CN115996750A - 通过病毒和抗原偶联形成的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文公开了在冷藏或室温下形成偶联化合物性质的化合物和示例性稳定化合物的方法，在一些实施方式中，该方法包括抗原和病毒颗粒在偶联反应中混合以形成偶联混合物，从而形成这些产物的条件和步骤允许将偶联物混合物作为疫苗使用，包括但不限于作为针对各种病原体的疫苗使用，包括用于治疗由新型冠状病毒(包括SARS‑COV 2)引起的疾病。

Description

通过病毒和抗原偶联形成的疫苗
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求2021年2月26日提交的美国非临时专利申请第17/186,941号的优先权和权益，该申请为部分继续申请，并要求2020年7月2日提交的美国非临时专利申请第16/919,943号的优先权和权益，该申请还要求2019年12月10日提交的美国非临时专利申请第16/709,063号的优先权和权益，该申请还要求2019年6月11日提交的美国非临时专利申请第16/437,734号的优先权和权益，该申请还要求2018年6月12日提交的美国临时专利申请第62/683,865号的优先权和权益；并且，本国际专利申请要求2020年7月2日提交的美国临时专利申请第63/047,629号的优先权和权益；以及2020年4月21日提交的美国临时专利申请第63/013,284号的优先权和权益；其教导和全部公开均通过引用纳入本文。
关于序列表
本申请包含电子形式的序列表，其通过引用其全文纳入本文。提交文件时提交的序列表文本文件包含计算机可读形式的文件“SequenceListings,PCT_ST25”，创建于2021年3月5日，大小为10,826字节。
技术领域
本文所述的实施方式包括用于生产高度纯化的重组病毒作为抗原运载体的多重(multi-set)过程的应用，并且进一步的各种实施方式涉及使用纯化的病毒和纯化的抗原的疫苗生产，包括意在用于预防新型冠状病毒的疫苗，包括SARS-CoV2(本文中称为Covid-19或SARS-2)疾病。
背景技术
病毒在蛋白质外壳中具有核酸分子，仅在其他生物体的活细胞内复制。通常被认为是有害的，各种病毒能够感染所有类型的生命形式，例如人、牲畜和植物。然而，从积极的一面来看，人们越来越有兴趣将病毒用于一系列治疗目的，包括但不限于疫苗创造、基因治疗和癌症治疗，举几个为例。然而，为了研究病毒，了解其结构，并使病毒适用于分子工具以及疾病治疗载体和运载体，必须首先纯化病毒以去除任何细胞碎片、大分子纤维、细胞器、脂质及其他会干扰病毒预期功能的杂质。
纯化后，病毒适合用于多种用途。与当前公开内容有关的一个传统观念是使用病毒(在本文中被视为病原体)来研究和开发针对病毒的遗传学策略。但在本发明内容中进一步讨论的是使用纯化的病毒作为抗原运载体来制备疫苗。抗原是分子，当适当地递送至生物体时，能够通过与生物体内的与抗原分子结构匹配的抗体结合来刺激抗体产生，从而在该生物体中产生免疫反应。由重组DNA产生重组抗原，将其通过已知技术克隆到载体中，然后将其导入特定的宿主细胞，例如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等中。然后利用宿主细胞的翻译器表达重组抗原。表达后，重组抗原可被收集并通过称为偶联的过程通过共价键附接至病毒。抗原与病毒偶联后，病毒可充当运载体以将抗原递送至生物体并激活免疫系统反应。这样，病毒-抗原偶联物可以提供治疗用途。抗原需要适当的病毒-抗原偶联来激活免疫反应，其在源生物的宿主细胞中产生抗体。病毒和抗原的纯化可以促进这种适当的偶联。
目前纯化病毒的方法通常仅限于以较小的生化量使用，例如以纳克至毫克的数量级，并且尚未在以克至千克的数量级的工业量中得到证明。例如，先前使用的被称为“粗感染细胞裂解物”的方法利用来自病毒感染细胞的粗细胞裂解物或细胞培养基。通过冻融或其他已知方法将感染的哺乳动物细胞裂解，通过低速离心去除碎片，然后将上清液用于实验。将完整的受感染的生物体破裂或进行物理研磨，使用离心或过滤澄清所产生的提取物以产生粗制病毒制剂。然而，这种方法受到许多非病毒因素的高度污染，影响了进行实验和操纵病毒的能力。
现有的纯化步骤的第二个例子是高速超速离心，通过该方法将病毒沉淀，或通过用低密度蔗糖溶液沉淀而进一步纯化，或悬浮在各种密度的蔗糖溶液之间。该方法的限制包括由于高速分离的有限的大小和可扩展性而只能少量地生产纯化的病毒，以及由于经常与病毒样品共纯化的其他宿主蛋白质而导致病毒纯度低下。
以前用于提高病毒纯度的第三种方法是密度梯度超速离心法。在这种方法中，氯化铯、蔗糖、碘克沙醇或其他溶液的梯度被用来分离组装的病毒颗粒或去除缺乏遗传成分的颗粒。这种方法的限制包括纯化病毒所需的时间(通常为2-3天)，样品数量有限，一次可以分析的样品数量(每个转子通常为6个)，以及可以纯化的病毒量少(通常为几微克至几毫克的最终产物)。
有机提取和聚乙二醇沉淀也已用于纯化病毒，包括从植物中纯化病毒，例如通过去除脂质和叶绿体。然而，这些已知方法同样存在纯度低下的问题，产物通常仍附着于宿主蛋白质、核酸、脂质和糖上，这导致所得病毒产物强烈地聚集。这些限制降低了最终产品符合美国食品和药物管理局(FDA)执行的现行良好生产规范(cGMP)法规的效用。
FDA颁布的现行cGMP法规包含对药品的制造、加工和包装中使用的方法、设施和控制的最低要求。这些法规旨在确保产品的安全性，并确保其具有它所声称的成分和强度。因此，对于用于疫苗生产、基因治疗、癌症治疗及其他临床环境的病毒，最终的病毒产品必须符合cGMP法规。如果最终的病毒产品不符合cGMP法规，如来自聚乙二醇沉淀法的产品，那么它在临床上使用的效用要么不存在，要么被大大削弱。
可扩展性是指即使产品量增加，例如从实验室规模(<0.1平方米)增加到至少>20平方米的系统，仍可一致地且可重现地生产相同产品的过程。以上所确定的先前使用的方法均存在缺乏一致性、可扩展性低(即仅以生化量生产产品)、以及不符合cGMP法规的问题。
在大规模生产方面，基于植物的生产受到关注，尽管其应用存在明显的限制。基于植物的生产系统能够以比动物细胞生产系统(如中国仓鼠卵巢(CHO))低得多的成本产生工业规模的产量。然而，在一些规模下适用于非植物病毒的某些常规纯化方法却不能用于植物制的病毒和抗原。这些限制是由于纯化植物病毒与纯化动物细胞培养物中的病毒之间存在大量差异而产生的。虽然动物细胞产生主要的蛋白质和核酸杂质，但植物也是动物细胞中所没有的重要和额外的杂质的来源。其中一些包括叶绿体膜和液泡膜的脂质成分，简单和复杂的碳水化合物杂质，以及纳米颗粒状的细胞器杂质。事实上，粗制植物提取物经常会弄脏用于处理和纯化从植物中获得的病毒和抗原物质的设备，例如，由于杂质在主要介质床或设备的分离膜上的积累。这种污垢不可避免地导致压力流动失败，过滤效果差，最终导致产品产量低。另一个问题是这些杂质倾向于聚集，并能够与植物所需的任何蛋白质、病毒或其他“产品”共纯化。因此，目前纯化病毒的方法不会充分去除所有或甚至足够量的杂质，包括但不限于在植物提取物中发现的杂质，也没有证明能适当地产生纯化的病毒。
在病毒和抗原纯化平台方面很少看到有进展，所述病毒和抗原纯化平台始终能够以符合cGMP法规的方式以商业规模(即克级至千克级或更高)生产高纯度的病毒。这样的改进将允许临床开发，以便在疫苗创造、基因治疗和癌症治疗中使用工具。与本文概述的其他特征和优点一起，本文描述的根据多个实施方式和替代性方式的平台满足了这一需求和其他需求。
迄今为止，已有七种冠状病毒(CoV)被鉴定为能够感染人，包括严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新鉴定的CoV(SARS-CoV2、2019-nCoV或Covid-19)。当在人群体中时，这三种病毒构成了重大的公共卫生风险，并表现出高死亡率：SARS-CoV:10％，MERS-CoV:34.4％和SARS-CoV2:6.1％。根据约翰-霍普金斯大学冠状病毒资源中心，Covid-19目前已传播到超过188个国家，感染了超过1000万人，并被认为是全世界50多万例死亡的原因。这些数字正在以指数形式增长，其爆发已经造成了世界范围内的健康和经济危机。Covid-19的出现及其对人健康和经济的影响，要求我们作出紧急反应，特别是预防Covid-19疾病的疫苗。尽管全球都在努力寻找疫苗来控制或减缓感染，但目前还没有批准针对人冠状病毒的抗病毒治疗方法。相反，主要治疗仍然是支持性和姑息性护理。
有效的SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的开发也获得了有限的成功。许多传统的疫苗策略已被利用，包括灭活病毒、重组减毒病毒、其他活病毒载体、亚单位疫苗或由DNA质粒或RNA递送系统表达的单个病毒蛋白。传统的SARS疫苗主要集中在刺突(S)蛋白上，因为它在人受体结合、膜融合和病毒进入方面的功能。此外，S蛋白是冠状病毒的主要抗原，且是保护性中和抗体的结合位点，其可以阻止病毒受体结合和感染的起始。尽管利用全长S蛋白的灭活SARS-CoV制剂在免疫动物中诱导了中和抗体，但这些常规疫苗在人中并不那么有效，而且已经发现引起了重大的安全问题(例如，在许多系统中实际上增强了病毒感染)。同样地，虽然已经开发和测试了许多不同的SARS和MERS疫苗，但所有的疫苗都显示通过病毒中和来保护免受感染，而没有伴随与全长或三聚体S蛋白疫苗相关的免疫病理学。
应理解，不同的病毒载体是已知的一系列抗原的运载体，向宿主生物体，例如哺乳动物，如人，提供有效的治疗性递送。然而，这样的病毒载体往往在与所递送的特定抗原分开的载体引起的免疫反应方面有所不同。例如，一些病毒载体，如
Figure BDA0004008870710000051
埃博拉扎伊尔疫苗(Ebola Zaire Vaccine)，是活病毒，会刺激宿主的免疫系统产生反应。然而，在许多情况下，对病毒载体本身的反应会钝化对病毒载体所递送的抗原的预期免疫反应，例如通过显示出对一种抗原的免疫优势，从而阻碍在以后接种相同或相似疫苗时产生反应。有利地，已经发现本发明的抗原可以与TMV NtK载体偶联，而后者不会刺激宿主的免疫反应，不会显示出一种抗原的免疫优势，也不会影响后续使用相同病毒载体的疫苗的分剂量给予。而且，避免这种由病毒载体本身引起的免疫反应，为二价、三价和四价疫苗提供了进一步的优势，因为可以评估对每个抗原的反应，而不必考虑病毒载体的影响，无论是在当前的疫苗接种还是在未来的接种中。
因此，对于用于预防Covid-19疾病的有效和可扩展的疫苗策略存在重大、紧迫和全球性的需求，需要既能引起高水平的中和抗体，又能在免疫后的很长一段时间内诱导持久、强力的中和抗体滴度的策略。与本文概述的其他特征和优点一起，本文描述的根据多个实施方式和替代性方式的平台满足了这一需求和其他需求。这样，根据本实施方式的疫苗在临床前研究中表现出强烈的免疫反应，能够一次与多个CoV抗原偶联(即多价疫苗)，这比传统的单价疫苗有显著的优势，引起高水平的中和抗体，并有可能在免疫后长时间诱导持久、强力的中和抗体滴度。
发明内容概述
在根据本公开的一些实施方式中，病毒纯化方法涉及多重过程，包括：从源生物体中收获含有至少一种病毒的病毒材料；从至少一种病毒中去除细胞碎片，从而澄清至少一种病毒的结构；将分离并澄清的病毒浓缩，其在一些实施方式中用包括膜的过滤装置进行，该膜所具有的孔的尺寸不超过使用者选择的预定限值；通过对浓缩的病毒进行一系列分离程序并在每个分离程序后收集病毒来对其进行加工，其中至少一个分离程序包括离子交换色谱法，其从病毒中分离宿主细胞污染物，并且至少一个分离程序包括多峰色谱法，其至少根据病毒和杂质之间的尺寸差异以及杂质与一种或多种色谱配体之间发生的化学相互作用，从病毒中分离残留的杂质。在一些实施方式中，植物是经历病毒的重组表达的源生物体，作为非限制性实例有本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和浮萍(Lemna minor)。当源生物体是植物时，收获可以包括种子生产和植物萌发，并诱导瞬时基因表达以形成所需蛋白质，如下所述。或者，经历病毒的重组表达的源生物体是非植物宿主，例如但不限于细菌、藻类、酵母、昆虫或哺乳动物生物体。
另外，本文所述的多个实施方式的各个方面涉及产生和/或纯化可与病毒颗粒偶联的抗原。在本实施方式和替代方式中，病毒颗粒包括但不限于病毒和/或其片段中的一种、一些或全部，如杆状病毒、二十面体病毒、包膜病毒以及上述一种或多种的片段。在一些实施方式中，植物是经历抗原的重组表达的源生物体；或者，经历抗原的重组表达的源生物体是非植物宿主，例如但不限于细菌、藻类、酵母、昆虫或哺乳动物生物体。
有利地，根据本文所述的各种实施方式实施的多重过程以商业规模产生高度纯化的病毒和/或重组抗原。采用各种步骤来改进上游纯化工艺，例如富集植物病毒。一些实施方式利用尺寸排阻色谱法以及其他特征来产生纯化的重组病毒和重组抗原。因此，本文所述的各种实施方式提供了一种或多种病毒和一种或多种抗原，适合于制备一种或多种偶联的病毒和抗原的疫苗。
关于病毒，通过实施本文所述的本发明的病毒纯化平台的一些实施方式，已实现杆状植物病毒(例如烟草花叶病毒，即“TMV”)和二十面体植物病毒(例如红三叶草花叶病毒)的纯化。根据本文的多个实施方式，实现了TMV和红三叶草花叶病毒的纯化，就尺寸和结构而言代表两种结构上有所差别的病毒。例如，像红三叶草花叶病毒这样较小的二十面体病毒具有T＝3的对称性，尺寸大约为31-34nm，约180个衣壳蛋白。相反，TMV的直径约为18nm，长度为300nm，含有2160个衣壳蛋白，TMV病毒粒子是由约17.5kDa的衣壳蛋白的大约2,131个拷贝构成的刚性杆状颗粒，以每个衣壳蛋白3nt的比率螺旋式包裹着基因组RNA。TMV NtK基因组为6,407个核苷酸，预计由2,135个衣壳蛋白包覆。虽然以下声明无意限制任何特定的病毒运载体用于本发明的实施，但对合适的TMV-NtK中间体和此类病毒的衣壳蛋白的其他说明和特征可以在参考文献中找到，例如，但不一定限于美国专利第7,939,318号(McCormick,等,“灵活的疫苗组装和疫苗递送平台(Flexible vaccine assembly andvaccine delivery platform)”)和Smith,等“改良的烟草花叶病毒颗粒作为支架，用于疫苗施用的蛋白抗原的展示(Modified Tobacco mosaic virus particles as scaffoldsfor display of protein antigens for vaccine applications),”Virology 2006；348(2):475-88。鉴于与不同种类的病毒相关的多样性，本发明的过程已经基于两种结构上不同的病毒进行了工作，以允许病毒穿透至渗透物中而同时保留不需要的细胞碎片。在使用中，可以控制操作参数，以使所有类型的病毒都穿透至渗透物中而同时保留叶绿素/细胞碎片，并且切向流(TFF)系统继续高效运行，而不会不适当地或不合时宜地发生污染。额外的TFF步骤被设计用来保留病毒，同时允许较小的蛋白质进入渗透物，双色谱步骤被控制用来排除大的和小的病毒，同时捕获宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、内毒素和植物多酚类。
基于红三叶草花叶病毒和TMV的成功纯化，预计根据多个实施方式和替代方式的病毒纯化平台可以成功纯化多种病毒颗粒，包括：病毒，其包括的范围有遗传物质(例如双链和单链DNA病毒以及RNA病毒)、几何形状(例如杆状、弯曲杆和二十面体)以及科(花椰菜病毒科(Caulimoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、伴生病毒科(Sequiviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae))。
预期本文所述的实施方式可在其上获得成功的非限制性病毒包括如下所述的属：杆状去氧核糖核酸病毒属(Badnavirus)(如鸭跖草黄斑驳病毒)；花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(如花椰菜花叶病毒)；SbCMV样病毒(如大豆褪绿斑驳病毒)；CsVMV样病毒(如木薯叶脉花叶病毒)；RTBV样病毒(如水稻东格鲁杆状病毒)；碧冬茄脉明样病毒(如碧冬茄脉明病毒)；玉米线条病毒属(Mastrevirus)(双生病毒亚组I)(如玉米线条病毒)和曲顶病毒属(Curtovirus)(双生病毒亚组II)(如甜菜曲顶病毒)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)(双生病毒亚组III)(如菜豆金色花叶病毒)；苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)(如苜蓿花叶病毒)；等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)(如烟草线条病毒)；雀麦花叶病毒属(Bromovirus)(如雀麦花叶病毒)；黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)(如黄瓜花叶病毒)；长线形病毒属(Closterovirus)(如甜菜黄化病毒)；毛形病毒属(Crinivirus)(如莴苣传染性枯黄病毒)；豇豆花叶病毒属(Comovirus)(如豇豆花叶病毒)；蚕豆病毒属(Fabavirus)(如蚕豆萎蔫病毒1)；多角体病毒属(Nepovirus)(如烟草环斑病毒)；马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(如马铃薯Y病毒)；黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)(如黑麦草花叶病毒)；大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)(如大麦黄花叶病毒)；伴生病毒属(Sequivirus)(如欧防风黄点病毒)；矮化病毒属(Waikavirus)(如水稻东格鲁球状病毒)；香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)(如香石竹斑驳病毒)；香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)(如香石竹环斑病毒)；玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)(如玉米褪绿斑驳病毒)；坏死病毒属(Necrovirus)(如烟草坏死病毒)；番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)(如番茄丛矮病毒)；发形病毒属(Capillovirus)(如苹果茎沟病毒)；香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)(如香石竹潜隐病毒)；耳突花叶病毒属(Enamovirus)(如豌豆耳突花叶病毒)；真菌传杆状病毒属(Furovirus)(如小麦土传花叶病毒)；大麦病毒属(Hordeivirus)(如大麦条纹花叶病毒)；悬钩子病毒属(Idaeovirus)(如悬钩子丛矮病毒)；大麦黄矮病毒属(Luteovirus)(如大麦黄矮病毒)；玉米雷亚朵非纳病毒属(Marafivirus)(如玉米雷亚朵非纳病毒)；马铃薯X病毒属(Potexvirus)(如马铃薯X病毒和三叶草花叶病毒)；南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)(如南方菜豆花叶病毒)；纤细病毒属(Tenuivirus)(如水稻条纹病毒)；烟草花叶病毒(Tobamovirus)(如烟草花叶病毒)；烟草脆裂病毒属(Tobravirus)(如烟草脆裂病毒)；纤毛病毒属(Trichovirus)(如苹果褪绿叶斑病毒)；芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)(如芜菁黄花叶病毒)；以及幽影病毒属(Umbravirus)(如胡萝卜斑驳病毒)。
已经以商业规模完成了成功的病毒纯化，并符合cGMP法规。在一些实施方式中，源生物体是植物，但尽管本实施方式的一些变体包括产生基于植物的病毒，本文所述的实施方式不限于在植物中制造或纯化病毒。在一些实施方式中，病毒纯化平台首先让植物在受控的生长室中生长，通过病毒复制感染植物，用破碎器破碎细胞并通过螺旋挤出从液体中去除植物纤维，藉此回收病毒。
在同时涉及基于植物的病毒和非植物病毒的一些实施方式中，纯化步骤包括使用切向流系统将澄清的提取物浓缩，其中，盒的孔径、跨膜压力和每平方米膜表面积的澄清提取物载量是受控的。跨膜压力(TMP)是分离膜上游和下游两侧的压力差，根据以下公式计算：((进料压力+截留压力)/2)-渗透压力。为了确保病毒穿过陶瓷以产生澄清的提取物，在一些实施方式中，对进料压力、截留压力和渗透压力分别进行控制以获得合适的TMP。澄清的提取物用离子交换柱体积进一步浓缩，并用离子交换色谱平衡缓冲液进行洗涤。在一些实施方式中，使Capto Q离子交换柱达到平衡，将进料上样并收集在流穿级分中。然后将柱洗涤至基线，并用高盐将宿主细胞污染物从柱上剥离。
在与基于植物的病毒有关的一些实施方式中，在使用切向流陶瓷过滤去除叶绿素及其他大细胞碎片如大分子纤维、细胞器、脂质等之前，添加提取缓冲液。在一些实施方式中，陶瓷过滤促进了植物宿主的叶绿素、细胞碎片和其他杂质的截留，同时优化了病毒的穿过。无论是基于植物的病毒还是非植物病毒，这种方法(其中所需物质(病毒或抗原)都作为渗透物穿过，杂质作为截留物保留下来)均可提高工艺的可扩展性。此外，跨膜压力、陶瓷孔径和每平方米载荷的生物量等参数都是受控的，以确保病毒穿过陶瓷，形成澄清的提取物。陶瓷TFF系统具有高度可扩展性，并且可容易地缩放诸如TMP、错流速度、孔径和表面积之类的参数，以接受更大量的生物质。额外的陶瓷模块可以很容易地添加到系统中。也可以控制进料、截留和渗透压力，以维持高效的错流速度，从而几乎不污染系统。在一些实施方式中，设定并控制错流速度和压力差，以产生约10-20psi的TMP，以使较小和较大规模的病毒能够高效地穿过。陶瓷TFF系统可以经受住高效的清洁化学品，如硝酸、漂白剂和氢氧化钠，允许进行清洁研究，满足GMP和/或cGMP要求。
无论是基于植物的病毒还是非植物病毒，根据多个实施方式和替代方式的纯化方法、以及与可扩展的高通量病毒纯化方法的开发相一致的其他方法中，采用至少一种使用多峰色谱法的分离程序，至少根据病毒和杂质之间的尺寸差异以及杂质与一种或多种色谱配体之间发生的化学相互作用，从病毒中分离残留的杂质。例如，用
Figure BDA0004008870710000091
Core 700色谱树脂(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences))进行至少一个分离过程包括于本实施方式的范围内。
Figure BDA0004008870710000101
Core 700‘珠’包括辛胺配体，其设计为具有疏水性和正电荷性，可捕获一定大小的分子，例如700千道尔顿(kDA)。因为某些病毒非常大(例如大于700kDA)，而珠外部是不活跃的，
Figure BDA0004008870710000102
Core 700允许通过尺寸排阻法纯化病毒，其中所需物质(病毒或抗原)作为渗透物穿过，杂质作为截留物保留。
在一些实施方式中，同样是对于基于植物的病毒和非植物病毒，都在多峰色谱柱之前用五倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡。在一些实施方式中，将来自Capto Q离子交换色谱的合并的流穿级分和洗涤级分上样到多峰色谱柱上，并将病毒收集在柱的空白体积中。将柱洗涤至基线，并用高电导率氢氧化钠剥离。一些实施方式的方面提供了在该步骤期间控制上样比率、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液。
将纯化的病毒例如通过渗滤进行无菌过滤，并储存。
关于抗原，通过实施本文所述的本发明的抗原纯化平台的一些实施方式，产生并纯化了重组抗原H5重组流感血凝素(rHA)、H7 rHA、西尼罗河病毒的结构域III(WNV rDIII)和拉沙热病毒重组蛋白1/2(LFV rGP1/2)，H1N1(甲型流感(Influenza A)/密歇根(Michigan))、H1N1(甲型流感/布里斯班(Brisbane))、H3N2(甲型流感/新加坡(Singapore))、H3N2(甲型流感/堪萨斯(Kansas))、B/科罗拉多(Colorado)和B/普吉岛(Phuket)、融合至人IgG1 Fc结构域的SARS-2刺突糖蛋白的RBD-Fc 121(受体结合结构域(RBD,S1结构域)(本文中“RBD-Fc121”指SARS-2刺突蛋白的氨基酸序列，如下文更详细解释)),和RBD-Fc 139(本文中“RBD-Fc 139”指SARS-2刺突蛋白的不同氨基酸序列，如下文更详细解释)。本文各种实施方式的抗原可以有很多来源，可以使用传统的重组蛋白制造策略，包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或基于植物的表达方法来生产。
在一些实施方式中，抗原制造平台首先让植物在受控的生长室中生长，感染植物以进行重组抗原复制，接着使用破碎器回收抗原，然后通过螺旋挤出从水性液体中去除纤维。加入提取缓冲液，以协助通过过滤去除叶绿素(在植物的情况下)和大的细胞碎片。无论是基于植物的还是非植物抗原，进料压力、过滤孔径、澄清剂和每平方米膜表面载荷的生物量都是受控的，以促进抗原穿过过滤器。对适合实现大规模病毒和抗原纯化的各种过程中控制的描述(尽管是非限制性的)，在实施例部分进一步详细表述。
在一些实施方式中，对于基于植物的抗原和非植物抗原，随后都用切向流系统将澄清的提取物浓缩。在这个任选的步骤中，包括盒的孔径、跨膜压力和每平方米膜表面的澄清提取物的载荷等因素都是受控的。在一些实施方式中，任选步骤被完全跳过。在这之后，澄清的提取物接下来被浓缩，并用离子交换色谱平衡缓冲液进行清洗。进行这一步骤的一种方法是将进料装入平衡的Capto Q离子交换柱，然后用平衡缓冲液洗涤，用盐洗脱/剥离。然后将抗原级分收集在洗脱物中，以备钴固定化金属亲和色谱(IMAC)。平衡IMAC，进料，然后用平衡缓冲液洗涤并洗脱。稀释洗脱级分并检测pH，然后将其上样到多峰陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱柱上。用平衡缓冲液平衡CHT树脂，并洗脱抗原。上样比率、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液是受控的因素。最后，抗原被浓缩，并用生理盐水缓冲液进行渗滤。重组抗原被灭菌过滤，然后储存。
再者，根据本文公开的各种实施方式，已经成功地偶联了以下单价制剂：H7 rHA偶联至TMV、H1N1(甲型流感/密歇根)偶联至TMV、H3N2(甲型流感/新加坡)偶联至TMV、B/科罗拉多偶联至TMV、B/普吉岛偶联至TMV、RBD-Fc121(SARS-2)至TMV和RBD-Fc 139(SARS-2)至TMV。根据本文的多种实施方式，TMV与两种乙型流感(Influenza B)病毒(B/科罗拉多和B/普吉岛)的二价制剂也已成功偶联，以及TMV与H1N1(甲型流感/密歇根)、H3N2(甲型流感/新加坡)、B/普吉岛和B/科罗拉多的四价偶联也已成功偶联。“四价”流感疫苗旨在预防四种不同的流感病毒：两种甲型流感病毒和两种乙型流感病毒。多年来，三价疫苗被普遍使用，但现在四价疫苗是最常见的，因为它们可能通过增加另一种乙型病毒而对循环的流感病毒提供更广谱的保护。在本文中，术语“多价”疫苗指的是多于一种抗原偶联至病毒。在一些实施方式中，根据多个实施方式和替代方式，所述蛋白质由能够与病毒偶联以产生疫苗、然后被递送至源生物体以产生免疫反应的任何类型的治疗剂组成。因此，本文的发明提供了包含一系列病毒-蛋白质偶联物的组合物，其包括病毒-抗原偶联物。在一些实施方式中，所选择的病毒是TMV或由本文的技术启示认识和/或指示的多种病毒中的任何一种。此外，在一些实施方式中，蛋白质可以是抗原，例如但不限于流感血凝素抗原(HA)，包括但不限于本段中列出的抗原，其包括介导病毒感染的流感病毒的表面上发现的HA蛋白的可溶形式。在一些实施方式中，HA表现出至少约50％的三聚体形成。HA在临床上很重要，因为它们趋于被生物体产生的某些抗体所识别，提供了对多种流感感染的主推力保护。因为HA的抗原性，所以HA的免疫原性与构象有关，已知HA三聚化在引发免疫反应方面优于单体形式。
