BR112020025250A2 - Purificação e conjugação de vírus e antígeno - Google Patents

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BR112020025250A2
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Hugh A. Haydon
Carrie A. Simpson
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Abstract

“purificação e conjugação de vírus e antígeno”. são divulgados nesse documento métodos e composições exemplificativos associados às purificação de vírus, purificação de antígeno e conjugação de vírus e proteínas (por exemplo, antígeno) para formar vacinas para dispensação de agentes imunológicos e outros agentes terapêuticos, aspectos exemplificativos dos quais podem incluir a colheita de substâncias virais e antigênicas de organismos de origem; uma plataforma de purificação que compreende separação química e separação por diferença de tamanho para a remoção de contaminantes, detritos e impurezas das substâncias virais e proteicas (por exemplo, antigênicas, incluindo antígenos de hemaglutinina da influenza), bem como sua concentração e coleta; e uma plataforma de conjugação que fornece ativação do vírus a um ph que aumenta a taxa de ligação e a propensão de ligação entre o vírus e a proteína, em que modalidades relacionadas à plataforma de conjugação incluem o controle da razão de vírus para proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PURIFICAÇÃO E CONJUGAÇÃO DE VÍRUS E ANTÍGENO”
PEDIDO DE PATENTE NÃO PROVISÓRIO DOS ESTADOS UNIDOS REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Esse pedido de patente internacional reivindica o benefício e a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. número de série 62/683.865, com data de depósito de 12 de junho de 2018, cujo conteúdo está totalmente incorporado nesse documento por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] As formas de realização descritas nesse documento incluem o uso de um processo de multiconjuntos para a produção de vírus recombinantes altamente purificados como portadores de antígeno, e ainda outras várias formas de realização se referem à produção de vacina usando um vírus purificado e um antígeno purificado.
ANTECEDENTES
[003] Os vírus têm uma molécula de ácido nucleico em um revestimento de proteína e se replicam apenas dentro das células vivas de outros organismos. Muitas vezes considerados prejudiciais, uma ampla faixa de vírus é capaz de infectar todos os tipos de formas de vida, tais como, humanos, animais domésticos e plantas. Ainda do lado positivo, há um interesse crescente em usar vírus para uma variedade de finalidades terapêuticas, incluindo, sem limitação, a criação de vacinas, terapia genética e tratamentos de câncer, para citar alguns. No entanto, para estudar vírus, compreender sua estrutura e adaptar os vírus para ferramentas moleculares e para vetores e carreadores de terapia de doenças, os vírus primeiro devem ser purificados para remover quaisquer resíduos celulares, fibras macromoleculares, organelas, lipídios e outras impurezas que possam interferir com a função pretendida do vírus.
[004] Uma vez purificados, os vírus são adequados para uma série de usos. Um que é relevante para a divulgação atual é a noção tradicional de usar o vírus (considerado um patógeno nesse contexto) para estudo e desenvolvimento de estratégias genéticas contra vírus. Mas discutido mais detalhadamente na presente divulgação é o uso de vírus purificados como carreadores de antígeno para preparar uma vacina. Antígenos são moléculas que, quando apropriadamente dispensados a um organismo, são capazes de produzir uma resposta imunológica naquele organismo, ao estimular a produção de anticorpos por meio da ligação com um anticorpo dentro do organismo que corresponda à estrutura molecular do antígeno. Os antígenos recombinantes são produzidos a partir de DNA recombinante, que por meio de técnicas conhecidas é clonado em vetores que são então introduzidos em células hospedeiras específicas, tais como, bactérias, células de mamíferos, células de levedura e células vegetais, para citar alguns. O antígeno recombinante é então expressado usando o aparelho de tradução da célula hospedeira. Após a expressão, o antígeno recombinante pode ser colhido e afixado a um vírus por meio de ligações covalentes, por meio de um processo conhecido como conjugação. Após a conjugação do antígeno ao vírus, o vírus pode servir como um carreador para dispensar o antígeno a um organismo e ativar a resposta do sistema imunológico. Dessa forma, um conjugado de vírus-antígeno pode fornecer um uso terapêutico. A conjugação adequada de vírus-antígeno é necessária para que o antígeno ative uma resposta imunológica que produz anticorpos nas células hospedeiras de um organismo de origem. A purificação do vírus e do antígeno promove essa conjugação adequada.
[005] Os métodos atuais para purificar vírus geralmente são limitados para uso em pequenas quantidades bioquímicas, por exemplo, na ordem de nanogramas a miligramas, e não foram comprovados em quantidades industriais, que estão na ordem de gramas a quilogramas. Por exemplo, um método usado anteriormente, conhecido como “Lisado de células infectadas bruto”, utiliza lisados de células brutos ou meios de cultura de células de células infectadas por vírus. As células de mamíferos infectadas são lisadas por congelamento-descongelamento ou por outros métodos conhecidos, os detritos são removidos por centrifugação de baixa velocidade e os sobrenadantes são então usados para experimentação. Os organismos infectados intactos são rompidos ou triturados fisicamente, e o extrato resultante é clarificado usando centrifugação ou filtração para produzir preparações de vírus brutos. No entanto, esse método sofre de alta contaminação com muitos fatores não virais que impactam a capacidade de conduzir experimentos e manipulam o vírus.
[006] Um segundo exemplo de etapas de purificação anteriores é a ultracentrifugação de alta velocidade, pela qual os vírus são peletizados, ou ainda purificados por peletização, por meio de uma solução de sacarose de baixa densidade, ou colocados em suspensão entre soluções de sacarose de várias densidades. As limitações desse método incluem a produção de vírus purificados em apenas pequenas quantidades devido ao tamanho limitado e escalabilidade das separações em alta velocidade e pureza do vírus pobre devido a proteínas hospedeiras adicionais, frequentemente copurificando com amostras de vírus.
[007] Um terceiro método usado anteriormente para aumentar a pureza do vírus é a ultracentrifugação de gradiente de densidade. Nesse método, gradientes de cloreto de césio, sacarose, iodixanol ou outras soluções são usados para a separação de partículas virais montadas ou para a remoção de partículas sem conteúdo genético. As limitações desse método incluem o tempo necessário para purificar o vírus (geralmente 2-3 dias), o número limitado de amostras, a quantidade de amostras que podem ser analisadas de cada vez (geralmente 6 por rotor) e a pequena quantidade de vírus que pode ser purificada (geralmente microgramas a miligramas do produto final).
[008] Extração orgânica e precipitação com polietilenoglicol também têm sido usadas para purificar vírus, incluindo vírus de plantas, tal como por meio da remoção de lipídios e cloroplastos. Novamente, no entanto, esses métodos conhecidos sofrem de pureza pobre, com produtos tipicamente ainda anexados a proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e açúcares do hospedeiro que resultam em agregação significativa de produtos de vírus resultantes. Essas limitações reduzem a utilidade do produto final para conformidade com as regulamentações de Boas Práticas de Fabricação Atuais (cGMP) aplicadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA.
[009] Os regulamentos de cGMP atuais promulgados pelo FDA contêm requisitos mínimos para o(a)s métodos, instalações e controles usado(a)s na(o) fabricação, processamento e acondicionamento de um produto farmacológico. Esses regulamentos têm como objetivo a segurança de um produto e garantir que ele tenha os ingredientes e a concentração que afirma ter.
Consequentemente, para que os vírus sejam utilizados na criação de vacinas, terapia genética, tratamentos de câncer e outras configurações clínicas, o produto viral final deve estar em conformidade com os regulamentos de cGMP. Se um produto viral final não estiver em conformidade com os regulamentos de cGMP, como o produto do método de precipitação com polietilenoglicol, sua utilidade para uso no ambiente clínico não existe ou é muito diminuída.
[0010] Escalabilidade se refere a um processo que produz de forma consistente e reprodutível o mesmo produto, mesmo quando a quantidade de produto aumenta, por exemplo, indo da escala de laboratório (<0,1 metros quadrados) para pelo menos sistemas > 20 metros quadrados. Os métodos usados anteriormente, como identificados acima, todos sofrem de falta de consistência, baixa escalabilidade (isto é, cria o produto apenas em quantidades bioquímicas) e uma falta de conformidade com os regulamentos de cGMP.
[0011] Em termos de produção em grande escala, a produção baseada em plantas tem atraído atenção, embora existam limitações proeminentes com seu uso. Os sistemas de produção baseados em plantas são capazes de produzir rendimentos em escala industrial a um custo muito menor do que os sistemas de produção de células animais, tal como de Ovário de Hamster Chinês (CHO). No entanto, certos métodos de purificação convencionais, que foram apropriados em alguma escala para vírus não vegetais, não funcionarão para vírus e antígenos preparados de plantas.
Essas limitações surgem devido a inúmeras diferenças na purificação de vírus de plantas, em oposição à purificação de vírus de culturas de células animais.
Enquanto as células animais produzem proteínas primárias e impurezas de ácido nucléico, as plantas também são fontes de impurezas adicionais e significativas não encontradas nas células animais.
Alguns deles incluem a composição lipídica das membranas de cloroplastos e de vacúolos, impurezas de carboidratos simples e complexos e impurezas de organelas de nanopartículas.
De fato, os extratos vegetais brutos muitas vezes incrustam o equipamento usado no processamento e na purificação da matéria viral e antigênica obtida das plantas, por exemplo,
devido ao acúmulo de impurezas nas membranas de separação do equipamento ou cama de cultivo.
Tal incrustação leva inevitavelmente à falha do fluxo de pressão, filtração pobre e, em última instância, baixo rendimento do produto.
Outro problema é que essas impurezas têm uma tendência a se agregarem e se tornarem capazes de copurificar dentro de qualquer proteína, vírus ou outro “produto” desejado de uma planta.
Consequentemente, os métodos atuais para purificar vírus não removerão adequadamente todas ou mesmo uma quantidade suficiente de impurezas, incluindo, mas não se limitando a, impurezas encontradas em extratos de plantas e que não mostraram produzir vírus purificados de maneira adequada.
[0012] Por conseguinte, há uma necessidade significativa de plataformas de purificação de vírus e antígenos consistentemente capazes de produzir vírus altamente purificados em escala comercial, isto é, gramas a quilogramas e mais, e de uma maneira que esteja em conformidade com os regulamentos de cGMP. Essas melhorias permitiriam o desenvolvimento clínico para o uso de ferramentas na criação de vacinas, terapia gênica e para tratamentos de câncer. Junto com outras características e vantagens descritas nesse documento, as plataformas descritas nesse documento de acordo com várias formas de realização e alternativas atendem a essa e outras necessidades.
SUMÁRIO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
[0013] Em algumas formas de realização de acordo com a presente divulgação, um método de purificação de vírus é direcionado a um processo de multiconjuntos que compreende a colheita de um material de vírus de organismo de origem contendo pelo menos um vírus; remoção de detritos celulares de pelo menos um vírus, clarificando assim a estrutura de pelo menos um vírus; concentração do vírus separado e clarificado que em algumas formas de realização é realizada com um dispositivo de filtração que compreende uma membrana com poros de um tamanho que não excede um limite predeterminado, como selecionado por um usuário; e processar o vírus concentrado submetendo-o a uma série de procedimentos de separação e coletar o vírus após cada procedimento de separação, em que pelo menos um procedimento de separação inclui cromatografia por troca iônica para separar contaminantes de células hospedeiras do vírus, e pelo menos um procedimento de separação inclui uma cromatografia multimodal para separar as impurezas residuais do vírus com base em pelo menos diferenças de tamanho entre o vírus e as impurezas, e a interação química que ocorre entre as impurezas e um ou mais de ligantes de cromatografia. Em algumas formas de realização, uma planta é o organismo de origem submetido à expressão recombinante de um vírus, com Nicotiana benthamiana e Lemna minor como exemplos não limitantes. Quando o organismo de origem é uma planta, a colheita pode incluir a produção de sementes e a germinação da planta com indução da expressão transiente do gene a partir de uma proteína desejada, como discutido abaixo.
Alternativamente, o organismo de origem submetido à expressão recombinante de um vírus é um hospedeiro não vegetal, tais como, sem limitação, bactérias, algas, leveduras, insetos ou organismos mamíferos.
[0014] Adicionalmente, vários aspectos de múltiplas formas de realização descritas nesse documento são direcionados à produção ou purificação, ou ambos, de um antígeno que pode ser conjugado com um vírus. Em algumas formas de realização, uma planta é o organismo de origem submetido à expressão recombinante do antígeno; alternativamente, o organismo de origem submetido à expressão recombinante de antígeno é um hospedeiro não vegetal, tais como, sem limitação, bactérias, algas, leveduras, insetos ou organismos mamíferos.
[0015] Vantajosamente, um processo de multiconjuntos praticado de acordo com várias formas de realização descritas nesse documento produz vírus altamente purificados ou antígenos recombinantes, ou ambos, em uma escala comercial.
Várias etapas são empregadas para melhorar os processos de purificação a montante, tal como enriquecimento de vírus de plantas. Algumas formas de realização utilizam cromatografia por troca iônica de tamanho, bem como outras características, para produzir vírus recombinantes purificados e antígenos recombinantes. Por conseguinte, várias formas de realização descritas nesse documento fornecem um ou mais vírus e um ou mais antígeno(s) adequados para a preparação de uma ou mais vacina(s) de vírus e antígenos conjugados.
[0016] No que se refere a vírus, por meio da prática de algumas formas de realização de uma plataforma de purificação de vírus da invenção descrita nesse documento, a purificação de vírus de plantas em forma de bastonete (tal como vírus do mosaico do tabaco, ou seja, “TMV”) e vírus de plantas icosaédrico (tal como vírus do mosaico do trevo vermelho).
De acordo com múltiplas formas de realização nesse documento, a purificação de TMV e vírus do mosaico do trevo vermelho foi alcançada, representando dois vírus estruturalmente diversos em termos de tamanho e estrutura. Por exemplo, um vírus icosaédrico menor como o vírus do mosaico do trevo vermelho tem simetria T = 3, dimensões de aproximadamente 31-34 nm, e aproximadamente 180 proteínas do capsídeo. Por outro lado, o TMV tem aproximadamente 18 nanômetros de diâmetro, 300 nm de comprimento e contém 2.160 proteínas do capsídeo. Em vista dessa diversidade, o processo da invenção funcionou com base em dois vírus estruturalmente diferentes para permitir a passagem do vírus para o permeado, enquanto retém detritos celulares indesejáveis. Em uso, os parâmetros operacionais podem ser controlados para que todos os tipos de vírus passem para o permeado, enquanto a(os) clorofila/detritos celulares é(são) retida(os) e o sistema de fluxo tangencial (TFF) continua a operar de forma eficaz sem se tornar incrustado indevidamente ou prematuramente.
Etapas adicionais de TFF são projetadas para reter vírus enquanto permitem que proteínas menores passem para o permeado, e etapas de cromatografia dupla são controladas para excluir vírus grandes e pequenos, enquanto captura proteínas da célula hospedeira, DNA da célula hospedeira, endotoxina e polifenólicos de planta.
[0017] Com base na purificação bem-sucedida do vírus do mosaico do trevo vermelho e TMV, espera-se que a plataforma de purificação do vírus de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas possa purificar com sucesso uma ampla faixa de vírus, incluindo: vírus compreendendo uma variedade de materiais genéticos (por exemplo, vírus de DNA de fita simples e fita dupla, e vírus de RNA), geometrias (por exemplo, em forma de bastonete, bastonetes flexíveis e icosaédricos) e famílias (Caulimoviridae, Geminiviridae, Bromoviridae, Closteroviridae, Comoviridae, Potyviridae, Sequiviridae, Tombusviridae).
