BRPI0811499B1 - Métodos para purificar um vírus ou antígeno viral, e para preparar uma vacina contra um vírus ou antígeno viral. - Google Patents

Métodos para purificar um vírus ou antígeno viral, e para preparar uma vacina contra um vírus ou antígeno viral. Download PDF

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Abstract

métodos para purificar um vírus ou antígeno viral, e para preparar uma vacina contra um vírus ou antígeno viral a presente invenção fornece um método para a purificação de um vírus ou antígeno viral que compreende fornecer uma preparação viral e centrifugação da dita preparação viral em um gradiente de um açúcar estabelecido pela adição de duas ou mais camadas de açúcar tamponadas de concentração diferente. o método leva a rendimentos mais altos e reduz a agregação não desejada do vírus ou antígeno viral pelo aumento do volume do grupo de pico.

Description

A presente invenção diz respeito ao campo da purificação viral.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os vírus, aqueles que ocorrem na natureza ou versões recombinadas destes, são usados para a vacinação e no campo da terapia de gene. É possível para muitos vírus ou partículas equivalente a vírus para propagar com segurança e eficientemente em células hospedeiras. Diversas publicações descrevem a purificação de vírus a partir de células hospedeiras, na maioria das vezes concentrando no uso de matrizes cromatográficas específicas para a purificação do vírus a partir de um lisado de célula hospedeira (ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 6.008.036). Outros métodos como descritos, por exemplo, na Patente U.S. N2 6.048.537 utilizam a centrifugação de gradiente de sacarose contínua, que libera produtos com menos pureza de antígeno e requer etapas de purificação adicionais pela centrifugação. Tais métodos também sofrem de agregação de antígeno, que pode levar a uma perda de antígeno viral ou inibir as etapas de inativação viral.
A agregação viral também pode inibir o rendimento de processos cromatográficos, que são intensivo em tempo e custo e difíceis de r adaptar a uma produção em larga escala. E portanto uma meta da presente invenção fornecer um método para purificar vírus, em particular a partir de amostras de célula hospedeira, que é simples mas ainda é capaz de fornecer frações de antígeno viral integrais em alta pureza com agregação de antígeno viral reduzida.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
Figura 1: Microfotografia de PMVHs purificadas com os procedimentos de ultracentrifugação convencional (Figura la) e inventiva (Figura lb).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece um método para a purificação de um vírus ou antígeno viral que compreende fornecer uma preparação viral e centrifugação da dita preparação viral em um gradiente de um açúcar estabelecido por uma primeira camada A do açúcar em uma concentração de um equivalente de sacarose de 34 % a 50 % (% p/p) e uma segunda camada B do açúcar em uma concentração de um equivalente de sacarose de 50 % a 65 % (% p/p) de sacarose, em um tampão aquoso, com um componente de tampão sendo um componente de tampão tendo um valor de pKa entre 6,0 e
9,4 e coletando o dito vírus ou antígeno viral do centrifugado, isto é, o produto do processo de centrifugação.
Um aspecto da invenção é fornecer um método para a purificação de um vírus ou antígeno viral. O método envolve fornecer uma solução contendo um gradiente de açúcar estabelecido pela centrifugação de pelo menos uma primeira solução de açúcar tamponada e pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada. A concentração de açúcar na primeira solução de açúcar tamponada tem um equivalente de sacarose de35%a50% (% p/p) ou em certas formas de realização, 34 % a 46 % (% p/p). A concentração de açúcar da segunda solução de açúcar tamponada tem um equivalente de sacarose de 50 % a 65 % (% p/p) ou em certas formas de realização, 50 % a 60 % (% p/p). Uma vez que o gradiente de açúcar é estabelecido, uma preparação viral é adicionada ao gradiente de açúcar. A preparação viral e gradiente de açúcar são depois centrifugados para obter um grupo de pico e o grupo de pico é extraído para obter o vírus ou antígeno viral DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Durante a purificação de um vírus ou antígeno viral, o vírus ou o antígeno viral é concentrado pela centrifugação, permitindo uma separação de componentes do meio de cultura celular e/ou células hospedeiras e componentes de célula hospedeira. O método inventivo pode minimizar a agregação viral e a perda de vírus na etapa de centrifugação da purificação.
Nos métodos da invenção, uma primeira solução de açúcar em um tampão fisiológico é carregado no geral verticalmente em um aparelho de ultracentrifúgação contínua para formar uma camada de solução de açúcar horizontal A e depois uma segunda, solução de açúcar de concentração mais alta no mesmo tampão fisiológico ou diferente é carregado no aparelho para formar uma camada de solução de açúcar horizontal B. O aparelho é depois ativado, criando um gradiente de açúcar que é mais concentrado na parede externa do aparelho e que se toma menos concentrado na direção do centro do aparelho. Uma solução colhida contendo vírus de uma cultura celular é depois carregado no aparelho e as partículas virais migram para uma localização no gradiente de açúcar onde a sua densidade é equivalente à densidade do gradiente. Quando o açúcar é sacarose, uma faixa de densidade típica onde este equilíbrio ocorre é de 36 % a 48 % (% p/p) de sacarose. Uma vez que o aparelho é parado, o gradiente muda para uma posição horizontal e a porção do gradiente que contém as partículas virais (ou “grupo de pico”) é retirada do aparelho.
Um aspecto desta invenção é a descoberta surpreendente que pela utilização de um método de solução de camada dupla, o volume do grupo de pico pode ser aumentado quando comparado aos métodos convencionais utilizando uma única concentração de solução de sacarose em água para formar um gradiente de sacarose. Este efeito surpreendente é obtido mesmo se a sacarose é usada e a concentração de sacarose máxima no gradiente for a mesma como usada no método convencional. Pela otimização das concentrações e quantidades das duas camadas de solução de sacarose A e B, o volume do grupo de pico pode ser aumentado, por exemplo, em duas vezes. Este volume de grupo de pico aumentado reduz a agregação de partículas virais inteiras ou antígeno pela redução de suas respectivas concentrações.