在一些实施方式中，偶联首先将纯化的抗原和病毒浓缩并渗滤至微酸性缓冲液中。然后基于摩尔浓度将抗原和病毒组合并混合。将新鲜制备的水溶性碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(也称为EDC)添加到混合物中，并同时基于摩尔浓度混合。然后基于摩尔浓度添加用于将羧基转化为可与胺反应的N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯的化学试剂，例如赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的Sulfo-NHS。继续反应直到预定的停止时间。然后将反应淬灭，其中一个示例涉及添加胺基(例如含有游离胺的液体)，并通过多峰色谱步骤或渗滤去除用于促进反应的任何化学接头(例如EDC、Sulfo-NHS)，然后将混合物稀释至目标浓度。在一些实施方式中，用蛋白质和抗原装饰的偶联和纯化的病毒颗粒可用于疫苗和/或诊断工具。这些颗粒可以用作诊断工具，因为它们有能力追踪宿主生物体内的抗原。
在一些实施方式中，除本文公开的各种实施方式外，纯化的病毒-抗原融合物还可源自基因融合物。抗原和病毒结构蛋白(位于外壳中)形成单一的连续开放阅读框。在一些实施方式中，该阅读框在植物中产生抗原-外壳蛋白质，使得外壳蛋白自我组装成病毒颗粒。接下来，根据本文公开的实施方式，收获植物材料并纯化病毒颗粒。然后，根据所公开的各种实施方式，用融合外壳蛋白装饰的病毒颗粒可用作疫苗和/或诊断工具。
一些病毒(例如作为非限制性实例的二十面体病毒)在某些pH条件下溶胀，并且在一些实施方式中，该“溶胀”可用于偶联。根据多个实施方式和替代方式，纯化的病毒可以通过将病毒结构置于酸性pH条件下，使病毒“膨胀(swell)”，从而偶联至治疗剂。通过用中性pH条件处理病毒结构，病毒结构松弛并在病毒的五聚体或其他结构亚基之间形成孔。接着，将治疗剂(例如化疗剂)添加到缓冲液中，并使其扩散至松弛的病毒颗粒中。通过再次改变pH值，病毒颗粒会收紧并去除将五聚体或结构亚基包装在一起的孔结构，从而防止化学物扩散进入或流出病毒颗粒。接下来，根据本文公开的实施方式，收获植物材料、纯化病毒颗粒，并将含有治疗剂的病毒颗粒用于药物递送。
因此，多个实施方式和替代方式包括一种或多种高度纯化的病毒的产生。更进一步地，多个实施方式和替代方式涵盖了重组抗原的生产或纯化或二者都有。更进一步地，多个实施方式和替代方式涵盖纯化的抗原和病毒的偶联，以用作疫苗。事实上，在临床前研究中，根据本文所述实施方式生产的TMV-平台疫苗刺激了针对多种病原体(包括病毒和抗菌系统)的有效免疫反应。此外，在本发明的TMV-平台上生产的疫苗证明了能够一次性偶联多个冠状病毒(CoV)抗原(即，多价疫苗)以刺激有效的免疫反应。这与常规单价疫苗相比具有显著优势，包括通过应用这些疫苗来对抗Covid-19疾病和流感(作为非限制性例子)。根据本发明的实施方式，病毒的纯化可以自身实施。同样地，重组抗原的生产或纯化也可以根据本发明的实施方式单独进行。任选地，这些多个实施方式的不同方面也可以组合，其中除其他实施这些实施方式的方法外，组合的实施方式将包括：从一种或多种源生物体开始，从中产生一种或多种病毒和一种或多种抗原，然后纯化该病毒和抗原，然后形成疫苗，该疫苗是至少一种抗原和至少一种病毒之间的偶联物。
附图简要说明
关于本公开的国际申请文件包含一个或多个以彩色绘制的图像，因为在黑白图像中不能实现或不可能呈现要显示的内容，例如，但不限于，图51(A)和图51(B)中的蛋白质结构和RBD-Fc融合体，图61中的显微镜图像，以及图71(A)-(C)、79(A)-(B)和81(A)-(B)中分别呈现多个线条的图。用于公开，如果需要，申请人将提供真正的黑白图像，代表彩色图像，不增加内容。
本文所述的附图和实施方式说明了本文公开的多个实施方式和替代方式的多个替代结构、方面和特征，并且它们不应被理解为限制这些实施方式和替代方式中的任一个的范围。还应理解，本文描述和提供的附图并不是按比例绘制的，并且本发明的实施方式并不限于所示的精确设置、描述和工具。
图1是显示根据多个实施方式和替代方式的，在本公开范围内的特定病毒纯化平台中的步骤的流程图。
图2是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的二十面体红三叶草花叶病毒。
图3是根据多个实施方式和替代方式的，二十面体红三叶草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图4是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的二十面体红三叶草花叶病毒。
图5是根据多个实施方式和替代方式的，二十面体红三叶草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图6是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的杆状烟草花叶病毒。
图7是根据多个实施方式和替代方式的，杆状烟草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图8是显示根据多个实施方式和替代方式的抗原制造平台的步骤的流程图。
图9是显示根据多个实施方式和替代方式的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图10是显示根据多个实施方式和替代方式的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图11是显示根据多个实施方式和替代方式的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图12是显示根据多个实施方式和替代方式的，通过抗原制造平台进行的各种抗原纯化的蛋白质印迹分析。
图13是根据多个实施方式和替代方式的，重组抗原偶联至病毒的图示。
图14是根据多个实施方式和替代方式的，抗原偶联至病毒的SDS-PAGE分析。
图15是根据多个实施方式和替代方式的，抗原偶联至病毒的SDS-PAGE分析。
图16是根据多个实施方式和替代方式的，抗原偶联至病毒的SDS-PAGE分析。
图17是根据多个实施方式和替代方式的，游离TMV产品的尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)报告。
图18是根据多个实施方式和替代方式的，在病毒和抗原之间偶联15分钟的SEC-HPLC报告。
图19是根据多个实施方式和替代方式的，在病毒和抗原之间偶联2小时的SEC-HPLC报告。
图20是根据多个实施方式和替代方式的，病毒和抗原之间的偶联的蛋白质印迹分析。
图21是显示根据多个实施方式和替代方式的，用各种水平的UV辐射处理的病毒的感染性的图。
图22是根据多个实施方式和替代方式的，重组抗原与病毒的偶联平台的一些步骤的图示。
图23是根据多个实施方式和替代方式的，抗原偶联至病毒的SDS-PAGE分析。
图24是根据多个实施方式和替代方式的，重组抗原的负染色透射电子显微镜(TEM)图像。
图25是根据多个实施方式和替代方式的，病毒的负染色TEM图像。
图26是根据多个实施方式和替代方式的，与添加了病毒的另一种重组抗原偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图27是根据多个实施方式和替代方式的，以1：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图28是根据多个实施方式和替代方式的，以1：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图29是根据多个实施方式和替代方式的，以4：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图30是根据多个实施方式和替代方式的，以16：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图31是根据多个实施方式和替代方式的抗原的标准化沉降系数分布。
图32是根据多个实施方式和替代方式的病毒的标准化沉降系数分布。
图33是根据多个实施方式和替代方式的，以1：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图34是根据多个实施方式和替代方式的，以1：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图35是根据多个实施方式和替代方式的，以1：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图36是根据多个实施方式和替代方式的，以4：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图37是根据多个实施方式和替代方式的，以16：1的病毒：重组抗原比率与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图38是根据多个实施方式和替代方式的，以各种病毒：重组抗原比率给予病毒-抗原产品之后的源生物体中抗原相关滴度的散点图。
图39是根据多个实施方式和替代方式的，显示以各种病毒：重组抗原比率给予病毒-抗原产品之后的源生物体中抗原相关滴度的几何平均数检验。
图40是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组抗原的SDS-PAGE分析。
图41(A)-(B)提供了QIV偶联物在两个不同温度范围内的稳定性数据图。
图42是根据多个实施方式和替代方式的，四价疫苗在小鼠中的免疫原性的图示。
图43是根据多个实施方式和替代方式的，四价疫苗在雪貂中的免疫原性和攻击研究的图示。
图44是根据多个实施方式和替代方式的，雪貂中病毒攻击后鼻腔冲洗病毒滴度的图示。
图45是根据多个实施方式和替代方式的，雪貂中病毒攻击后鼻腔冲洗病毒滴度的图示。
图46是根据多个实施方式和替代方式的，在多种病毒比重组抗原比率下，小鼠中生产的单价疫苗的免疫原性的图示。
图47是根据多个实施方式和替代方式的，注射四价疫苗后经过一段时间在组织中TMV vRNA的图示。
图48是根据多个实施方式和替代方式的，注射四价疫苗后八天在组织中TMV vRNA的图示。
图49是根据多个实施方式和替代方式的，注射四价疫苗后，基于从兔血清样品中的ELISA分析的总抗流感滴度的图示。
图50是根据多个实施方式和替代方式的，注射四价疫苗后在兔中测量的中和滴度的图示。
图51(A)是空间填充模型中Covid-19刺突三聚体的蛋白质结构图，受体结合结构域在水平和垂直视图中被圈出。图51(B)是根据多个实施方式和替代方式的，Covid-19受体结合结构域与人Fc结构域融合体的图示。
图52是根据多个实施方式和替代方式的，包含重组Covid-19抗原的构建体的表达质粒的图示。
图53是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组Covid-19抗原的SDS-PAGE分析。
图54是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组Covid-19抗原的SEC-HPLC报告。
图55是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组Covid-19抗原的SDS-PAGE分析。
图56是根据多个实施方式和替代方式的，重组Covid-19抗原与病毒的偶联平台和药物物质填充的一些步骤的图示。
图57是根据多个实施方式和替代方式的重组Covid-19抗原偶联至病毒的标准化沉降系数分布。
图58是根据多个实施方式和替代方式的重组Covid-19抗原偶联至病毒的标准化沉降系数分布。
图59是根据多个实施方式和替代方式的重组Covid-19抗原偶联至病毒的SDS-PAGE分析。
图60(A)是说明重组Covid-19抗原与Covid-19人中和单克隆抗体结合的ELISA标准曲线。图60(B)是说明根据本文所述的多个实施方式和替代方式的多种疫苗替代物(有时在本文中称为疫苗候选物)的结合，以及根据多个实施方式和替代方式的结合至Covid-19人中和单克隆抗体的图。
图61由以下组成：共聚焦显微镜图像，说明了根据多个实施方式和替代方式，重组Covid-19抗原与ACE-2特异性抗体的共定位。
图62(A)是根据多个实施方式和替代方式，说明天然激动剂和重组Covid-19抗原与ACE-2特异性抗体的共定位的图。图62(B)是根据多个实施方式和替代方式，说明在存在共定位对照的情况下，天然激动剂和重组Covid-19抗原与ACE-2特异性抗体的共定位的图。
图63(A)-(D)是显示在首次接种(随后在第14天进行加强)示例性疫苗后，在有和没有佐剂的情况下，在免疫前、第12天、第28天和第42天，在增加稀释水平和含有不同浓度的RBD-Fc抗原的情况下，合并的血清样品进行噬斑中和试验的结果。
图64(A)-(B)提供了进一步检查在第28天和第42天按照相同稀释度的15和45μg组但不含佐剂生产的中和滴度的图表。
图65(A)是说明用重组Covid-19抗原和对照物免疫的动物的免疫反应的图。图65(B)是说明用偶联至病毒的重组Covid-19抗原(无佐剂)免疫的动物的免疫反应的图。图65(C)是说明用含佐剂的偶联至病毒的重组Covid-19抗原免疫的动物的免疫反应的图。图65(D)比较了识别Covid-19抗原(黑色)和RBD-His(灰色)的IgG滴度。
图66(A)-63(C)是根据多个实施方式和替代方式，说明取自用偶联至病毒的重组Covid-19抗原、对照和佐剂免疫的动物的个体血清的IgG同种型分析的图示。图66(A)说明了与分析相关的Th1反应(IgG2a和IgG2c)，图66(B)说明了与分析相关的Th2反应(IgG1)，图66(C)是通过ELISA分析的相对IgG2比IgG1抗体反应的堆叠图比较。
图67是根据多个实施方式和替代方式的，说明用SARS2病毒与鼠血清孵育后的细胞活力的图。
图68是根据多个实施方式和替代方式的，说明用偶联至病毒的重组Covid-19抗原、对照免疫的动物和历史比较的免疫反应滴度的图。
图69用不同浓度的示例性疫苗接种小鼠后的病毒中和滴度图。
图70(A)是说明用病毒和重组Covid-19抗原免疫的动物的IFNγELISpot分析的图。图70(B)是说明用无佐剂的TMV:RBD-Fc疫苗免疫的动物的IFNγELISpot分析的图。图70(C)是说明用TMV:RBD-Fc疫苗和佐剂免疫的动物的IFNγELISpot分析的图。
图71(A)-(C)提供了与对照组相比，基于不同浓度的RBD-Fc疫苗的接种，感染后测试对象的存活率图，图71(A)；临床表现图，图71(B)；和攻击后体重图，图71(C)。
图72是说明根据多个实施方式和替代方式，对来自用各种TMV:RBD-Fc疫苗剂量免疫的小鼠的鼠血清的
Figure BDA0004008870710000191
分析，有佐剂和无佐剂的情况。
图73(A)-(B)提供了通过
Figure BDA0004008870710000192
分析来自动物研究的血清的特异性和相对滴度，比较不同捕获抗原的实验结果的图表。
图74是通过
Figure BDA0004008870710000193
在来自个体动物的第42天血清中测量的滴度与个体和合并中和滴度比较的图。
图75(A)是显示添加了非发明性抗体的暴露于SARS-2的核衣壳和刺突蛋白的巨噬细胞的活力的结果，作为疾病的抗体增强的指标。图75(B)是含有抗体的小鼠血清图，这些抗体是根据多个实施方式和替代方式由TMV:RBD-Fc疫苗产生的，在暴露于SARS-CoV2的核衣壳和刺突蛋白之后。图75(C)显示了适用于图75(A-B)中的图的统计差异。
图76是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组Covid-19抗原的SDS-PAGE分析。
图77是根据多个实施方式和替代方式的，纯化的重组Covid-19抗原的SEC-HPLC报告。
图78说明了SARS-2和其他相关冠状病毒的刺突蛋白的受体结合结构域序列比对。
图79(A)-(B)分别提供了小鼠和雪貂的攻击研究的数据图，其中对象以不同的比率、在有佐剂和无佐剂的情况下被接种示例性疫苗。
图80提供了基于没有感染的接种示例性疫苗后体重随时间变化的疫苗耐受性的图。
图81(A)-(B)分别提供了兔子的体重增加和存活率的攻击研究的数据图，其中对象以不同的比率、在有佐剂和无佐剂的情况下被接种示例性疫苗。
多个实施方式和替代方式
根据本文的多个实施方式和替代方式的多重过程改进了上游纯化工艺，进一步富集了植物病毒，并促进了病毒和抗原的偶联以形成疫苗。根据多个实施方式和替代方式生产和纯化病毒的步骤如表1和图1中列出并讨论。同样地，生产和纯化抗原的步骤如表2中列出并讨论。尽管多个平台都有下面描述的具体实施方式，但本文所包含的实施方式的范围不限于任何一个具体的实施方式。
病毒产生和纯化
表1和图1显示根据多个实施方式和替代方式的病毒纯化平台的步骤。
表1.病毒的产生和纯化
Figure BDA0004008870710000201
Figure BDA0004008870710000211
该纯化平台设计成有商业可扩展性并符合cGMP法规，并在整个纯化过程中使用一种缓冲液。根据多个实施方式和替代方式，给出了病毒纯化平台的步骤，与植物表达有关。然而，如下所述的在气生组织收获和细胞破碎之后的步骤也将适用于非植物病毒(除非上下文与植物明显相关，例如，提及去除植物纤维)。
根据本文所述的多个实施方式和替代方式，病毒表达通过适合于特定宿主的方法完成。在一些实施方式中，基于病毒向植物宿主递送基因是通过修饰的TMV表达载体使烟草植物重组地形成病毒来完成的。一种此类可用替代方式是美国专利7,939,318“灵活的疫苗组装和疫苗递送平台”中描述的
Figure BDA0004008870710000212
平台。该专利中描述的这种基于植物的瞬时表达平台采用了植物病毒TMV来利用植物蛋白生产机制，在接种后很短的收获时间内(例如，少于21天)表达各种病毒。接种了病毒基因的烟草植物在受感染的细胞中表达特定的病毒，并在收获时提取病毒。作为本文所述方法的使用者选择的例子，接种是通过对叶片表面的手工接种、对植物床的机械接种、对叶片的高压喷雾或真空渗透进行的。
除本氏烟草(Nicotiana benthamiana)外，本公开还考虑了其他植物和非植物宿主，包括发明内容中提到的那些。除
Figure BDA0004008870710000213
平台外，可以采用其他策略将基因递送至植物(作为非限制性实例有膨胀浮萍(Lemna gibba)或小浮萍(Lemna minor))和非植物生物体(作为非限制性实例有藻类)。这些其他策略包括农杆菌渗透，它通过农杆菌(Agrobacterium)细菌载体将病毒基因引入整个转染植物的许多细胞。另一种是电穿孔法，在宿主的细胞膜上开孔，引入重组产生病毒和抗原的基因，例如但不限于以下实施例1和3中所述的那些。另一个策略是基于TMV RNA的过表达(TRBO)载体，它利用缺少TMV外壳蛋白基因序列的35S启动子驱动的TMV复制子，如John Lindbo,“TRBO：高效的基于烟草花叶病毒RNA的过表达载体”,Plant Physiol.第145卷,2007中所述。
在一些实施方式中，本氏烟草野生型植物在受控的生长室中生长。植物生长受控于灌溉、光照和施肥周期。植物在无土培养基中生长，并且在整个过程中控制温度。
在适当的播种后天数(DPS)，例如23-25DPS后，通过病毒复制感染植物。感染后，仅用水灌溉植物，并在一定的感染后天数(DPI)内根据病毒类型通过光照周期和温度进行控制。
检查植物的高度、感染症状，并收获气生组织。
采用配置有优化好的刀片/筛尺寸的破碎器进行病毒回收/细胞破碎，然后从水性液体中去除残留的纤维素植物纤维(例如通过螺旋挤出)。
将适当的提取缓冲液(例如200mM乙酸钠，pH 5.0；作为非限制性实例有图1的步骤201)以1：1的缓冲液：组织比率添加至所得提取物中。在中试规模(pilot scale)上，去除叶绿素和大的细胞碎片涉及使用切向流(TFF)陶瓷过滤(1.4微米/5.0微米)。在一些实施方式中，采用了额外的0.1-微米的陶瓷切向流过滤步骤。跨膜压力、陶瓷孔径和每平方米膜表面载荷的生物量都是受控的，以确保病毒穿过陶瓷。在一些实施方式中，设置并控制进料压力、截留压力和渗透压力，以产生约1.5–2巴TMP范围内的跨膜压力。任选地，陶瓷切向流过滤之后是死端过滤，例如，使用1.2微米的玻璃纤维过滤。
通过使用玻璃纤维深度过滤进一步澄清陶瓷渗透物(作为非限制性实例有图1的步骤203)。
用TFF系统(购自Sartorius AG)将澄清的提取物浓缩。盒的孔径(100–300kDa)、适当的TMP(如本文所述)，以及每平方米膜表面积的澄清提取物的载荷都是受控的。
将澄清的提取物浓缩至2倍于离子交换柱体积的NMT，并用离子交换色谱平衡缓冲液(200mM乙酸钠，pH 5.0，图1的步骤204提供了一个非限制性实例)洗涤7次。将Capto Q离子交换柱用五倍柱体积的200mM乙酸钠，pH 5.0平衡(图1的步骤205提供了一个非限制性实例)，将进料上样并收集在流穿级分中。将柱洗涤至基线，并用高盐将宿主细胞污染物从柱上剥离。
收集流穿级分和洗涤级分，合并以备多峰
Figure BDA0004008870710000231
Core 700色谱。将多峰色谱柱用五倍柱体积的平衡缓冲液(200mM醋酸钠，pH 5.0；图1的步骤206提供了一个非限制性实例)平衡。
将来自Capto Q离子交换色谱的合并的流穿级分和洗涤级分上样到柱上，并将病毒收集在柱的空白体积中。将柱洗涤至基线，并用高电导率氢氧化钠剥离。上样比率、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液都是受控的。在一些实施方式中，病毒的配制和浓缩(图2的步骤208)是用TFF系统(例如Sartorius AG系统)进行的。孔径(30-300kDa)、合适的TMP(如本文所述)，以及每平方米膜表面积的载荷和孔材料都是受控的。病毒被浓缩到合适的浓度，如10mg/ml，在一些实施方式中，用合适的缓冲液(如磷酸钠)进行渗滤。将配制好的病毒消毒并适当保存。在一些实施方式中，用PES滤器进行消毒。
本文提供的所有实例都意在说明病毒产生、病毒纯化、抗原产生、抗原纯化和病毒-抗原偶联的任何或全部的多个实施方式和替代方式的各个方面。这些例子是非限制性的，只是本文多个替代性实施方式的特征。
实施例1—二十面体红三叶草花叶病毒的纯化
作为检测混合物中各种蛋白质的已知技术，图3中提供的蛋白质印迹(WesternBlot)，其中显示图2所示的二十面体红三叶草花叶病毒的成功纯化。类似地，图5中的蛋白质印迹显示成功地纯化了图4中说明的二十面体红三叶草花叶病毒。这两种病毒都是根据本文所述的实施方式纯化的。根据已知的检测技术，从组织中提取目的蛋白。然后根据等电点、分子量、电荷或这些因素的不同组合，用凝胶电泳分离样品的蛋白质。然后，样品被加载到凝胶的各个泳道，其中一个泳道保留用于"梯标"，其包含具有确定分子量的已知蛋白质的混合物。例如，在图3中，泳道12为梯标。然后在凝胶上施加电压，使各种蛋白质根据上述因素以不同的速度迁移通过凝胶。在分别在图3和5中给出的每个泳道内，不同的蛋白质被分离成可见的条带。对于蛋白质印迹，更纯的产物的特征是有清晰可见的条带，这些图中就有这样的特征。
图3和图5显示成功纯化二十面体红三叶草花叶病毒的病毒纯化平台。蛋白质印迹的每个泳道均显示在病毒纯化平台的不同步骤完成后的病毒的纯度。图3中，泳道包括：泳道1—绿汁，泳道2—TFF陶瓷澄清截留物，泳道3—TFF陶瓷澄清渗透物，泳道4—TFF盒截留物，泳道5—TFF盒渗透物，泳道6—离子交换，泳道7—离子交换，泳道8—多峰，泳道9—多峰，泳道10—30K TFF渗透物，泳道11—30K截留物，泳道12—标记物。图5中，蛋白质印迹的泳道包括如下泳道：泳道1—绿汁，泳道3—TFF陶瓷澄清截留物，泳道5—TFF陶瓷澄清渗透物，泳道7—TFF盒截留物，泳道9—TFF盒渗透物，泳道11—离子交换，泳道13—多峰，泳道14—标记物。
一旦在病毒纯化平台中进行完最后一步，就将所得病毒产品高度纯化，如图3泳道11和图5泳道13中的可见条带所示。
实施例2—杆状TMV的纯化
图6显示纯化的杆状TMV，图7显示在本文公开的多个实施方式和替代方式的范围内的、用于实现该纯化的TMV的病毒纯化平台。与图3和图5类似，图7说明了当前病毒纯化平台的各个步骤结束后病毒产物的纯度。在最后的纯化步骤之后，得到的产物是高度纯化的病毒产物，与图7第13泳道中清晰可见的条带一致。这种示例性的、偶联前、TMV-NtK中间体的身份可以通过质谱法，例如MALDI-TOF质谱法来确认。在一些实施方式中，TMV-NtK中间体的理化特性包括pH为约7.0-7.4、渗透压为约15-45mOsm/kg H20、生物负荷不大于100CFU(克隆形成单位)/mL和残留宿主细胞蛋白小于100ng/mg。
因此，本发明的病毒纯化平台已经成功地纯化出发明人应用了这些方法的每种病毒，包括二十面体病毒和杆状病毒，并且该平台有望以商业规模可重现地且一致地纯化几乎任何类型(如果不是所有类型)的病毒。
重组抗原的产生和纯化
表2和图8显示根据多个实施方式和替代方式的抗原纯化平台的步骤。
表2.重组抗原的产生和纯化
Figure BDA0004008870710000251
Figure BDA0004008870710000261
该纯化平台设计成有商业可扩展性并符合cGMP法规，并在整个纯化过程中使用一种缓冲液。根据多个实施方式和替代方式，抗原纯化平台的步骤如下：
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)野生型植物在受控的生长室中生长。植物生长受控于灌溉、光照和施肥周期。植物在无土培养基中生长，并且在整个过程中控制温度。在适当数量的DPS之后，例如23至25，植物被感染以进行所选抗原的蛋白质复制。一旦加标，蛋白质就足以保留在转基因植物细胞的ER中。感染后，仅用水灌溉植物，在合适的感染后天数通过光照周期和温度进行控制，例如7-14天，取决于抗原的类型。检查植物的高度和感染症状，并收获气生组织。
采用配置有优化好的刀片/筛尺寸的破碎器进行植物产生的抗原的回收，然后从水性液体中去除残留的纤维素植物纤维(例如通过螺旋挤出)。
将合适的提取缓冲液以合适的比率(例如1：1的缓冲液：组织比率或2：1的缓冲液：组织比率)添加到所得提取物中。在一些实施方式中，提取缓冲液可以是50-100mM磷酸钠+2mM EDTA+250mM NaCl+0.1％ Tween80,pH8.5。叶绿素和大的细胞碎片的去除涉及使用过滤。以33g/L的比率加入Celpure300并混合15分钟。进料压力(<30PSI)、过滤孔径(0.3微米)、澄清剂(Celpure300)和每平方米膜表面载荷的生物量都是受控的，以确保抗原的穿过。
用TFF系统(例如Sartorius AG系统)将澄清的提取物浓缩。在一些实施方式中，盒的孔径(例如，30kDa)、适当的TMP(如本文所述)，以及每平方米膜表面积的澄清提取物的载荷都是受控的。
将澄清的提取物浓缩，并用适当的离子交换色谱平衡缓冲液(例如50mM磷酸钠+75mM NaCl，pH 6.5)洗涤7次。Capto Q离子交换柱用50mM磷酸钠+75mM氯化钠，pH6.5平衡5个柱体积，进料上样，用平衡缓冲液洗涤，用高盐洗脱/剥离柱。
将抗原级分收集在洗脱液中，以备钴IMAC色谱。IMAC用50mM磷酸钠+500mM氯化钠，pH8.0平衡5个柱体积，进料上样，用平衡缓冲液洗涤，用咪唑洗脱。
稀释洗脱级分至一定导电率，并检测pH，将其上样到多峰陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱柱上。将CHT树脂用五倍柱体积的平衡缓冲液(5mM磷酸钠，pH 6.5)平衡。使用梯度磷酸盐和NaCl洗脱抗原。上样比率、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液都是受控的。抗原的配制和浓缩使用TFF系统(如Sartorius AG系统)进行。孔径(以kDa)、TMP、每平方米膜表面积的载荷和孔材料都是受控的，在此进一步讨论。
