JPH0665095A - Ａ型肝炎ウイルスキャプシッドの新規な精製法 - Google Patents
Ａ型肝炎ウイルスキャプシッドの新規な精製法Info
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- JPH0665095A JPH0665095A JP3177934A JP17793491A JPH0665095A JP H0665095 A JPH0665095 A JP H0665095A JP 3177934 A JP3177934 A JP 3177934A JP 17793491 A JP17793491 A JP 17793491A JP H0665095 A JPH0665095 A JP H0665095A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
- C12N2770/32434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 （ａ）ＨＡＶ感染細胞溶解物の水相をイオン
交換クロマトグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）の流出液をイオン交換クロマトグラフィー
にかける；及び （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかける。 【効果】 界面活性剤あるいは外来性の酵素を用いるこ
となしに極めて純粋なＨＡＶキャプシッドを得ることが
できる。
交換クロマトグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）の流出液をイオン交換クロマトグラフィー
にかける；及び （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかける。 【効果】 界面活性剤あるいは外来性の酵素を用いるこ
となしに極めて純粋なＨＡＶキャプシッドを得ることが
できる。
Description
【０００１】Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）は形態学的、
生化学的及び免疫学的にも明らかにピコルナウィルスの
一員であり、ヒトにおける伝染性肝炎の原因因子であ
る。
生化学的及び免疫学的にも明らかにピコルナウィルスの
一員であり、ヒトにおける伝染性肝炎の原因因子であ
る。
【０００２】研究に際してのＨＡＶ粒子の部分精製に関
する種々の方法や粒子の特徴に関しての記載が多数あ
る。例えばホーンベック、シー．エル．(Hornbeck,C.
L.) 等、インターヴィロロジー(Intervirology) 、第６
巻：第３０９−３１４頁（１９７５）；ロカーニニ、エ
ス．エー．(Locarnini,S.A.)等、インターヴィロロジー
(Intervirology) 、第１０巻：第３００−３０８頁（１
９７８）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)等、ジェイ．ヴ
ィロル．(J.Virol.)、第２６巻、第４０−４７頁（１９
７８）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)等、ジェイ．ジェ
ン．ヴィロル．(J.Gen.Virol.)、第５７巻、第３３１−
３４１頁（１９８１）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)
等、インターヴィロロジー(Intervirology) 、第２２
巻、第２１８頁（１９８４）；フューエス、ジェイ．ヴ
ィ．(Hughes,J.V.) 等、ジェイ．ヴィロル．(J.viro
l.)、第５２巻、第４６５頁（１９８４）；及びウィー
レル、シー．エム．(Wheeler,C.M.)等、ジェイ．ヴィロ
ル、(J.Virol.)、第５８巻、第３０７（１９８６）を参
照。以上記載の各方法には、人体用として用いるなら
ば、どの様なＨＡＶワクチンであろうとも食品医薬品局
からは承認されないであろうステップが１つないしそれ
以上用いられており、あるいは市販品としては非実用的
なものもある。例えば、界面活性剤及び／あるいは外来
性の酵素が一般的に使用されたり、またショ糖密度勾配
遠心法あるいはＣｓＣｌ−密度勾配遠心法などの扱いに
くく、非実用的であまりにも不経済な方法が用いられて
いる。
する種々の方法や粒子の特徴に関しての記載が多数あ
る。例えばホーンベック、シー．エル．(Hornbeck,C.
L.) 等、インターヴィロロジー(Intervirology) 、第６
巻：第３０９−３１４頁（１９７５）；ロカーニニ、エ
ス．エー．(Locarnini,S.A.)等、インターヴィロロジー
(Intervirology) 、第１０巻：第３００−３０８頁（１
９７８）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)等、ジェイ．ヴ
ィロル．(J.Virol.)、第２６巻、第４０−４７頁（１９
７８）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)等、ジェイ．ジェ
ン．ヴィロル．(J.Gen.Virol.)、第５７巻、第３３１−
３４１頁（１９８１）；シーグル、ジー．(Siegl,G.)
等、インターヴィロロジー(Intervirology) 、第２２
巻、第２１８頁（１９８４）；フューエス、ジェイ．ヴ
ィ．(Hughes,J.V.) 等、ジェイ．ヴィロル．(J.viro
l.)、第５２巻、第４６５頁（１９８４）；及びウィー
レル、シー．エム．(Wheeler,C.M.)等、ジェイ．ヴィロ
ル、(J.Virol.)、第５８巻、第３０７（１９８６）を参
照。以上記載の各方法には、人体用として用いるなら
ば、どの様なＨＡＶワクチンであろうとも食品医薬品局
からは承認されないであろうステップが１つないしそれ
以上用いられており、あるいは市販品としては非実用的
なものもある。例えば、界面活性剤及び／あるいは外来
性の酵素が一般的に使用されたり、またショ糖密度勾配
遠心法あるいはＣｓＣｌ−密度勾配遠心法などの扱いに
くく、非実用的であまりにも不経済な方法が用いられて
いる。
【０００３】出願者は界面活性剤あるいは外来性の酵素
を用いることなしに極めて純粋なＨＡＶキャプシッドを
得る方法を発見した。さらに、ここに書かれている方法
を用いれば、たやすく市販用製造レベルにまでスケール
アップする事が可能である。その上さらに、人体用ワク
チン製造に関して、食品医薬品局よりその使用が認めら
れているヒト二倍体繊維芽細胞であるＭＲＣ−５に対し
ても、出願者はその方法を開発した。
を用いることなしに極めて純粋なＨＡＶキャプシッドを
得る方法を発見した。さらに、ここに書かれている方法
を用いれば、たやすく市販用製造レベルにまでスケール
アップする事が可能である。その上さらに、人体用ワク
チン製造に関して、食品医薬品局よりその使用が認めら
れているヒト二倍体繊維芽細胞であるＭＲＣ−５に対し
ても、出願者はその方法を開発した。
【０００４】実質的なＨＡＶキャプシッドの精製方法が
示されており以下のステップより成る。 （ａ）ＨＡＶ感染細胞溶解物の水相をイオン交換クロマ
トグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）の流出液をイオン交換クロマトグラフィー
にかける；及び （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかけ実質的な精製ＨＡＶキャプシッドを得る。
示されており以下のステップより成る。 （ａ）ＨＡＶ感染細胞溶解物の水相をイオン交換クロマ
トグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）の流出液をイオン交換クロマトグラフィー
にかける；及び （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかけ実質的な精製ＨＡＶキャプシッドを得る。
