CN112566494B - 病毒和抗原纯化和偶联 - Google Patents

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Abstract

本文公开了：与病毒纯化、抗原纯化以及病毒和蛋白质(例如抗原)偶联以形成用于递送免疫和其他治疗剂的疫苗有关的方法和示例性组合物，其示例性方面可以包括从源生物体中收获病毒和抗原性物质；纯化平台，其包括用于从病毒和蛋白质(例如抗原性抗原，包括流感血凝素抗原)物质中去除污染物、碎片和杂质的化学分离和尺寸差异分离，及其浓缩和收集；以及偶联平台，其在增加病毒和蛋白质之间的结合速率和结合倾向的pH下提供病毒的活化，其中与偶联平台有关的实施方式包括控制病毒和蛋白质的比例。

Description

病毒和抗原纯化和偶联
美国非临时专利申请
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求2018年6月12日提交的美国临时专利申请序列号62/683,865的权益和优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
本文所述的实施方式包括用于生产高度纯化的重组病毒作为抗原运载体的多重(multi-set)过程的应用，并且进一步的各种实施方式涉及使用纯化的病毒和纯化的抗原的疫苗生产。
背景技术
病毒在蛋白质外壳中具有核酸分子，仅在其他生物体的活细胞内复制。通常被认为是有害的，各种各样的病毒能够感染所有类型的生命形式，例如人类、牲畜和植物。但从积极的一面来看，人们越来越有兴趣将病毒用于多种治疗目的，包括但不限于疫苗生产、基因治疗和癌症治疗等。然而，为了研究病毒，了解其结构，并使病毒适用于分子工具以及疾病治疗载体和运载体，必须首先纯化病毒以去除任何细胞碎片、大分子纤维、细胞器、脂质及其他会干扰病毒预期功能的杂质。
纯化后，病毒适合用于多种用途。与当前公开内容有关的一个传统观念是使用病毒(在本文中被视为病原体)来研究和开发针对病毒的遗传学策略。但在本公开中，进一步以大篇幅讨论的是使用纯化的病毒作为抗原运载体来制备疫苗。抗原是分子，当适当地递送至生物体时，能够通过与生物体内的与抗原分子结构匹配的抗体结合来刺激抗体产生，从而在该生物体中产生免疫应答。由重组DNA产生重组抗原，将其通过已知技术克隆到载体中，然后将其导入特定的宿主细胞，例如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等中。然后利用宿主细胞的翻译器表达重组抗原。表达后，重组抗原可被收集并通过称为偶联的过程通过共价键与病毒连接。抗原与病毒偶联后，病毒可充当运载体以将抗原递送至生物体并激活免疫系统应答。如此，病毒-抗原偶联物可提供治疗用途。抗原需要适当的病毒-抗原偶联来激活免疫应答，其在源生物的宿主细胞中产生抗体。病毒和抗原的纯化均促进了这种适当的偶联。
目前纯化病毒的方法通常仅限于以较小的生化量使用，例如以纳克至毫克的数量级，并且尚未在以克至千克的数量级的工业量中得到证明。例如，先前使用的被称为“粗感染细胞裂解物”的方法利用来自病毒感染细胞的粗细胞裂解物或细胞培养基。通过冻融或其他已知方法将感染的哺乳动物细胞裂解，通过低速离心去除碎片，然后将上清液用于实验。将完整的感染生物体物理破碎或粉碎，采用离心或过滤将所得提取物澄清，以生产粗病毒制剂。然而，这种方法的问题在于受到许多非病毒因素的高度污染，这些非病毒因素会影响进行实验和操纵病毒的能力。
现有的纯化步骤的第二个例子是高速超速离心，通过该方法将病毒沉淀，或通过用低密度蔗糖溶液沉淀而进一步纯化，或悬浮在各种密度的蔗糖溶液之间。该方法的限制包括由于高速分离的有限的大小和可扩展性而只能少量地生产纯化的病毒，以及由于经常与病毒样品共纯化的其他宿主蛋白质而导致病毒纯度低下。
先前用于提高病毒纯度的第三种方法是密度梯度超速离心。在该方法中，使用氯化铯、蔗糖、碘克沙醇或其他溶液的梯度来分离组装的病毒颗粒或去除缺乏遗传成分的颗粒。这种方法的限制包括纯化病毒所需的时间(通常为2～3天)，样品数量有限，一次可以分析的样品数量(每个转子通常为6个)，以及可以纯化的病毒量少(通常为几微克至几毫克的最终产物)。
有机提取和聚乙二醇沉淀也已用于纯化病毒，包括从植物中纯化病毒，例如通过去除脂质和叶绿体。然而，这些已知方法同样存在纯度低下的问题，产物通常仍附着于宿主蛋白质、核酸、脂质和糖上，这导致所得病毒产物强烈地聚集。这些限制降低了最终产物的效用，无法符合美国食品药品监督管理局(FDA)实施的现行良好生产规范(cGMP)法规。
FDA颁布的当前cGMP法规包含对药品的制造、加工和包装中使用的方法、设施和控制的最低要求。这些法规旨在确保产品安全，并确保其具有声称具有的成分和强度。因此，对于用于疫苗生产、基因治疗、癌症治疗及其他临床环境的病毒，最终的病毒产品必须符合cGMP法规。如果最终的病毒产品不符合cGMP法规(例如聚乙二醇沉淀法的产品)，则其在临床环境中的效用不存在或大大降低。
可扩展性是指即使产品量增加，例如从实验室规模(<0.1平方米)增加到至少>20平方米的系统，仍可一致地且可重现地生产相同产品的过程。以上所确定的先前使用的方法均存在缺乏一致性、可扩展性低(即仅以生化量生产产品)、以及不符合cGMP法规的问题。
在大规模生产方面，基于植物的生产受到关注，尽管其应用存在明显的限制。基于植物的生产系统能够以比中国仓鼠卵巢(CHO)等动物细胞生产系统低得多的成本生产工业规模的产品。然而，在一些规模下适用于非植物病毒的某些常规纯化方法却不能用于植物制的病毒和抗原。这些限制的产生原因在于纯化植物病毒的众多差异，这是与从动物细胞培养物中纯化病毒相反的。动物细胞生产主要成分的蛋白质和核酸杂质，而植物还是不存在于动物细胞中的大量其他杂质的来源。其中的一些包括叶绿体膜和液泡膜的脂质组成、简单和复杂的碳水化合物杂质、以及纳米颗粒状细胞器杂质。的确，例如由于杂质积聚在设备或培养基床导流管的分离膜上，粗植物提取物经常会污染用于加工和纯化从植物获得的病毒和抗原物质的设备。这种污染不可避免地导致压力流故障、过滤不良并最终导致产物收率低下。另一个问题是这些杂质倾向于聚集，并能够与植物所需的任何蛋白质、病毒或其他“产品”共纯化。因此，目前的纯化病毒的方法将不能充分去除所有或甚至足够量的杂质，包括但不限于存在于植物提取物中的杂质，并且尚不能充分产生纯化的病毒。
因此，非常需要病毒和抗原纯化平台，其始终能够以符合cGMP法规的方式以商业规模(即克级至千克级或更高)生产高纯度的病毒。这样的改进将允许在临床上开发在疫苗生产、疫苗治疗、基因治疗和癌症治疗中使用的工具。连同本文概述的其他特征和优点一起，根据多个实施方式和替代方案的本文所述的平台满足了这种及其他需求。
发明内容
在根据本公开的一些实施方式中，病毒纯化方法涉及多重过程，包括：从源生物体中收获含有至少一种病毒的病毒材料；从至少一种病毒中去除细胞碎片，从而阐明至少一种病毒的结构；将分离并澄清的病毒浓缩，其在一些实施方式中用包括膜的过滤装置进行，该膜所具有的孔的尺寸不超过使用者选择的预定限值；通过对浓缩的病毒进行一系列分离程序并在每个分离程序后收集病毒来对其进行加工，其中至少一个分离程序包括离子交换色谱法，其从病毒中分离宿主细胞污染物，并且至少一个分离程序包括多峰色谱法，其至少根据病毒和杂质之间的尺寸差异以及杂质与一种或多种色谱配体之间发生的化学相互作用，从病毒中分离残留的杂质。在一些实施方式中，植物是经历病毒的重组表达的源生物体，作为非限制性实例有本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和浮萍(Lemna minor)。当源生物体是植物时，收获可以包括种子生产和植物萌发，并诱导瞬时基因表达以形成所需蛋白质，如下所述。或者，经历病毒的重组表达的源生物体是非植物宿主，例如但不限于细菌、藻类、酵母、昆虫或哺乳动物生物体。
另外，本文所述的多个实施方式的各个方面涉及产生和/或纯化可与病毒偶联的抗原。在一些实施方式中，植物是经历抗原的重组表达的源生物体；或者，经历抗原的重组表达的源生物体是非植物宿主，例如但不限于细菌、藻类、酵母、昆虫或哺乳动物生物体。
有利地，根据本文所述的各种实施方式实施的多重过程以商业规模产生高度纯化的病毒和/或重组抗原。采用各种步骤来改进上游纯化工艺，例如富集植物病毒。一些实施方式利用尺寸排阻色谱法以及其他特征来产生纯化的重组病毒和重组抗原。因此，本文所述的各种实施方式提供了一种或多种病毒和一种或多种抗原，其适合于制备一种或多种偶联的病毒和抗原的疫苗。
关于病毒，通过实施本文所述的本发明的病毒纯化平台的一些实施方式，已实现杆状植物病毒(例如烟草花叶病毒，即“TMV”)和二十面体植物病毒(例如红三叶草花叶病毒)的纯化。根据本文的多个实施方式，实现了TMV和红三叶草花叶病毒的纯化，就尺寸和结构而言代表两种结构上有所差别的病毒。例如，较小的二十面体病毒(如红三叶草花叶病毒)具有T＝3对称性，尺寸约为31～34nm，有约180个衣壳蛋白。相反，TMV的直径约为18纳米，长度约为300nm，含有2160个衣壳蛋白。鉴于这种的差别，本发明的过程已经基于两种结构上不同的病毒进行了工作，以允许病毒穿透至渗透物中而同时保留不需要的细胞碎片。在使用中，可以控制操作参数，以使所有类型的病毒都穿透至渗透物中而同时保留叶绿素/细胞碎片，并且切向流(TFF)系统继续高效运行，而不会不适当地或不合时宜地发生污染。设计了额外的TFF步骤来保留病毒而同时允许较小的蛋白质穿透至渗透物中，并控制双色谱步骤以排除大病毒和小病毒而同时捕获宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、内毒素和植物多酚。
基于红三叶草花叶病毒和TMV的成功纯化，预计根据多个实施方式和替代方案的病毒纯化平台可以成功纯化多种病毒，包括：病毒，其包括的范围有遗传物质(例如双链和单链DNA病毒以及RNA病毒)、几何形状(例如杆状、弯曲杆和二十面体)以及科(花椰菜病毒科(Caulimoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、伴生病毒科(Sequiviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae))。