接着，将抗原浓缩至合适的浓度，例如3mg/ml，并用合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)渗滤。将配制好的抗原消毒并适当保存。在一些实施方式中，用PES滤器进行消毒。
图9、10和11显示根据多个实施方式和替代方式的抗原纯化平台的各个步骤。图9显示了Capto Q色谱步骤结束后抗原产物的纯度，图10显示了亲和色谱步骤后抗原产物的纯度，图11显示了CHT色谱柱后的纯度。
实施例3、4、5和6—H5 rHA、H7 rhA、WNV rDIII和LFV rGP1/2
如图12所示，根据多个实施方式和替代方式的抗原纯化平台已经成功地纯化了H5rHA、H7 rhA、WNV rDIII和LFV rGP1/2。图12包含两张从抗原纯化平台的结果中拍摄的图像：左图包含SDS Page凝胶，表明病毒载体TMV NtK(其中NtK是N末端赖氨酸的缩写)和流感抗原的纯度，右图包含蛋白质印迹，表明对西尼罗河和拉沙热抗原的免疫反应性。如图12中清晰可见的条带所示，每种抗原产品都是高纯度的。因此，根据多个实施方式和替代方式的抗原纯化平台在其使用的商业规模上一致地纯化了每种类型的抗原，其方式也符合cGMP法规。以同样的方式，该平台有望在纯化几乎任何类型(如果不是所有类型)的抗原方面具有可重复性。
重组抗原-病毒偶联物的产生
表3显示根据多个实施方式和替代方式的重组抗原偶联的步骤。
表3.重组抗原的产生和纯化
Figure BDA0004008870710000271
Figure BDA0004008870710000281
在一个实施方式中，偶联平台的步骤如下：
将纯化的抗原和病毒分别浓缩并渗滤至微酸性缓冲液中，例如含有NaCl的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。
将水溶性碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(称为EDC)在纯净水中配制成0.5M的摩尔浓度。
将羧基转化为可与胺反应的N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯的化学试剂，例如赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的Sulfo-NHS在纯净水中配制成0.1M的摩尔浓度。
基于重量或摩尔浓度将抗原和病毒合并，并混合至均匀(例如以1：1mg：mg添加)。
将新鲜制备的水溶性碳二亚胺(例如EDC)添加到混合物中，并同时基于摩尔浓度混合。
在添加EDC的一分钟内，基于摩尔浓度添加将羧基转化为可与胺反应的酯的化学试剂(例如Sulfo-NHS)。开始偶联反应并继续直到预定的混合停止时间，例如4小时，并控制室温。
通过添加游离胺淬灭反应，并通过多峰色谱步骤(例如
Figure BDA0004008870710000291
Core 700)或渗滤到磷酸盐缓冲盐水中来除去化学接头(例如EDC和Sulfo-NHS)。根据多个实施方式和替代方式，根据作为截留物的杂质和作为渗透物的偶联物混合物之间的大小差异，从偶联反应的结果(有时在本文中称为偶联物混合物)中去除残留的杂质。
偶联物混合物被稀释到目标浓度。此时，将病毒-抗原偶联物制备成用作纯化的疫苗/药物物质。疫苗的合适的递送机制包括液体小瓶，或待用生理缓冲液重建以用于进行注射的冻干材料。注射可以是肌肉内的或皮下的。还考虑了其他递送方法，包括但不限于鼻内。
实施例7—H7 rHA偶联至TMV
图13提供了重组抗原(记作“疫苗抗原”)偶联至病毒的图示，其中浅色和深色阴影的椭圆形表示实施例中所示的疫苗抗原的偶联程度。较浅的色度代表游离病毒，而较深的色度代表偶联至病毒的蛋白外壳的抗原。同样，如图13所示，一些病毒在RNA基因组周围含有位于外壳上的蛋白。例如，病毒载体TMV NtK包括N-末端赖氨酸，作为与外壳蛋白的连接点。在一些实施方式中，对与N末端赖氨酸残基结合的病毒部分进行修饰，以更强地呈现重组抗原的结合，从而提供蛋白质(例如抗原)与病毒的胺靶向偶联。结合本文中的径向测量的讨论，在重组抗原偶联至病毒外壳蛋白后，病毒半径大大增加。在一些实施方式中，在包膜的病毒发生改变时进行修饰，以增强其残基的呈现。
如图14-20所示，重组抗原与病毒的偶联平台已经成功地将H7 rHA偶联至TMV。图14-16显示基于十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)在pH 5.50下对H7rHA和TMV之间的偶联的分析。如这些数字所示，几乎所有的H7 rHA都在2小时内偶联至TMV。rHA蛋白条带的消失和同时出现的高于200KDa标志物的复合物的染色表明复合物的形成。所述条带与HA特异性抗体的反应性进一步证实了这一结论。
SEC-HPLC报告还表明，根据偶联平台的当前实施方式成功地将H7 rHA偶联至TMV。图17显示游离TMV产物的SEC-HPLC报告。图17中，游离TMV产品的SEC-HPLC报告产生了下表4中详细示出的信号数据。
表4.游离TMV的SEC-HPLC数据
Figure BDA0004008870710000301
图18显示根据偶联平台的当前实施方式将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC报告。图18中，将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC报告产生了下表5中详细示出的信号数据。
表5.将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC数据
Figure BDA0004008870710000302
图19显示根据偶联平台的当前实施方式在将H7 rHA偶联至TMV 2小时后的SEC-HPLC报告。图19中，根据偶联平台的当前实施方式将H7 rHA偶联至TMV 2小时后获取的SEC-HPLC报告产生了下表6中详细示出的信号数据。
表6.将H7 rHA偶联至TMV 2小时后的SEC-HPLC数据
Figure BDA0004008870710000311
如图19和20所示，SEC-HPLC报告表明，在偶联15分钟后，所有TMV杆均被一些H7rhA包被，并且在最多2小时内有更多的H7 rhA添加至杆中。2小时后，没有检测到额外的偶联。根据多个实施方式和替代方式，SEC-HPLC报告表明，偶联反应使未偶联的天然分子量的病毒外壳蛋白减少了至少约50％，并且在偶联发生4小时后，剩余约3％的游离TMV。
如图20所示，偶联物产品的蛋白质印迹分析表明，H7 rhA通过共价连接成功地偶联至TMV。图20显示根据当前实施方式的偶联平台的各个步骤的蛋白质印迹分析，其中所有样品均以10μL上样。不同的泳道说明了抗原和病毒之间不同的偶联反应时间。第14和第13泳道显示，15分钟后，所有的TMV杆都被抗原包被。两小时后，第6-9泳道说明没有发生额外的偶联。
实施例8—TMV NtK的UV灭活
为了避免生物制药产品的病毒污染，通常需要将病毒灭活(或消毒)，以确保病毒不再具有感染性。此外，许多监管机构已经制定了规则(例如cGMP法规)，要求在病毒产物的纯化过程中有至少一个有效的灭活步骤。虽然UV-C辐射已在水处理系统中使用多年，但其在生物制药产品中的使用仍未得到探索，关于其有效灭活病毒的能力研究有限。
因此，在病毒产生和纯化之后但在与重组抗原偶联之前，评估了各种UV-C条件(即能量密度和波长)和各种TMV浓度，以有效地将TMV NtK灭活和消毒。尽管测试了许多能量密度，但只有更高水平的能量密度成功地将TMV NtK灭活。此外已确定，成功的病毒灭活是浓度依赖性的，因为未将TMV溶液稀释至合适的浓度时，UV-C辐射不能有效地将样品中的每种病毒消毒。因此，TMV溶液必须适当稀释，以允许UV-C辐射与各个病毒相互作用并有效灭活。
如图21所示，在烟草(Nicotiana tabacum)植物上测试了各种量的UV-C辐射(能量密度在300J/m2和2400J/m2之间)以评估感染性。如图21所示，在2400J/m2的UV-C能量剂量后，病变减少到零，因此表明病毒被成功灭活。此外，还测试了高得多的水平的能量剂量，并且确定在4800J/m2至5142J/m2范围内的能量密度下也成功地将TMV NtK灭活。
根据多个实施方式和替代方式，(在纯化之后但在偶联之前的)病毒灭活的步骤如下：
通过A260测得TMV NtK溶液稀释至小于50微克/毫升的浓度(这是通过将样品暴露于260nm波长的紫外光并测定穿过样品的光量来定量核酸的常规方法)。
以0.45微米过滤TMV溶液，以去除细菌和任何其他可能干扰紫外光视线的大物质，以及根据本实施方式的其他纯化步骤，在用UV光灭活之前立即进行。
通过将病毒暴露于能量密度在约2400J/m2和约5142J/m2之间的紫外光谱中的光以将TMV NtK灭活。在一些实施方式中，UV光的能量密度在约4800J/m2至约5142J/m2之间。根据多个实施方式和替代方式，UV光的波长为254nm。
接着，将灭活的TMV NtK准备好与重组抗原偶联。
这些病毒灭活步骤是为商业可扩展性和合规cGMP法规而设计的实施例9—偶联的pH依赖性
为了评估在酸性pH值下孵育病毒是否会导致高质量的偶联，使用相同批次的病毒、抗原、缓冲剂和酯进行了实验，但只改变了病毒的制剂。在反应1中，根据多个实施方式和替代方式，TMV被配制成1X MES偶联缓冲液，pH值为5.50，浓度为3.1mg/ml。在反应2中，TMV在磷酸盐缓冲液中浓缩至11.0mg/ml，并直接以偶联反应体积的15％加入。在这些步骤后，通过SEC监控偶联过程，其中游离TMV从零分钟(以T＝0表示)开始有序减少就表明成功的偶联。
如表7和8所示，反应1表现出成功的偶联(因为游离TMV从零分钟开始有序减少)，而反应2未成功，如剩余的游离TMV百分比所示。
表7.反应1，成功的偶联—在酸性pH中配制的TMV
Figure BDA0004008870710000331
表8.反应2，不成功的偶联—在磷酸盐缓冲液中配制的TMV
Figure BDA0004008870710000341
因此，如表7所示，在酸性pH中孵育病毒会产生大于90％的偶联。如果不发生酸性pH孵育步骤，那么偶联百分比仍然低于50％(如表8所示)。
基于该实验，开发了偶联用的模型(如图22所示)。根据多个实施方式和替代方式，通过将病毒暴露在偶联环境中来改进病毒以接合抗原的化学准备状态(在本文中称为“激活”或“活化”)而大大增强纯化的病毒和纯化的抗原(图22中用“rHA”表示)之间的偶联。在一些实施方式中，病毒激活是通过在偶联反应前在酸性pH值中配制病毒，使正电荷在病毒表面聚集而发生的。在一些实施方式中，激活步骤包括将病毒暴露在约5.5或更低的pH值中，并持续足够的时间进行激活。在一些实施方式中，这种暴露在偶联环境中的时间约为18至72小时。根据多个实施方式和替代方式，在酸性pH下加工纯化的病毒通过使外壳蛋白赖氨酸带电来活化病毒。由于在偶联环境中的激活步骤，正电荷通过胺基的聚类在病毒表面聚集(如图22所示)，病毒已经准备好与重组抗原的羧基端偶联。
根据多个实施方式和替代方式，病毒活化步骤与储存病毒时的pH通常保持在中性pH或接近中性pH的传统方法相反。如图22所示，传统方法没有在病毒表面聚集正电荷，因此，偶联百分比仍低于50％(见表8)。此外，传统方法利用了磷酸盐缓冲液，其促进了溶解性，但却牺牲了有利的表面电荷。
在考察涉及TMV的成功偶联过程中观察到，通常在活化步骤中通过动态光散射(DLS)测得的病毒半径增加了至少2.75倍时才发生成功的偶联(参见表9A与表9B的对比)。一般来说，成功的TMV偶联(如表9C讨论的)的特征为DLS半径从约70nm增加到约195nm或更高，如这些表格所示。
基于采用病毒活化的成功偶联，开发了将纯化的抗原与纯化的病毒偶联的平台。根据多个实施方式和替代方式，制备用于偶联的纯化的抗原的步骤如下：
为了确保偶联反应的pH控制，在临近反应开始之前将纯化的抗原配制成反应缓冲液。
在偶联前，将纯化的抗原储存在中性至微碱性pH的磷酸盐缓冲盐水中。
取决于分子的性质，抗原的pH目标通常为pH 5.50-6.50。
为了促进与病毒的偶联，使用超滤将储存缓冲液替换为酸性pH下的MES/NaCl缓冲液。蛋白质浓度也增加到大于3mg/mL。
然后在抗原制备完成后的4小时内开始偶联反应，以防止蛋白质结构不稳定。
根据多个实施方式和替代方式，制备偶联用的纯化的病毒的步骤如下：
在中性pH下储存后，在偶联前在酸性pH下将病毒激活。为了成功的反应，在偶联反应开始前，将病毒从pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成pH 5.50的醋酸盐缓冲液，时间最少约18小时，最多约72小时。在一些实施方式中，在偶联反应开始前，将病毒从pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成pH 4.50的醋酸盐缓冲液，时间最少约18小时，最多72小时。据观察，在酸性pH值下储存超过72小时的病毒会在病毒之间产生自关联(self-association)，从而导致病毒不溶，并抑制偶联的效率。
表9A和9B还利用通过DLS测得的病毒半径(此时为TMV)的增加证明了活化步骤。具体而言，表9A提供了在活化之后并在成功偶联之前TMV的DLS半径增加的数据，其中抗原列在右侧列中。“半径增加的因数”是将活化后的TMV半径除以中性pH下的典型TMV半径(约70nm)。相反，表9B提供了在活化步骤开始之后、在不成功的偶联尝试之前的TMV的DLS半径增加的数据，其中抗原列在右侧列中。在表9A和9B中，左栏代表TMV杆在中性pH值和一般储存条件下的标准半径，即在发生任何活化之前。
表9A.(在成功偶联之前)通过DLS测得的游离TMV半径
Figure BDA0004008870710000361
Figure BDA0004008870710000371
表9B.(在未成功偶联之前)通过DLS测得的游离TMV半径
Figure BDA0004008870710000372
Figure BDA0004008870710000381
在这些制备步骤之后，抗原和病毒反应物被混合以形成偶联物混合物，并使用DLS和SDS-PAGE方法监测偶联进展。表9C说明了在使用酸性pH值激活病毒后，使用DLS的偶联反应的平均分子半径随时间变化的情况。如表9C所示，分子半径是病毒杆由抗原分子成功包被的一个指标。
表9C.TMV NtK SEC和DLS史
Figure BDA0004008870710000382
反过来，图23显示了根据多个实施方式和替代方式，基于SDS-PAGE对活化的TMVNtK和纯化的抗原之间的偶联的分析。如图23所示，游离TMV NtK和游离抗原随时间有序地减少，以及出现>200kDA的蛋白质条带，表明成功的偶联。
实施例10—不同比率的纯化的病毒和纯化的抗原进行偶联的TEM成像纯化的病毒和纯化的抗原之间所需的偶联反应用以下公式表示：
病毒+抗原→病毒-抗原(式1)
然而，众所周知，抗原倾向于自偶联，可能无法获得所需的反应，如下式所示：
病毒+抗原→病毒-抗原+抗原-抗原(式2)
纯化的抗原的自偶联对于疫苗的成功开发而言是一个问题，因为在尺寸色谱步骤中不会去除抗原-抗原偶联物，其结果是免疫反应减至最小或减弱。
为了解决该自偶联的问题，进行了各种实验以确定如何消耗未反应的抗原和抗原偶联物。首先，通过将抗原暴露在抑制自偶联的试剂中，对抗原进行封端。虽然预计这种传统的方法会成功，但这种方法失败了，因为反应发生得太快了。
接下来，调整了病毒与抗原的比率，以确定合适的偶联比率。如表10和11以及图24-30所示，通过负染色透射电子显微镜(TEM)成像分析了七个不同的样品。样品1-3是对照组，样品4-7含有不同的血凝素(HA)与TMV的比率(在偶联平台的混合步骤中，如表3的操作步骤5所示)。
表10.TEM成像样品—对照组
Figure BDA0004008870710000391
表11.TEM成像样品—偶联物
Figure BDA0004008870710000392
Figure BDA0004008870710000401
在本文列出的各种名称中，“KBP-VP”描述的是TMV抗原呈递，仅作参考之用。图24是样品1(游离HA，批次19UL-SG-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图24中，该样品含有小球形箭头(由箭头A指示)和细长颗粒(由箭头B指示)，尺寸在约5nm至约9nm的范围内。这些颗粒的外观显示出与HA的有序聚集相一致的规则结构，符合天然三聚体的构象。此外，该颗粒分散良好，结块的情况很少。
图25是样品2(单独的TMV NtK，批次18HA-NTK-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图25中，观察到杆状颗粒(箭头A)，尺寸在长约125nm至约700nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内。这些尺寸与TMV颗粒的大小和形状一致。此外，在杆中观察到约4nm的中心通道(箭头B)，这是TMV的已知特征。多个杆经常平行于其长轴对齐，并且杆的表面通常是光滑的。在少数情况下，观察到约8nm至约10nm的小球形颗粒(箭头C)，其既与杆的表面结合，又与背景中的杆状颗粒不结合。这些球形颗粒(箭头C)不像单个HA三聚体。
图26是样品3(添加有TMV NtK的HA：HA自偶联物，批次19UL-SG-004)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图26中，观察到杆状颗粒，其长度在约25nm至约885nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。这些杆要么根本不装饰，要么稀疏地装饰着各种尺寸和形状的小蛋白质颗粒(箭头C)。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。图26显示较大的HA颗粒团块，但TMV看起来与预期的未偶联的TMV相同(如图25所示)。
图27是样品4(TMV:HA为1：1的比率，批次18KBP-VP-SG-002)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图27中，观察到杆状颗粒，其尺寸在长约50nm至大于约1000nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。颗粒杆的大小和形状与图28中观察到的偶联的TMV相似，不同的是，大多数颗粒杆的表面上有大量的小蛋白密度的装饰(箭头C)。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。图27所示的样品5看起来优于其他TEM图像，这很可能是由于偶联前病毒处理的不同。对于该批次，在pH 5.50配制病毒，然后在15分钟内将pH降至4.50，并在偶联反应开始时恢复至pH 5.50。对于图28-30所示的批次，病毒被直接配制成pH 4.50，并在偶联之前保持过夜。
图28是样品5(TMV：HA为1：1的比率，批次19UL-SG-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图28中，可见许多杆状颗粒，其长度在约65nm至约720nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有一个约4nm的中心内部通道(箭头B)。颗粒杆的大小和形状与图25中观察到的游离TMV NtK(样品2)相似。然而，与图25中显示的未偶联的病毒相比，图28中观察到的颗粒杆中等地装饰有蛋白密度(箭头C)。这些密度在形状和尺寸上是不规则的，并且似乎与杆的表面随机结合，没有明显的图案。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图29是样品6(TMV：HA为4：1的比率，批次19UL-SG-002)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图29中，观察到杆状颗粒，其长度在约25nm至大于约1000nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。在图29中观察到的颗粒杆的尺寸与先前的偶联样品类似，但是小蛋白质密度(箭头C)的表面装饰水平介于中等到稀疏之间。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图30是样品7(TMV：HA为16：1的比率，批次19UL-SG-003)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图30中，观察到杆状颗粒，其尺寸在长约30nm至大于约1000nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。图30中观察到的颗粒杆在整体形态上与之前的偶联样品相似。然而，这些杆只有稀疏的蛋白质装饰(箭头C)或根本没有装饰。在背景中仅可见少量的小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图24-30显示，1：1的比率显示出充分的杆装饰，4：1的比率显示出适度的装饰，而16：1的比率显示出稀疏的装饰。换言之，1:1的比率产生的病毒杆上有大量的HA抗原装饰(即较多的密度)，而16:1的比率产生的病毒杆上有较少的HA抗原装饰(即较少的密度)。作为偶联反应的副产物，观察到HA-HA自偶联物，主要是在1:1比率反应中。此外，与1:1的反应相比，在4:1的反应中似乎有更少的游离HA或HA-HA偶联物，在TEM图像和SDS-PAGE反应分析中用16:1反应甚至更少(数据未显示)。换言之，在16：1的比率下，HA仅与TMV杆偶联的效率整体上更高，但与1：1反应相比，每个杆的HA密度更低。
实施例11—不同偶联条件下的沉降速度分析
在分析型超速离心机(“AUC”)中测得的沉降速度(“SV”)是获取有关蛋白质异质性和聚集的缔合状态的信息的理想方法。具体地，可以根据不同的沉降系数检测聚集物或不同的寡聚物。该方法还检测低于1重量％水平的聚集物或其他次要成分。此外，SV对物质的相对量进行高质量定量，并为任何聚集物提供准确的沉降系数。
为了测定自偶联和未反应的HA的量，以及不同偶联条件下的TMV NtK上HA的占位量，用SV-AUC测定与游离抗原、游离病毒和各种TMV：HA比率的沉降有关的总信号。表12中提供了以下样品和说明：
表12.SV-AUC用样品和说明
Figure BDA0004008870710000421
这些储液被冷藏运输(非冷冻)，随后被储存在2-8℃直到分析。使用来自康宁公司(Corning)的1X PBS来进行样品稀释并用作空白参比。样品1被1:1稀释，样品2-7用1X PBS1:3稀释，以创建沉降速度样品。进行这些稀释是为了使样品的总吸光度在吸光度检测系统的线性范围内。
方法—将稀释后的样品上样到具有12mm光程的双通道木炭制epon中心部件的皿中。1X PBS上样到每个细胞的参比通道。将装载的细胞放入分析转子，装入分析超速离心机，并将其升至20癈。然后将转子升至3000rpm，扫描(在280nm处)样品以确认正确的细胞装载。对于样品2-7，转子被调至最终的运行速度为9000rpm。在这个转子速度下尽可能快地记录扫描结果(每3分钟一次)，持续约11小时(每个样品总共扫描250次)。对于样品1(游离的HA)，转子被调至35,000rpm，每4分钟记录一次扫描，持续5.3小时。然后使用Schuck,P.(2000),“通过沉降速度超速离心和Lamm方程模型进行大分子的尺寸分布分析(Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocityultracentrifugation and Lamm equation modeling)”Biophys.J.78,1606-1619中所述的c(s)方法分析数据。使用该方法，直接拟合原始扫描以得出沉降系数的分布，并同时针对扩散对数据的影响进行建模以提高分辨率。
结果与讨论—样品1-7的高分辨率沉降系数分布如图31-37所示。在这些图中，纵轴提供浓度，横轴提供基于沉降系数的分离度。通过将曲线下的总面积设置为1.0(100％)，每个分布都进行了标准化，以确保每个峰下的面积提供种类的分数。因为样品2-7所含的物质进行沉降的沉降系数范围很广，所以数据分析被推进到覆盖速度快至2000个Svedburg单位(S)的物种沉降，因此横轴为对数标度。为了补偿对数缩放比例可能会扭曲峰的可见面积的影响，纵轴已被乘以沉降系数，从而正确地缩放了相对峰值面积。样品1(游离HA)的数据采用传统的线性沉降系数缩放来表示。
图31是样品1(单独的HA，批次19S-G-001)的标准化沉降系数分布。由于游离抗原的尺寸比病毒小得多，因此该样品的转子转速(35,000rpm)比样品2-7(9,000RPM)快得多，以便充分表征尺寸分布。如图31所示，样品1在某种程度上是均匀的，在8.967S提供了73.7％的主峰。这是仅有HA抗原的样品的预期结果。该沉降系数以及主边界的宽度意味着，该主峰物质的摩尔质量为约222kDa，这可能表明该主峰大致对应于预期的约70kDa单体的HA三聚体。该沉降系数在物理上不可能对应于单体，相反，主峰对应于比单体更大的低聚态。如下表13所示，在HA3新加坡释放时的SEC HPLC数据，>90％的HA被鉴定为三聚体状态，分析的4个样品中有3个三聚体化程度超过50％。
表13.三聚体化的程度
Figure BDA0004008870710000441
同样如图31所示，检测到七个比主峰更快沉降的次要峰，它们总共占总沉降吸光度的6.2％。据推测，这两个峰表示产物聚集，而不是高分子量的杂质。12.4S(4.25％)处的主要聚集物物质的沉降比单体快1.4倍，该比率落在通常在二聚体中可见的1.4-1.5的范围内。尽管该比率表明该物质是主峰物质的二聚体(可能是约70kDa单体的六聚体)，但其沉降系数也可能表明它是主峰物质的高度扩展或部分未折叠的三聚体(可能是约70kDa单体的九聚体)。
图31中，15.3S(0.96％)处的下一个峰的沉降比单体快1.7倍，这表明主峰物质的三聚体。对于任何大于30.9S的沉降系数都没有检测到吸光度。另外，在2.8S(2.81％)、4.5S(12.44％)和6.0S(4.94％)处也检测到了比主峰沉降更慢的三个次要峰。在这些次要峰中，4.5S的峰最有可能对应的是抗原单体。
图32是样品2(游离TMV NtK，批次18HA-NTK-001)的标准化沉降系数分布。如图32所示，在约60S之下未检测到沉降物质。该样品看起来相当异质，在229S(30.9％)处有丰度最高的峰沉降。在191S(28.7％)处检测到丰度第二高的峰。目前还不清楚哪个峰对应的是完全组装的病毒。此外，在229S到2,000S之间观察到25.3％的总信号沉淀，这是本实施例11中允许的最大沉降系数。不清楚从约60S到2000S的部分可分辨的峰代表什么。
图33-37显示病毒-抗原偶联物的标准化沉降系数分布。这些图的每张都显示了约0.15OD的显著吸光度，没有沉降。这是通过在每次运行完成后将转子速度提高到35,000RPM，以便将所有剩余的物质都颗粒化而成立的。在游离抗原或游离TMV NtK样品中都没有观察到这种物质。然而，由于这种物质不沉降，它并不影响测量的尺寸分布的结果。
图33是样品3(TMV和HA的比率为1：1，批次19UL-SG-004)的标准化沉降系数分布。如图33所示，沉降系数的结果范围从大约40S到2000S，与观察到的游离病毒的结果相似(如图33所示)。在1-40S的沉降系数范围内还观察到三个峰：9.9S(28.3％)、18.7S(7.8％)和34.5S(1.0％)。在9.9S处观察到的峰可能对应于在游离的HA样品中观察到的主峰(如图32所示)。各种较小的峰可能反映了HA-HA的自偶联事件。
图34是样品4(TMV和HA的比率为1：1，批次KBP-VP-SG-002)的标准化沉降系数分布；并且图35是样品5(TMV和HA的比率为1：1，批次19UL-SG-001)的标准化沉降系数分布。图34和35中显示的结果与对于样品3所讨论的(并在图33中显示)相似。然而，观察到一些明显的差异。首先，由于在这个转子速度下的分辨率很差，很难评论对于游离抗原样品(1-40S)观察到的差异。尽管如此，图34和35显示出比样品3更多的存在于40S-2,000S(表示病毒结合物质)的总信号量。
图36是样品6(TMV和HA的比率为4：1，批次19UL-SG-002)的标准化沉降系数分布；并且图37是样品7(TMV和HA的比率为16：1，批次19UL-SG-003)的标准化沉降系数。图36显示出91.1％的总病毒结合物质(即病毒-抗原偶联物)，图37显示出99.4％的病毒结合物质(即病毒-抗原偶联物)。