【０００５】本発明の商業的に適応しうる精製方法は、
その由来が弱毒であろうと、強毒であろうと、またＨＡ
Ｖの感染に感受性を示すならばどの様な細胞系あるいは
培養細胞からでも産出されたすべてのＨＡＶキャプシッ
ドの精製を含むものである。さらに欠損（ウィルス核酸
を持たないもの）であれ完全（ウィルス核酸を含むも
の）であれ、すべてのＨＡＶキャプシッドに対しても本
発明の方法に含まれる。
その由来が弱毒であろうと、強毒であろうと、またＨＡ
Ｖの感染に感受性を示すならばどの様な細胞系あるいは
培養細胞からでも産出されたすべてのＨＡＶキャプシッ
ドの精製を含むものである。さらに欠損（ウィルス核酸
を持たないもの）であれ完全（ウィルス核酸を含むも
の）であれ、すべてのＨＡＶキャプシッドに対しても本
発明の方法に含まれる。
【０００６】ＨＡＶ変異株Ｐ１８のＣＲ３２６Ｆは本発
明におけるＭＲＣ−５への感染に用いられているが、こ
れは単に本発明の目的を説明する為である。Ｐ１８ＣＲ
３２６ＦとはＨＡＶの弱毒株である。一般的な手法で弱
毒化されたＨＡＶ株も含め、他の株及び／あるいは他の
血清型のＨＡＶキャプシッドに対しても本発明に含まれ
ている。ＨＡＶの増殖に適切な細胞系としては、他にVe
ro、ＦＬ、ＷＩ−３８及びＦＲｈＫ６細胞がある。細胞
培養によるＨＡＶの増殖に関して、これら及び他のシス
テムはゲレティ、アール．ジェイ．(Gerety,R.J.) “ア
クティブ イムナイゼーション アゲインスト ヘパテ
ィティスＡ、”("Active ImmunizationAgainst Hepatit
is A ,") 、ヘパティティス Ａ アカデミック プレ
ス(Hepatitis A Academic Press)１９８４、pp，２６３
−２７６、ゲレティ、アール．ジェイ．著、の中に記載
されており、またティケハルスト、ジェイ．アール．(T
icehurst,J.R.)、セミナーズ イン リバー ディジー
ズ(Seminars in Liver Disease) 、第６巻、第４６−５
５頁（１９８６）にも述べられている。本質的には、い
かなる細胞系であれ、例えばどの様なヒト二倍体繊維芽
細胞であっても、ＨＡＶ感染に対して感受性であるなら
ば、ＨＡＶの産生に関する宿主細胞になりうるという事
である。そして好ましい細胞系としてＭＲＣ−５があげ
られている。
明におけるＭＲＣ−５への感染に用いられているが、こ
れは単に本発明の目的を説明する為である。Ｐ１８ＣＲ
３２６ＦとはＨＡＶの弱毒株である。一般的な手法で弱
毒化されたＨＡＶ株も含め、他の株及び／あるいは他の
血清型のＨＡＶキャプシッドに対しても本発明に含まれ
ている。ＨＡＶの増殖に適切な細胞系としては、他にVe
ro、ＦＬ、ＷＩ−３８及びＦＲｈＫ６細胞がある。細胞
培養によるＨＡＶの増殖に関して、これら及び他のシス
テムはゲレティ、アール．ジェイ．(Gerety,R.J.) “ア
クティブ イムナイゼーション アゲインスト ヘパテ
ィティスＡ、”("Active ImmunizationAgainst Hepatit
is A ,") 、ヘパティティス Ａ アカデミック プレ
ス(Hepatitis A Academic Press)１９８４、pp，２６３
−２７６、ゲレティ、アール．ジェイ．著、の中に記載
されており、またティケハルスト、ジェイ．アール．(T
icehurst,J.R.)、セミナーズ イン リバー ディジー
ズ(Seminars in Liver Disease) 、第６巻、第４６−５
５頁（１９８６）にも述べられている。本質的には、い
かなる細胞系であれ、例えばどの様なヒト二倍体繊維芽
細胞であっても、ＨＡＶ感染に対して感受性であるなら
ば、ＨＡＶの産生に関する宿主細胞になりうるという事
である。そして好ましい細胞系としてＭＲＣ−５があげ
られている。
【０００７】ＨＡＶ感染細胞の培養及びハーベストは多
数ある一般的方法より１つないしそれ以上の手段を用い
て行なわれる。培地の選択も含めて培養の条件は用いた
細胞系の要求に従がうものである。ＭＲＣ−５は吸着面
依存性なので、培養容器下層部への付着必でありこの
為、ハーベスト時には、物理的、化学的もしくは酵素を
用いた細胞の脱離操作が要求される。本発明の目的に有
益なその他の細胞型としては浮遊培養可能な細胞があ
り、これは常に遠心によってハーベストされる。
数ある一般的方法より１つないしそれ以上の手段を用い
て行なわれる。培地の選択も含めて培養の条件は用いた
細胞系の要求に従がうものである。ＭＲＣ−５は吸着面
依存性なので、培養容器下層部への付着必でありこの
為、ハーベスト時には、物理的、化学的もしくは酵素を
用いた細胞の脱離操作が要求される。本発明の目的に有
益なその他の細胞型としては浮遊培養可能な細胞があ
り、これは常に遠心によってハーベストされる。
【０００８】培養及びハーベストの後、ＨＡＶ感染細胞
は種々の手法の中より１つあるいはそれ以上の方法によ
り溶解される。低張緩衝液に溶かす、ボルテックスにか
ける、凍結融解を繰り返す、音波処理にかける、しかし
これらに限定されるものではない。破壊された細胞より
得られた懸濁液は、１つあるいはそれ以上の細胞破壊操
作の組み合わせにより得られたものであっても、これよ
り後、ここでは“セルライセイト”("cell lysate") と
して示す。出願者は、細胞よりＨＡＶキャプシッドを効
率よく分離する為に、そのＨＡＶ感染細胞であるＭＲＣ
−５を十分にかつ完全に溶解させるのに好ましい可溶化
操作とは音波処理である事をつきとめた。（破壊された
細胞から分離されたＨＡＶキャプシッドがどの様なもの
であれこれより後、ここでは“リシス”("lysis") とし
て示す。）感染細胞中の細胞質内で偽結晶化状態になっ
ている所より効率よくＨＡＶキャプシッドを分離するに
は音波処理であると思われている。さらにより好ましい
方法は、低張液溶解、ボルテックスあるいは凍結融解の
繰り返しなどの他の可溶化操作を１つあるいは数種、音
波処理と併用する事にある。ＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞
を可溶化するのに出願者が用いた最も好ましい方法は次
のステップから成る。 （１）チューブ中にある凍結ハーベスト細胞を融解し、
可溶化緩衝液（１０mM−トリス−ＨＣｌ pH７．５、１
０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 ）を加える； （２）強くボルテックスする（１０−１５秒セッティン
グ１０、ボルテックス−ジェニィー（Vortex-genie) 使
用）； （３）凍結融解を１回あるいは数回繰り返す。エタノー
ル−ドライアイス浴による凍結、３７℃水浴中における
融解を連続させて行なう；及び （４）循環氷水浴中でカップ ホーン ソニケーターの
ワット出力を最大にして３０秒、１回ないし数回音波処
理する（ブランソン ソニフィール セル ディスラプ
ター(Branson Sonifier Cell Disrupter) １８５及びウ
ルトラ ソニックカップ ホーン）。
は種々の手法の中より１つあるいはそれ以上の方法によ
り溶解される。低張緩衝液に溶かす、ボルテックスにか
ける、凍結融解を繰り返す、音波処理にかける、しかし
これらに限定されるものではない。破壊された細胞より
得られた懸濁液は、１つあるいはそれ以上の細胞破壊操
作の組み合わせにより得られたものであっても、これよ
り後、ここでは“セルライセイト”("cell lysate") と
して示す。出願者は、細胞よりＨＡＶキャプシッドを効
率よく分離する為に、そのＨＡＶ感染細胞であるＭＲＣ
−５を十分にかつ完全に溶解させるのに好ましい可溶化
操作とは音波処理である事をつきとめた。（破壊された
細胞から分離されたＨＡＶキャプシッドがどの様なもの
であれこれより後、ここでは“リシス”("lysis") とし
て示す。）感染細胞中の細胞質内で偽結晶化状態になっ
ている所より効率よくＨＡＶキャプシッドを分離するに
は音波処理であると思われている。さらにより好ましい
方法は、低張液溶解、ボルテックスあるいは凍結融解の
繰り返しなどの他の可溶化操作を１つあるいは数種、音
