JPS60172933A - グリコシド含有キヤリアに結合された抗原及び／又は抗原決定基から成る免疫原の製法 - Google Patents

グリコシド含有キヤリアに結合された抗原及び／又は抗原決定基から成る免疫原の製法

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JPS60172933A
JPS60172933A JP59221893A JP22189384A JPS60172933A JP S60172933 A JPS60172933 A JP S60172933A JP 59221893 A JP59221893 A JP 59221893A JP 22189384 A JP22189384 A JP 22189384A JP S60172933 A JPS60172933 A JP S60172933A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キャリアに結合している抗原及び／又は抗原
決定基からなる免疫原の製法及びこれらの免疫原を含む
ワクチンに係る。
ウィルス、バクテリア、寄生体等の病原性有機体による
感染からヒト及び動物を保護するために、免疫化が広く
行なわれている。長期間に亘り保護が持続する能動免疫
化が好ましい。能動免疫化は、病原性有機体の抗原を保
護ずべき各個体に投与することによって行なわれる。は
とんどの場合、これは病原体の不活化又は弱毒化株を接
種することによりなされる。不活化株の接種の場合には
、この不活化の過程で生起する抗原の部分的変性のため
免疫化力がむしろ低い場合が多い。病原菌の弱δ化株の
接種の場合には、これらの株の成る種の病原性の危険が
残る。
それ故、より安全で且つより効果的な能動免疫化法が望
まれている。１つの可能性は、例えば、完全な病原性有
機体の替わりに抗原だけを専ら含む調製物を接種するこ
とである。この場合、精製度を極めて高くづること及び
特に例えばウィルス遺伝物質を安全に除去することがし
ばしば困難である。最近、抗原の一次及び空間構造に関
する情報が増え続けてるとともに、能動免疫用免疫原と
して、可能な限り小さい抗原フラグメントすなわちいわ
ゆるｖＬ原決定基を利用する方法がめられている。抗原
決定基は抗原の一部であり、該抗原に対づる特定タイプ
の免疫グロブリンを認識する部位として作用する。完全
抗原の分割により得られるこのような小さいフラグメン
トは抗原そのものを精製するよりも精製が簡単である場
合が多い。またこのような小さいフラグメントは合成調
製ができる番まどに充分小さい。
しかしながら、遊離的に溶解している抗原及び抗原決定
基を接種すると、しばしば免疫化レベルが非常に低いと
いう大きな欠点を残し“Ｃいる。
抗原又は抗原決定基を主１アリアに結合さｌた免疫原を
接種することにより、非常に良い好成績で免疫化が行な
われている。この目的のために用いられる公知のキャリ
アは具体的には免疫原高分子物質例えば破傷層トキソイ
ド、アオガイヘモシアニン（Ｋｌ−Ｈ）、マルチ−ポリ
（ＤＬ−アラニル）−ポリ（Ｌ−リジン）、Ｄ−アミノ
酸共重合体等Ｃある。しかしながら、抗原又は抗原決定
基はこのようにより強い免疫原性を示すようにされると
いえども、完全なままの微生物のような天然の抗原等に
較べると、その免疫原性はなお幾分か低い。更に用いら
れる高分子キャリアはヒト投与に適しているとはいい難
く、且つ、例えばＫ　Ｌ　ｌ−１は該材料が非常に高価
なので商業的には殆んど魅力がない。
本発明に於い−Ｃ１今までに知られているキＡ７リアが
存在Ｊる免疫原よりも実質的により強い免疫化力を右づ
る、新規な免疫原が知見された。本発明の免疫原に用い
るギＡ７リアは更に非発熱性であり、公知のｎ分子キＡ
７リアよりも商業的に魅力あるものである。
本発明の免疫原の製法の特徴は、抗原又は抗原決定基又
はその誘導体を、親水性部分と疎水性部分とをイｊする
少なくとも１種類のグリコシドと複合化した疎水性化合
物の反応基に結合し、得られた免疫原粒子を任意に安定
化させること及び／又は消化分解から保護することであ
る。
疎水性部分及び親水性部分を有するものであれば、どの
ようなグリコシドでも利用可能である。好ましくは、Ｉ
Ａ、　ｔｌｅｒｚ、　Ｈ，Ｇｒ　ｉ　５ｅｂａｃｈ及び
６．−８Ｋｉ　ｒｂｙ編Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ　ｄ
ｅｒ　Ｃｈｅｍｉｅｏｒｇａｎｉｓｃｌｌｅｒ　Ｎａｔ
ｕｒｓｔｏｆｆｅ、　Ｖｏｌ。
３０（１９７３）にオイて’Ｃｈｅｍｉｅ　ｕｎｄ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｅ　ｄｅｒ　５ａｐｏｎｉｎｅ”と題して
Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ及びＭｕｆｆが記載しているような
サポニン、特に高分極性サポニン、格別には分極性酸性
ビスーデスモシドのような分極性トリプルペンーサポニ
ン、例えばキラヤ皮からのサポニン抽出物、アラＯシト
Ａ、チクセツ（Ｃｈｉｋｕｓｅｔｓｕ）　−＋）ボニン
