RO111472B1 - Procedeu de purificare a capsidelor virusului de hepatită A - Google Patents

Abstract

Procedeul conform invenției constă în aceea că, faza apoasă a lizatului celulelor infectate cu virusul hepatitei A se supune cromatografiei de schimb anionic, efluentul rezultat se supune din nou unei cromatografii de schimb anionic, iar eluatul obținut se gel-filtrează, cu obținerea capsidelor de virus de hepatită A, atenuate și purificate substanțial, pentru a fi folosite în scopuri de vaccinare. Prima etapă a cromatografiei de schimb anionic este făcută la o concentrație a NaCI de aproximativ 0,3...0,4 M, de preferință 0,35 M, iar etapa a doua de cromatografie de schimb anionic este făcută la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,1...0,2 M pentru adsorbția capsidei, și la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,3...0,4, de preferință 0,38 M, pentru eluția capsidei. Capsida virusului de hepatită A obținută este în formă efectivă pură și nu prezintă particule contaminate de 30 nm, observabile la microscop.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de purificare a capsidelor virusului de hepatită A[HAV), care este un virus [picornavirus) distinct din punct de vedere morfologic, biochimic și imunologic, fiind agentul etiologic al infecțiilor de hepatită, la oameni.

Sunt cunoscute, în domeniul de specialitate, diverse metode de purificare parțială a virionelor HAV, în vederea investigării și caracterizării acestora (de exemplu: Intervirology 6,309 - 314, 1975; J. Virol., 26, 40 - 47, 1978; J.Gen., Virol. 57, 331-341, 1981; Intervirology 22, 218, 1984; J. Virol. 52, 465, 1984 si J.Virol. 58, 307, 1986).

Fiecare din aceste metode folosește una sau mai multe etape care pot împiedica aprobarea de către Administrația Alimentelor și Medicamentelor a oricărui vaccin HAV pentru uz uman, sau sunt impracticabile din punct de vedere comercial. De exemplu, detergenții și/ sau enzimele exogene sunt utilizați în mod uzual; toate aceste metode folosesc etape laborioase, care sunt impracticabile și sunt excesiv de scumpe, cum ar fi centrifugarea cu gradient (sucroză) sau centrifugarea cu gradient de densitate CaCI.

Se cunoaște un procedeu de obținere a plasmei sanguine, neinfecțioase, ce constă în aceea că plasma sanguină congelată și desghețată la temperatura de 20 ... 30°C se aduce la pH =7,0 ... 7,4 și se tratează cu amestec de tr/s-Nbutilfosfat:triton X-100 : apă (0,5 ... 2: 0,5 ... 2,2 .... 4), se adaugă 10% din volum, lipide compatibile din punct de vedere biologic, alese dintre ulei de soia și/sau ulei de ricin, se cormatografiază, se filtrează pe materiale hidrofobe micronizate și apoi se cromatografiază cu fază inversată pe un derivat de octadecil C₁₈ cu verificarea pH-ului care trebuie să fie 7,0 ... 7,4, se filtrează steril și apoi se liofilizează în mod cunoscut.

Procedeul de purificare, conform invenției, constă în aceea că faza apoasă ,a Uzatului celulelor infectate cu virusul hepatitei A, se supune cromatografiei de schimb anionic, efluentul rezultat se supune din nou unei cromatografii de schimb anionic iar eluatul obținut se gelfiltrează, cu obținerea capsidelor de virus de hepatită A atenuate și purificate substanțial, pentru a fi folosite în scopuri de vaccinare. Prima etapă a cromatografiei de schimb anionic este făcută la o concentrație a NaCI de aproximativ 0,3 ... 0,4 M, de preferință 0,35 M, iar etapa a doua de cromatografie de schimb anionic este făcută la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,1 ... 0,2 M pentru adsorbția capsidei, și la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,3 ... 0,4 M de preferință 0,38 M, pentru eluția capsidei. Capsida virusului de hepatită A obținută este în formă efectivă pură și nu prezintă particule contaminante de 30 nm observabile la microscop.