预期本文所述的实施方式可在其上获得成功的非限制性病毒包括如下所述的属：杆状去氧核糖核酸病毒属(Badnavirus)(如鸭跖草黄斑驳病毒)；花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(如花椰菜花叶病毒)；SbCMV样病毒(如大豆褪绿斑驳病毒)；CsVMV样病毒(如木薯叶脉花叶病毒)；RTBV样病毒(如水稻东格鲁杆状病毒)；碧冬茄脉明样病毒(如碧冬茄脉明病毒)；玉米线条病毒属(Mastrevirus)(双生病毒亚组I)(如玉米线条病毒)和曲顶病毒属(Curtovirus)(双生病毒亚组II)(如甜菜曲顶病毒)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)(双生病毒亚组III)(如菜豆金色花叶病毒)；苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)(如苜蓿花叶病毒)；等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)(如烟草线条病毒)；雀麦花叶病毒属(Bromovirus)(如雀麦花叶病毒)；黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)(如黄瓜花叶病毒)；长线形病毒属(Closterovirus)(如甜菜黄化病毒)；毛形病毒属(Crinivirus)(如莴苣传染性枯黄病毒)；豇豆花叶病毒属(Comovirus)(如豇豆花叶病毒)；蚕豆病毒属(Fabavirus)(如蚕豆萎蔫病毒1)；多角体病毒属(Nepovirus)(如烟草环斑病毒)；马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(如马铃薯Y病毒)；黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)(如黑麦草花叶病毒)；大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)(如大麦黄花叶病毒)；伴生病毒属(Sequivirus)(如欧防风黄点病毒)；矮化病毒属(Waikavirus)(如水稻东格鲁球状病毒)；香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)(如香石竹斑驳病毒)；香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)(如香石竹环斑病毒)；玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)(如玉米褪绿斑驳病毒)；坏死病毒属(Necrovirus)(如烟草坏死病毒)；番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)(如番茄丛矮病毒)；发形病毒属(Capillovirus)(如苹果茎沟病毒)；香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)(如香石竹潜隐病毒)；耳突花叶病毒属(Enamovirus)(如豌豆耳突花叶病毒)；真菌传杆状病毒属(Furovirus)(如小麦土传花叶病毒)；大麦病毒属(Hordeivirus)(如大麦条纹花叶病毒)；悬钩子病毒属(Idaeovirus)(如悬钩子丛矮病毒)；大麦黄矮病毒属(Luteovirus)(如大麦黄矮病毒)；玉米雷亚朵非纳病毒属(Marafivirus)(如玉米雷亚朵非纳病毒)；马铃薯X病毒属(Potexvirus)(如马铃薯X病毒和三叶草花叶病毒)；南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)(如南方菜豆花叶病毒)；纤细病毒属(Tenuivirus)(如水稻条纹病毒)；烟草花叶病毒(Tobamovirus)(如烟草花叶病毒)；烟草脆裂病毒属(Tobravirus)(如烟草脆裂病毒)；纤毛病毒属(Trichovirus)(如苹果褪绿叶斑病毒)；芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)(如芜菁黄花叶病毒)；以及幽影病毒属(Umbravirus)(如胡萝卜斑驳病毒)
已经以商业规模完成了成功的病毒纯化，并符合cGMP法规。在一些实施方式中，源生物体是植物，但尽管本实施方式的一些变体包括产生基于植物的病毒，本文所述的实施方式不限于在植物中制造或纯化病毒。在一些实施方式中，病毒纯化平台首先让植物在受控的生长室中生长，通过病毒复制感染植物，用破碎器破碎细胞并通过螺旋挤出从液体中去除植物纤维，藉此回收病毒。
在同时涉及基于植物的病毒和非植物病毒的一些实施方式中，纯化步骤包括使用切向流系统将澄清的提取物浓缩，其中，盒的孔径、跨膜压力和每平方米膜表面积的澄清提取物载量是受控的。跨膜压力(TMP)是分离膜上游侧和下游侧之间的压力差，基于如下公式计算：((进料压力+截留压力)/2)–渗透压力。为了确保病毒穿过陶瓷以产生澄清的提取物，在一些实施方式中，对进料压力、截留压力和渗透压力分别进行控制以获得合适的TMP。澄清的提取物进一步用离子交换柱体积浓缩，并用离子交换色谱平衡缓冲液洗涤。在一些实施方式中，使Capto Q离子交换柱达到平衡，将进料上样并收集在流穿级分中。然后将柱洗涤至基线，并用高盐将宿主细胞污染物从柱上剥离。
在与基于植物的病毒有关的一些实施方式中，在使用切向流陶瓷过滤去除叶绿素及其他大细胞碎片如大分子纤维、细胞器、脂质等之前，添加提取缓冲液。在一些实施方式中，陶瓷过滤促进植物宿主、细胞碎片和其他杂质中叶绿素的保留，并同时优化病毒的穿透。无论是基于植物的病毒还是非植物病毒，这种方法(其中所需物质(病毒或抗原)都作为渗透物穿过，杂质作为截留物保留下来)均可提高工艺的可扩展性。另外，诸如跨膜压力、陶瓷孔径和每平方米的生物质载量之类的参数都是受控的，以确保病毒穿过陶瓷以产生澄清的提取物。陶瓷TFF系统具有高度可扩展性，并且可容易地缩放诸如TMP、错流速度、孔径和表面积之类的参数，以接受更大量的生物质。很容易在系统中添加额外的陶瓷模块。也可以控制进料、截留和渗透压力，以维持高效的错流速度，从而几乎不污染系统。在一些实施方式中，设定并控制错流速度和压力差，以产生约10～20psi的TMP，以使较小和较大规模的病毒能够高效地穿过。陶瓷TFF系统适合使用高效清洁化学品，例如硝酸、漂白剂和氢氧化钠，以便进行清洁研究以满足GMP要求。
无论是基于植物的病毒还是非植物病毒，根据多个实施方式和替代方案的纯化方法、以及与可扩展的高通量病毒纯化方法的开发相一致的其他方法中，采用至少一种使用多峰色谱法的分离程序，至少根据病毒和杂质之间的尺寸差异以及杂质与一种或多种色谱配体之间发生的化学相互作用，从病毒中分离残留的杂质。例如，用
Figure BDA0002941491080000081
Core 700色谱树脂(通用电气医疗生物科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences))进行至少一种分离程序也包括在实施方式的范围内。/>
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Core 700“珠子”包含辛胺配体，其被设计成同时具有疏水性和带正电荷的特性，可以捕获特定尺寸(例如700千道尔顿(kDA))的分子。因为某些病毒相当大(例如大于700kDA)，并且珠子的外部没有活性，所以/>
Figure BDA0002941491080000082
Core 700允许通过尺寸排阻来纯化病毒，其中所需的物质(病毒或抗原)作为渗透物穿过，杂质作为截留物保留下来。
在一些实施方式中，同样是对于基于植物的病毒和非植物病毒，都在多峰色谱柱之前用五倍柱体积的平衡缓冲液进行平衡。在一些实施方式中，将来自Capto Q离子交换色谱的合并的流穿级分和洗涤级分上样到多峰色谱柱上，并将病毒收集在柱的空白体积中。将柱洗涤至基线，并用高电导率氢氧化钠剥离。一些实施方式的方面提供了在该步骤期间控制上样比例、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液。
将纯化的病毒例如通过渗滤进行无菌过滤，并储存。
关于抗原，通过实施本文所述的本发明的抗原纯化平台的一些实施方式，产生并纯化了重组抗原H5重组流感血凝素(rHA)、H7 rHA、西尼罗河病毒的结构域III(WNV rDIII)和拉沙热病毒重组蛋白1/2(LFV rGP1/2)。本文的各种实施方式的抗原可以来自许多来源，并且可以使用传统的重组蛋白制造策略来生产，包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或基于植物的表达方法。
在一些实施方式中，抗原制造平台首先让植物在受控的生长室中生长，感染植物以进行重组抗原复制，接着使用破碎器回收抗原，然后通过螺旋挤出从水性液体中去除纤维。添加提取缓冲液以帮助通过过滤去除叶绿素(在植物环境中)和大细胞碎片。无论是基于植物的抗原还是非植物抗原，进料压力、滤器孔径、澄清剂和每平方米膜表面的生物质载量都是受控的，以促进抗原穿过滤器。适用于实现大规模病毒和抗原纯化的各种工艺中控制的描述(尽管是非限制性的)在实施例部分中更详细地表述。
在一些实施方式中，对于基于植物的抗原和非植物抗原，随后都用切向流系统将澄清的提取物浓缩。在此可选步骤中，受控的因素包括盒的孔径、跨膜压力和每平方米膜表面的澄清提取物载量。在一些实施方式中，可选步骤被完全跳过。在此之后，随后将澄清的提取物浓缩，并用离子交换色谱平衡缓冲液洗涤。进行该步骤的一种方法是将进料上样到平衡的Capto Q离子交换柱上，然后用平衡缓冲液洗涤并用盐洗脱/剥离。然后将抗原级分收集在洗脱物中，以备钴固定化金属亲和色谱(IMAC)。平衡IMAC，进料，然后用平衡缓冲液洗涤并洗脱。稀释洗脱级分并检测pH，然后将其上样到多峰陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱柱上。用平衡缓冲液平衡CHT树脂，并洗脱抗原。上样比例、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液是受控的因素。最后，将抗原浓缩并用盐水缓冲液渗滤。将重组抗原无菌过滤后保存。
再者，根据本文公开的各种实施方式，已成功地将H7 rHA和TMV偶联，将H1N1(甲型流感/密歇根州)偶联至TMV，将H3N2(甲型流感/新加坡)偶联至TMV，以及将TMV偶联至两种乙型流感病毒(B/科罗拉多州和B/普吉岛)。在一些实施方式中，根据多个实施方式和替代方案，所述蛋白质由能够与病毒偶联以产生疫苗、然后被递送至源生物体以产生免疫应答的任何类型的治疗剂组成。因此，本文的公开内容提供了包含包括病毒-抗原偶联物在内的一系列病毒-蛋白质偶联物的组合物。在一些实施方式中，所选择的病毒是TMV或由本文的技术启示认识和/或指示的多种病毒中的任何一种。另外，在一些实施方式中，蛋白质可以是抗原，例如但不限于流感血凝素抗原(HA)，包括但不限于本段所列的那些。在一些实施方式中，HA表现出至少约50％的三聚体形成。HA在临床上是很重要的，因为它们易于被生物体产生的某些抗体所识别，从而提供了抵抗各种流感感染的主要保护。因为HA的抗原性，所以HA的免疫原性与构象有关，已知HA三聚化在引发免疫应答方面优于单体形式。
