JPS60172932A - グリコシド含有キヤリアに結合した抗原決定基からなる免疫原の製造 - Google Patents

グリコシド含有キヤリアに結合した抗原決定基からなる免疫原の製造

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JPS60172932A
JPS60172932A JP59221892A JP22189284A JPS60172932A JP S60172932 A JPS60172932 A JP S60172932A JP 59221892 A JP59221892 A JP 59221892A JP 22189284 A JP22189284 A JP 22189284A JP S60172932 A JPS60172932 A JP S60172932A
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ニコラース・フイツセール
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Akzo NV
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キャリアに結合している抗原決定基からなる
免疫原の製法及びこれらの免疫原を含むワクチンに係る
。
ウィルス、バクテリア、寄生体等の病原性有機体による
感染からヒト及び動物を保護するために、免疫化が広く
行なわれている。長期間に亘り保護が持続する能動免疫
化が好ましい。能動免疫化は、病原性有機体の抗原を保
護すべき各個体に投与することによって行なわれる。は
とんどの場合、これは病原体の不活化又は弱毒化株を接
種することによりなされる。不活化株の接種の場合には
、この不活化の過程で生起する抗原の部分的変性のため
免疫化力がむしろ低い場合が多い。病原菌の弱毒化株の
接種の場合には、これらの株の成る種の病原性の危険が
残る。
それ故、より安全で且つより効果的な能動免疫化法が望
まれている。１つの可能性は、例えば、完全な病原性有
機体の替わりに抗原だけを専ら含む調製物を接種するこ
とである。この場合、精製度を極めて高くすること及び
特に例えばウィルス遺伝物質を安全に除去することがし
ばしば困難である。最近、抗原の一次及び空間構造に関
する情報が増え続けるとともに、能動免疫用免疫原とし
て、可能な限り小さい抗原フラグメン１−すなわちいわ
ゆる抗原決定基を利用する方法がめられている。抗原決
定基は抗原の一部であり、該抗原に対する特定タイプの
免疫グロブリンを認識する部位として作用する。完全抗
原の分割により得られるこのような小さいフラグメント
は抗原そのものを精製するよりも精製が簡単である場合
が多い。またこのような小さいフラグメントは合成調製
ができるほどに充分小さい。
しかしながら、遊離的に溶解している抗原決定基を接種
すると、免疫化レベルが非常に低い。
抗原決定基をキ鬼アリアに結合させた免疫原を接種する
ことにＪ：す、非常に良い好成績で免疫化が行なわれて
いる。この目的のために用いられる公知のキＡ７リアは
具体的には免疫原高分子物質例えば破傷風ト４ニソイド
、アオガイヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）　。
マルヂーボリ（ＤＬ−アラニル）−ポリ（し−リジン）
、Ｄ−アミノ酸共重合体等である。しかしながら、抗原
決定基は、このようにより強い免疫原性を示１ようにさ
れるといえども、該抗原決定基が誘導される天然の抗原
等に較べると、その免疫原性はなお幾分か低い。更に用
いられる高分子キャリアはヒト投与に適しているとはい
い難く、且つ、例えばＫＬＨは該材料が非常に高価なの
で商業的にはあまり価値がない。
本発明に於いて、今までに知られているキャリアが存在
する免疫原よりも実質的により強い免疫化力を有する、
抗原決定基含有免疫原が知見された。本発明の免疫原に
用いるキャリアは更に非発熱性であり、公知の高分子キ
ャリアよりも商業的に価値あるものである。
本発明免疫原は、疎水性残基に結合している抗原決定基
を疎水性及び親水性部分を共に有し且つ少なくとも限界
ミセルｌ！麿で存在するグリコシドの溶液に、グリコシ
ドミセルと疎水性残基との間で複合体が形成されるよう
な条件下で接触させ、次いで得られる免疫原粒子を任意
に安定化し及び／又は消化分解から保護することにより
製造される。
疎水性部分及び親水性部分を有するグリコシドであれ４
よ、どのようなグリコシドでも利用可能である。
好ましくは、Ｗ、Ｈｅｒｚ、Ｈ，Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ及