Față de stadiul cunoscut al tehnicii, prezenta invenție are următoarele avantaje: metoda pentru obținerea capsidei HCV, care este extrem de pură, este fără utilizarea detergenților sau a enzimelor exogene. Mai mult, metodele prezentate în această invenție pot fi ușor transpuse la scară de producție industrială. In plus, specialiștii au preluat și dezvoltat aceste metode, pentru cultura de celule de fibroblast MRC - 5 diploid uman, metode care au fost certificate de Administrația Alimentelor și Medicamentelor, pentru utilizarea în producția de vaccin uman. In descrierea sumară a invenției, sunt dezvăluite metodele de purificare efectivă a capsidelor HAV, metode care cuprind următoarele etape: a] supunerea fazei apoase a Uzatului celulelor HAV infectate, unei cromatografii de schimb ionic; b) supunerea efluentului din etapa de mai sus, unei alte cromatografii deschimb ionic și c) gel-filtrarea eluatului din etapa b) care conține capside HAV, obținânduse astfel capside HAV substanțial purificate.

Procedeele de purificare sunt adaptabile la scară industrială, pentru prepararea la scară industrială, în vederea obținerii capsidelor purificate

RO 111472 Bl atât a celor derivate de la virușii atenuați, cât și de la cei virulenți HAV, produși în orice linie celulară sau cultură susceptibilă de infectare prin HAV. In plus, toate capsidele HAV, atât cele goale(care nu au acizi nucleici virali) cât și cele complete (care conțin acizi nucleici virali) sunt cuprinse în procesul în conformitate cu prezenta invenție.

In această invenție, HAV varianta P18 a tipului CR326F a fost utilizată pentru a infecta celule MRC - 5, numai pentru scopuri ilustrative. P18CR326F este un tip HAV atenuat. Alte tipuri și/sau serotipuri ale capsidelor HAV au fost cuprinse în această invenție, incluzând tipurile HAV care pot fi atenuate prin tehnici convenționale. Alte linii celulare, adecvate pentru propagarea HAV, includ celule Vero, FL, Wl - 38 și FRhK6. Acestea și alte sisteme pentru propagarea HAV în culturi de celule sunt cunoscute și discutate în literatura de specialitate. In principiu orice linie celulară, cum ar fi linia celulară fibroblast diploid uman, poate servi ca celulă gazdă pentru HAV prevăzută ca fiind susceptibilă infectării HAV. Este de preferat ca linia celulară să fie MRC - 5.

Celulele infectate HAV sunt crescute și recoltate, prin una sau mai multe variante de tehnici convenționale. Condițiile de creștere, incluzând selecția mediului, depind de cerințele liniei celulare întrebuințate. Celulele MRC - 5 sunt ancorate dependent, așadar este necesară aderarea la un substrat de pe care detașarea celulelor recoltate să se poată face prin metode fizice, chimice sau enzimatice. Alte tipuri de celule utilizate pentru scopul acestei invenții includ pe cele capabile de a crește prin ancorare independentă și care sunt, în mod uzual, recoltate prin centrifugare.

După creștere și recoltare, celulele infectate HAV sunt lizate (dezintegrare și dizolvare a celulelor), prin una sau mai multe variații de tehnică cunoscute, incluzând expunerea la soluții tampoane hipotonice, agitare puternică, cicluri de înghețare-desghețare și supunerea la băi de sunete (sonicare), dar fără limitarea numai la aceste tehnici. Dacă celulele au fost dezintegrate printr-o tehnică de lizare a celulei sau printr-o combinație de tehnici de lizare, suspensia rezultată din celulele dezintegrate este denumită, în invenția de față, ca fiind celule lizate.