波処理と併用する事にある。ＨＡＶ感染ＭＲＣ−５細胞
を可溶化するのに出願者が用いた最も好ましい方法は次
のステップから成る。 （１）チューブ中にある凍結ハーベスト細胞を融解し、
可溶化緩衝液（１０mM−トリス−ＨＣｌ pH７．５、１
０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2 ）を加える； （２）強くボルテックスする（１０−１５秒セッティン
グ１０、ボルテックス−ジェニィー（Vortex-genie) 使
用）； （３）凍結融解を１回あるいは数回繰り返す。エタノー
ル−ドライアイス浴による凍結、３７℃水浴中における
融解を連続させて行なう；及び （４）循環氷水浴中でカップ ホーン ソニケーターの
ワット出力を最大にして３０秒、１回ないし数回音波処
理する（ブランソン ソニフィール セル ディスラプ
ター(Branson Sonifier Cell Disrupter) １８５及びウ
ルトラ ソニックカップ ホーン）。
【０００９】セルライセイトを緩衝液で希釈後、有機溶
媒による抽出を行なう。その様な抽出により、他の夾雑
物中より、脂質及び脂質様物質を取り除く。その為に
は、セルライセイトを、リン酸緩衝生理水、トリス、炭
酸、重炭酸あるいは酢酸緩衝液などの種々の緩衝液の中
のいずれか１つを用いて希釈する。ＨＡＶキャプシッド
はいくぶん酸耐性を示すので、酸性pH領域中の緩衝液が
適切であろう。緩衝液中のＭｇＣｌ2 の存在はＨＡＶキ
ャプシッドの収量を著るしく低下させる事を出願者は発
見した。最も好ましい緩衝液はＴＮＥ（１０mM トリス
−ＨＣｌ pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤ
ＴＡ）である。
媒による抽出を行なう。その様な抽出により、他の夾雑
物中より、脂質及び脂質様物質を取り除く。その為に
は、セルライセイトを、リン酸緩衝生理水、トリス、炭
酸、重炭酸あるいは酢酸緩衝液などの種々の緩衝液の中
のいずれか１つを用いて希釈する。ＨＡＶキャプシッド
はいくぶん酸耐性を示すので、酸性pH領域中の緩衝液が
適切であろう。緩衝液中のＭｇＣｌ2 の存在はＨＡＶキ
ャプシッドの収量を著るしく低下させる事を出願者は発
見した。最も好ましい緩衝液はＴＮＥ（１０mM トリス
−ＨＣｌ pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤ
ＴＡ）である。
【００１０】緩衝液で希釈されたセルライセイトは塩化
メチレン、クロロホルム、テトラクロロエタン、あるい
は類似溶媒などのハロゲン化された低級アルカンとイソ
アミルアルコールの様な消泡剤との混合液の添加により
抽出される。本発明における低級アルカンは、１−６炭
素原子を含んでいる。ハロゲン化低級アルカンと消泡剤
の容積比率は約１５：１及び５０：１の間であり、好ま
しくは２０：１及び３０：１の間にある。出願者はこの
段階ではクロロホルムよりも塩化メチレンの方がすぐれ
ている事を発見した。ＨＡＶキャプシッドはその大部分
が水相及び水相／有機溶媒の中間相に認められた。
メチレン、クロロホルム、テトラクロロエタン、あるい
は類似溶媒などのハロゲン化された低級アルカンとイソ
アミルアルコールの様な消泡剤との混合液の添加により
抽出される。本発明における低級アルカンは、１−６炭
素原子を含んでいる。ハロゲン化低級アルカンと消泡剤
の容積比率は約１５：１及び５０：１の間であり、好ま
しくは２０：１及び３０：１の間にある。出願者はこの
段階ではクロロホルムよりも塩化メチレンの方がすぐれ
ている事を発見した。ＨＡＶキャプシッドはその大部分
が水相及び水相／有機溶媒の中間相に認められた。
【００１１】次に最も好ましい方法を述べると、音波処
理した物に等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール
（２４：１、Ｖ／Ｖ）を加えて１分間ボルテックスした
後、ＩＥＣ遠心機（３０００×g) で３０００rpm 、１
０分間、２０℃の遠心にかけ水相／有機溶媒相に分離す
る。そこより水相を取り出しておき、有機溶媒相を除去
した後、中間相に対して最初の試料容量の１／３相当量
のＴＮＥ緩衝液を加えて再度抽出操作を行なう。ボルテ
ックス及び遠心は上記同様である。得られた水相を先に
取り出しておいた水相と合わせ、その容量を測定し、Ｈ
ＡＶキャプシッドを有機溶媒抽出セルライセイト中に回
収した。
理した物に等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール
（２４：１、Ｖ／Ｖ）を加えて１分間ボルテックスした
後、ＩＥＣ遠心機（３０００×g) で３０００rpm 、１
０分間、２０℃の遠心にかけ水相／有機溶媒相に分離す
る。そこより水相を取り出しておき、有機溶媒相を除去
した後、中間相に対して最初の試料容量の１／３相当量
のＴＮＥ緩衝液を加えて再度抽出操作を行なう。ボルテ
ックス及び遠心は上記同様である。得られた水相を先に
取り出しておいた水相と合わせ、その容量を測定し、Ｈ
ＡＶキャプシッドを有機溶媒抽出セルライセイト中に回
収した。
【００１２】次のステップはタンパク沈降に効果的な水
−可溶性合成ポリマーによる濃縮である。出願者は約
２，０００ダルトンから１２，０００ダルトンの間にそ
の分子量を持つポリエチレングリコールにより有機溶媒
抽出セルライセイト（ＨＡＶキャプシッドを含む）を濃
縮した。特色としては、最終濃度が約１５０mMから５０
０mMの間になる様にセルライセイトにＮａＣｌを加えた
事である。次にＰＥＧを最終濃度が約２％（Ｗ／Ｖ）及
び１０％（Ｗ／Ｖ）の間になる様に加えた。最も好まし
い調製としては、有機溶媒抽出セルライセイトに対して
約５００mMのＮａＣｌであり、ＰＥＧ（８０００mw）を
約４％（Ｗ／Ｖ）になる様に加える事である。得られた
４％ＰＥＧ沈降セルライセイトを遠心にかけ、上清除去
後、次の操作の為に、沈殿物を懸濁しておく。以下に示
す様に、２回目の有機溶媒抽出に先立って懸濁したＰＥ
Ｇ沈殿物を音波処理する。
−可溶性合成ポリマーによる濃縮である。出願者は約
２，０００ダルトンから１２，０００ダルトンの間にそ
の分子量を持つポリエチレングリコールにより有機溶媒
抽出セルライセイト（ＨＡＶキャプシッドを含む）を濃
縮した。特色としては、最終濃度が約１５０mMから５０
０mMの間になる様にセルライセイトにＮａＣｌを加えた
事である。次にＰＥＧを最終濃度が約２％（Ｗ／Ｖ）及
び１０％（Ｗ／Ｖ）の間になる様に加えた。最も好まし
い調製としては、有機溶媒抽出セルライセイトに対して
約５００mMのＮａＣｌであり、ＰＥＧ（８０００mw）を
約４％（Ｗ／Ｖ）になる様に加える事である。得られた
４％ＰＥＧ沈降セルライセイトを遠心にかけ、上清除去
後、次の操作の為に、沈殿物を懸濁しておく。以下に示
す様に、２回目の有機溶媒抽出に先立って懸濁したＰＥ
Ｇ沈殿物を音波処理する。
【００１３】上記音波処理済みＰＥＧ沈殿物の懸濁液
を、クロロホルムなどのハロゲン化低級アルカンとイソ
アミルアルコールなどの消泡剤との混合液により抽出し
た。ハロゲン化低級アルカンと消泡剤との容積比は約１
５：１から５０：１の間であり、好ましくは約２０：１
及び３０：１の間にある。出願者はこの２回目の有機溶
媒抽出が最終ＨＡＶ産物の純度を実質的に上げる事を発
見した。さらに、１回目の抽出操作とは対照的に、２回
目の有機溶媒抽出時には塩化メチレンよりもクロロホル
ムの方がすぐれている事を発見した。
を、クロロホルムなどのハロゲン化低級アルカンとイソ
アミルアルコールなどの消泡剤との混合液により抽出し
た。ハロゲン化低級アルカンと消泡剤との容積比は約１
５：１から５０：１の間であり、好ましくは約２０：１
及び３０：１の間にある。出願者はこの２回目の有機溶
媒抽出が最終ＨＡＶ産物の純度を実質的に上げる事を発
見した。さらに、１回目の抽出操作とは対照的に、２回
目の有機溶媒抽出時には塩化メチレンよりもクロロホル
ムの方がすぐれている事を発見した。
【００１４】２回目の有機溶媒抽出の最も好ましい操作
ステップを以下に示した。
ステップを以下に示した。
【００１５】音波処理済みＰＥＧ沈殿物の懸濁液に等量
のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ
／Ｖ）を加えて激げしくボルテックスした後、抽出し
た。この抽出物を４，０００ｇ、１０分間、２０℃の遠
心にかけ分離した。水相を取り出しておき、中間相及び
有機溶媒相に最初の試料容量の１／３容量に相当するＴ
ＮＥを加えて再度抽出操作を行ない、得られた両者の水
相を合わせて、ＰＥＧ沈殿抽出物として回収した。
のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ
／Ｖ）を加えて激げしくボルテックスした後、抽出し
た。この抽出物を４，０００ｇ、１０分間、２０℃の遠
心にかけ分離した。水相を取り出しておき、中間相及び
有機溶媒相に最初の試料容量の１／３容量に相当するＴ
ＮＥを加えて再度抽出操作を行ない、得られた両者の水
相を合わせて、ＰＥＧ沈殿抽出物として回収した。
【００１６】上記抽出物をゲルあるいはマトリックス状
のレジンよりなるアニオン交換クロマトグラフィーにか
けた。代表的なアニオン交換マトリックスとしてはＤＥ
ＡＥセルロース；ＤＥＡＥアガロース；ＤＥＡＥバイオ
ゲル；ＤＥＡＥデキストラン；ＤＥＡＥセファデック
ス；ＤＥＡＥセファロース；アミノヘキシルセファロー
ス；エクテオーラセルロース；ＴＥＡＥセルロース：Ｑ
ＡＥセルロース；モノ−Ｑ；あるいはベンゾイル化ジエ
チルアミノエチルセルロースなどがあるが、これらに限
定されるものではない。
のレジンよりなるアニオン交換クロマトグラフィーにか
けた。代表的なアニオン交換マトリックスとしてはＤＥ
ＡＥセルロース；ＤＥＡＥアガロース；ＤＥＡＥバイオ
ゲル；ＤＥＡＥデキストラン；ＤＥＡＥセファデック
ス；ＤＥＡＥセファロース；アミノヘキシルセファロー
ス；エクテオーラセルロース；ＴＥＡＥセルロース：Ｑ
ＡＥセルロース；モノ−Ｑ；あるいはベンゾイル化ジエ
チルアミノエチルセルロースなどがあるが、これらに限
定されるものではない。
【００１７】アニオン交換マトリックスとして好ましい
のはＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）
である。イオン交換クロマトグラフィーに関する一般的
な基礎知識は、例えばティー．エス．（Ｔ．Ｓ．）等の
ラボラトリー テクニクスイン バイオケミストリー
アンド モレクュラー バイオロジー(LaboratoryTechn
iques in Biochemistry and Molecular Biology) 中の
イー．エー．ピーターソン(E.A.Peterson)、“セルロジ
ック イオン イクスチェンジャーズ(Cellulosic Ion
Exchangers) ”、第２巻、パートII、第２２３頁より、
ノース−オランダ(North-Holland) １９７０により得る
事ができる。
のはＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）
である。イオン交換クロマトグラフィーに関する一般的
な基礎知識は、例えばティー．エス．（Ｔ．Ｓ．）等の
ラボラトリー テクニクスイン バイオケミストリー
アンド モレクュラー バイオロジー(LaboratoryTechn
iques in Biochemistry and Molecular Biology) 中の
イー．エー．ピーターソン(E.A.Peterson)、“セルロジ
ック イオン イクスチェンジャーズ(Cellulosic Ion
Exchangers) ”、第２巻、パートII、第２２３頁より、
ノース−オランダ(North-Holland) １９７０により得る
事ができる。
【００１８】抽出物へＮａＣｌを最終濃度が約０．３Ｍ
から０．４Ｍの間になる様に加える、好ましくは０．３
５ＭのＮａＣｌである。次にこの抽出物をＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂのカラムクロマトグラフィーにかけ
る。ＨＡＶキャプシッドはＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂに吸着する事なしに素通りするが、細胞由来核酸を
含む不純物はＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂに吸着
し、そのままカラム中にとどまる。流出分画（ＨＡＶキ
ャプシッドを含む）を集めた。ＨＡＶキャプシッドは実
質的に細胞由来核酸より遊離した状態で存在している。
から０．４Ｍの間になる様に加える、好ましくは０．３
５ＭのＮａＣｌである。次にこの抽出物をＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂのカラムクロマトグラフィーにかけ
る。ＨＡＶキャプシッドはＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂに吸着する事なしに素通りするが、細胞由来核酸を
含む不純物はＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂに吸着
し、そのままカラム中にとどまる。流出分画（ＨＡＶキ
ャプシッドを含む）を集めた。ＨＡＶキャプシッドは実
質的に細胞由来核酸より遊離した状態で存在している。
【００１９】本アニオン交換のステップの持つ効果は細
胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びその他の不純物をＨＡＶキ
ャプシッドより除去する事にある。それゆえ、原理的に
はアニオン交換は、精製過程のこの段階でＤＮＡｓｅの
付加及び除去にも代用されるであろうし、あるいはＤＮ
Ａの除去または他の核酸の除去を目的とした別の処理に
より代用されるであろう。
胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びその他の不純物をＨＡＶキ
ャプシッドより除去する事にある。それゆえ、原理的に
はアニオン交換は、精製過程のこの段階でＤＮＡｓｅの
付加及び除去にも代用されるであろうし、あるいはＤＮ
Ａの除去または他の核酸の除去を目的とした別の処理に
より代用されるであろう。
【００２０】この段階における流出画分中にはＨＡＶキ
ャプシッド（欠損及び完全粒子を含む）が含まれている
のが認められるが、電子顕微鏡により約３０nmの粒子の
分散も観察される（図１参照）。
ャプシッド（欠損及び完全粒子を含む）が含まれている
のが認められるが、電子顕微鏡により約３０nmの粒子の
分散も観察される（図１参照）。
【００２１】上記アニオン交換クロマトグラフィーによ
り得られた流出画分にはＨＡＶキャプシッドが含まれて
おり、これをさらに２回目のアニオン交換クロマトグラ
フィーにかけ、細胞質由来の不純物を除く。流出画分は
１０mMトリス、１mM ＥＤＴＡ、pH７．５により希釈さ
れＮａＣｌ濃度は約０．１Ｍから０．２Ｍの間とされ、
好ましくはＮａＣｌが０．１５Ｍとなるように調整し
た。この希釈流出画分をアニオン交換マトリックスにか
ける。代表的なアニオン交換マトリックスには、ＤＥＡ
Ｅセルロース；ＤＥＡＥアガロース；ＤＥＡＥバイオゲ
ル；ＤＥＡＥデリトラン；ＤＥＡＥセファデックス；Ｄ
ＥＡＥセファロース；アミノヘキシルセファロース；エ
クテオーラセルロース；ＴＥＡＥセルロース；ＱＡＥセ
ルロース；モノ−Ｑ；あるいはベンゾイル化ジエチルア
ミノエチルセルロースなどがあるが、これらに限定され
るものではい。好ましいアニオン交換マトリックスとし
てはＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア）。
り得られた流出画分にはＨＡＶキャプシッドが含まれて
おり、これをさらに２回目のアニオン交換クロマトグラ
フィーにかけ、細胞質由来の不純物を除く。流出画分は
１０mMトリス、１mM ＥＤＴＡ、pH７．５により希釈さ
れＮａＣｌ濃度は約０．１Ｍから０．２Ｍの間とされ、
好ましくはＮａＣｌが０．１５Ｍとなるように調整し
た。この希釈流出画分をアニオン交換マトリックスにか
ける。代表的なアニオン交換マトリックスには、ＤＥＡ