び、Ｇ、Ｗ、Ｋｉｒｂｙ編Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ　
ｄｅｒ　Ｃｈｅｎ＋ｉｅ、ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｒ　Ｎ
ａｔｕｒｓｔｏｆｆｅＶｏｌ、　３０（１９７３）にお
いて”ＣｈｅＩＩｌｉｅ　ｕｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅ　
ｄｅｒＳａｐｏｎ　ｉ　ｎｅ”と題してＴｓｃｈｅｓｃ
ｈｃ及びＭｕｆｆが記載しているようなサポニン、特に
高分極性サポニン、格別には分極性酸性ごスーデスモシ
ドのような分極性トリテルペンーサポニン、例えばキラ
ヤ皮からのサポニン抽出物、アラロシドＡ、チクセツ（
Ｃｈｉｋｕｓｅｔｓｕ）−サポニンＩＶ、キンセンカ（
Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）−グリコシドＣ，チクセツ（ｃｈ
ｕｔｕｓｅｔｓｕ）−ザボニンＶ、イノコズヂ（八ｃｈ
ｙｒａｎｔｈｅｓ）−１ナボニンＢ、キンセン力（ｃａ
＋ｅｎ−ｄｕｌａ）グリコシドＡ、アラロシドＢ、アラ
ロシドＣ１ｐｕｔｒａｎｊｔａ−サポニンＩ［ｌ　、　
ＢｅｒＳａｌｌｌａサボニシド、　Ｐｕ−Ｌｒａｌｌｊ
ｉａ−リ゛ボニンＩＶ、スリコシドＡ、　トリコシドＢ
、ザポナシドへ、トリコシドＣ，ジブソシド、ヌタノシ
ド、ジアンソシドＣ，サポナシドＤ、セイヨウトチノキ
（Ａｅｓｃｕｌｕｓ　ｈｉｐｐｏｃａｓｔｏｎｕｍ）か
らのニスキン又はナデシ：ｌ　（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌ
ａ　５ｔｒｕｔｈｉｕｉ）からのサポアルビン並びに特
にキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ　５ａｐｏｎａｒｉａＨｏ
ｌｉｎａ）からのサポニン抽出物、好ましくはに、Ｄａ
ｌ−ｓｇａａｒｄの方法（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕ
ｖａｎｔｓ”、Ｂｕｌｌ、Ｏｆｆ、　ｉｎｔ。
Ｅｐｉｚ　７７（７−８）、１２８９−１２９５（１９
７２））により調製されるＤＱ抽出物及びに、ｏａｌｓ
Ｏａａｒｄの方法（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕｗａｎ
ｔｓ　ｌ［−Ａｒｃｈｉｖ　ｆｊｒ　ｄｉｅ　ｇｃｓａ
ｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ−ｕｎｇ封、　２４３
−２５４（１９７４））により調製されるＱｕｉ１八等
が用いられる。
グリコシドの混合物もまた使用づることかできる。
本発明方法による免疫原の製造に適当な抗原決定基は例
えば小さいポリペプチド、小さいオリゴサツカライド、
オリゴヌクレオチド、グリコタンパクフラグメント及び
ハブテンである。
ここに小さいポリペプチドとは、少なくとも４個、約４
０個までのアミノ酸からなるポリペプチドをいう。一般
に抗原決定基は４〜８個以下のアミノ酸からなる。しか
しながら、抗原決定基の独特の空間構造を確ＩＪるため
に、これよりも幾分か数の多いアミノ酸が必要となる場
合もあり、このときこれら過剰のアミノ酸は適当には疎
水性残基に属し得る。ポリペプチドは、例えば公知のア
ミノ酸配列に基づいて合成的に調製することができ、又
は微生物の膜タンパク質の如き大きいポリペプチドもし
くはタンパク質又は植物もしくは動物起源のタンパク質
のタンパク質加水分解開裂もしくは化学的開裂によって
得ることができ、又はポリペプチドホルモンもしくはイ
のフラグメントもしくはそれらの類似物であり得る。
小さいオリゴサツカライドとは、一般に、糖単位の直鎖
又は分岐鎖を意味し、少なくとも４個、約２０個まぐの
糖単位からなるものをいい、より好ましくは６〜１０個
の糖単位からなる。これらのオリゴサツカライドは合成
的に又は天然のポリサッカライドもしくはグリコタンパ
ク質の化学的もしくは酵素的分解により調製覆ることが
できる。
オリゴヌクレオチドとは、少なくとも１個、約１５個ま
での、合成的に又はＲＮ　Ａ及びＤＮＡの如きポリヌク
レオチドの酵素的もしくは化学的開裂により得られると
ころのりボヌクレオチド又はデ第４シリボヌクレオチド
からなる化合物をいう。これらのオリゴヌクレオチドは
任意に二本鎖であってもＪ：い。
グリコタンパクフラグメントは、合成的に又はグリコタ
ンパク質の化学的及び酵素的開裂により調製される。
ハプテンは上記したポリペプチド、オリゴサツカライド
、オリゴヌクレオチド及びグリコタンパクフラグメント
と異なる分子であり、キＡ７リアに結合しない限り抗体
形成の誘発には適さないものである。
