JP3205932B2 - ライム病に対するワクチン、その取得法、モノクローナル抗体、抗原、組換えｄｎａ、組換えベクター及び抗原の取得法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ライム−病（Lyme−Krankheit）に対する
ワクチン、その取得法、モノクローナル抗体、病原性ボ
レリア・ブルグドルフェリ菌株、抗原、組換えDNA、組
換えベクター、抗原の取得法及び病原性B.ブルグドルフ
ェリを単離かつ再培養する方法に関する。

［従来の技術］ ライム−ボレリオース（Lyme−Borreliose）は、温帯
における屡々、ダニにより媒介される伝染病である。こ
れは、スピロヘータ ボレリア・ブルグドルフェリ（Bo
rrelia burgdorferi）により惹起され、この菌は特に
マダニ（Ixodes）によりヒトに伝染される。この病気
は、多くの臓器例えば皮ふ、中枢又は末梢神経系、心
臓、肝臓、腎臓及び骨格筋系に羅病する慢性で漸進性の
伝染病である。抗生物質を用いる治療によるこの病気の
可能な処置は困難であるので、現在は、病原菌そのもの
及び宿主のB.ブルグドルフェリでの感染に対する免疫応
答を研究する多大の努力がなされている。ライム病にか
かったヒトでは、B.ブルグドルフェリに対する高い抗体
価が確認されるが、この感染に対する保護の作用は得ら
れない。この病原体は非常に迅速に血管から組織中に移
行し、そこで、免疫系にもはや直接到達可能ではないと
考えられる。このことは、抗体による保護は、感染の開
始の直後にのみ、病原体がなお血管内に存在するかぎり
において可能であることを意味している。

種々の動物におけるB.ブルグドルフェリによる自然の
感染が発見された事実は、ライム病に関する実験室内モ
デルを作る試みをもたらした。このことは、限られた結
果で成功した。例えば、マウスにおけるB.ブルグドルフ
ェリに対して特異的な免疫応答の誘発を目的とした実験
では、既に長時間培養したB.ブルグドルフェリ−単離体
での同系交配−マウス種の感染は、種々の臓器例えば
脳、心臓、肺及び腎臓内での、ライム病を有する患者で
観察されるそれと匹敵する中程度であるが顕著な病理形
態学的な変化をもたらしたことが判明した（Schaible等
による（1988）、Infect.Immun.1,41）。動物における
重大な病気の発症は、おそらく、宿主の免疫防御及び／
又は長時間にわたり試験管内で培養されたスピロヘータ
の減少された毒性に依り、阻止された（Johnson等によ
る（1984）J.Clin.Microbiol.20,747,Schwan等による
（1988）Infect.and Immun.56,1837）。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の基礎となっている課題は、ライム病に対する
有効なワクチンを製造することである。しかしながら、
このためには、まず、適当な実験動物モデルの開発が必
要である。ところで、機能的Ｔ−及びＢ−細胞のないマ
ウス、いわゆるScid−マウス（Scid−Maus;Bosma等によ
るNature（1983）10,52参照）を実験動物として使用す
ることが提案された。それというのも、Scid−マウスは
病原性B.ブルグドルフェリ−単離体での感染時に、多系
統疾病しかも、主として多発関節炎及び心筋炎を発症す
るからである。この動物モデルにより、はじめて、ライ
ム病に対するこのワクチンの作用を確かめることが可能
になる。

本発明の対象物は、B.ブルグドルフェリの31kD抗原
（OspA）又は／及び34kD抗原（OspB）殊に菌株B31（ATC
C35210）又は／及びZS7（DSM5527）のOspA又は／及びOs
pBに関して特異的なモノクローナル抗体１種以上を含有
する、ライム病に対する受動ワクチンである。IgG群特
にIgG2b又はIgG1亜群の本発明による抗体を含有するワ
クチンが有利である。本発明による抗体の適用は、意外
にも、例えばB.ブルグドルフェリの41kD表面抗原（Flag
e−llin）に対する他の抗体の適用とは反対に、免疫欠
失実験動物特に生存可能な病原性B.ブルグドルフェリ特
にB.ブルグドルフェリZS7で感染されたScid−マウスに
おいて、関節炎、心筋炎及び肝炎の発症を完全に又は少
なくとも充分に阻止する作用をする。