Os processos de ultracentrifugação contínua são úteis para a purificação de preparações virais. As soluções altamente concentradas de açúcar (por exemplo, sacarose ou sorbitol) ou sal (por exemplo, CsCl2 ou NaBr) podem ser usadas para gerar gradientes pela ultracentrifugação. Entretanto, as soluções de açúcar sem quaisquer aditivos têm uma concentração baixa de eletrólitos e nenhuma capacidade de tampão. Assim, um aspecto da invenção é a compreensão de que as preparações virais em soluções de açúcar, tais como soluções de sacarose, têm uma tendência forte para formar agregados, dependente da concentração das partículas virais, que podem causar problemas no processamento adicional para a produção de vacina. Os métodos inventivos podem eficazmente minimizar estes problemas usando soluções de açúcar (por exemplo, soluções de sacarose a 55 % p/p) com a adição de sal nas concentrações fisiológicas (por exemplo, NaCl a cerca de 4 a 8 g/kg) e com a adição de um tampão (por exemplo, Tris, aproximadamente 10 a 20 mmoles/kg, seguidos pelo ajuste do pH) para se obter eletrólito fisiológico e condições de pH no gradiente. Em certas formas de realização, soluções de açúcar diferentes são aplicadas para formar o gradiente na ultracentrífúga. Como um exemplo, 200 ml de uma solução a 55 % p/p e 800 ml de uma solução a 42 % p/p são carregados ma ultracentrífúga. A quantidade menor de solução de sacarose de concentração mais alta garante que no final da ultracentrifugação a concentração de sacarose máxima permaneça acima de 45 % e a quantidade maior de 42 % de sacarose resulta em um gradiente mais gradual na faixa de cerca de 40 % onde o pico viral máximo tipicamente ocorre. Por estes métodos da invenção, o volume do grupo de pico pode ser aumentado e portanto a suspensão de partícula viral é diluída e resulta em menos agregação. Também, a difusão de moléculas ou partículas entre o sobrenadante que é carregado na ultracentrífuga e o gradiente é modificado pelo uso de tais formulações de sacarose.
Por via de exemplo, um gradiente de densidade formado usando solução de sacarose de aproximadamente 42 % e 55 % (% p/p) em 20 mmoles/kg de tampão Tris foi descoberto ser particularmente útil para o vírus da influenza mas também pode ser facilmente adaptado para outros vírus. Tris (tris-hidroximetilaminometano) é um tampão útil para as faixas de pH entre
6,5 e 9,7. Embora a sacarose seja usada neste exemplo particular de uma forma de realização da invenção, outros açúcares adequados para a centrifugação de gradiente podem ser usados. Além disso, outros compostos de tampão, em particular compostos de tampão orgânicos, tais como aminas, podem ser usados. Preferivelmente o tampão tem um valor de pKa acima de 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 ou 8,0 e abaixo de 9,4, 9,2, 9,0, 8,8, 8,6,
8,4 ou 8,2. Os tampões adequados compreendem por exemplo HEPES (ácido
4-(2-hidroxietil)-l-piperazinoetanossulfônico), ACES (ácido N-(2Acetamido)-2-aminoetanossulfônico), bis-tris-metano ou -propano, CAPS (ácido N-ciclo-hexil-3-aminopropanossulfônico) ou CAPSO, PIPES (ácido piperazino-N,N’-bis(2-etanossulfônico)), tampão de fosfato ou qualquer outro tampão usado no campo da bioquímica. O tampão é de modo preferível quimicamente inerte às biomoléculas.
O processo de centrifugação pode gerar uma fração de grupo de pico em que a partícula viral é dispersada sob condições fisiológicas com respeito ao eletrólito e condições de pH. A concentração do antígeno viral inteiro na fração de grupo de pico pode ser modificada pela adição de quantidades diferentes de soluções de açúcar de concentração alta e baixa para definir o gradiente e portanto o volume da fração de pico. Adicionalmente, o volume da fração de pico é também aumentado pela adição de sal e um tampão adequado (por exemplo, solução salina tamponada com Tris (TBS)) sozinho, levando a um rendimento significantemente mais alta de antígeno e proteína. Este efeito seria devido a uma mobilidade inesperadamente melhorada de proteínas e antígeno viral em um gradiente de açúcar contendo concentrações fisiológicas de sal e um pH fisiológico. Condições de ultracentrífuga diferentes (por exemplo, com e sem pré clarificador e forças gravitacionais diferentes) claramente mostrou que um aumento de rendimento significante e uma agregação reduzida de partículas virais podem ser obtidos por estas modificações do gradiente de sacarose.
Preferivelmente a adição de eletrólitos é maior do que 50 mOsm/kg, 100 mOsm/kg, 150 mOsm/kg, 200 mOsm/kg ou 250 mOsm/kg e menos do que 500 mOsm/kg, 450 mOsm/kg, 400 mOsm/kg ou 350 mOsm/kg, preferivelmente de cerca de 300 mOsm/kg. Deve ser mencionado que a quantidade de eletrólito é calculada como equivalente para a osmolalidade de soluções aquosas sem a correção do fator de van’t Hoffs. Além disso, a contribuição da substância formadora de gradiente (por exemplo, sacarose) não é usada para o cálculo. Por exemplo, a osmolalidade de eletrólitos é calculada como segue: 8 g de NaCl/kg / 58,44 g/mol = 136.9 mmol/kg x 2 (íons/mol) = 273,8 mOsm/kg + 20 mM/kg TRIS x 2 íons/mol = 40 mOsm/kg; Total (NaCl+TRIS) 313,8 mOsm/kg). O valor do pH pode estar na faixa fisiológica, preferivelmente entre 5,5 e 9,5, mais preferivelmente entre 5,5 e 8,5, especialmente preferido acima de 5,5, 6, 6,5 ou 7 e abaixo de 9,5, 9,0, 8,5, 8 ou 7,5, em particular entre 7,0 e 7,5 ou entre 7,0 e 7,4.
Em uma forma de realização particularmente preferida, o açúcar usado para criar um gradiente de densidade é a sacarose. Entretanto, esta invenção também considera o uso de outros açúcares, incluindo açúcares de álcool, um exemplo não limitante do qual é o sorbitol. Além disso, a invenção considera o uso de açúcares hidrogenados, açúcares lineares, açúcares modificados ou qualquer outro açúcar, contanto que o açúcar tenha uma solubilidade em água suficiente para produzir as soluções com as densidades aqui especificadas. Combinações de açúcares (i.e., dois ou mais açúcares), na mesma ou em camadas diferentes, também podem ser usadas para gerar os gradientes aqui descritos, contanto que as soluções de açúcar correspondentes que constituem estas camadas tenham as densidades aqui especificadas.
Em formas de realização preferidas, o volume da preparação que forma o gradiente está entre 5 % a 100 %, preferivelmente acima de 5 %, 10 % 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 32 %, 35 %, 40 %, 45 % ou 50 % ou menos do que 100 %, 90 %, 80 %; 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 48 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 % ou 25 %, do volume eficaz do rotor ou dispositivo de ultracentrifugação que aplica as forças centrífugas à amostra. Em outras formas de realização, o volume da preparação que forma gradiente está entre 1 % a 75 % do volume eficaz do rotor ou dispositivo de ultracentrifugação que aplica forças centrífugas à amostra.