ｔＶ、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）　−ｔｊ　Ｉ
Ｊ　コシトＣ。
チクセツ（Ｃｂｉｋｕｓｅｔｓｕ）−サポニン■、イノ
コズチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ）−サポニンＢ、キン
センカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）−グリコシドＡ、アラロ
シドＢ、アラロシドＣ１Ｐｕｔｒａｎｊｉａ−サポニン
ｇ、　ＢｅｒＳａｌａサボニシド。
Ｐｕｔｒａｎｊｉａ−サポニン夏ｖ、トリコシドＡ、　
ｔ−リフシトＢ、サボナシドＡ、　ｔ−リコシドＣ，ジ
ブソシド。
ヌタノシド、ジアンソシドＣ，サボナシドＤ、セイヨウ
トヂノキ（＾ｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓｔｏｎ
ｕｍ）からのニスキン又ハナデシＤ　（Ｇｙｐｓｏｐｈ
ｉｌｌａ　ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ）がらのサボアルビン並
びに特にキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ　５ａｐｏｎａｒｉ
ａ　Ｈｏ１ｉｎａ）からのサポニン抽出物、好ましくは
に、Ｄａｌｓｇａａｒｄの方法（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａ
ｄｊｕｖａｎａｔｓ”、Ｂｕｌｌ、ｏｆｆ。
ｉｌ、［ｐｉｚ７７　（７−８）、１２８９−１２９５
（１９７２））により調製されるＤＱ抽出物及びに、　
Ｄａｌｓｇａａｒｄの方法（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊ
ｕｖａｎｔｓ　［１χ八ｒｃｔ＋ｉｖ　ｆｉｉｒ　ｄｉ
ｅ　ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆ。
ｒｓｃｈｕｎ（Ｊ　４４，２４３−２５４（１９７４）
）により調製されるＱｕｉｌＡ等が用いられる。
グリコシドの混合物もまた使用することができる。
本発明では、免疫原の調製に抗原又は抗原決定基を使用
する。
抗原とし゛Ｃ使用できるのはタンパク、ポリペプチド、
多糖、オリゴ糖、糖タンパク、リポタンパク及びポリヌ
クレオチドの如き高分子である。これらの抗原は、天然
抗原として生じるものでもよく、又は生物、特にウィル
ス、細菌、真核微生物、奇生生物から得られてもよく、
又は多細胞生物に所属もしくは由来する細胞もしくは細
胞系から得られてもよい。
所望の場合、例えば含まれている干渉基を除去するため
あるいは抗原性の強化を図るために、抗原を使用以前に
酵素的又は化学的に開裂してもよい。
特に、遺伝子組換生物から抗原を得ることもでき、格別
には、組換ＤＮＡでコードされたポリペプチドが至適抗
原である。
本発明方法による免疫原の製造に適当な抗原決定基は例
えば小さいポリペプチド、小さいＡリボサツカライド、
Ａ−リボヌクレオチド、グリコタンパクフラグメント及
びハブテンである。
ここに小さいポリペプチドとは、少なくとも４個、約４
０個までのアミノ酸からなるポリペプチドをいう。一般
に抗原決定基は４〜８個以下のアミノ酸からなる。しか
しながら、抗原決定基の独特の空間構造を確認−Ｊるた
めに、これよりも幾分か数の多いアミノ酸が必要となる
場合もある。ポリペプチドは、例えば公知のアミノ酸配
列に基づいて合成的に調製することができ、又は微生物
の膜タンパク質又は植物もしくは動物起源のタンパク質
のような大きいポリペプチドもしくはタンパク質のタン
パク質加水分解開裂もしくは化学的開裂にＪ：って得る
ことができ、又はポリペプチドホルモンもしくはそのフ
ラグメントししくはそれらの類似物ｒ８ＱＶ）得る。
小さいＡリゴＩナッカライドと番よ、一般に糖単位の直
鎖又は分岐鎖を意味し、少なくとも４個から約２０個ま
での糖１．１１位からなるものをいい、より好ましくは
６〜１０個の糖単位からなる。これらのオリゴ１ノツカ
ライドは合成的に又は天然のポリ勺ツカライドもしくは
グリコタンパク質の化学的もしくは酵素的分解により調
製することができる。
オリゴヌクレＡ−チドとは、少なくとも１個から約１８
個までの、合成的に又はＲＮＡ及びＤＮＡの如きポリヌ
クレオチドの酵素的もしくは化学的開裂により得られる
ところのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチ
ドからなる化合物をいう。これらのオリゴヌクレオヂド
は任意に二本鎖であってもよい。
グリコタンパクフラグメントは、合成的に又はグリコタ
ンパク質の化学的及び酵素的開裂により調製される。
ハブテンは上記したポリペプチド、Ａリボサツカライド
、オリゴヌクレオヂド及びグリ−」タンパクフラグメン
トと異なる分子であり、キＡアリアに結合しない限り抗
体形成の読発には適さないものである。
ハブテンの例としては、ステロイド、プ［］スタグラン
ジン等がある。
抗原又は抗原決定基は、少なくとも１つの反応基を有し