Specialiștii au găsit ca model de sonicare, procedeul de supunere la baia de sunete prin tehnica de lizare preferată pentru o lizare suficient de completă a celulelor MRC - 5 care au fost infectate HAV, rezultând o eliberare eficientă a capsidelor HAV din celule. Orice eliberare a capsidelor HAV dintr-o celulă gazdă dezintegrată este denumită de aici încolo ca lizat. Este cunoscut faptul că baia de sonicare (prin aplicarea unui procedeu de sonizare) eliberează eficient capside HAV din starea subcelulară pseudocristalină din interiorul celulei. Este de preferat o combinare a procesului de sonicare cu una sau mai multe tehnici de lizare, cum ar fi lizarea hipotonică, agitare foarte puternică sau supunerea la cicluri de înghețare-desghețare. Specialiștii preferă îndeosebi următoarele etape de lizare a celulelor MRC 5 care sunt infectate HAV 1) dezghețarea celulelor înghețate și recoltate în tuburi și adăugarea tamponului de lizare (10 mM TRIS - HCI cu pH = 7,5, 10 mM NaCI și 1,5 mM MgCIJ; 2) agitarea foarte energică, timp de 10 ... 15 secunde (folosind un aparat Vortex Genis cotat la 10); 3) cicluri înghețaredezghețare, o dată sau de mai multe ori prin înghețări succesive într-o baie de etanol-gheață uscată, urmată de dezghețări în baia de apă la temperatura de 37°C și 4) supunerea la baia de sunete (procesul de sonicare), timp de 30 secunde, fiecare la puterea de ieșire maximă a aparatului - baia de sunete (sonicator) - cu recipient capsulă cu baie cu circulație apă-gheață.

Celula lizată este diluată cu o soluție tampon, după care urmează extracția ca un solvent organic. O astfel de extracție îndepărtează printre alți contaminanți și lipidele precum și alte substanțe asemănătoare lipidelor. In concordanță cu

RO 111472 Bl aceasta, celula lizată, care a fost obținută, este diluată cu oricare dintre tampoanele cunoscute, incluzând soluțiile de săruri fosfatice tamponate, soluțiile TRIS, carbonați, bicarbonați sau soluții de tampon acetat. Deoarece capsidele HAV sunt probabil stabile la acid, tampoanele care au un domeniu acid sunt, de asmeenea, posibil de Înlocuit. Sepecialiștii au descoperit că prezența MgCI₂ în tampon scade în mod substanțial randamentul capsidelor HAV. Cel mai preferat tampon este TNE (10 mM TRIS + HCI cu pH = 7,5 , 150 mM NaCI și 1 mM EDTA).

Celulele lizate și care au fost diluate cu soluție tampon, sunt apoi extrase prin adăugarea unui amestec care conține un alean inferior halogenat, cum ar fi, de exemplu, clorură de metilen, cloroformul, tetraclormetanul sau altele, precum și un agent antispumant cum ar fi alcoolul izoamilic. In conformitate cu prezenta invenție, aleanul inferior conține 1 ... 6 atomi de carbon. Raportul (v/v) de alean inferior halogenat și agent antispumant este cuprins între 15: 1 și 50 : 1, de preferat însă între aproximativ 20 : 1 și 30 : 1. Specialiștii au găsit că clorură de metilen este superioară cloroformului în această etapă. Capsidele HAV au fost găsite în mod predominantîn faza apoasă și în interfața de soluție apoasă/solvent organic. Este de preferat ca procesul de sonicare să fie realizat prin adăugarea unui solvent organic, în volum egal, cum ar fi un amestec de clorură de metilen și alcool izoamilic în raport de 24 : 1(v/v), cu agitare puternică timp de 1 min și apoi centrifugare la 3000 rot/min, timp de 10 min și la temperatura de 20°C, într-o centrifugă IEC (3000 x 66) pentru a obține separarea fazei apoase de faza organică. In continuare, faza apoasă este păstrată iar faza organică este îndepărtată. Interfața este extrasă cu un volum de TNE egal cu o treime din volumul original de probă, urmată de o agitare puternică și centrifugare, așa cum s-a arătat mai sus. Cele două faze apoase reunite într-un volum măsurat, reprezintă capsidele HAV din celulele lizate și care au fost extrase organic.