如图33-37所示的病毒-抗原标准化沉降系数分布的结果列于表14。如前所述，根据多个实施方式和替代方式，介于1-40S之间的分数表示HA单体/三聚体的百分比，而介于40-2000S之间的分数表示TMV NtK-HA偶联物的百分比。
表14.不同的病毒-抗原偶联物的SV-AUC结果
Figure BDA0004008870710000461
表14中的结果表明，与4:1和16:1的比率相比，1:1的比率具有更多的HA自偶联和HA产物。此外，增加TMV：HA比率导致TMV偶联事件中HA产物的几乎完全接合(在样品7中接近100％的偶联)。
根据多个实施方式和替代方式，通过将TMV NtK和HA的比率从1：1增加到16：1来减少偶联反应中的HA量，其结果是：(1)如实施例10和图24～30所观察到的，HA抗原在各TMV杆上的聚集减少；(2)如图31～37和表14所示，自偶联和未反应HA事件的量减少到几乎为零；以及(3)如图31～37和表14所示，与自偶联和未反应HA事件相比，HA与TMV的结合增加(以百分比表示)。
实施例12—小鼠中的免疫反应
为了确定给予本发明的病毒-抗原偶联物后的免疫反应，通过肌内注射向小鼠给予偶联物作为疫苗。每种疫苗都是如本文所述以1：1(TMV：HA)比率产生的TMV：HA偶联物，在研究的第0天和第14天对大多数动物接种(对照动物给予单独的缓冲液、单独的TMV或单独的HA)。接种疫苗的接受了15、7.5或3.75mcg(微克)的抗原，如下表15所示。一个群组在第7天采样，另一个群组在第14和21天采样，第三个在第28、42和90天采样，然后对样品进行血凝抑制(HAI)试验。
根据该试验，在第7天或第14天，没有任何动物对任何疫苗产生可测量的反应。然而，在第21天在一些动物中看到了初步反应。具体而言，27只动物中有10只对H1N1疫苗(甲型流感/密歇根州/45/2015(H1N1pdm09))显示出低水平的反应(其中只有1只>80HAI滴度)。另外，22/27对H3N2疫苗(甲型流感/新加坡/INFIMH-16-0019/2016)表现出低水平反应(其中只有2只>80)。在第28天，该群组中对H1N1疫苗有可测量的反应的动物数量为8/29，其中一只动物的HAI滴度为80，其他的都较低。对于H3N2疫苗，有可测量反应的动物数量为14/29，也有一只动物达到了80的HAI滴度，其他动物则较低。
从第42天和第90天采集的血液样品中观察到最明显的结果，这些结果示于下表15中。在该表中，提供了平均值的标准误差(SEM)，以及有反应的动物的比例(Fr.Resp.)。应注意，在各个队列中，一些小鼠接受了乙型流感病毒疫苗(分别为B/科罗拉多/06/2017(V)和B/普吉岛/3073/2013(Y))。这些动物在任何一天都没有检测到反应，如所预期的，因为已知乙型流感病毒和相应的HA免疫原在小鼠体内产生HAI滴度的效率和有效性不如A型HA免疫原。
表15.基于剂量和疫苗接种后时间的免疫反应
Figure BDA0004008870710000471
Figure BDA0004008870710000481
Figure BDA0004008870710000491
与先前描述的免疫反应研究分开进行，并且为了以合适的病毒和抗原的比率进一步评估本发明的系统，以各种TMV：HA偶联物比率(即1：1、4：1、16：1)接种甲型流感病毒和乙型流感病毒的疫苗以及如下所述的对照后，评估小鼠中的体液免疫反应。通过这种方式，研究了各种偶联比率及其对免疫反应的影响。在研究的第0天和第14天，通过注射给予接受疫苗接种的小鼠15mcg HA，在背侧的皮下区域。然后分析对疫苗接种的血清抗体反应的HA特异性活性。表15(H3流感病毒用作捕获蛋白)和表16(重组H3蛋白用作捕获蛋白)显示了小鼠的分组(每组12只小鼠)，以及被给予的试剂，每个表中的右侧列显示了ELISA抗体(Ab)滴度结果。
表16.TMV：HA比率研究—甲型流感HA。
Figure BDA0004008870710000492
图38是与表16有关的散点图，其提供了以0、1：1、4：1和16：1(TMV：HA)的比率给予疫苗后的H3：HA Ab滴度的图解分析。图39还以图形说明了抗原相关Ab滴度的几何平均测试结果，使用重组H3抗原(表17)作为包被，或作为捕获蛋白捕获H3病毒(表17)，与抗甲型流感H3抗原抗体结合。就密度(被HA占据的TMV表面积)而言，这三种比率的趋势以1：1(密度最高)>4：1>16：1(密度最低)发展，正如TEM和AUC分析所证明的。在这些表示用H3抗原获得的ELISA结果的图片中，用密度最低的偶联物观察到的免疫反应最高。即，免疫反应的趋势是16:1>4:1>1:1，与密度的趋势相反。因此，令人惊讶的是，在TMV：HA的这些比率下，较低密度的偶联物倾向于提供更好的免疫反应。对此令人惊讶的发现，即抗原性与最大的HA偶联事件不相关，可能的解释包括：(1)当密度相对较低时，抗原更均匀，具有较少的未反应或自偶联的蛋白质；(2)可以更高效地加工偶联的抗原，并更多地保留/统一抗原构象；和(3)TMV杆(举例来说)可以刺激更多的抗原递呈细胞迁移到注射部位并刺激附着的抗原的加工；或这些因素的一些组合。然而，应注意，仅仅是TMV颗粒的存在并不能替代偶联的需要(例如，见表14和15)。
除甲型流感H3抗原外，还使用重组乙型流感普吉岛抗原及其相应抗体的结合倾向性对乙型流感抗原(B-普吉岛HA)进行了研究。下文表17介绍了这部分研究的结果，根据平均ELISA Ab滴度的结果，16:1>4:1>1:1的显示不是很明显。
表17.TMV：HA比率研究—乙型流感HA.
Figure BDA0004008870710000501
Figure BDA0004008870710000511
即便如此，16：1的比率仍显示出最高的平均抗体滴度。因此，有理由预测，密度和免疫反应之间的关系同样适用于乙型流感抗原的研究(B-普吉岛HA)。即，与H3抗原的结果一样，对于密度较低的偶联物形式，免疫反应会更高。此外，有理由相信，4：1比率的偶联反应没有像其他比率的反应那样进行，这是因为偶联过程中可能出现异常，并且没有对该样品进行电子显微镜分析和超速离心分析。无论如何，这里的数据都显示所有三种比率下的免疫反应。在多种比率下实现免疫反应的事实强调了该系统不受任何一个特定比率的约束的稳健性。在特定的TMV偶联疫苗中看到的这种灵活性可能进一步表明，当除了这些研究中包括的H3和H1抗原外，其他抗原偶联至TMV时，以及当除TMV外的其他病毒运载体用于运载体时，该系统都能良好地发挥作用。
就临床实用性而言，根据本文所述的多个实施方式和替代方式中的任一种进行偶联的产物可以通过经由纯化的病毒递送纯化的抗原而用作疫苗，例如但不限于实施例7、9、10、11和12中所述的病毒-抗原偶联物。再者，本公开的实施方式包括以任何数量形式(例如小瓶)包装的、具有合适的缓冲液和添加剂的任何疫苗产品，其由任何病毒-蛋白质偶联物组合物制造，为此提供其偶联。在这方面，实施方式包括其中此类疫苗产物可以以单位剂量的形式提供递送给对象，例如但不限于通过注射器或喷雾的方式给予，包括但不限于皮下、肌肉内、皮内给予和鼻腔，以及在临床指示的范围内通过口服和/或局部给予。作为非限制性的例子，在不影响本文实施方式的广度和范围的情况下，TMV的大小(通常为18nm×300nm)及其杆状形状可促进抗原呈递细胞(APC)的抗原摄取，从而起到增强T细胞(如Th1和Th2)促进的免疫的作用，包括细胞反应,并为表面偶联的亚基蛋白提供佐剂活性。这种活性也通过病毒RNA/TLR7的相互作用被刺激。因此，疫苗摄取的组合效应直接刺激了APC的激活。体液免疫通常通过皮下和鼻内递送在IgG1和IgG2亚型之间进行平衡。一旦递送粘膜疫苗后，反应还包括大量的全身性和粘膜IgA。细胞免疫也非常强大，诱导抗原特异性分泌，类似于活病毒感染反应。整个抗原融合允许天然细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位处理，而不必担心人白细胞抗原(HLA)差异。
与根据当前实施方式的多重纯化平台有关的广泛的(体液和细胞的)且(幅度和有效性)有所增强的免疫反应与没有TMV偶联的被测试的亚基蛋白质形成鲜明的对比，后者几乎或完全不诱导细胞免疫或体液免疫。这些免疫反应的影响是，根据当前实施方式，经由多重平台产生的疫苗促进了单剂疫苗的高保护性反应，并提供了其他常规疫苗平台所无法提供的速度和安全性。事实上，该偶联平台被证明可以在广泛的病毒和蛋白质(包括抗原)上发挥作用，在广泛的比率范围内进行组合，并以各种剂量成功给予，这再次表明了该系统的稳健性。当前实施方式中用于产生疫苗的多重平台的其他优点包括：是一种积极主动的抗原刺激方法，用于针对病原体的侵袭进行全身性免疫保护，该平台非常适合于从疾病病原体(包括病毒糖蛋白或非分泌性病原体抗原)产生抗原性结构域，并且该平台可充当病毒和细菌病原体的有效疫苗平台。
除了关于疫苗应用的优点之外，可以将通过根据当前实施方式的多重平台纯化的植物病毒颗粒配制用于各种药物递送目的。这些不同的目的可以包括：1)免疫治疗—通过将治疗性抗体与病毒颗粒表面偶联并将其递送以增强细胞毒性效果；2)基因治疗—通过加载用于导入特定细胞类型以进行基因修饰的特定核酸；以及3)药物递送—通过将化疗剂加载到病毒颗粒中以进行靶向肿瘤递送。
作为本文讨论的方法的许多优点的简要示例，根据多个实施方式的多重平台可通过首先通过将纯化的病毒暴露于如上所述的pH变化而使其溶胀来用作药物递送工具。随后，将在这种条件下的病毒与浓缩的化疗剂(例如阿霉素)溶液一起孵育，然后将pH恢复到中性，从而使病毒恢复到其溶胀前状态，从而包埋化疗分子。接下来，可以通过选自包括但不一定限于注射在内的一组中选择的递送机制将病毒颗粒递送到生物体中，以便对肿瘤靶向治疗。
因此，以上说明提供了多个实施方式和多种替代方法，用于：(i)基于植物的病毒制造和纯化；(ii)基于植物的抗原制造和纯化；(iii)在植物外形成作为疫苗和抗原运载体具有治疗益处的病毒-抗原偶联物；以及(iv)递送包含纯化的病毒和纯化的抗原的治疗性疫苗。
实施例13-疫苗在冷藏和室温条件下的稳定性
疫苗极大地改善了人和动物的健康。例如，仅在20世纪，疫苗就根除了天花，在美洲消除了脊髓灰质炎，并在全世界控制了各种疾病。然而，疫苗是非常不稳定的，对温度的变化非常敏感。正如F.Coenen等,流感亚单位疫苗的稳定性。在冰箱外放几天有什么关系吗？(Stability of influenza sub-unit vaccine.Does a couple of days outside therefrigerator matter？)Vaccine 24(2006),525-531中讨论过，流感疫苗在室温储存(即～25℃)五周后一般是不可接受的，也是没有活性的。在F.Coenen文章中讨论的所有流感疫苗中，只有一种疫苗在室温储存下表现出12周的稳定性。在许多情况下，这对其他疫苗类型以及疫苗的个别特定成分(如中间体)来说也是一个重大问题。因此，疫苗一般都必须在从商业化生产到给予的整个供应链中进行冷藏，通常被称为“冷链”。
在冷藏环境中，大多数疫苗在典型的七八周稳定目标中保持稳定。然而，对冷链的绝对要求是一个全球性的问题，它限制了全世界的疫苗供应，因为它在发展中国家往往难以保证，并导致了普遍的疫苗损失。为创造室温稳定的疫苗做出了许多努力，但正如文献中所讨论的那样，这些努力都是不成功的。此外，对于制造商，以及接收、储存和向民众应用疫苗的医生和组织来说，维持冷链的成本非常高。因此，全球都需要增加疫苗的稳定性，增强疫苗-抗原的稳定性，以减少对冷链的依赖，确保疫苗在使用前保持其效力。关于抗原本身的稳定性，即作为一种中间体，准备与适当的病毒运载体偶联，在生产和纯化之后，但在偶联之前，保持抗原的稳定性有优势。这些优势包括但不限于在单独的制造设备或在与病毒运载体的生产和纯化不同的时间制造抗原的能力。能够这样做为供应链提供更多的灵活性。此外，改进稳定性可以延长疫苗的保质期，这将有利于在潜在的大流行病的准备中储备疫苗，并防止在不利条件下的疫苗损失。与本文概述的其他特征和优点一起，本实施方式的范围满足了这些和其他需求。这样，本发明的纯化和偶联平台扩展了蛋白质-病毒偶联物在冷藏和室温条件下的稳定性。
有几种确定抗原质量和疫苗稳定性的方法，包括：(1)通过BCA蛋白测定法(其基于以下原理：蛋白质在碱性溶液中可将Cu2+还原为Cu+1，从而导致形成紫色)测量的蛋白质浓度，(2)通过
Figure BDA0004008870710000531
抗体阵列结合法(利用多重夹心免疫测定法)测量的储存效力，(3)SDS-Page纯度，在单个迁移带方面测量，(4)pH，作为物理污染特性的测量，以及在可能的情况下，(5)尺寸排阻色谱法来表征抗原的多聚体结构。在一些实施方式中，还进行了生物负荷测试，以分析是否存在细菌或霉菌污染(在以下表格中，“TAMC”是需氧微生物总数(TotalAerobic Microbial County)的缩写，“TCYM”是总组合酵母/霉菌计数(Total CombineYeast/Mold Count)的缩写)。此外，如果未能通过BCA蛋白测定、
Figure BDA0004008870710000542
测试或SDS-Page分析，则被认为疫苗不能被接受使用。换言之，如果疫苗未能通过这三项测试中的任何一项，该疫苗就不能被接受使用，是失活的。
Figure BDA0004008870710000543
效力测定用于以更高的灵敏度评估一系列不同病毒的毒株以及疫苗对它们的治疗效果，包括SARS-CoV2和流感的大流行毒株。
Figure BDA0004008870710000544
测定关于流感病毒和疫苗的一些方面描述于Byrne-Nash,Rose T.,等,“用于快速评估‘大流行’流感疫苗的VaxArray效力测定(VaxArray potency assay for rapidassessment of‘pandemic’influenza vaccines),”npj Vaccines 3,43(2018)。随着2020年SARS-CoV-2大流行的发生，
Figure BDA0004008870710000545
效力测定用于冠状病毒、疫苗和疫苗中间体研究是市售可得的。
因此，上一段提到的五项测试是对根据多个实施方式和替代方式生产和纯化的下列流感HA抗原进行的：H1NI(A/密歇根)、H3N2(A/新加坡)、H1N1(A/布里斯班)、H3N2(A/堪萨斯)、B/科罗拉多和B/普吉岛。下表提供了在释放时和装入小瓶后并在冷藏条件下储存(2°至8℃)的不同时间测量的稳定性数据和储存效力。如本文所用,初始浓度或完整性是指化合物、偶联物混合物、药物产品、疫苗等的在其释放日期(release date)(即,药物产品的构成或稀释后，有时被称为“第0天”)的浓度或完整性，释放日期是根据21C.F.R.第11部分(21C.F.R.Part 11)和ICH Q1A新药物质和产品的稳定性测试，修订版2(ICH Q1AStabilityTesting of New Drug Substances and Products,Revision 2)(2003年11月)，以及后一文件中引用的参考文献确定的，上述所有内容通过引用完全纳入本文用于所有目的。
表18.纯化的H1NI(A/密歇根)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000541
Figure BDA0004008870710000551
表19.纯化的H3N2(A/新加坡)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000552
表20.H1NI(A/布里斯班)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000561
表21.H3N2(A/堪萨斯)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000562
表22.B/科罗拉多在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000563
Figure BDA0004008870710000571
表23.B/普吉岛在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000572
表18-23说明，纯化的游离抗原表现出不同的稳定性模式。例如，一些抗原如H1NI(A/密歇根)和H3N2(A/新加坡)在6个月后似乎很稳定，测量结果没有显著偏差(如通常观察到的)。然而，其他抗原如B/科罗拉多和H1N1(A/布里斯班)，以及在较小程度上H3N2(A/堪萨斯)和B/普吉岛，在这些条件下表现出降解、三聚体的损失或其他关键特性的损失。例如，图40是在冷藏条件下1个月后对纯化的B/普吉岛的SDS-PAGE分析。在图40中，在～60kDA的完整条带下方的低分子量的降解条带表明纯化的B/普吉岛抗原已经降解。正如预期，表18-23和图40中的数据表明，不同的蛋白质在冷藏条件下表现出不同的稳定性。
根据多个实施方式和替代方式，当相同的纯化抗原偶联至TMV时，其稳定性概况和储存效力会变化。在一些实施方式中，本发明的方法增强包括蛋白质和病毒颗粒的偶联化合物的稳定性的量度，并包括激活病毒颗粒，然后在偶联反应中混合病毒颗粒和抗原以形成偶联物混合物，导致当偶联化合物被置于未冷藏环境中并在释放日期后至少42天的时间段后稳定性增强。示例性的储存温度是至少20℃。稳定性增强可以通过比较偶联物混合物和单独的抗原的稳定性来衡量。合适的量度是抗原浓度、抗原完整性或抗原效力中的任何一个或多个。例如，当稳定性的量度是抗原浓度时，如通过BCA或其他适当的方法来测量，偶联化合物的浓度与单独的抗原浓度之间的差异为至少10％在本实施方式的范围内。同样，当稳定性的量度是抗原的完整性时，如通过SDS-PAGE、SEC-HPLC或其他适当的方法测量，偶联化合物的完整性与单独的抗原的完整性之间的差异为至少10％在本实施方式的范围内。同样，当稳定性的量度是抗原效力时，如通过基于ELISA结果的抗原-抗体相互作用，或
Figure BDA0004008870710000582
表面等离子体共振或其他适当的方法测量，偶联化合物的效力和单独的抗原的效力之间的差异为至少30％在本实施方式的范围内。
因此，下表提供了在释放时和装入小瓶后并在冷藏条件下(2°至8℃)储存后的不同时间的几种单价制剂(在TMV与抗原的比率为1:1时)的稳定性数据。
表24.H1NI(A/密歇根)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000581
Figure BDA0004008870710000591
表25.H3N2(A/新加坡)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000592
表26.B/普吉岛偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000593
Figure BDA0004008870710000601
表27.B/科罗拉多偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000602
此外，下表提供了在释放时和装入小瓶后并在冷藏条件下(2°至8℃)储存后的不同时间的几种单价制剂(在TMV与抗原的比率为8:1时)的稳定性数据。
表28A.H1NI(A/密歇根)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000603
Figure BDA0004008870710000611
表28B.H1NI(A/密歇根)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000612
表29A.H3N2(A/新加坡)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000613
Figure BDA0004008870710000621
表29B.H3N2(A/新加坡)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000622
表30A.B/普吉岛偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000623
表30B.B/普吉岛偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000631
表31A.B/科罗拉多偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000632
表31B.B/科罗拉多偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000633
Figure BDA0004008870710000641
下表提供了在释放时和装入小瓶后并在冷藏条件下(2°至8℃)或在室温条件下(22°至28℃)储存后的不同时间的几种其他单价制剂(在TMV与抗原的比率为8:1时)的稳定性数据:
表32.H1NI(A/布里斯班)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000642
Figure BDA0004008870710000651
表33.H1NI(A/布里斯班)偶联至TMV的偶联物在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000652
表34.H3N2(A/堪萨斯)偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000653
Figure BDA0004008870710000661
表35.H3N2(A/堪萨斯)偶联至TMV的偶联物在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000662
Figure BDA0004008870710000671
表36.B/普吉岛偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000672
表37.B/普吉岛偶联至TMV的偶联物在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000673
Figure BDA0004008870710000681
表38.B/科罗拉多偶联至TMV的偶联物在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000682
Figure BDA0004008870710000691
表39.B/科罗拉多偶联至TMV的偶联物在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000692
在表24-39中描述的各个偶联物中，通过冷藏条件下至少6个月和其他至少12个月的储存保持其纯度、pH、蛋白质浓度和储存效力。此外，在此时间范围内，多分散性也是一致的。多分散性是指复杂产品中粒度的变化，一般来说，多分散性越低，产品就越好。同样地，根据多个实施方式和替代方式，该纯化和偶联平台成功地维持了各种抗原的稳定性和效力，并利用了各种偶联比率，说明了其通用性。
除了单价制剂外，根据多个实施方式和替代方式以1:1的TMV与抗原比率生产的以下四价偶联物在冷藏(2°至8℃)和室温(22°至28℃)条件下都表现出很强的稳定性。
表40A.四价偶联物(以1:1比率)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000701
表40B.四价偶联物(以1:1比率)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000702
Figure BDA0004008870710000711
表41A.四价偶联物(以1:1比率)在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000712
Figure BDA0004008870710000721
表41B.四价偶联物(以1:1比率)在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000722
此外，根据多个实施方式和替代方式以8:1的TMV与抗原比率生产的以下四价偶联物在冷藏(2°至8℃)和室温(22°至28℃)条件下都表现出很强的稳定性。这种四价偶联物的结果是针对四种不同的HA与修饰的TMV NtK运载体偶联而得到的，其中包括甲型流感毒株/密歇根、甲型流感/新加坡、B/科罗拉多和B/普吉岛。本文提供了关于这些和其他偶联物和疫苗成分的额外效力数据。
表42A.四价偶联物(以8:1比率)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000731
Figure BDA0004008870710000741
表42B.四价偶联物(以8:1比率)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000742
表43A.四价偶联物(以8:1比率)在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000751
表43B.四价偶联物(以8:1比率)在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000752
Figure BDA0004008870710000761
此外，表42A、42B、43A和43B中描述的四价偶联物的效力分别在图41A和41B中得到了说明。图41(A)是表42A和42B中的冷藏温度为2-8℃时的QIV稳定性图(图中称为常规稳定性)。图41(B)是表43A和43B中的更高温度范围为22-28℃时的QIV稳定性图(图中称为加速稳定性)。如图41A和41B所示，在室温条件下或冷藏条件下，根据多个实施方式和替代方式以8:1的TMV与抗原比率生产的四价偶联物的效力没有观察到统计学上的显著差异。
此外，根据多个实施方式和替代方式以8:1的TMV与抗原比率生产的以下四价偶联物在冷藏(2°至8℃)和室温(22°至28℃)条件下都表现出很强的稳定性。与上面表42-43中讨论的四价偶联物不同，以下的四价偶联物利用了四种不同的HA偶联至修饰的TMV NtK运载体，其中包括以下抗原：H1(布里斯班)、H3(堪萨斯)、B/Y(普吉岛)、B/V(科罗拉多)。
表44.四价偶联物(以8:1比率)在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000771
表45.四价偶联物(以8:1比率)在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710000772
Figure BDA0004008870710000781
表40-45和图41A和41B说明，四价偶联物在冷藏和室温条件下，在蛋白质浓度、储存效力、pH和外观方面至少3-12个月保持一致和稳定。数据还表明，根据多个实施方式和替代方式，纯化和偶联平台成功地偶联了多种抗原，并在不同的偶联比率下提高了稳定性。
表46提供了表41A和41B中描述的多种抗原的储存效力的百分比变化，通过比较初始效力和特定时间的储存效力。
表46.通过VaxArray测量储存效力与初始效力的
Figure BDA0004008870710000783
Figure BDA0004008870710000782
因此，如表46所示，当把偶联物置于未冷藏环境中时，30天结束时的储存效力至少是偶联后第一天内偶联物混合物初始效力的70％。在90天结束时，储存在未冷藏环境中的偶联物混合物的储存效力至少是初始效力的68％，而在至少180天结束时，偶联物混合物的储存效力至少是75％。
下表通过比较纯化的重组抗原与根据多个实施方式和替代方式偶联至TMV的相同蛋白质的释放条件，说明了本文所述实施方式的稳定效果。此外，通过分析蛋白质浓度、效力、SDS-page纯度和PH，比较纯化的抗原和偶联至TMV的相同抗原在冷藏条件(4°至8℃)下6个月后的稳定性，如下：
表47.纯化的B/科罗拉多抗原和B/科罗拉多偶联至TMV偶联物的稳定性之间的比较
Figure BDA0004008870710000791