在一些实施方式中，偶联首先将纯化的抗原和病毒浓缩并渗滤至微酸性缓冲液中。然后基于摩尔浓度将抗原和病毒组合并混合。将新鲜制备的水溶性碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(也称为EDC)添加到混合物中，并同时基于摩尔浓度混合。然后基于摩尔浓度添加用于将羧基转化为可与胺反应的N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯的化学试剂，例如赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的Sulfo-NHS。继续反应直到预定的停止时间。然后将反应淬灭，其中一个示例涉及添加胺基(例如含有游离胺的液体)，并通过多峰色谱步骤或渗滤去除用于促进反应的任何化学接头(例如EDC、Sulfo-NHS)，然后将混合物稀释至目标浓度。在一些实施方式中，用蛋白质和抗原装饰的偶联和纯化的病毒颗粒可用于疫苗和/或诊断工具。这些颗粒可用作诊断工具，因为其能够追踪宿主生物体中的抗原。
在一些实施方式中，除本文公开的各种实施方式外，纯化的病毒-抗原融合物还可源自基因融合物。抗原和病毒结构蛋白(位于外壳中)形成单个连续的开放阅读框。在一些实施方式中，阅读框在植物中产生抗原外壳蛋白，从而外壳蛋白自组装成病毒颗粒。接着，根据本文公开的实施方式收获植物材料并纯化病毒颗粒。然后，根据所公开的各种实施方式，用融合外壳蛋白装饰的病毒颗粒可用作疫苗和/或诊断工具。
一些病毒(例如作为非限制性实例的二十面体病毒)在某些pH条件下溶胀，并且在一些实施方式中，该“溶胀”可用于偶联。根据多个实施方式和替代方案，可以通过使病毒结构处于引起病毒“溶胀”的酸性pH条件下，将纯化的病毒与治疗剂偶联。通过用中性pH条件处理病毒结构，病毒结构松弛并在五聚体或病毒的其他结构亚基之间形成孔。接着，将治疗剂(例如化疗剂)添加到缓冲液中，并使其扩散至松弛的病毒颗粒中。通过再次改变pH值，病毒颗粒收紧并去除将五聚体或结构亚基包在一起的孔结构，从而防止进出病毒颗粒的化学扩散。接着，根据本文公开的实施方式，收获植物材料，纯化病毒颗粒，并将含有治疗剂的病毒颗粒用于药物递送。
因此，多个实施方式和替代方案包括一种或多种高度纯化的病毒的产生。再者，多个实施方式和替代方案包括重组抗原的产生和/或纯化。再者，多个实施方式和替代方案包括用作疫苗的纯化的抗原和病毒的偶联。根据本实施方式，病毒的纯化可以自行进行。同样，根据本实施方式，重组抗原的产生或纯化可以单独进行。任选地，这些多个实施方式的不同方面也可以组合，其中除其他实施这些实施方式的方法外，组合的实施方式将包括：从一种或多种源生物体开始，从中产生一种或多种病毒和一种或多种抗原，然后纯化该病毒和抗原，然后形成疫苗，该疫苗是至少一种抗原和至少一种病毒之间的偶联物。
附图说明
本文所述的附图和实施方式说明了本文公开的多个实施方式和替代方案的多个替代结构、方面和特征，并且它们不应被理解为限制这些实施方式和替代方案中的任一个的范围。还应理解，本文所描述和提供的附图不是按比例绘制的，并且实施方式不限于所示的精确布置、描绘和手段。
图1是显示根据多个实施方式和替代方案的，在本公开范围内的特定病毒纯化平台中的步骤的流程图。
图2是根据多个实施方式和替代方案的，纯化的二十面体红三叶草花叶病毒。
图3是根据多个实施方式和替代方案的，二十面体红三叶草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图4是根据多个实施方式和替代方案的，纯化的二十面体红三叶草花叶病毒。
图5是根据多个实施方式和替代方案的，二十面体红三叶草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图6是根据多个实施方式和替代方案的，纯化的杆状烟草花叶病毒。
图7是根据多个实施方式和替代方案的，杆状烟草花叶病毒的纯化物的蛋白质印迹分析。
图8是显示根据多个实施方式和替代方案的抗原制造平台的步骤的流程图。
图9是显示根据多个实施方式和替代方案的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图10是显示根据多个实施方式和替代方案的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图11是显示根据多个实施方式和替代方案的抗原制造平台的一些步骤的蛋白质印迹分析。
图12是显示根据多个实施方式和替代方案的，通过抗原制造平台进行的各种抗原纯化的蛋白质印迹分析。
图13是根据多个实施方式和替代方案的，重组抗原与病毒偶联的图示。
图14是根据多个实施方式和替代方案的，抗原与病毒偶联的SDS-PAGE分析。
图15是根据多个实施方式和替代方案的，抗原与病毒偶联的SDS-PAGE分析。
图16是根据多个实施方式和替代方案的，抗原与病毒偶联的SDS-PAGE分析。
图17是根据多个实施方式和替代方案的，游离TMV产品的尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)报告。
图18是根据多个实施方式和替代方案的，在病毒和抗原之间偶联15分钟的SEC-HPLC报告。
图19是根据多个实施方式和替代方案的，在病毒和抗原之间偶联2小时的SEC-HPLC报告。
图20是根据多个实施方式和替代方案的，病毒和抗原之间的偶联的蛋白质印迹分析。
图21是显示根据多个实施方式和替代方案的，用各种水平的UV辐射处理的病毒的感染性的图。
图22是根据多个实施方式和替代方案的，重组抗原与病毒的偶联平台的一些步骤的图示。
图23是根据多个实施方式和替代方案的，抗原与病毒偶联的SDS-PAGE分析。
图24是根据多个实施方式和替代方案的，重组抗原的负染色透射电子显微镜(TEM)图像。
图25是根据多个实施方式和替代方案的，病毒的负染色TEM图像。
图26是根据多个实施方式和替代方案的，与添加了病毒的另一种重组抗原偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图27是根据多个实施方式和替代方案的，以1：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图28是根据多个实施方式和替代方案的，以1：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图29是根据多个实施方式和替代方案的，以4：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图30是根据多个实施方式和替代方案的，以16：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的负染色TEM图像。
图31是根据多个实施方式和替代方案的抗原的标准化沉降系数分布。
图32是根据多个实施方式和替代方案的病毒的标准化沉降系数分布。
图33是根据多个实施方式和替代方案的，以1：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图34是根据多个实施方式和替代方案的，以1：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图35是根据多个实施方式和替代方案的，以1：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图36是根据多个实施方式和替代方案的，以4：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图37是根据多个实施方式和替代方案的，以16：1的病毒：重组抗原比例与病毒偶联的重组抗原的标准化沉降系数分布。
图38是根据多个实施方式和替代方案的，以各种病毒：重组抗原比例给予病毒-抗原产品之后的源生物体中抗原相关滴度的散点图。
图39是根据多个实施方式和替代方案的，显示以各种病毒：重组抗原比例给予病毒-抗原产品之后的源生物体中抗原相关滴度的几何平均数检验。
多个实施方式和替代方案
根据本文的多个实施方式和替代方案的多重过程改进了上游纯化工艺，进一步富集了植物病毒，并促进了病毒和抗原的偶联以形成疫苗。结合表1和图1列出并讨论了根据多个实施方式和替代方案的产生和纯化病毒的步骤。同样地，结合表2列出并讨论了产生和纯化抗原的步骤。尽管各种平台具有下文中针对它们描述的特定实施方式，但是本文所包含的实施方式的范围不限于任何一个特定实施方式。
病毒的产生和纯化
表1和图1显示根据多个实施方式和替代方案的病毒纯化平台的步骤。
表1.病毒的产生和纯化
Figure BDA0002941491080000151
该纯化平台设计成有商业可扩展性并符合cGMP法规，并且在整个纯化过程中使用一种缓冲液。根据多个实施方式和替代方案，结合植物表达给出病毒纯化平台的步骤。然而，如下所述的在气生组织收获和细胞破碎之后的步骤也将适用于非植物病毒(除非上下文与植物明显相关，例如，提及去除植物纤维)。
根据本文所述的多个实施方式和替代方案，病毒表达通过适合于特定宿主的方法完成。在一些实施方式中，基于病毒将基因递送至植物宿主是通过修饰的TMV表达载体完成的，该载体可使烟草植物以重组方式形成病毒。一种此类可用替代方案是美国专利7,939,318“灵活的疫苗组装和疫苗递送平台”中描述的
Figure BDA0002941491080000161
平台。该专利中描述的该基于植物的瞬时表达平台采用植物病毒TMV来利用植物蛋白生产机制，该机制在接种后的很短的收获时间内(例如少于21天)表达多种病毒。接种了病毒基因的烟草植物在受感染的细胞中表达特定的病毒，并在收获时提取病毒。接种通过例如由本文所述方法的使用者选择的方式来进行，例如手工接种叶片表面、机械接种植物床、叶片高压喷雾或真空渗透。
除本氏烟草(Nicotiana benthamiana)外，本公开还考虑了其他植物和非植物宿主，包括发明内容中提到的那些。除
Figure BDA0002941491080000162
