 포함하는 방법으로서, 상기 항원의 정제가 상기 항원으로부터 세포 찌꺼기를 제거하고, 상기 항원을 농축시키고, 하나 이상의 화학적 분리를 수행하여 상기 항원으로부터 숙주 세포 오염물질을 분리시키고, 상기 항원에 친화성 크로마토그래피를 수행하여 상기 항원을 용출시키고, 상기 항원에 다중-모드 크로마토그래피를 수행하여, 체류물로서 불순물과 투과물로서 항원 사이의 크기 차이를 근거로 상기 항원으로부터 잔류 불순물을 분리시킴을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스를 다공성 필터를 포함하는 접선흐름 여과 장치에 통과시켜 상기 바이러스를 정제하고, 하나 이상의 상기 바이러스를 다공성 멤브레인을 포함하는 막성 여과 장치에 통과시켜 농축시킴을 또한 포함하는 방법.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    단백질이 인플루엔자 헤마글루티닌 항원(HA)을 포함하는 항원이고, 바이러스가 담배 모자이크 바이러스(TMV)인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    TMV 및 HA를 약 4:1 이상의 비로 혼합하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    TMV 및 HA를 약 1:1 내지 4:1의 비로 혼합하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합 반응을 유리 아민을 함유하는 하나 이상의 액체를 사용하여 급냉시킴을 또한 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    급냉 단계에 이어서, 체류물로서 잔류 불순물과 투과물로서 접합체 혼합물 사이의 크기 차이를 근거로 상기 접합체 혼합물로부터 상기 잔류 불순물을 분리시킴을 또한 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    접합 반응이, 접합되지 않은 고유 분자량의 바이러스 코트 단백질의 약 50% 이상의 감소를 성취하는 방법.
  12. 제1항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 TMV이고, 상기 TMV가 반경을 가지고, 상기 바이러스 및 단백질의 혼합 단계가, 상기 TMV 반경이 활성화 단계 동안 2.75 이상의 인자만큼 증가된 후에 수행되는 방법.
  13. 제1항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 TMV이고, 상기 TMV가 반경을 가지고, 상기 바이러스 및 단백질의 혼합 단계를, 상기 TMV 반경이 활성화 단계 동안 약 195 ㎚ 이상까지 증가된 후에 수행되는 방법.
  14. 바이러스-항원 접합체를 포함하는 조성물로서, 상기 항원이 인플루엔자 헤마글루티닌 항원(HA)을 포함하고 약 50% 이상의 삼량체 형성을 나타내는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    바이러스가 담배 모자이크 바이러스(TMV)인 조성물.
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