Următoarea etapă include concentrarea efectivă a precipitatului proteic cu un polimer sintetic solubil în apă.Specialiștii preferă să concentreze celulele lizate extrase organic(care conțin capsidele HAV) cu polietilenglicol (PEG) care are o greutate moleculară cuprinsă între aproximativ 2000 și 12000 daltoni. In mod obișnuit, celulei lizate i se adaugă clorură de sodiu pentru a obține o concentrație fianlă cuprinsă între aproximativ 150 mM și 500 mM. Se adaugă apoi polietilenglicolul', pentru a obține o concentrație finală cuprinsă între aproximativ 2% (greutate/volum) și 10% (greutate/volum). Este de preferat ca celula lizată și extrasă organic să fie ajustată la o concentrație de circa 500 mM NaCI, apoi să se adauge polietilenglicol ( 800 mg) până la obținerea unei concentrații de 4% (greutate/volum). Precipitatul rezultat, în astfel de condiții, este centrifugat după care se îndepărtează supernatantul, iar paleta obținută este resuspendată pentru continuarea procedeului. Este preferabil ca paleta PEG să fie supusă unei băi de sunete (sonicare] înainte de cea de a doua extracție organică, care se va descrie mai jos. Deci, paleta resuspendată și supusă unei băi de sunete (sonicare), așa cum s-a obținut cu cele arătate mai sus, este extrasă în continuare, prin adăugarea unui amestec de a alean inferior halogenat, care ar fi ,de exemplu, cloroformul și un agent anti spumant, cum ar fi, de exemplu, alcoolul izoamilic. Raportul (volum/volum) al aleanului inferior halogenat și agentului antispumant este cuprins între aproximativ 1% : 1 și 50 : 1, de preferat să fie cuprins între circa 20 : 1 și 30:1. Specialiștii au găsit că această a doua extracție îmbunătățește substanțial puritatea produsului HAV final. Mai mult, în contrast cu prima extracție organică, specialiștii au găsit că cloroformul este superior clorurii de metilen în cea de a doua extracție organică. Cel mai indicat este ca, etape

RO 111472 Bl le celei de a doua extracții organice să fie executate după cum urmează: paleta PEG resuspendată și supusă băii de sunete (sonicare) să fie apoi extrasă organic prin adăugarea unui volum egal de amestec de cloroform și alcool izoamilic în raport de 24 : 1 (volum/ volum), cu o agitare foarte puternică. Acest extract obținut este limpezit prin centrifugarea la 4000 x g, timp de 10 min și la temperatura de 20°C. Faza apoasă este păstrată, iar interfața și faza organică sunt supuse procedeului de retragere cu un volum de tampon TNE care este egal cu o treime din volumul probei originale, după care ambele faze apoase sunt reunite și rezultă paleta PEG extrasă.

Extrasul de mai sus este supus cromatrograficii de schimb anionic pe o rășină, pe un gel sau pe o matrice. Matricele schimbătoare de anioni includ în mod tipic următoarele DEAE celuloză: DEAE agaroză; DEAE Biogel; DEAE dextran; DEAE Sefadax, DEAE Sefaroze; Aminohexil Sefaroza; Ecteol celuloză; TEAE celuloză; non-0 sau Benzoilat dietilaminoetil celuloză (dar nu numai acestea). Matricea schimbătoare de ioni preferată este DEAE-Sefaroza CL - 6B (de uz farmaceutic). Informații suplinitoare și referitoare la modul de efectuare a cromatografiei de schimb ionic pot fi găsite în literatura de specialitate.