平台外，可以采用其他策略将基因递送至植物(作为非限制性实例有膨胀浮萍(Lemna gibba)或小浮萍(Lemna minor))和非植物生物体(作为非限制性实例有藻类)。这些其他策略包括农杆菌渗透，其通过农杆菌细菌载体将病毒基因导入整个转染植物的许多细胞。另一个策略是电穿孔，其在宿主细胞膜上开孔，以导入以重组方式产生病毒和抗原的基因，例如但不限于以下实施例1和3中所述的那些。另一个策略是基于TMV RNA的过表达(TRBO)载体，它利用缺少TMV外壳蛋白基因序列的35S启动子驱动的TMV复制子，如John Lindbo,“TRBO：高效的基于烟草花叶病毒RNA的过表达载体”,Plant Physiol.Vol 145,2007中所述。
在一些实施方式中，本氏烟草野生型植物在受控的生长室中生长。植物的生长通过灌溉、光照和施肥循环来控制。植物在无土培养基中生长，并且在整个过程中控制温度。
在适当的播种后天数(DPS)，例如23～25DPS后，通过病毒复制感染植物。感染后，仅用水灌溉植物，并在一定的感染后天数(DPI)内根据病毒类型通过光照周期和温度进行控制。
检查植物的高度、感染症状，并收获气生组织。
采用配置有优化好的刀片/筛尺寸的破碎器进行病毒回收/细胞破碎，然后从水性液体中去除残留的纤维素植物纤维(例如通过螺旋挤出)。
将适当的提取缓冲液(例如200mM乙酸钠，pH 5.0；作为非限制性实例有图1的步骤201)以1：1的缓冲液：组织比例添加至所得提取物中。使用切向流(TFF)陶瓷过滤(1.4微米/5.0微米)，以中试规模去除叶绿素和大细胞碎片。跨膜压力、陶瓷孔径和每平方米膜表面的生物质载量都是受控的，以确保病毒穿过陶瓷。在一些实施方式中，设置并控制进料压力、截留压力和渗透压力，以产生约1.5–2巴TMP范围内的跨膜压力。
通过使用玻璃纤维深度过滤进一步澄清陶瓷渗透物(作为非限制性实例有图1的步骤203)。
用TFF系统(购自Sartorius AG)将澄清的提取物浓缩。盒的孔径(100～300kDa)、本文所述的适当TMP以及每平方米膜表面积的澄清提取物载量都是受控的。
将澄清的提取物浓缩至2倍于离子交换柱体积的NMT，并用离子交换色谱平衡缓冲液(200mM乙酸钠，pH 5.0，图1的步骤204提供了一个非限制性实例)洗涤7次。将Capto Q离子交换柱用五倍柱体积的200mM乙酸钠，pH 5.0平衡(图1的步骤205提供了一个非限制性实例)，将进料上样并收集在流穿级分中。将柱洗涤至基线，并用高盐将宿主细胞污染物从柱上剥离。
收集流穿级分和洗涤级分，合并以备多峰
Figure BDA0002941491080000171
Core 700色谱。将多峰色谱柱用五倍柱体积的平衡缓冲液(200mM醋酸钠，pH 5.0；图1的步骤206提供了一个非限制性实例)平衡。
将来自Capto Q离子交换色谱的合并的流穿级分和洗涤级分上样到柱上，并将病毒收集在柱的空白体积中。将柱洗涤至基线，并用高电导率氢氧化钠剥离。上样比例、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液都是受控的。在一些实施方式中，病毒的配制和浓缩(图2的步骤208)是用TFF系统(例如Sartorius AG系统)进行的。孔径(30～300kDa)、本文所述的适当TMP、每平方米膜表面积的载量以及孔材料都是受控的。将病毒浓缩至合适的浓度，例如10mg/ml，并且在一些实施方式中，用合适的缓冲液(例如磷酸钠)渗滤。将配制好的病毒消毒并适当保存。在一些实施方式中，用PES滤器进行消毒。
本文提供的所有实例都意在说明病毒产生、病毒纯化、抗原产生、抗原纯化和病毒-抗原偶联的任何或全部的多个实施方式和替代方案的各个方面。这些实例是非限制性的，并且仅仅是本文的多个替代实施方式的特征。
实施例1—二十面体红三叶草花叶病毒的纯化
作为检测混合物中各种蛋白质的已知技术，图3中提供的蛋白质印迹(WesternBlot)，其中显示图2所示的二十面体红三叶草花叶病毒的成功纯化。类似地，图5中的蛋白质印迹显示图4所示的二十面体红三叶草花叶病毒的成功纯化。两种病毒均根据本文所述的实施方式纯化。根据已知的检测技术，从组织中提取靶蛋白。然后根据其等电点、分子量、电荷或这些因素的各种组合，使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。然后将样品上样到凝胶中的各个泳道中，保留一个泳道供“梯标”使用，该“梯标”中含有具有确定分子量的已知蛋白质的混合物。例如在图3中，泳道12充当梯标。然后将电压施加到凝胶上，使得各种蛋白质基于上述因素以不同的速度通过凝胶迁移。在分别在图3和5中给出的每个泳道内，不同的蛋白质被分离成可见的条带。通过蛋白质印迹，更纯净的产品的特征是清晰可见的条带，这些特征也体现在这些图中。
图3和图5显示成功纯化二十面体红三叶草花叶病毒的病毒纯化平台。蛋白质印迹的每个泳道均显示在病毒纯化平台的不同步骤完成后的病毒的纯度。图3中，泳道包括：泳道1—绿汁，泳道2—TFF陶瓷澄清截留物，泳道3—TFF陶瓷澄清渗透物，泳道4—TFF盒截留物，泳道5—TFF盒渗透物，泳道6—离子交换，泳道7—离子交换，泳道8—多峰，泳道9—多峰，泳道10—30K TFF渗透物，泳道11—30K截留物，泳道12—标记物。图5中，蛋白质印迹的泳道包括如下泳道：泳道1—绿汁，泳道3—TFF陶瓷澄清截留物，泳道5—TFF陶瓷澄清渗透物，泳道7—TFF盒截留物，泳道9—TFF盒渗透物，泳道11—离子交换，泳道13—多峰，泳道14—标记物。
一旦在病毒纯化平台中进行完最后一步，就将所得病毒产品高度纯化，如图3泳道11和图5泳道13中的可见条带所示。
实施例2—杆状TMV的纯化
图6显示纯化的杆状TMV，图7显示在本文公开的多个实施方式和替代方案的范围内的、用于实现该纯化的TMV的病毒纯化平台。与图3和图5类似，图7显示该病毒纯化平台的各个步骤完成后的病毒产品的纯度。在最后的纯化步骤后，所得产品是高度纯化的病毒产品，与图7的泳道13中清晰可见的条带一致。
因此，本发明的病毒纯化平台已经成功地纯化出发明人应用了这些方法的每种病毒，包括二十面体病毒和杆状病毒，并且该平台有望以商业规模可重现地且一致地纯化几乎任何类型(如果不是所有类型)的病毒。
重组抗原的产生和纯化
表2和图8显示根据多个实施方式和替代方案的抗原纯化平台的步骤。
表2.重组抗原的产生和纯化
Figure BDA0002941491080000201
该纯化平台设计成有商业可扩展性并符合cGMP法规，并在整个纯化过程中使用一种缓冲液。根据多个实施方式和替代方案，抗原纯化平台的步骤如下：
本氏烟草野生型植物在受控的生长室中生长。植物的生长通过灌溉、光照和肥料循环来控制。植物在无土培养基中生长，并且在整个过程中控制温度。在适当数量的DPS(例如23～25)后，感染植物以进行所选抗原的蛋白质复制。标记后，该蛋白质足以保留在转基因植物细胞的ER中。感染后，仅用水灌溉植物，并在一定的感染后天数(例如7～14天)内根据抗原类型通过光照周期和温度进行控制。检查植物的高度和感染症状，并收获气生组织。
采用配置有优化好的刀片/筛尺寸的破碎器进行由植物产生的抗原的回收，然后从水性液体中去除残留的纤维素植物纤维(例如通过螺旋挤出)。
将合适的提取缓冲液以合适的比例(例如1：1的缓冲液：组织比例或2：1的缓冲液：组织比例)添加到所得提取物中。在一些实施方式中，提取缓冲液可以是50～100mM磷酸钠+2mM EDTA+250mM NaCl+0.1％Tween80，pH 8.5。采用过滤去除叶绿素和大细胞碎片。以33g/L的比例添加Celpure300，并混合15分钟。进料压力(<30PSI)、滤器孔径(0.3微米)、澄清剂(Celpure300)以及每平方米膜表面的生物质载量都是受控的，以确保抗原穿过。
用TFF系统(例如Sartorius AG系统)将澄清的提取物浓缩。在一些实施方式中，盒的孔径(例如30kDa)、本文所述的适当TMP以及每平方米膜表面积的澄清提取物载量都是受控的。
将澄清的提取物浓缩，并用适当的离子交换色谱平衡缓冲液(例如50mM磷酸钠+75mM NaCl，pH 6.5)洗涤7次。将Capto Q离子交换柱用五倍柱体积的50mM磷酸钠+75mMNaCl，pH 6.5平衡，将进料上样，用平衡缓冲液洗涤，并将柱用高盐洗脱/剥离。
将抗原级分收集在洗脱液中，以备钴IMAC色谱。将IMAC用五倍柱体积的50mM磷酸钠+500mM氯化钠，pH 8.0平衡，将进料上样，用平衡缓冲液洗涤并用咪唑洗脱。
稀释洗脱级分至一定导电率，并检测pH，将其上样到多峰陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱柱上。将CHT树脂用五倍柱体积的平衡缓冲液(5mM磷酸钠，pH 6.5)平衡。用磷酸盐和氯化钠的梯度洗脱抗原。上样比例、柱床高度、停留时间和色谱缓冲液都是受控的。抗原的配制和浓缩是用TFF系统(例如Sartorius AG系统)进行的。孔径(单位kDa)、TMP、每平方米膜表面积的载量以及孔材料都是受控的，如本文进一步讨论。
接着，将抗原浓缩至合适的浓度，例如3mg/ml，并用合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)渗滤。将配制好的抗原消毒并适当保存。在一些实施方式中，用PES滤器进行消毒。
图9、10和11显示根据多个实施方式和替代方案的抗原纯化平台的各个步骤。图9显示Capto Q色谱步骤完成后的抗原产品的纯度，图10显示亲和色谱步骤之后的抗原产品的纯度，图11显示CHT色谱柱之后的纯度。
实施例3、4、5和6—H5 rHA、H7 rhA、WNV rDIII和LFV rGP1/2
如图12所示，根据多个实施方式和替代方案的抗原纯化平台已经成功地纯化了H5rHA、H7 rhA、WNV rDIII和LFV rGP1/2。图12包含从抗原纯化平台的结论中获取的两个图像：左图包含SDS Page凝胶，表明病毒载体TMV NtK(其中NtK是N末端赖氨酸的缩写)和流感抗原的纯度，右图包含蛋白质印迹，表明对西尼罗河和拉沙热抗原的免疫反应性。如图12中清晰可见的条带所示，每种抗原产品都是高纯度的。因此，根据多个实施方式和替代方案的抗原纯化平台以符合cGMP法规的方式，以商业规模一致地纯化每种类型的抗原。以同样的方式，该平台有望可重现地纯化几乎任何类型(如果不是所有类型)的抗原。
重组抗原-病毒偶联物的产生
表3显示根据多个实施方式和替代方案的重组抗原偶联的步骤。
表3.重组抗原的产生和纯化
Figure BDA0002941491080000231
在一个实施方式中，偶联平台的步骤如下：
将纯化的抗原和病毒分别浓缩并渗滤至微酸性缓冲液中，例如含有NaCl的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。
将水溶性碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(称为EDC)在纯净水中配制成0.5M的摩尔浓度。