ており、該反応基は、前記抗原又は抗原決定基とグリコ
シドに複合した疎水性化合物との間に直接又は間接の結
合を形成するのに適している。
疎水性化合物としては、疎水性の化学基であれば任意の
ものを使用することができる。この例としては、疎水性
ポリペプチド、脂肪族化合物、リン脂質誘導体又はカチ
オン洗浄剤などがある。
本発明の免疫原の適当な疎水性化合物として疎水性ポリ
ペプチドがある。これらポリペプチドは、好ましくは４
−５０個のアミノ酸を含むことができ、特に、バリル、
ファニルアラニル、トリプトフィル、メヂＡニル、ロイ
シル及び／又はイソロイシル残基の如き疎水性アミノ酸
残基から構成され得る。特に、例えば合成の進行中に適
正な溶解度を得るためには、疎水性化合物中に多数の付
加的親水性アミノ酸が含まれていることが必要であろう
。
別の適当な疎水性化合物としては、直鎖状又は分枝鎖状
脂肪族炭化水素誘導体、例えば、炭素原子約５〜１８個
のアルキルアミン又は炭素原子約４〜１５個のアルキル
メルカプタンがある。
同じく適当な疎水性化合物としては、スルフヒドリル、
ヒドロキシル又はカルボキシル基の如き伺加的反応基を
含むカチオン洗浄剤、例えばＤ　Ｔ　Ａ　Ｂ　。
ＤＴＡＣ又は０ＴＡＣがある。
同じく有利な疎水性化合物として、炭化水素°直鎖又は
分枝鎖を含むリン脂質例えばホス１チジル誘導体がある
。
上記又はそれ以外の疎水性化合物のいずれを選択する場
合にも、これら化合物に必要な一般前提条ｆ１は、少な
くとも１つの反応基例えばアミノ、カルボキシル、スル
フヒドリル、ヒドロキシル、アルデヒド又はケトン基を
含むことである。これらの基は、疎水性化合物の一部を
形成してもよく、又は、疎水性複合体の形成後リンカ−
によって結合されてもよい。実際には反応基の種類は主
として該反応基と反応すべき抗原又は抗原決定基に含ま
れる反応基の種類に従って選択される。
親水性部分と疎水性部分とを含むグリコシドと疎水性化
合物との複合体（キャリア複合体）を製造するには種々
の方法を使用し得る。極めて普及した方法は、任意に可
溶化剤を添加しておいた疎水性化合物の溶液と１つの疎
水性部分と１つの親水性部分とから成る少なくども１つ
のグリコシドを臨界ミセルｍ度以上の量ｔ゛含右−るグ
リコシド溶液とを接触さｕ１接触ど同時又は接触後に、
含まれる可溶化剤を除去する方法である。
この方法は例えば、前記グリコシド溶液の存在中で疎水
性化合物の溶液を可溶化剤と共に透析するが又は限外濾
過Ｊることによって行い得る。
特に、本発明のキャリア複合体の量産には限外濾過が適
している。
キャリア複合体の有利な製法としては、親水性部分と疎
水性部分とを有するグリコシドと疎水性化合物とを溶媒
中で混合し、混合物を超音波処理する方法がある。引続
き、キャリア複合体を分離及び／又は精製してもよい。
しかしながら、可溶化剤の存在下で疎水性化合物溶液を
、疎水性部分と親水性部分とを有するグリコシドを少な
くとも臨界ミレル濃度の化にて添加した例えば糖又は塩
溶液の濃度勾配にかけ、その後全体を遠心してキャリア
複合体をバンドとして分離Ｊることによってキャリア複
合体を調製することも可能である。
前記の如く調製されたキャリア複合体に含まれた疎水性
化合物は抗原又は抗原決定基の結合に適した反応基を備
えていてもよく、又は備えていなくｃもよい。反応基を
備えている場合、以後の抗原又は抗原決定基の結合の際
に反応基が実際に作用し得ることを確保すべく反応基を
適正に選択するが及び／又は適正な方法で複合体を調製
する必要がある。
このためには特に、反応基が比較的親水性のリンカ−基
を介して付着した疎水性化合物を使用するとよい。
又はキャリア複合体の形成後に反応基が疎水性化合物に
結合されてもよい。このためには、一方が複合体中の疎
水性化合物に付着しており他方が抗原又は抗原決定基へ
の付着適性を有する２官能価のリンカ−を使用づるのが
有利である。
架橋に適した２官能価試薬は、Ｔ、１１．Ｊｉにより記
述されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［ｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　９１　５８０−６０９（１９８３））。
２官能価リンカーとしては、ヘテロ２官能試薬の利用が
右利である。特に、アミノ塞（例えばスクシンイミジル
基又はイミデート基）と反応する１つの反応部位と、別
の１つの基例えばスルフヒドリル基（例えばマレイミド
基）又は種々の基（例えばＵＶ放射に反応するアジドフ
ェニル基）又はジチオピリジル基と反応する別の反応部
位とを有する２官能試薬が適当である。
本発明は更に、種々の抗原及び／又は抗原決定基を含む
免疫原の製造に係る。これらの免疫原に４３いては、別
々の抗原及び／又は抗原決定基が同一の抗原性及び／又
は病原性の特質を有していでもよく、所望ならば例えば
同一の病原体の別々の血清型であってもよく、又は別々
の抗原及び／又は抗原決定基が別々の抗原性及び／又は
病原性の特質を有していてもよい。
本発明免疫原は所望に応じ安定化することができ、それ
は例えば免疫原自体に、あるいは抗原決定基及び／又は
それに結合（「架橋」）シている疎水性残基と万いに結