Em formas de realização preferidas, a carga do rotor contendo o material que forma o gradiente é realizada em um modo contínua ou descontinuamente repetido (i.e., ultracentrifugação contínua ou ultracentrifugação por batelada), onde o volume carregado é preferivelmente mais alto do que o volume vazio do rotor (volume total menos o volume de gradiente), preferivelmente mais do que lx, 2x, 3x, 5x, lOx, 20x, 30x, 40x, 50x, 60x, 80x ou menos do que 300x, 250x, 200x, 150x, 120x, lOOx, 80x. Em certas formas de realização particularmente preferidas, a ultracentrifugação contínua é usada.
Em uma forma de realização particularmente preferida, o volume carregado está entre 20 L a 50 L por 600 ml a 1000 ml de volume vazio (volume do rotor de 1600 ml menos 600 ml a 1000 ml de volume vazio), que é de cerca de uma razão de 20x a 80x. Em uma outra forma de realização, o volume carregado está entre 40 L a 100 L por 1200 ml a 2000 ml de volume vazio (volume do rotor de 3200 ml menos 1200 ml a 2000 ml de volume vazio, que é de cerca de uma razão 20x a 80x).
Durante a centrifugação um gradiente do açúcar contínuo é estabelecido. Em uma outra forma de realização uma fração do centrifugado é coletada acima de uma concentração de sacarose de 24 % (equivalente a cerca de 1,10 kg/1), 26 %, 28 %, 30 %, 32 %, 34 %, 36 %, 38 %, 40 %, 42 %, 44 % ou 46 % (% p/p) (equivalente para cerca de 1,22 kg/1) e menos do que 66 % (equivalente a cerca de 1,32 kg/1), 63 %, 60 %, 58 %, 56 %, 54 %, 52 %, 50 %, 48 %, 46 % 44 % ou 42 % (% p/p) (equivalente para cerca de 1,19 kg/1). Normalmente, o produto viral acumula nesta faixa. Preferivelmente, uma fração do centrifugado é coletada entre uma concentração de sacarose de cerca de 30 % e 54 % (% p/p), mais preferido entre 36 % e 48 % (% p/p) de sacarose. As frações coletadas de gradientes formados de outros açúcares podem ter concentrações diferentes (% p/p), mas densidades equivalentes. As densidades da fração coletada podem estar acima de 1,10 kg/1, 1,12 kg/1, 1,14 kg/1, 1,16 kg/1 ou 1,18 kg/1, 1,20 kg/1, 1,22 kg/1 e abaixo de 1,32 kg/1, 1,30 kg/1, 1,28 kg/1, 1,26 kg/1, 1,24 kg/1, 1,22 kg/1 ou 1,20 kg/1. Em formas de realização particularmente preferidas, as densidades podem estar entre 1,13 e 1,25 kg/1, mais preferido entre 1,16 e 1,22 kg/1.
Em certas formas de realização, a concentração de tampão ou componente de tampão (por exemplo, solução salina tamponada com TRIS) está entre 2 mmoles/kg a 50 mmoles/kg, preferivelmente 5 mmoles/kg a 40 mmoles/kg, 10 mmoles/kg a 40 mmoles/kg, mais preferivelmente entre 10 mmoles/kg a 30 mmoles/kg, mais preferivelmente entre 18 mmoles/kg a 25 mmoles/kg e é mais preferido ser de 20 mmoles/kg. O tampão é preferivelmente aquoso com menos do que 5 % de solventes orgânicos miscíveis em água, mais preferivelmente menos do que 2 % de solventes orgânicos e é mais preferivelmente livre de solventes orgânicos. O tampão tem uma concentração de mais do que 2 mmoles/kg, 5 mmoles/kg, 10 mmoles/kg, 12 mmoles/kg, 14 mmoles/kg, 15 mmoles/kg, 17 mmoles/kg, 18 mmoles/kg, 19 mmoles/kg ou 20 mmoles/kg ou menos do que 50 mmoles/kg, 40 mmoles/kg, 35 mmoles/kg, 30 mmoles/kg, 25 mmoles/kg, 23 mmoles/kg ou 21 mmoles/kg.
A centrifugação pode ser realizada preferivelmente com uma força centrífuga de pelo menos 20.000 g, mais preferivelmente 30.000 g, mais preferivelmente 50.000 g, mais preferivelmente 70.000 g, mais preferivelmente 90.000 g, mas em outras formas de realização, a força centrífuga é de menos do que 200.000 g, menos do que 150.000 g, menos do que 120.000 g, menos do que lOO.OOOg ou menos do que 90.000 g.
Em formas de realização preferidas particulares, a razão de volume da camada inicial A para a camada inicial B (isto é, antes da aplicação da preparação viral) está entre 20:1 a 1:1, preferivelmente entre 10:1 a 1,5:1, mais preferivelmente entre 8:1 a 2:1 ainda mais preferivelmente entre 6:1 a 3:1 e o mais preferivelmente 4:1. A razão pode ser menor do que 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 5:1, 4:1, 3:1 ou maior do que 1:2, 1:1, 1,5:1, 2:1,3:1 ou 4:1.
Em uma forma de realização particularmente preferida, o fluido de centrifugação contendo açúcar é de camada dupla (isto é, que compreende as camadas de açúcar A e B de concentrações diferentes antes da adição da preparação viral, abaixo da camada de enchedor de líquido na ultracentrífuga). Naturalmente durante a centrifugação novos gradientes de concentração ou gradientes de densidade pode se formar. Entretanto, esta invenção também considera fluidos de centrifugação com mais do que duas camadas. Por exemplo, em certas formas de realização não limitante, o fluido de centrifugação é compreendido de 3, 4, 5, 6, 7 ou ainda 8 camadas diferentes. Cada camada pode ter o mesmo tampão como as outras camadas ou os tampões de cada camada podem ser independentemente escolhidos.
Em formas de realização particularmente preferidas, o método de preparação não compreende uma etapa de pré-clarificação. Entretanto, se desejado, a pré-clarificação pode ser realizada em uma câmara de préclarificação do aparelho de ultracentrifugação.
Em outras formas de realização a camada A compreende entre 40 % e 44 % (% p/p) de sacarose, preferivelmente de 41 % a 43 % (% p/p) de sacarose. A concentração de sacarose pode estar acima de 35 % (equivalente a cerca de 1,15 kg/1), 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 % ou 42 % (% p/p) (equivalente a cerca de 1,19 kg/1) ou abaixo de 50 % (equivalente a cerca de 1,23 kg/1), 49 %, 48 %, 47 %, 46 %, 45 %, 44 %, 43 % ou 42 % (% p/p) (equivalente a cerca de 1,19 kg/1). A camada A formada a partir de um outro açúcar teria uma concentração diferente em uma base em peso/peso, mas terá uma densidade que cai dentro das faixas de densidade aqui especificadas.