将羧基转化为可与胺反应的N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯的化学试剂，例如赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的Sulfo-NHS在纯净水中配制成0.1M的摩尔浓度。
基于重量或摩尔浓度将抗原和病毒合并，并混合至均匀(例如以1：1mg：mg添加)。
将新鲜制备的水溶性碳二亚胺(例如EDC)添加到混合物中，并同时基于摩尔浓度混合。
在添加EDC的一分钟内，基于摩尔浓度添加将羧基转化为可与胺反应的酯的化学试剂(例如Sulfo-NHS)。开始偶联反应并继续直到预定的混合停止时间，例如4小时，并控制室温。
通过添加游离胺淬灭反应，并通过多峰色谱步骤(例如
Figure BDA0002941491080000241
Core700)或渗滤到磷酸盐缓冲盐水中来除去化学接头(例如EDC和Sulfo-NHS)。根据多个实施方式和替代方案，基于作为截留物的杂质与作为渗透物的偶联物混合物之间的尺寸差异，从偶联物混合物中去除残留的杂质。
将偶联物混合物稀释至目标浓度。此时，将病毒-抗原偶联物制备成用作纯化的疫苗/药物物质。疫苗的合适的递送机制包括液体小瓶，或待用生理缓冲液重建以用于进行注射的冻干材料。注射可以是肌内注射或皮下注射。考虑了其他递送方法，包括但不限于鼻内。
实施例7—H7 rhA偶联至TMV
图13提供了重组抗原(记作“疫苗抗原”)偶联至病毒的图示，其中浅色和深色阴影的椭圆形表示实施例中所示的疫苗抗原的偶联程度。浅色阴影表示游离病毒，而深色阴影表示偶联至病毒蛋白质外壳的抗原。同样，如图13所示，一些病毒在RNA基因组周围含有位于外壳上的蛋白。例如，病毒载体TMV NtK包含N末端赖氨酸，其充当外壳蛋白的连接点。在一些实施方式中，对与N末端赖氨酸残基结合的病毒部分进行修饰，以更强地呈现重组抗原的结合，从而提供蛋白质(例如抗原)与病毒的胺靶向偶联。结合本文中的径向测量的讨论，在重组抗原偶联至病毒外壳蛋白后，病毒半径大大增加。在一些实施方式中，在包膜的病毒发生改变时进行修饰，以增强其残基的呈现。
如图14～20所示，重组抗原与病毒的偶联平台已经成功地将H7 rHA偶联至TMV。图14-16显示基于十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)在pH 5.50下对H7rHA和TMV之间的偶联的分析。如这些图中所示，在2小时内，几乎所有H7 rHA都偶联至TMV。rHA蛋白条带的消失以及在200KDa标记物上方的复合物染色的同时出现表明了复合物的形成。所述条带与HA特异性抗体的反应性进一步证实了这一结论。
SEC-HPLC报告还表明，根据偶联平台的当前实施方式成功地将H7 rHA偶联至TMV。图17显示游离TMV产品的SEC-HPLC报告。图17中，游离TMV产品的SEC-HPLC报告产生了下表4中详细示出的信号数据。
表4.游离TMV的SEC-HPLC数据
Figure BDA0002941491080000251
图18显示根据偶联平台的当前实施方式将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC报告。图18中，将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC报告产生了下表5中详细示出的信号数据。
表5.将H7 rHA偶联至TMV 15分钟后的SEC-HPLC数据
RT[min] 宽度[min] 面积 高度 面积％ 峰对称性
26.539 0.52 553.75 17.65 100 0.83
图19显示根据偶联平台的当前实施方式在将H7 rHA偶联至TMV 2小时后的SEC-HPLC报告。图19中，根据偶联平台的当前实施方式将H7 rHA偶联至TMV 2小时后获取的SEC-HPLC报告产生了下表6中详细示出的信号数据。
表6.将H7 rHA偶联至TMV 2小时后的SEC-HPLC数据
Figure BDA0002941491080000261
如图19和20所示，SEC-HPLC报告表明，在偶联15分钟后，所有TMV杆均被一些H7rhA包被，并且在最多2小时内有更多的H7 rhA添加至杆中。2小时后，没有检测到额外的偶联。根据多个实施方式和替代方案，SEC-HPLC报告表明，偶联反应使未偶联的天然分子量的病毒外壳蛋白减少了至少约50％，并且在偶联发生4小时后，剩余约3％的游离TMV。
如图20所示，偶联物产品的蛋白质印迹分析表明，H7 rhA通过共价连接成功地偶联至TMV。图20显示根据当前实施方式的偶联平台的各个步骤的蛋白质印迹分析，其中所有样品均以10μL上样。各个泳道显示抗原和病毒之间不同的偶联反应时间。泳道14和13显示，15分钟后，所有TMV杆均被抗原包被。2小时后，泳道6～9显示未发生额外的偶联。
实施例8—TMV NtK的UV灭活
为了避免生物制药产品的病毒污染，通常需要将病毒灭活(或消毒)，以确保病毒不再具有感染性。此外，许多监管机构已经制定了规章(例如cGMP法规)，要求在病毒产品的纯化过程中有至少一个有效的灭活步骤。尽管UV-C辐射已在水处理系统中使用了很多年，但其在生物制药产品中的应用仍未被开发，并且关于其有效灭活病毒的能力的研究还很有限。
因此，在病毒产生和纯化之后但在与重组抗原偶联之前，评估了各种UV-C条件(即能量密度和波长)和各种TMV浓度，以有效地将TMV NtK灭活和消毒。尽管测试了许多能量密度，但只有更高水平的能量密度成功地将TMV NtK灭活。此外已确定，成功的病毒灭活是浓度依赖性的，因为未将TMV溶液稀释至合适的浓度时，UV-C辐射不能有效地将样品中的每种病毒消毒。因此，TMV溶液必须适当稀释，以允许UV-C辐射与每种病毒相互作用并有效地将其灭活。
如图21所示，在烟草(Nicotiana tabacum)植物上测试了各种量的UV-C辐射(能量密度在300J/m2和2400J/m2之间)以评估感染性。如图21所示，在2400J/m2的UV-C能量剂量后，病灶减少至零，因此表明病毒已成功灭活。此外，还测试了高得多的水平的能量剂量，并且确定在4800J/m2至5142J/m2范围内的能量密度下也成功地将TMV NtK灭活。
根据多个实施方式和替代方案，(在纯化之后但在偶联之前的)病毒灭活的步骤如下：
通过A260测得TMV NtK溶液稀释至小于50微克/毫升的浓度(这是通过将样品暴露于260nm波长的紫外光并测定穿过样品的光量来定量核酸的常规方法)。
以0.45微米过滤TMV溶液，以去除细菌和任何其他可能干扰紫外光视线的大物质。
通过将病毒暴露于能量密度在约2400J/m2和约5142J/m2之间的紫外光谱中的光以将TMV NtK灭活。在一些实施方式中，紫外光的能量密度在约4800J/m2和约5142J/m2之间。根据多个实施方式和替代方案，紫外光的波长为254nm。
接着，将灭活的TMV NtK准备好与重组抗原偶联。
设计这些病毒灭活步骤是为了实现商业可扩展性并符合cGMP法规。
实施例9—偶联的pH依赖性
为了评估在酸性pH下孵育病毒是否会产生高质量的偶联，使用相同批次的病毒、抗原、缓冲液和酯、而仅改变病毒的配方来进行实验。在反应1中，根据多种实施方式和替代方案，将TMV配制成1X MES偶联缓冲液，pH为5.50，浓度为3.1mg/ml。在反应2中，将TMV在磷酸盐缓冲液中浓缩至11.0mg/ml，并直接以偶联反应体积的15％添加。在这些步骤后，通过SEC监控偶联过程，其中游离TMV从零分钟(以T＝0表示)开始有序减少就表明成功的偶联。
如表7和8所示，反应1表现出成功的偶联(因为游离TMV从零分钟开始有序减少)，而反应2未成功，如剩余的游离TMV百分比所示。
表7.反应1，成功的偶联—在酸性pH中配制的TMV
Figure BDA0002941491080000281
/>
表8.反应2，不成功的偶联—在磷酸盐缓冲液中配制的TMV
Figure BDA0002941491080000291
因此，如表7所示，在酸性pH中孵育病毒会产生大于90％的偶联。如果不进行酸性pH孵育步骤，则偶联百分比仍小于50％(如表8所示)。
基于该实验，开发了偶联用的模型(如图22所示)。根据多个实施方式和替代方案，通过改善病毒与抗原结合的化学就绪性(在本文中称为“活化”、“激活”或“致活”)，纯化的病毒和纯化的抗原(在图22中以“rHA”表示)之间的偶联大大增强。在一些实施方式中，病毒活化是通过在偶联反应之前在酸性pH中配制病毒，从而使正电荷聚集在病毒表面来进行的。在一些实施方式中，活化步骤包括将病毒暴露于约5.5或更低的pH一段足以活化的时间。在一些实施方式中，这段时间约为18～72小时。根据多个实施方式和替代方案，在酸性pH下加工纯化的病毒通过使外壳蛋白赖氨酸带电来活化病毒。作为该活化步骤的结果，正电荷通过胺基团的集聚而聚集在病毒表面(如图22所示)，并且病毒准备好与重组抗原的羧基末端偶联。
根据多个实施方式和替代方案，病毒活化步骤与储存病毒时的pH通常保持在中性pH或接近中性pH的传统方法相反。如图22所示，传统方法不会使正电荷聚集在病毒表面，因此其结果是，偶联百分比仍小于50％(参见表8)。此外，常规方法使用的是磷酸盐缓冲液，其以所具有的有利的表面电荷为代价来促进溶解性。
在考察涉及TMV的成功偶联过程中观察到，通常在活化步骤中通过动态光散射(DLS)测得的病毒半径增加了至少2.75倍时才发生成功的偶联(参见表9A与表9B的对比)。通常，成功的TMV偶联(例如表9C所讨论)的特征是，DLS半径从约70nm增加到约195nm或更高，如这些表所示。
基于采用病毒活化的成功偶联，开发了将纯化的抗原与纯化的病毒偶联的平台。根据多个实施方式和替代方案，制备偶联用的纯化的抗原的步骤如下：
为了确保偶联反应的pH控制，在临近反应开始之前将纯化的抗原配制成反应缓冲液。
在偶联前，将纯化的抗原储存在中性至微碱性pH的磷酸盐缓冲盐水中。
取决于分子的性质，抗原的pH目标通常为pH 5.50～6.50。
为了促进与病毒的偶联，使用超滤将储存缓冲液替换为酸性pH下的MES/NaCl缓冲液。蛋白质浓度也增加到大于3mg/mL。
然后在抗原制备完成后的4小时内开始偶联反应，以防止蛋白质结构不稳定。
根据多个实施方式和替代方案，制备偶联用的纯化的病毒的步骤如下：
在中性pH下储存后，在偶联前在酸性pH下将病毒激活。为了成功反应，在偶联反应开始之前的最少约18小时～最多约72小时，将病毒从pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成pH5.50的乙酸盐缓冲液。在一些实施方式中，在偶联反应开始之前的最少约18小时～最多72小时，将病毒从pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成pH 4.50的乙酸盐缓冲液。观察到病毒在酸性pH下储存超过72小时会在病毒之间产生自缔合，从而导致病毒不溶并抑制偶联效率。