合することにより行ないつる。
架橋は、抗原あるいは抗原決定基及び／又は疎水性残基
に少なくとも２つの基を結合させうる反応基を有するい
かなる試薬によっても達成できる。一般的にポリペプチ
ドへの架橋にはゲルタールアルデヒド又はホルムアルデ
ヒドを用いる。架橋試薬としては、例えばビスアミディ
ト、ピザクシンイミジルエステルの如きホモ２官能暴試
薬又はアジドフェニル基とアミディト又はザクシンイミ
ジル又は活性化フルオロベンゼン又はハロケトン基のよ
うな基を有する化合物の如きヘテロ２官能基試薬も好適
である。
本発明免疫原は特にワクチン接種に好適である。
該免疫原を含有り−るワクチンは特に特定な病原体に対
りる免疫化いわゆる初回免疫又は免疫学的不妊法すしく
は去勢に使用しつる。初回免疫においては身体は直ちに
特異遊離抗体を形成りるように刺激されるのではなく効
果的に予備調整されるのであって、例えば不活化又は弱
毒化病原体によって感染あるいはワクチン接種した後に
強い免疫反応がもたらされる（特に［１ｎ１ら（１９８
３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４．６９９〜７０３を参照せ
よ）。免疫学的不妊法もしくは去勢においＣは、ある種
のホルモンの如き生殖過程に重要な物質に対する抗体が
産生される。
従って、本発明は本発明免疫原を含有する、動物又はヒ
トに使用するワクチンをも包含する。免疫原中に存在す
る特定の病原体に特有の少なくとも１つの型の抗原又は
抗原決定基のために、このワクチンは特定の病原体に対
する免疫化又は初回免疫に適しうる。ワクチン中には１
つの同じ病原体の複数の型の抗原及び／又は抗原決定基
を含んでいてもよい。
同時に各免疫原が複数の抗原及び／又は抗原決定基から
成っていってもよく、あるいは異なる免疫原中に各々の
型の抗原及び／又は抗原決定基が含まれていてもよい。
本発明によると、複数の病原体に対づるワクチンを構成
することもでき、このような場合にはやはり、各抗原及
び／又は抗原決定基が異なる免疫原中に存在していても
よく、あるいは１つの免疫原中に共存していてもよい。
従って、本発明免疫原は診断試験において、例えばいわ
ゆる１ノンドウイツチ試験の固相、あるいは凝集試験の
粒子相、あるいは免疫化学試験のマーカー相として使用
できる。免疫化学試験に使用する場合、マーカーは免疫
原中に含まれているか、含まれていることができる。
本発明免疫原をワクチンの目的で使用するためには、免
疫原を投与に適した形態とする必要がある。
筋肉内又は皮下投与のためには、免疫原を例えば生理的
食塩溶液と況合することができる。０内又は眼内投与の
ために例えばスプレーの形態とするためには、好ましく
は水溶液が使用されるであろう。局所（例えば経口）投
与のためには、多くの場合例えば口腔内の直納分解性酵
素又は胃中の蛋白質分解酵素に対して免疫原を一時的に
保護する必要があるだろう。このような保護は例えば免
疫原をカプセル化（＋３ｎｃａｐｓｔｌｌａｔｉＯｎ）
することにより、又は徐放形態化することにより、又は
ホリペプヂド抗原又は抗原決定基及び／又は疎水性化合
物の酵素感受性部位にＪ３いて１つ又はそれ以上のＤ型
のアミノ酸を用いることにより行ない得る。
カプセル化とは（一時的に）ある種の分解作用の攻撃に
対して薬剤を保護するいかなる方法をも意味するもので
ある。本発明の全ての個々の複合体をも保護剤で包むこ
と（マイクロカプセル）、あるいは複数の複合体を１つ
の保護シールド（ＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇＳｈｉｅｌｄ）
でおおうこと（マクロカプセル）によりカプセル化は達
成しつる。
カプセル化材料は半透過性であり得、あるいは動物もし
くは人間の体内にもたらされたとき又は動物もしくは人
間の体内である種の部位をＩＩしたときに（半）透過性
となりうるちのである。この意味ではカプセル化と徐放
化の両者は１つの製剤中で達成しうる。従って、一般的
にカプセル化には生体内分解可能な材料が使用される。
マイクロカプセル化には、本発明の適宜架橋した複合体
を生体内分解可能なポリマー溶解中に分散することが適
しており、適宜表面活性剤を添加する。
その後ポリマーが界面にカプセルを形成する。マイクロ
カプセルを分離し、生理学的に許容し得る溶媒に懸濁覆
ることができる。又、マイクロカプセルは凍結乾燥し得
る。
マイクロカブ［ル化は当業界に公知の方法で達成し得る
。本発明の適宜架橋した複合体をゼラチン、澱粉などの
ような経口（軟又は硬）カプセル材料により、適当な形
態に変換することが好ましい。この目的のために、マン
ニトール、直納、グリレロールなどを添加した複合体を
乾燥又は凍結乾燥しつる。
その後、この材料を粒状化しあるいは例えば天然もしく
は合成ゲルに懸濁し、例えばホルムアルデヒド、セルロ
ースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチル
セルロースフタレート又はポリアクリル化合物で腸溶性
にコートしたカプセル中に充填する。
又は、水中懸濁した本発明の複合体を充填するに先たち