Em certas formas de realização, a camada B compreende uma solução de sacarose tendo uma concentração entre 50 % e 65 % (% p/p), preferivelmente entre 52 % e 58 % (% p/p) e mais preferivelmente entre 54 % e 56 % (% p/p). A concentração de sacarose (% p/p) pode estar acima de 50 % (equivalente a cerca de 1,23 kg/1), 51 %, 52 %, 53 %, 54 % ou 55 % (equivalente a cerca de 1,26 kg/1) ou abaixo de 66 % (equivalente a cerca de 1,32 kg/1), 64 %, 62 %, 61 %, 60 %, 59 %, 58 %, 57 %, 56 % ou 55 % (equivalente a cerca de 1,26 kg/1). A camada B formada de outros açúcares teria uma concentração diferente em uma base em peso/peso, mas terá uma densidade que cai dentro das faixas de densidade aqui especificadas.
Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o vírus é um ortomixovírus, em particular um vírus da influenza, preferivelmente selecionado de influenza A e B. Os exemplos não limitantes de outros vírus considerados pela invenção incluem os vírus selecionados do grupo de famílias de vírus de RNA tais como Reoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Arenaviridae, Retroviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae, Astroviridae, Bornaviridae e famílias de vírus de
DNA tais como Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae. Em certas formas de realização preferidas, o vírus é selecionado do grupo que consiste de Influenza A/Panama/2007/99, A/New Caledonia/20/99 e B/Shangdong/7/97.
Em algumas formas de realização da invenção, a colheita de vírus é preparada a partir de células inoculadas com o vírus. O vírus pode ser produzido em quaisquer células adequadas para a produção de vírus. Preferivelmente, as células são de uma cultura celular ou linhagem celular de animal. Tais células podem ser de um tecido específico ou células embrionárias tais como ovos embrionárias. O animal é preferivelmente um mamífero ou um pássaro. Em várias formas de realização da invenção, as células são células aviárias, caninas, de roedor ou de primata. Em formas de realização específicas, as células são células epiteliais, em particular preferidas células epiteliais renais, tais como células Vero de um macaco verde africano.
A colheita de vírus aplicada ao aparelho de ultracentrifugação pode ser a cultura celular inteira ou o sobrenadante de cultura celular obtidos depois de separar as células e/ou porções destas da cultura celular. Em algumas formas de realização da invenção, as células na cultura celular são deixadas sedimentar no vaso de cultura antes da drenagem de um sobrenadante de cultura celular. Em outras formas de realização da invenção, as células podem ser lisadas pelos métodos químicos ou mecânicos, os exemplos não limitantes dos quais incluem a lise hipo ou hipertônica, tratamento com detergente, sonicação e rompimento mecânico.
Preferivelmente, o vírus é inativado ou fragmentado (por exemplo, como descrito na WO 05/11800) antes ou depois da centrifugação. Adicionalmente, uma vacina do vírus pode ser preparada pelos métodos conhecidos na técnica. Uma vacina é uma composição imunogênica de uma substância antigênica, isto é, o vírus (não infeccioso), suas cascas, partículas ou seus antígenos, que pode ser usada para imunizar um animal, por exemplo, um mamífero tal como um ser humano ou um pássaro.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos sem estar limitada aos mesmos.
EXEMPLOS
Durante a purificação de antígeno viral da influenza, a colheita monovalente (MVH) é concentrada pela ultracentrifugação. Um procedimento de centrifugação de fluxo contínuo pode ser aplicado para a fabricação de vacina viral cultivada em cultura de célula Vero com base em um gradiente de sacarose formado usando uma solução de sacarose a 50 % (% p/p) em água. O modelo de rotor de centrífuga usado foi equipado com um pré-clarificador. Vários métodos de otimizar a fermentação como a troca do meio da cultura de célula Vero pela suplementação de hidrolisado de soja ou condições de temperatura elevada na fase inicial da replicação do vírus da Influenza resultaram em um processo mais robusto assim como rendimentos de antígeno aumentados. Portanto verificou-se que o gradiente de sacarose / água a 50 % (% p/p) não permitiu que se obtivesse a recuperação desejada devido às limitações na capacidade de ligação de antígeno. Além disso, as PMVHs (MVH purificada) de cepas virais New Caledonia, Panama e Shangdong mostrou agregação de antígeno inesperada nesta etapa de produção particular. Várias tentativas foram feitas para minimizar a agregação viral e a perda de vírus na etapa de centrifugação. Solução salina tamponada com TRIS ao invés de água foi usada para dissolver a sacarose para o material de gradiente. Além disso a modificação de usar duas soluções que formam gradiente com densidades diferentes foi introduzida para aumentar o volume do grupo de pico. Além disso, a ultracentrifugação sem pré-clarificador mas com forças g aumentadas mostrou ser uma ferramenta valiosa para a melhora de rendimento. Para provar este conceito, resultados de purificações anteriores com as condições padrão (50 % de sacarose em água, com pré-clarificador a
20.000 rpm - 90.000g) e novas (42 % e 55 % de sacarose (% p/p), 20 mmoles/kg de TRIS, 8 g/kg de NaCl, sem pré-clarificador a 35.000 rpm = 90.000g, com uma colheita de PMVH de 48 % a 36 % da fração de sacarose) foram avaliados.
Exemplo 1: Materiais e Métodos
Uma ultracentrífuga de fluxo contínuo CC40S com um rotor C40CTS (volume de rotor de 1.600 ml) ou uma ultracentrífuga Alfa Wassermann RK6 com um rotor equivalente foram usadas. As soluções de gradiente de sacarose foram carregadas ao rotor e depois aceleradas até a velocidade rotacional de 20.000 a 35.000 rpm. Depois da carga contínua com a colheita inativada, o rotor foi fluxado com tampão para remover a proteína residual, que não entrou no gradiente. Depois da fluxagem, o rotor foi desacelerado e a ultracentrifugação foi interrompida, permitindo que o gradiente mudasse da direção radial para axial do rotor. A eluição e fracionação foram realizada de acordo com as concentrações de sacarose. Uma unidade de detecção de densidade do tipo Coriolis e uma unidade de detecção UV 254 nm foram usados para monitorar a concentração de sacarose e proteína.