表9A和9B还利用通过DLS测得的病毒半径(此时为TMV)的增加证明了活化步骤。具体而言，表9A提供了在活化之后并在成功偶联之前TMV的DLS半径增加的数据，其中抗原列在右侧列中。“半径增加的因数”是将活化后的TMV半径除以中性pH下的典型TMV半径(约70nm)。相反，表9B提供了在活化步骤开始之后、在不成功的偶联尝试之前的TMV的DLS半径增加的数据，其中抗原列在右侧列中。表9A和9B中，左列代表在中性pH和常规储存条件下，即在任何活化发生之前，TMV杆的标准半径。
表9A.(在成功偶联之前)通过DLS测得的游离TMV半径
Figure BDA0002941491080000311
/>
Figure BDA0002941491080000321
表9A.(在成功偶联之前)通过DLS测得的游离TMV半径
Figure BDA0002941491080000322
在这些准备步骤之后，将抗原和病毒反应物混合，并使用DLS和SDS-PAGE方法监测偶联进程。表9C显示在用酸性pH活化病毒之后，使用DLS的偶联反应的平均分子半径随时间的变化。如表9C所示，分子半径是用抗原分子成功包被病毒杆的一个指标。
表9C.TMV NtK SEC和DLS历程
Figure BDA0002941491080000331
进而，图23显示根据多个实施方式和替代方案的，对活化的TMV NtK和纯化的抗原之间的偶联的基于SDS-PAGE的分析。如图23所示，游离TMV NtK和游离抗原随时间有序地减少，以及出现>200kDA的蛋白质条带，表明成功的偶联。
实施例10—不同比例的纯化的病毒和纯化的抗原进行偶联的TEM成像纯化的病毒和纯化的抗原之间所需的偶联反应由下式表示：
病毒+抗原→病毒-抗原 (式1)
然而，众所周知，抗原容易自偶联，可能无法获得所需的反应，如下式所示：
病毒+抗原→病毒-抗原+抗原-抗原 (式2)
纯化的抗原的自偶联对于疫苗的成功开发而言是一个问题，因为在尺寸色谱步骤中不会去除抗原-抗原偶联物，其结果是免疫应答减至最小或减弱。
为了解决该自偶联问题，进行了各种实验以确定如何消耗未反应的抗原和抗原偶联物。首先，通过将抗原暴露于抑制自偶联的试剂来封闭抗原。尽管预期这种传统方法会成功，但该方法因为反应发生得太快而失败了。
接着，调节病毒和抗原的比例，以确定合适的偶联比例。如表10和11以及图24～30所示，通过负染色透射电子显微镜(TEM)成像分析了7个不同的样品。样品1～3是对照组，样品4～7含有不同比例的血凝素(HA)和TMV(在偶联平台的混合步骤中，如表3的操作步骤5所示)。
表10.TEM成像样品—对照组
Figure BDA0002941491080000341
表11.TEM成像样品—偶联物
Figure BDA0002941491080000342
图24是样品1(游离HA，批次19UL-SG-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图24中，该样品含有小球形箭头(由箭头A指示)和细长颗粒(由箭头B指示)，尺寸在约5nm至约9nm的范围内。这些颗粒的外观显示出与HA的有序聚集相一致的规则结构，并且与天然三聚体构型保持一致。此外，颗粒分散良好，只有极少的结块。
图25是样品2(单独的TMV NtK，批次18HA-NTK-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图25中，观察到杆状颗粒(箭头A)，尺寸在长约125nm至约700nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内。这些尺寸与TMV颗粒的尺寸和形状相一致。此外，在杆中观察到约4nm的中心通道(箭头B)，这是TMV的已知特征。多个杆经常平行于其长轴对齐，并且杆的表面通常是光滑的。在少数情况下，观察到约8nm至约10nm的小球形颗粒(箭头C)，其既与杆的表面结合，又与背景中的杆状颗粒不结合。这些球形颗粒(箭头C)不像单个HA三聚体。
图26是样品3(添加有TMV NtK的HA：HA自偶联物，批次19UL-SG-004)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图26中，观察到杆状颗粒，其长度在约25nm至约885nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有一个约4nm的中心内部通道(箭头B)。这些杆要么根本不装饰，要么稀疏地装饰着各种尺寸和形状的小蛋白质颗粒(箭头C)。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。图26显示较大的HA颗粒团块，但TMV看起来与预期的未偶联的TMV相同(如图25所示)。
图27是样品4(TMV：HA为1：1的比例，批次18TAP-SG-002)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图27中，观察到杆状颗粒，其尺寸在长约50nm至大于约1000nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。颗粒杆的尺寸和形状与图28中观察到的偶联TMV类似，不同之处在于，大多数杆的表面都以较小的蛋白质密度被重度装饰(箭头C)。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。图27所示的样品5看起来优于其他TEM图像，这很可能是由于偶联前的病毒处理的差异。对于该批次，在pH 5.50配制病毒，然后在15分钟内将pH降至4.50，并在偶联反应开始时恢复至pH5.50。对于图28～30所示的批次，将病毒直接配制成pH 4.50并在偶联前保持过夜。
图28是样品5(TMV：HA为1：1的比例，批次19UL-SG-001)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图28中，可见许多杆状颗粒，其长度在约65nm至约720nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有一个约4nm的中心内部通道(箭头B)。颗粒杆的尺寸和形状与图25中观察到的游离TMV NtK(样品2)类似。然而，与图25所示的未偶联的病毒相反，在图28中观察到的颗粒杆以适度的蛋白质密度被装饰(箭头C)。这些密度在形状和尺寸上是不规则的，并且似乎与杆的表面随机结合，没有明显的图案。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图29是样品6(TMV：HA为4：1的比例，批次19UL-SG-002)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图29中，观察到杆状颗粒，其长度在约25nm至大于约1000nm的范围内，宽度在约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。在图29中观察到的颗粒杆的尺寸与先前的偶联样品类似，但是小蛋白质密度(箭头C)的表面装饰水平介于中等到稀疏之间。在背景中也可见一些小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图30是样品7(TMV：HA为16：1的比例，批次19UL-SG-003)的TEM图像，放大倍数为52,000x，比例尺为200nm。图30中，观察到杆状颗粒，其尺寸在长约30nm至大于约1000nm、宽约18nm至约20.5nm的范围内(箭头A)，并且有约4nm的中心内部通道(箭头B)。图30中观察到的颗粒杆的整体形态与先前的偶联样品类似。但是，这些杆仅稀疏地装饰着蛋白质(箭头C)，或者根本不装饰。在背景中仅可见少量的小蛋白质颗粒，与杆不结合(箭头D)。
图24～30显示，1：1的比例显示出充分的杆装饰，4：1的比例显示出适度的装饰，而16：1的比例显示出稀疏的装饰。换言之，1：1的比例产生的病毒杆具有HA抗原的重度抗原装饰(即密度更高)，而16：1的比例产生的病毒杆在每个杆上具有HA抗原的较少的抗原装饰(即密度更低)。作为偶联反应的副产物，主要在1：1比例的反应中观察到HA-HA自偶联物。此外，与1：1反应相比，在TEM图像和SDS-PAGE反应分析(数据未示出)中，4：1反应中的游离HA或HA-HA偶联物似乎较少，而16：1反应中的游离HA或HA-HA偶联物更加少。换言之，在16：1的比例下，HA仅与TMV杆偶联的效率整体上更高，但与1：1反应相比，每个杆的HA密度更低。
实施例11—不同偶联条件下的沉降速度分析
在分析型超速离心机(“AUC”)中测得的沉降速度(“SV”)是获取有关蛋白质异质性和聚集的缔合状态的信息的理想方法。具体而言，可以基于不同的沉降系数来检测聚集物或不同的低聚物。该方法还检测低于1重量％水平的聚集物或其他次要成分。此外，SV对物质的相对量进行高质量定量，并为任何聚集物提供准确的沉降系数。
为了测定自偶联和未反应的HA的量，以及不同偶联条件下的TMV NtK上HA的占位量，用SV-AUC测定与游离抗原、游离病毒和各种TMV：HA比例的沉降有关的总信号。表12中提供了以下实例和描述：
表12.SV-AUC用样品和说明
样品 说明 批次 浓度
1 单独的HA 19S-G-001 1.01mg/ml
2 单独的TMV Ntk 18HA-NTK-001 0.54mg/ml
3 TMV:HA＝1:1 19UL-SG-004 1.0mg/ml
4 TMV:HA＝1:1 18TAP-SG-002 1.0mg/ml
5 TMV:HA＝1:1 19UL-SG-001 0.8mg/ml
6 TMV:HA＝4:1 19UL-SG-002 1.0mg/ml
7 TMV:HA＝16:1 19UL-SG-003 1.0mg/ml
将这些储液冷运输(未冷冻)，然后在2～8℃下储存，直到进行分析。使用来自康宁公司(Corning)的1X PBS来进行样品稀释并用作空白参比。使用1X PBS将样品1以1：1稀释，将样品2～7以1：3稀释，以产生沉降速度样品。进行这些稀释以使样品的总吸光度在吸光度检测系统的线性范围内。