Clorura de sodiu este adăugată extractului pentru concentrarea finală, între aproximativ 0,3 M până la 0,4 M, de preferat 0,35 M NaCI. Extractul obținut este apoi trecut printr-o coloană cromatografică care este umplută cu DEAE Safaroza CI - 6B. Capsidela HAV trec prin această coloană cromatografică, fără să fie adsorbite de aceasta, în timp ce contaminanții care includ și acizi nucleici celulari, sunt adsorbiți pe DEAE Safaroza CL - 6B și rămân în coloană. Efluentul (care conține capsidele HAV) este colectat, și acesta constă din capside HAV în mod substanțial libere de acizi nucleici celulari. Efectul acestei etape de schimb anionic este de îndepărtare a acizilor celulari ADE, ARN precum și a altor impurități din capsidele HAV. In principiu, schimbul anionic poate fi substituit prin adăugarea sau îndepărtarea ADN, sau prin tratamente alternative desemnate să înlăture ADNul sau alți acizi nucleici în această etapă a procesului de purificare.

In această etapă, efluentul apare conținând capside HAV (atât goale cât și complete) și particule difuze în jur de 30 nm, atunci când se face observarea prin microscopie electronică (vezi figura 1, care va urma).

Efluentul obținut de la cromatografia de schimb anionic de mai sus, și care conține capside HAV, este supus unei a doua etape de cromatografie de schimb anionic, pentru îndepărtarea în continuare a componentelor celulare contaminante. Efluentul obținut este diluat cu 10 mM TRIS, 1 mM EDTA cu pH = 7,5, pentru a da o concentrație de NaCI cuprinsă între aproximativ 0,1 M și 0,2 M, de preferință 0,15 M. In continuare, efluentul diluat este trecut printr-o matrice de schimb anionic. Matrice schimbătoare de anioni, tipice pentru această etapă sunt următoarele DEAE celuloză; DEAE agaroză: DEAE Biogel: DEAE dextran; DEAE Sefadex; DEAE Sefaroza; Aminohexil Sefaroza; Ecteol celuloza; TEAE celuloză; mono - O sau Benzoilat dietilaminoetil celuloză (dar nunumai acestea). Matricea schimbătoare de ioni preferată este DEAE Sefaroza CL - 6 B (de uz farmaceutic).

S-a descoperit că, la valoarea de molaritate a clorurii de sodiu, descrisă mai sus, capsidele HAV aderă la matricea schimbătoare de anioni, în timp ce contaminanți rămași trec în mod sigur prin matrice. Coloana este spălată de mai multe ori cu soluție de clorură de sodiu 0,15 M, pentru a favoriza îndepărtarea contaminanților reținuți. Capsidele HAV sunt eluate din coloana schimbătoare de anioni, utiizând un volum de 0,35 M NaCI egal cu volumul din coloană plus volumul probei originale. Efectul acestei a doua etape de schimb anionic este de îndepărtare a particulelor care apar difuze prin microscopia elec

RO 111472 Bl ironică, și care au un diametru în jur de 30 nm și se crede că sunt compuse din carbohidrat celular (vezi figura 2, care va urma).

Cromatografia de schimb anionic este urmată de etapa finală și anume a cromatografiei de gel-filtrare. In această situație, în mod tipic, este folosită Sefaroza CL - 4B (de uz farmaceutic), dar poate fi înlocuită de numeroase alte tipuri de matrice de gel-filtrare și care sunt cunoscute în domeniul de specialitate.

In timp ce secvența particulară a etapelor cromatrografice ale schimbului anionic urmată de gel-filtrare, reprezintă procedura tipică pentru purificarea capsidelor HAV în această invenție, trebuie să se înțeleagă că secvența poate fi variată. De exemplu, gel-filtrarea poate proceda una din etapele de schimb anionic. Mai mult, secvența celor două etape ale cromatografiei de schimb anionic pot fi variate.

In cele ce urmează sunt prezentate etapele adiționale.