As amostras das colheitas inativadas purificadas foram medidas quanto a concentração de proteína total, HA-SRD e Antígeno Vero pelo ELISA de acordo com procedimentos padronizados para quantificar rendimento e pureza a partir dos experimentos de ultracentrifugação. Exemplo 2: Experimentos iniciais com um gradiente de TBS-sacarose
Várias rodadas de purificação em escala pequena com colheitas de vírus monovalente A/Panama/2007/99 indicaram que o uso de um gradiente de sacarose produzido a partir de uma mistura de 50 % p/p de sacarose com 50 % p/p de solução salina tamponada com Tris (20 mmoles/kg de TRIS, 8 g/kg de NaCl) (concentração final de 10 mmoles/kg de TRIS, 4 g/kg de NaCl) teve várias vantagens em relação ao sistema de sacarose / água padrão. Uma ultracentrífuga de laboratório modelo RK-6 foi usada para purificar alíquotas de MVH de 25 litros e 50 litros sob condições diferentes. Uma visão geral do ajuste de parâmetro e os resultados para as rodadas de purificação com os sistemas de sacarose / água e sacarose / TBS é dada na Tabela 1.
Tabela 1: Comparação do rendimento do antígeno
A/Panama/2007/99 da Influenza e a aparência de PMVH. Vírus purificado com gradiente de sacarose de experimentos de ultracentrifugação com préclarificador a 30.000g.
Rodada de Purificação Condições /Ajuste Carga de MVH (litro) Razão de HA-SRD/ proteína (mg/mg) Volume de grupo de pico (ml) Rendimento de antígeno (mg de antígeno /litro de colheita) PMVH (aparência)
1 Sacarose/água 800 ml 25 0,51 333 1,2 agregação
2 Sacarose/TBS 800 ml 25 0,34 440 2,0 agregação reduzida
3 Sacarose/TBS 800 ml 50 0,26 492 1,4 agregação reduzida
A partir da Tabela 1 pode ser concluído que os gradientes de sacarose em TBS têm diversas vantagens em relação aos gradientes padrão no sistema de sacarose / água. Para a Rodada de Purificação 1 um rendimento de
1,2 mg de colheita de antígeno/L pôde ser obtida, a fração de antígeno (PMVH) mostrou agregação viral inesperada. Os experimentos de purificação (rodada 2) com sacarose em TBS deu rendimentos de antígeno aumentados comparado com a rodada de referência 1. Para as preparações de TBS uma redução significante na fração de agregado pôde ser observada. Embora o gradiente de sacarose TBS tem várias vantagens em relação ao sistema padrão (sacarose / água), uma perda no rendimento de antígeno foi observada em cargas mais altas (50 litros comparados com 25 litros) do gradiente (rodada
3).
Em ambos os casos de usar TBS ao invés de água, o volume do grupo de pico aumentou, que é indicativo de mais difusão entre a colheita carregada e o gradiente contendo uma substância tampão e outros eletrólitos. Exemplo 3: Desenvolvimento de um gradiente de sacarose/TBS de duas etapas:
Este exemplo mostra uma forma de realização exemplar em que um gradiente de sacarose foi modificado para aumentar o volume da fração de grupo de pico sem mudar os limites para o fracionamento. Um gradiente de sacarose com uma concentração reduzida de 42 % (% p/p) foi usado, que resultou em um gradiente de sacarose menos pronunciado eluído da ultracentrífuga. De modo a garantir uma concentração de sacarose suficientemente alta no gradiente, uma solução de sacarose/TBS mais concentrada de 50 % (% p/p) foi carregada subsequente à solução de 42 % (% p/p), que, como uma solução de concentração mais alta, formou uma “almofada” para prevenir a sedimentação de antígeno na parede do rotor. A Tabela 2 mostra rodadas de purificação usando um tal gradiente de duas etapas com 900 ml de uma solução de sacarose/TBS menos concentrada (42 % p/p de sacarose, 11,7 mmoles/kg de TRIS, 4,7 g/kg de NaCI) e 100 ml de uma solução de sacarose/TBS mais concentrada (50 % p/p, 10 mmoles/kg de TRIS, 4 g/kg de NaCI), comparada com uma rodada de purificação usando um gradiente formado apenas com uma solução a 50 % de sacarose/TBS, aplicada em volumes diferentes (a saber, 600, 800 e 1000 ml). Os testes foram realizados com pré-clarificador a 20.000 rpm (RCF apr. 30.000g).
Aplicando-se as quantidades diferentes e concentração das soluções de sacarose/TBS o rendimento e a pureza do material não foram significantemente influenciados. Entretanto, o uso do gradiente de duas etapas formado pela mistura de 42 %/50 % (% p/p) de sacarose/TBS resultou em um aumento significante do volume do grupo de pico, que leva a melhores condições de purificação pela redução da concentração de antígeno para evitar sobrecarga da fração de grupo de pico.
Tabela 2: Comparação de rendimento de produto e pureza de antígeno de colheitas inativadas de A/Panama/2007/99 purificadas pela ultracentrifúgação com quantidades diferentes de Sacarose/TBS 50 % (% p/p) vs. um gradiente de Sacarose/TBS de duas etapas (50 %/42 % (% p/p)).
Rodada de Purificação Condições/Ajuste Razão de HASRD/proteína (mg/mg) Rendimento de antígeno (mg de antígeno/ litro de colheita) Volume de Reunião de Pico (ml)
1 Sacarose /TBS 50 % 600 ml 0,58 1,3 346
2 Sacarose / TBS 50 % 800 ml 0,58 1,3 325
3 Sacarose / TBS 50 % 1000 ml 0,45 1,1 338
4 Sacarose / TBS 42 % 900 ml 4- Sacarose / TBS 50 % 100 ml 0,53 1,5 713
Exemplo 4: Implementação de forças centrífugas relativas mais altas sem préclarificador:
Forças centrífugas relativas mais altas para a ultracentrifúgação foram investigadas para aumentar o rendimento de antígeno, entretanto a perda de material no pré-clarificador teve que ser esperada sob tais condições. Os rotores de ultracentrifúgação podem ser conduzidos com ou sem pré-clarificador, portanto uma comparação de 20.000 rpm (apr. 30.000g) com pré-clarificador e 35.000 rpm (apr. 90.000 g) em um gradiente de sacarose/TBS de duas etapas (100 ml de 50 % p/p de sacarose, concentração final de 10 mmoles/kg de TRIS, 4 g/kg de NaCl e 900 ml de 39 % p/p de sacarose, concentração final de 12,2 mmoles/kg de TRIS, 4,9 g/kg de NaCl) foi realizada. De modo a avaliar a perda potencial de antígeno, o pré-clarificador e a parede do rotor foram limpas com tampão e analisadas quanto as perdas de antígeno. Os resultados deste experimento são mostrados na Tabela 3. O rendimento de antígeno pode ser aumentado em mais de 60 % de 1,7 mg de colheita de HA-SRD/L para 2,8 mg de colheita de HA-SRD/L. A parte principal do antígeno perdido puderam ser limpas do pré-clarificador, ao passo que apenas cerca de 5 % do antígeno foi perdido na parede do rotor da ultracentrífuga. A razão de SRD/Proteína é apenas levemente reduzida pela omissão da pré-clarificação antes do carregamento da colheita no gradiente de sacarose/TBS.