方法—将稀释后的样品上样到具有12mm光程的双通道木炭制epon中心部件的皿中。将1X PBS上样到每个皿的参比通道中。将上样后的皿置于分析转子中，加载至分析型超速离心机中，并使其达到20℃。然后使转子达到3000rpm，并扫描样品(在280nm处)以确认合适的皿载量。对于样品2～7，使转子达到9,000rpm的最终运行速度。尽可能快地(每3分钟)以该转子速度记录扫描约11小时(每个样品250次总扫描)。对于样品1(游离HA)，使转子达到35,000rpm，每4分钟记录一次扫描，持续5.3小时。然后使用Schuck,P.(2000),“通过沉降速度超速离心和Lamm方程模型进行大分子的尺寸分布分析”,Biophys.J.78,1606-1619中所述的c(s)方法分析数据。使用该方法，直接拟合原始扫描以得出沉降系数的分布，并同时针对扩散对数据的影响进行建模以提高分辨率。
结果与讨论—样品1～7的高分辨率沉降系数分布如图31～37所示。在这些图中，纵轴表示浓度，横轴表示基于沉降系数的区分。通过将曲线下总面积设置为1.0(100％)来将每个分布标准化，以确保每个峰下的面积提供该物种的分数。因为样品2～7所含的物质进行沉降的沉降系数范围很广，所以数据分析被推进到覆盖速度快至2000个Svedburg单位(S)的物种沉降，因此横轴为对数标度。为了补偿对数标度会扭曲峰的可观测面积的影响，纵轴已乘以沉降系数，从而准确地标度相对峰面积。样品1(游离HA)的数据是用常用的线性沉降系数标度表示的。
图31是样品1(单独的HA，批次19S-G-001)的标准化沉降系数分布。由于游离抗原的尺寸比病毒小得多，因此以比样品2～7(9,000RPM)快得多的转子速度(35,000rpm)分析该样品，以便充分表征尺寸分布。如图31所示，样品1略显均质，在8.967S处提供73.7％的主峰。这是仅有HA抗原的样品的预期结果。该沉降系数以及主边界的宽度意味着，该主峰物质的摩尔质量为约222kDa，这可能表明该主峰大致对应于预期的约70kDa单体的HA三聚体。该沉降系数在物理上不可能对应于单体，相反，主峰对应于比单体更大的低聚态。如下表13所示，HA3新加坡发布时的SEC HPLC数据中，在三聚体状态下鉴定出>90％的HA，分析的4个样品中有3个的三聚化程度大于50％。
表13.三聚化程度
Figure BDA0002941491080000381
同样如图31所示，检测到七个比主峰更快沉降的次要峰，它们总共占总沉降吸光度的6.2％。推测这两个峰代表产物聚集物，而不是高分子量杂质。12.4S(4.25％)处的主要聚集物物质的沉降比单体快1.4倍，该比例落在通常在二聚体中可见的1.4～1.5的范围内。尽管该比例表明该物质是主峰物质的二聚体(可能是约70kDa单体的六聚体)，但其沉降系数也可能表明它是主峰物质的高度扩展或部分未折叠的三聚体(可能是约70kDa单体的九聚体)。
图31中，15.3S(0.96％)处的下一个峰的沉降比单体快1.7倍，这表明主峰物质的三聚体。对于大于30.9S的任何沉降系数均未检测到吸光度。另外，在2.8S(2.81％)、4.5S(12.44％)和6.0S(4.94％)处也检测到三个比主峰沉降更慢的次要峰。在这些次要峰中，4.5S处的峰最有可能对应于抗原单体。
图32是样品2(游离TMV NtK，批次18HA-NTK-001)的标准化沉降系数分布。如图32所示，在约60S之下未检测到沉降物质。该样品看起来相当异质，在229S(30.9％)处有丰度最高的峰沉降。在191S(28.7％)处检测到丰度第二高的峰。不清楚哪个峰对应于完全组装的病毒。此外，观察到总信号的25.3％从229S沉降到2,000S，这是本实施例11中允许的最大沉降系数。不清楚从约60S到2000S的部分可分辨的峰代表什么。
图33～37显示病毒-抗原偶联物的标准化沉降系数分布。这些图的每一个都显示出约0.15OD的显著吸光度，而没有沉降。这是通过在每次运行完成后将转子速度提高到35,000RPM，以便将所有剩余的物质都颗粒化而成立的。在游离抗原或游离TMV NtK样品中均未观察到该物质。然而，因为该物质不沉降，所以其不会影响测得的尺寸分布的结果。
图33是样品3(TMV和HA的比例为1：1，批次19UL-SG-004)的标准化沉降系数分布。如图33所示，沉降系数的结果在约40S～2000S的范围内，与对于游离病毒观察到的结果类似(如图33所示)。在沉降系数1～40S的范围内还观察到三个峰：9.9S(28.3％)，18.7S(7.8％)和34.5S(1.0％)。在9.9S处观察到的峰可能对应于在游离HA样品中观察到的主峰(如图32所示)。各种较小的峰可能反映了HA-HA自偶联事件。
图34是样品4(TMV和HA的比例为1：1，批次18TAP-SG-002)的标准化沉降系数分布；并且图35是样品5(TMV和HA的比例为1：1，批次19UL-SG-001)的标准化沉降系数分布。图34和35所示的结果与针对样品3所讨论(并且在图33中示出)的那些类似。然而，观察到一些明显的差异。首先，由于在该转子转速下分辨率较差，因此很难评论观察到的游离抗原样品(1～40S)的差异。尽管如此，图34和35显示出比样品3更多的存在于40S～2,000S(表示病毒结合物质)的总信号量。
图36是样品6(TMV和HA的比例为4：1，批次19UL-SG-002)的标准化沉降系数分布；并且图37是样品7(TMV和HA的比例为16：1，批次19UL-SG-003)的标准化沉降系数分布。图36显示出91.1％的总病毒结合物质(即病毒-抗原偶联物)，图37显示出99.4％的病毒结合物质(即病毒-抗原偶联物)。
如图33～37所示的病毒-抗原标准化沉降系数分布的结果列于表14。如前所述，根据多个实施方式和替代方案，介于1～40S之间的分数表示HA单体/三聚体的百分比，而介于40～2000S之间的分数表示TMV NtK-HA偶联物的百分比。
表14.不同的病毒-抗原偶联物的SV-AUC结果
Figure BDA0002941491080000401
表14中的结果表明，与4：1和16：1的比例相比，1：1的比例具有更多的HA和HA自偶联的产物。此外，增加TMV：HA比例会导致HA产物几乎完全参与到TMV偶联事件中(在样品7中接近100％偶联)。
根据多个实施方式和替代方案，通过将TMV NtK和HA的比例从1：1增加到16：1来减少偶联反应中的HA量，其结果是：(1)如实施例10和图24～30所观察到的，HA抗原在各TMV杆上的聚集减少；(2)如图31～37和表14所示，自偶联和未反应HA事件的量减少到几乎为零；以及(3)如图31～37和表14所示，与自偶联和未反应HA事件相比，HA与TMV的结合增加(以百分比表示)。
实施例12—小鼠中的免疫应答
为了确定给予本发明的病毒-抗原偶联物后的免疫应答，通过肌内注射向小鼠给予偶联物作为疫苗。每种疫苗都是如本文所述以1：1(TMV：HA)比例产生的TMV：HA偶联物，在研究的第0天和第14天对大多数动物给药(对照动物给予单独的缓冲液、单独的TMV或单独的HA)。给予疫苗的那些小鼠接受了15、7.5或3.75mcg(微克)的抗原，如下表15所示。一个组在第7天采样，另一个组在第14和21天采样，第三组在第28、42和90天采样，然后对样品进行血凝抑制(HAI)试验。
根据该试验，在第7天或第14天，没有任何动物对任何疫苗产生可测量的应答。然而，在第21天在一些动物中看到了最初的应答。具体而言，27只动物中有10只对H1N1疫苗(甲型流感/密歇根州/45/2015(H1N1pdm09))显示出低水平的应答(其中只有1只>80HAI滴度)。同样，27只动物中有22只对H3N2疫苗(甲型流感/新加坡/INFIMH-16-0019/2016)显示出低水平的应答(其中只有2只>80)。在第28天，该组中对H1N1疫苗作出可测量的应答的动物数量为8/29，其中一只动物为80HAI滴度，其他所有动物都更少。对于H3N2疫苗，作出可测量的应答的数量为14/29，其中一只动物为80HAI滴度，其他所有动物都更少。
从第42天和第90天采集的血液样品中观察到最明显的结果，这些结果示于下表15中。在该表中，提供了动物响应的平均值和分数(Fr.Resp.)的标准误差(SEM)。将注意到，在每个组中，一些小鼠接受了针对乙型流感病毒(分别为B/科罗拉多州/06/2017(V)和B/普吉岛/3073/2013(Y))的疫苗。正如预期的那样，在这些动物中在任何一天都没有检测到应答，因为已知乙型流感病毒和相应的HA免疫原不会以像甲型HA免疫原那样的效率和有效性在小鼠中产生HAI滴度。
表15.基于剂量和疫苗接种后时间的免疫应答
Figure BDA0002941491080000421
与先前描述的免疫应答研究分开进行，并且为了以合适的病毒和抗原的比例进一步评估本发明的系统，以各种TMV：HA偶联物比例(即1：1、4：1、16：1)接种甲型流感病毒和乙型流感病毒的疫苗以及如下所述的对照后，评估小鼠中的体液免疫应答。以这种方式，研究了各种偶联比例及其对免疫应答的影响。在研究的第0天和第14天，在背部皮下区域通过注射向接受疫苗接种的小鼠给予15mcg HA。然后分析对疫苗接种的血清抗体反应的HA特异性活性。表15(H3流感病毒用作捕获蛋白)和16(重组H3蛋白用作捕获蛋白)显示小鼠的分组(每组12只小鼠)和所给予的药剂，每张表的右列所示为ELISA抗体(Ab)滴度的结果。
表16.TMV：HA比例研究—甲型流感HA。
Figure BDA0002941491080000431
图38是与表16有关的散点图，其提供了以0、1：1、4：1和16：1(TMV：HA)的比例给予疫苗后的H3：HA Ab滴度的图解分析。图39还图解显示使用重组H3抗原(表17)作为包被或使用捕获H3病毒作为捕获蛋白(表17)(其与抗甲型流感H3抗原抗体结合)的，抗原相关Ab滴度的几何平均数检验的结果。就密度(被HA占据的TMV表面积)而言，这三种比例的趋势以1：1(密度最高)>4：1>16：1(密度最低)发展，正如TEM和AUC分析所证明的。在这些代表用H3抗原获得的ELISA结果的图中，用最低密度的偶联物观察到最高的免疫应答。即，免疫应答的趋势为16：1>4：1>1：1，与密度的趋势相反。因此，令人惊讶地发现在TMV∶HA的这些比例下，更低的偶联密度倾向于提供更好的免疫应答。对于抗原性与最大的HA偶联事件不相关这一令人惊讶的发现，可能的解释包括：(1)当密度相对较低时，抗原更均匀，具有较少的未反应或自偶联的蛋白质；(2)可以更高效地加工偶联的抗原，并更多地保留/统一抗原构象；和(3)TMV杆(举例来说)可以刺激更多的抗原递呈细胞迁移到注射部位并刺激附着的抗原的加工；或这些因素的一些组合。然而应注意，仅TMV颗粒的存在并不能代替偶联的需要(参见例如表14和15)。
除甲型流感H3抗原外，还使用重组乙型流感普吉岛抗原及其相应抗体的结合倾向性对乙型流感抗原(B-普吉岛HA)进行了研究。下表17所示为本研究部分的结果，即：根据平均ELISA Ab滴度的结果，没有那么清晰地显示出16：1>4：1>1：1。
表17.TMV：HA比例研究—乙型流感HA.