表48.纯化的B/普吉岛抗原和B/普吉岛偶联至TMV偶联物的稳定性之间的比较
Figure BDA0004008870710000792
表49.纯化的H3N2(A/新加坡)抗原和H3N2(A/新加坡)偶联至TMV偶联物的稳定性之间的比较
Figure BDA0004008870710000801
表50.纯化的H1NI(A/密歇根)抗原和H1NI(A/密歇根)偶联至TMV偶联物的稳定性之间的比较
Figure BDA0004008870710000802
表46-50说明了纯化和偶联实施方式的稳定性诱导特性，最明显的是B/科罗拉多、B/普吉岛和H1NI(A/密歇根)抗原在纯度方面的量度。对于H3N2(A/新加坡)和B/科罗拉多抗原来说，偶联物的稳定性也是以抗原浓度来显示的。如表31-34所示，根据多个实施方式和替代方式，纯化和偶联过程稳定了抗原的物理性质、抗原反应性和其他定量稳定性特征。
此外，表41A-45和图41B说明，根据多个实施方式和替代方式产生的四价偶联物在室温储存(22°至28℃)中表现出至少六个月或二十四周的强稳定性量度。与在室温下表现出平均约5周稳定性的传统疫苗相比(如上述F.Coenen文章中所讨论的)，根据多个实施方式和替代方式的疫苗表现出比传统流感疫苗至少多5倍的稳定性，比纯化抗原长几倍。因此，根据多个实施方式和替代方式的制剂和偶联过程稳定了极其不稳定的抗原—例如B/科罗拉多--并延长了其他抗原—例如H3N2(A/新加坡)、H1NI(A/密歇根)和B/普吉岛--的稳定性，远远超过了游离抗原和传统疫苗的稳定性极限。
实施例14(a)至14(h)–四价流感疫苗研究
为了证明本文所公开的实施方式在免疫原性和保护季节性病毒攻击方面的安全性、功效和实用性，使用四价季节性疫苗候选物(在本实施例中称为“QIV疫苗”)进行了一些临床前研究。研究中使用的疫苗是根据本文公开的多个实施方式和替代方式制造的。对象QIV疫苗包含以下流感HA抗原，其来自2018/2019北美季节性流感疫苗毒株，根据世界卫生组织、疾病控制和预防中心和FDA的疫苗和相关生物制品咨询委员会(Vaccines andRelated Biological Products Advisory Committee)(VRBPAC)建议：(A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09、A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)、B/普吉岛/3073/2013(B山形县(BYamagata)谱系)和B/科罗拉多/06/2017(B维多利亚谱系)，偶联至灭活的TMV NtK。在一些实施方式中，这四种疫苗抗原偶联物，在含有0.01％硫柳汞作为防腐剂的磷酸盐缓冲溶液中(作为非限制性例子)，被掺混在一起，形成一个可注射的四价疫苗制剂。正如下文详细讨论的那样，这些研究表明，本文公开的实施方式增强了重组血凝素蛋白抗原的免疫原性。这是由各种措施和分析确定的，包括血凝抑制和中和抗体滴度。同样地，本实施例中所述的研究表明，QIV季节性疫苗具有免疫原性，因为它在迄今为止测试的所有哺乳动物疾病模型中提供了一定程度的保护，免受与疫苗株HA抗原同源的病毒株的攻击。除非另有说明，否则在研究中，纳入偶联反应的灭活TMV NtK和HA中间体的含量在mg:mg的基础上(即重量(wt))相等(1：1)。作为一个非限制性的例子，用QIV疫苗以8:1的TMV NtK:HA比率(以mg:mg为基础)偶联的药物物质中间体的后续研究显示了理想的体液反应。
表51提供了根据本实施例对QIV疫苗进行的研究概述。“GLP”是指良好实验室规范，例如《疫苗临床前药理学和毒理学测试指导CPMP说明》(CPMP Note for Guidance onPreclinical Pharmacological and Toxicological Testing of Vaccines)(CPMP/SWP/465/95)和世界卫生组织《疫苗非临床评价指南》(WHO技术报告系列，第927号)，两者的全部内容通过参考纳入本文。表后对研究的各方面进行了补充讨论。
表51.实施例14(a)至14(h)的QIV非临床研究概述
Figure BDA0004008870710000821
Figure BDA0004008870710000831
Figure BDA0004008870710000841
Figure BDA0004008870710000851
如表52所总结的，在BALB/c小鼠中分别使用单价和四价制剂进行了免疫原性研究，以评估理想的制剂比率，并监测注射部位的反应和临床毒性迹象。
表52.BALB/c小鼠中免疫原性–实施例14(a)
Figure BDA0004008870710000852
a.仅磷酸盐缓冲盐水
b.单价疫苗：A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)
c.QIV疫苗:A/密歇根/45/2015(H1N1)、A/新加坡/INFIMH-016-0019/2016(H3N2)、B/科罗拉多/06/2017和B/普吉岛/3073/2013
该研究是按照GLP规定的精神进行的。BALB/c小鼠(N＝5/组)在第0天和第14天用相应的疫苗制剂进行免疫。在第0天和第14天给予前，对动物进行放血以制备血清用于HAI抗体滴度分析，并在第28天收集最后一次放血。
表53(如下)提供了产生可检测的HAI滴度的动物数量、阳性动物的滴度范围和几何平均滴度(GMT)。GMT值使用Armitage和Berry，《医学研究中的统计方法》(StatisticalMethods in Medical Research)，第2版(1987)，第31-33页中所示的以下公式计算，其全部内容通过参考纳入本文：
GM＝{x1 x2 x3....xn}1/n   (式3)
如表53所示，在第一次接种疫苗之前(第0天)，所有研究组的血清样本的HAI滴度都低于检测极限(<10)。在第14天(第二次接种前)，除以下情况外，所有组的抗体滴度都低于可检测水平：第3组(30μg剂量的单价疫苗)中1/5的小鼠对A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)的HAI滴度为10，第7组(30μg剂量的四价疫苗)中2/5的小鼠对A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)产生滴度为10。在表37中，HAI抗体滴度是抑制4个HA单位病毒的血凝的血清最高稀释度的倒数。
表53.BALB/c小鼠中免疫原性结果–实施例14(a)
Figure BDA0004008870710000861
Figure BDA0004008870710000871
a.A/密歇根/45/2015(H1N1pdm09)；
b.A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)；
c.B/科罗拉多/06/2017(Vic)
d.B/普吉岛/3073/2013(Yam)
e.括号中的数据是滴度范围和几何平均滴度(GMT)。
在第14天，仅在单价和QIV疫苗组中检测到针对高剂量(30μg)的H3N2病毒的HAI滴度。在第28天，在四价疫苗中对A/密歇根/45/2015(H1N1)的HAI滴度有剂量依赖性的增加，在单价疫苗和四价疫苗中对A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)有剂量依赖性的增加。在少数动物中，抗原剂量低至1.5μg时HAI滴度是可检测的，大多数动物在每HA抗原7.5μg时产生抗体滴度。用针对其他三种测试毒株的单价疫苗接种过的小鼠没有产生可检测的滴度。虽然不那么明显，但QIV疫苗也在小鼠子集中诱导了针对B/科罗拉多/06/2017的HAI滴度。对山形县谱系B/普吉岛/3073/2013成分没有产生可检测的HAI滴度。
总之，基于HAI试验数据，单价制剂疫苗对H3N2病毒诱导了可检测的体液免疫反应。QIV制剂对四种抗原中的三种诱导了可检测的体液免疫反应。用单价和QIV疫苗制剂接种的小鼠对流感H1N1和H3N2抗原的诱导免疫反应是剂量依赖性的。如表37所示，H1N1 GMT范围为20-279(随着剂量的增加而增加)，H3N2 GMT范围为20-52。此外，单价或QIV疫苗接种没有观察到不良临床迹象或注射反应。
如表54所总结的，通过评估有和无TMV偶联(TMV NtK:HA抗原的比率为1:1)的四价疫苗的随时间免疫原性，在原初小鼠(BALB/c小鼠)中进行了免疫原性研究。该研究的目的是确认表53中所示的先前研究的结果，比较QIV和未与TMV NtK运载体偶联的相同抗原的疫苗的免疫原性，并分析90天内免疫反应的持久性。下表中的疫苗是以TMV NtK:HA抗原1:1的比例偶联的。
表54.BALB/c小鼠中QIV疫苗免疫原性–实施例14(b)
Figure BDA0004008870710000881
Figure BDA0004008870710000891
图42显示了QIV疫苗对小鼠的H1N1和H3N2血凝抑制(HAI)滴度的诱导随时间的变化。数据包括BALB/c小鼠的几何平均滴度(GMT)，用每HA 15μg的QIV疫苗接种。使用以下公式计算GMT值：
GM＝{x1 x2 x3....xn}1/n   (式3)
根据之前提到的Armitage和Berry所述，滴度值≤10的小鼠被赋予5的滴度值以计算GMT。
如图42和下表55和56所示，只在接种QIV疫苗(图42中称为“KBP-VP H1NI”和KBP-VP H3N2”)的动物中观察到HAI滴度，并且只对H1N1和H3N3抗原。对未偶联的抗原没有产生可检测的免疫反应。对A/密歇根/45/2015(H1N1)和A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)的滴度直到第21天都低于可检测水平。HAI滴度在第28天和第42天仍然是可检测的，在第90天最高。此外，体液反应至少在90天内继续增加，这是常规流感疫苗未已知拥有的特征。由于单独使用抗原没有可检测的反应，该测试进一步支持将抗原与TMV NtK运载体偶联产生免疫反应的功效。
表55.产生针对甲型流感抗原的HAI几何平均滴度和动物的百分比–第21天和第28天
Figure BDA0004008870710000901
a.A/密歇根/45/2015(H1N1)
b.A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)
c.四价疫苗抗原(A/密歇根/45/2015(H1N1pdm09)；A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)；B/科罗拉多/06/2017(Vict)；B/普吉岛/3073/2013(Yam)，单独，不偶联至TMVNtK运载体
d.QIV疫苗(A/密歇根/45/2015(H1N1pdm09)；A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)；B/科罗拉多/06/2017(Vict)；B/普吉岛/3073/2013(Yam)偶联1:1TMV NtK:HA抗原
表56.产生针对甲型流感抗原的HAI几何平均滴度和动物的百分比–第42天和第90天
Figure BDA0004008870710000911
Figure BDA0004008870710000921
a.A/密歇根/45/2015(H1N1)
b.A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)
c.四价疫苗抗原(A/密歇根/45/2015(H1N1pdm09)；A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)；B/科罗拉多/06/2017(Vict)；B/普吉岛/3073/2013(Yam)，单独，不偶联至TMVNtK运载体
d.QIV疫苗(A/密歇根/45/2015(H1N1pdm09)；A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)；B/科罗拉多/06/2017(Vict)；B/普吉岛/3073/2013(Yam)偶联1:1TMV NtK:HA抗原
与HAI滴度一样，病毒中和(VN)滴度只在接种QIV疫苗的动物中观察到。如表57所示,直到第21天也观察到对A/密歇根/45/2015(H1N1)和A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)的VN滴度。VN滴度在第28天和第42天仍然是可检测的，在第90天最高。
表57.对甲型流感抗原诱导的中和几何平均抗体滴度
Figure BDA0004008870710000922
Figure BDA0004008870710000931
在表54中概述的研究中，还监测了小鼠的临床迹象和注射部位反应。在尸检时，测量了器官重量，并对组织进行了大体尸检和组织病理学检查。在第21天或第90天被解剖的任何动物都没有与试验品有关的大体发现。
对于在第21天安乐死的动物，在第2组(TMV NtK对照组)的9只动物中的3只、第3组(单独的HA)的9只动物中的1只和第6组(QIV)的9只动物中的9只中注意到与试验品有关的显微镜发现，即注射部位的最小到轻微的混合细胞浸润。第6组检验的9只动物中的1只中也注意到了注射部位肌纤维的最小退化/再生。对于在第21天或第90天安乐死的小鼠，没有注意到其他与显微镜检试验品有关的发现。
总之，基于HAI和病毒中和试验，QIV疫苗诱导了可检测的体液免疫反应。最强力的反应是对A/密歇根/45/2015(H1N1)和A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)。HAI和VN滴度在第21天首次可检测，第90天达到最高。这些数据表明，QIV疫苗在小鼠中是安全的，具有免疫原性。
雪貂中的免疫原性和攻击研究-实施例14(c)
还在雪貂中进行了使用QIV疫苗的免疫原性和攻击研究，雪貂被认为是流感感染的最有代表性的动物模型，与核准的疫苗比较物相比，以通过攻击后的病毒负荷减少来评估疫苗功效。如图43说明的研究设计所示，在以下研究日取血液用于免疫原性试验：-3、7、14、21、28和42日。在研究第43天，对动物进行攻击，并在研究第45和47天进行鼻腔清洗以获得病毒滴度。
简言之，每组雪貂N＝30(15M/15F)，在研究第0天和第14天用以下之一进行免疫：
1.安慰剂缓冲液作为阴性对照(与第4组量相同)
2.
Figure BDA0004008870710000932
四价疫苗作为核准的比较物(每HA 15μg，总HA 60μg)
3.每HA抗原15μg的QIV(总HA抗原60μg；60μg TMV NtK运载体)
4.每HA抗原45μg的QIV(180μg总HA)
在每剂之后，连续7天每天监测注射部位和临床迹象。如图43所示，以一定间隔对动物进行放血，以测量HAI和中和抗体滴度。将各个剂量组的动物细分为两组(N＝12，6M/6F)，在第43天用1x106个噬斑形成单位(PFU)的A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09或A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)(作为非限制性例子)攻击。监测动物，并在攻击后2天和4天进行鼻腔清洗，以定量残留的流感病毒滴度并评估病毒清除。
在给予15或45μg剂量水平的QIV和
Figure BDA0004008870710000941
的雪貂中，检测到针对所有四种测试的病毒[A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09、A/S新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)、B/科罗拉多/06/2017和B/普吉岛/3073/2013]的血凝抑制(HI)抗体。QIV疫苗对B/普吉岛、B/科罗拉多和A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)引发最强的HI反应。最弱的HI反应是针对A/密歇根/45/2015(H1N1)病毒。对所有病毒都检测到了病毒中和(VN)滴度，反应依次递减：A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09、A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)、B/普吉岛和B/科罗拉多/06/2017表现出最低的反应。
在用A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09进行流感攻击后，如图43所示，在攻击后第2天和第4天，在所有被攻击的雪貂的鼻腔洗液中检测到病毒。图44显示了H1N1攻击后的鼻腔洗液滴度(log10 TCID50/mL)，其中QIV疫苗被称为“QIV”。如图44所示，攻击后第2天的病毒滴度没有统计学差异，然而，只在安慰剂对照组观察到平均体温上升1.0℃。在攻击后第4天与安慰剂组相比，所有三个疫苗组都产生了统计学上的病毒滴度降低，QIV疫苗显示了剂量依赖性的对数降低(2.3和1.9log10 TCID50/mL)，其在统计学上高于
Figure BDA0004008870710000942
(0.83log10TCID50/mL)。在图44中，与安慰剂相比，
Figure BDA0004008870710000943
值的p值小于0.05，与
Figure BDA0004008870710000944
相比，QIV值的p值小于0.001。另外，在
Figure BDA0004008870710000945
和QIV疫苗接种的雪貂中观察到的体重下降与安慰剂对照组相当。
图45显示了H3N2攻击后的鼻腔洗液滴度(log10 TCID50/mL)，其中QIV疫苗被称为“QIV”。如图45所示，在用A/新加坡/INFIMH-16-0019(H3N2)攻击后，在攻击后的第2天和第4天，所有被攻击的雪貂的鼻腔洗液中都检测到病毒。与安慰剂组相比，QIV疫苗45μg剂量组在第2天观察到病毒滴度的最大对数降低(1.0log10 TCID50/mL)，其在统计学上低于安慰剂。QIV疫苗和
Figure BDA0004008870710000946
产生的对数降低分别为0.7log10TCID50/mL和0.5log10 TCID50/mL，其与安慰剂组相比没有统计学意义的降低(p值小于0.05)。如图45所示，在第4天，所有疫苗接种组、
Figure BDA0004008870710000952
(1.3log10TCID50/mL)、QIV疫苗(15μg剂量，1.4log10 TCID50/mL)和QIV疫苗(45μg,1.2log10 TCID50/mL)观察到的病毒滴度都有相当水平的显著对数降低。此外，安慰剂组和
Figure BDA0004008870710000953
疫苗接种组的最大平均体重损失相当，分别为3.1％和2.6％。QIV免疫动物具有较少的感染引起的最大平均体重损失，分别为2.1％(15μg QIV)和1.2％(45μg QIV)。
关于免疫原性反应的研究，本实施例的QIV疫苗在HI和VN试验中诱导了针对四个抗原的可检测的体液免疫反应。强烈的VN反应与攻击后第4天在受到A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09攻击的接种疫苗的雪貂中观察到的鼻腔洗液病毒滴度的降低相对应。与
Figure BDA0004008870710000954
相比，接种QIV疫苗的雪貂在第4天观察到的病毒滴度对数降低的要大1.1至1.5对数。针对A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)，在所有三组接种疫苗的雪貂中都观察到强烈的HI反应。在受到A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)攻击的雪貂中，高剂量组在感染后第2天和第4天观察到了改进的保护，接种QIV疫苗的雪貂和
Figure BDA0004008870710000955
的病毒滴度有类似的对数降低--两者的病毒滴度在统计学上都比安慰剂低。这些数据表明，QIV疫苗具有免疫原性，为雪貂提供一定程度的保护，使其免受H1N1和H3N2同源病毒的攻击。
小鼠的免疫原性矩阵研究--实施例14(d)
本研究的目的是评估QIV疫苗在TMV NtK与HA抗原的不同偶联比率下的免疫原性。在本研究中，使用A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)配制单价疫苗。如表58所示，将固定剂量的HA与增加的TMV，和固定剂量的TMV与减少剂量的HA进行比较(数据未显示)。
表58.矩阵研究综述
Figure BDA0004008870710000951
Figure BDA0004008870710000961
8周龄雌性BALB/c小鼠，每组5只，在第1天和第14天用A/新加坡/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)单价流感疫苗通过皮下途径接种进行免疫，疫苗成分注明。在第12、28、42天对小鼠进行放血并收集血清，在第60天收集终末血清。
图46说明了以不同比率的TMV NtK:HA抗原生产的单价疫苗的免疫原性。相对IgG滴度以每mL血清的ng IgG表示。如图46所示，在第60天(研究结束)，与基准的1:1比率组相比，以增加TMV-NtK:HA抗原偶联比率制备的单价疫苗所诱导的IgG滴度继续显示出显著改进。
此外，在HA抗原研究中，随着TMV NtK浓度的增加，HA的剂量固定在15μg，8:1和16:1的疫苗制剂诱导了最高的平均反应，并随时间的推移而稳定。该数据支持使用根据多个实施方式和替代方式生产的疫苗作为产生体液免疫的有效策略的用途。
因此，在小鼠中的免疫原性研究和在雪貂中的效力研究清楚地表明，本实施例的QIV疫苗在产生体液免疫方面有显著的提高。此外，免疫原性被证明与HA抗原与灭活的TMVNtK运载体的偶联有关。在小鼠中，体液反应在90天内持续增加。此外，QIV疫苗的免疫能够显著降低病毒攻击后的H1N1和H3N2病毒载量，其效果大于或相当于传统疫苗的比较物
Figure BDA0004008870710000962
换言之，接种QIV疫苗能够降低因感染与该疫苗毒株同源的H1N1和H3N2流感毒株而引起的发病率和病毒水平，这种降低大于或等于传统疫苗比较物
Figure BDA0004008870710000963
预计按照本发明实施方式制造的疫苗将显示出与实施例14的QIV疫苗类似的改进的效力，在广泛的抗原与病毒如TMV偶联的情况下，可用于对抗多种病毒。
药代动力学研究–实施例14(e)和14(f)
进行药代动力学研究以评估在雄性新西兰白兔中单次肌肉内注射QIV疫苗后在8天内的生物分布。该研究使用了RT-qPCR方法，该方法已被开发并有资格衡量从组织或血液中提取的TMV NtK病毒RNA，该研究比较了用不同量的TMV NtK运载体制备的两种不同QIV疫苗制剂。分析的组织包括血液、骨骼肌(注射部位)、淋巴结、脾脏、胸腺、心脏、肝脏、肺脏、肾脏和睾丸。
图47显示了单次注射两种不同的QIV制剂后，通过RT-qPCR测量的随时间的TMVvRNA在组织中的比较性分布，在0.5mL剂量中纳入了45μg(1:1制剂单价疫苗)或1440μg(8:1制剂四价疫苗)的TMV NtK运载体(作为非限制性例子)。图48显示了单次注射后8天，TMVvRNA在组织中按器官和剂量组的生物分布情况。在图47和48中，“LOQ”是指定量极限，“LOD”是指检测极限。
正如预期的那样，这两种制剂显示出一致的分布模式。在图47和48中，在整个研究期间，注射部位的骨骼肌组织的QIV含量最高，两种制剂的QIV含量均随时间推移而减少。继骨骼肌之后，在整个研究过程中，QIV在脾脏和引流淋巴结中检测到且含量最高，表明在免疫后QIV进入这些组织。在给予后24小时的时间点，在肝脏、心脏和睾丸中检测到瞬时水平，此后两种制剂都低于LOQ。8:1制剂在免疫后24小时在血液、肺和胸腺组织中检测到低的瞬时信号，到免疫后第3天低于定量极限(LOQ)，这可能是由于该制剂中包含的TMV NtK的量高出32倍。QIV制剂在脑或肾组织中都没有检测到可量化的QIV残留。
因此，在所有的制剂中，观察到疫苗从注射部位流向免疫器官，在非目标器官中没有观察到累积。同样地，当在注射部位测量TMV特异性Q-RT-PCR信号时，观察到该信号是剂量依赖性的，并从所有非目标器官中迅速清除。因此，在免疫系统器官中的检测表明有“储库(depot)”效应(即在注射部位持续释放抗原)和对免疫系统的长期刺激。
毒理学研究–实施例14(g)和14(h)
如前文表51所述和下文表59所述，根据GLP要求进行了几项毒理学研究，以评估QIV疫苗的潜在毒性，并支持QIV疫苗用于预防流感病毒感染引起的疾病(作为非限制性例子)的临床使用。根据多个实施方式和替代方式，使用两种QIV制剂在新西兰白兔中进行了两次重复剂量毒理学研究，这两种制剂在与纯化的重组HA抗原偶联的TMV NtK运载体的含量上有所不同。正如下文更详细地描述的那样，这些研究没有发现与处理有关的或具有毒理学显著性的临床结果，这支持在人研究中安全使用TMV NtK:HA偶联物。
表59.毒理学研究综述
Figure BDA0004008870710000981
如表59所示，使用不同的病毒与抗原比率在兔身上进行了两次重复剂量的GLP毒性研究。在一些实施方式中，以每年为基础的单次肌肉内注射方式给予QIV疫苗。为了研究这种方法的功效，采用了人剂量数加1(N+1)的策略，在第一剂量后28天给予第二剂量。测试品包括以在TMV NtK运载体分子的每个偶联水平(1:1和8:1的制剂)上的预定人高剂量QIV疫苗，以及高剂量的单独的TMV NtK运载体。
在QIV疫苗的重复剂量毒性研究中，以TMV NtK运载体、HA抗原1:1的比率，季节性流感疫苗候选物在研究第1天和第29天对雄性和雌性新西兰白兔肌肉内给予两次(每天一次)，并评估28天恢复期后的效果可逆性。如表60所示，每组由10只兔/性别/组组成。在研究的第30天(最后一次给予后1天)，5只兔/性别/组被处死，在研究的第57天(最后一次给予后28天)，5只兔/性别/组被处死。
表60.重复剂量毒性研究设计，实施例14(g)-1:1QIV制剂
Figure BDA0004008870710000991
在研究的第1天和第29天，通过肌肉内(IM)注射来给予测试制品。在每次注射时，每组的动物接受0.5mL的对照品(第1组)、低剂量疫苗(第2组)或高剂量疫苗(第3组)，使用连接到塑料1-mL注射器的25号针头(作为非限制性例子)。给予部位是后肢后侧相对较大的肌肉块，并被剃光或重新剃光(视情况而定)。在注射的每一天，用酒精擦拭给予部位，并在给予前让其彻底干燥至少10分钟。IM给予部位在后肢之间交替进行，右后肢接受第一次给予。
5只兔/性别/组在研究第31天(最后一剂后两天)被安乐死，其余研究动物(4只/性别/组)继续观察，并在研究第57天(最后一剂后28天)被安乐死。实验终点包括发病率/死亡率；体格检查、临床毒性迹象和接种部位(Draize)反应原性评分；体重；体重变化；食物消耗；体温；眼科；临床病理学(临床化学、血液学、凝血学)；器官重量；免疫原性分析；尸检时的大体病理学；以及显微镜病理学。
所有的研究兔都活到了预定的尸检。没有观察到与治疗有关的或毒理学上的显著临床发现或接种部位的反应原性。在体重、体重变化、食物消耗、体温、眼科、临床化学、血液学和器官重量方面没有观察到与治疗有关的或毒理学上显著的影响。
疫苗处理组的纤维蛋白原水平通常在给予后两天增加(p<0.05或<0.01)。这些组中纤维蛋白原的增加被认为与疫苗处理有关，但被认为是用免疫原性物质处理后的预期(炎症)反应。在28天恢复期结束时，纤维蛋白原不再增加(P>0.05)(可逆效应)。
左侧坐骨神经和注射部位(研究第29天最后一次IM给予的一侧)的混合细胞浸润是肌肉内给予疫苗毒理学研究中常见的显微镜发现。这种病变在坐骨神经中是可以恢复的，但在28天恢复期结束时，注射部位没有完全恢复。这种病变不被认为是不良反应，但却是与免疫原性材料的给予相一致的预期发现。
总之，肌肉内给予QIV疫苗，剂量为15或45μg，每四周一次，注射两次(研究第1和29天)，耐受性良好。注意到的任何发现都没有导致任何不良或限制性毒性，被认为是最小的毒理学意义(例如，只在一个性别中注意到，可逆的、瞬时的，没有改变器官功能等)，和/或在给予免疫原性物质后的预期发现(如纤维蛋白原增加和注射部位或坐骨神经的混合细胞浸润)。