場合によっては、本発明によるワクチンは、作用物質
としての抗体と共になお慣用の担持剤、充填剤及び助剤
をも含有していてもよい。

更に、本発明は、実験動物特に、B.ブルグドルフェリ
生物体又はその１部特に完全B.ブルグドルフェリB31又
は／及びZS7生物体で免疫化されているマウスのリンパ
細胞又は脾臓細胞からの、ライム病に対する受動ワクチ
ンの取得法にも関し、この際、免疫化された動物のリン
パ細胞又は脾臓細胞から細胞融合により、本発明のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。

OspAに対する本発明による抗体LA−２（IgG2b）を産
生するハイブリドーマ−セルライン（ECACC89091302）
も本発明の対象物である。更に、OspAに対する抗体LA−
26.1（IgG1）を産生するハイブリドーマ−セルラインEC
ACC90050406並びにOspBに対する抗体LA−25.1もしくはL
A−27.1（IgG2bもしくはIgG1）産生性のハイブリドーマ
−セルラインECACC90050405もしくはECACC90050407も本
発明の対象物である。

同様に、本発明には、病原性B.ブルグドルフェリ菌株
ZS7（DSM5527）も包含される。

更に、本発明のモノクローナル抗体と免疫反応する抗
原も本発明の対象物である。これは、OspAもしくはOspB
の全アミノ酸配列又はOspAもしくはOspBの免疫原作用を
する部分配列（免疫原性エピトープ）のみをも含有する
抗原である。当業者は、この蛋白質の可能な免疫原性エ
ピトープを困難なく、OspA−蛋白質の構造分析（例えば
Chou−Fassmann Analyse）により確認し、実験的にそ
の作用を試験することができる。

本発明の１目的物は、殊に本発明の抗体と免疫反応す
る組換え抗原でもあり、この際抗原に関して暗号化する
DNA−配列は、組換えベクター特に蛋白質表現のために
好適である原核性ベクター上に存在する。

殊に、本発明の目的物は、特異的に本発明の抗体と免
疫反応し、第１図に記載のアミノ酸配列又はこの配列か
らの免疫原性エピトープを有する、B.ブルグドルフェリ
からの抗原である。相応して、本発明は、（１）第１図
に記載の配列、（２）遺伝子コードの変性の範囲内でそ
れに相応する核酸配列又は（３）（１）又は／及び
（２）からの配列と厳しい条件下にハイブリド形成し、
B.ブルグドルフェリZS7の31kD抗原又はその免疫原性エ
ピトープに関して暗号化する配列を有する組換えDNAに
も関する。ここで、「厳しいハイブリド形成条件」なる
概念は、マニアチス（Maniatis）等のモレキュラー・ク
ローニング・ア・ラボラトリイ・マニュアル（Molecula
r Cloning Ａ Laboratory Manual（1982）,Cold S
pring Harbor Laboratory New York）に記載のよう
な条件と解すべきである。

特に、組換え非融合蛋白質又はβ−ガラクトシダーゼ
−融合蛋白質である、本発明の抗原が有利である。

更に、本発明は、本発明による組換えDNAの１以上の
コピーを有する組換えベクターをも包含する。この本発
明によるベクターは、原核性及び／又は真核性のベクタ
ーであってよく、原核性ベクターが有利である。この組
換えベクターは、宿主細胞中に染色体外に存在（例えば
プラスミド）していてよいか又は宿主細胞のゲノム内に
組み込むこともできる（例えばバクテリオファージラム
ダ）。本発明のベクターはプラスミドが有利である。特
に、組換えベクターpZS−7/31−２（DSM5528）が有利で
ある。

１以上の本発明による抗体を用いるB.ブルグドルフェ
リ遺伝子バンクの検査により、本発明による抗原を取得
する方法も本発明の対象であり、ここでは、使用抗体と
正の免疫反応を示すクローンを単離する。

本発明による抗原は、それ自体、活性免疫化のため、
即ち、生物体内での抗体形成を誘発するために使用する
ことができるので、作用物質としての本発明の抗原を、
場合によっては慣用の担持剤、充填剤及び助剤と共に含
有する、ライム病に対する活性ワクチンも本発明に包含
される。本発明による抗原を遺伝子工学的な方法で取得
するのが有利な実施形である。