La prezentul proces de purificare a capsidelor HAV, pot fi adăugate opțional, fără efecte semnificative asupra rezultatelor procesului, și alte proceduri convenționale care sunt cunoscute și utilizate, în mod normal, în purificarea proteinelor, fie a celor virale sau celulare, fie a particulelor cum sunt capsidele. Aceste proceduri includ punctele care urmează, dar fără să se limiteze numai la acestea: a) adsorbția selectivă sau repartiția pe o fază solidă, de exemplu, silicagel, fosfat de calciu, cărbune sau celit-alumină; b) cromatografia hidrofobică ca de exemplu butil-agaroză; c) extracția selectivă cu alți solvenți organici sau reactivi; d) etape adiționale de precipitare a capsidelor HAV; e) cromatografie prin orice metodă standard, incluzând cromatografia în strat subțire, gel-cromatografia, cromatografia pe site moleculare, cromatografia de excluziune moleculară, cromatografia de schimb ionic, cu afinitatea ligandului, de imuno-afinitate sau prin electroforeză; f) fracționarea solventului prin două faze de extracție, de exemplu cu polietilenglicol și dextran; g) dializa, ultrafiltrare sau diafiltrare; h) centrifugare cu gradient de densitate; i) electrofocalizare; j) înghețare uscată sau liofilizare; k) cristalizarea; I) adăugarea inhibitorilor (proteaze) și/sau a agenților de chelatizare la soluțiile tampon sau m) substiuirea unei soluții tampon cu altă soluție tampon.

Lista de mai sus nu este exhaustivă și ordinea sa nu este o indicație a ordinii de preferat la utilizare. Trebuie înțeles că o purificare reușită a capsidelor HAV poate include una, câteva, toate sau nici una dintre etapele a) - m) arătate mai sus, și că aceste etape sunt opționale și nu au efect asupra rezultatului procesului prezentei invenții conturate ca mai sus. Etape de procesare adiționale care sunt convenționale și bine cunoscute sunt și pot fi necesare pentru purificarea capsidelor HAV în vederea folosirii acestora ca vaccin. De exemplu, tratamentul cu formalină, filtrarea sterilă și adsorbția purtătorilor sau adjuvanților sunt etape de bază și tipice pentru prepararea unui vaccin inactivat cu formaldehidă, și care este cunoscut specialiștilor în domeniul respectiv. HAV poate fi inactivat prin căldură, prin schimbarea valorii pH-ului, prin tratamente cu solvenți organici, prin iradiere cu radiații ultraviolete sau prin tratare cu formalină. Trebuie să se înțeleagă că scopul prezentei invenții cuprinde, în plus față de varianta P18 a tipului CR32BF a HAV, orice variantă HAV sau tip, fie atenuat fie virulent. Tipurile sau variantele atenuate pot fi izolate prin trecerea în serie în celule animale sau prin alte metode (a se vedea de exemplu Proc. Soc. Exp. Biol. Red. 170,8 (1982); J.Med. Virol. 20, 165 (1986), care cuprind detalii asupra modului de atenuare). Metodele de purificare care sunt arătate în prezenta invenție sunt ușor și repede de adaptat tipurilor de HAV virulente sau atenuate. Exemplele care urmează ilustrează partea practică a invenției, dar fără de a se limita scopul și conținutul invenției.

RO 111472 Bl

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1 și 2 carereprezintă;

-fig. 1, prezintă imaginea obținută la microscopul electronic (putere de mărire 130.OOO x) a afluentului de la prima etapă de cromatografie de schimb anionic, care conține capsidele HAV (c) și particule (p) de 30 cm.

-fig.2, prezintă imaginea obținută la microscopul electronic (puterea de mărire de 130.000 x) a eluatului de la a doua etapă de cromatografiere de schimb anionic, care conține capside HAV (o) libere de particule de 30 nm.

Exemplul 1. Se referă la procedeul de purificare a capsidelor virusului hepatitei A (HAV) din celula MRC - 5.