ハブテンの例としては、ステロイド、プロスタグランジ
ン等がある。
疎水性残基としては、疎水性の化学基であれば任意のも
のを使用することができる。この例としては、疎水性ポ
リペプチド、脂肪族鎖、脂肪酸誘導体又はリン脂質誘導
体などがある。
疎水性ポリペプチドは好ましくは４〜５０個のアミノ酸
からなることができ、特にバリル、フェニルアラニル、
トップトフイル、メチオニル、ロイシル及び／又はイソ
ロイシル残基の如き疎水性アミノ酸残基からなることが
できる。とりわけ、例えば合成過程にお１ノる適当な溶
解性のために、疎水性残基中にいくつかの非疎水性アミ
ノ酸を追加的に含むことが必要であろう。疎水性ポリペ
プチドは抗原決定基と合成的に結合しゃずいという利点
を有し特に合成ポリペプヂド抗原決定基を用いる場合に
は疎水性残基と抗原決定基の合成がひとつの全体操作と
し【行ないうるという利点を有する。
疎水性残基として好適な脂肪族鎖はステアリル又はパル
ミチルの如き分校状あるいは直鎖状の炭化水素鎖である
。
ホスファチジル誘導体のような分校状あるいは１鎖状炭
化水素のグリセロールエステルから誘導された基も又好
適である。
本発明は種々の型の抗原決定基からなる免疫原の製法を
も包含する。これらの抗原決定基は１つの同じ病原体に
そしてもし必要ならば１つの同じ病原体の種々のセロタ
イプに特有の種々の抗原決定基であってもよく、又は種
々の病原体に特有の種々の抗原決定基であっもよい。
本発明免疫原は多数の可能な方法で製造しつる。
一般的には、疎水基が結合しており、溶解性改善を望む
ときには可溶化剤例えばデタージェントを添加した抗原
決定基溶液をグリコシド溶液と接触させ、それと同時に
あるいはその後、可溶化剤が存在していれば、その可溶
化剤を除去する。該グリコシド溶液は１つの疎水性部分
と１つの親水性部分とを有するグリコシドを少なくとも
１つ、少なくとも臨界ミセル濃度の量にて含有している
。
このＪ：うな製法は、該グリコシド溶液の存在下で、疎
水性残基と結合した抗原決定基溶液を可溶化剤と共に透
析あるいは限外濾過することによって行ない得る。
特に本発明免疫原の大規模製造には限外濾過が非常に好
適である。
しかしながら、１社溶化剤の存在下で、疎水性残基と結
合しＩこ抗原決定基溶液を、疎水性部分と親水性部分と
を右りるグリコシドを少なくとも臨界ミセル濃度の聞に
て添加した例えば糖又は塩溶液の濃度勾配にか番ノ、そ
の後全体を遠心して免疫原をバンドとして分離すること
によって調製することも可能である。
又、疎水性残基と結合した抗原決定基を、疎水性部分と
親水性部分とを有するグリコシドを少なくとも臨界ミセ
ル濃度にて含有する溶液中で超音波処坤することができ
、その後形成しＩこ複合体を媒体から単離する。
本発明免疫原は所望に応じ安定化することができ、それ
は例えば免疫原自体に、あるいは抗原決定基及び／又は
それに結合（「架橋」）シている疎水性残基と互いに結
合づることにより行ないうる。
架橋は抗原決定基及び／又は疎水性残り上の少なくとも
２つの基に結合しうる反応基を右づるいかなる試薬によ
っても達成できる。一般的にポリペプチドへの架橋には
ゲルタールアルデヒド又はホルムアルデヒドを用いる。
架橋試薬として、ビスアミディト、ビスサクシンイミジ
ルエステルの如さホ′Ｅ２官能性試薬又はアジドフェニ
ル基とアミディ１〜又はザクシンイミジル又は活性化フ
ルオロベンゼン又はへロケトン基を有づる化合物の如き
ヘテロ２官能性試薬も好適である。
本発明免疫原は特にワクチンに好適である。該免疫原を
含有するワクチンは特に特定な病原体に対する免疫化い
わゆる初回免疫又は免疫学的不妊化もしくは去勢に使用
しうる。初回免疫においては身体は直ちに特異遊離抗体
を形成するように刺激されるのＴへなく効果的に予備調
整されるのであって、例えば不活化又は弱毒化病原体で
感染あるいはワクチン接種覆ると強い免疫反応がもたら
される（特にＥｍｉｎｉら（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ
　３０４．６９９〜７０３を参照１よ）。
免疫学的不妊化もしくは去勢においては、ある種のホル
モンの如ぎ生殖過程に重要な物質に対する抗体が産生さ
れる。
従って、本発明は本発明免疫原を含有するワクチンをも
包含する。免疫原中に存在する特定の病原体に特有の少
なくとも１つの型の抗原決定基のために、このワクチン
は特定の病原体に対する免疫化又は初回免疫に適しうる
。ワクチン中には１つの同じ病原体の複数の型の抗原決
定基を含んでいてもよい。同時に各免疫原が複数の抗原
決定基から成っていてもよく、あるいは異なる免疫原中
に各々の型の抗原決定基が含まれていてもよい。本発明
によると、複数の病原体に対するワクチンを構成するこ