Tabela 3: Comparação de rendimento de produto e perdas e pureza de antígeno pela ultracentrifugação de colheita inativada de A/Panama/2007/99 com forças centrífugas relativas diferentes com e sem pré5 clarificador.
Rodada de Purificação Condições / Ajuste Razão de HASRD/proteín a (mg/mg) Rendimento de antígeno (mg de antígeno /litro de colheita) Perda na parede do Rotor [mg SRD / L de colheita] Perda no Préclarificador [mg SRD / L de colheita]
1 20.000 rpm w/Préclarificador 0,63 1,7 0,1 1,4
2 35.000 rpm w/o Pré- clarificador 0,52 2,8 0,1 N/A
Exemplo 5: Modificação da concentração de TRIS e NaCl nos gradientes de sacarose
As formulações iniciais foram realizadas pela preparação de um gradiente de 50 % p/p de sacarose/TBS pela mistura de 50 % (peso) de 10 sacarose a 50 % (peso) de tampão TBS (20 mmoles/kg de TRIS, 8 g/kg de
NaCl) resultando nas concentrações finais de 10 mmoles/kg de TRIS e 4 g/kg de NaCl. Subsequentemente, formulações menos concentradas de soluções a 42 % a 39 % de sacarose/TBS foram preparados com quantidades mais altas de TBS, resultando em concentrações mais baixas de sacarose mas 15 correspondentemente concentrações mais altas de TRIS e NaCl (ver os exemplos anteriores). As soluções mais concentradas como, por exemplo, 55 % (p/p) de sacarose em TBS tiveram portanto concentrações mais baixas de TRIS e NaCl.
De modo a padronizar a concentração de TRIS e NaCl em tais 20 preparações uma nova formulação foi planejada onde 42 % a 55 % em peso de sacarose foram adicionados ao recipiente de mistura, 20 mmoles/kg (2,42 g/kg) de TRIS e 8 g/kg de NaCl foram adicionados e enchidos com água até 100 % em peso. Tais preparações depois tiveram concentrações signifícantemente (cerca de 2x) mais alta de TRIS e NaCl comparadas com as formulações usadas em exemplos anteriores. Também medições refratométricas de tais formulações resultaram em resultados refratométricos de cerca de 2o (Io a 3o) Brix mais altos, devido à menor quantidade de água, que foi substituída pela adição de TRIS e NaCl antes de encher até o peso final de 100 %.
Em um experimento, duas versões diferentes de gradientes de sacarose/TBS de duas etapas foram comparadas. Gradientes foram formados pela adição de 200 ml da solução de sacarose/TBS concentrada mais alta para criar uma almofada de sacarose mais robusta, de densidade alta no gradiente, depois de carregar com 800 ml de sacarose/TBS a 42 %.
Os resultados das diferentes preparações de sacarose /TBS em um experimento de ultracentrífúga são mostrados na Tabela 4. Nenhuma diferença significante pôde ser observada com respeito ao rendimento ou pureza quando concentrações de TRIS e NaCl diferentes foram usadas. Tabela 4: Comparação de Rendimento e Pureza de Produto de Antígeno pela Ultracentrifugação de colheita inativado de A/Panama/2007/99 com preparações de Sacarose/TBS diferentes com concentrações de TRIS e NaCl diferente.
Rodada de Purificação Condições /Ajuste Razão de HA- SRD/proteína (mg/mg) Rendimento de antígeno (mg antígeno / litro de colheita)
1 42 % de sacarose em TBS (12,2 mmoles/kg de TRIS / 4,9 g/kg de NaCl) 55 % de sacarose em TBS (8,9 mmoles/kg de TRIS / 3,6 g/kg de NaCl) 0,42 5,0
2 42 % de sacarose em TBS (20 mmoles/kg de TRIS / 8 g/kg de NaCl) 55 % de sacarose em TBS (20 mmoles/kg de TRIS / 8 g/kg de NaCl) 0,39 (1,8
Exemplo 6: Capacidade de Carga do rotor e investigação da taxa de fluxo de carga
Volumes de colheita diferentes de três cepas diferentes foram investigados para avaliar a capacidade do procedimento de ultracentrifugação otimizado e para investigar problemas de aumentos potenciais na fabricação, quando volumes de colheita mais altos devam ser aplicados ao procedimento de ultracentrifugação. As colheitas inativadas foram carregadas com 15 a 17 L e 45 a 51 L no rotor de 1600 ml.
Neste experimento, a mesma versão modificada do gradiente de sacarose/TBS de etapa dupla foi aplicada como no exemplo 5 anterior. Primeiro, a concentração da solução de densidade mais alta foi aumentada para 55 % p/p e um volume mais alto de 200 ml foi usado para criar uma almofada de sacarose de densidade alta mais robusta no gradiente, depois de carregar com 800 ml de sacarose/TBS a 42 %. A concentração de TRIS final no gradiente foi aumentada para 20 mmoles/kg e a concentração de NaCl final foi aumentada para 8 g/kg em ambas as soluções de sacarose/TBS. As condições de ultracentrifugação foram de 35.000 rpm (90.000 g) sem préclarificador e o fracionamento foi realizado entre 48 % e 36 % de sacarose.
Os resultados do experimento de capacidade de carga são mostrados na Tabela 5.
Com o gradiente da invenção e a força de centrifugação mais alta sem pré-clarificador apenas diferenças menores no rendimento de cerca de 3 % a 6 % nos volumes de carga de colheita diferentes puderam ser observadas. Isto está em contraste com a capacidade de carga limitada demonstrada no Exemplo 2 / Tabela 1, onde para a cepa A/Panama/2007/99 um aumento do volume de colheita de 25 litros para 50 litros resultou em uma diminuição no rendimento de cerca de 30 %. Este rendimento melhorado pode ser explicado pela combinação de forças centrífugas relativas aumentadas e pela melhora do perfil de gradiente e volume de grupo de pico devido ao gradiente de sacarose/TBS de etapa dupla.
Tabela 5: Comparação de Rendimento e Pureza de Produto de Antígeno pela
Ultracentrifugação com Volumes de Carga Diferentes.