[0018] Os vírus não limitativos sobre os quais se espera que as formas de realização descritas nesse documento tenham sucesso incluem aqueles dos gêneros Badnavirus (por exemplo, vírus commelina de mancha amarela); Caulimovirus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor); Vírus do tipo SbCMV (por exemplo, vírus da mancha clorótica da soja); Vírus do tipo CsVMV (por exemplo, vírus do mosaico da veia da mandioca); Vírus do tipo RTBV (por exemplo, vírus baciliforme do tungro do arroz); vírus tipo de palidez da veia da petúnia (por exemplo, vírus de palidez da veia da petúnia); Mastrevirus (Geminivírus subgrupo I) (por exemplo, vírus da estria do milho) e Curtovirus (Geminivírus subgrupo II) (por exemplo, vírus do topo crespo da beterraba) e Begomovirus (Geminivírus subgrupo III) (por exemplo, vírus do mosaico dourado do feijão); Alfamovirus (por exemplo, vírus do mosaico da alfafa); Ilarvirus (por exemplo, vírus da estria do tabaco); Bromovirus (por exemplo, vírus do mosaico do capim bromo); Cucumovirus (por exemplo, vírus do mosaico do pepino); Closterovirus (por exemplo, vírus do amarelo da beterraba); Crinivirus (por exemplo, vírus amarelo infeccioso da alface); Comovirus (por exemplo, vírus do mosaico do feijão-caupi); Fabavirus (por exemplo, vírus da murcha de fava 1); Nepovirus (por exemplo, vírus da mancha anelar do tabaco); Potyvirus (por exemplo, vírus da batata
Y); Rimovirus (por exemplo, vírus do mosaico do azevém);
Bymovirus (por exemplo, vírus do mosaico amarelo da cevada);
Sequivirus (por exemplo, vírus da mancha amarela da pastinaca); Waikavirus (por exemplo, vírus tungro esférico do arroz); Carmovirus (por exemplo, vírus da mancha de cravo); Dianthovirus (por exemplo, vírus dos anéis de cravo);
Machlomovirus (por exemplo, vírus da mancha clorótica do milho); Necrovirus (por exemplo, vírus da necrose do tabaco);
Tombusvirus (por exemplo, vírus do emanjericado do tomateiro); Capillovirus (por exemplo, vírus do acanalamento do tronco da maçã); Carlavirus (por exemplo, vírus latente do cravo); Enamovirus (por exemplo, vírus do mosaico da ervilha); Furovirus (por exemplo, vírus do mosaico do trigo transmitido pelo solo); Hordeivirus (por exemplo, virus do mosaico estriado da cevada); Idaeovirus (por exemplo, vírus do nanismo arbustivo da framboesa); Luteovirus (por exemplo, vírus do nanismo amarelo da cevada); Marafivírus (por exemplo, vírus do raiado fino do milho); Potexvirus (por exemplo, vírus da batata X e vírus do mosaico do trevo); Sobemovirus (por exemplo, vírus do mosaico do feijão do sul); Tenuivirus (por exemplo, vírus do estriado do arroz); Tobamovirus (por exemplo, vírus do mosaico do tabaco); Tobravirus (por exemplo, vírus do chocalho do tabaco); Trichovirus (por exemplo, vírus da mancha clorótica da folha da maçã); Tymovirus (por exemplo, vírus do mosaico amarelo do nabo); e Umbravirus (por exemplo, vírus do mosaico da cenoura).
[0019] A purificação do vírus com sucesso foi realizada em escala comercial e de uma maneira que está em conformidade com os regulamentos de cGMP. Em algumas formas de realização, o organismo de origem é uma planta, mas embora algumas variações das presentes formas de realização incluam a produção de vírus à base de plantas, as formas de realização descritas nesse documento não se limitam à fabricação ou purificação de vírus em plantas. Em algumas formas de realização, uma plataforma de purificação de vírus começa com o cultivo de plantas em uma sala de crescimento controlada, infectando as plantas com replicação de vírus, recuperando os vírus rompendo as células com um desintegrador e removendo a fibra da planta do líquido por meio de uma prensa parafuso.
[0020] Em algumas formas de realização, envolvendo vírus baseados em plantas e não vegetais, as etapas de purificação incluem a concentração do extrato clarificado usando o sistema de fluxo tangencial, em que o tamanho dos poros do cassete, a pressão transmembranar e a carga de extrato clarificado por metro quadrado de área superficial da membrana são controlados. A pressão transmembranar (TMP) é o diferencial de pressão entre os lados a montante e a jusante da membrana de separação e é calculada com base na seguinte fórmula: ((pressão de alimentação + pressão de retido)/2) - pressão de permeado. Para garantir a passagem dos vírus através da cerâmica para criar um extrato clarificado, em algumas formas de realização, cada uma da pressão de alimentação, da pressão de retido e da pressão de permeado é controlada para obter uma TMP apropriada. O extrato clarificado é concentrado adicionalmente com um volume de coluna de troca iônica e lavado com tampão de equilíbrio de cromatografia por troca iônica. Em algumas formas de realização, uma coluna de troca iônica Capto Q é equilibrada e a alimentação é carregada e coletada na fração de fluxo direto. A coluna é então lavada até a referência e os contaminantes da célula hospedeira são removidos da coluna com alto teor de sal.
[0021] Em algumas formas de realização associadas a vírus baseados em plantas, um tampão de extração é adicionado antes de remover a clorofila e outros grandes detritos celulares, tais como, fibras macromoleculares, organelas, lipídios, etc., usando filtração em cerâmica de fluxo tangencial. Em algumas formas de realização, a filtração de cerâmica promove a retenção de clorofila de hospedeiros de planta, detritos de células e outras impurezas enquanto otimiza a passagem do vírus. Seja para vírus de plantas ou não vegetais, essa abordagem - em que a matéria desejável (vírus ou antígeno) passa como permeado e impurezas são retidas como retido - promove a escalabilidade do processo.
Adicionalmente, parâmetros, tais como, pressão transmembranar, tamanho de poro de cerâmica e biomassa carregada por metro quadrado são todos controlados para garantir a passagem do vírus através da cerâmica para criar um extrato clarificado. Os sistemas de TFF de cerâmica são altamente escalonáveis e parâmetros, tais como, TMP, velocidade de fluxo cruzado, tamanho de poro e área superficial podem ser escalonados prontamente para aceitar grandes quantidades de biomassa. Módulos de cerâmica adicionais são facilmente adicionados ao sistema. A pressão de alimentação, retido e permeado também pode ser controlada para manter a velocidade de fluxo cruzado eficiente, permitindo pouca ou nenhuma obstrução do sistema. Em algumas formas de realização, a velocidade cruzada e o diferencial de pressão são definidos e controlados para produzir uma TMP de aproximadamente 10-20 psi (68,9-137,9 KPa), permitindo a passagem eficiente de vírus em escalas menores e maiores. Os sistemas de TFF de cerâmica podem usar produtos químicos de limpeza altamente eficientes, tais como, ácido nítrico, alvejante e hidróxido de sódio, permitindo que estudos de limpeza sejam realizados atendendo aos requisitos de BPF.
[0022] Seja para vírus baseados em plantas ou não vegetais, um método de purificação de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas, e de outra forma consistente com o desenvolvimento de métodos escalonáveis e de alto rendimento para purificar vírus, utiliza pelo menos um procedimento de separação usando cromatografia multimodal para separar impurezas residuais de um vírus com base em pelo menos diferenças de tamanho entre o vírus e as impurezas, e interação química que ocorre entre as impurezas e um ou mais de ligandos de cromatografia. Por exemplo, a realização de pelo menos um procedimento de separação com resina de cromatografia Capto® Core 700 (GE Healthcare Bio- Sciences) está incluída no escopo das formas de realização.
Os ‘grânulos’ Capto® Core 700 compreendem ligandos de octilamina projetados para ter propriedades hidrofóbicas e carregadas positivamente que captam moléculas sob um determinado tamanho, por exemplo, 700 quilodaltons (kDA).
Como certos vírus são bastante grandes (por exemplo, maior que 700 kDA), e os exteriores do grânulo são inativos, o Capto® Core 700 permite a purificação de vírus por exclusão de tamanho, em que a matéria desejável (vírus ou antígeno) passa como permeado, e as impurezas são retidas como retido.
[0023] Em algumas formas de realização, novamente para vírus baseados em plantas e não vegetais semelhantes, antes da coluna de cromatografia multimodal, o equilíbrio é realizado com cinco volumes de coluna de tampão de equilíbrio. Em algumas formas de realização, as frações combinadas de fluxo transversal e lavagem da cromatografia por troca iônica Capto Q são carregadas na coluna de cromatografia multimodal e o vírus é coletado no volume vazio da coluna. A coluna é lavada até a referência e removida com hidróxido de sódio de alta condutividade. Aspectos de algumas formas de realização fornecem o controle da razão de carregamento, altura do leito da coluna, tempo de residência e tampões de cromatografia durante essa etapa.
[0024] O vírus purificado é esterilizado por filtração, por exemplo com diafiltração, e armazenado.
[0025] No que se refere aos antígenos, através da prática de algumas formas de realização de uma plataforma de purificação de antígeno da invenção descrita nesse documento, os antígenos recombinantes H5 de hemaglutinina de influenza recombinante (rHA), H7 rHA, domínio III do vírus do Nilo Ocidental (WNV rDIII) e proteína recombinante do vírus da febre de Lassa 1/2 (rGP1/2 LFV) foi produzida e purificada. Antígenos para várias formas de realização nesse documento podem ser de muitas fontes e podem ser produzidos usando estratégias tradicionais de fabricação de proteínas recombinantes, incluindo abordagens de expressão baseadas em bactérias, leveduras, insetos, mamíferos ou plantas.
[0026] Em algumas formas de realização, uma plataforma de fabricação de antígeno começa pelo cultivo de plantas em uma sala de crescimento controlada, infectando as plantas para replicação do antígeno recombinante e, em seguida, a recuperação do antígeno usando um desintegrador seguida pela remoção da fibra do líquido aquoso por meio de uma prensa parafuso. Um tampão de extração é adicionado para auxiliar na remoção da clorofila (no contexto da planta) e grandes detritos celulares por filtração. Seja para antígeno de planta ou não vegetal, a pressão de alimentação, o tamanho do poro do filtrado, o agente de clarificação e a biomassa carregada por metro quadrado de superfície da membrana são controlados) para facilitar a passagem dos antígenos através do filtro. Uma descrição (embora não limitativa) de vários controles em processo adequados para alcançar a purificação de vírus, e o antígeno em grande escala é expressado em mais detalhes na seção de Exemplos.
[0027] Em algumas formas de realização, antígenos de planta e não vegetais semelhantes, o extrato clarificado é em seguida concentrado com um sistema de fluxo tangencial.
Durante essa etapa opcional, fatores incluindo tamanho dos poros do cassete, pressão transmembranar e carga de extrato clarificado por metro quadrado de superfície da membrana são controlados. Em algumas formas de realização, a etapa opcional é totalmente ignorada. Em seguida, o extrato clarificado é então concentrado e lavado com um tampão de equilíbrio de cromatografia por troca iônica. Uma maneira de realizar essa etapa é carregar a alimentação em uma coluna de troca iônica Capto Q equilibrada, seguida por lavagem com tampão de equilíbrio e eluição/remoção com sal. As frações de antígeno são então coletadas na eluição e preparadas para cromatografia por afinidade por metal imobilizado com cobalto (IMAC). O IMAC é equilibrado, a alimentação é carregada, depois lavada com tampão de equilíbrio e eluída.
A fração de eluição é diluída e verificada quanto ao pH, depois carregada em uma coluna de cromatografia de hidroxiapatita de cerâmica multimodal (CHT). A resina de CHT é equilibrada com tampão de equilíbrio e os antígenos são eluídos. Taxa de carregamento, altura do leito da coluna, tempo de residência e tampões de cromatografia estão entre os fatores que estão sendo controlados. Por último, o antígeno é concentrado e diafiltrado com tampão salino. O antígeno recombinante é esterilizado por filtração e, em seguida, armazenado.
[0028] Ainda, de acordo com várias formas de realização divulgadas nesse documento, H7 rHA e TMV, H1N1 (Influenza
A/Michigan) para TMV, H3N2 (Influenza A/Singapura) para TMV,
e TMV para dois vírus Influenza B (B/Colorado e B/Phuket),
foram conjugados com sucesso.
Em algumas formas de realização, a proteína consiste em qualquer tipo de agente terapêutico capaz de ser conjugado a um vírus para criar uma vacina e, então, dispensado a um organismo de origem para produzir uma resposta imunológica de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas.
Consequentemente, as divulgações fornecem nesse documento composições compreendendo uma matriz de conjugados de vírus-proteína,
incluindo conjugados de vírus-antígeno.
Em algumas formas de realização, o vírus selecionado é TMV, ou qualquer um de uma série de vírus identificados e/ou indicados pelos ensinamentos nesse documento.
Adicionalmente, em algumas formas de realização, a proteína pode ser um antígeno, tal como, mas não se limitando a, antígeno de hemaglutinina (HA)
da Influenza, incluindo, sem limitação, aqueles listados nesse parágrafo.
Em algumas formas de realização, o HA exibe pelo menos cerca de 50% de formação de trímero.
Os HAs são clinicamente importantes porque tendem a ser reconhecidos por certos anticorpos produzidos por um organismo,
fornecendo o principal impulso de proteção contra várias infecções por influenza.
Portanto, a antigenicidade do HA e a imunogenicidade do HA estão ligadas para conformação, sabe- se que a trimerização do HA é vantajosa sobre a forma monomérica em termos de desencadeamento de respostas imunológicas.
[0029] Em algumas formas de realização, a conjugação começa pela concentração e diafiltração do antígeno e do vírus purificados em um tampão ligeiramente ácido. O antígeno e o vírus são então combinados com base na molaridade e misturados. Uma carbodiimida solúvel em água recém- preparada, tal como 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (também conhecida como EDC) é adicionada à mistura enquanto se mistura com base na molaridade. Um reagente químico para converter grupos carboxila em ésteres N-hidroxissulfosuccinimida reativos a amina, tal como Sulfo-NHS de ThermoFisher, é então adicionado com base na molaridade. A reação é continuada até um tempo de parada predeterminado. A reação é então extinta, com um exemplo envolvendo a adição de um grupo amina (por exemplo, líquido contendo aminas livres) e qualquer(quaisquer) ligante(s) químico(s) usado(s) para facilitar a reação (por exemplo, EDC, Sulfo-NHS) é(São) removido(s) através de múltiplas etapas de cromatografia modal ou diafiltração, com a mistura sendo então diluída para a concentração alvo. Em algumas formas de realização, as partículas de vírus conjugadas e purificadas que são decoradas com proteínas e antígenos podem ser usadas para vacinas e/ou ferramentas de diagnóstico. Essas partículas podem ser usadas como ferramentas de diagnóstico devido à sua capacidade de rastrear antígenos no organismo hospedeiro.
[0030] Em algumas formas de realização, a fusão vírus- antígeno purificada pode ser derivada da fusão genética, além das várias formas de realização divulgadas nesse documento. O antígeno e as proteínas estruturais do vírus (localizadas no revestimento) formam uma única fase de leitura aberta contínua. Em algumas formas de realização, a fase de leitura produz uma proteína de revestimento de antígeno em uma planta de modo que a proteína de revestimento se automonte em partículas de vírus. Em seguida, os materiais de planta são colhidos e as partículas de vírus são purificadas de acordo com as formas de realização divulgadas nesse documento. As partículas de vírus decoradas com as proteínas do revestimento de fusão podem então ser usadas como uma vacina e/ou uma ferramenta de diagnóstico de acordo com as várias formas de realização divulgadas.
[0031] Alguns vírus (tais como vírus icosaédricos, tal como um exemplo não limitativo) incham sob certas condições de pH e em algumas formas de realização, esse “inchaço” pode ser usado para conjugação. De acordo com várias formas de realização e alternativas, o vírus purificado pode ser conjugado a um agente terapêutico submetendo a estrutura do vírus a condições de pH ácido que fazem com que o vírus “inche”. Ao tratar a estrutura do vírus com condições de pH neutro, a estrutura do vírus relaxa e cria poros entre o pentâmero ou outras subunidades estruturais do vírus. Em seguida, um agente terapêutico (tal como um agente quimioterápico) é adicionado ao tampão e permitido difundir na partícula viral relaxada. Ao alterar o pH novamente, as partículas de vírus se contraem e removem as estruturas de poro que empacotam o pentâmero ou ficam juntas estruturalmente de modo que a difusão química para dentro ou para fora da partícula de vírus seja evitada. Em seguida, os materiais de planta são colhidos, as partículas de vírus são purificadas, e as partículas de vírus contendo um agente terapêutico são usadas para a dispensação de fármacos, de acordo com as formas de realização divulgadas nesse documento.