、腸溶性カプセルの内面をボリシロキ４ｊン又は合成も
しくは植物性油もしくはろうのような軟線水層でおＪ３
っておく。
本発明は下記の実施例を参照して更に明らかにされる。
Ａ、１８Ｍ抗原の調製 コロナウィルス（ｃｏｒｏｎａ　ｖｉｒｕｓｅｓ）のグ
ループに属する鳥類感染性気管支炎ウィルス（Ａｖｉａ
ｎ　１ｎｆｅｃ口Ｏｕｓ　ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ　ｖｉ
ｒｕｓ）　（Ｉ　Ｂ　Ｖ　）をＩＢＶ感染した生後１１
日目の受精卵の尿膜液からショ糖濃度勾配遠心分離によ
って精製１−る。
精製したＩＢＶをＰ　Ｂ　Ｓ　１　ｄ当りタンパク５ｍ
ｇの割合でＰＢＳに懸濁さぜ、５ｍＭＣａｃｉ＋２の存
在下サーモリシン（０，１１Ｒｇ／ｄ）を用いて２２℃
で１５分間処理する。４ｍＭ　ＥＤＴＡ（最終１度）を
加えて酵素反応を停止させる。この酵素反応によってウ
ィルス表面のタンパク性トゲが切り離される。
１００．０ＯＯＸ（ｌで６０分間遠心してトゲをピリオ
ン粒子から分離する。可溶化したトゲのタンパクを含有
づる上清を、ＰＭ３０フィルターを備えたへｍ１ｃｏｎ
限外濾過レルで透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）　Ｌ／、次に凍結乾燥する。
Ｂ、リボニンＱｕｉｌ＾キャリア複合体の調製水エタノ
ール（１：１）に溶解したチオコリンＮ−ｎ−ドデシル
−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−チオエチル）−アンモ
ニウムクロライド［ｎ　−０１２１−１÷ ２５Ｎ　（ＣＨ３）Ｉ　ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ，ＣＲ−］の
濃溶液を脱酵素した０、１Ｍリン酸バッフ１−１ｐＨ６
，０，０，９％ＮａｃＲ，５ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解した
サポニンＱｕｉｌ＾の１％溶液に加え、前記ヂＡコリン
界面活性剤の最終濃度を０．４ｍＭにする。
混合ミセルが形成される。
Ｃ，キャリア複合体の活性化 ステップＢで調製した混合ミセルを、０．１Ｍリン酸塩
ハｙ　７　Ｆ−１ｌｌＨ５，Ｏｌｏ、９％ＮａＣｆ５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ中の５ｍＭのＮ−スクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）−シクロへキリン−１−カ
ルボキシレート（ＳＭＣＣ）とＶ渇で３０分間反応させ
る。０．１Ｍリン酸塩バッファー、１）Ｈ５，０，０，
９％ＮａＣＪ！中の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　２５を用い
たゲル濾過によって余剰ＳＭＣＧを除去する。
Ｄ、免疫原の調製 ステップＣで得られた活性キャリア複合体を、０．１Ｍ
リン酸塩バッファー、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣ１’
中にステップＡで得られ／ｊ４Ｂ、Ｖ抗原を１０ｍｇ／
ｄ含有する溶液に速やかに添加する。得られた混合物は
Ｑｕｉｌ＾とタンパクとを重量比１：４で含有する。０
．１Ｎ　Ｎａ０ＩＩで溶液のｌ）　Ｈを７．８に調製し
、混合物を室温で２時間静置する。１１０−４０ｆｆｉ
％のショ糖濃度勾配により一１４℃において２５０゜０
０（ｌで１０時間遠心して免疫原を単離する。次に複合
体を２０ｍＭリンＭ塩バッファー、Ｉ）■７゜４、１５
０ｍＭ　Ｎａｃｆｆｉに透析づる。粉粒状免疫原粒子が
電子顕微鏡で観察できる。
Ａ、ブタバーボウィルス抗原の調製 Ｔ、１４．　Ｈｏ１ｉＬｏｒ、　１１．ｓ、　Ｊｏｏ及
び１４．Ｓ、　Ｃｏ１１ｅｔｔ：に、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
す、　８４２−８！１４（１９８３）　：に記載の方法
でブタパーボウイルレス（ｐｐｖ）の６５にＨ−の大き
いカプシドタンパクを単離づる。ＰＰＶ含有組織培養液
に２５ｍｔｖｌＣａα２になるまで１ｌｃａα２溶液を
１滴ずつ加える。
ウィルス沈澱物を１２０．ＯＯＯｘｇで２０分間遠心す
る。ウィルス含有ベレットをＣ５ｃＲＱ度勾配で遠心分
離し、密度１．３ｙ／＃Ｉｉ！のウィルスビークを採取
し、透析して１％のドデシル硫酸す１〜リウム（ＳＤＳ
）で３分間処理する。６５にタンパクを用意した５Ｏ８
−ＰＡＧＥで単離し、透析し、凍結乾燥する。
Ｂ、ＰＰＶタンパクの誘導化 ステップＡで得られたタンパクを０．１Ｍリン酸塩バッ
ファー。１）ｌ−１７，５に３ｍｌ／ｒｉｆｔになるよ
うに溶解し、５モル５船のＳＭＣＣを用いて室温で３０
分間処理する。０．１Ｍリン酸塩バッファー、ｐ　＋−
＋６．０．０．９％ＮａＣｆｆ１　、５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　
１−　Ａ中の５ｅｐｌ＋ａｄｅｘＧ　２５を用いてゲル
濾過して余剰５ＩＶＬＣＣを除去する。
Ｃ，キャリア複合体の調製 ０．１ＭＩＩｔ酸塩バッファー、ｐＨ４，５に溶解した