Ｅセルロース；ＤＥＡＥアガロース；ＤＥＡＥバイオゲ
ル；ＤＥＡＥデリトラン；ＤＥＡＥセファデックス；Ｄ
ＥＡＥセファロース；アミノヘキシルセファロース；エ
クテオーラセルロース；ＴＥＡＥセルロース；ＱＡＥセ
ルロース；モノ−Ｑ；あるいはベンゾイル化ジエチルア
ミノエチルセルロースなどがあるが、これらに限定され
るものではい。好ましいアニオン交換マトリックスとし
てはＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシ
ア）。
【００２２】ＮａＣｌが上記モル濃度の時には、ＨＡＶ
キャプシッドはアニオン交換マトリックスに吸着し不純
物は素通りする事が発見された。このカラムをカラム等
量の０．１５Ｍ ＮａＣｌで数回洗浄して、カラム中に
残っている不純物を洗い流す。
キャプシッドはアニオン交換マトリックスに吸着し不純
物は素通りする事が発見された。このカラムをカラム等
量の０．１５Ｍ ＮａＣｌで数回洗浄して、カラム中に
残っている不純物を洗い流す。
【００２３】ＨＡＶキャプシッドは最初の試料の等容量
と１カラム容量を合わせた容量の０．３５Ｍ ＮａＣｌ
によりアニオン交換クロマトグラフィーより溶出されて
くる。
と１カラム容量を合わせた容量の０．３５Ｍ ＮａＣｌ
によりアニオン交換クロマトグラフィーより溶出されて
くる。
【００２４】この２回目のアニオン交換の効果は、細胞
成分炭水化物の構成成分で直径約３０nmの電子顕微鏡に
より分散して存在している事が認められた粒子が除かれ
る事にある（図２参照）。
成分炭水化物の構成成分で直径約３０nmの電子顕微鏡に
より分散して存在している事が認められた粒子が除かれ
る事にある（図２参照）。
【００２５】アニオン交換クロマトグラフィーに続く最
後のステップとしてゲル濾過を行なう。代表的なものと
して、セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）が用い
られるけれども、その他数多くのゲル濾過マトリックス
で代用される時もある。例えばティー．エス．（Ｔ．
Ｓ．）等のラボラトリー テクニクス イン バイオケ
ミストリー アンド モレクュラー バイオロジー、エ
リセバー(Elsevier)のフィッシャー、エル．(Fischer,
L.)による“ゲル フィルトレーション クロマトグラ
フィー(Gel Filtration Chromatography) ”（１９８
０）を参照。
後のステップとしてゲル濾過を行なう。代表的なものと
して、セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）が用い
られるけれども、その他数多くのゲル濾過マトリックス
で代用される時もある。例えばティー．エス．（Ｔ．
Ｓ．）等のラボラトリー テクニクス イン バイオケ
ミストリー アンド モレクュラー バイオロジー、エ
リセバー(Elsevier)のフィッシャー、エル．(Fischer,
L.)による“ゲル フィルトレーション クロマトグラ
フィー(Gel Filtration Chromatography) ”（１９８
０）を参照。
【００２６】アニオン交換の後にゲル濾過にかけるクロ
マトグラフィーの手順は本発明におけるＨＡＶキャプシ
ッド精製の代表的な行程ではあるが、手順そのものに関
しては幾通りもあるという事がよく知られている。例え
ば、２回のアニオン交換ステップに先立ってゲル濾過を
行なってもよい。さらに２回のアニオン交換クロマトグ
ラフィーの操作手順も多様である。
マトグラフィーの手順は本発明におけるＨＡＶキャプシ
ッド精製の代表的な行程ではあるが、手順そのものに関
しては幾通りもあるという事がよく知られている。例え
ば、２回のアニオン交換ステップに先立ってゲル濾過を
行なってもよい。さらに２回のアニオン交換クロマトグ
ラフィーの操作手順も多様である。
【００２７】追加的ステップ 精製すべきタンパクがウィルス由来であれ、細胞由来で
あれ、あるいはキャプシッドの様な粒子であろうともそ
こにおいて一般的に用いられる、その他の標準的あるい
はよく知られている所の方法は本発明の行程に十分な効
果が結果として表われなくとも、それらの方法をＨＡＶ
キャプシッド精製の本行程に随意に組み込んでもよい。
その方法を以下に示すと； （ａ）固相としての吸着剤あるいは分離剤の選択、例え
ば、シリカゲル、カルシウムホスフェートチャコール、
あるいはセライトアルミナ等； （ｂ）例えばブチルアガロースなどを用いた疎水性クロ
マトグラフィー； （ｃ）抽出に用いる他の有機溶媒あるいは溶剤の選択； （ｄ）ＨＡＶキャプシッドを沈降させる追加的ステッ
プ； （ｅ）薄層、ゲル、モレクュラーシーブ、分子排除、イ
オン−交換、リガンドアフィニティー、イムノアフィニ
ティー、あるいは電気泳動など、標準的方法によるクロ
マトグラフィー； （ｆ）二相抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧおよびデ
キストラン； （ｇ）透析、ウルトラフィルトレーションあるいはダイ
アフィルトレーション； （ｈ）密度勾配遠心； （ｉ）エレクトロフォーカッシング； （ｊ）凍結乾燥； （ｋ）結晶化； （ｌ）緩衝液へのプロテアーゼインヒビター及び／ある
いはキレート剤の添加； （ｍ）１つの緩衝液を別の緩衝に代える、等の方法があ
るがこれらに限定されるものではない。
あれ、あるいはキャプシッドの様な粒子であろうともそ
こにおいて一般的に用いられる、その他の標準的あるい
はよく知られている所の方法は本発明の行程に十分な効
果が結果として表われなくとも、それらの方法をＨＡＶ
キャプシッド精製の本行程に随意に組み込んでもよい。
その方法を以下に示すと； （ａ）固相としての吸着剤あるいは分離剤の選択、例え
ば、シリカゲル、カルシウムホスフェートチャコール、
あるいはセライトアルミナ等； （ｂ）例えばブチルアガロースなどを用いた疎水性クロ
マトグラフィー； （ｃ）抽出に用いる他の有機溶媒あるいは溶剤の選択； （ｄ）ＨＡＶキャプシッドを沈降させる追加的ステッ
プ； （ｅ）薄層、ゲル、モレクュラーシーブ、分子排除、イ
オン−交換、リガンドアフィニティー、イムノアフィニ
ティー、あるいは電気泳動など、標準的方法によるクロ
マトグラフィー； （ｆ）二相抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧおよびデ
キストラン； （ｇ）透析、ウルトラフィルトレーションあるいはダイ
アフィルトレーション； （ｈ）密度勾配遠心； （ｉ）エレクトロフォーカッシング； （ｊ）凍結乾燥； （ｋ）結晶化； （ｌ）緩衝液へのプロテアーゼインヒビター及び／ある
いはキレート剤の添加； （ｍ）１つの緩衝液を別の緩衝に代える、等の方法があ
るがこれらに限定されるものではない。
【００２８】上記リストに述べたものがすべての方法で
はなく、また使用に際しての好ましい順序で記載したも
のでもない。ＨＡＶキャプシッドの精製を上手に遂行す
るには、上記記載のステップが随意に用いられ、かつ本
発明の行程に効果をもたらさないかもしれないが、ステ
ップ（ａ）−（ｍ）のいずれか、または幾つか、または
すべてを用いる事にあり、また１つも用いなくてもよい
事はよく知られている所である。
はなく、また使用に際しての好ましい順序で記載したも
のでもない。ＨＡＶキャプシッドの精製を上手に遂行す
るには、上記記載のステップが随意に用いられ、かつ本
発明の行程に効果をもたらさないかもしれないが、ステ
ップ（ａ）−（ｍ）のいずれか、または幾つか、または
すべてを用いる事にあり、また１つも用いなくてもよい
事はよく知られている所である。
【００２９】一般的及びよく知られているステップの追
加は、ワクチン使用に際しての精製ＨＡＶキャプシッド
の調製には、必要であるし、また必要になるものであ
る。例えば、ホルマリン不活化ワクチンの調製には、ホ
ルマリン処理、滅菌濾過、担体あるいはアジュバントへ
の吸着といった特徴的な基本ステップがある。例えば、
プロボスト、ピィー．ジェイ．(Provost,P.J.)等、プロ
ク．ソク．イクスプ．ビオル．メディ．(Proc.Soc.Exp.