[0032] Por conseguinte, várias formas de realização e alternativas abrangem a produção de um ou mais de vírus altamente purificados. Além disso, várias formas de realização e alternativas abrangem a produção ou purificação ou ambas de um antígeno recombinante. Além disso, várias formas de realização e alternativas abrangem a conjugação de antígenos e vírus purificados para uso como vacinas. A purificação de vírus pode ser praticada por si mesma de acordo com as presentes formas de realização. Da mesma forma,
a produção ou purificação de antígenos recombinantes pode ser praticada sozinha de acordo com as presentes formas de realização. Opcionalmente, também, diferentes aspectos dessas formas de realização múltiplas podem ser combinados, em que a combinação de formas de realização incluiria, entre outras formas de praticar essas formas de realização, começando com um ou mais de organismos de origem, a partir do(s) qual(ais) é(são) produzido(s) um ou mais vírus e um ou mais antígeno(s), então purificando tais vírus e antígenos, então formando vacinas que são conjugadas entre pelo menos um antígeno e pelo menos um vírus.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0033] Os desenhos e as formas de realização descritos nesse documento são ilustrativos de múltipla(o)s estruturas, aspectos e características alternativa(o)s das múltiplas formas de realização e alternativas divulgadas nesse documento e não devem ser entendidos como limitantes do escopo de qualquer uma dessas formas de realização e alternativas. Será ainda compreendido que as figuras dos desenhos descritas e fornecidas nesse documento não estão em escala e que as formas de realização não estão limitadas aos(às) arranjos, representações e instrumentalidades preciso(a)s mostrado(a)s.
[0034] A Fig. 1 é um fluxograma que mostra as etapas em uma determinada plataforma de purificação de vírus dentro do escopo da presente divulgação, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0035] A Fig. 2 é o vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico purificado, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0036] A Fig. 3 é uma análise de western blot da purificação do vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0037] A Fig. 4 é o vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico purificado, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0038] A Fig. 5 é uma análise de western blot da purificação do vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0039] A Fig. 6 é o vírus do mosaico do tabaco em forma de bastonete purificado, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0040] A Fig. 7 é uma análise de western blot da purificação do vírus do mosaico do tabaco em forma de bastonete, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0041] A Fig. 8 é um fluxograma que mostra as etapas de uma plataforma de fabricação de antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0042] A Fig. 9 é uma análise de western blot de algumas das etapas de uma plataforma de fabricação de antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0043] A Fig. 10 é uma análise de western blot de algumas das etapas de uma plataforma de fabricação de antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0044] A Fig. 11 é uma análise de western blot de algumas das etapas de uma plataforma de fabricação de antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0045] A Fig. 12 é uma análise de western blot da purificação de vários antígenos através da plataforma de fabricação de antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0046] A Fig. 13 é uma ilustração da conjugação de antígeno recombinante a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0047] A Fig. 14 é uma análise SDS-PAGE da conjugação de um antígeno a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0048] A Fig. 15 é uma análise SDS-PAGE da conjugação de um antígeno a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0049] A Fig. 16 é uma análise SDS-PAGE da conjugação de um antígeno a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0050] A Fig. 17 é um relatório de cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SEC-HPLC) de um produto de TMV livre, de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas.
[0051] A Fig. 18 é um relatório de SEC-HPLC de conjugação entre um vírus e um antígeno por quinze minutos, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0052] A Fig. 19 é um relatório de SEC-HPLC de conjugação entre um vírus e um antígeno duas horas, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0053] A Fig. 20 é uma análise de western blot de conjugação entre um vírus e um antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0054] A Fig. 21 é um gráfico que ilustra a infecciosidade de vírus tratados com vários níveis de irradiação UV, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0055] A Fig. 22 é uma ilustração de algumas das etapas da plataforma de conjugação de antígeno recombinante a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0056] A Fig. 23 é uma análise SDS-PAGE da conjugação de um antígeno a um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0057] A Fig. 24 é uma imagem por microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa (TEM) do antígeno recombinante, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0058] A Fig. 25 é uma imagem de TEM de coloração negativa de um vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0059] A Fig. 26 é uma imagem de TEM de coloração negativa de um antígeno recombinante conjugado a outro antígeno recombinante com vírus adicionado, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0060] A Fig. 27 é uma imagem de TEM de coloração negativa de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 1:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0061] A Fig. 28 é uma imagem de TEM de coloração negativa de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 1:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0062] A Fig. 29 é uma imagem de TEM de coloração negativa de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 4:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0063] A Fig. 30 é uma imagem de TEM de coloração negativa de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 16:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0064] A Fig. 31 é uma distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação de um antígeno, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0065] A Fig. 32 é uma distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação de um vírus, de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas.
[0066] A Fig. 33 é uma distribuição de coeficiente de sedimentação normalizada de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 1:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0067] A Fig. 34 é uma distribuição de coeficiente de sedimentação normalizada de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 1:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0068] A Fig. 35 é uma distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação do antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 1:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0069] A Fig. 36 é uma distribuição de coeficiente de sedimentação normalizada de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 4:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0070] A Fig. 37 é uma distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação de antígeno recombinante conjugado a um vírus em uma razão de vírus para antígeno recombinante de 16:1, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0071] A Fig. 38 é um gráfico de dispersão de títulos relevantes para o antígeno em um organismo de origem após a administração de produtos de antígeno de vírus em várias razões de vírus para recombinantes, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
[0072] A Fig. 39 é um teste de média geométrica que ilustra os títulos relevantes para o antígeno em um organismo de origem após a administração de produtos de antígeno de vírus em várias razões de vírus para recombinantes, de acordo com várias formas de realização e alternativas.
MÚLTIPLAS FORMAS DE REALIZAÇÃO E ALTERNATIVAS
[0073] Um processo de multiconjuntos de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas nesse documento melhora os processos de purificação a montante, enriquecendo adicionalmente mais os vírus de plantas e facilita a conjugação de vírus e antígeno para formar uma vacina. As etapas para a produção e a purificação de um vírus de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas são listadas e discutidas em conexão com a Tabela 1 e a Figura 1. Da mesma forma, as etapas para a produção e a purificação de um antígeno são listadas e discutidas em conexão com a Tabela 2. Embora as várias plataformas têm uma forma de realização específica descrita para as mesmas abaixo, o escopo das formas de realização contidas nesse documento não está limitado a qualquer forma de realização específica.
Produção e purificação de vírus
[0074] A Tabela 1 e a Figura 1 ilustram as etapas da plataforma de purificação de vírus de acordo com várias formas de realização e alternativas.
Tabela 1. Produção e purificação de vírus Etapas Operações de unidade Controles em Análise em processo operacionais Processo 1 Crescimento da planta Irrigação, Ciclo De Altura, estrutura e (25 DPS) Nb Luz, Fertilizante, qualidade da folha Meio, Umidade, da planta Temperatura 2 Infecção por vírus Concentração, Taxa N/A de aplicação de Inóculo 3 Replicação Viral (7 Irrigação, Ciclo De N/A DPI) Crescimento da Luz, Umidade, planta Temperatura 4 Colheita de Tecido Inspeção Visual de N/A Aéreo Plantas
Etapas Operações de unidade Controles em Análise em processo operacionais Processo 5 Desintegração de Tipo de lâmina e pH, Condutividade, Células de Plantas RPM, Tamanhos de SDSPage, (Extração) tela, Razão de Endotoxina, Tampão:Tecido Nicotina 6 Clarificação de Tamanho Cerâmico, pH, Condutividade, Extrato de Planta TMP, kg/m2 SDSPage, Endotoxina, Nicotina 7 Clarificação de Tamanho do Poro, pH, Condutividade, Extrato de Planta TMP, Material do SDSPage, Clarificado Poro, kg/m2 Endotoxina, Nicotina 8 Cromatografia por kg/L, altura do pH, Condutividade, Troca Iônica leito, tempo de SDSPage, residência Endotoxina, Nicotina 9 Cromatografia kg/L, altura do pH, Condutividade, Multimodal leito, tempo de SDSPage, residência Endotoxina, Nicotina 10 Concentração do vírus Tamanho do Poro, UV260, TEM, DLS, purificado TMP, Material do SDSPage, Poro, kg/m2 Endotoxina, Nicotina, Aminoácido
[0075] Essa plataforma de purificação é projetada para escalabilidade comercial e conformidade com os regulamentos de cGMP e utiliza um tampão em todo o processo de purificação. De acordo com várias formas de realização e alternativas, as etapas da plataforma de purificação de vírus são fornecidas em conexão com a expressão em plantas. No entanto, as etapas após a colheita do tecido acima do solo e ruptura celular, conforme descrito abaixo, também se aplicam a vírus não vegetais (exceto onde o contexto está claramente relacionado a plantas, por exemplo, referência à remoção de fibra da planta).
[0076] De acordo com várias formas de realização e alternativas descritas nesse documento, a expressão do vírus é realizada por meio de métodos que são apropriados para um hospedeiro específico. Em algumas formas de realização, a dispensação baseada em vírus de genes a uma planta hospedeira é realizada com um vetor de expressão de TMV modificado que faz com que as plantas de tabaco formem o vírus de forma recombinante. Uma dessas alternativas disponíveis é a plataforma GENEWARE® descrita na Patente dos Estados Unidos
7.939.318, “Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform”. Essa plataforma de expressão baseada em planta transiente descrita nessa patente emprega o vírus de planta TMV para aproveitar a maquinaria de produção de proteína da planta, que expressa uma variedade de vírus em um curto período de tempo de colheita pós-inoculação (por exemplo, menos de 21 dias). As plantas de tabaco inoculadas com os genes do vírus expressam o vírus específico nas células infectadas e os vírus são extraídos na colheita. A inoculação ocorre, como exemplos a serem selecionados por um usuário dos métodos descritos nesse documento, inoculação manual de uma superfície de uma folha, inoculação mecânica de um canteiro, um spray de alta pressão de uma folha ou infiltração a vácuo.
[0077] Além de Nicotiana benthamiana, outros hospedeiros de planta e não vegetais são contemplados por essa divulgação, incluindo aqueles mencionados no Sumário.
Além da plataforma GENEWARE®, outras estratégias podem ser empregadas para dispensar genes a plantas (Lemna gibba ou Lemna minor como exemplos não limitantes) e organismos não vegetais (algas como um exemplo não limitativo). Essas outras estratégias incluem Agroinfiltração, que introduz o gene viral por meio de um vetor bacteriano Agrobacterium em muitas células em toda a planta transfectada. Outra é a eletroporação para abrir poros nas membranas celulares do hospedeiro para introduzir os genes que produzem de forma recombinante os vírus e antígenos, tais como, mas não se limitando aos descritos nos Exemplos 1 e 3 abaixo. Outro é o vetor de superexpressão baseada em RNA de TMV (TRBO), que utiliza um replicon de TMV induzido pelo promotor 35S que não possui a sequência do gene da proteína de revestimento de TMV, como descrito em John Lindbo, “TRBO: A High- Efficiency Tobacco Mosaic Virus RNA-Based Overexpression Vector,” Plant Physiol. Vol 145, 2007.
[0078] Em algumas formas de realização, o crescimento de plantas de tipo selvagem Nicotiana benthamiana ocorre em uma sala de crescimento controlada. O crescimento das plantas é controlado por meio de ciclos de irrigação, luz e fertilização. As plantas são cultivadas em um meio sem solo e a temperatura é controlada durante todo o processo.
[0079] Após um número apropriado de dias pós-semeadura (DPS), por exemplo 23-25 DPS, as plantas são infectadas com a replicação do vírus. Após a infecção, as plantas são irrigadas apenas com água e controladas por ciclo de luz e temperatura por um determinado número de dias após a infecção (DPI) dependendo do tipo de vírus.
[0080] As plantas são inspecionadas quanto à altura, aos sintomas de infecção e o tecido acima do solo é colhido.
[0081] A recuperação/ruptura celular do vírus envolve um desintegrador configurado com um tamanho de lâmina/tela otimizado seguido pela remoção de fibra da planta celulósica residual do líquido aquoso (tal como por meio de uma prensa parafuso, como um exemplo).
[0082] Um tampão de extração apropriado (por exemplo, 200 mM de acetato de sódio, pH 5,0; etapa 201 da Fig. 1 como um exemplo não limitativo) é adicionado ao extrato resultante em uma razão de 1:1 de tampão:tecido. A remoção de clorofila e grandes detritos celulares em escala piloto envolve o uso de filtração de cerâmica de fluxo tangencial (TFF) (1,4 mícrons/5,0 mícrons). A pressão transmembranar, o tamanho dos poros da cerâmica e a biomassa carregada por metro quadrado da superfície da membrana são todos controlados para garantir a passagem do vírus pela cerâmica. Em algumas formas de realização, a pressão de alimentação, a pressão de retido e a pressão de permeado são ajustadas e controladas para produzir uma pressão transmembranar resultante em uma faixa de cerca de 1,5 - 2 Bar (150 KPa – 200 KPa) de TMP.
[0083] O permeado de cerâmica é adicionalmente clarificado por meio do uso de filtração em profundidade de fibra de vidro (etapa 203 da Fig. 1 como um exemplo não limitativo).
[0084] O extrato clarificado é concentrado com um sistema de TFF (disponível na Sartorius AG). O tamanho dos poros do cassete (100 - 300 kDa), um TMP apropriado como descrito nesse documento, e a carga de extrato clarificado por metro quadrado de área superficial da membrana são controlados.
[0085] O extrato clarificado é concentrado para NMT 2X o volume da coluna de troca iônica e lavado 7X com tampão de equilíbrio de cromatografia por troca iônica (acetato de sódio 200 mM, pH 5,0, etapa 204 da Fig. 1 fornece um exemplo não limitativo). A coluna de troca iônica Capto Q é equilibrada para cinco volumes de coluna com acetato de sódio 200 mM, pH 5,0 (a etapa 205 da Fig. 1 fornece um exemplo não limitativo), e a alimentação é carregada e coletada na fração de fluxo contínuo. A coluna é lavada até a referência e os contaminantes da célula hospedeira são removidos da coluna com alto teor de sal.
[0086] As frações de fluxo e lavagem são coletadas,
combinadas e preparadas para cromatografia multimodal Capto® Core 700. A coluna de cromatografia multimodal é equilibrada com cinco volumes de coluna de tampão de equilíbrio (acetato de sódio 200 mM, pH 5,0; a etapa 206 da Fig. 1 fornece um exemplo não limitativo).
[0087] As frações combinadas de fluxo e lavagem da cromatografia por troca iônica Capto Q são carregadas na coluna e o vírus coletado no volume vazio da coluna. A coluna é lavada até a referência e removida com hidróxido de sódio de alta condutividade. A taxa de carregamento, a altura do leito da coluna, o tempo de residência e os tampões de cromatografia são todos controlados. A formulação e a concentração de vírus (etapa 208, Fig. 2) ocorre em algumas formas de realização com um Sistema de TFF (tal como o sistema Sartorius AG). O tamanho dos poros (30-300 kDa), um TMP apropriado como descrito nesse documento, a carga por metro quadrado da área superficial da membrana e o material dos poros são todos controlados. O vírus é concentrado para uma concentração apropriada, tal como 10 mg/ml, e em algumas formas de realização é diafiltrado com um tampão apropriado, tal como Fosfato de Sódio. O vírus formulado é esterilizado e armazenado de forma adequada. Em algumas formas de realização, a esterilização é fornecida por meio de um filtro de PES.