ザボニンＱｕｉｌ＾の１％（Ｗ／Ｗ）溶液に、ペプチド
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　Ｉ　Ｖ−（Ｌｅｕ）
５−ＧＩＶのＮα−３−（２−ピリジルジチＡ）プ１コ
ピＡニル化したメチルエステル誘導体のトリフルオロ−
エタノール溶液（４％、Ｗ／Ｗ）を添加する。
２ｍＭのペプチドを含有する得られた溶液を次に超音波
処理して透明溶液を得る。Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを５ｍＭまで
加え、溶液を窒素で洗う。ジチ第１リトリトールを濃度
２０ｍＭまで加える。室温で１５分間還元し、０．１Ｍ
の脱酸素リン酸塩バッファー、ｐＨ６，０，０，９％Ｎ
ａ１Ｊ及び５ｒＴＩＭＥＤＴＡを用いで平衡化した５ｅ
ｐｈａｄｅｘカラムでゲル濾過して余剰のＤ　−１”　
Ｅを除去する。
Ｄ、免疫原の調製 ステップＢで誘導化されたタンパクとステップＣで得ら
れたチオレートキャリア複合体とを１：４（ＱｕｉｌＡ
：タンパク）で結合させる。溶液を室温で５時間静置し
、５時間後に１０−４０　（ｗ／ｗ）％のショ糖濃度勾
配により４℃において２５０．０００×９で１０時間遠
心して免疫原複合体を単１１１する。
引続き、免疫原複合体を２０ｍＭリン酸塩バッファー、
ｐＨ７，４，１５０ｍＭＨａＣｊ！に透析する。
実施例２と同様にして、Ｅ、Ｃ０Ｉｉ中の発現ベクター
中の各ウィルス遺伝子の分子クローニングによって誘導
されたＰＰＶ６５にタンパク（Ａｍａｅｎ、　Ｃａ１Ｈ
ｏｒｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を出発物質としてパーボ
ウィルス免疫原を調製する。
β−エンドルフィン−（６−１７）のマレイミド誘導体
のチオコリン化合物 の１．２モル当量を０．１Ｍリン酸塩バッファー、ｐ１
１６．０．０．９％Ｈａｌ＆、５ｍＭＥＤ’ＴＡに溶解
した溶液を、実施例１のステップＢで調製したザボニン
ＱＩＪｉｌＡキＡ７リア複合体に添加する。
混合物を室温に１時間維持し、引続き、２０ｍＭリン酸
塩バッファー、ｐＨ７，４，１５０ｍＭＮａＣ１’を３
回交換しＣ４℃で１５時間透析する。
Δ、クレブシェラ菌血清を１１の莢膜オクタ゛リーツカ
ライドＺｉ（ｌｔｅｒｌｌｌａｎ等の方法（ＶＩＬｈ　
Ｉｎｔｅｒｎａｌ、　Ｃａｒｂ。
ｇｙｄｒａｔｅ　Ｓｙｍｐ、ａｔ　ｕｔｒｅｃｌ＋ｔ、
ｔｌ＋ｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；　ＶｏｎｋＰｕｂ
ｌ　１ｓｈｅｒｓ、　Ｚｅｉｓｔ、　１９８４：Ｅｄ、
Ｖｌ　ｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ等、３０８ベージ）によっ
てクレブシェラ菌抗原型１１の莢膜多糖（Ｋｌ　１　Ｐ
Ｓ）のオクタサう力ライドザンプルを調製する。要約す
ると、６ｄのＰＢＳ中の５×１０１０ｐｆｕのバクテリ
オファージφ１１を添加した５ＩＲｇのＫＩＩＰＳを３
７℃で２４時間インキュベートづる。引続き、オクタサ
ツカライド（Ｋ１１０Ｓ）を５ｅｐｈａｄｅｘＱ　２５
　（Ｐｈａｒｉ＋ａｃｉａ）でゲル濾過して単離精製す
る。式■のオクタサツカライドが観１られる。
Ｂ、に１１０Ｓの活性化 ステップＡで調製した２０〜のオクタサツカライドを２
５ｉｙの２−（４−アミノフェニル）−エチルアミンと
１０日間反応させる。この間０、生じる不安定なＮ−ア
ルキル誘導体を２１ｄの水成バッファー、１］８８．５
の中のシアノボロハイドライドナトリウムで還元づる。
ゲル濾過りＯマドグラフィーによって余剰の反応体を除
去し、生成物を過剰母のチオホスゲンで処理し、得られ
たイソチオシアノドフェニル誘導体を凍結乾燥する。
Ｃ，キ１アリア複合体の調製 ２５＃１ｇのホスファチジルエタノールアミンを０゜１
５Ｍリン酸塩バッフ１−１ｐＨ７，４中の１％溶液にし
た１７５■のサポニンＱｕｉｌ＾と混合し、室温で２０
分間超音波処理する。得られた複合体を０゜１Ｍ重炭酸
塩バッファー、ｐＨ９に十分に透析する。
Ｄ、免疫原の調製 ステップＢで得られた活性Ａリボ糖をステップＣで得ら
れたキャリア複合体溶液に溶解し、１週間反応させる。
生成物をＰＢＳを３回順次交換して透析し、凍結乾燥Ｊ
る。
実施例１に従って１８Ｍ免疫原をＷ４１！Ｊシ、２ｄの
０．１ＭリンＭ塩バッファー、ＤＨ７，５中に約５１Ｒ
ｇ／Ｉ１１で懸濁させ、連続的に撹拌し乍ら１１１１ｅ
の２０ｍＭグルタルアルデヒドを滴下する。反応混合物
を室温で３０分同量置し、次に水冷する。架橋複合体を
前記バッファーで十分に透析してから凍結乾燥づる。
イヌパーボウィルス（ＣＰＶ）　６４　Ｋカプシドタン
パクを含有Ｊる免疫原を実施例２に記載の方法で調製す
る。
０．１５９の前記免疫原を含む８ｇの２１％アルブミン
溶液を６０℃の液体パラフィン２０ｄに入れ、５分間こ
の温度に維持してから５℃に・冷却する。この温度を９
０分間維持する。引続いて１０ｇのイソプロパツールを
加える。懸濁物質を膜フィルターで吸引濾過して分離し
、イソプロパツールで洗う。次に３ｄの１０％ホルムア