Biol.Med.)、第１６０巻、第２１３頁（１９７９）；プ
ロボスト、ピィ−．ジェイ．等、ジェイ．メディ．バイ
オル．(J.Med.Virol) 、第１９巻、第２３頁（１９８
９）を参照。ＨＡＶの不活化は、熱、pH変化、有機溶媒
処理、紫外線照射、あるいはホルマリン処理などにより
行なわれる。本発明の範囲に、ＨＡＶのＣＲ３２６Ｆ株
の変異株であるＰ１８に加えて、それが弱毒であろう
と、強毒であろうと、他のいかなるＨＡＶ変異株が含ま
れている事は明白である。弱毒化変異株等は細胞、動物
中における連続的継代あるは他の方法により分離されて
くるものである。例えばプロボスト、ピィー．ジェイ．
等、プロク．ソク．イクス．ビオル．メディ．第１７０
巻、第８頁（１９８２）；及びプロボスト、ピィー．ジ
ェイ．等、ジェイ．メディ．バイオル．第２０巻、第１
６５頁（１９８６）を参照すればそこに弱毒化の詳細が
記載されている。本発明における精製方法はＨＡＶの弱
毒あるいは強毒株に迅速、簡便に適用しうる方法であ
る。
加は、ワクチン使用に際しての精製ＨＡＶキャプシッド
の調製には、必要であるし、また必要になるものであ
る。例えば、ホルマリン不活化ワクチンの調製には、ホ
ルマリン処理、滅菌濾過、担体あるいはアジュバントへ
の吸着といった特徴的な基本ステップがある。例えば、
プロボスト、ピィー．ジェイ．(Provost,P.J.)等、プロ
ク．ソク．イクスプ．ビオル．メディ．(Proc.Soc.Exp.
Biol.Med.)、第１６０巻、第２１３頁（１９７９）；プ
ロボスト、ピィ−．ジェイ．等、ジェイ．メディ．バイ
オル．(J.Med.Virol) 、第１９巻、第２３頁（１９８
９）を参照。ＨＡＶの不活化は、熱、pH変化、有機溶媒
処理、紫外線照射、あるいはホルマリン処理などにより
行なわれる。本発明の範囲に、ＨＡＶのＣＲ３２６Ｆ株
の変異株であるＰ１８に加えて、それが弱毒であろう
と、強毒であろうと、他のいかなるＨＡＶ変異株が含ま
れている事は明白である。弱毒化変異株等は細胞、動物
中における連続的継代あるは他の方法により分離されて
くるものである。例えばプロボスト、ピィー．ジェイ．
等、プロク．ソク．イクス．ビオル．メディ．第１７０
巻、第８頁（１９８２）；及びプロボスト、ピィー．ジ
ェイ．等、ジェイ．メディ．バイオル．第２０巻、第１
６５頁（１９８６）を参照すればそこに弱毒化の詳細が
記載されている。本発明における精製方法はＨＡＶの弱
毒あるいは強毒株に迅速、簡便に適用しうる方法であ
る。
【００３０】以下記載の実施例は本発明を説明する為の
ものであり、本発明の範囲や内容を限定するものではな
い。
ものであり、本発明の範囲や内容を限定するものではな
い。
【実施例】ＭＲＣ−５細胞からのＡ型肝炎ウィルス（Ｈ
ＡＶ）キャプシッドの精製方法。
ＡＶ）キャプシッドの精製方法。
【００３１】Ａ．細胞破壊 弱毒ＨＡＶ（株ＣＲ３２６ＦのＰ１８変異株）に感染し
たＭＲＣ−５細胞をその培養層よりかき集め、採集した
細胞をポリプロピレンのチューブに入れ、−７０℃に凍
結する。チューブ１本当り、４本のローラーボトルの細
胞数に相当。チューブ当り３mlのリシス緩衝液（１０mM
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ pH７．５、１０mMＮａＣｌ、１．
５mM ＭｇＣｌ2 ）を２本のチューブにそれぞれ加えて
融解し、強くボルテックスにかけ(Vortex-Genie 、セッ
ティング１０、１０〜１５秒）、それを氷水中に１５分
間静置する。溶解物の凍結融解をエタノールドライアイ
ス浴と３７℃の水浴を用いて、２回繰り返す。次に各チ
ューブを循環氷水浴(Branson Sonifier Cell Disrupter
１８５及びUltrasonics cup horn) 中でカップ ホーン
ソニケーターのワット出力を最大にして３０秒、３回
音波処理する。この音波処理物を集め、タンパク濃度標
準としてＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)を用いて、ブラ
ッド フォード タンパク アッセイ(Bradford protei
n assay)（バイオ ラッド(Bio Rad) ）によりタンパク
量を測定した後、ＴＮＥ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ
( ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、
１mMＥＤＴＡ）を用いて１ml当り３mgのタンパク量に調
製し、等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール（２
４：１、Ｖ／Ｖ）を加えて、１分間ボルテックスにかけ
有機的に抽出を行なった。ＩＥＣ遠心機（３０００×g)
を用いて、２０℃、１０分間、３０００rpm の遠心に
かけ有機相／水相に分離した。そこより水相を取り出し
ておき有機溶媒相を除去した後、中間相に対して最初の
試料容量の１／３相当量のＴＮＥ緩衝液を加えて再度抽
出操作を行なう。ボルテックス及び遠心は上記同様であ
る。得られた水相を先に取り出しておいた水相と合わ
せ、その容量を測定しＨＡＶキャプシッドを有機溶媒抽
出セルライセイト中に回収した。
たＭＲＣ−５細胞をその培養層よりかき集め、採集した
細胞をポリプロピレンのチューブに入れ、−７０℃に凍
結する。チューブ１本当り、４本のローラーボトルの細
胞数に相当。チューブ当り３mlのリシス緩衝液（１０mM
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ pH７．５、１０mMＮａＣｌ、１．
５mM ＭｇＣｌ2 ）を２本のチューブにそれぞれ加えて
融解し、強くボルテックスにかけ(Vortex-Genie 、セッ
ティング１０、１０〜１５秒）、それを氷水中に１５分
間静置する。溶解物の凍結融解をエタノールドライアイ
ス浴と３７℃の水浴を用いて、２回繰り返す。次に各チ
ューブを循環氷水浴(Branson Sonifier Cell Disrupter
１８５及びUltrasonics cup horn) 中でカップ ホーン
ソニケーターのワット出力を最大にして３０秒、３回
音波処理する。この音波処理物を集め、タンパク濃度標
準としてＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)を用いて、ブラ
ッド フォード タンパク アッセイ(Bradford protei
n assay)（バイオ ラッド(Bio Rad) ）によりタンパク
量を測定した後、ＴＮＥ緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ
( ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）pH７．５、１５０mM ＮａＣｌ、
１mMＥＤＴＡ）を用いて１ml当り３mgのタンパク量に調
製し、等量の塩化メチレン：イソアミルアルコール（２
４：１、Ｖ／Ｖ）を加えて、１分間ボルテックスにかけ
有機的に抽出を行なった。ＩＥＣ遠心機（３０００×g)
を用いて、２０℃、１０分間、３０００rpm の遠心に
かけ有機相／水相に分離した。そこより水相を取り出し
ておき有機溶媒相を除去した後、中間相に対して最初の
試料容量の１／３相当量のＴＮＥ緩衝液を加えて再度抽
出操作を行なう。ボルテックス及び遠心は上記同様であ
る。得られた水相を先に取り出しておいた水相と合わ
せ、その容量を測定しＨＡＶキャプシッドを有機溶媒抽
出セルライセイト中に回収した。
【００３２】Ｂ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈
降 有機溶媒抽出セルライセイト中のＨＡＶキャプシッドを
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降法で濃縮した。
ライセイト (Lysate) を５００mM ＮａＣｌになる様に
調整して、４０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ８０００（１０mM
トリス−ＨＣｌ、pH７．５、５００mM ＮａＣｌ、１mM
ＥＤＴＡにより調製）を４％ＰＥＧ８０００になる様
加え、激しくボルテックスにかけた。この４％ＰＥＧラ
イセイトを４℃に１時間静置後、ベックマンＨＢ−４ロ
ーターを用いて４℃、１０分間、１，５００×g の遠心
にかけた。上清除去後、ＰＥＧ沈殿物に１０mlの１０mM
トリス−ＨＣｌ、pH７．５、５０mM ＮａＣｌ １０mM
ＥＤＴＡを加えて、激しくボルテックスにかけ懸濁し、
上記記載の循環氷水浴中でカップ ホーン ソニケータ
ーのワット出力を最大にして３０秒、３回、音波処理し
た。音波処理した懸濁ＰＥＧ沈殿物に等量のクロロホル
ム：イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ／Ｖ）を加え