[0088] Todos os exemplos fornecidos nesse documento são ilustrativos de vários aspectos de várias formas de realização e alternativas de qualquer ou toda a produção de vírus, purificação de vírus, produção de antígeno, purificação de antígeno e conjugação de vírus-antígeno.
Esses exemplos são não limitativos e meramente característicos de várias formas de realização alternativas nesse documento.
Exemplo 1 - Purificação do vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico
[0089] O Western Blot, fornecido na Fig. 3 como uma técnica conhecida para detectar várias proteínas em uma mistura, mostra a purificação bem-sucedida do vírus do mosaico de trevo vermelho icosaédrico ilustrado na Fig. 2.
De forma similar, o Western Blot na Figura 5 mostra a purificação bem sucedida do vírus do mosaico do trevo vermelho icosaédrico ilustrado na Fig. 4. Ambos os vírus foram purificados de acordo com as formas de realização descritas nesse documento. De acordo com a técnica de detecção conhecida, proteínas alvo foram extraídas do tecido. Em seguida, as proteínas da amostra foram separadas usando eletroforese em gel com base em seu(sua) ponto isoelétrico, peso molecular, carga elétrica ou várias combinações desses fatores. As amostras foram então carregadas em várias linhas no gel, com uma linha reservada para uma “escada” contendo uma mistura de proteínas conhecidas com pesos moleculares definidos. Por exemplo, na Fig. 3, a linha 12 serve como escada. Uma voltagem foi então aplicada ao gel, fazendo com que as várias proteínas migrassem através do gel em velocidades diferentes com base nos fatores mencionados acima. A separação das diferentes proteínas em bandas visíveis dentro de cada faixa ocorreu como fornecido nas Figuras 3 e 5, respectivamente. Com o Western Blot, um produto mais puro é caracterizado por uma banda clara e visível, e é caracterizado nessas figuras.
[0090] As Figuras 3 e 5 ilustram a plataforma de purificação de vírus que purifica com sucesso o vírus do mosaico de trevo vermelho icosaédrico. Cada linha do western blot mostra a pureza do vírus após a conclusão de uma etapa diferente na plataforma de purificação do vírus. Na Fig. 3, as linhas incluem: linha 1 - suco verde, linha 2 - Retido de clarificação de cerâmica TFF, linha 3 - Permeado de clarificação de cerâmica TFF, linha 4 - Retido de cassete TFF, linha 5 - Permeado de cassete TFF, linha 6 - Troca iônica, linha 7 - Troca de íons, linha 8 - multimodal, linha 9 - multimodal, linha 10 - Permeado de TFF 30K, Retido 30K linha 11, linha 12 - marcador. Na Fig. 5. as linhas do Western blot incluem o seguinte: linha 1 - Suco Verde, linha 3 - Retido de Clarificação de Cerâmica de TFF, linha 5 - Permeado de Clarificação de Cerâmica de TFF, linha 7 - Retido de Cassete de TFF, linha 9 - Permeado de Cassete de TFF,
linha 11 - Troca de íons, linha 13 - Multimodal e Linha 14 - Marcador.
[0091] Uma vez que a etapa final ocorreu na plataforma de purificação do vírus, o produto viral resultante é altamente purificado, como mostrado pela banda visível na linha 11 da Fig. 3 e na linha 13 da Fig. 5.
Exemplo 2 - Purificação de TMV em forma de Bastonete
[0092] A Fig. 6 mostra um TMV purificado em forma de bastonete, e a Fig. 7 ilustra uma plataforma de purificação de vírus usada na obtenção desse TMV purificado, dentro do escopo de múltiplas formas de realização e alternativas divulgadas nesse documento. Similar às Figuras 3 e 5, a Fig.
7 ilustra a pureza do produto de vírus após a conclusão das várias etapas da plataforma de purificação de vírus atual.
Após a etapa de purificação final, o produto resultante é um produto de vírus altamente purificado consistente com uma banda clara e visível na linha 13 da Fig. 7.
[0093] Por conseguinte, uma plataforma de purificação de vírus da invenção purificou com sucesso todos os vírus nos quais os inventores aplicaram esses métodos, incluindo um vírus icosaédrico e um vírus em forma de bastonete, e espera-se que esta plataforma seja reproduzível e purifique consistentemente em um tipo (senão todos os tipos) de vírus virtualmente em escala comercial.
Produção e Purificação de Antígeno Recombinante
[0094] A Tabela 2 e a Figura 8 ilustram as etapas da plataforma de purificação de antígeno de acordo com várias formas de realização e alternativas.
Tabela 2. Produção e Purificação do Antígeno Recombinante Etapas Operações de unidade Controles em Análise em operacionais Processo processo 1 Crescimento da planta Irrigação, Altura, (25 DPS) Nb Ciclo de Luz, Estrutura e Fertilizante, Qualidade da Meio, Umidade, Folha da Temperatura Planta 2 GENEWARE Infecção por Concentração, Antígeno Alvo Taxa de aplicação de Inóculo 3 Replicação (7-14 DPI) Irrigação, Crescimento da planta Ciclo de Luz, Umidade, Temperatura 4 Colheita de Tecido Inspeção Visual Aéreo de Plantas 5 Desintegração de Tipo de lâmina pH, Células de Plantas e RPM, Tamanhos Condutividade, (Extração) de tela, Razão SDSPage, de Endotoxina, Tampão:Tecido Nicotina 6 Clarificação de Extrato Tamanho do Poro pH, de Planta da Prensa do Condutividade, Filtro, Pressão SDSPage, de Alimentação, Endotoxina, kg/m2 Nicotina 7 Clarificação de Extrato Tamanho do pH, de Planta Clarificado Poro, TMP, Condutividade, Material do SDSPage, Poro, kg/m2 Endotoxina, Nicotina 8 Cromatografia em Capto kg/L, Altura do pH, Q Leito, Tempo de Condutividade, Residência SDSPage, Endotoxina,
Etapas Operações de unidade Controles em Análise em operacionais Processo processo Nicotina 9 ColMAC ou ConA kg/L, Altura do pH, Leito, Tempo de Condutividade, Residência SDSPage, Endotoxina, Nicotina 10 Hidroxiapatita Cerâmica kg/L, Altura do pH, Leito, Tempo de Condutividade, Residência SDSPage, Endotoxina, Nicotina 11 Concentração/Formulação Tamanho do UV260, TEM, de Antígeno Purificado Poro, TMP, DLS, SDSPage, Material do Endotoxina, Poro, kg/m2 Nicotina, Aminoácido
[0095] Essa plataforma de purificação é projetada para escalabilidade comercial e conformidade com os regulamentos de cGMP e utiliza um tampão em todo o processo de purificação. De acordo com várias formas de realização e alternativas, as etapas da plataforma de purificação de antígeno são como a seguir:
[0096] Crescimento de plantas de tipo selvagem Nicotiana benthamiana em uma sala de crescimento controlada.
O crescimento das plantas é controlado por meio de ciclos de irrigação, luz e fertilizantes. As plantas são cultivadas em um meio sem solo e a temperatura é controlada durante todo o processo. Após um número apropriado de DPS, por exemplo 23 a 25, as plantas são infectadas para a replicação da proteína de um antígeno selecionado. Uma vez marcada, a proteína é suficiente para a retenção no RE da célula vegetal transgênica. Após a infecção, as plantas são irrigadas apenas com água e controladas por meio de um ciclo de luz e temperatura por um número apropriado de dias após a infecção, tais como 7 a 14 dias, dependendo do tipo de antígeno. As plantas são inspecionadas quanto à altura e sintomas de infecção, e o tecido acima do solo é colhido.
[0097] A recuperação do antígeno produzido pelas plantas envolve um desintegrador configurado com um tamanho de lâmina/tela otimizado seguido pela remoção da fibra de planta celulósica residual do líquido aquoso (tal como através de uma prensa parafuso, como um exemplo).
[0098] Um tampão de extração adequado é adicionado ao extrato resultante em uma razão apropriada, tal como uma razão de 1:1 de tampão:tecido ou uma razão de tampão:tecido de 2:1. Em algumas formas de realização, o tampão de extração pode ser 50-100 mM de Fosfato de Sódio + EDTA 2 mM + NaCl 250 mM + Tween80 0,1%, pH 8,5. A remoção da clorofila e de grandes detritos celulares envolve o uso de filtração.
Celpure300 é adicionado a uma razão de 33 g/L e misturado por 15 minutos. A pressão de alimentação (<30 PSI), o tamanho do poro do filtrado (0,3 mícrons), o agente de clarificação (Celpure300) e a biomassa carregada por metro quadrado de superfície da membrana são todos controlados para garantir a passagem dos antígenos.
[0099] O extrato clarificado é concentrado com um sistema de TFF (tal como o sistema Sartorius AG). Em algumas formas de realização, o tamanho dos poros do cassete (por exemplo, 30 kDa), um TMP apropriado, como descrito nesse documento, e a carga de extrato clarificado por metro quadrado de área superficial da membrana são controlados.
[00100] O extrato clarificado é concentrado e lavado 7X com um tampão de equilíbrio de cromatografia por troca iônica apropriado (tal como Fosfato de Sódio 50 mM + NaCl 75 mM, pH 6,5). A coluna de troca iônica Capto Q é equilibrada para cinco volumes de coluna com Fosfato de Sódio 50 mM + NaCl 75 mM, pH 6,5, a alimentação é carregada, lavada com tampão de equilíbrio e a coluna eluída/removida com alto teor de sal.
[00101] As frações de antígeno são coletadas na eluição para a preparação para cromatografia IMAC com cobalto. IMAC é equilibrado para cinco volumes de coluna com Fosfato de Sódio 50 mM + Cloreto de Sódio 500 mM, pH 8,0, a alimentação é carregada, lavada com tampão de equilíbrio e eluída usando imidazol.
[00102] A fração de eluição é diluída até a condutividade, o pH é verificado e carregado em uma coluna de cromatografia de cerâmica hidroxiapatita multimodal (CHT). A resina de CHT é equilibrada com cinco volumes de coluna de tampão de equilíbrio (Fosfato de Sódio 5 mM, pH
6,5). Os antígenos são eluídos usando um gradiente de fosfato e NaCl. A taxa de carregamento, a altura do leito da coluna, o tempo de residência e os tampões de cromatografia são todos controlados. A formulação e a concentração dos antígenos ocorrem usando um sistema de TFF (tal como o sistema Sartorius AG). Tamanho de poro (em kDa), TMP, carga por metro quadrado de área superficial de membrana e material de poro são todos controlados, como discutido adicionalmente nesse documento.
[00103] O antígeno é em seguida concentrado para uma concentração adequada, tal como 3 mg/ml, e diafiltrado com um tampão adequado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4). O antígeno formulado é esterilizado e armazenado de forma adequada. Em algumas formas de realização, a esterilização é fornecida por meio de um filtro de PES.
[00104] As Figuras 9, 10 e 11 ilustram as várias etapas da plataforma de purificação de antígeno de acordo com várias formas de realização e alternativas. A Fig. 9 mostra a pureza do produto de antígeno após a conclusão da etapa de cromatografia em Capto Q, a Fig. 10 mostra a pureza do produto de antígeno após a etapa de cromatografia de afinidade e a Fig. 11 mostra a pureza após a coluna de cromatografia em CHT.
Exemplos 3, 4, 5 e 6 - H5 rHA, H7 rhA, WNV rDIII e LFV rGP1/2
[00105] Como mostrado na Fig. 12, a plataforma de purificação de antígeno de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas purificou com sucesso H5 rHA, H7 rhA, WNV rDIII e LFV rGP1/2. A Fig. 12 contém duas imagens tiradas da conclusão da plataforma de purificação do antígeno: a imagem à esquerda contém um gel de SDS Page indicando pureza para o vetor viral NtK de TMV (onde NtK é uma abreviatura para lisina N-terminal) e antígenos da influenza, e a imagem à direita contém um western blot indicando a imunorreatividade para os antígenos da febre do Nilo Ocidental e da febre de Lassa. Como mostrado pelas bandas claras e visíveis na Fig. 12, cada produto de antígeno é altamente puro. Portanto, a plataforma de purificação de antígeno de acordo com várias formas de realização e alternativas purificou consistentemente cada tipo de antígeno em uma escala comercial com a qual foi usado de uma maneira que também está em conformidade com os regulamentos de cGMP. Da mesma maneira, espera-se que essa plataforma seja reproduzível para purificar virtualmente qualquer tipo (senão todos os tipos) de antígeno.
Produção De Antígeno Recombinante - Conjugados de Vírus
[00106] A Tabela 3 ilustra as etapas da conjugação do antígeno recombinante de acordo com várias formas de realização e alternativas.
Tabela 3. Produção e purificação do Antígeno Recombinante Etapas Operações de unidade Controles em Análise em operacionais Processo processo 1 Concentração/Diafiltração Tamanho do UV280 ou BCA, de Antígeno Poro, TMP, SDSPage, pH, Material do Condutividade Poro, kg/m2 2 Concentração/Diafiltração Tamanho do UV260, de TMV 1295.10 Poro, TMP, SDSPage, pH, Material do Condutividade Poro, kg/m2 3 Formulação de Concentrado Mistura, de EDC Verificação de Peso 4 Formulação de Concentrado Mistura, de Sulfo-NHS Verificação de Peso 5 Combinado de Antígeno e Razão Molar, pH, TMV 1295.10 Mistura, Condutividade, Volume SDSPage 6 Adição de EDC Molaridade, pH, Mistura, Condutividade, Volume de EDC SDSPage 7 Adição de Sulfo-NHS Molaridade, pH, Mistura, Condutividade, Volume de SDSPage Sulfo-NHS 8 Reação de Conjugação Tempo, Temperatura, Mistura 9 Extinção de Reação Tempo, Temperatura, Mistura, Molaridade de Grupo Amina 10 Diafiltração para Remover Tamanho do pH, Reagentes Poro, TMP, Condutividade, Material do SDSPage, Poro, kg/m2 Reagentes (EDC/NHS)
Etapas Operações de unidade Controles em Análise em operacionais Processo processo 11 Concentração/Formulação de Tamanho do Certificado de Vacina Purificada Poro, TMP, Análise (Substância Farmacológica) Material do Poro, kg/m2
[00107] Em uma forma de realização, as etapas de uma plataforma de conjugação são como a seguir: o antígeno e o vírus purificados são concentrados separadamente e diafiltrados em um tampão ligeiramente ácido, tal como um tampão de ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES) contendo NaCl.
[00108] Uma carbodiimida solúvel em água, tal como 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (conhecida como EDC) é formulada em água purificada para uma molaridade de 0,5 M.
[00109] Um reagente químico para a conversão de grupos carboxila em ésteres N-hidroxissulfosuccinimida reativos com amina, tal como Sulfo-NHS da ThermoFisher, é formulado em água purificada a uma molaridade de 0,1 M.
[00110] Antígeno e vírus são combinados com base no peso ou molaridade e misturados até homogeneidade (por exemplo, uma adição de 1:1 em mg:mg).
[00111] A carbodiimida solúvel em água recém- preparada (tal como EDC) é adicionada à mistura enquanto se mistura com base na molaridade.
[00112] Um reagente químico para converter grupos carboxila em ésteres reativos com amina (como Sulfo-NHS) é adicionado com base na molaridade dentro de um minuto após a adição de EDC. A reação de conjugação começa e continua até um tempo de parada de mistura predeterminado, tal como quatro horas, e a temperatura ambiente é controlada.
[00113] A reação é extinta pela adição de aminas livres e o ligante químico (por exemplo EDC e Sulfo-NHS) é removido através de uma etapa de cromatografia multimodal, tal como Capto® Core 700, ou diafiltração em uma solução salina tamponada com fosfato. De acordo com várias formas de realização e alternativas, as impurezas residuais são removidas da mistura do conjugado com base nas diferenças de tamanho entre as impurezas como o retido, e a mistura do conjugado como o permeado.