ともでき、このような場合には又、各抗原決定基が異な
る免疫原中に存在していてもよく、あるいは１つの免疫
原中に共存していてもよい。
従って、本発明免疫原は診断法において、例えば凝集試
験の同相としであるいは免疫化学試験のマーカー相とし
て使用することができ、この後者の場合マーカーは免疫
原中に含まれている又は含まれていることができる。
本発明免疫原をワクチンの目的で使用するためには、免
疫原を投与に適した形態とＪる必要がある。
筋肉内又は皮下投与のためには、免疫原を例えば生理的
食塩溶液と混合することができる。０内又は点眼投与用
に例えばスプレーの形態と４−るためには、好ましくは
水溶液も使用されるであろう。局所（例えば口内）投与
のためには、多くの場合例えば口腔内の庶糖分解性酵素
又は胃中の蛋白質分解酵素に対して免疫原を一時的に保
護する形態を使用づる必要があるだろう。このような保
護は例えば免疫原をカプセル化（ＯＩＩＣａｐＳＩＪｌ
ａｔｉＯＩｌ）　することにより、又は徐放化Ｊること
により、又は抗原決定基及び／又は疎水性残基の酵素感
受性部位に１つ以上のＤ−型アミノ酸を用いることにＪ
：り行ないうる。
カッヒル化とは（一時的に）ある種の分解作用の攻撃に
スＩＴ薬剤を保護するいかなる方法をも意味りるもので
ある。本発明のいかなる個々の複合体をも保護剤で包む
こと（マイクロカプセル）、あるいは複数の複合体を１
つの保護シールド（ｐｒｏｔｅ員団ｇＳｈｉｅｌｄ）で
おおうこと（マク［：１カプセル）によりカプセル化は
達成しうる。
カプセル化材料は半透過性であり１！１、あるいは動物
もしくは人間の体内に入ったとき又は動物もしくは人間
の体内である種の部位に達したときに（半）透過性とな
ってもよい。この意味でＩｉｔカプセル化と徐放化の両
者は１つの製剤で達成しうる。従って、一般的にカプセ
ル化には生物分解性のｔｔＡ利が使用される。
マイクロカプセル化には、本発明の適宜架橋した複合体
を生物分解性ポリマー溶解中に分散りることが適してお
り、適宜表面活性剤を添加づる。ぞの後ポリマーが界面
でカプセルを形成する。マイクロカプセルを分離し、生
理学的に許容し得る媒体にｗＮ濁しうる。又は、マイク
ロカプセルを凍結乾燥してもよい。
マクロカプセル化は当業界に公知の方法で達成しうる。
本発明の適宜架橋した複合体をゼラチン、澱粉などのよ
うな経口（軟又は硬）カプセル材に適合し得る適当な調
合形態に変換することが好ましい。
この目的のために、マンニトール、直納、グリセロール
などを添加した複合体を乾燥又は凍結乾燥しうる。その
後、この材料を粒状化しあるいは例えば天然もしくは合
成ゲルに懸濁し、例えばホルムアルデヒド、セルロース
アセテ−１〜フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロースフタレ−１〜又はポリアクリル化合物で腸溶性
に］−トしたカプセル中に充。
填づる。又、水中懸濁した本発明の複合体を充填するに
先だち腸溶性皮膜カプセルの内面をポリシロキサン又は
合成もしくは植物性油もしくはろうのような軟疎水層で
おおう。
下記の実施例を参照して本発明を更に詳述する。
実施例中では下記の省略形を使用する：保護基として： ｔ３ｕ　第三級ブチル Ｂｚｌ　ベンジル Ｚ　ベンジルオキシカルボニル 溶剤及び試薬として： ＤＭＦ　ジメチルホルムアミド ＤＣＣジシクロヘキシルカルボジイミドＤＣＵ　ジシク
ロへキシルウレア Ｂ　ｕ　Ｏ　Ｈ　ブタノール ＴＦＡ　ｔ−リフルオロ酢酸 ＩＡＮ　イソアミルナイトライ１〜 ＮＥＭ　Ｎ−エチルモルボリン アミノ酸残基として： １−ｅｕ　ロイシル ｃｄｙ　グリシル ｐＧＩｕ　ピログルタミル １−１ｉｓ　ヒスチジル Ｔｒｐ　ｌ−リブトフイル Ｓｅｒ　セリル Ｔｙｒ　チロシル ＡｒＣｌ　アルＶニル ｐｒｏ　プロリル ｙａ＋　バリル ＡＳｎ　アスパラギニル ＡＳＤ　アスパルブール Ｇ　ｌ　ｎ　グルタミニル Ａｌａ　アラニル Ｔｈ　ｒ　スレオニル ｌｊ／Ｓ　リシル ペプチドとして： Ｌ　Ｈ　−　ＲＨ　黄体形成ホルモン放出ホルモンクＩ
　ＬＨ−Ｒ１−１ハ 本物質は、ヘキザペプチド　Ｈ−・ｌ−ｅｕ−１−ｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＱ　ｙ−ｏｔｓｕとＬＨ
−ＲＨ　（ｐＧＱｕ−Ｈｉ　ｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ　−Ｔ
ｙｒ−Ｇ　Ｑ　ｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｑ　（　ト１（Ｊ＞　
−Ｐｒ。
−〇ρＶ−ＯＨ）酸の塩酸塩を２回連続して結合させて
調製した。
Ｌ　Ｈ　−　Ｒ　Ｈ酸の塩酸塩をＤＭＦに溶解し、２当