ルデヒドのイソプロパツール溶液を粉粒状物質に添加し
７℃で２４時間反応させる。硬化した莢膜物質を濾過し
、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＩＩＩ！濁液として保存１゛
る。
手続ン市−ＣＥ柑（方式） ％式％］ １、事件の表示　昭和５９年特Ｋ［願第２２１８９３号
３、祁ｉ正を７る者 事件との関係　４：＋　ｉＦｌ出願人 名　称　アクゾ・土ヌ・ヴ−［− ４、代　理　人　東京都新宿区新１５１月口１番１４）
１　山ＩＩｉビル５、補正指令の日付　昭和６０年２月
６日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　タイプ印出により鮭明にｉ７＋肉した
明細古８、補正の内容 （１）　明細書中、第６頁第５行目にｒＷ、　Ｈｅｒｚ
　。
１−１　、　Ｇ　ｒ　ｉ　５ｅｂａｃｈ　Ｊとあるを１
−ダブり具、ヘルツ（Ｗ、　Ｈｅｒｚ）、　Ｉイヂ、グ
リセバラＡ（’Ｈ０Ｇ　ｒ　ｉ　５ＯｂａＣ１ｌ）　Ｊ
と補正する。
（２）　明細書中、第６頁第５行目にｒＧ、Ｗ。
ＫｉｒｂｙＪとあるを１゛ジー、ダブリュ、ギルビイ（
Ｇ、　Ｗ、　Ｋｉｒｂｙ）　Ｊ　ト補１１Ｆ′７１ル。
（３）　明＠Ｊ）中、第６頁第５ｈ目乃至第７行目に［
Ｆｏｒｔｓｃｌ＋ｒｉｔｔｅ−・−（１９７３）　Ｊと
あるを「フＡル１〜シコリツテ　デル　ケミ　オルガニ
ツシエプに１ルストツフエ、第３０巻（１９７３）（［
ｏｒｔｓｃｌ＋ｒｉｔＬｅ　ｄｅｒ、　（：、　ｈｃｍ
ｉｅ　ｏｒｇａｎｉｓｃｂｅｒＮａｔｕｒｓｔｏｒｒｅ
、　ＶＯＩ、　３０（１９７３））　Ｊど補正する。
（４）　明１書中、第６頁第７行目乃至第８４１目に「
”　ＣＩ＋ｅＩＩｌｉｅ　−−−−−−３ａｐｏｎｉｎ
ｅ　”　Ｊとあるを「“ケミ　ラン１〜　ビオロジイ　
ゲル　勺ボニン″（”　Ｃｈｃｍｉｅ　ｕｎｄ　３　ｉ
ｏ１ｏｇｉｅ’　ｄｅｒ　５ａｐｏｎｉ、ｎｅ　”　）
　Ｊと補正づる。
（・５）　明細書中、第６頁第８行目に「’ｒ　ｓｃｌ
＋ｅｓｃｌ＋ａ　Ｊどあるを１ツシエツシＩ　（Ｔｓｃ
ｂｅｓｃｈｅ）　Ｊど補正する。
（６）　明細書中、第６頁第８行目にｒＷｕｌｆｊどあ
るを［ビュルフ（Ｗｕｌｆ）Ｊと補正づる。
（７）　明ｍ＠中、第６頁最下行及び第７頁第１行目に
「ＰｕｔｒａｎｊｉａＪどあるを「ブ１−ランシア（Ｐ
ｕｔｒａｎｊｉａ）　Ｊと補正する。
（８）　明細書中、第６頁最下行に［ＢｅｒｓａｍａＪ
どあるを［ベル４）ｑ　（３ｅｒｓａｍａ）　Ｊど補正
する。
（９）　明細書中、第７頁第７行ｌ］乃至第８ｆ＋目及
び第７頁第１０行目に［Ｋ　、　Ｄ　ａｌｓｇａａｒｄ
ｊとあるを１−ケー、ダルスガード（Ｋ、　Ｄａｌｓｕ
ａａｒｄ）　Ｊど補正する。
（１０）明りｎ書中、第７頁第８行目乃至第９ｆｊ目に
「（”　５ａｐｏｎｉｎ・・・−（１’）７２））Ｊと
あるを「（パ→Ｊボニン　アジコバンｌ−”　、　フル
、オフ、インド。
エピツ　７７　（７−８）、　１２８９−１２９５（１
９７２１（”　Ｓ　ａｐｏｎｉｎΔｄｊｕｖａｎｔｓ”
　、　Ｂｕｌｌ、Ｏｆｆ、　ｉｎｔ、Ｅｐｉｚ　７７（
７−８）、　１２８９−１２９５（１９７２））Ｊと補
正づ゛る。
（１１）明細書中、第７頁第１０行目乃至第１２行１］
にｒ　（”　Ｓ　ａｐｏｎ：ｎ−−−−−・（１９７４
））Ｊとあるをｒ（”１）゛ボニン　アジコバンｌ−Ｉ
ＩＩ　”　、アーキブ　フユールデイ　グセムデ　ヴイ
ルスフＡルシュング　Ｑ２４３−２５４　（１９７４）
　（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓｎｌ”。
Ａ　ｒｃｌ＋ｉｖ　ｆｕｒ　ｄｉｅ　ｇｅｓａｍｔｅ　
Ｖ　１ｒｕｓｆｏｒｓｃｌ＋ｕ＋＋ｇす。
２４３−２５４　（１９７４））　Ｊど補正Ｊ−る。
（１２）明１１Ｉ店中、第７頁第１３行目、第２３頁Ｆ
から第３ｔｒ　Ｉ」、第２４頁第５行［ｌ、第２５頁第
５行目、第２７頁第３ｈｌ−１、第２８頁第２行目、第
２９真下から第９ｔ’Ｔ目及び第３１真下から第ｊ）行
目にＩ’　Ｑ　ｕ　ｉ　ｌΔ」とあるを１゛−１−ル△
（ＱｕｉｌＡ）、１と補任−スル。
（１３）明［ｌ書中、第１５頁下がら第５行目に［“［
。
ｌ−１，ＪｉＪとあるを「ディ、エイヂ、ジー（Ｔ。
Ｈ，Ｊｉ）Ｊと補正する。
（１４）明細書中、第１５真下から第４行目乃至第３行
目にｒ　（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ−・−（１９８３））Ｊと
あるを［メソツズ　イン　エンザイモ［１ジー　０．１
．５８０−ＧＯ９（１９８３）　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅ　ｎＺｙｌｌｌｏｌｏ（ＩＶ　９１゜５８０−（
ｉ０９　（１９８３））　Ｊと補正する。。
（１５）　明細書中、第１８頁第３行目）こｌ’Ｅｍｉ
＋＋ｉら・・・・・・〜７０３」とあるを１“１ミニら
（１９１１３）ネイブー曳ｌ−３０４，６９９〜７０３
　（Ｅ　ｏ＋ｉ旧ら（１９８３）　ｌ’ＪａＬｕｒｅ倶
リー、６９９〜す０３）Ｊと補正する。。
（１６）明細書中、第２３真下から第５行目にｒＡｎｉ