A. Ruperea celulei.

Celulele MRC - 5 infectate cu un HAV atenuat (varianta P18 a tipului CR 326F) au fost recoltate prin răzuirea celulelor de pe stratul de cultură și s-au colectat celulele în tuburi de polipropilenă, după care au fost înghețate la o temperatură de -70°C, pentru a obține patru sticluțe cu vergea echivalente pe tub. Două tuburi au fost dezghețate prin adăugarea a 3 ml de tampon de lizare per tub (10 mM TRIS HCI cu pH = 7,5, 10 mM NaCI și 1,5 mM MgCI₂) și prin agitare viguroasă, timp de 10 ... 15 s (cu aparatul Vortex - Cenis setat la 10) și apoi ținute pe gheață umedă timp de 15 min. Elementele au fost înghețate de două ori în baia de etanol-gheață uscată și apoi dezghețate în baia de apă, la temperatura de 37°C. Fiecare tub a fost supus unei băi de sunete, de trei ori câte 30 s, la puterea maximă de ieșire a (sonicator) băii de sunete recipient capsula cu baia cu circulație gheață-apă (Branson Senifier Cell Disrupter 185 și Ultrasonic). După baia de sunete, au fost reunite și încercate pentru proteină, utilizând o proteină de probă cu albumină serică bovină (BSA) ca proteină de concentrație standard, și apoi ajustat la 3 mg proteină/ml, utilizând tampon TNE (10 mM TRIS - HCI cu pH = 7,5, 150 mM NaCI și 1 mM EDTA). S-a trecut apoi la faza de extracție organică, prin adăugarea unui volum egal de amestec de clorură de metilen si alcool izoamilic în raport de 24 : 1 (volum/volumj și prin agitare puternică, timp de 1 min, după care urmează centrifugarea la 3000 rot/min, timp de 10 min, la temperatura de 20°C, într-o centrifugă IEC (3000 x g), pentru a obține separarea fazei apoase de faza organică. Faza apoasă obținută a fost păstrată, iar faza organică a fost îndepărtată. Interfața a fost reextrasă cu un volum de tampon TNE egal cu o treime din volumul probei originale, prin agitare puternică și apoi cromatografiere, așa cum s-a arătat mai sus. Cele două faze apoase au fost reunite și s-a măsurat volumul, obținând astfel capsida HAV în celulele lizate și supuse extracției organice.

B. Precipitarea cu polietîlenglicol (PEG)

Capsidele HAV, din celulele lizate, au fost supuse extracției organice, au fost concentrate prin precipitare cu polietîlenglicol (PEG). Uzatele au fost ajustate la 500 mM NaCI și apoi aduse la 4% (greutate/volum) prin adăugare de PEG 8000, cu agitare puternică (PEG 8000 a fost preparat în 10 m^M TRIS HCI cu pH = 7,5, 500 (mM) NaCI și 1 mM EDTA). Uzatele PEG 4% au fost ținute la temperatura de 4°C, timp de o oră și apoi centrifugate la 1500 rot/min , timpi O min, la 4°C într-un rotor Behkman HB -4. S-a îndepărtat supernatantul, și paleta PEG a fost resuspendată, prin agitare puternică, în tampon ce cuprinde 10 mM TRIS-HCI cu pH = 7,5, 50 mM NaCI, 10 mM EDTA, după care s-a supus la baia de sunete, în trei reprize, pe o perioadă de câte 30 s și de fiecare dată, la puterea maximă de ieșire a aparatului - în (sonicator) - baia de sunete recipient capsula cu baie cu circulație gheață-apă, așa cum s-a descris mai sus. Paleta PEG resuspendată și supusă băii de sunete a fost apoi supusă extracției organice prin adăugarea unui volum egal de cloroform în amestec cu alcool izoamilie (raport 4 : 1), cu agitare puternică și apoi limpezirea prin centrifugare la 4000 rot/ min, timp de 10

RO 111472 Bl

VERSIUNE CORECTATA - CORRECTED VERSION

Semnalat în: / Reffered to in: BOP! 2/1998 min, la temperatura de 2O°C. S-a păstrat faza apoasă, interfața și faza organică care au fost reextrase cu un volum de TNE egal cu o treime din volumul supus băii de sonicare, iar volumul în care este suspendată paleta împreună cu ambele faze apoase au fost combinate, obținând paleta PEG resuspendată.