量のＨＯＢｔを加えた。混合物を０℃までＷｔ　ｆＪＩ
　シ、Ｈ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−１ｅｕ−ｌｅｕ−１ｅｕ
−ＧＱｙ−ＯｔＢｕをＤＭＦに溶解したものを加えた。
この混合液をさらに一２０℃まで冷却し、その後２当最
のＤＣＣをＤＭＦに溶解したものを加えた。
そして混合液を一１５℃で１５分間、０℃で２時間更に
４０℃で１２時間撹拌した。次に反応生成物を＝２０℃
まで冷却し、沈澱したＣＣＵを濾別した。
滅液を蒸発させ、残留物をＳｅＣ−ＢＵＯＩＩ：　ＣＩ
Ｉ２　Ｃｆｆｉ２　（２：３）ｄｊ、合物に溶解した。
この溶液をΦ吹酸溶液で３回、水（゛Ｊ３同イれぞれ洗
浄し、その後有機層を乾燥した。
最後に、ｉｌｌられた溶液にエーテルを加えペプチドを
沈澱さＵだ。該ペプチドを窒素ガス流下の９０％１−Ｆ
ＡＩ−アニソール中で脱保護化し、その後エーテルを添
加し、沈澱物を濾別し、エーテルで洗浄し乾燥させた。
上記のようにして得られた生成物を第２のペプチドであ
るｔ　ｅａ−４ｅｕ−１，ｅｕ−１−ｅｕ−ｌ−ｅｕ−
ＧＱ　Ｖ−ＯｔＢｕにＡ、に記述した方法で結合し、そ
の後脱保護化した。
Ｃ、Ｉ−ｊ−１〜Ｌｔ＝ｌＪ″′１ Ｂ、で記述したペプチドの３りをｐＨ７，２の０．０５
＋１１０Ｑ／ＱｈリスＩＩｃＩ’バツフ１−中の２％強
度トリ１ヘン溶液の１１ｄに溶解した。この溶液を１）
Ｈ７，２の０．０５ｍｏＱ、’Ｑ　ｔ−リスＩＩＣアバ
ツノ７′−中の０．２％強度サすニンＱｕｉｌＡ溶液の
４０ｄと７１１合し、１０００〜２０００Ｄのカットオ
フを持つ限外濾過膜を備えた限外濾過セル（八ｍ１ｃｏ
＋＋　Ｎｏ、５＋２２）に移した。このセルでステンレ
ススチール製供給容器中に入れである上記の１〜リスＩ
Ｉ　＋Ｊバッファーを供給しながら限外濾過を行った。
０．５Ｑのバッファーが限外濾過膜を通過するまで限外
濾過セル中の溶液を濃縮し、その後限外濾過セルに２０
００００のカットオフを持つ限外濾過膜を装着し、再び
０．５０の前記バッファーで限外濾過を打つｌｃｏその
後、形成された免疫原の最終濃度が約５　ｍ”Ｊ　／　
ｄとなるまで溶液を濃縮した。電子顕微鏡下で直径約３
０ｎｏ＋の球状構造が観察された。
（Ｈ（Ｊ　−ＧＱ　−Ａｓ　０ＢｚＱ　−ｅｕ−Ｑｎ−
ＶａＱ　−ｅｕ　−Ｑａ　−Ｑｎ−Ｌ　５Ｚ−Ｖａ　Ｉ
　−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−△ｒｇ（ト１＋Ｊ）−Ｇ
　Ω　Ｖ−ＡＳＤ　（ＯＢｚ　Ｑ）　−Ｌｅｕ　−ＧＱ
ｎ−−ＶａΩ−１−ｅｕ−ＡＱａ−Ｇ（２ｎ−１−ｙｓ
（Ｚ）−ＶａＱ−ΔＱａ−Ａｒ（Ｊ　（ＮＣＲ）−Ｔｈ
ｒ−ＬｅＬＪ　Ｐｒｏ　Ｎ２　Ｈ３をＤＭＦに溶解し、
この溶液を０℃まで冷却した。ＤＭＦ中の２当量の１１
０！をこの溶液に加え、混合物を一２０℃まで冷却した
。次に１当ｍのＩＡＮを添加した後、混合物を一２０℃
で１５分間撹拌した。その後、２当ωのＮＥＭとＤＭＦ
に溶解した１当量のペプチド　ト１−Ｌｅｕ−１−ｅｕ
−１ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＱＶ−ＱＬ：３ｕとを加
えＮＥＭによりｐＨを７．２７５に調整し、０℃で３日
間撹拌した。濾液を蒸発させ、残留物をＳｅｃ　−Ｂｕ
ｏｌｌ：　Ｃｌ１２ＣＲ２（２：３）混合物に取り、こ
の溶液を重炭酸溶液で３回、水で３回それぞれ洗浄し乾
燥した。溶液にエーテルを加え、沈澱したペプチドを濾
別した。Ｃ−末端　ｔ３ｕ基を窒素ガス流下で９０％Ｔ
ＦＡ＋アニソールで切り離した。反応生成物をエーテル
で沈澱さゼエーテルで洗浄し乾燥させた。
本ペプチドはＡ、で得られた生成物を１．ｅ、ｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＧＱ　ｙ−ＯｔＢｕと、
実施例１Ａに記述したものに対応り“る方法にＪ：す２
回続けて結合して調製した。
Ｃ，ｔ−１−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ　−ｅｕ　−ｒｏ
　１−１　。
Ｚ及び０Ｆ３ｚＱ保護基は、トリフルオロ酢酸中のメタ
ンスルホン酸とチオアニソールで処理して切り離した。
反応液をエーテルに滴下して濾別し、沈澱物を洗浄し乾
燥して遊離ペプチドをＴＦＡ塩として単離した。
べ　−ζ Ｃ０により調製したペプチドの４ηを２％トリトンＸ１
００を含有するｐＨ７，２の０．０５＋＋＋ｏＱ／Ｑト
リスＩＩＣβバツフアーに溶解した。超遠心管にＱｕｉ
ｌ＾を０．２％含有する２０〜５０％のシュクロースＩ
ｌ庶勾配を満した。１％トリトンを含有する１５％シュ
クロース溶液層をその上に導入し、さらにその上に上記
ペプチド溶液を導入した。
遠心管を２０℃で４０時間、Ｎｏ、５Ｗ６５０−ターに