[00114] A mistura de conjugado é diluída para a concentração alvo. Nesse ponto, o conjugado vírus-antígeno é preparado para uso como vacina/fármaco purificada(o). Um mecanismo de dispensação adequado da vacina incluiria um frasco de líquido ou material liofilizado a ser reconstituído com tampão fisiológico para projeto de injeção. A injeção pode ser intramuscular ou subcutânea. Outros métodos de dispensação são contemplados, incluindo, sem limitação, intranasal.
Exemplo 7 - Conjugação de H7 rhA para TMV
[00115] A Fig. 13 fornece uma ilustração da conjugação de um antígeno recombinante (denotado pelo “antígeno da vacina”) a um vírus, com ovais sombreados mais claros e mais escuros representando a extensão da conjugação para o antígeno da vacina representado no exemplo. O sombreado mais claro representa o vírus livre, enquanto o sombreado mais escuro representa o antígeno conjugado com o revestimento proteico do vírus. Além disso, como indicado na Fig. 13, alguns vírus contêm proteínas posicionadas no revestimento em torno do genoma do RNA. Por exemplo, o vetor viral NtK de TMV inclui lisinas N-terminais que servem como pontos de conexão para as proteínas do revestimento. Em algumas formas de realização, as porções do vírus associadas aos resíduos de lisina N-terminal são modificadas para intensificar a apresentação para a ligação do antígeno recombinante fornecendo conjugação direcionada a amina da proteína, por exemplo, antígeno para vírus. Em conexão com a discussão de medição radial nesse documento, o raio viral aumenta muito após a conjugação dos antígenos recombinantes com as proteínas do revestimento viral. Em algumas formas de realização, a modificação é realizada quando os vírus com envelope são alterados para permitir a apresentação intensificada de seus resíduos.
[00116] Como mostrado nas Figuras 14-20, a plataforma de conjugação de antígeno recombinante com vírus conjugou H7 rHA com TMV com sucesso. As Figuras 14-16 mostram uma análise baseada na eletroforese em gel de dodecilssulfato de sódio- poliacrilamida (“SDS-PAGE”) da conjugação entre H7 rHA com TMV em pH 5,50. Como ilustrado nestas figuras, quase todo o H7 rHA foi conjugado com o TMV em 2 horas. O desaparecimento da banda da proteína rHA e o aparecimento simultâneo de complexos com coloração acima do marcador de 200 KDa indicam a formação do complexo. A reatividade das bandas com anticorpos específicos para HA adicionalmente estabelece essa conclusão.
[00117] Os relatórios de SEC-HPLC também indicaram a conjugação bem-sucedida de H7 rHA com TMV de acordo com as formas de realização atuais da plataforma de conjugação. A Fig. 17 mostra um relatório de SEC-HPLC do produto de TMV livre. Na Fig. 17, o relatório de SEC-HPLC do produto de TMV livre produziu os dados de sinal detalhados na Tabela 4 abaixo.
Tabela 4. Dados de SEC-HPLC de TMV Livre TR [min] Largura Área Altura % de Simetria [min] Área de Pico 13,233 0,77 1078,39 23,41 100 0,39
[00118] A Fig. 18 mostra um relatório de SEC-HPLC após H7 rHA ser conjugado com TMV por quinze minutos de acordo com as formas de realização atuais da plataforma de conjugação. Na Fig. 18, o relatório de SEC-HPLC após H7 rHA ser conjugado com TMV por quinze minutos produziu os dados de sinal detalhados na Tabela 5.
Tabela 5. Dados de SEC-HPLC Após H7 rHA ser conjugado com TMV por 15 minutos TR [min] Largura Área Altura % de Simetria [min] Área de Pico 26,539 0,52 553,75 17,65 100 0,83
[00119] A Fig. 19 mostra um relatório de SEC-HPLC após H7 rHA ser conjugado com TMV por duas horas de acordo com as formas de realização atuais da plataforma de conjugação. Na Fig. 19, o relatório de SEC-HPLC obtido após H7 rHA ser conjugado com TMV por duas horas de acordo com as formas de realização atuais da plataforma de conjugação produziu os dados de sinal detalhados na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6. Dados de SEC-HPLC após H7 rHA ser conjugado com TMV por 2 horas TR [min] Largura Área Altura % de Simetria [min] Área de Pico 13,304 0,73 37,30 0,86 0,36 0,43 20,569 1,83 167,16 1,52 1,59 0,00 22,336 1,17 62,55 0,89 0,59 0,64 24,489 2,05 73,35 0,60 0,70 1,34 26,510 0,54 10153,91 316,30 96,56 0,80 29,649 0,83 21,16 0,42 0,20 2,15
[00120] Como ilustrado nas Figuras 19 e 20, os relatórios de SEC-HPLC indicaram que todos os bastonetes de TMV foram revestidos com algum H7 rhA após conjugação por quinze minutos, e mais H7 rhA foi adicionado aos bastonetes por até duas horas. Após duas horas, nenhuma conjugação adicional foi detectada. De acordo com múltiplas formas de realização e alternativas, os relatórios de SEC-HPLC indicam que a reação de conjugação atinge pelo menos cerca de 50% de redução no peso molecular nativo não conjugado, proteína de revestimento do vírus, e que aproximadamente 3% de TMV livre permaneceu após a conjugação ocorrer por quatro horas.
[00121] Como ilustrado na Fig. 20, a análise de western blot do produto conjugado indicou a conjugação bem- sucedida de H7 rhA com TMV via ligação covalente. A Fig. 20 mostra uma análise de Western blot das várias etapas da plataforma de conjugação de acordo com as formas de realização atuais, em que todas as amostras foram carregadas a 10 µL. As várias linhas ilustram diferentes tempos de reação de conjugação entre o antígeno e o vírus. As linhas 14 e 13 mostram que todos os bastonetes de TMV estavam revestidos com o antígeno após quinze minutos. Após duas horas, as linhas 6-9 ilustram que nenhuma conjugação adicional ocorreu.
Exemplo 8 - Inativação por UV de NtK de TMV
[00122] A fim de evitar a contaminação viral de produtos biofarmacêuticos, muitas vezes é necessário inativar (ou esterilizar) o vírus para garantir que o vírus não seja mais infeccioso. Além disso, muitas agências reguladoras promulgaram regras (tais como os regulamentos de cGMP) que exigem pelo menos uma etapa de inativação eficaz no processo de purificação de produtos virais. Embora a radiação UV-C tenha sido usada em sistemas de tratamento de água por muitos anos, seu uso com produtos biofarmacêuticos permanece inexplorado e há estudos limitados sobre sua capacidade de inativar vírus de forma eficaz.
[00123] Por conseguinte, após a produção e a purificação do vírus, mas antes da conjugação com o antígeno recombinante, várias condições de UV-C (isto é, densidade de energia e comprimento de onda) e várias concentrações de TMV foram avaliadas a fim de efetivamente inativar e esterilizar NtK de TMV. Embora muitas densidades de energia tenham sido testadas, apenas os níveis mais elevados de densidades de energia inativaram o NtK de TMV com sucesso. Além disso, foi determinado que a inativação do vírus bem-sucedida depende da concentração porque, quando a solução de TMV não foi diluída para uma concentração apropriada, a radiação UV-C não esterilizou efetivamente todos os vírus na amostra.
Portanto, a solução de TMV deve ser diluída de forma adequada para permitir que a radiação UV-C interaja com cada vírus e inative eficazmente.
[00124] Como mostrado na Fig. 21, várias quantidades de radiação UV-C (com densidades de energia entre 300 J/m2 e 2400 J/m2) foram testadas em plantas de Nicotiana tabacum para avaliar a infetividade. Como mostrado na Fig. 21, as lesões foram reduzidas a zero após uma dosagem de energia UV-C de 2.400 J/m2, indicando, portanto, a inativação bem-
sucedida do vírus. Além disso, dosagens de energia em níveis muito mais altos também foram testadas, e foi determinado que a inativação bem-sucedida de NtK de TMV também ocorreu em densidades de energia variando entre 4800 J/m2 e 5142 J/m2.
[00125] De acordo com várias formas de realização e alternativas, as etapas da inativação viral (após a purificação, mas antes da conjugação) são como a seguir:
[00126] Diluição da solução de NtK de TMV para uma concentração menor que 50 microgramas/ml, como medido por A260 (que é um método comum de quantificação de ácidos nucleicos expondo uma amostra à luz UV em um comprimento de onda de 260 nm e medindo a quantidade de luz que passa pela amostra).
[00127] Filtragem a 0,45 mícrons da solução de TMV para remover bactérias e quaisquer outras espécies grandes que possam interferir na linha de visão UV.
[00128] Inativação do NtK de TMV expondo o vírus à luz no espectro de UV com uma densidade de energia entre cerca de 2.400 J/m2 e cerca de 5142 J/m2. Em algumas formas de realização, a densidade de energia da luz UV está entre cerca de 4800 J/m2 e cerca de 5142 J/m2. De acordo com várias formas de realização e alternativas, o comprimento de onda da luz UV é de 254 nm.
[00129] Em seguida, o NtK de TMV inativado está pronto para ser conjugado ao antígeno recombinante.
[00130] Essas etapas de inativação viral são projetadas para escalabilidade comercial e conformidade com os regulamentos de cGMP.
Exemplo 9 - Dependência de pH da Conjugação
[00131] Para avaliar se a incubação do vírus em um pH ácido resulta em conjugação de alta qualidade, um experimento foi realizado usando os mesmos lotes de vírus, antígeno, tampões e ésteres, mas alterando apenas a formulação do vírus. Na reação 1, o TMV foi formulado em 1X de Tampão de Conjugação MES a pH 5,50 a uma concentração de 3,1 mg/ml, de acordo com várias formas de realização e alternativas. Na reação 2, o TMV foi concentrado a 11,0 mg/ml em tampão fosfato e adicionado diretamente como 15% do volume da reação de conjugação. Após essas etapas, o processo de conjugação foi monitorado por SEC, em que uma diminuição ordenada no TMV livre de zero minutos (indicado por T = 0) indicaria a conjugação bem-sucedida.
[00132] Como mostrado nas Tabelas 7 e 8, a reação 1 exibiu conjugação bem-sucedida (devido à diminuição ordenada no TMV livre de zero minutos), enquanto a reação 2 não teve sucesso, como mostrado pela porcentagem restante do TMV livre.
Tabela 7. Reação 1, Conjugação bem-sucedida - TMV Formulado em pH Ácido
Reação 1 Área de (TMV Pico de % de TMV Amostra Formulado TMV Livre em MES a Livre Remanescente 3,1mg/mL) por SEC NtK 284,8 nm 11104 N/A Livre T = 0 154,9 nm 9732 100% T = 5' 139,8 nm 3909 40% T = 15' 142,8 nm 1815 19% T = 30' 149,4 nm 1039 11% T = 45' 155,6 nm 769 8% T = 60' 153,2 nm 777 8% Tabela 8. Reação 2, Conjugação sem sucesso - TMV Formulado em Tampão Fosfato Reação 2 Área de (TMV a Pico de % de TMV Amostra 11,0 mg/mL TMV Livre em Tampão Livre Remanescente Fosfato) por SEC NtK 64,2 nm 27590 N/A Livre T = 0 67,5 nm 14750 100% T = 5' 68,8 nm 14916 101% T = 15' 66,9 nm 13046 88% T = 30' 73,3 nm 11705 79% T = 45' 75,8 nm 8109 55% T = 60' 80,0 nm 11020 75%
[00133] Por conseguinte, como mostrado na Tabela 7, a incubação do vírus em pH ácido resulta em uma conjugação maior que 90%. Se a etapa de incubação em pH ácido não ocorrer, a porcentagem de conjugação permanece menor que 50% (como mostrado na Tabela 8).
[00134] Com base nesse experimento, um modelo para conjugação (mostrado na Fig. 22) foi desenvolvido. De acordo com várias formas de realização e alternativas, a conjugação entre o vírus purificado e o antígeno purificado (denotado por “rHA” na Fig. 22) é bastante intensificada por melhorar a prontidão química do vírus para envolver o antígeno (referido nesse documento como “ativando”, “ativação” ou “ativa”). Em algumas formas de realização, a ativação do vírus ocorre formulando o vírus em um pH ácido antes da reação de conjugação, de modo que a carga positiva se agregue na superfície do vírus. Em algumas formas de realização, a etapa de ativação envolve a exposição do vírus a um pH de cerca de 5,5 ou menos por um período de tempo suficiente para a ativação. Em algumas formas de realização, esse período é entre cerca de 18 e 72 horas. De acordo com várias formas de realização e alternativas, o processamento do vírus purificado em um pH ácido ativa o vírus carregando a proteína de revestimento lisina. Como resultado dessa etapa de ativação, cargas positivas agregam-se na superfície do vírus (como mostrado na Fig. 22) por meio do agrupamento dos grupos amina e o vírus está pronto para a conjugação com a extremidade carboxila do antígeno recombinante.
[00135] As etapas de ativação de vírus, de acordo com várias formas de realização e alternativas, estão em contraste com as abordagens tradicionais nas quais o pH ao armazenar vírus geralmente é mantido em ou próximo a pH neutro. Como mostrado na Fig. 22, a abordagem tradicional não agrega carga positiva na superfície do vírus e, como resultado, a porcentagem de conjugação permanece abaixo de 50% (ver Tabela 8). Além disso, a abordagem convencional utiliza tampões de fosfato que promovem a solubilidade em detrimento de terem carga superficial favorável.
[00136] Durante a investigação de conjugações bem- sucedidas envolvendo TMV, observou-se que as conjugações bem-sucedidas geralmente ocorriam quando o raio medido de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) do vírus aumentou durante a etapa de ativação em pelo menos um fator de 2,75 (ver Tabela 9A, em comparação com a Tabela 9B). Em geral, as conjugações de TMV bem-sucedidas (como discutido na Tabela 9C) foram caracterizadas por um aumento no raio de DLS de cerca de 70 nm para cerca de 195 nm ou mais, como mostrado nessas tabelas.
[00137] Com base na conjugação bem-sucedida que utilizou a ativação do vírus, uma plataforma foi desenvolvida para conjugar o antígeno purificado com o vírus purificado.
De acordo com várias formas de realização e alternativas, as etapas para a preparação do antígeno purificado para conjugação são como a seguir:
para garantir o controle do pH da reação de conjugação, o antígeno purificado é formulado em um tampão de reação imediatamente antes do início da reação.
[00138] Antes da conjugação, os antígenos purificados são armazenados em solução salina tamponada com fosfato em pH neutro a ligeiramente básico.
[00139] O pH alvo do antígeno é tipicamente pH 5,50 a 6,50, dependendo da natureza da molécula.
[00140] Para facilitar a conjugação ao vírus, o tampão de armazenamento é substituído por um tampão de MES/NaCl em pH ácido usando ultrafiltração. A concentração de proteína também é aumentada para mais de 3 mg/mL.
[00141] A reação de conjugação é então iniciada dentro de quatro horas após a conclusão da preparação do antígeno para evitar a desestabilização da estrutura da proteína.
[00142] De acordo com várias formas de realização e alternativas, as etapas para a preparação do vírus purificado para conjugação são como a seguir:
[00143] após o armazenamento em pH neutro, o vírus é ativado em pH ácido antes da conjugação. Para reações bem- sucedidas, o vírus é formulado a partir de tampão fosfato a pH 7,4 em tampão acetato a pH 5,50 por um mínimo de cerca de 18 horas a um máximo de cerca de 72 horas antes do início da reação de conjugação. Em algumas formas de realização, o vírus é formulado a partir de tampão fosfato a pH 7,4 em tampão acetato a pH 4,50 por um mínimo de cerca de 18 horas a um máximo de 72 horas antes do início da reação de conjugação. Foi observado que o armazenamento do vírus por mais de 72 horas em pH ácido cria autoassociação entre os vírus, o que causa insolubilidade do vírus e inibe a eficiência da conjugação.