て、激しくボルテックスにかけ抽出した。２０℃で１０
分間、４，０００×g の遠心にかけた後、水相を取り出
し、中間相及び有機溶媒相に音波処理した懸濁ＰＥＧ沈
殿物の容量の１／３に相当するＴＮＥを加えて再度抽出
操作を行ない、得られた両者の水相を合わせて、懸濁Ｐ
ＥＧ沈殿物として回収した。
降 有機溶媒抽出セルライセイト中のＨＡＶキャプシッドを
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降法で濃縮した。
ライセイト (Lysate) を５００mM ＮａＣｌになる様に
調整して、４０％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ８０００（１０mM
トリス−ＨＣｌ、pH７．５、５００mM ＮａＣｌ、１mM
ＥＤＴＡにより調製）を４％ＰＥＧ８０００になる様
加え、激しくボルテックスにかけた。この４％ＰＥＧラ
イセイトを４℃に１時間静置後、ベックマンＨＢ−４ロ
ーターを用いて４℃、１０分間、１，５００×g の遠心
にかけた。上清除去後、ＰＥＧ沈殿物に１０mlの１０mM
トリス−ＨＣｌ、pH７．５、５０mM ＮａＣｌ １０mM
ＥＤＴＡを加えて、激しくボルテックスにかけ懸濁し、
上記記載の循環氷水浴中でカップ ホーン ソニケータ
ーのワット出力を最大にして３０秒、３回、音波処理し
た。音波処理した懸濁ＰＥＧ沈殿物に等量のクロロホル
ム：イソアミルアルコール（２４：１、Ｖ／Ｖ）を加え
て、激しくボルテックスにかけ抽出した。２０℃で１０
分間、４，０００×g の遠心にかけた後、水相を取り出
し、中間相及び有機溶媒相に音波処理した懸濁ＰＥＧ沈
殿物の容量の１／３に相当するＴＮＥを加えて再度抽出
操作を行ない、得られた両者の水相を合わせて、懸濁Ｐ
ＥＧ沈殿物として回収した。
【００３３】Ｃ．イオン交換及びゲル濾過クロマトグラ
フィー 懸濁ＰＥＧ沈殿物を０．３５Ｍ ＮａＣｌになる様に調
整して、流速３ml／分で、２mlのＤＥＡＥ−セルロース
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラ
フィーを行なった。カラムはコンテスフレックスカラム
(Kontes Flex Column)（１．０×５．０cm）を用い、１
０mM トリス−ＨＣｌ pH７．５、０．３５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１mM ＥＤＴＡにより平衡化しておく。ＨＡＶキャ
プシッドを含む、最初の１５ml溶出画分を集めた。この
溶出画分を、１０mMトリス、１mMＥＤＴＡ、pH７．５で
ＮａＣｌの濃度が０．１５Ｍになる様に希釈した。これ
を流速３ml／分で２mlのＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラフィー
を行なった。カラムはコンテスフレックスカラム（１．
０cm×５．０cm）を用い、１０mMトリス、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１mMEDTA、pH７．５により平衡化してお
く。ＨＡＶキャプシッドの溶出は１０mMトリス、０．３
５Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、pH７．５を用いて行
なった。ＨＡＶキャプシッドを含む、最初の１５ml溶出
画分を集めた。ＴＮＥ緩衝液で平衡化しておいたセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラム（２．６×９
５cm）に、流速４０ml／時でこの溶出画分のクロマトグ
ラフィーを行なった。５mlのフラクションを行ない実質
的に精製された弱毒ＨＡＶキャプシッドとして回収し
た。ＨＡＶキャプシッドを含む画分に対して、ＨＡＶ特
異的抗体を用いたラジオイムノ アッセイ（ＲＩＡ）を
行ない画分を集めミレックス(Millex)ＧＶ−０．２２μ
フィルター（ミリポア）により濾過滅菌した後、−７０
℃に保存した。集めたＨＡＶの濃度をＲＩＡにより定量
し（もし必要があれば）凍結乾燥によりその試料を濃縮
する。精製ＨＡＶキャプシッド試料の５μg について、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を行ない銀
染色及びウエスタンブロットをしたがいかなる不純物も
検出されなかった。
フィー 懸濁ＰＥＧ沈殿物を０．３５Ｍ ＮａＣｌになる様に調
整して、流速３ml／分で、２mlのＤＥＡＥ−セルロース
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラ
フィーを行なった。カラムはコンテスフレックスカラム
(Kontes Flex Column)（１．０×５．０cm）を用い、１
０mM トリス−ＨＣｌ pH７．５、０．３５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１mM ＥＤＴＡにより平衡化しておく。ＨＡＶキャ
プシッドを含む、最初の１５ml溶出画分を集めた。この
溶出画分を、１０mMトリス、１mMＥＤＴＡ、pH７．５で
ＮａＣｌの濃度が０．１５Ｍになる様に希釈した。これ
を流速３ml／分で２mlのＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア）カラムにかけクロマトグラフィー
を行なった。カラムはコンテスフレックスカラム（１．
０cm×５．０cm）を用い、１０mMトリス、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１mMEDTA、pH７．５により平衡化してお
く。ＨＡＶキャプシッドの溶出は１０mMトリス、０．３
５Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、pH７．５を用いて行
なった。ＨＡＶキャプシッドを含む、最初の１５ml溶出
画分を集めた。ＴＮＥ緩衝液で平衡化しておいたセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）カラム（２．６×９
５cm）に、流速４０ml／時でこの溶出画分のクロマトグ
ラフィーを行なった。５mlのフラクションを行ない実質
的に精製された弱毒ＨＡＶキャプシッドとして回収し
た。ＨＡＶキャプシッドを含む画分に対して、ＨＡＶ特
異的抗体を用いたラジオイムノ アッセイ（ＲＩＡ）を
行ない画分を集めミレックス(Millex)ＧＶ−０．２２μ
フィルター（ミリポア）により濾過滅菌した後、−７０
℃に保存した。集めたＨＡＶの濃度をＲＩＡにより定量
し（もし必要があれば）凍結乾燥によりその試料を濃縮
する。精製ＨＡＶキャプシッド試料の５μg について、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動を行ない銀
染色及びウエスタンブロットをしたがいかなる不純物も
検出されなかった。
【００３４】説明の為に実施例を用いて本発明の本質を
上記に示したが、特許請求の範囲に記載されている様
に、明細書における方法及び行程に関しての、多様性、
適用、改良、削除、あるいは付加的なものがすべて本発
明の実施に含まれる事はよく理解されているものであ
る。
上記に示したが、特許請求の範囲に記載されている様
に、明細書における方法及び行程に関しての、多様性、
適用、改良、削除、あるいは付加的なものがすべて本発
明の実施に含まれる事はよく理解されているものであ
る。
【図１】図１はＨＡＶキャプシッド（ｃ）及び３０nm粒
子（ｐ）を含む、１回目のアニオン交換クロマトグラフ
ィーにより得られた流出液の電子顕微鏡（倍率１３０，
０００×）図である。
子（ｐ）を含む、１回目のアニオン交換クロマトグラフ
ィーにより得られた流出液の電子顕微鏡（倍率１３０，
０００×）図である。
【図２】図２は実質的に３０nm粒子より遊離したＨＡＶ
キャプシッド（ｃ）を含む、２回目のアニオン交換クロ
マトグラフィーにより得られた溶出画分の電子顕微鏡
（倍率１３０，０００×）図である。
キャプシッド（ｃ）を含む、２回目のアニオン交換クロ
マトグラフィーにより得られた溶出画分の電子顕微鏡
（倍率１３０，０００×）図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＨＡＶキャプシッド（ｃ）及び３０ｎｍ
粒子（ｐ）を含む、１回目のアニオン交換クロマトグラ
フィーにより得られた流出液の電子顕微鏡（倍率１３
０，０００×）写真である。
粒子（ｐ）を含む、１回目のアニオン交換クロマトグラ
フィーにより得られた流出液の電子顕微鏡（倍率１３
０，０００×）写真である。
【図２】図２は実質的に３０ｎｍ粒子より遊離したＨＡ
Ｖキャプシッド（ｃ）を含む、２回目のアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより得られた溶出画分の電子顕微鏡
（倍率１３０，０００×）写真である。