より６５０００ｒ、ｐ、ｍ、（平均３０００００Ｘｑ）
で遠心分離した。管の内容物を分画に分け、所望免疫原
の存在づる分画を、口蹄疫ウィルス０１に血清型抗血清
を使用した免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により検出した。
クレブシェラ（旧ｅｂｓｉｅｌｌａ）血清型１１カプセ
ル状ポリサツカライド（Ｋ１１　ＰＳ）に特有のオクタ
サツカライドをジグターマン他の方法（Ｚｉｒｌｔｅｒ
ｍａｎｅｔ　ａｌ、Ｘｉ　ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　
Ｃａｒｂｏｂｙｄｒａｔｅ　Ｓｙａ＋ｐ、　ａＬＵｔｒ
ｅｃｈｔ、　ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｖｏｎ
ｋ　Ｐｕｂｌｉｓｌ＋ｅｒｓ、　Ｅｄ。
Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　ＺｅｉｓＬ
、　１９８４．　ｐ、３０８．）により調製した。要約
すると５ｍｌのに１１ＰＳに６ＩｄのＰＢＳ中の５ｘｌ
Ｏ１０ｐｆｕバクテリオファージφ１１を加え、２４時
間３７℃でインキュベートして行った。
その後Ａ−クタ１ナッカライドを、セファデックスＱ　
２５　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５．　Ｐｈａｒｎ＋ａ
ｃｉａ）上のゲル濾過により分離精製した。
１式に示されるオクタサツカライド（Ｋ１１０Ｓ＞が？
！）られた。
スニツ１他（Ｓｎｉｐｐｅ　ｅｔ　ａｔ、　Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｕｕ−ｎｉｔｙ−酩ユ８４２−４
．１９８３）により記述された方法によりＡ、で得られ
たオクタサツカライドにステアリルアミンを結合した。
結合による生成物をセファデックスＧ　２５　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過により分１１１１精製し、
その後凍結乾燥した。
Ｃ，に１１０Ｓ−ステアリル゛からの１−　の■ Ｂにより得られた凍結乾燥生成物を０．２％サポニンＱ
ｕｉｌＡを加えたＰＢＳに溶解した。溶液を室温で２０
分間超音波処理し、得られた複合体をＰＢＳに対して充
分に透析した。
夫盪１Ａ　−工゛ルフィン−６−１ 夙 β−エンドルフィン−（６−１７）のジパルミトイル−
リシル誘導体ＰａＱｍ−Ｌｙｓ−７ｈｒ−■ ｐ　ａ　Ｑ　ｒＴ＋ ５ｅｒ−ＧＱｕ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−ＧＱ　ｒ＋−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＶａＱ−Ｔｈｒ−Ｌ　ｅｕ−ＯＨの
トリフルオロエタノール溶液を、メタノール／水（３／
１．Ｖ／Ｖ）混合液中のサボニーンＱｕｉｌＡ溶液に加
えた。混合液を蒸発乾固し、残留物を０．９％ＮａＣ９
，ｐＨ７，４の０．０５Ｍ’Ｊン酸ナトリウムバッファ
ー中に、Ｑｕｉｌ　Ａｏ、　５％（Ｗ／Ｗ）及び１ｍＭ
ペプチドの′ｍ度となるように分散させた。分散液をプ
ローブ型超音波発生１１！（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉ
ｆｉｅｒ　ｉ８５゜ｍ１ｃｒｏｔｉｐ、５ｏｎｉｃ　ｐ
ｏｗｅｒ　４０）により４℃で１分間超音波処理した。
得られた粒子状生成物を０．９％ｎａａの０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウムバッフ１−に対して４セで充分に透析し
、その後凍結乾燥した。
支施皿支　【区免亘兄 実施例２に依り調製した口蹄疫免疫原をｐＨ７，２の０
．１Ｍリン酸バッファーに５＃＋９／ｒｒｄｌの濃度に
溶解し、ジ（メチルスルホニルエチル）−ビメリデイ１
〜 の作成したばかりの溶液に最終濃度が３　ｍ　ｌｙｌと
なるように加えた。
混合液を４℃で４時間保持した後、１４０ｆｆ１ＭＮａ
ＣＲのｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸バッフ？−に対して
、バッファーを２回交換して２０時間透析にかけ、その
後凍結乾燥した。
１凰ＪＬｆｉ　力　セル　ロ 実施例２に依り調製した免疫１ｉ０．１ｇを含有りる２
０％ゼラチン溶液の１０ｇを、液体パラフィン２５ＳＪ
と６０℃で充分に混合した。混合物を６０℃で５分間保
持した後、５℃まで冷却し、この温度で９０分間保持し
た。その後１０ｇのイソプロパツールを加え、粒子状の
物質をメンブレンフィルターでの吸引濾過により分離し