C. Cromatografia de schimb ionic și de gel-filtrare.

Paleta PEG resuspendată a fost ajustată la 0,35 M NaCI și apei supusă cromatografiei prin 2 ml DEAE - Sefaroza CL - 88 ( de uz farmaceutic), pe coloane legate în serie, la un debit al pompei de 3 ml/min. Coloana a fost preparată în coloana Kontes Flex (1,0 x 5,0 cm) și echilibrată în 10 mM TRIS - HCI pH = 7,5, 0,35 mM NaCI, 1 mM EDTA. Primii 15 ml de eluat, care conțin capsidele HAV, au fost colectați. Eluatul a fost diluat la o concentrație de NaCI 0,15 M utilizând 10 mM TRIS, 1 mM EDTA, pH = 7,5 și apoi supus cromatografiei prin 2 ml Sefaroza CL - 88 (de uz farmaceutic), coloana fiind legată la o pompă cu un debit de 3 ml/min. Coloana a fost preparată într-o coloană Kontes Flex (1,0 x 5,0) si echilibrată în 10 mM TRIS - HCI, 0,15 mM NaCI, 0,1mM EDTA, pH = 7,5. Coloana a fost spălată cu câteva volume de 10 mM TRIS, 0,15 mm NaCI, 0,1 mM EDTA, pH=7,5. Capsidele HAV au fost eluate utilizând 10 mM TRIS, 0,35 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH = 7,5. Primii 15 ml de eluat, care conțin capsidele HAV, au fost colectați. Eluatul a fost supus cromatografiei prin coloana cu Sefaroza CI 4B (de uz farmaceutic), echilibrată în tampon TNE și legată la o pompă cu un debit 40 ml/oră. S-au colectat fracțiuni de câte 5 ml, obținând astfel capside HAV atenuate și purificate în mod substanțial. Fracțiunile care conțin capmide HAV au fost identificate prin analiza radioimunologică (RIA)utilizând un anticorp specific pentru HAV, combinat, sterilizat prin filtrare printr-un filtru 0,22 m (Millipore) și stocat la -70°C. Comcentratul de HAV a fost determinat prin analiza radioimunologică cantitativă (RIA) și proba concentrată (dacă este necesar) prin liofilizare.

Cu o probă de 5 mg de capside HAV purificate, gel electroforeza cu SOSpoliacrilamidă nu reușește să detecteze nici o puritate după colorarea și deplasarea petei.

In timp ce specificația precedentă arată principiile prezentei invenții, cu exemple ilustrative, prevăzute în acest scop, trebuie înțeles că practica acestei invenții înglobează toate variațiile, adaptările, modificările, suprimările sau adăugările uzuale ale procedurilor și protocolurilor descrise mai sus.

Claims (4)

1. Revendicări

   1. Procedeu de purificare a capsidelor virusului de hepatită A, caracterizat prin aceea că faza apoasă a lizatului celulelor infectate cu virusul hepatitei A se supune cromatografiei de schimb anionic, efluentul rezultat se supune din nou unei cromatografii de schimb anionic, iar eluatul obținut se gelfiltrează, cu obținerea capsidelor de virus de hepatită A atenuate și purificate substanțial, pentru a fi folosite în scopuri de vaccinare.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că prima etapă a cromatografiei de schimb anionic este făcută la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,3 ... 0,4 preferință 0,35 M.
3. 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că etapa a doua de cromatografie de schimb anionic este făcută la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,1 ... 0,2 M pentru adsorbția capsidei, și la o concentrație de NaCI de aproximativ 0,3 ... 0,4 M, de preferință 0,38 M, pentru eluția capsidei.
4. 4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că capsida obținută este în formă efectiv pură și nu prezintă particule contaminante de 30 nm obsrvabile la microscop.