Ｖキャプシッド（ｃ）を含む、２回目のアニオン交換ク
ロマトグラフィーにより得られた溶出画分の電子顕微鏡
（倍率１３０，０００×）写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーシィ エレン アームストロング アメリカ合衆国，19473 ペンシルヴァニ ア，シュウェンクスヴィル，バーンブリッ ジ ドライヴ 1080
Claims (10)
- 【請求項１】 以下のステップより成るＨＡＶキャプシ
ッドの実質的な精製方法で （ａ）ＨＡＶ感染細胞溶解物の水相をイオン交換クロマ
トグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）の流出液をイオン交換クロマトグラフィー
にかける；及び （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかけ実質的に精製されたＨＡＶキャプシッドを得
る方法である。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法による生成物。
- 【請求項３】 電子顕微鏡により観察される３０nmの不
純物粒子を除いた実質的に純粋な状態におけるＡ型肝炎
ウィルスキャプシッド。 - 【請求項４】 ステップ（ａ）及び（ｂ）におけるイオ
ン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラ
フィーである、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 ステップ（ａ）のアニオン交換クロマト
グラフィーが約０．３Ｍから０．４ＭのＮａＣｌ濃度に
おいて行なわれた、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 ステップ（ａ）のアニオン交換クロマト
グラフィーが約０．３５ＭのＮａＣｌ濃度において行な
われた、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ステップ（ｂ）のアニオン交換クロマト
グラフィーがＨＡＶキャプシッドの吸着に際しては約
０．１Ｍから０．２Ｍの間におけるＮａＣｌ濃度で行な
い、ＨＡＶキャプシッドの溶出に際しては０．３Ｍから
０．４ＭのＮａＣｌ濃度で行なわれた請求項４記載の方
法。 - 【請求項８】 ＨＡＶキャプシッドの吸着に際しては約
０．１５ＭのＮａＣｌ濃度及びＨＡＶキャプシッドの溶
出に際しては約０．３８ＭのＮａＣｌ濃度である請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】 以下のステップより成る、ワクチン接種
を目的とした弱毒化ＨＡＶキャプシッドの実質的な精製
方法で （ａ）ＨＡＶ感染細胞溶解物の水相を０．３５Ｍ Ｎａ
Ｃｌでアニオン交換クロマトグラフィーにかける； （ｂ）（ａ）における流出液を吸着なら０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌにおける吸着及び０．３８Ｍ ＮａＣｌにおける
溶出によるアニオン交換クロマトグラフィーにかける； （ｃ）ＨＡＶキャプシッドを含む（ｂ）の溶出液をゲル
濾過にかけワクチン接種を目的とした弱毒化ＨＡＶキャ
プシッドの実質的な精製物を得る方法である。 - 【請求項１０】 請求項９記載の方法による生成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55502090A | 1990-07-18 | 1990-07-18 | |
| US555020 | 1990-07-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0665095A true JPH0665095A (ja) | 1994-03-08 |
Family
ID=24215654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3177934A Pending JPH0665095A (ja) | 1990-07-18 | 1991-07-18 | Ａ型肝炎ウイルスキャプシッドの新規な精製法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0468702A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0665095A (ja) |
| CA (1) | CA2047041A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2686084B1 (fr) * | 1992-01-10 | 1995-12-22 | Bioprojet Soc Civ | Nouveaux derives de l'imidazole, leur preparation et leurs applications therapeutiques. |
| USRE37303E1 (en) * | 1992-01-10 | 2001-07-31 | Institut National Del La Sante Et De La Recherche Medicale | Imidazole compounds and their therapeutic applications |
| DZ1706A1 (fr) * | 1992-08-07 | 2002-02-17 | Merck & Co Inc | Vaccin contre le virus de l'hepatite a. |
| FR2696748B1 (fr) * | 1992-10-14 | 1994-12-30 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV). |
| HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
| US6149917A (en) † | 1995-08-01 | 2000-11-21 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Industrial production process for a vaccine against Japanese encephalitis virus and vaccine produced |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6451080A (en) * | 1987-08-06 | 1989-02-27 | Merck & Co Inc | Novel purification of hepatities a virus particle |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2398504A1 (fr) * | 1977-07-29 | 1979-02-23 | Tours Inst Virologie | Culture de virus de l'hepatite a, in vitro. application a la production d'un antigene reactif, d'immunserums specifiques et de vaccins contre l'hepatite a |
| JPH0751513B2 (ja) * | 1988-04-28 | 1995-06-05 | 国立予防衛生研究所長 | Ａ型肝炎ワクチン |
-
1991
- 1991-07-15 CA CA002047041A patent/CA2047041A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-18 EP EP19910306541 patent/EP0468702A3/en not_active Withdrawn
- 1991-07-18 JP JP3177934A patent/JPH0665095A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6451080A (en) * | 1987-08-06 | 1989-02-27 | Merck & Co Inc | Novel purification of hepatities a virus particle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0468702A3 (en) | 1992-02-05 |
| EP0468702A2 (en) | 1992-01-29 |
| CA2047041A1 (en) | 1992-01-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19950419 |