、イソプロパツールで洗浄した。その後、イソプロパツ
ール中１０％ホルムアルデヒド溶液１．５ａｄ！を加え
た。反応は７℃で２４時間行った。上記のように固化し
た粒子を濾過により分離し、水洗してＰＢＳ中に懸濁し
た。
手続有０．１１ミ沈　（方式） ％式％ ２、発明の名称　グリコシド含有キャリアに結合し！ご
抗原決定基からなる免疫原の製造 ３、補正をする者 事イ′１どの関係　特ａ′Ｅ出願人 名　称　アクゾ・土ヌ・ヴ■− ４、代　理　人　東京ｔ；新１ｒｆ区新宿１丁目１吊１
４月　山Ｉｌ＋ヒル５、補正指令の日イｑ　昭和６０　
ｆｆ’　２月６ｒＪり、補正の内容 （１）　明１１１１中、第７頁第３行目にＦＷ、　ｌ−
１ｅｒｚ。
ｆ−Ｉ　Ｇｒｉｓｅｂａｃｌ＋Ｊとあるを１ダブリュ、
ヘルツ（Ｗ、　Ｈｅｒｚ）、　エイチ、グリセバッハ（
１−１。
Ｑ　ｒｉｓｅｂａｃ＋１）　Ｊと補正スル。
（２）　明細書中、第７頁第３行目にｒＧ、Ｗ。
Ｋ　１ｒｂｙＪとあるを１ジー、ダブリュ、キルビイ（
Ｇ、　Ｗ、　Ｋｉｒｂｙ）　ｊ　、！：補止Ｊる。
（３）　明細山中、第１頁第４行目乃至第５１−１目に
「Ｆ　ｏｒｔｓｈｒｉｔｔｅ・−・−（１９７３）　ｊ
とあるを「フオルツシ：Ｉ、リット　デル　ケミ　Ａル
ガニツシエ　ナチュＪＬ／　７．　ｌ−”／　７１　第
３０巻（１９７３）　（Ｆ　ｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅｄ
ｃｒ　Ｃｌ＋ｅｎｌｉｅ　ｏｒｇａｎｉｓｃｌ＋ｅｒ　
Ｎ　ａｔｕｒｓｔｏＨｅ　ｖｏｌ、３０（１９７３））
Ｊど補正する。
（４）　明細書中、第１頁第５）行目乃至Ｇ　１−ｉ目
に「”　ＣｂｃＩＩｌｉｅ　−−−−−−Ｓ　ａｐｏｎ
ｉｎｅ　”　、Ｉとあるを「″°ケミ　ラン１〜　ビＡ
【１シイ　ゲル　１ノボニン″（”　Ｃｈｅｍｉｅ　ｕ
ｎｄ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｅ’ｄｅｒ　３ａｐｏｎｉｎｅ
　”　）　Ｊと補正する。
（５）　明ａｉｌ中、第７頁第６行目に［［５ｃｈｅｓ
ｃｌ＋ｃＪとあるを［トシエツシエ、（Ｔｓｃｈｅｓｃ
ｌ＋ｅ）　Ｊと補止する。
（６）　明細書中、第１頁第６行目にｒＷｕｌｆ、Ｊと
あるを１°ビこ１刀レフ（ＷＬｌｌｆ）Ｊと補ｉＥ　’
Ｊる。
（７）　明細書中、第７頁第１５行目及び第７頁第１５
行目乃至第１６行目に１”ｐ　Ｌｌｔｒａｎｊ　ｉａＪ
とあるを１ブトランシア（ｐ　ｕＬｒａｎｊｉａ）　Ｊ
と補正する。
（８）　明細書中、第７頁第１５１ｊ目にｌ’　Ｂ　ｅ
ｒｓａｍａ　Ｊとあるを［ベルザｖ　（３ｅｒｓａＩｌ
ｌａ）　Ｊと補正する。。
（９）　明細書中、第８頁第５１−１目乃至第６行目及
び第８頁第８行目にｒＫ、　ＤａｌｓｇａａｒｄＪとあ
るを１−　’７−　、　’ｌ、）Ｌｔ　７．ガード（Ｋ
、　Ｄａｌｓｇａａｒ＋１）　Ｊと補正する。
（１０）明細書中、第８頁第６行目乃至第７行目に［（
”　Ｓ　ａｐｏｎｉｎ・−・−（１９７２））　Ｊとあ
るを［（“勺ボニン　アジ：１パンＩ−Ｉ＋、プル、オ
フ、インｌ−。
エピツ　７７　（７−８）、１２８９−１２９５　（１
９７，２）（”５ａｐｏｎｉｎ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”
　、　３ｕ１１．　Ｑｆｆ。
１１１ｔ、　ＥｌｌｉＺ　７７　（７−８）、　１２８
９−１２９５（１９７２）　）　Ｊと補正づる。
（１１）明細書中、第８頁第８行目乃至第１０行目にｒ
（”５ａｐｏ旧ｎ−−−−−−（１９７４）　）　Ｊと
あるを「（゛リボニン　アジュバント■“′、ファー。
′ブフコール　ディ　ゲザムテ　ウィルスフＡルシュン
グ　リ、２４３−２！ｉ４　（１９７４）　（”　Ｓ　
ａｐｏｎｉｎＡ　ｄｊｕｖａｎｔｓ　ｍ　”　、　Ａ　
ｒｃｌｌｉｖ　ｆｕｒ　ｄｉｅ　ｇｅｓａｍｔｅＶ　ｉ
ｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　４４．２４３−２５４　（
１９７４））　Ｊと補正する。
（１２）明細書中、第８頁第１０行目、第２４頁第２行
目、第２１頁］・から第２行目、第３０頁第９行目、第
３１頁第３行目及び第３１頁第６行目に［ＱｕｉｌΔ−
１とあるを「キールＡ　（Ｑｕｉｌ’Ａ　）　Ｊと補正
づる。
（１３）明細書中、第１５頁下から第５行目にｌＥｍｉ
ｎｉら・・・・・・６９９〜７０３」とあるを［１ミニ
ら（１９８３）ネイチｖ　−３０４，６９９〜７０３ノ
（Ｆ’、ｍ１ｎｉら（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０
４　、　６９９〜７０３　）　Ｊと補正する。
（１４）明細書中、第２４頁第４行目に［（Δｍ１ｃｏ
ｎＮ’ｏ、５１２２）　Ｊとあるを［（アミコン　Ｎｏ