Figure BDA0002941491080000441
即便如此，16：1的比例仍显示出最高的平均抗体滴度。因此，发明人相信可以合理地预测，相同的密度和免疫应答之间的关系也适用于乙型流感抗原(B-普吉岛HA)的研究。即，与H3抗原的结果一样，对于偶联物的密度较小的形式，免疫应答将更高。此外，有理由相信，4：1比例的偶联反应没有像其他比例的反应那样进行，这是因为偶联过程中可能出现异常，并且没有对该样品进行电子显微镜分析和超速离心分析。无论如何，这里的数据都显示所有三种比例下的免疫应答。在多种比例下实现了免疫应答这一事实强调，该系统的稳健性不依赖于任何一种特定比例。如与特定TMV偶联的疫苗所见，这种灵活性可能进一步表明，当除这些研究中包括的H3和H1抗原以外的其他抗原与TMV偶联时，以及当使用除TMV以外的其他病毒运载体作为运载体时，该系统都能很好地工作。
就临床实用性而言，根据本文所述的多个实施方式和替代方案中的任一种进行偶联的产物可以通过经由纯化的病毒递送纯化的抗原而用作疫苗，例如但不限于实施例7、9、10、11和12中所述的病毒-抗原偶联物。再者，本公开的实施方式包括以任何数量形式(例如小瓶)包装的、具有合适的缓冲液和添加剂的任何疫苗产品，其由任何病毒-蛋白质偶联物组合物制造，为此提供其偶联。在这方面，实施方式包括其中这样的疫苗产品适合于以提供给人或动物患者的单位剂量形式递送的那些实施方式，例如但不限于通过注射器或喷雾剂通过包括但不限于以下途径给药：皮下给药，肌内给药，皮内给药和经鼻给药，以及经口和/或局部口服给药，达到临床上指示的程度。作为非限制性实例，并且在不损害本文的实施方式的广度和范围的情况下，TMV的尺寸(通常为18nm x 300nm)及其杆状形状促进抗原递呈细胞(APC)的抗原摄取，并因此增强T细胞(例如Th1和Th2)的免疫力，并为表面偶联的亚基蛋白提供佐剂活性。通过病毒RNA/TLR7相互作用也可刺激这种活性。其结果是，疫苗摄入的综合效果直接刺激APC的活化。通过皮下和鼻内递送，体液免疫通常在IgG1和IgG2亚类之间达到平衡。粘膜疫苗递送后，应答还包括大量的全身性和粘膜IgA。细胞免疫也非常强大，可诱导抗原特异性分泌，类似于活病毒感染的应答。完整抗原融合物可用于天然细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位加工，而无需考虑人白细胞抗原(HLA)变异。
与根据当前实施方式的多重纯化平台有关的广泛的(体液和细胞的)且(幅度和有效性)有所增强的免疫应答与没有TMV偶联的被测试的亚基蛋白质形成鲜明的对比，后者几乎或完全不诱导细胞免疫或体液免疫。这些免疫应答的影响是，根据当前实施方式，经由多重平台产生的疫苗促进了单剂疫苗的高保护性应答，并提供了其他常规疫苗平台所无法提供的速度和安全性。的确，偶联平台已显示可在多种病毒和蛋白质(包括抗原)上工作，以大范围内的比例组合，并且以各种剂量成功给药，这再次表明该系统的稳健性。当前实施方式中用于产生疫苗的多重平台的其他优点包括：是一种积极主动的抗原刺激方法，用于针对病原体的侵袭进行全身性免疫保护，该平台非常适合于从疾病病原体(包括病毒糖蛋白或非分泌性病原体抗原)产生抗原性结构域，并且该平台可充当病毒和细菌病原体的有效疫苗平台。
除了关于疫苗应用的优点之外，可以将通过根据当前实施方式的多重平台纯化的植物病毒颗粒配制用于各种药物递送目的。这些不同的目的可以包括：1)免疫治疗—通过将治疗性抗体与病毒颗粒表面偶联并将其递送以增强细胞毒性效果；2)基因治疗—通过加载用于导入特定细胞类型以进行基因修饰的特定核酸；以及3)药物递送—通过将化疗剂加载到病毒颗粒中以进行靶向肿瘤递送。
作为本文讨论的方法的许多优点的简要示例，根据多个实施方式的多重平台可通过首先通过将纯化的病毒暴露于如上所述的pH变化而使其溶胀来用作药物递送工具。随后，将在这种条件下的病毒与浓缩的化疗剂(例如阿霉素)溶液一起孵育，然后将pH恢复到中性，从而使病毒恢复到其溶胀前状态，从而包埋化疗分子。接着，可通过选自包括但不限于用于靶向治疗肿瘤的注射的递送机制将病毒颗粒递送至生物体。
此外，本文包含的实施方式包括其中通过离子交换色谱法或其他化学分离步骤从蛋白质或抗原中分离宿主细胞污染物的那些实施方式，并且没有一种分离方法与任何一种蛋白质、抗原或病毒特异性结合。本文关于方法和组合物的实施方式均包括其中病毒选自下组的那些实施方式：红三叶草花叶病毒、鸭跖草黄斑驳病毒、花椰菜花叶病毒、大豆褪绿斑驳病毒、木薯叶脉花叶病毒、水稻东格鲁杆状病毒、碧冬茄脉明病毒、玉米线条病毒、甜菜曲顶病毒、菜豆金色花叶病毒、苜蓿花叶病毒、烟草线条病毒、雀麦花叶病毒、黄瓜花叶病毒、甜菜黄化病毒、莴苣传染性枯黄病毒、豇豆花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒1、烟草环斑病毒、马铃薯Y病毒、黑麦草花叶病毒、大麦黄花叶病毒、欧防风黄点病毒、水稻东格鲁球状病毒、香石竹斑驳病毒、香石竹环斑病毒、玉米褪绿斑驳病毒、烟草坏死病毒、番茄丛矮病毒、苹果茎沟病毒、香石竹潜隐病毒、豌豆耳突花叶病毒、小麦土传花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、悬钩子丛矮病毒、大麦黄矮病毒、玉米雷亚朵非纳病毒、马铃薯X病毒、三叶草花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、苹果褪绿叶斑病毒、芜菁黄花叶病毒、胡萝卜斑驳病毒。
在一些实施方式中，例如在病毒是具有半径的TMV的实施方式中，蛋白质可以是抗原(包括但不限于HA)，并且在活化步骤中，在TMV半径增加了至少2.75倍之后，进行将病毒和抗原混合的步骤。或者但同样不限于，在活化步骤中，在TMV半径增加到至少约195nm之后，进行将病毒和抗原混合的步骤。简而言之，出于方法、组合物和疫苗产品的目的，任何和所有可行的组合、变化和替代方案都包含在本公开内。
因此，以上说明提供了多个实施方式和多种替代方法，用于：(i)基于植物的病毒制造和纯化；(ii)基于植物的抗原制造和纯化；(iii)在植物外形成作为疫苗和抗原运载体具有治疗益处的病毒-抗原偶联物；以及(iv)递送包含纯化的病毒和纯化的抗原的治疗性疫苗。
应理解，本文描述的实施方式在其应用中不限于文中所阐述的教导和描述的细节、或者如附图所示的细节。相反，应理解，本文所描述和要求保护的当前实施方式和替代方案能够以各种方式来实施或执行。还应理解，本文所用的词汇和术语是为了是说明性目的而不应被认为是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、“例如”、“含有”或“具有”及这些词汇的变化表示涵盖其后列出的项目及其等同物以及额外的项目。
因此，对几个实施方式和替代方案的前述描述旨在说明而不是限制本公开内容的范围。本文中的描述并非旨在穷举，也不旨在将对实施方式的理解限制在所公开的精确形式。本领域普通技术人员应理解，根据以上教导和描述，这些实施方式的修改和变化是合理可能的。

Claims (15)

1.一种将蛋白质和病毒偶联的方法，包括：通过将病毒置于pH为4.5～5.5的环境中来活化病毒，其中，化学修饰病毒上的表面暴露的赖氨酸残基，以促进蛋白质的胺靶向偶联；和在活化步骤之后，在偶联反应中将病毒和蛋白质混合，形成偶联物混合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，病毒活化步骤在缓冲液中进行18小时～72小时的时间段。
3.如权利要求1所述的方法，其中，蛋白质是抗原，并且所述方法还包括：在混合步骤之前，通过纯化抗原并将抗原暴露于5.50～6.50的pH的子步骤来制备抗原。
4.如权利要求3所述的方法，还包括：从源抗原中收获抗原，其中纯化抗原包括从抗原中去除细胞碎片，浓缩抗原，进行至少一种化学分离以从抗原中分离宿主细胞污染物，对抗原进行亲和色谱以洗脱抗原，并基于作为截留物的杂质与作为渗透物的抗原之间的尺寸差异，对抗原进行多峰色谱，以从抗原中分离残留的杂质。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，还包括：使病毒穿过包含多孔滤器的切向流过滤装置以纯化病毒，并使至少一种病毒穿过包含多孔膜的膜过滤装置以浓缩病毒。
6.如权利要求1或3所述的方法，其中，蛋白质是包含流感血凝素抗原（HA）的抗原，并且病毒是烟草花叶病毒（TMV）。
7.如权利要求6所述的方法，其中，TMV和HA以至少4：1的比例混合。
8.如权利要求6所述的方法，其中，TMV和HA以1：1～4：1的比例混合。
9.如权利要求1～3中任一项所述的方法，还包括：使用至少一种含游离胺的液体淬灭偶联反应。
10.如权利要求9所述的方法，还包括：在淬灭步骤之后，基于作为截留物的杂质与作为渗透物的偶联物混合物之间的尺寸差异，从偶联物混合物中分离残留的杂质。
11.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，偶联反应使未偶联的天然分子量的病毒外壳蛋白减少至少50％。
12.如权利要求1、7、8中任一项所述的方法，其中，病毒是TMV，并且TMV具有半径，并且在活化步骤中，在TMV半径增加了至少2.75倍之后，进行将病毒和蛋白质混合的步骤。
13.如权利要求1、7、8中任一项所述的方法，其中，病毒是TMV，并且TMV具有半径，并且在活化步骤中，在TMV半径增加到至少195 nm之后，进行将病毒和蛋白质混合的步骤。
14.一种包含病毒-抗原偶联物的组合物，其通过权利要求1～13中任一项所述的方法制得，其中，抗原包含流感血凝素抗原（HA），所述HA与病毒上的表面暴露的赖氨酸残基化学结合，并且至少50％的所述HA呈三聚体形式。
15.如权利要求14所述的组合物，其中，病毒是烟草花叶病毒（TMV）。
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