重复剂量毒性研究–实施例14(h)
在QIV疫苗的重复剂量毒性研究中，以TMV NtK运载体、HA抗原8:1的比率，季节性流感疫苗候选物也在研究第1天和第29天对雄性和雌性新西兰白兔肌肉内给予两次(每天一次)，并评估28天恢复期后的效果可逆性。如表61所示，每组由8只兔/性别/组组成。在研究的第30天(最后一次给予后1天)，5只兔/性别/组被处死，在研究的第57天(最后一次给予后28天)，5只兔/性别/组被处死。
表61.重复剂量毒性研究设计，实施例14(h)-1:1QIV制剂
Figure BDA0004008870710001001
Figure BDA0004008870710001011
在研究的第1天和第29天，通过IM注射来给予测试制品。在每次注射时，每组的动物接受0.5mL的对照品(第1组)、低剂量疫苗(第2组)或高剂量疫苗(第3组)，使用连接到塑料1-mL注射器的25号针头(作为非限制性例子)。给予部位是后肢后侧相对较大的肌肉块，并被剃光或重新剃光(视情况而定)。在注射的每一天，用酒精擦拭给予部位，并在给予前让其彻底干燥至少10分钟。IM给予部位在后肢之间交替进行，右后肢接受第一次给予。
4只兔/性别/组在研究第31天(最后一剂后两天)被安乐死，其余研究动物(4只/性别/组)继续观察，并在研究第57天(最后一剂后28天)被安乐死。实验终点包括发病率/死亡率；体格检查、临床毒性迹象和接种部位(Draize)反应原性评分；体重；体重变化；食物消耗；体温；眼科；临床病理学(临床化学、血液学、凝血学)；器官重量；免疫原性分析；尸检时的大体病理学；以及显微镜病理学。
所有的研究兔都活到了预定的尸检。没有观察到与治疗有关的或毒理学上的显著临床发现或接种部位的反应原性。在体重、体重变化、食物消耗、体温、眼科、临床化学、血液学和器官重量以及大体和显微镜下的病理学方面没有观察到与治疗有关的或毒理学上显著的影响。
处理组的纤维蛋白原水平通常在给予剂量后两天增加(p<0.01)。这些组中纤维蛋白原的增加被认为与处理有关，但被认为是用免疫原性物质处理后的预期(炎症)反应。在恢复期，纤维蛋白原不再增加(P>0.05)(可逆效应)。
因此，对QIV疫苗候选物或灭活的TMV NtK进行IM给予，剂量分别为每种HA抗原45μg(180μg总HA+180μgTMV NtK)或每种HA抗原1440μg，每四周一次注射两次(研究第1和29天)，耐受性良好。这些GLP毒理学研究的发现没有导致任何不良或限制性的毒性，被认为有最小的毒理学意义(例如，只在一个性别中注意到，可逆的、瞬时的，没有改变器官功能等)，和/或在给予免疫原性物质后的预期发现(如纤维蛋白原增加)。在这些研究中，1:1或8:1(TMV NtK:HA抗原)制剂的QIV疫苗都没有发现显著的毒理学问题。
此外，在两项GLP毒理学研究中(例14(g)和14(h))，根据ELISA、HAI和中和抗体滴度，在接受低剂量和高剂量QIV疫苗测试制品的兔中也测出了强力的抗原特异性免疫原性反应。图49说明了QIV疫苗免疫后第1天和第29天的兔血清样品的总抗HA IgG ELISA分析。如图49所示，免疫反应在第二次给予QIV疫苗后达到顶峰，这是对原初动物进行免疫的预期。在第29天注射后，在血清样本中测量了对所有四种流感抗原(密歇根H1N1、新加坡H3N2、B/科罗拉多和B/普吉岛作为非限制性例子)的抗流感滴度。此外，在研究的第42、49和57天，检测到的平均抗流感滴度高达90倍(比对照组高)。
如下表62所示，在研究第42、49和57天，在大多数动物中检测到针对A/密歇根/45/2015(H1N1)、A/新加坡/INFIMH-16-0019/2019(H3N2)和B/科罗拉多/06/2017病毒(作为非限制性例子)的HA滴度。相反，在研究的第42、49和57天，针对B/普吉岛/3073/2013病毒(作为非限制性例子)的HAI滴度一般出现在4只或更少的动物身上。
表62.在GLP毒理学研究的第49天具有可检测HAI滴度的动物的百分比
Figure BDA0004008870710001021
Figure BDA0004008870710001031
图50说明了在整个GLP毒理学研究中使用8:1QIV制剂对QIV疫苗中的每种病毒进行微中和GMT滴度的测量。另外，下表63提供了在两项GLP毒理学研究(即1:1和8:1的QIV制剂)的第49天具有可检测的微中和滴度的动物的百分比。如图50和表63所示，在研究第42、49和57天接受低剂量和高剂量疫苗的兔中，对这相同的四种病毒(作为非限制性例子)的中和滴度也是一致的，其中对A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09和A/新加坡/INFIMH-16-0019/2019(H3N2)病毒的滴度最高。
表63.在GLP毒理学研究的第49天具有可检测的微中和滴度的动物的百分比
Figure BDA0004008870710001032
Figure BDA0004008870710001041
因此，本实施例中讨论的研究表明，QIV疫苗在三个物种(小鼠、雪貂和兔)的肌肉内给予后持续产生了强大的免疫反应。免疫力的主要指标是产生HAI抗体滴度，这是公认的保护流感感染的血清生物标志物。在免疫学原初动物中，体液免疫反应主要是在第二次(加强)免疫后检测出来的。对疫苗血凝素抗原的免疫原性取决于与TMV NtK运载体的偶联。以比率8:1的TMV NtK运载体-与-重组HA抗原制备的QIV疫苗被证明是可取的。在疾病攻击模型中，用QIV免疫雪貂可以显著降低随后受到同源H1N1和H3N2毒株攻击的动物的病毒载量，这一点从鼻腔清洗样本中得到评估。这种病毒载量的减少大于或等于经批准的比较物的。免疫还改善了与攻击病毒有关的发病率的临床症状。
这些研究还调查了QIV疫苗的分布和安全性。在所有的研究中都没有发现水肿或注射部位的反应。对QIV的生物分布研究(测量TMV NtK运载体的RNA)发现，在注射部位肌肉之外，在所有测试的时间点，QIV在脾脏和淋巴结中的测量结果表明，TMV病毒RNA在这些器官中相对稳定或缓慢减少，这提供了潜在的作用和向免疫系统呈递抗原的机制。在重复剂量毒性研究中，唯一的发现是处理组的临床化学概况中纤维蛋白原水平的可逆性升高，通常是在给予后两天，这是免疫物质的预期发现。在体重、体重变化、食物消耗、体温、眼科、临床化学、血液学和器官重量以及大体和显微镜下的病理学方面没有观察到其他与处理有关的或毒理学上显著的影响。
总之，这些数据支持将TMV NtK偶联物推进到人临床研究，并且与目前批准的流感疫苗相比具有明显优势。由于在QIV疫苗中没有观察到毒理学上的重大发现，因此，对于按照抗原平台纯化的、与本文所述TMV NtK运载体偶联的任何其他抗原而言，观察不到此类事件的概率也会增加。因此，预计与灭活的TMV NtK偶联的其他抗原将具有类似的生物分布和毒理学概况，从而适合用于人。
实施例15(a)至(c)–冠状病毒疫苗候选物：RBD-Fc 121(SARS-2)偶联至TMV
通过在本氏烟草(Nicotiana benthemiana)(Nb)植物中表达与人IgG1的Fc结构域融合的重组版RBD SARS-2刺突蛋白(作为非限制性例子)，形成抗原，从而生产出Covid-19疫苗。在偶联之前，然后根据本文所述的抗原纯化平台，按照多个实施方式和替代方式纯化形成抗原，和根据本文所述的病毒纯化平台，按照多个实施方式和替代方式纯化和灭活TMV病毒颗粒。然后根据本文多个实施方式和备选方式的教导，将纯化的重组RBD-Fc抗原偶联至纯化和灭活的TMV病毒颗粒。在递送给哺乳动物对象(如人或动物)时，RBD-Fc与TMV的偶联物通过化学偶联至TMV病毒颗粒呈递与人IgG1 Fc结构域融合的SARS-2刺突糖蛋白RBD。正如下面更详细的讨论，本实施方式中RBD-Fc融合体的递呈已被证明在迄今为止测试的所有哺乳动物疾病模型中增强Th1和Th2反应。
在这个实施例中，Covid-19疫苗的抗原是通过靶向SARS-2刺突糖蛋白的RBD结构域来选择的，因为它是人ACE-2受体的结合位点，并且该结合位点与特征的中和抗体重叠。SARS-2刺突糖蛋白存在于S1亚基中编号约为320至520的氨基酸处。在图51(A)中，SARS-2刺突三聚体在空间填充模型中显示，RBD在水平和垂直视图中被圈出。图51(B)显示了RBD结构域与人171同种异型IgG1 Fc结构域融合，根据多个实施方式和替代方式从植物中表达和纯化。
在选择SARS-2RBD作为开发本实施例和下一实施例所述的RBD-Fc抗原的融合伴侣时，有几点考虑。SARS-2RBD是中和抗体的结合位点。另外，如下文所述，CR 3022是从SARS患者身上分离出来的人mAb，它与SARS-2RBD结构域中的结构域结合。CR 3022结合可以中和SARS-1和SARS-2CoV。SARS-2的RBD也递呈ACE-2(血管紧张素II)结合结构域。
根据本实施例的方法，设计并构建了多基因构建体，以包含编码合成针对SARS-2的RBD结构域的Covid-19抗原所需的蛋白质的基因。在本实施例中，使用以下抗原序列(本文中统称为“RBD-Fc 121构建体”)合成Covid-19抗原：
1.“(SEQ ID NO:1)”信号肽：MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA
2.“(SEQ ID NO:2)”SARS-2病毒刺突氨基酸编号331-632:NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPT
3.“(SEQ ID NO:3”)Fc铰链:VEPKSCDKTHTCPPCP
4.“(SEQ ID NO:4”)IgG1 171同种异型Fc：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
说明性地，且不限于此，图52显示了用于在Nb植物中生产SARS-CoV2RBD-Fc融合肽(即抗原)的组装的TRBO表达质粒。成功的浸润和植物孵育后，如本文所述，对抗原进行了提取和纯化。如图所示并在本文中进一步讨论，形成了融合肽，该融合肽具有第一肽，其包括病原体(具体地，冠状病毒，即SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白RBD)的受体结合结构域(RBD)，与第二肽融合，该第二肽包括抗体的可结晶片段(Fc)区(含有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列，人IgG1 Fc结构域)，以及连接第一肽和第二肽的铰链部分(含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列)。在实施例15中，RBD含有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，在实施例17中，RBD含有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。应注意，图52的质粒中提到的密码子包括RBD和Fc区以及铰链部分。编码RBD-Fc抗原的序列被优化，以实现高效的植物表达。根据质粒的设计，合成了含有融合肽的参考核酸序列的供体质粒。抗原供体质粒和TRBO表达质粒用合适的限制性酶进行消化。抗原被连接到TRBO表达质粒中，随后对克隆进行筛选以确认克隆。在大肠杆菌中扩增来自成功连接的组装表达质粒(图52)，并进行DNA纯化。TRBO表达质粒中的抗原的载体DNA确认的克隆被用来转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)，准备渗透到Nb植物中。以无菌方式转移单克隆，培养，并从培养物中产生20％的甘油储液，作为抗原主细胞库保留。如图52进一步说明的那样，示例性构建体包括花椰菜花叶病病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)35S启动子，其为DNA依赖性RNA启动子，设置为转录具有精确5'末端的TMV表达载体。此外，TMV复制酶是由126kDa和183kDa复制相关蛋白构成。在图52中，“30k”是指从183kDa蛋白编码区3’端的亚基因组启动子中产生的运动蛋白。在示例性构建体中，抗原基因是从30kDa蛋白编码区3'端的亚基因组启动子转录的，3'非翻译区有核酶以确保转录在真实3'端附近终止。此外，还有大肠杆菌复制原点和TI质粒的边界区域以及其他元件，以便在农杆菌中高效复制并插入植物细胞。
因此，可以根据本文的多个实施方式和备选方式制造提供可与病毒偶联的抗原构建体的质粒。这种构建体可包括编码融合肽的第一和第二编码区。在非限制性的方式中，第一编码区包含编码如上SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸序列，或通过下文的进一步实施例SEQ ID NO:8。第一肽可以包括或基本上包括病原体的受体结合结构域，如病毒，其非限制性的例子包括冠状病毒和流感病毒，如在本文中进一步讨论。此外，同样以类似的非限制性方式，第二编码区包含编码上述SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的核酸序列。第二肽可以是能够结合至Fc受体的抗体的可结晶片段(Fc)区域。在一些实施方式中，第一肽和第二肽通过由第三编码区编码的铰链部分连接。第三编码区可包含编码上述SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，铰链部分是Fc区的部分。在一些实施方式中，本文鉴定的一个或多个核酸序列将成为异源表达系统的部分。
植物表达、纯化和表征–实施例15(a)
在本实施例中，在烟草植物中表达RBD-FC 121融合肽(以下在本实施例中称为“RBD-Fc 121抗原”)，收获然后纯化。表达发生在原初的野生型Nb植物中，根据本文的多个实施方式和替代方式，用表达载体(如图52所示的载体作为非限制性例子)感染，用于RBD-Fc 121抗原的蛋白质复制，植物的生长和培养发生在封闭和受控的室内环境中。RBD Fc-121抗原的纯化是根据本文所述的抗原纯化平台进行的(例如，如表2和图8所示)，在此具体的实施例中省略了多模式陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱柱步骤。因此，对于本实施例，图51(B)显示了RBD结构域与人171同种异型IgG1 Fc结构域融合，根据多个实施方式和替代方式从植物中表达和纯化。可以通过MALDI-TOF质谱法确认这种示例性的、偶联前的、SARS-COV2RBD-Fc纯化的抗原中间体的身份。在一些实施方式中，抗原中间体的理化性质包括pH值在约7.0±0.4之间，渗透压在约250-350mOsm/kg H20之间，生物负荷小于10CFU/mL，以及残留的宿主细胞蛋白小于100ng/mg。灭活的TMV NtK中间体和RBD-Fc中间体的含量将被纳入偶联反应。
如图54-55所示，根据多个实施方式和替代方式的抗原纯化平台成功地纯化了RBD-Fc 121抗原，从而以符合GLP规定的方式获得了高产率(>400mg RBD-Fc蛋白)，纯的、稳定的抗原作为RBD-Fc单体。图53取自应用于该抗原的纯化平台的结论，包含表明RBD-Fc121抗原纯度的SDS page凝胶，其中泳道1显示标记物，泳道2显示纯化的RBD-Fc 121蛋白。如图53的泳道2中清晰可见的条带所示，RBD-Fc 121抗原产品是高纯度的。此外，图53所示的蛋白质迁移与图53所示的游离纯化的RBD-Fc 121的SEC-HPLC报告一致。在图54中，游离的RBD-Fc 121抗原的SEC-HPLC报告产生的信号数据详见下表64。
表64.游离、纯化的RBD-Fc 121抗原的SEC-HPLC数据
Figure BDA0004008870710001081
Figure BDA0004008870710001091
表64和图54说明，>90％的纯化的RBD-Fc 121抗原是单体形式。同样地，各批次中的杂质低，低于0.442EU/mg。因此，RBD-Fc 121抗原被成功地、充分地纯化，符合GLP。
RBD-Fc 121抗原的稳定性反映在图55和表65(如下)。图55包含纯化后5周的纯化的RBD-Fc 121抗原的SDS Page凝胶。在图55中，泳道包括：泳道1-标志物，泳道2-空白，泳道3-空白，泳道4-6-纯化5周后的RBD-Fc 121抗原。图55中清晰可见的条带表明纯化的RBD-Fc121抗原是高度稳定的。此外，如下表49所示，基于ELISA结果，纯化的RBD-Fc 121抗原在纯化后至少5周内保持其效力。
表65–ELISA测量的纯化的RBD-Fc 121抗原的效力
测试参数 测试方法 单位 2周 3周 4周 5周
效力 ELISA ug/mL 7010 8188 7096 5178
偶联和制备–实施例15(a)
然后将纯化的RBD-Fc 121抗原与TMV NtK运载体进行偶联。具有表面赖氨酸残基以进行充分偶联的TMV NtK病毒是在Nb植物中制造的(同样，作为非限制性的例子)。TMVNtK运载体根据本文所述的病毒纯化平台进行纯化(例如，如表1和图1所示)。根据本文的多个实施方式和替代方式，在纯化之后，TMV NtK被进行微米级过滤(例如0.45)，并进行紫外线灭活处理(如本文实施例8中讨论的)。
然后根据本文的多个实施方式和替代方式，将纯化的无活性TMV NtK与RBD-Fc121抗原进行化学偶联，以生产Covid-19疫苗(例如，如表3所示)。
如图56所示，一个示例性的偶联程序可至少包括以下步骤：
纯化的RBD-Fc 121抗原被渗滤到50mM MES缓冲盐(50mM NaCl)溶液中，浓缩到适合偶联的目标浓度，并进行0.2微米的过滤。
在1小时的混合反应中，使用EDC和Sulfo-NHS化学方法将纯化的RBD-Fc 121抗原与纯化的TMV NtK颗粒偶联。
如前所述，偶联可以在一系列TMV NtK:抗原(mg：mg)的比率下发生，包括但不限于8：1、4：1和1：1。
现在回到本实施例，RBD-Fc 121抗原和TMV NtK经历了在pH值约为6.0、EDC(4mM)和Sulfo NHS(5mM)中进行的偶联反应。在这方面，偶联反应的pH和纯化步骤的pH不需要相同。用游离胺(Tris碱)猝灭偶联反应，任选地使用30kDa的UF膜来去除残留的EDC、SulfoNHS和Tris碱。
因此，偶联的药物物质经过了渗滤和配制。由于偶联物超过了0.2微米，TMV NtK紫外线处理和抗原0.2-微米过滤的所有下游步骤都保持在无菌状态。
此时，TMV NtK:RBD-Fc偶联物将(在实施例15的情况下，是)准备好进行药物物质填充和药物产品填充。疫苗的合适的递送机制包括液体小瓶，或待用生理缓冲液重建以用于进行注射的冻干材料，按照本文所述的可选方法进行疫苗给予。
为了确定TMV NtK和RBD-Fc 121抗原之间的偶联百分比，使用AUC测量SV。如前所述，根据多个实施方式和替代方式，介于1-40S之间的分数表示RBD-Fc单体/三聚体的百分比，而介于40-2000S之间的分数表示TMV NtK:RBD-Fc偶联物的百分比。
在本实施例中，图57显示了样品4(其中TMV:RBD-Fc偶联物被稀释了28倍)的归一化沉降系数，图58显示了另一样品(其中TMV:RBD-Fc偶联物被稀释了10倍)的归一化沉降系数。图57显示100％的总病毒缔合物质(即病毒-抗原偶联物)，图58显示99.7％的总病毒缔合物质(即病毒-抗原偶联物)。图57和58的结果表明RBD-Fc产物几乎完全参与了TMV偶联事件。
TMV NtK和RBD-Fc 121抗原之间的成功偶联通过SDS-Page分析得到确认。图59包含了TMV NtK:RBD-Fc偶联物在偶联后不同时间段的SDS Page凝胶。在图59中，各泳道包括：泳道1–标志物，泳道2-0分钟时的偶联物混合物，泳道3–偶联后5分钟的偶联物混合物，泳道4–偶联后15分钟的偶联物混合物，泳道5-偶联后30分钟的偶联物混合物，泳道6-偶联后45分钟的偶联物混合物，泳道7-偶联后60分钟的偶联物混合物，泳道8-混合后的最终偶联物混合物，泳道9-TMV:HA偶联物作为对照，泳道10-偶联混合物0分钟，泳道11-偶联后5分钟时的偶联混合物，泳道12-偶联后15分钟时的偶联混合物，泳道13行-偶联后30分钟时的偶联混合物，泳道14-偶联后45分钟的偶联物混合物，泳道15-偶联后60分钟的偶联物混合物，泳道16-混合后的最终偶联物混合物，和泳道17-TMV:HA偶联物作为对照。泳道8和16中清晰可见的条带，与泳道9和17中的条带相似，表明TMV NtK与RBD-Fc 121抗原成功偶联。
因此，通过AUC和SDS Page证实了RBD-Fc 121抗原几乎100％偶联至TMV NtK。
体外测试–实施例15(b)
为了确定TMV NtK与RBD-Fc 121偶联物作为Covid-19疫苗候选物的功效，分析了该抗原与CR 3022和ACE-2受体的结合，以及小鼠的免疫反应。如下文更详细地讨论，数据表明与TMV NtK偶联的RBD-Fc抗原成功地结合至人ACE-2受体。如表51进一步显示，在使用TMVNtK:RBD-Fc偶联物的一个疫苗剂量后，刺激的初始免疫反应支持这一观察结果。同样地，与TMV NtK SARS-2RBD特异性、人中和单克隆抗体(mAb)CR 3022偶联的RBD-Fc 121抗原也是如此。
为了确定偶联物的结合效力，我们开发了ELISA测试，使用CR3022 mAb进行捕获，测量游离抗原(即仅RBD-FC 121)和偶联形式(TMV偶联至RBD-Fc)的RBD效力。进行ELISA测试是为了找到不与抗原的Fc部分结合的血清，以消除背景结合。该测试是通过各种方法进行的，包括预吸收和/或结合至CR3022轻链的κ区。图60显示了CR3022的ELISA数据，显示了游离抗原和TMV:RBD-Fc偶联物分别以8:1和4:1(TMV NtK:抗原)的比率配制的RBD构象的保守。在图60(A)中，ELISA标准曲线说明了SARS-2刺突抗原与CR 3022抗体结合的灵敏度和线性度。在图60(B)中，TMV:RBD-Fc偶联物被称为“TMV:RBD-Fc”。图60(B)显示了CR 3022与RBD-Fc 121抗原和配制的TMV与RBD-Fc 121偶联物的强、剂量依赖性结合。因此，图60表明，与商业来源的对照SARS刺突和RBD试剂相比，RBD-Fc 121抗原对CR 3022的反应性大于5倍。这一数据还表明，与传统的购买试剂相比，纯化的RBD-Fc 121抗原以更有利的方式保持了基本的构象表位。
ACE-2在入侵呼吸道上皮细胞时作为SARS-CoV2的刺突蛋白的细胞表面受体发挥作用。为了分析RBD-Fc 121抗原与ACE-2受体结合并引起对SARS-CoV2感染的保护性免疫反应的能力，使用双色共聚焦显微镜对ACE-2进行定量和功能性结合，并在Vero e6细胞上通过共定位和竞争性结合方法进行分析，以评估配体与ACE-2的共定位以及与血管紧张素II相比RBD-抗体复合物对ACE2的相对亲和力。
Vero细胞来自非洲绿猴的肾脏，通常用于细胞研究。Vero e6细胞是Vero76的亚克隆，表现出一系列的病毒敏感性。在本文中，通过分析浓度依赖性阻断ACE-2特异性抗体(ab15348，血管紧张素II的同源物)与活Vero e6细胞上受体的结合的能力，比较了天然激动剂，血管紧张素II与RBD-Fc的结合能力。在进行这些研究时，植物生产的重组H7毒株流感HA蛋白被用来作为对照。每种抗原-抗体复合物的浓度从0.04μg/ml到10μg/ml不等，与Veroe6细胞进行孵育，并与血管紧张素II(ACE-2的天然配体)进行比较，看其与受体结合的能力。图62(A)用图形说明了配体共定位事件，其中FAM-血管紧张素II如预期的那样与Veroe6细胞结合，每视场平均有452个颗粒，比非特异性的H7对照增加了2.79倍(n＝10次分析)。(在讨论图61、62(A)和62(B)时，血管紧张素II是指ab15348。)如同图所示，RBD-Fc 121抗原以浓度依赖的方式与Vero e6细胞结合，浓度为10ug/ml时增加2.58倍(n＝10个分析)。相比之下，在同一图中，重组流感HA-H7的结合保持在平均每视场122.5个颗粒，在任何浓度下都没有显著变化。图61直观地说明了配体共定位以及血管紧张素II和RBD-Fc121抗原之间与Vero e6细胞的竞争性结合，如图62(A)所讨论的。图61中的图像是在以下ACE-2特异性抗体浓度下用共聚焦显微镜获得的：10ug/ml、3.3ug/ml、1.1ug/ml和0.12ug/ml，其中比例尺等于15μm。在图61中，红色显示血管紧张素II与Vero e6细胞的结合，而绿色显示RBD-Fc 121抗原与这些细胞的共定位结合。RBD-Fc 121抗原与Vero e6细胞的结合以浓度依赖的方式发生，比H7 HA对照组增加2.58倍。因此，观察到RBD-Fc抗原(绿色)的结合增加与血管紧张素II结合(红色)的检测减少相关。血管紧张素II和RBD-Fc 121抗原(n＝10)的较高浓度与ACE-2受体结合的可检测水平的直接和明显下降相关(与较低浓度相比)，但重组流感HA-H7并不与浓度增加的直接下降相关联。
图62(B)说明加入共定位对照会减少所有的特异性结合，表明在血管紧张素II和RBD-Fc 121抗原存在的情况下，ACE-2抗体的结合减少。应注意，H7HA的结合并不影响单克隆抗体在任何浓度下对ACE-2的检测。这些数字还说明，RBD-Fc 121抗原能有效地与血管紧张素II竞争在Vero e6细胞上的ACE-2受体结合，并以与血管紧张素II类似的亲和力和特异性与这些细胞共定位。
因此，图60-62说明，RBD-Fc 121抗原通过与CR 3022和ACE-2的结合保持功能构象和活性。与ACE-2的结合显示出与天然激动剂血管紧张素II相似的亲和力和特异性，表明重组RBD-Fc 121融合肽复合物中的刺突蛋白RBD的构象与天然SARS-2刺突蛋白观察到的构象相当。这一数据表明，RBD-Fc 121抗原显示出必要的正确结构，以引起针对Covid-19刺突蛋白RBD的中和抗体的产生。
为了进一步评估RBD-Fc 121抗原(包括游离和TMV偶联形式)不仅能刺激免疫反应，而且能通过阻断细胞进入ACE-2受体来中和病毒感染，使用SARS-CoV2噬斑中和试验分析了免疫前、第12天、增强后第28天和第42天的汇总血清样品。中和滴度是通过确定能减少50％噬斑的血清稀释度来计算的。将标准的100PFU量的SARS-CoV-2与两倍的连续稀释的血清样品孵育一小时。然后用病毒-血清混合物接种Vero e6细胞60分钟，用EMEM琼脂培养基加1.25％Avicel覆盖细胞，培养2天，用1％福尔马林中的结晶紫染色后计数噬斑。图63(A)-(D)所示，免疫前血清表明没有证据表明对SARS-CoV2噬斑中和试验有干扰(图63(A))。第12天的血清在最低稀释度1/20时显示出轻微的抑制趋势，但与载剂对照没有统计学差异(图63(B))。到第28天(第2次疫苗接种后14天)，在1/20稀释度下，15μg纯品(未接种)和15μg+CpG组的滴度出现了统计学上的显著下降。然而，45μg纯品和45μg+CpG组在1/320稀释度下显示出显著性(图63(C))。到第42天(第二次疫苗接种后28天)，15μg纯品组在1/640稀释液和15μg+CpG组在1/320稀释液中显示出显著的中和滴度。45mcg纯品的中和滴度增加到1/5120，45μg+CpG增加到1/1280稀释度(图63(D))。
图64(A)-(B)进一步强调了15和45μg组的中和滴度的增长。这项研究与下面表68提供的数据相结合，在两个鼠临床前试验中由TMV:RBD-Fc 121疫苗诱导的中和抗体滴度，通过使用CPE中和试验和PRNT50方法以几何平均滴度(GMT)测量，显示了剂量反应，与图64(A)所示的纯疫苗组相比，纳入CpG没有对中和滴度额外诱导。正如表52中进一步总结的那样，使用标准的细胞病理学效应(CPE)中和试验对第42天(疫苗2接种后28天)的血清进行了测试，测试对象为SARS-CoV2。CPE中和试验开始于热灭活血清样品的滴定稀释，与100TCID50的SARS-CoV-2混合，一式两份，孵育1小时。然后将血清/病毒混合物加入到Veroe6细胞中，在37℃和5％的二氧化碳条件下孵育3天。孵育后，固定细胞单层，用结晶紫染色，评估是否存在病毒诱导的CPE。每个样品的病毒中和滴度被报告为防止CPM为孔的50％的最高稀释度的倒数。所有组的单个血清样品的CPE-中和方法获得的结果与SARS-CoV2噬斑试验获得的合并血清结果有很好的相关性。显示出最高中和滴度的组别，从高到低依次为：TAP COVID-19 45μg纯品(GMT＝2702)、45μg+CpG(GMT＝1280)、15μg(GMT＝676)、15μg+CpG(338)、仅RBD-Fc抗原(GMT＝294)和PBS载剂(<64)。组别对应清楚地显示了剂量反应和CpG对促进增强中和滴度没有可衡量的贡献。