[00144] As tabelas 9A e 9B demonstram adicionalmente a etapa de ativação em termos de aumento do raio do vírus (nesse caso, TMV) conforme medido por DLS. Especificamente, a Tabela 9A fornece dados para o aumento do raio DLS de TMV após ser ativado, e antes de ocorrer uma conjugação bem- sucedida, com os antígenos listados na coluna da direita. O “Fator pelo qual o raio aumentou” divide o raio do TMV após a ativação pelo raio típico do TMV em pH neutro, que é cerca de 70 nm. Por outro lado, a Tabela 9B fornece dados para o aumento do raio de DLS do TMV após uma etapa de ativação ter sido iniciada, antes de tentativas malsucedidas de conjugação, com os antígenos listados na coluna da direita.
Nas Tabelas 9A e 9B, a coluna da esquerda representa o raio padrão dos bastonetes de TMV em pH neutro e sob condições gerais de armazenamento, isto é, antes de ocorrer qualquer ativação.
Tabela 9A. Raios de TMV livre medidos por DLS (antes da conjugação bem-sucedida)
Raio de TMV em Raio de TMV Fator pelo qual Antígeno pH neutro após a o raio aumentou ativação(nm)
(Resultados de
DLS)
70 nm 195,2 2,789 SG
70 nm 207,2 2,960 SG
70 nm 249,1 3,559 SG
70 nm 249,1 3,559 SG
70 nm 228,6 3,266 SG
70 nm 234,1 3,344 SG
70 nm 234,1 3,344 SG
70 nm 441,3 6,304 SG
70 nm 284,8 4,069 SG
70 nm 517,6 7,394 SG
70 nm 574,0 8,200 SG
70 nm 448,2 6,403 SG
70 nm 209,7 2,966 PH
70 nm 220,4 3,149 PH
70 nm 495,6 7,080 PH
70 nm 517,6 7,394 PH
70 nm 266,8 3,811 CO
70 nm 495,6 7,080 CO
70 nm 517,6 7,394 CO
70 nm 295,4 4,220 MI
70 nm 517,6 7,394 MI
70 nm 574,0 8,200 MI
Média (nm): Fator Médio
413,5 para Aumento:
5,176 Tabela 9B.
Raios de TMV livre medidos por DLS (Antes da conjugação bem-sucedida)
Raio de TMV em Raio de TMV Fator pelo qual Antígeno pH neutro após a o raio aumentou (padrão) ativação(nm) (Resultados de DLS) 70 nm 95,4 1,363 SG 70 nm 105,4 1,506 SG 70 nm 156,0 2,229 SG 70 nm 176,5 2,521 PH Média (nm): Fator médio 133,3 para aumento: 1,905
[00145] Após essas etapas de preparação, o antígeno e os reagentes de vírus foram misturados e o progresso da conjugação foi monitorado usando os métodos de DLS e SDS- PAGE. A Tabela 9C ilustra o raio molecular médio da reação de conjugação ao longo do tempo usando DLS depois que o vírus foi ativado usando pH ácido. Como mostrado na Tabela 9C, o raio molecular é um indicador de revestimento bem-sucedido dos bastonetes virais com moléculas de antígeno.
Tabela 9C. Histórico de SEC e DLS de NtK de TMV Área de Pico de SEC de Raio de DLS NTK solúvel (nm) 10750 496 9651 518 7106 574 5538 660
[00146] Por sua vez, a Fig. 23 mostra uma análise com base no SDS-PAGE da conjugação entre o NtK de TMV ativado e o antígeno purificado de acordo com várias formas de realização e alternativas. Como mostrado na Fig. 23, a redução ordenada em ambos NtK de TMV livre e antígeno livre ao longo do tempo, juntamente com o aparecimento de bandas de proteína de > 200 kDA, indica conjugação bem-sucedida.
Exemplo 10 – Formação de Imagem de TEM de Diferentes Razões de Vírus Purificado para Antígeno Purificado para Conjugação
[00147] A reação de conjugação desejada entre o vírus purificado e o antígeno purificado é representada pela seguinte fórmula: Vírus + Antígeno à Antígeno-Vírus (Fórmula 1)
[00148] No entanto, é bem conhecido que os antígenos são propensos à autoconjugação e a reação desejada pode não ser obtida, como mostrado pela seguinte fórmula: Vírus + Antígeno à Vírus-Antígeno + Antígeno-Antígeno (Fórmula 2)
[00149] A autoconjugação do antígeno purificado é um problema para o desenvolvimento bem-sucedido de vacinas porque os conjugados antígeno-antígeno não são removidos durante a etapa de cromatografia por tamanho e o resultado é uma resposta imunológica minimizada ou reduzida.
[00150] Para resolver esse problema de autoconjugação, vários experimentos foram realizados para determinar como consumir os antígenos não reagidos e os conjugados de antígenos. Primeiro, os antígenos foram capeados, expondo-os a reagentes que inibiam a autoconjugação. Embora fosse antecipado que essa abordagem tradicional teria sucesso, ela falhou porque a reação ocorreu muito rapidamente.
[00151] Em seguida, as razões de vírus para antígeno foram ajustadas para determinar as razões de conjugação adequadas. Como mostrado nas Tabelas 10 e 11 e as Figs. 24- 30, sete amostras diferentes foram analisadas por formação de imagem por microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa (TEM). As amostras 1-3 eram grupos de controle e as amostras 4-7 continham diferentes razões de hemaglutinina (HA) para TMV (na etapa de mistura da plataforma de conjugação, como mostrado na etapa operativa 5 da Tabela 3).
Tabela 10. Amostras de formação de imagem de TEM - Grupos de controle Volume Temp. Amostra Descrição Lote Concentração Aprox.(µl) Armazenada 1,01 mg/ml de 1 HA apenas 19UL-SG-001 100 4°C HA livre 0,54 mg/ml de NtK de TMV 2 18HA-NTK-001 100 4°C NtK de TMV apenas livre Conjugados de HA:HA 3 com NtK de 19UL-SG-004 100 4°C 2,335 mg/ml
TMV adicionados Tabela 11. Amostras de imagem de TEM – Conjugados Amostra Razão Lote Volume Temp. Concentração
Aprox. Armazenada (µl) 4 TMV:HA = 1:1 18TAP-SG-002 100 4°C 5,2 mg/ml 5 TMV:HA = 1:1 19UL-SG-001 100 4°C 1,688 mg/ml 6 TMV:HA = 4:1 19UL-SG-002 100 4°C 1,387 mg/ml 7 TMV:HA = 16:1 19UL-SG-003 100 4°C 3,479 mg/ml
[00152] A Fig. 24 é uma imagem de TEM da amostra 1 (HA livre, lote 19UL-SG-001) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 24, essa amostra continha pequenas setas globulares (indicadas pela seta A) e partículas alongadas (indicadas pela seta B) que variaram de ~5 nm a ~9 nm em tamanho. A aparência dessas partículas mostra uma estrutura regular consistente com agregação ordenada de HA de acordo com a conformação do trímero nativo.
Além disso, as partículas estavam bem dispersadas com ocorrências mínimas de aglomeração.
[00153] A Fig. 25 é uma imagem de TEM da amostra 2 (NtK de apenas TMV, lote 18HA-NTK-001) com uma ampliação de
52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 25, partículas em forma de bastonete (seta A) foram observadas em tamanhos que variam de ~125 nm a ~700 nm de comprimento e ~18 nm a ~20,5 nm de largura. Essas dimensões são consistentes com o tamanho e a forma das partículas de TMV.
Além disso, um canal central de ~4 nm foi observado nos bastonetes (seta B), que é uma característica conhecida do TMV. Múltiplos bastonetes eram frequentemente alinhados paralelos ao seu eixo longo e a superfície dos bastonetes era geralmente lisos. Em algumas ocasiões, pequenas partículas globulares de ~8 nm a ~10 nm (seta C) foram observadas associadas à superfície dos bastonetes e não associadas às partículas em forma de bastonete no fundo.
Essas partículas globulares (seta C) não se assemelhavam a trímeros individuais de HA.
[00154] A Fig. 26 é uma imagem de TEM da amostra 3 (Autoconjugados de HA:HA com NtK de TMV adicionados, lote 19UL-SG-004) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 26, partículas em forma de bastonete foram observadas que variaram de ~25 nm a ~885 nm de comprimento a ~18 nm a ~20,5 nm de largura (seta A) e um canal interno central de ~4 nm (seta B). Os bastonetes não eram decorados de forma alguma ou eram escassamente decorados com pequenas partículas proteicas de vários tamanhos e formas (seta C). Algumas das pequenas partículas proteicas também foram vistas no fundo, não associadas aos bastonetes (seta D). A Fig. 26 ilustra aglomerados maiores de partículas de HA, mas o TMV parece idêntico ao TMV não conjugado (mostrado na Fig. 25) como esperado.
[00155] A Fig. 27 é uma imagem de TEM da amostra 4 (TMV:HA em uma razão de 1:1, lote 18TAP-SG-002) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 27, partículas em forma de bastonete foram observadas que variaram em tamanho de ~50 nm a mais de ~1000 nm de comprimento e ~18 nm a ~20,5 nm de largura (seta A) com um canal interno central de ~4 nm (seta B). Os bastonetes de partículas eram similares em tamanho e forma ao TMV conjugado observado na Fig. 28, com a exceção de que a maioria dos bastonetes estava fortemente decorada com pequenas densidades proteicas em sua superfície (seta C). Algumas das pequenas partículas proteicas também foram vistas no fundo, não associadas aos bastonetes (seta D). A amostra 5 mostrada na Fig. 27 parece superior às outras imagens de TEM, o que provavelmente se deve à diferença no tratamento do vírus antes da conjugação. Para esse lote, o vírus foi formulado em pH 5,50, então o pH foi reduzido para 4,50 por 15 minutos, e trazido de volta para pH 5,50 no início da reação de conjugação. Para os lotes mostrados nas Figs. 28-30, o vírus foi formulado diretamente em pH 4,50 e mantido durante a noite antes da conjugação.
[00156] A Fig. 28 é uma imagem de TEM da amostra 5 (TMV:HA em uma razão de 1:1, lote 19UL-SG-001) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 28, muitas partículas em forma de bastonete eram visíveis que variavam de ~65 nm a ~720 nm de comprimento e ~18 nm a ~20,5 nm de largura (seta A) com um canal interno central de ~4 nm (seta B). Os bastonetes de partículas eram similares em tamanho e forma ao NtK de TMV livre (amostra 2)
observado na Fig. 25. No entanto, em contraste com o vírus não conjugado mostrado na Fig. 25, os bastonetes de partículas observados na Fig. 28 eram moderadamente decorados com densidades proteicas (seta C). Essas densidades eram irregulares em forma e tamanho e pareciam estar aleatoriamente associadas à superfície dos bastonetes sem nenhum padrão óbvio. Algumas das pequenas partículas proteicas também foram vistas no fundo, não associadas aos bastonetes (seta D).
[00157] A Fig. 29 é uma imagem de TEM da amostra 6 (TMV:HA em uma razão de 4:1, lote 19UL-SG-002) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na Fig. 29, partículas em forma de bastonete foram observadas que variaram de ~ 25 nm a mais de ~ 1000 nm de comprimento e ~ 18 nm a ~ 20,5 nm de largura (seta A) com um canal interno central de ~ 4 nm (seta B). Os bastonetes de partículas observados na Fig. 29 eram similares em dimensão às amostras previamente conjugadas, mas o nível de decoração da superfície das pequenas densidades proteicas (seta C) variou de moderada a esparsa. Algumas das pequenas partículas proteicas também foram vistas no fundo, não associadas aos bastonetes (seta D).
[00158] A Fig. 30 é uma imagem de TEM da amostra 7 (TMV:HA em uma razão de 16:1, lote 19UL-SG-003) com uma ampliação de 52.000x e uma barra de escala de 200 nm. Na
Fig. 30, partículas em forma de bastonete foram observadas que variaram em tamanho de ~30 nm a mais de ~1000 nm de comprimento e ~18 nm a ~20,5 nm de largura (seta A) com um canal interno central de ~4 nm (seta B). Os bastonetes de partículas observados na Fig. 30 eram similares em morfologia geral às amostras conjugadas anteriores. No entanto, os bastonetes eram apenas esparsamente decorados com proteína (seta C) ou nem eram decorados. Apenas algumas pequenas partículas proteicas foram vistas no fundo, não associadas aos bastonetes (seta D).
[00159] As Figs. 24-30 ilustram que a razão de 1:1 exibiu decoração de bastonete completa, a razão de 4:1 exibiu decoração moderada e a razão de 16:1 exibiu decoração esparsa. Dito de outra forma, a razão de 1:1 gerou bastonetes de vírus com decoração de antígeno pesada (isto é, mais densidade) de antígeno HA, enquanto a razão de 16:1 gerou bastonetes virais com menos decoração de antígeno (isto é, menos densidade) de antígeno HA em cada bastonete. Como subproduto da reação de conjugação, autoconjugados de HA-HA foram observados, principalmente nas reações de razão 1:1. Além disso, em comparação com as reações 1:1, parecia haver menos HA livre ou conjugados HA-HA na reação 4:1 e ainda menos com a reação 16:1 em imagens de TEM, bem como análises de reação de SDS-PAGE (dados não mostrados). Em outras palavras, houve maior eficiência de conjugação de HA apenas para bastões de TMV em geral na razão de 16:1, mas menos densidade de HA por bastonete do que a reação de 1:1.
Exemplo 11 - Análise de Velocidade de Sedimentação de Diferentes Condições de Conjugação
[00160] A velocidade de sedimentação (“SV”), medida em uma ultracentrífuga analítica (“AUC”), é um método ideal para obter informações sobre a heterogeneidade da proteína e o estado de associação de agregação. Especificamente, agregados ou diferentes oligômeros podem ser detectados com base em diferentes coeficientes de sedimentação. Esse método também detecta agregados ou outros componentes secundários em um nível abaixo de 1% em peso. Além disso, a SV fornece quantificação de alta qualidade das quantidades relativas de espécies e fornece coeficientes de sedimentação precisos para quaisquer agregados.
[00161] A fim de medir a quantidade de HA autoconjugado e não reagido, bem como a quantidade de ocupação de HA em NtK de TMV com diferentes condições de conjugação, o sinal total associado à sedimentação de antígeno livre, vírus livre e várias razões de TMV:HA foram medidas usando SV-AUC. Os seguintes exemplos e descrições são fornecidos na Tabela 12: Tabela 12. Amostras e Descrições para SV-AUC
Amostra Descrição Lote Concentração 1 HA apenas 19S-G-001 1.01 mg/ml Ntk de TMV 2 18HA-NTK-001 0.54 mg/ml Apenas 3 TMV:HA = 1:1 19UL-SG-004 1.0 mg/ml 4 TMV:HA = 1:1 18TAP-SG-002 1.0 mg/ml 5 TMV:HA = 1:1 19UL-SG-001 0.8 mg/ml 6 TMV:HA = 4:1 19UL-SG-002 1.0 mg/ml 7 TMV:HA = 16:1 19UL-SG-003 1.0 mg/ml
[00162] Essas cargas foram enviadas frias (não congeladas) e subsequentemente armazenadas a 2-8 °C até serem analisadas. 1X PBS da Corning foi usado para diluição da amostra e como branco de referência. A amostra 1 foi diluída e 1:1 e as amostras 2-7 foram diluídas 1:3 com 1X PBS para criar as amostras de velocidade de sedimentação. Essas diluições foram realizadas para trazer a absorbância total da amostra dentro da faixa linear do sistema de detecção de absorbância.
[00163] Métodos - As amostras diluídas foram carregadas em células com peças centrais de carvão vegetal de 2 canais com comprimento de trajeto óptico de 12 mm. 1X PBS foi carregado no canal de referência de cada célula. As células carregadas foram colocadas em um rotor analítico, carregadas em uma ultracentrífuga analítica e trazidas a 20 °C. O rotor foi então levado a 3000 rpm e as amostras foram escaneadas (a 280 nm) para confirmar o carregamento adequado das células. Para as amostras 2-7, o rotor foi levado à velocidade final de funcionamento de 9.000 rpm. As varreduras foram registradas nessa velocidade do rotor o mais rápido possível (a cada 3 minutos) por ~11 horas (250 varreduras no total para cada amostra). Para a amostra 1 (HA livre), o rotor foi levado a 35.000 rpm e as varreduras foram registradas a cada 4 min por 5,3 horas. Os dados foram então analisados usando o método c(s) descrito em Schuck, P.