、５１２２（Ａ　ｍ１ｃｏｎ　Ｎ　ｏ、５１２２））　
Ｊと補正する。
（１５）明細ｍ中、第２８真下から第４行目乃〒最１ぐ
行に「（Ｚ　１ａＬｅｒｍａｎ・−・・−・ｐ、３０ｇ
、）」とあるを１（ジグターマンら、第ＸＩ回インター
プツｌ−、カーボハイドレート　ランプ。於１トレヒト
、オランダ：フオンク　パブリツシャ、ビリーゲン１−
バー・１・ら編、ツアイスト、　１９８４．　ｐ、３０
８．　）　（Ｚ　ｉｇＬｅｒｍａｎｅｔ　ａｌ、Ｘ　ｎ
　’ｔｌ＋　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｃｓｎ＋ｐ、　ａｔ　ＬＪ　ｔｒｅｃｈｔ、　ｔｈ
ｅ　Ｎｅｔｌ＋ｅｒｌａｎｄｓ；　ＶｏｎｋＰｕｂｌｉ
ｓｌｌｃｒｓ、　Ｅｄ、　Ｖｌｉｅｏｅｏｔｈａｒｔｅ
ｔａｌ。
Ｚ　ｅｉｓｔ、　１９８４．　ｐ、３０８．　）Ｎと補
正する。
（１６）明細山中、第２９頁第６行目及び第３０員第４
行目ニｌｐｌ＋ａｒｍａｃｉａＪどあるを１フアルマシ
ア（Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ）　Ｊと補正する。
（１１）明ｗＪｍ中、第２９頁最下行乃至第３０頁第１
行目に［ｌ　ｒ＋４ｅｃｔ　１ｏｎ−ニー１９８３４と
あるをしイン゛）１クシヨン　アンド　イミコーニテイ
　４２−、　８４２−４゜１９８３　（Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４２，８４２−４゜
１９８３）Ｊと補正する。
（１８）　明細山中、第３１頁第８行目乃至第９行目に
ｒ　（Ｂｒａｎｓｏｎ−−−−−−ｐｏｗｅｒ　４０）
　Ｊとあるを（″（プランソン　ソニ゛ノイア　１８５
．マイクロチップ、ソニック　パワー　４０（Ｂｒａｎ
ｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒ　１８５　。
ｍ１ｃｒｏＬｉｐ、　５Ｏ１ｌｉＣｐＯＷＯｒ　４０）
）Ｊと補正する。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　疎水性残基に結合している抗原決定基を、疎水
    性及び親水性部分を共に有し且つ少なくとも臨界ミセル
    濃度の１で存在するグリコシドの溶液に、前記グリコシ
    ドミセルと前記疎水性残基との間に複合体が形成される
    条件下で接触させ、次いで得られる免疫原粒子を任意に
    安定化し及び／又は消化分解ｈ（ら保護することを特徴
    とする免疫原の製法。
  2. （２）　任意に可溶化剤を含む疎水性残基に結合してい
    る抗原決定基の溶液をグリコシドの前記溶液と接触さμ
    、次いで可溶化剤が存在するならばこれを除去し、免疫
    原を単離して精製することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項に記載の製法。
  3. （３）　小さいポリペプチド、小さいオリゴザツカライ
    ド、ハプテン、ポリヌクレＡ゛チド及びグリコタンパク
    フラグメントからなるグループから抗原決定基を選択す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に
    記載の製法。
  4. （４）　疎水性残基に結合している２つ又はそれ以上の
    異なる抗原決定基の混合物を用いることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の製法
    。
  5. （５）　抗原決定基及び／又は疎水性残基を架橋覆るこ
    とにより免疫原粒子を安定化させることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の製法
    。
  6. （６）　爾後に免疫原粒子をカプセル化することにより
    消化分解から保護することを特徴とする特許請求の範囲
    第１項乃至第５項のいずれかに記載の製法。
  7. （７）　特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の方法により製造した免疫原からなるワクチン。
  8. （８）　特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の方法により製造した複数の異なった免疫原からな
    るワクチン。
  9. （９）　特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の方法により製造した少なくとも１つの免疫原を含
    有する免疫化学試薬。
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