体内测试–实施例15(c)
使用雌性C57BL/6小鼠对上述TMV NtK:RBD-Fc 121 Covid-19疫苗进行了两个平行评价，以评估其免疫原性。如图65(A)-(D)所示，收集的血清通过ELISA测试总IgG抗-RBD反应性，使用重组COV2 RBD-His作为捕获抗原，以比较各组之间的免疫反应。
在第一次评估中，每组使用10只动物，其中每组5只动物在第14天处死，以获得足够的血清用于广泛的测试。每组剩余的5只动物在第14天被加强，并在第28天被处死。如本文所用，术语“加强(boost)”或“增强(booster)”或这些词的其他衍生是指以与第一次相同的剂量第二次接种疫苗。在第二次评估中，每组使用5只动物，每只动物分别在第0天和第14天接受初免和加强疫苗接种，在第0、12、14、28天和终点对所有动物进行抽血。在这两项评估中，试验终点包括测量小鼠体内诱导的抗原特异性几何平均抗体滴度、SARS-2中和滴度和抗体同种型分析。下文表66概述了这些试验，其中包括各种剂量、不同的疫苗(包括仅纯化的TMV NtK、仅RBD-Fc和TMV:RBD-Fc偶联物)，并比较了使用和不使用CpG寡脱氧核苷酸(CpG)作为佐剂的相同剂量。CpG被添加到疫苗制剂中，使抗原的浓度在一致的100mcL的注射液中保持与纯的(无佐剂的)疫苗制剂相同。在一些实施方式中，利用单磷酸脂质A(MPLA)和/或SE-M作为佐剂，以增强对象对疫苗的免疫反应。“SE-M”是一种稳定的乳剂，它通常使用TRL4 Toll-样受体激动剂作为佐剂。
表66.在小鼠中的TMV NtK:RBD-Fc疫苗免疫原性测试
Figure BDA0004008870710001151
Figure BDA0004008870710001161
图65(A)显示了首次接种后12天、28天和42天，仅由RBD-Fc抗原刺激的免疫反应(ng/mL)。图65(B)显示了第一次接种后12天、28天和42天，由TMV:RBD-Fc偶联物以15mcg和45的纯剂量(无佐剂)刺激的免疫反应(ng/mL)。图65(C)显示了第一次接种后12天、28天和42天时，由加佐剂的TMV:RBD-Fc偶联物(15mcg)和TMV:RBD-Fc偶联物(45mcg+CpG)疫苗刺激的免疫反应(ng/mL)。在图65(d)中，来自取自第42天的血清展示了识别RBD-Fc抗原(黑色)和RBD-His(灰色)的IgG滴度的比较。对RBD-His的反应的相对比率显示为RBD-Fc反应总量的百分比，在每个堆积图成员上方。
RBD-His和RBD-121-Fc抗原的基线血清抗体水平非常低，<100ng/mL。此外，对PBS载剂对照的动物没有测出显著的反应，未偶联的RBD-Fc抗原产生了有限的抗体反应，表明需要偶联到TMV NtK运载体上才能产生强力的免疫反应。
如图65(B)和65(C)所示，所有TMV:RBD-Fc疫苗组到第12天都显示出可测量的抗体反应。如图65(A)、65(B)和65(C)所示，在比较仅RBD-Fc抗原和TMV:RBD-Fc偶联物时观察到了剂量反应。此外，在第二次接种后的第12天至第28天，观察到强烈的加强作用。TMV:RBD-Fc偶联物组从第28天到第42天显示出抗体滴度的扩大，而CpG佐剂疫苗显示出一致的(45μg+CpG)或下降的滴度(15μg+CpG)。无佐剂的TMV:RBD-Fc偶联物组显示出与CpG有佐剂疫苗相似的定量滴度，针对单一捕获蛋白同时分析所有血清。
如图65(D)所示，测试了对SARS-2RBD的相对免疫反应，以及抗原人Fc部分对免疫反应的影响。用SARS-2RBD-His或RBD-121-Fc蛋白作为捕获剂，通过ELISA分析第42天血清。PBS/RBD-121-Fc抗原免疫组1:100稀释后测量ELISA数据，TMV:RBD-Fc偶联物组1:1000稀释后测量。识别RBD的滴度显著低于RBD-Fc抗原，抗RBD的百分比因TMV:RBD-Fc组而异，为12-35％(图65(D))。无论捕获抗原，各TMV:RBD-Fc偶联物组的免疫反应滴度没有显著差异。
通过平衡促炎症和抗炎症反应，产生的Th1/Th2细胞因子的良好平衡有利于安全和有效的免疫反应。鉴于Th1/Th2平衡的重要性，还通过测量第42天采集的单个血清的IgG1(Th2)和IgG2(IgG2a+IgG2c；Th1))同种型进行了IgG同种型分析，结果见图66。图66(A)说明了Th1反应(IgG2a和IgG2c)，图66(B)说明了Th2反应(IgG1)，图66(C)是通过ELISA法对相对IgG2比IgG1抗体的堆叠图比较。在图66中，“*”表示与其他组相比，p<0.05。
正如预期的那样，与所有TMV:RBD-Fc偶联物组相比，PBS和RBD--Fc抗原组显示出低的整体IgG2抗体反应。所有TMV:RBD-Fc偶联物组都彼此不同，通过剂量和添加佐剂，IgG2滴度显著提高。与所有其他组相比，无佐剂的TMV:RBD-Fc偶联物组的IgG1滴度显著较高，CpG有佐剂组显著较低，与仅RBD-Fc组相当。各组的IgG1与G2同种型比率不同，RBD-121-Fc组主要是IgG1同种型滴度，无佐剂TMV:RBD-Fc偶联物组的IgG1比G2比率大于1，而TMV:RBD-Fc偶联物+CpG佐剂组的IgG1比G2比率小于0.1。总之，CpG佐剂使TMV:RBD-Fc偶联物疫苗的同型反应向Th1型倾斜，而无佐剂的TMV:RBD-Fc偶联物显示出更平衡的Th1/Th2反应混合。未偶联的蛋白几乎完全刺激了Th2反应。
在上述第一项评估中，SARS-2的中和滴度是用第14天样品的Vero E6细胞活力测试来测量的。图67显示了SARS-2病毒与鼠血清共同孵育后的平均细胞存活率，其中平均细胞存活率占总细胞的百分比与血清稀释度相对作图。图67中的数据说明，与对照组—仅载剂和仅抗原相比，在TMV:RBD-Fc 121疫苗组(仅45mcg、15和45mcg+CpG)中观察到的活力显著增加。计算了各组的几何平均中和滴度，见表51。
表67.在小鼠中TMV:RBD-Fc 121疫苗诱导的几何平均中和滴度
Figure BDA0004008870710001181
表67中的数据显示了有佐剂和纯(无佐剂)TMV:RBD-Fc 121疫苗在小鼠体内接种初免疫苗后诱导的可测量的中和滴度。图69是表示在小鼠接种针对SARS CoV-2疫苗后基于滴度的血清中和活性的图。图69中描述的数据代表了对数(2)转换的终点血清稀释度，对CPE的抑制为50％。点线和虚线分别代表用于初免后和加强后试验的起始稀释度。(*p<0.05,单向方差分析，Tukey多重比较，GraphPad Prism 8.4.2)。图69中的数据提供了进一步的支持，示例性的TMV:RBD-Fc疫苗(包括但不限于TMV:RBD-Fc 121疫苗)在有和无佐剂的单一疫苗接种后可以诱导可测量的中和滴度。在第二次疫苗加强后，这些滴度在15和45μg的浓度下都有显著增长。参照图71(A)-(C)，示例性的TMV:RBD-Fc疫苗在暴露于SARS-CoV2后为生物体提供保护。五个小组的对象或接受对照组(PBS)，或接受不同水平的RBD-Fc浓度的示例性疫苗(仅CpG佐剂，15μg无佐剂，或45μg无佐剂)，或不进行免疫。对生存(图71(A))、临床表现(图71(B))和攻击后的体重(图71(C))进行了评估和绘图。临床表现数据基于体温和身体外观，后者以0-3分计分：0＝正常；1＝轻度，缺乏梳理；2＝中度，被毛粗糙，有鼻/眼分泌物；3＝重度，呼吸窘迫，对刺激缺乏反应，被人道地安乐死。即使无佐剂，接受5μg和45μg浓度的对象的存活也是最好的，后者在感染后12天内有100％的存活率。
在第二次评估中，重组的RBD蛋白(6-His融合体)被用作捕获蛋白，测量抗原特异性抗体，并以合并组血清的ng IgG结合/mL表示。图68显示了由TMV:RBD-Fc 121疫苗在小鼠体内诱导的疫苗1(初免；第12天)和疫苗2(加强，第28天)后测量的反应滴度。这些样品代表了对每组5只动物的合并血清的分析，捕获抗原是重组RBD-6-His蛋白。如图68所示，在第12天(接种疫苗1后—初免接种)观察到45mcg纯品或与CpG佐剂混合的TMV:RBD-Fc 121疫苗的可测反应。在第28天接种疫苗2(图67中用“加强”表示)后，对于45mcg纯品或与CpG抗原组混合的TMV:RBD-Fc 121疫苗也呈现了类似的滴度。此外，这些滴度似乎显著高于15mcg纯品或与CpG抗原混合的TMV:RBD-Fc 121疫苗所诱导的滴度。在图68中，所有TMV:RBD-Fc 121组都显著高于单独由RBD-Fc抗原诱导的免疫反应。这些试验显示了TMV:RBD-Fc 121疫苗的剂量依赖性，并揭示了佐剂在与灭活的TMV颗粒偶联时对增强RBD-Fc 121抗原的免疫反应没有重大贡献。此外，如图68所示，在以45mcg剂量提供时，TMV:RBD-Fc 121疫苗诱导的反应水平大于600mcg/mL。
使用SARS-2噬斑试验，在免疫学原初动物中测试血清产生的病毒中和抗体(Nab)滴度。单次免疫后可检测到Nab滴度，但第二次(加强免疫)后，Nab滴度大大增加到<4000GMT。如下表68所示，使用了两种不同的中和测定方法，显示了可比的滴度，为结果提供了高度的有效性。应注意的是，在两个实验中，佐剂都没有增加Nab的滴度。数据支持低至15mcg的TMV:RBD-Fc 121疫苗的有效性--因为它在一次试验中显示Nab滴度在第一次给予后约为200，第二次给予后>4,000，第二次试验中>600滴度。
表68.在两个鼠临床前试验中由TMV:RBD-Fc 121疫苗诱导的中和抗体滴度，采用CPE中和试验和PRNT50方法以几何平均滴度(GMT)衡量
Figure BDA0004008870710001201
*TCID50值:CPE中和试验
**PRNT50:与病毒对照相比较，p<0.05
对鼠血清的进一步分析表明，TMV:RBD-Fc 121疫苗引起的Th1/Th2免疫反应是平衡的，而且，疫苗的免疫原性在很大程度上依赖于对TMV NtK运载体的偶联。在一个评估TMV:RBD-Fc疫苗诱导抗体增强疾病(ADE)潜力的体外模型中，含有≥2700的中和抗体滴度的血清没有显示出增强SARS-CoV-2进入巨噬细胞的证据。这表明该疫苗策略刺激Nab滴度而不促进ADE。
此外，还通过细胞刺激分析探究了Th1免疫反应。在这项研究中，5只小鼠一组，在第1天和第14天通过皮下给予一次，用15μg或45μg的抗原剂量，有或没有CpG，在50mcL的总体积(包含PBS的缓冲液)进行免疫。在第0、12、18和42天收集血清，以针对目标抗原的总滴度评估对疫苗抗原的抗体反应的量级，并与PBS免疫血清或免疫前血清进行比较。未偶联的蛋白RBD-Fc被用作评估IgG的目标，以及RBD-HIS以评估对总抗原和抗原的RBD(刺突S1结构域)成分的反应。第一次免疫后约6周，对接种疫苗的小鼠进行安乐死，收集终末血清，并收获脾脏进行IFNγELISpot分析。该研究的概述如表69所示。
表69.矩阵研究综述
Figure BDA0004008870710001211
在第42天收获每组两只动物的脾脏，生成单细胞悬液，用SARS-CoV-2RBD-HIS蛋白刺激细胞36小时，测量IFNγ分泌细胞数量。结果示于图70，其中图70(A)说明了只用载剂和RBD-Fc的IFNγELISpot分析，图70(B)说明了无佐剂的TMV:RBD-Fc疫苗的IFNγELISpot分析，以及图70(C)说明了有CpG佐剂的TMV:RBD-Fc疫苗的IFNγELISpot分析。
如图70所示，只有从接种含有CpG佐剂的TMV:RBD-Fc疫苗的小鼠身上回收的细胞在第42天(第2次免疫后4周)诱导出统计学显著的数量的IFNγ分泌细胞，15和45μg剂量组的数量相当(图70(C))。这一数据支持IgG同种型分析，表明TMV:RBD-Fc疫苗与CpG佐剂共同递送刺激了小鼠的Th1反应。
此外，对鼠血清进行了
Figure BDA0004008870710001221
SeroAssay分析，所述血清来自于用不同剂量的有和没有佐剂的TMV:RBD-Fc疫苗免疫的小鼠，评估与异源冠状病毒抗原结合的相关性。在图72中，nCoV抗原(i)是完整的SARS-CoV2刺突蛋白，(ii)是S1(RBD)结构域，SARS(i)是完整的SARS-1刺突蛋白，还有MERS(i)和HKU1(i)，各自在哺乳动物系统中生产。相对滴度表示为比对照组报道的信号增强的倍数。注意到对SARS-2抗原的强反应性和对SARS-1抗原的明显交叉反应性。如图72所示，没有观察到与不同的MERS或HKU1刺突蛋白的结合。因此，图72中的结果表明，来自小鼠的具有中和滴度的抗血清识别异源产生的(哺乳动物细胞)SARS-2刺突蛋白、RBD和SARS-1刺突蛋白(即表现出交叉反应性)。
通过
Figure BDA0004008870710001222
分析终末采血(第42天)的血清的特异性和相对滴度。使用了9种不同的捕获抗原，包括8种与SARS-CoV2疫苗成分的异源抗原，包括：SARS-CoV2刺突(在昆虫细胞中产生)；SARS-CoV2刺突(在哺乳动物细胞中产生)；在植物中产生的RBD(S1)-人Fc(同源抗原)；SARS-CoV2 RBD(S1)(在哺乳动物细胞中产生)；SARS-CoV2 S2结构域(在昆虫细胞中产生)；SARS-CoV2S1-绵羊Fc(在哺乳动物细胞中产生)；SARS-CoV1 S1-兔Fc(在昆虫细胞中产生)；MERS刺突(在哺乳动物细胞中产生)；以及HKU1刺突(在哺乳动物细胞中产生)。
Figure BDA0004008870710001223
试验是用每组的单个血清进行的，并在100、350和700ms的暴露下进行读取。图73(A)和73(B)显示了每组血清对每种抗原的反应性。图73(A)显示了对每个捕获抗原的反应性。图73(B)显示了各研究组对特定捕获抗原的比较反应性。除了SARS-CoV2 S2结构域、MERS和HKU1刺突蛋白，100ms的暴露导致疫苗血清对所有捕获抗原的反应性。然而，对SARS-COV1 S1结构域则观察到有意义的反应。对来自SARS-CoV2来源的全部和S1捕获抗原观察到不同的整体反应性。就整体反应性而言，从45μg+CpG、45μg纯品、15μg纯品、15μg+CpG和单独的RBD中降序观察到强烈的反应性，而来自PBS处理的动物血清则没有反应性。此外，图74提供了进一步的一致性，当把表52中看到的用CPE测量的个体动物反应与用
Figure BDA0004008870710001231
测量的噬斑组微中和滴度联系起来时。在图74中，CoV2 RBD-Fc免疫动物1和3、TAP 15μg动物2或15mcg+CpG动物3都显示了较低的病毒滴度和较低的中和滴度。另一方面，较高的滴度，如绝对数字和无法通过稀释减少的滴度，显示出较高的中和值。整个群体的滴度和群体中和滴度之间的总体相关性与个体滴度的绝对数、GMT和合并的血清值相吻合。
有关生存的其他数据分别见图79(A)-(B)。前者提供了小鼠攻击研究中有关生存的信息，后者提供了雪貂攻击研究中有关生存的信息。在14天的小鼠研究中(图79(A))，在感染时或接近感染时，对象(除接受安慰剂的组别外)接受8:1比率或1:1比率的HA7大流行流感疫苗(即TMV:H7抗原疫苗，有或没有CpG佐剂)。接受佐剂的对象到第14天的存活率为100％。图79(B)提供了有关雪貂攻击研究结果的信息。这也是用TMV-H7偶联物进行的，有或没有CpG佐剂。根据从鼻甲收集的病毒滴度，结果显示，疫苗改进了恢复率，与无佐剂的组相比，有佐剂组的滴度较低。
鼠测试还研究了缺乏ACE-2结合结构域的鼠巨噬细胞系(Raw 264.7)，发现抗-刺突蛋白RBD中和了病毒的杀伤力，并不促进鼠巨噬细胞感染的抗体依赖性增强。在人中，ACE-2在入侵呼吸道上皮细胞时作为SARS-CoV2的刺突蛋白的细胞表面受体发挥作用。同时，在人、小鼠和其他生物体中，从SARS-CoV康复的患者中发现了针对该刺突蛋白受体结合结构域的中和抗体，并被认为对SARS-CoV2的感染有保护作用。然而，事实也表明，非中和抗体能够增强SARS-CoV感染的严重性，并阻碍了冠状病毒(包括SARS-CoV1和SARS-CoV2)疫苗的成功开发。
在鼠测试研究中，对于对SARS-CoV2感染的抗体依赖性增强，比较了某些抗体的能力，包括由主体TMV:RBD-Fc疫苗产生的抗体。原始264.7细胞在VGCM中生长于96孔板中，并允许其粘附过夜。在加入血清或抗体之前，对细胞进行广泛的清洗。研究的抗体(或合并的血清)同时孵育1小时，以便在与巨噬细胞孵育前通过中和抗体促进病毒失活。孵育后，将含有抗体和SARS-CoV2的培养基添加到巨噬细胞中并孵育48小时，此时通过添加Cell TiterGlo(普洛麦格(Promega))来评估活力，并根据发光输出进行评价。
如图75(A-B)进一步显示，针对SARS-CoV2的核衣壳和刺突蛋白的非中和抗体增强了病毒进入鼠巨噬细胞的能力，巨噬细胞这种细胞类型在细胞表面不表达ACE2，通常对感染有抵抗力。在没有抗体的情况下，暴露于病毒的巨噬细胞的活力在感染后48小时平均为细胞活力对照的91.5％(n＝10)。图75(A)；图75(B)，第一和第五柱。在6.25ug/ml的针对整个刺突蛋白的抗核衣壳抗体存在的情况下，活力平均下降到55.69％，在大于1ug/ml的浓度依赖性下降最大。图75(A).在针对整个刺突蛋白的多克隆抗体存在(6.25ug/ml)的情况下，活力平均下降到59.78％。图75(A).相反地，在实施例15(b)的研究中，针对6.25ug/ml的TAPCOVID-19疫苗的合并的鼠血清显示出高中和滴度，没有可观察到的抗体依赖性增强，如与细胞活力对照相比，平均活力为125.56％。使用单向方差分析和Tukey的P值来衡量统计学差异，结果提供于图75(C)。因此，非中和抗体(针对核衣壳或刺突蛋白)促进了病毒进入巨噬细胞，而由TMV:RBD-Fc疫苗产生的抗体没有显示这种效果。
因此，体内测试显示，相比于对照组，TMV:RBD-Fc 121疫苗诱导可测量的、具有统计学显著性的SARS-2中和抗体滴度。本实施例的TMV:RBD-Fc 121疫苗显示出强烈的、有活力的、有希望的免疫反应。除了IgG，免疫球蛋白M(IgM)也是疫苗效力的另一个指标。在接受疫苗接种的对象中，可以通过ELISA和中和抗体滴度评估IgM水平。通常，预测IgM抗体水平会在给予疫苗后上升，通常是在几周的时间内，例如，约两周。因此，虽然可以使用其他时间段，但根据本实施方式，在接种Covid-19疫苗后的第0天、第7天、第14天和第28天，可以通过ELISA或中和抗体滴度或两者进行测试。据预测，在这种接种后进行的这种测试可以确认IgM的产生，以及在第0天和第14天之间其水平的增加，作为疫苗接种的免疫原性反应的指标。随后，随着IgG抗体滴度的增加，预计IgM水平将在第28天之前下降。还应注意，整个疫苗制造过程，从Covid-19抗原的初次测序到最终生产出药物产品无菌的cGMP疫苗，可以在8周的时间内完成，这比传统的疫苗生产方法有很大的优势，因为传统的疫苗生产方法通常需要6个月以上。
为了评估疫苗接种的潜在不良反应，研究了本文所述的示例性TMV:RBD-Fc 121疫苗对动物体重的影响。未暴露于病毒的雌性小鼠(n＝5)以8:1的TMV与抗原比率如图80所示的浓度接种，接种疫苗后每周记录每只动物的体重。图80中的数据表示动物接受了一次接种(第0天)和二次接种(第14天)，研究在第28天结束。如图80所示，所有对象的体重都有所增加。
在一项单独的攻击研究中，给新西兰白兔接种了不同比率的示例性疫苗，其中有佐剂和无佐剂，并与对照组进行了攻击后体重(图81A)和生存率(图81(B))的评估。记录了12天期间的结果，疫苗组在这两方面都明显优于安慰剂，如图所示。
此外，如实施例14所述，对QIV疫苗的研究显示，在实验动物中，H1、H3、H5和H7流感模型的研究前景非常好，没有观察到毒理学上的重大发现。此数据以及灭活的TMV作为运载体的作用表明，由于结构成分和开发平台相似，本文公开的Covid-19疫苗具有类似的潜力。正如下文实施例16所讨论的，本文所公开的Covid-19疫苗在室温和室温条件下至少6个月内表现出高稳定性。
因此，通过本文某些实施方式的实践，可以制造出适合与运载体偶联的可偶联抗原。本文的教导考虑到并以其他方式指向可偶联至病毒颗粒的抗原、病毒颗粒、疫苗、构建体和其他物质组合物，以及在制造这些东西时采用的所有方法。此抗原可以是重组抗原，一般包括具有第一肽的融合肽，该肽包括病原体的受体结合结构域，病原体的非限制性的例子是冠状病毒，和第二肽，该肽包括能够与Fc受体结合的抗体的可结晶片段(Fc)区。在一些实施方式中，第一肽和第二肽通过铰链部分连接。任选地，该铰链部分可以是Fc区的一部分。在一些实施方式中，铰链部分包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。可获得受体结合结构域的示例性冠状病毒包括但不限于SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS。
现在参考图51(A)，SARS-CoV-2的示例性受体结合结构域，该受体结合结构域包含在冠状病毒的刺突蛋白的S-1亚基中，它包括接触残基，该残基位于约289位至约662位的范围内。在一些实施方式中，第二肽可包括IgG1抗体的Fc结构域，如本文所述，这种结构域含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
与本文的教导一致，在一些实施方式中，制造疫苗，所述疫苗包括至少一种可偶联的抗原，如根据本公开的多个实施方式和替代方式所述，以及包括病毒颗粒的运载体。在一些实施方式中，这种病毒颗粒是病毒，例如TMV。可偶联抗原的第一肽可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。第一肽可包含位于冠状病毒刺突蛋白的S-1亚基的约289位至约662位的接触残基，在接种疫苗后抗原从病毒颗粒运载体中释放出来后，其将与被接种该疫苗的哺乳动物对象的细胞上的ACE-2受体接触。对于RBD-FC121抗原，接触残基可能位于S-1亚基的约301位至约662位的范围内。已发现，关于本文所指的RBD-FC 121抗原的可偶联抗原，第一肽缺乏SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，而RBD-Fc139抗原的第一肽确实含有该序列。在这两种情况下，当疫苗的可偶联抗原在具有包含一个或多个ACE-2受体的细胞的哺乳动物对象体内释放时，至少有一个可偶联抗原与一个或多个ACE-2受体结合。在一些实施方式中，用于制造这种疫苗的病毒颗粒具有表面赖氨酸残基，其与融合肽，更具体地，是与偶联反应产生的第一肽化学缔合。
与本文教导的广度一致，在一些实施方式中，根据本文教导的疫苗是多价的，包括至少一种具有甲型流感病毒受体结合结构域的可偶联抗原和至少一种具有冠状病毒受体结合结构域的可偶联抗原。其他可能的组合也在本实施方式的范围内，本文提供的组合是说明性和非限制性的。在一些实施方式中，根据本文教导的疫苗是多价的，包括至少一种具有乙型流感病毒受体结合结构域的可偶联抗原和至少一种具有冠状病毒受体结合结构域的可偶联抗原。或者，根据本文的教导的疫苗是多价的，包括至少一种具有甲型流感病毒受体结合结构域的可偶联抗原、至少一种具有乙型流感病毒受体结合结构域的可偶联抗原，以及至少一种具有冠状病毒受体结合结构域的可偶联抗原。可以选择各种比率并如下表示，病毒颗粒:抗原(按wt)(即病毒颗粒和至少一种可偶联抗原的重量比)。根据需要，该比率可在约1:1至约8:1之间，更具体地，8:1。任选地，CpG可以作为佐剂包含在根据本文教导的疫苗中，用于增强哺乳动物对象对疫苗的免疫反应。
实施例16-冠状病毒疫苗候选物TMV:RBD-Fc 121疫苗在冷藏和室温条件下的稳定 性
与实施例13中讨论的QIV疫苗的稳定性相似，RBD-Fc 121抗原和TMV:RBD-Fc 121疫苗在冷藏和室温条件下至少6个月都表现出一致性和稳定性。在本实施例中，使用实施例13中讨论的测试，测定了RBD-Fc 121抗原的稳定性，以及TMV:RBD-Fc 121疫苗的稳定性。
如前所述，根据多个实施方式纯化和生产RBD-Fc 121抗原。在这个实施例中，然后分析了纯化的RBD-Fc 121抗原的稳定性。下表提供了纯化的RBD-Fc 121抗原的稳定性数据和储存效力，这些数据是在释放时和装入小瓶并在冷藏条件(2°至8℃)和室温(22°至28℃)下储存后的不同时间测量的。在这些表中，“HMW”是高分子量的缩写。
表70–纯化的RBD-Fc 121抗原在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710001271
表71–纯化的RBD-Fc 121抗原在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710001281
按照根据多个实施方式和替代方式的生产和纯化方法，表70和71显示，纯化的RBD-Fc 121抗原是高度稳定和有效的。
同样地，根据多个实施方式和替代方式，当相同的纯化RBD-Fc 121抗原偶联至TMV时，其稳定性概况和储存效力会保持一致。下表提供了在释放时和装入小瓶后的不同时间并在冷藏条件下(2°至8℃)储存后的TMV:RBD-Fc 121疫苗(在TMV与抗原的比率为8:1时)的稳定性数据。
表72-TMV:RBD-Fc 121疫苗在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710001282
Figure BDA0004008870710001291
下表提供了在释放时和装入小包后并在冷藏条件下(2°至8℃)和室温条件(22°至28℃)下储存不同时间后的TMV:RBD-Fc 121疫苗(在TMV与抗原的比率为8:1时)的稳定性数据：
表73-TMV:RBD-Fc 121疫苗在冷藏条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710001292
表74-TMV:RBD-Fc 121疫苗在室温条件下的稳定性
Figure BDA0004008870710001301
表72和73说明TMV:RBD-Fc 121疫苗在冷藏条件下表现出至少六个月的强稳定性量度。同样，表74说明，根据多个实施方式和替代方式生产的TMV:RBD-Fc 121疫苗在室温储存(22°至28℃)下表现出至少六个月的强稳定性量度。这与传统的SARS-2疫苗形成了鲜明的对比，后者在大多数情况下需要储存在超低温冰箱(如-20℃至-70℃)中，或者在冷藏条件下，或者最多只能在室温下提供几个小时的稳定性。此外，根据多个实施方式和替代方式的纯化和制剂工艺使RBD-Fc 121抗原本身稳定化--远远超过了传统方法的稳定性限制。
实施例17–冠状病毒疫苗候选物：植物表达、纯化、表征和RBD-Fc 139(SARS-2)偶 联至TMV
除了RBD-Fc 121抗原，预计任何类型的病毒抗原，包括其他Covid-19抗原，都可以被纯化并偶联至灭活的TMV，根据多个实施方式和替代方式，用作有效的疫苗候选物。在一些实施方式中，使用以下抗原序列(本文中称为“RBD-Fc 139构建体”)合成Covid-19抗原：
1.“(SEQ ID NO:1”)信号肽：MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA
2.“(SEQ ID NO:5”)SARS-2病毒刺突氨基酸编号319-330:RVQPTESIVRFP
3.(SEQ ID NO:6”)SARS-2病毒刺突氨基酸编号331-591:NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS
4.“(SEQ ID NO:7”)烟草蚀纹病毒NIA裂解序列：enlyfqg
5.“(SEQ ID NO:3”)Fc铰链:VEPKSCDKTHTCPPCP
6“(SEQ ID NO:4”)IgG1 171同种异型Fc:APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在RBD-FC 139构建体的一个实施方式中，使用以下抗原序列合成Covid-19抗原：
“(SEQ ID NO:8”)SARS-2病毒刺突氨基酸编号319-591:RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS
设计和构建多基因构建体以包含编码合成RBD-Fc 139抗原所需的蛋白质的基因，其也以与RBD-Fc 121类似的方式靶向SARS-2的RBD结构域。根据多个实施方式和备选方式，RBD-Fc 139构建体被连接到TRBO载体中(作为非限制性的例子)，并对随后的克隆进行筛选以确认克隆。扩增含有RBD-Fc 139构建体的组装表达质粒，类似于图52所示的质粒，然后纯化用于生产主细胞库。
根据多个实施方式和替代方式，在植物中表达RBD-Fc 139抗原并使用本文所述的抗原纯化平台进行纯化。如图76-77所示，根据多个实施方式和替代方式，抗原纯化平台成功地纯化了RBD-Fc 139，从而以符合GLP规定的方式获得了高产率的、作为RBD-Fc单体的纯净、稳定的抗原。图76，取自抗原纯化平台的结论，包含SDS page凝胶，表明RBD-Fc 139抗原在还原和非还原条件下的纯度和成功纯化。在图76中，泳道包括：泳道1-还原条件下11.8ug纯化的抗原，泳道2-空白，泳道3-5：还原条件下1.5ug纯化的抗原，泳道6-空白，泳道7-标志物，泳道8-空白，泳道9-11-非还原条件下1.5ug纯化的抗原，泳道12-空白，泳道13，非还原条件下的11.8ug纯化的抗原。清晰可见的条带表明RBD-Fc 139抗原产物的纯度很高。
图77是游离的RBD-Fc 139抗原的SEC-HPLC报告，其产生的信号详见下文表75。峰下100％的面积表明100％的RBD-Fc 139抗原是单体形式。
表75.游离、纯化的RBD-Fc 139抗原的SEC-HPLC数据
Figure BDA0004008870710001321
因此，游离RBD-Fc 139抗原的SDS page凝胶和SEC-HPLC报告证实了所使用的抗原纯化平台，根据多个实施方式和替代方式，成功地纯化了RBD-Fc 139抗原。
在生产Covid-19抗原的同时，在植物中制造具有表面赖氨酸残基以高效偶联的TMV NtK病毒粒子，并根据本文所述的病毒纯化平台进行纯化。纯化后，TMV NtK要经过微米过滤，并立即用UV灭活处理。然后，RBD-Fc 139抗原通过表面暴露的赖氨酸残基偶联至灭活的TMV，利用本文所述的重组抗原实施方式偶联。
同样根据本文的实施方式，目前正在研究TMV:RBD-Fc 139偶联物作为Covid-19疾病的疫苗候选物。然而，基于四价疫苗的成功和最初的TMV:RBF-Fc 121偶联物的强烈免疫反应，TMV:RBD-Fc 139偶联物也有望成为可行的Covid-19疫苗。
很容易理解的是，本文的教导的广度符合多个实施方式，在实施该实施方式的替代方式中具有广泛的选择。因此，在一个实施方式中，本文中称为实施方式A，针对抗原，融合肽由第一肽和第二肽构成，第一肽包括病原体的受体结合域，第二肽包括能够结合Fc受体的抗体的可结晶片段(Fc)区。在实施方式A的范围内的一个实施方式中，并在本文中称为实施方式B，该抗原进一步包括连接第一肽和第二肽的铰链部分。作为Fc区的部分，更具体地说，如本文所指的实施方式C，铰链部分可包含SEQ ID NO:3中所列的氨基酸序列。在实施方式A范围内的一个实施方式中，并在本文中称为实施方式D，该病原体是具有受体结合结构域的冠状病毒，更具体地说，如本文所指的实施方式E，冠状病毒选自下组：SARS-CoV-1和SARS-CoV-2。在实施方式E范围内的一个实施方式中，并在本文中称为实施方式F，冠状病毒的受体结合结构域包括接触残基位于冠状病毒的刺突蛋白的S-1亚基的约289位至约662位的范围内，其中接触残基与哺乳动物对象细胞上的ACE-2受体接触，或者，在本文中称为实施方式G的实施方式中，接触残基位于S-1亚基的约301位至约662位的范围内。在实施方式F范围内的一个实施方式中，并在本文中称为实施方式H，冠状病毒的受体结合结构域缺乏SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。
在实施方式D范围内的一个实施方式，并在本文中称为实施方式I，冠状病毒是中东呼吸综合征冠状病毒。在实施方式A范围内的一个实施方式中，在本文中称为实施方式J，第二肽是IgG1抗体的Fc结构域，更具体地，如在本文中称为实施方式K，Fc结构域包含SEQID NO:4中所述的氨基酸序列，第一肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列。因此，根据本文更全面描述的实施方式A，可以实施抗原(即制备、形成、设计、使用等)。可选地且如实施本发明的人所希望的那样，可通过结合实施方式A实施方式B、C、D、E、F、G、H、I或J中的任何一个或多个来实施本发明的抗原，并且实施方式可针对在实施这些备选实施方式中的任何一个或多个的化合物、方法和遗传构建体。同样地，实施方式可针对实施方式A、B、C、D、E、F、G、H、I或J中所述的包含抗原的疫苗、形成抗原的方法或对形成抗原有用的遗传构建体，并进一步包括与上述任何一个实施方式相结合，包含病毒颗粒的运载体，其中在一些实施方式中的病毒是一种病毒，具体地，烟草花叶病毒，其中融合肽与运载体表面的赖氨酸残基化学缔合。
再进一步，且不限于此，在本文称为实施方式K的一个实施方式中，疫苗包括流感血凝素抗原(HA)和包括具有表面赖氨酸残基的病毒颗粒的运载体，其中HA与表面赖氨酸残基化学缔合。在实施方式K范围内，并在本文中称为实施方式L的一个实施方式中，病毒颗粒在具有包括一个或多个ACE-2受体的细胞的哺乳动物对象中释放至少一种抗原，该至少一种抗原与一个或多个ACE-2受体结合。在实施方式K范围内，并在本文中称为实施方式M的一个实施方式中，该病毒颗粒是一种病毒，或更具体地，如在本文中称为实施方式N，该病毒是烟草花叶病毒。在实施方式K、L、M或N中任何一个的范围内，并在本文中称为实施方式O的一个实施方式中，该疫苗是多价的，且HA选自下组：A型HA和B型HA，且疫苗进一步包括至少一种具有冠状病毒受体结合结构域的抗原，其中至少一种具有冠状病毒受体结合结构域的抗原与表面赖氨酸残基化学缔合。在实施方式O范围内，并在本文中称为实施方式P的一个实施方式中，该HA包括两个或更多A型血凝素抗原(HA)和两个或更多B型HA。另外，在实施方式O范围内，并在本文中称为实施方式Q的一个实施方式中，在实施方式A、B、C、D、E、F、G、H、I或J中的任何一个或多个中发现的额外特征与疫苗的冠状病毒元件纳入。此外，在本文中称为实施方式R的实施方式中，在实施方式Q范围内的疫苗中，病毒颗粒和至少一种抗原的比率(按重量)在1:1和8:1之间，更具体地，在称为实施方式S的实施方式中范围为8:1。
在实施方式K、L、M或N中任何一个的范围内，并在本文中称为实施方式T的一个实施方式中，疫苗是多价的，流感血凝素抗原(HA)被称为第一抗原，并且多价疫苗包括与表面赖氨酸残基化学缔合的第二抗原。在实施方式T范围内，并在本文中称为实施方式U的一个实施方式中，第二抗原是第一抗原以外的流感HA。在实施方式T或U范围内，并在本文中称为实施方式V的一个实施方式中，多价疫苗包括两个或更多的A型血凝素抗原(HA)和两个或更多的B型HA。在实施方式T范围内，并在本文中称为实施方式W的一个实施方式中，第二抗原包括冠状病毒的受体结合结构域。在实施方式W范围内，并在本文中称为实施方式X的一个实施方式中，该冠状病毒选自SARS-CoV01和SARS-CoV-2。在实施方式T、W或X范围内，并在本文中称为实施方式Y的一个实施方式中，多价疫苗包括两个或更多的A型血凝素抗原(HA)和两个或更多的B型HA。在实施方式T范围内，并在本文中称为实施方式Z的一个实施方式中，该病毒是烟草花叶病毒。另外，在实施方式Z范围内，并在本文中称为实施方式AA的一个实施方式中，在实施方式T-Z的任何一个或多个中发现的额外特征被包括在多价疫苗中。此外，在本文中称为实施方式BB的实施方式中，在实施方式AA范围内的疫苗中，病毒颗粒和至少一种抗原的比率(按重量)在1:1和8:1之间，更具体地，在称为实施方式CC的实施方式中范围为8:1。
在一个实施方式中，在本文中称为实施方式DD，针对病毒-抗原偶联物，包含病毒和至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包括融合肽，其具有第一肽，该第一肽包括病原体的受体结合结构域，和第二肽，其中所述融合肽可与所述病毒偶联。在实施方式DD范围内的，并在本文中称为实施方式EE一个实施方式中，该偶联物是多价的，并进一步包括至少一种选自A型HA和B型HA的流感血凝素抗原(HA)。在实施方式DD或EE范围内，并在本文中称为实施方式FF的一个实施方式中，该偶联物是多价的，且第二肽是能够结合至Fc受体结合的抗体的可结晶片段(Fc)区，且该Fc区是IgG1抗体的Fc结构域。在实施方式DD、EE或FF中任何一个范围内，并在本文中称为实施方式GG的一个实施方式中，该偶联物进一步包括连接第一肽和第二肽的铰链部分，其中铰链部分包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，并且病原体是具有所述受体结合结构域的冠状病毒。在实施方式DD、EE、FF或GG中任何一个的范围内，并在本文中称为实施方式HH的一个实施方式中，所述第一肽包含SEQ IDNO:2或SEQ IDNO:8中任何一个所示的氨基酸序列。在实施方式DD、EE、FF、GG或HH中任何一个的范围内，并在本文中称为实施方式II的一个实施方式中，所述病毒是烟草花叶病毒，其包含N-末端赖氨酸残基。在实施方式DD、EE、FF、GG、HH或II中任何一个的范围内，并在本文中称为实施方式JJ的一个实施方式中，病原体是具有所述受体结合结构域的冠状病毒，并且其中冠状病毒的受体结合结构域位于冠状病毒的刺突蛋白的S-1亚基上，并且包括接触残基，位于从约位置289到约位置662的范围内。
本文中新颖主题的其他实施方式和用途
除了上文所述的抗原，包括用于治疗SARS-CoV2的RBD-Fc抗原，根据本文描述的多个实施方式和替代方式可以形成无数其他抗原。本文的说明和教导的范围意在仅受权利要求书所限。例如，可以采用类似于实施例14、15和16的策略，从其他人感染性冠状病毒中衍生出疫苗候选物，包括急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-1)和中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS)。如图78所示，同源结构域可以被鉴定为刺突S1结构域中与受体结合和其他基本活动相关的功能区域。
在这方面，图78显示了SARS-CoV-2和其他相关冠状病毒的刺突蛋白序列比对的受体结合结构域。这里显示的是SARS-CoV-2(MN938384)、Bat-CoV(MN996532和MG772933)和SARS-CoV(NC004718)的相互作用(即结合)结构域的序列比对。所述ACE2和SARS-CoV2相互作用的关键氨基酸标有下划线。(线(-)＝相同的氨基酸，点(.)＝缺失)。图78来自OrtegaJT,Serrano ML,Pujol FH,Rangel HR.SARS-CoV-2刺突蛋白的变化在与人ACE-2受体的相互作用中的作用：计算机分析(Role of changes in SARS-CoV-2spike protein in theinteraction with the human ACE-2receptor:An in silico analysis.)EXCLI J.2020；19:410–417。公开于2020年3月18日。Doi:10.17179/excli2020-1167.
从RBD-Fc 121抗原和RBD-Fc 139抗原的构建体可见，N-末端阅读，功能的核心元件从用于RBD-Fc 139构建体的“RVQPT”基序延伸到用于RBD-Fc 121和RBD-Fc 139构建体的“CGPKK”结构域。更紧密地观察RBD-Fc 121构建体，在核心结构域之外延伸出更多的蛋白质结构域，其有利于适当的折叠。事实上，通过以下过程，该策略有望扩展到任何类型的冠状病毒抗原：
1.蛋白同源性分析–如图78所示，
2.使用现存的冠状病毒刺突模型进行计算机模拟(in silico)蛋白质折叠，
3.创建伸展蛋白(extensin)信号肽–通过SignalIP或Phobius判断，促进高效裂解的RBD遗传融合；
4.与Fc阅读框的遗传融合-如RBD-Fc 121和139构建体所描述的；
5.在植物中表达，
6.通过蛋白质A和本专利申请中说明的其他方法纯化，
7.根据本文所述的多个实施方式和替代方式偶联至TMV。
可以形成这样的疫苗以包含一些不同的和多样化的抗原，并用于预防已鉴定的冠状病毒病原体，如SARS-1或MERS，或与RBD-Fc 121或139抗原配制成多价疫苗以预防SARS-1、SARS-2和MERS，作为非限制性例子。根据本文所述的多个实施方式和替代方式，例如用甲型和乙型流感抗原，多价TMV偶联物疫苗可以混合为等量或按比例定量的每种TMV-抗原偶联物，并在单次免疫中应用。如本文所述，多价TMV偶联物疫苗不会显示出对一种抗原的免疫优势阻止对第二或第三或第四种抗原的反应。事实上，在用四价TMV流感疫苗免疫的动物中，对所有毒株都产生了HAI和中和抗体，这一点在实施例14中看出。使用这种四价疫苗，对大于一个的单个流感疫苗的保护是可以测量的。
因此，预计本文所述的方法，根据多个实施方式和替代方式，有可能在单一病毒颗粒运载体上提供广泛和多样的抗原。为了以非限制性的方式说明，在一个实施方式中，根据本文的教导提供了多价疫苗，包括两个、三个、四个、五个或更多针对各种病毒和其他病原体的不同抗原。至少一种抗原可以中和或刺激对一种类型的病毒(如流感)的免疫反应，而至少另一种抗原对另一种类型的病毒(如冠状病毒或HA7等大流行病毒)也有同样的作用。占据运载体上位置的抗原可以由以病毒的受体结合结构域之后合并融合伴侣为模型的融合蛋白构成，例如来自IgG1分子尾部区域的抗体的Fc结构域。单一疫苗上的至少一种抗原的流感部分可以包括甲型和乙型流感。同样地，该方法可以提供针对一种或多种冠状病毒的至少一种抗原。本文的方法的灵活性和本文考虑的可组合的抗原-病毒偶联物的广泛范围促进了在压缩的时间段内大规模制造广谱疫苗的能力，其通常以几周计而不是许多个月。
应理解，本文描述的实施方式在其应用中不限于文中所阐述的教导和描述的细节、或者如附图所示的细节。相反，应理解，本发明的实施方式和替代方式，如本文所说明和要求保护的，能够以各种方式实施或执行。另外，应理解的是本文中使用的词语和短语是为了是说明性目的而不应被认为是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、“例如”、“含有”或“具有”及这些词汇的变化表示涵盖其后列出的项目及其等同物以及额外的项目。
因此，对几个实施方式和替代方式的前述描述旨在说明而不是限制本公开内容的范围。本文的说明书并不意味着穷举，也不意味着将对实施方式的理解限制在所公开的精确形式上。本领域普通技术人员应理解，根据以上教导和描述，这些实施方式的修改和变化是合理可能的。
序列表
<110> KBIO控股有限公司(Kentucky BioProcessing, Inc.)
<120> 通过病毒和抗原偶联形成的疫苗
<130> 611016.1
<140> 17/186,941
<141> 2021-02-26
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的肽；用于本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的信号肽
<400> 1
Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Phe Leu Val Val Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala
            20                  25
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-2病毒刺突氨基酸编号331-632
<400> 2
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
            20                  25                  30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
        35                  40                  45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
    50                  55                  60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
            100                 105                 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
        115                 120                 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
                165                 170                 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
        195                 200                 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu
    210                 215                 220
Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala
225                 230                 235                 240
Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp
                245                 250                 255
Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr
            260                 265                 270
Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr
        275                 280                 285
Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr
    290                 295                 300
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人(Homo sapien); Fc铰链
<400> 3
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                   10                  15
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人(Homo sapien); IgG1 171同种异型Fc
<400> 4
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
    50                  55                  60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
                85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
        115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
                165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
            180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
        195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    210                 215
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-2病毒刺突氨基酸编号319-330
<400> 5
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro
1               5                   10
<210> 6
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-2病毒刺突氨基酸编号331-591
<400> 6
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
            20                  25                  30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
        35                  40                  45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
    50                  55                  60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
            100                 105                 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
        115                 120                 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
                165                 170                 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
        195                 200                 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu
    210                 215                 220
Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala
225                 230                 235                 240
Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp
                245                 250                 255
Ile Thr Pro Cys Ser
            260
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 烟草蚀纹病毒NIA裂解序列
<400> 7
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1               5
<210> 8
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-2病毒刺突氨基酸编号319-591
<400> 8
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
    210                 215                 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225                 230                 235                 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
                245                 250                 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
            260                 265                 270
Ser

Claims (15)

1.一种多价疫苗，其包括：
包含流感血凝素抗原(HA)的第一抗原；
第二抗原；和
包含具有表面赖氨酸残基的病毒颗粒的运载体；其中第一抗原和第二抗原与表面赖氨酸残基化学缔合。
2.如权利要求1所述的多价疫苗，其中第二抗原是第一抗原以外的流感HA。
3.如权利要求1或2中任一项所述的多价疫苗，其中所述疫苗包含两种或更多A型血凝素抗原(HA)和两种或更多B型HA。
4.如权利要求1所述的多价疫苗，其中所述第二抗原包括冠状病毒的受体结合结构域。
5.如权利要求4所述的多价疫苗，其中所述疫苗包含两种或更多A型血凝素抗原(HA)和两种或更多B型HA。
6.如权利要求1所述的多价疫苗，其中所述病毒颗粒是烟草花叶病毒。
7.如权利要求1所述的多价疫苗，其中当所述疫苗在未冷藏环境中以储存温度放置一段时间后，在所述时间段结束时，所述疫苗的完整性或浓度为所述疫苗的初始完整性或初始浓度的至少90％，其中所述时间段为所述疫苗的释放日期后至少42天。
8.如权利要求7所述的多价疫苗，其中所述储存温度为至少20o C。
9.一种病毒-抗原偶联物，包含病毒和至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包括融合肽，其具有第一肽，该第一肽包括病原体的受体结合结构域，和第二肽，其中所述融合肽可与所述病毒偶联。
10.如权利要求9所述的偶联物，其中所述偶联物是多价的，并进一步包括至少一种流感血凝素抗原(HA)，其选自下组：A型HA和B型HA。
11.如权利要求9或10中任一项所述的偶联物，其中所述第二肽是能够结合至Fc受体的抗体的可结晶片段(Fc)区，并且所述Fc区是IgG1抗体的Fc结构域。
12.如权利要求9-11中任一项所述的偶联物，进一步包括连接所述第一肽和所述第二肽的铰链部分，其中所述铰链部分包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，并且所述病原体是具有所述受体结合结构域的冠状病毒。
13.如权利要求9-12中任一项所述的偶联物，其中所述第一肽包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:8中任一项所示的氨基酸序列。
14.如权利要求9-13中任一项所述的偶联物，其中所述病毒是烟草花叶病毒，其包括N-末端的赖氨酸残基。
15.如权利要求9所述的偶联物，其中所述病原体是具有所述受体结合结构域的冠状病毒，并且其中所述冠状病毒的受体结合结构域位于所述冠状病毒的刺突蛋白的S-1亚基上，并且包括接触残基，位于约289位至约662位之间。
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