(2000), “Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling,” Biophys. J. 78, 1606-1619. Usando esse método, as varreduras brutas foram ajustadas diretamente para derivar a distribuição dos coeficientes de sedimentação, enquanto modelam a influência da difusão nos dados para intensificar a resolução.
[00164] Resultados e discussão - As distribuições do coeficiente de sedimentação de alta resolução para as amostras 1-7 são mostradas nas Figuras 31-37. Nessas figuras, o eixo vertical fornece a concentração e o eixo horizontal fornece a separação com base no coeficiente de sedimentação.
Cada distribuição foi normalizada definindo a área total sob a curva para 1,0 (100%) para garantir que a área sob cada pico forneça a fração daquela espécie. Uma vez que as amostras 2-7 contêm material que sedimenta em uma ampla faixa de coeficientes de sedimentação, a análise de dados foi empurrada para cobrir espécies que sedimentam tão rápido quanto 2.000 unidades de Svedburg (S) e, portanto, o eixo horizontal está em uma escala logarítmica. Para compensar o efeito de que a escala logarítmica pode distorcer a área visível dos picos, o eixo vertical foi multiplicado pelo coeficiente de sedimentação, que dimensiona corretamente as áreas relativas dos picos. Os dados da amostra 1 (HA livre) são apresentados tradicionalmente por meio de uma escala de coeficiente de sedimentação linear.
[00165] A Fig. 31 é a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada para a amostra 1 (apenas HA, lote 19S-G-001). Como o antígeno livre é muito menor em tamanho do que o vírus, essa amostra foi analisada a uma velocidade de rotor muito mais rápida (35.000 rpm) do que as amostras 2-7 (9.000 RPM) de modo a caracterizar adequadamente a distribuição de tamanho. Como mostrado na Fig. 31, a amostra 1 é um tanto homogênea, fornecendo 73,7% do pico principal em 8,967 S. Esse era o resultado esperado para a amostra apenas com antígeno HA. Esse coeficiente de sedimentação, juntamente com a largura do limite principal, implica que esta espécie de pico principal tem uma massa molar de ~222 kDa, o que pode indicar que o pico principal corresponde a aproximadamente um trímero de HA do monômero de ~70 kDa esperado. Não é fisicamente possível que esse coeficiente de sedimentação corresponda ao monômero; em vez disso, o pico principal corresponde a um estado oligomérico maior do que o monômero. Como observado na Tabela 13 abaixo, os dados da
HPLC SEC no lançamento do HA3 em Singapura,> 90% do HA foi identificado no estado de trímero, com 3 das 4 amostras analisadas tendo mais do que 50% de trimerização.
Tabela 13. Extensão da trimerização Antígeno Número do Trímero Monômero Lote Pré-Clínico lote de HA de SEC % de SEC % B/Colorado 18TAP-CO-001 18HA-CO-003 55,05% 44,95% A/Michigan 18TAP-MH-002 18HA-MH-007 11,93% 88,07% B/Phuket 18TAP-PH-002 18HA-PH-003 84,51% 15,49% A/Singapura 18TAP-SG-002 18HA-SG-003 94,52% 3,90%
[00166] Como também mostrado na Fig. 31, sete picos menores, sedimentando mais rápido do que o pico principal, foram detectados, os quais juntos representam 6,2% da absorbância total de sedimentação. Presumivelmente, esses dois picos representam agregados de produto em vez de impurezas de alto peso molecular. A principal espécie agregada a 12,4 S (4,25%) está sedimentando 1,4 vezes mais rápido do que o monômero, uma razão que cai na faixa de 1,4 a 1,5 geralmente observada para dímeros. Embora essa razão sugira que esta espécie é um dímero do material do pico principal (possivelmente um hexâmero do monômero de ~70 kDa), seu coeficiente de sedimentação também pode sugerir que é um trímero altamente estendido ou parcialmente desdobrado do material do pico principal (possivelmente um nonâmero do monômero de ~70 kDa).
[00167] Na Fig. 31, o próximo pico em 15,3 S (0,96%) está sedimentando 1,7x mais rápido do que o monômero, o que sugere um trímero do material do pico principal. Nenhuma absorbância foi detectada para qualquer coeficiente de sedimentação maior que 30,9 S. Além disso, três picos menores sedimentando mais lentamente do que o pico principal, também foram detectados em 2,8 S (2,81%), 4,5 S (12,44%) e 6,0 S (4,94%). desses picos menores, o pico em 4,5 S provavelmente corresponde ao monômero do antígeno.
[00168] A Fig. 32 é a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada para a amostra 2 (NtK de TMV livre, lote 18HA-NTK-001). Como mostrado na Fig. 32, nenhum material de sedimentação foi detectado abaixo de ~60 S.
Essa amostra parecia bastante heterogênea, com o pico de sedimentação mais abundante em 229 S (30,9%). O segundo pico mais abundante foi detectado em 191 S (28,7%). Não está claro qual pico corresponde ao vírus totalmente montado. Além disso, 25,3% do sinal total foram observados sedimentando de 229 S a 2.000 S, o maior coeficiente de sedimentação permitido nesse Exemplo 11. Não está claro o que os picos parcialmente resolvidos de ~60 S a 2000 S representam.
[00169] As Figs. 33-37 mostram a distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação para conjugados vírus-antígeno. Cada uma dessas figuras mostra uma absorbância significativa de cerca de 0,15 DO que não sedimentou. Isso foi estabelecido aumentando a velocidade do rotor para 35.000 RPM após a conclusão de cada ciclo, a fim de peletizar todo o material restante. Esse material não foi observado nem no antígeno livre nem nas amostras livres de NtK de TMV. No entanto, como esse material não sedimentou, ele não afetou os resultados das distribuições de tamanho medidas.
[00170] A Fig. 33 é a distribuição normalizada do coeficiente de sedimentação para a amostra 3 (TMV para HA na razão de 1:1, lote 19UL-SG-004). Como ilustrado na Fig. 33, os resultados no coeficiente de sedimentação variam de cerca de 40 S a 2000 S, e são semelhantes aos observados para vírus livre (mostrado na Fig. 33). Três picos também foram observados na faixa do coeficiente de sedimentação de 1 - 40 S: 9,9 S (28,3%), 18,7 S (7,8%) e 34,5 S (1,0%). O pico observado em 9,9 S pode corresponder ao pico principal observado na amostra de HA livre (mostrado na Fig. 32). A variedade de picos menores pode refletir eventos de autoconjugação de HA-HA.
[00171] A Fig. 34 é a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada para a amostra 4 (TMV para HA na razão de 1:1, lote 18TAP-SG-002) e a Fig. 35 é a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada para a amostra 5 (TMV para HA em razão de 1:1, lote 19UL-SG-001). Os resultados mostrados nas Figs. 34 e 35 são similares aos discutidos para a amostra 3 (e mostrados na Fig. 33). No entanto, algumas diferenças notáveis foram observadas. Em primeiro lugar, é difícil comentar sobre as diferenças observadas para a amostra de antígeno livre (de 1 - 40 S) devido à baixa resolução nessa velocidade do rotor. No entanto, as Figs. 34 e 35 mostram mais sinal total presente de 40 S - 2.000 S (o que é indicativo de material associado a vírus) do que a amostra 3.
[00172] A Fig. 36 é a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada para a amostra 6 (TMV para HA em uma razão de 4:1, lote 19UL-SG-002), e a Fig. 37 é o coeficiente de sedimentação normalizado para a amostra 7 (TMV para HA em uma razão de 16:1, lote 19UL-SG-003). A Fig.
36 mostra 91,1% do material total associado ao vírus (isto é, conjugados de vírus-antígeno) e a Fig. 37 mostra 99,4% do material associado ao vírus (isto é, conjugados de vírus- antígeno).
[00173] Os resultados para a distribuição do coeficiente de sedimentação normalizada do antígeno de vírus, como mostrado nas Figs. 33-37, são apresentados na Tabela 14. Como observado anteriormente, a fração entre 1 - 40 S indica a porcentagem de monômero/trímero de HA, e a fração entre 40 - 2000 S indica a porcentagem de conjugado NtK de TMV-HA, de acordo com múltiplas formas de realização e alternativas.
Tabela 14. Resultados de SV-AUC dos Diferentes Conjugados de
Vírus-Antígeno Fração Entre 1-40 Fração Entre S (%) 40-2000 S (%) Amostra Lote Razão (monômero/ (Conjugado de trímero de NtK de TMV-HA) HA) 3 19UL-SG-004 1:1 37,1 62,9 4 18TAP-SG-002 1:1 26,1 73,9 5 19UL-SG-001 1:1 31,4 68,6 6 19UL-SG-002 4:1 11,2 91,1 7 19UL-SG-003 16:1 0,6 99,4
[00174] Os resultados na Tabela 14 indicam que uma razão de 1:1 tem mais autoconjugação de HA e produtos de HA, em comparação com as razões de 4:1 e 16:1. Além disso, o aumento da proporção TMV:HA resulta no envolvimento virtualmente completo de produtos de HA em eventos de conjugação de TMV (aproximando-se de quase 100% de conjugação na amostra 7).
[00175] De acordo com várias formas de realização e alternativas, diminuir a quantidade de HA em uma reação de conjugação, aumentando a razão NtK de TMV para HA de 1:1 para 16:1, resulta em: (1) redução da agregação do antígeno HA em cada bastonete de TMV, conforme observado no Exemplo 10 e nas Figs. 24-30; (2) diminuir a quantidade de autoconjugação e eventos de HA não reagidos para quase zero, como mostrado pelas Figs. 31-37 e Tabela 14; e (3) aumentar a associação de HA (como uma porcentagem) a TMV em comparação com a autoconjugação e eventos de HA não reagidos, como mostrado pelas Figs. 31-37 e Tabela 14.
Exemplo 12 - Resposta imunológica em Camundongos
[00176] Para determinar a resposta imunológica após a administração dos conjugados de vírus-antígeno da invenção, os camundongos foram administrados como vacinas por meio de injeção intramuscular. Cada vacina era um conjugado de TMV:HA produzido em uma razão de 1:1 (TMV:HA) como descrito nesse documento, administrado à maioria dos animais nos Dias 0 e 14 do estudo (animais de controle receberam apenas dom tampão, apenas TMV, ou apenas HA). As vacinas administradas receberam 15; 7,5 ou 3,75 mcg (microgramas) de antígeno, como mostrado abaixo na Tabela 15. Uma coorte teve amostras colhidas no Dia 7, outra nos Dias 14 e 21, e uma terceira nos Dias 28, 42, e 90, com as amostras então submetidas ao ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI).
[00177] Com base no ensaio, nenhuma resposta mensurável de qualquer animal para qualquer vacina ocorreu nos dias 7 ou 14.
No entanto, as respostas iniciais foram vistas em alguns animais no dia 21. Especificamente, 10/27 animais mostraram respostas de baixo nível (apenas 1 deles >80 títulos de HAI) para a vacina H1N1 (Influenza A/Michigan/45/2015 (H1N1pdm09)).
Além disso, 22/27 mostraram respostas de baixo nível (apenas 2 deles >80) para a vacina H3N2 (Influenza A/Singapura/INFIMH- 16-0019/2016). No Dia 28, o número de animais dentro dessa coorte respondendo de forma mensurável à vacina contra H1N1 foi de 8/29 com um único animal com títulos de 80 de HAI e todos os outros menos. Para a vacina contra H3N2, o número de respostas mensuráveis foi 14/29, também com um único animal com títulos de 80 de HAI e todos os outros menos.
[00178] Os resultados mais pronunciados foram observados a partir de amostras de sangue colhidas no Dia 42 e Dia 90, que são apresentadas na Tabela 15, abaixo. Nessa tabela, um erro padrão da média (SEM) é fornecido com a média e a fração de animais que respondem (Fr. Resp.). Será notado que em cada coorte, alguns dos camundongos receberam vacinas para o vírus Influenza B (B/Colorado/06/2017 (V) e B/Phuket/3073/2013 (Y), respectivamente). Nenhuma resposta foi detectada nesses animais em qualquer um dos dias, como esperado porque os vírus da gripe do tipo B e os imunógenos de HA correspondentes são conhecidos por não gerar títulos de HAI em camundongos com a eficiência e eficácia como imunógenos HA do tipo A.
Tabela 15. Resposta imunológica com base na dose e no tempo pós-vacinação Dia 42 Dia 90 Títulos de HAI Médios Títulos de HAI Médios Imunógeno H1N1 Fr. H3N2 Fr. H1N1 Fr. H3N2 Fr. Resp. Resp. Resp. Resp.
1. Apenas 0 0 0 0 0 0 0 0 veículo
2. Apenas 0 0 0 0 0 0 0 0 TMV: 15 mcg
3. HA Quad 15 0 0 0 0 0 0 0 0 mcg
4.HA Quad 7,5 0 0 0 0 0 0 0 0 mcg
Dia 42 Dia 90 Títulos de HAI Médios Títulos de HAI Médios Imunógeno H1N1 Fr. H3N2 Fr. H1N1 Fr. H3N2 Fr. Resp. Resp. Resp. Resp.
5.HA Quad 0 0 0 0 0 0 0 0 3,75 mcg
6.V-HA Quad 20± 7/10 27± 8/10 274± 10/10 136± 10/10 15 mcg 5,477 7,218 66,336 33,442
7.V-HA Quad 26± 9/10 22± 6/10 174± 9/10 84± 45,77 6/10
7.5 mcg 4,733 9,466 40,797
8.V-HA Quad 19± 7/9 17± 6/9 224± 8/9 40 ± 7/9 3,75 mcg 4,566 4,969 62,993 10,423
[00179] Separado do estudo de resposta imunológica descrito anteriormente, e para avaliar ainda mais o sistema da invenção em termos de razões de vírus e antígenos adequadas, a resposta imunológica humoral em camundongos foi avaliada após vacinação em várias razões de conjugado de TMV:HA (isto é, 1:1, 4:1, 16:1) de ambos os antígenos Influenza A e Influenza B, juntamente com os controles, como observado abaixo. Dessa forma, várias razões de conjugação e seus efeitos sobre a resposta imunológica foram estudados.
Os camundongos que receberam a vacinação foram administrados com 15 mcg de HA por injeção no Dia 0 e no Dia 14 do estudo, em uma região subcutânea dorsalmente. As respostas dos anticorpos séricos à vacinação foram então analisadas quanto à atividade específica de HA. As tabelas 15 (vírus da gripe H3 usado como proteína de captura) e 16 (proteína H3 recombinante usada como proteína de captura) mostram os agrupamentos de camundongos (12 camundongos por agrupamento) e os agentes que foram administrados, com a coluna da direita em cada tabela apresentando resultados de títulos de anticorpos (Ab) de ELISA.
Tabela 16. Estudo da razão de TMV:HA – HA de influenza tipo A.