ｃｏｎ　」どあるを［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｊど補
正する。
（１７）明細書中、第２４頁下がら第３ｉｊ目及び第２
Ｇ頁下から第３１１目乃至第２ｆｊ目にｌ’　Ｓ　ｃｐ
ｌ＋ａｄｃｘＧ２５」どあるを１−ゼファデツクス　Ｇ
２５（Ｓ　ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ｇ　２５　）　Ｊと補正
する。
（１８）明細書中、第２５頁１・から第２行目乃至最下
行に（’　Ｔ　、　Ｗ、　Ｍｏ１ｉｔｏｒ、・・・・・
・＜１９８３）　Ｊとあるを［チー、ダブリ］１．モリ
ター（Ｔ、Ｗ。
Ｍｏ１ｉｔｏｒ）　、　エイヂ、ニス、ジー４−（＋−
１，３゜Ｊｏｏ）及び１ム、ニス、コレラｌ−（Ｍ、Ｓ
。
Ｃｏ１１ｅｃｔ）　ニジ１−、バイｏロジー４５．８４
２−８５４（１９８３）　（Ｊ　、　Ｖ　１ｒＯｌＯ（
ＩＶ　４５．８４２−８５４（１９８３））Ｊと補正す
る。
（１９）明ｌＩｌ書中、第２７頁Ｆから第４行目にｊ　
３　ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ｊとあるを１゛セフアデツクス
（Ｓ　ｅｌ）ｌ＋ａｄｅｘ）　Ｊ　ト補正スル。
（２０）明細書中、第２８頁第１０行目に「Ｅ、Ｃ０１
１」どあるを「大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｊと補正す
る。
（２１）明細書中、第２８頁第１２行目乃至第１３行目
に（−（八ｍｇｅｔ＋、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＩＪ
、　Ｓ、　Ａ、　）　ｊどあるを「アムジエン（Ａｍｇ
ｅｎ）　、カリノオルニア（Ｃａ１Ｎｏｒｎｉａ）、米
ａＪ（ｔＪ、Ｓ、Ａ、））Ｊと補正１”る。
（２２）明ｌｌ１ｌ中、第２９真下から第２行目に［ｚ
　ｉｇｔｅｒｍａｎ’Ｊとあるを１゛ジグターマン（Ｚ
ｉｇＬｅｒｍａｎ）　Ｊと補正Ｊる。
（２３）明細書中、第２９真下から第２行目乃至第３０
頁第２行目にｒ　Ｖ　ｎ　ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ、−
・−・−ページ）１どあるを１第ｘ■回インタープツ１
−．ノコ−ボハイドレート　ランプ。於１トレヒＩ−、
：、１ランダ；ノオンク　バブリツシャ、ツアイスト，
１９８４：ビリーゲントハート等編、３０８ページ（Ｘ
　ＩＩ　ｔｌ＋Ｉｎｔａｒｎａｔ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ　Ｓｙｎ＋ｐ、　ａｔ　ＵＬｒｃｃｌ＋ｔ。
ｔｂｅ　Ｎｅｔｌ＋ｅｒｌａｎｄ　：　ＶＯｌｌｋ　ｒ
’ｕＮｉｓｃｂｅｒ、７ｅｉｓＬ。
１９８４　：　Ｅ　（＋、Ｖ　ｌｉｃｇｅｎｔｈａｒｔ
　等、３０８ページ））１と補正する。
（２４）明細書中、第３０頁第８行目に［Ｓ　ｅｐｌ＋
ａｄｅｘＧ　２５　（Ｐ　ｌ＋ａｒｍａｃｉａ）　Ｊと
あるな「セノアデツクスＧ２５　（３ｃｐｌ＋ａｄｅｘ
　Ｇ２５）　（ファルマシア（ｐ　ｂａｒｍａｃｉａ）
）　」と補正する。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　抗原又は抗原決定基又はその誘導体を、親水性
    部分と疎水性部分とを有する少なくとも１種類のグリコ
    シドと複合した疎水性化合物の反応基に結合し、得られ
    た免疫原粒子を任意に安定化させる及び／又は消化分解
    から保護ツることを特徴とする免疫原の製法。
  2. （２）　異なる２種以上の抗原及び／又は抗原決定基又
    はその誘導体を前記反応基に結合させることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項に記載の製法。
  3. （３）　免疫原粒子が抗原及び／又は抗原決定基又はそ
    のｍＷＪ体の架橋によって安定化されることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の製法。
  4. （４）　免疫原粒子がカプセル化によって消化分解から
    保護されることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
    第３項のいずれかに記載の製法。
  5. （５）　特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに
    記載の方法で製造された免疫原を少ｆＪ　くとも１種含
    有するワクチン。
  6. （６）　特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに
    記載の方法で製造された免疫原を少なくとも１種含有す
    る免疫化学試薬。
JP59221893A 1983-10-22 1984-10-22 グリコシド含有キヤリアに結合された抗原及び／又は抗原決定基から成る免疫原の製法 Pending JPS60172933A (ja)

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