Rodada Purificação de Cepa / Volume de Colheita Carregado Razão de HA- SRD/proteína (mg/mg) Rendimento de antígeno (mg antígeno / litro de colheita)
1 A/New Caledonia/20/99 45 litros 0,37 1,6
2 A/New Caledonia/20/99 15 litros 0,45 1,7
3 A/Panama/2007/99 51 litros 0,36 1,9
4 A/Panama/2007/99 17 litros 0,44 2,0
5 B/Shangdong/7/97 45 litros 0,44 6,0
6 B/Shangdong/7/97 15 litros 0,51 6,2
Exemplo 7: Comparação dos procedimentos de ultracentrifugação inventivo e convencional
O uso combinado de:
a) 90.000g (35.000 rpm) sem pré-clarificador (ao invés de 30.000g (20.000 rpm) com pré-clarificador)
b) um gradiente de sacarose em TBS (ao invés de sacarose em água) com uma concentração final de 20 mmoles/kg de TRIS e 8 g/kg de
NaCl
c) formar um tal gradiente com duas concentrações de sacarose diferentes (200 ml a 55 % + 800 ml a 42 %) para aumentar o volume da fração de grupo de pico (ao invés de 800 ml de sacarose a 50 %) foi comparado com um procedimento de ultracentrifugação anterior, convencional (Tabela 6).
Tabela 6: Condições e ajuste da fabricação e escala pequena (versão infra escala de 1:2) operação da unidade de purificação nas condições padrão (50 % de sacarose em água) e novas.
Método Gradiente Sacarose Carga Viral (1/h) RPM Fracionamento
padrão Sacarose/ água 800 ml 50 % 12,5 20.000 ac. com sinal UV (max. 50 % a 34 %)
novo Sacarose/ TBS 20 mM 800 ml 42 % 200 ml 55 % 12,5 35.000* 48 % a 36 %
* sem pré-clarificador
Três experimentos comparativos foram realizados com as cepas 2002/2003 (a saber, A/New Caledonia/20/99, A/Panama/2007/99 e B/Shangdong/7/97). Os limites do fracionamento do grupo de pico para estas rodadas foram definidos com 48 % a 36 % (% p/p) de sacarose. Os resultados são mostrados no Exemplo 8 ao Exemplo 10.
Os resultados das rodadas de purificação com Influenza New
Caledonia, Panama e Shangdong sob condições padrão (50 % de sacarose / água) e modificada (gradiente de sacarose / TBS) foram comparadas com base nos parâmetros de rendimento e qualidade de produto.
Exemplo 8: Purificação da Cepa da Influenza A/New Caledonia/20/99
Experimentos de purificação com condições de acordo com o procedimento padrão e os novos parâmetros de gradiente de sacarose / TBS de acordo com a Tabela 6 foram realizados com New Caledonia MVH. Na Tabela 7 uma comparação dos resultados das rodadas de purificação é dada.
Tabela 7: Comparação de rendimento de antígeno de A/New Caledonia/20/99, razão de HA / proteína e impureza da proteína Vero. Vírus purificado no gradiente de sacarose com o método 2001/2002 convencional vs gradiente de TBS modificado.
Rodada de Purificação Rendimento de antígeno (mg de antígeno / litros de colheita) Razão de HA/ proteína total Razão de proteína Vero/ HA
Padrão 2,7 0,41 0,06
Novo (gradiente TBS) 3,4 0,60 0,07
A partir dos dados na Tabela 7, pode ser concluído que uma melhora de processo significante foi obtida com as novas condições de purificação de gradiente de sacarose / TBS para a cepa da Influenza A/New Caledonia/20/99. Um aumento significante no rendimento do vírus de 2,7 a
3,4 mg de antígeno por litro de MVH foi demonstrado para esta cepa particular. A qualidade de antígeno viral medido como razão de proteína HA / total e razão de proteína Vero/ HA mostra que este aumento em doses por litros não comprometeu a qualidade do antígeno. Um leve aumento na HA / proteína total de 0,41 a 0,60 foi obtido com as novas condições de gradiente de sacarose. Para a razão de proteína de célula hospedeira / HA nenhuma diferença significante pôde ser detectada. Sob as condições de gradiente de sacarose / TBS para a produção de PMVH, a agregação da cepa A/New Caledonia/20/99 foi levemente reduzida. Este efeito pôde ser confirmado pela observação microscópica (ver, por exemplo, a FIG. IA e FIG. 1B). Na ampliação de 400x a mais forte, a formação de agregados é claramente visível quando da aplicação da versão de gradiente de sacarose/água anterior (FIG. IA), ao passo que a despeito dos rendimentos aumentados, a fração de grupo de pico derivada do procedimento de ultracentrifugação otimizado parece ser significantemente mais homogêneo (FIG. 1B).
Exemplo 9: Purificação da cepa da influenza A/Panama/2007/99
Experimentos de purificação com condições de acordo com o procedimento padrão e os novos parâmetros de gradiente de sacarose / TBS de acordo com a Tabela 6 foram realizados com Panama MVH. Na Tabela 8 uma comparação dos resultados das rodadas de purificação é dada.
Tabela 8: Comparação de rendimento de antígeno de A/Panama/2007/99, razão de HA / proteína e impureza de proteína Vero. Vírus purificado com 5 gradiente de sacarose com o método padrão vs o método de gradiente de TBS da invenção.
Rodada de Purificação Rendimento de antígeno (mg antígeno / litros de colheita) Razão de HA / proteína total Razão de proteína Vero / HA
Padrão 2,0 1,47 0,06
Novo (gradiente de TBS) 5,5 0,77 0,07
A partir dos dados na Tabela 8 pode ser concluído que uma melhora de processo significante foi obtida com as novas condições de purificação em gradiente de sacarose / TBS para a cepa da Influenza Panama.
Um aumento significante no rendimento viral de 2,0 a 5,5 mg de antígeno por litro de MVH foi demonstrado para esta cepa particular pela aplicação das novas condições de gradiente de sacarose / TBS. Uma razão de HA / proteína total de 0,77 foi obtida, ao passo que para o PMVH produzido sob as condições padrão a razão calculada foi de 1,47. Devido ao fato de que nenhuma diferença significante pôde ser observada para a razão de proteína
Vero/ HA de PMVHs produzidas com ambos os procedimentos, é assumido que a agregação do antígeno Panama (como observado em uma comparação de microfotografia de PMVHs Panama (não mostrado)) pode ser a causa para a razão de HA / proteína total não usual de 1,47. Para ambos os 20 procedimentos de purificação, a qualidade do antígeno viral medida como a razão de HA / proteína total e razão de proteína Vero/ HA é aceitável. Mas, sob as condições de gradiente de sacarose TBS para a produção de PMVH, a agregação da cepa Panama pôde ser significantemente reduzida usando o gradiente de sacarose /TBS.