Grupamento Vacina Razão de Título de Ab conjugação por ELISA (TMV:Antígeno) Médio
1. Solução tamponada por n/a 0 fosfato
2. TMV-H3 H3 HA:HA 0
3. TMV-H3 1:1 0
4. TMV-H3 4:1 120
5. TMV-H3 16:1 200
[00180] A Figura 38 é um gráfico de dispersão associado à Tabela 16, que fornece uma análise gráfica dos títulos de Ab H3:HA após a administração da vacina em razões de 0,1:1, 4:1 e 16:1 (TMV:HA). A Figura 39 também ilustra graficamente os resultados do teste de média geométrica de títulos de Ab relevantes para o antígeno, usando o antígeno H3 recombinante (Tabela 17) como revestimento ou vírus H3 de captura como proteína de captura (Tabela 17) que se liga ao anticorpo antígeno H3 da Influenza A. Em termos de densidade (área superficial de TMV ocupada por HA), a tendência para as três razões progride de 1:1 (mais densa)>4:1>16:1 (menos densa), como demonstrado pelas análises TEM e AUC. Nessas figuras que representam os resultados de ELISA obtidos com o antígeno H3, a resposta imunológica mais elevada foi observada com o conjugado menos denso. Isto é, a tendência para a resposta imunológica foi
16:1> 4:1> 1:1 e foi ao contrário da tendência para a densidade. Assim, surpreendentemente, foi encontrado nessas razões para TMV:HA, menor densidade de conjugação tendeu a fornecer melhor resposta imunológica. As possíveis explicações para esta descoberta surpreendente de que a antigenicidade não se correlaciona com eventos de conjugação de HA máximos incluem: (1) antígeno mais uniforme com menos ou nenhuma proteína não reagida ou autoconjugada quando a densidade é comparativamente mais baixa; (2) poderia haver processamento mais eficiente do antígeno conjugado e conformação do antígeno mais preservada/uniforme; e (3) os bastonetes de TMV (a título de exemplo) podem estimular mais células apresentadoras de antígeno a migrarem para o local da injeção e estimular o processamento do antígeno ligado, ou alguma combinação desses fatores. Observe, no entanto, que apenas a presença de partículas de TMV não substitui a necessidade de conjugação (ver, por exemplo, Tabelas 14 e 15).
[00181] Além do antígeno H3 de Influenza A, o antígeno de Influenza B também foi estudado (B-Phuket HA) usando a propensão de ligação do antígeno de Influenza B Phuket recombinante e seu anticorpo correspondente. A Tabela 17, abaixo, apresenta os resultados dessa parte do estudo que não é tão claro de uma exibição de 16:1> 4:1> 1:1 com base nos resultados dos títulos de Ab por ELISA médios.
Tabela 17. Estudo da razão de TMV:HA - HA de influenza tipo B.
Grupamento Vacina Razão de Título de Ab conjugação por ELISA (TMV:Antígeno) Médio
1. Solução tamponada por n/a 0 fosfato
2. TMV-B HA de B Phuket:HA 283±
3. TMV-B 1:1 211±
4. TMV-B 4:1 56±
5. TMV-B 16:1 329±
[00182] Mesmo assim, a razão de 16:1 demonstrou o maior título médio de anticorpos. Assim, os inventores acreditam que é razoável prever que a mesma relação entre a densidade e a resposta imunológica se aplica ao estudo do Antígeno de Influenza B (B-Phuket HA). Ou seja, como com os resultados do antígeno H3, a resposta imunológica será maior para formas menos densas dos conjugados. Adicionalmente, há razões para acreditar que a reação de conjugação para a razão de 4:1 não ocorreu como as reações para as outras razões devido a possíveis anormalidades durante a conjugação e ao fato de que nem microscopia eletrônica nem análise de ultracentrifugação foram realizadas nessa amostra. Em qualquer caso, os dados mostram nesse documento resposta imunológica em todas as três razões. O fato de que a resposta imunológica foi alcançada em razões múltiplas ressalta a robustez do sistema por não estar vinculado a nenhuma razão particular. Essa flexibilidade, como vista com as vacinas conjugadas com TMV particulares, provavelmente dá uma indicação adicional de que o sistema funcionará bem tanto quando outros antígenos são conjugados ao TMV além dos antígenos H3 e H1 incluídos nesses estudos, quanto quando outros portadores de vírus além do TMV são usados para o portador.
[00183] Em termos de utilidade clínica, um produto conjugado de acordo com qualquer uma das múltiplas formas de realização e alternativas descritas nesse documento pode ser utilizado como uma vacina através da dispensação do antígeno purificado por meio de um vírus purificado, tal como, mas não limitado aos conjugados de vírus-antígeno descritos nos Exemplos 7, 9, 10, 11 e 12. Ainda mais, as formas de realização da presente divulgação incluem quaisquer produtos de vacina acondicionados em qualquer número de formas (por exemplo, frasco) com tampões e aditivos apropriados, sendo fabricados a partir de quaisquer composições de conjugado de vírus- proteína, das quais a conjugação é fornecida nesse documento. A esse respeito, as formas de realização incluem aquelas em que tais produtos de vacina são passíveis de dispensação na forma de doses unitárias fornecidas a um paciente humano ou animal, tais como, mas não se limitando à, administração por seringa ou spray através de vias que incluem, mas não estão limitadas à, administração subcutânea, intramuscular, intradérmica e nasal, bem como administração oral pela boca e/ou tópica, na medida clinicamente indicada. A título de exemplo não limitativo, e sem prejudicar a amplitude e o escopo das formas de realização nesse documento, o tamanho do TMV (normalmente 18 nm x 300 nm) e sua forma semelhante a um bastonete promove a absorção de antígeno pelas células apresentadoras de antígeno (APCs), e assim serve para intensificar a imunidade de células T (tais como Th1 e Th2) e fornece atividade adjuvante para proteínas de subunidade de superfície conjugada. Essa atividade também é estimulada por meio da interação viral de RNA/TLR7. Como resultado, o efeito combinado da absorção da vacina estimula diretamente a ativação das APCs. A imunidade humoral é tipicamente balanceada entre as subclasses de IgG1 e IgG2 por meio de dispensação subcutânea e intranasal. Após a dispensação da vacina na mucosa, as respostas também incluem IgA sistêmica e mucosal substancial. A imunidade celular também é muito robusta, induzindo secreção específica do antígeno, similar a uma resposta à infecção por vírus vivo. As fusões de antígenos inteiros permitem o processamento de epítopos de linfócitos T citotóxicos nativos (CTL), sem preocupação com a variação do antígeno leucocitário humano (HLA).
[00184] As respostas imunológicas amplas (humoral e celular) e aumentadas (amplitude e eficácia) associadas à plataforma de purificação de multiconjuntos de acordo com as formas de realização atuais estão em nítido contraste com as proteínas de subunidade testadas sem conjugação de TMV, que induzem pouco ou nenhum celular ou imunidade humoral. O impacto dessas respostas imunológicas é que as vacinas criadas por meio da plataforma de multiconjuntos, de acordo com as formas de realização atuais, promovem respostas altamente protetoras como vacinas de dose única e oferecem velocidade e segurança não oferecidas por outras plataformas de vacinas convencionais. Na verdade, a plataforma de conjugação é mostrada para funcionar em uma ampla variedade de vírus e proteínas (incluindo antígenos), combinados dentro de uma ampla faixa de razões e administrados com sucesso em várias doses, o que novamente é indicativo da robustez do sistema. As vantagens adicionais da plataforma de multiconjuntos para a produção de vacinas nas formas de realização atuais incluem: uma abordagem de estimulação de antígeno proativa para proteção imunológica sistêmica contra o desafio de patógenos, a plataforma é altamente adaptável para produzir domínios antigênicos de patógenos de doenças (incluindo glicoproteínas de vírus ou antígenos de patógenos não secretados), e a plataforma serve como uma plataforma de vacina eficaz para vírus e patógenos bacterianos.
[00185] Além das vantagens em relação às aplicações de vacinas, as partículas de vírus de plantas purificadas por meio da plataforma de multiconjuntos de acordo com as formas de realização atuais podem ser formuladas para vários fins de dispensação de fármacos. Esses diferentes propósitos podem incluir: 1) terapia imunológica - por meio da conjugação de anticorpos terapêuticos à superfície de partículas de vírus e sua distribuição para intensificar o efeito citotóxico; 2) terapia gênica - por meio do carregamento de ácidos nucleicos específicos para introdução em determinados tipos de células para modificação genética, e 3) administração de fármacos - por meio do carregamento de agentes quimioterápicos em partículas de vírus para a dispensação direcionada ao tumor.
[00186] Como um breve exemplo das muitas vantagens dos métodos discutidos nesse documento, a plataforma de multiconjuntos de acordo com múltiplas formas de realização pode ser utilizada como uma ferramenta de dispensação de fármacos, primeiro fazendo com que o vírus purificado inche expondo-o a uma mudança de pH como discutido acima.
Subsequentemente, o vírus nessa condição seria incubado com uma solução de agente quimioterápico concentrado, tal como a doxorrubicina, e o pH é então revertido para neutro, fazendo com que o vírus retorne ao seu estado pré-inchado e, assim, aprisionando as moléculas quimioterápicas. Em seguida, a partícula de vírus pode ser dispensada a um organismo por um mecanismo de dispensação escolhido de um grupo que inclui, mas não está necessariamente limitado à, injeção para tratamento direcionado a tumores.
[00187] Adicionalmente, as formas de realização contidas nesse documento incluem aquelas em que uma separação de contaminantes da célula hospedeira da(o) proteína ou antígeno é realizada por cromatografia por troca iônica ou outras etapas de separação química, e nenhum método para separação está especificamente associado a qualquer proteína, antígeno ou vírus.
As formas de realização nesse documento, tanto quanto aos(às) métodos e composições,
incluem aquelas em que o vírus é escolhido do grupo que consiste em vírus do mosaico do trevo vermelho; vírus do mosaico amarelo de commelina, vírus do mosaico da couve-
flor, vírus do mosaico clorótico da soja, vírus do mosaico da veia da mandioca, vírus do tungro do arroz baciliforme,
vírus de palidez da veia da petúnia, vírus da risca do milho,
vírus do topo crespo da beterraba, vírus do mosaico dourado do feijão, vírus do mosaico da alfafa, vírus da estria do tabaco, vírus do mosaico do capim bromo, vírus do mosaico do pepino, vírus do amarelo da beterraba, vírus amarelo infeccioso da alface, vírus do mosaico do feijão-caupi, vírus da murcha da fava 1, vírus da mancha anelar do tabaco, vírus da batata Y, vírus do mosaico do azevém, vírus do mosaico amarelo da cevada, vírus da mancha amarela da Pastinaca,
vírus esférico do tungro do arroz, vírus da mancha de cravo,
vírus da mancha anelar de cravo, vírus da mancha clorótica do milho, vírus da necrose do tabaco, vírus do emanjericado do tomateiro, vírus do acanalamento do tronco da macieira, vírus latente do cravo, vírus do mosaico da ervilha, vírus do mosaico do trigo transmitido pelo solo, virus do mosaico estriado da cevada, vírus do nanismo arbustivo da framboesa, vírus do nanismo amarelo da cevada, vírus do raiado fino do milho, vírus X da batata, vírus do mosaico do trevo, vírus do mosaico do feijão do sul, vírus do estriado do arroz, vírus do mosaico do tabaco, vírus do chocalho do tabaco, vírus da mancha clorótica da folha da maçã, vírus do mosaico amarelo do nabo, vírus da mancha da cenoura.
[00188] Em algumas formas de realização, por exemplo, com o vírus sendo um TMV, tendo um raio, a proteína pode ser um antígeno (incluindo, sem limitação, HA), e a etapa de misturar o vírus e o antígeno é realizada após o raio de TMV ter aumentado por pelo menos um fator de 2,75 durante a etapa de ativação. Alternativamente, e novamente sem limitação, a etapa de mistura do vírus e do antígeno é realizada após o raio do TMV ter aumentado para pelo menos cerca de 195 nm durante a etapa de ativação. Em resumo, para fins de métodos, composições e produtos de vacina, qualquer e todas as combinações, variações e alternativas viáveis são englobadas na presente divulgação.
[00189] Por conseguinte, as descrições acima oferecem múltiplas formas de realização e uma série de abordagens alternativas para (i) a fabricação à base de plantas e purificação de vírus; (ii) a fabricação baseada em plantas e a purificação de antígenos; e (iii) a formação de conjugados de vírus-antígeno fora da planta que são terapeuticamente benéficos como vacinas e carreadores de antígeno; e (iv) a dispensação de vacinas terapêuticas compreendendo um vírus purificado e um antígeno purificado.
[00190] Será entendido que as formas de realização descritas nesse documento não são limitadas em sua aplicação aos detalhes dos ensinamentos e das descrições estabelecido(a)s, ou conforme ilustrado nas figuras anexas.
Em vez disso, será entendido que as presentes formas de realização e alternativas, conforme descritas e reivindicadas nesse documento, são capazes de ser praticadas ou realizadas de várias maneiras. Além disso, deve ser entendido que as palavras e expressões usadas nesse documento são para fins de descrição e não devem ser consideradas como limitantes. O uso nesse documento de “incluindo”, “compreendendo”, “por exemplo”, “contendo” ou “tendo” e variações dessas palavras destina-se a abranger os itens listados a seguir e seus equivalentes, bem como itens adicionais.
[00191] Por conseguinte, as descrições anteriores de várias formas de realização e alternativas têm como objetivo ilustrar, em vez de servir como limites no escopo do que foi divulgado nesse documento. As descrições nesse documento não pretendem ser exaustivas, nem pretendem limitar a compreensão das formas de realização às formas precisas divulgadas.
Será entendido por aqueles habilitados comuns na técnica que modificações e variações dessas formas de realização são razoavelmente possíveis à luz dos ensinamentos e das descrições acima.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para conjugar uma proteína e um vírus, caracterizado pelo fato de que compreende: ativar um vírus pela localização do vírus em um ambiente a um pH de cerca de 5,5 ou menos; e misturar o vírus e uma proteína após a etapa de ativação em uma reação de conjugação para formar uma mistura de conjugado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de ativação do vírus compreende adicionalmente a modificação química dos resíduos de lisina expostos à superfície no vírus para facilitar a conjugação direcionada à amina da proteína, e em que a etapa de ativação do vírus é conduzida em um tampão por um período de tempo entre cerca de 18 horas e cerca de 72 horas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína é um antígeno e compreende adicionalmente a preparação do antígeno por subetapas de purificação do antígeno e exposição do antígeno a um pH de cerca de 6,5 ou menos antes da etapa de mistura.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a colheita do antígeno de um antígeno de origem, em que a purificação do antígeno compreende a remoção de detritos celulares do antígeno, concentrando o antígeno, realizando pelo menos uma separação química para separar contaminantes da célula hospedeira do antígeno, submetendo o antígeno para cromatografia por afinidade para eluir o antígeno, e submetendo o antígeno a cromatografia multimodal para separar as impurezas residuais do antígeno com base nas diferenças de tamanho entre as impurezas como retido e o antígeno como permeado.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente passar o vírus através de um aparelho de filtração de fluxo tangencial que compreende um filtro poroso para purificar o vírus e passar o pelo menos um vírus através de um dispositivo de filtração com membra que compreende uma membrana porosa para concentrar o vírus.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína é um antígeno que compreende um antígeno de hemaglutinina de influenza (HA) e o vírus é um vírus do mosaico do tabaco (TMV).
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o TMV e HA são misturados a uma razão de pelo menos cerca de 4:1.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o TMV e HA são misturados em uma razão entre cerca de 1:1 e 4:1.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente extinguir a reação de conjugação usando pelo menos um líquido contendo aminas livres.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente, após a etapa de extinção, a separação de impurezas residuais da mistura de conjugado com base nas diferenças de tamanho entre as impurezas como retido e a mistura de conjugado como permeado.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a reação de conjugação atinge pelo menos cerca de 50% de redução na proteína de revestimento do vírus de peso molecular nativo não conjugada.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o vírus é TMV e o TMV tem um raio, e a etapa de misturar o vírus e a proteína é realizada após o raio do TMV ter aumentado em pelo menos um fator de 2,75 durante a etapa de ativação.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o vírus é TMV e o TMV tem um raio, e a etapa de misturar o vírus e a proteína é realizada após o raio do TMV ter aumentado para pelo menos cerca de 195 nm durante a etapa de ativação.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado de vírus-antígeno, em que o antígeno compreende um antígeno de hemaglutinina (HA) de influenza e exibe pelo menos cerca de 50% de formação de trímero.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus do mosaico do tabaco (TMV).
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