Exemplo 10: Purificação da cepa B/Shangdong/7/97
Os experimentos de purificação com condições de acordo com o procedimento padrão e os novos parâmetros de gradiente de sacarose / TBS de acordo com a Tabela 6 foram realizados com MVH Shangdong. Na Tabela 9 uma comparação dos resultados das rodadas de purificação é dada.
Tabela 9: Comparação de rendimento de antígeno de B/Shangdong/7/97, razão HA/proteína e impureza de proteína Vero. Vírus purificado com gradiente de sacarose com o método padrão vs novo método do gradiente de TBS.
Rodada de Purificação Rendimento de antígeno (mg de antígeno / litros dd colheita) Razão de HA / proteína total Razão de proteína Vero/ HA
padrão 2,2 0,55 0,10
novo (gradiente de TBS) 5,1 0,34 0,20
A partir dos dados na Tabela 9, pode ser concluído que uma melhora de processo significante foi obtida com as condições de purificação de gradiente de sacarose/TBS da invenção para a cepa B da Influenza /Shangdong/7/97. Um aumento significante no rendimento viral de 2,2 a 5,1 mg de antígeno por litro de MVH foi demonstrado para esta cepa particular. A razão de HA / proteína total reduzida de 0,34 para a MVH purificada com sacarose / TBS situa-se dentro da faixa de especificação das PMVHs da Influenza. Outras melhoras da fase de replicação do vírus B/Shangdong/7/97 permitiu estabelecer um processo de produção mais compatível pela troca do perfil de dosagem de tripsina. Sob as condições do gradiente de sacarose TBS para a produção de PMVH, a agregação da cepa B/Shangdong/7/97 foi significantemente reduzida como confirmado por uma microfotografia (não mostrada) de PMVHs Shangdong purificadas com as condições padrão versus TBS.
Nos experimentos em escala grande e pequena exemplares aqui fornecidos, foi demonstrado que o gradiente de sacarose da invenção permite a carga eficiente das colheitas monovalentes. Existem muitas vantagens de usar os métodos da invenção aqui descritos, incluindo 1) rendimento viral aumentado de pelo menos 25 %, 2) uma razão de HA / proteína total dependente da cepa de 0,34 a 0,77, 3) um teor de proteína da célula hospedeira dependente da cepa de 2 % a 7 % e 4) agregação viral 5 minimizada no grupo de pico da sacarose (PMVH).

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para purificar um vírus ou antígeno viral, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma solução que forma gradiente contendo um gradiente de açúcar pela centrifugação de pelo menos uma primeira solução de açúcar tamponada e pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada, em que a concentração de açúcar na primeira solução de açúcar tamponada tem um equivalente de sacarose entre 35 % e 50 % (% p/p) e a concentração de açúcar na segunda solução de açúcar tamponada tem um equivalente de sacarose entre 50 % e 65 % (% p/p), em que a segunda solução de açúcar tamponada tem uma densidade mais alta do que a primeira solução de açúcar tamponada, e em que a razão de volume da primeira solução de açúcar tamponada para a pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada é maior ou igual a 3:1;
adicionar uma preparação viral ao gradiente de açúcar;
centrifugar a preparação viral e o gradiente de açúcar para obter um grupo de pico; e extrair o grupo de pico para obter o vírus ou antígeno viral.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume da solução que forma gradiente está entre 5 % e 100 % do volume do rotor de ultracentrifugação.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo de pico tem uma densidade entre 1,13 kg/l e 1,25 kg/l.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo de pico é coletado com um equivalente de sacarose entre 30 % e 54 % (% p/p) de sacarose.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos tampões tem uma concentração entre 5 mM e 50 mM.
Petição 870190003099, de 10/01/2019, pág. 13/16
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um tampão tem uma concentração entre 15 mM e 30 mM.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um tampão tem uma concentração entre 18 mM e 25 mM.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de centrifugar a preparação viral é realizada com uma centrifugação relativa de pelo menos 20.000 g.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita força de centrifugação relativa é de pelo menos 30.000 g.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita força de centrifugação relativa é de pelo menos 90.000 g.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita razão de volume está entre 6:1 e 3:1.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita solução contendo um gradiente de açúcar compreende duas camadas.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita preparação não compreende um pré-clarificador.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma primeira solução de açúcar tamponada compreende um açúcar em uma faixa de concentração de 40 % a 44 % (% p/p) de equivalente de sacarose.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma primeira solução de açúcar tamponada compreende um açúcar em uma faixa de concentração de 41 % a 43 % (% p/p) de equivalente de sacarose.
Petição 870190003099, de 10/01/2019, pág. 14/16
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada compreende um açúcar em uma faixa de concentração de 52 % a 58 % (% p/p) de equivalente de sacarose.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada compreende um açúcar de 54 % a 56 % de equivalente de sacarose.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito vírus é um ortomixovírus.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito vírus é um vírus da influenza.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita preparação viral compreende células inoculadas com o vírus.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as ditas células são de uma cultura celular ou linhagem celular de animal.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as ditas células são células epiteliais.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as ditas células são células epiteliais renais.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as ditas células são células Vero.
25. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito vírus é inativado.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito vírus é fragmentado.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de tampão é uma amina.
Petição 870190003099, de 10/01/2019, pág. 15/16
28. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de tampão é TRIS.
29. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão é solução salina tamponada com TRIS.
30. Método para preparar uma vacina contra um vírus ou antígeno viral, caracterizado pelo fato de compreender obter o dito vírus ou antígeno viral usando o método como definido na reivindicação 1.
31. Método para purificar um vírus ou antígeno viral, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma solução que forme gradiente contendo um gradiente de açúcar pela centrifugação de pelo menos um primeira solução de açúcar tamponada e pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada, em que a densidade da primeira solução tamponada é de 1,15 kg/l a 1,23 kg/l e a densidade da segunda solução de açúcar tamponada é de 1,23 kg/l a 1,32 kg/l, em que a segunda solução de açúcar tamponada tem uma densidade mais alta do que a primeira solução de açúcar tamponada, e em que a razão de volume da primeira solução de açúcar tamponada para a pelo menos uma segunda solução de açúcar tamponada é maior ou igual a 3:1;
adicionar uma preparação viral para o gradiente de açúcar;
centrifugar a preparação viral e o gradiente de açúcar para obter um grupo de pico; e extrair o grupo de pico para obter o vírus ou antígeno viral.
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