天然のもしくは組換えOspAを正常マウスに適用する
と、Scid−マウスへの受動的伝達の後にこれをライム−
ボレリオースに対して保護する防御抗体の形成を誘発す
る事実が判明した。殊に、組換えOspAは、天然のOspAと
匹敵する保護的免疫応答を誘発し、従って、ヒトのライ
ム−ボレリオースに対するワクチンに関する有望な候補
であることが判明した。

更に、本発明の対象は、ライム病に対する受動ワクチ
ンを取得する方法であり、この際、実験動物特にマウス
を本発明による抗原で免疫化し、この免疫化された実験
動物から常法で、保護性の、ポリクローナル又はモノク
ローナルの抗体を取得する。

最後に、本発明には、病原性B.ブルグドルフェリ生物
体の単離及び再培養法も包含され、これは、免疫欠失実
験動物特に、予め病原体で感染されたマウスから病原体
を取得し、この際、病原体の病原性を保持残留させるこ
とよりなる。特に、感染されたScid−マウスの血液及び
／又は関節から病原性B.ブルグドルフェリZS7（DSM552
7）生物体を取得する方法が有利である。

次の実施例及び第１図及び第２図により本発明を詳述
する。

第１図はB.ブルグドルフェリZS7からの31kD抗原（Osp
A）のDNA−及びアミノ酸配列を示す図であり、第２図
は、組換え蛋白質rZS7/31−２の免疫学的特性を示す図
である。

実施例 例 １ B.ブルグドルフェリ菌株での感染によるScid−マウスで
の関節炎、心臓炎及び肝炎の誘発 B.ブルグドルフェリでのマウスの処置 C.B−17Scid種（Scid−突然変異に関するホモ接合
体）及びC.B−17種の成長したマウスに生存可能である
か又は殺した（UV−照射）B.ブルグドルフェリ生物体１
×10⁵、５×10⁵、１×10⁶又は１×10⁸を尻尾のつけ根に
皮下注射する。

ダニ及びマウスからのB.ブルグドルフェリの単離 この実験をすでに長期間培養されてきたB.ブルグドル
フェリ菌株B31（ATCC35210）及び雌のイキソデス・リチ
ヌスダニ（Ixodes rizinus Zecke）から単離された、
新らしい単離体B.ブルグドルフェリZS7（DSM5527）を用
いて実施した。すべてのB.ブルグドルフェリ株を変性ケ
リーの培地（Kelly's Medium）中で培養した（Barbour
等著、1983年、Switzerland.Curr.Microbiol.第８巻、
第123頁）。エタノールで殺菌したダニの腸中部から、
又は感染したマウスの血液から得られたB.ブルグドルフ
ェリ生物体をカナマイシン８μg/ml及びフルオルウラシ
ル230μg/mlを添加下にケリーの培地中でまず培養した
（Johnson等著、1984年、J.Clin.Microbiol.第１巻、第
81頁）。

血清学的テスト B.ブルグドルフェリ特異的抗体の検出を慣用のエリザ
（ELISA）法により実施した（Justus等著、1988年、Weh
rmed.Mschr.第32巻、第263頁）。免疫グロブリン（Ig）
の含量に関する標準曲線を抗マウスIg（Paesel,フラン
クフルト、西独からの血清溶液の1:500希釈）を含有す
るシャーレの塗布及び全−マウスIgG−又はIgM含量の滴
定（Calbiochem.LaJolla,USA）により得た。全血清IgM
及びIgGを同様に測定した。B.ブルグドルフェリ特異的I
gM−又はIgG−抗体の濃度をIg μg/ml血清で示した。

免疫蛍光法及びギームザ（Giemsa）染色 血液50μをヘマトクリット管中にピペットで採取し
（Becton und Dickinson,Heidelberg,BRD）、ヘマト
クリット遠心分離機（ECCO,BRD）中5000gで遠心分離し
た。この管を血清と赤血球の中間相で切開し、血清の５
μをスライドプレート上に担持した（Superior,Bad
Mergentheim,BRD）。血清試料で被覆されたスライドプ
レートを空中で乾燥し、100％エタノール中−20℃で１
分間固定する。家兎−抗B.ブルグドルフェリ高免疫血清
（1:100希釈）と共に室温で１時間恒温保持した後、こ
のスライドプレートをPBS中で５回洗浄し、次いでFITC
結合山羊−家兎−抗血清（1:20希釈、Jackson Lab.,We
st Grove,USA）で１時間染色する。このスライドプレ
ートを洗浄し、カイザー（Kaiser）のグリセリン−ゼラ
チン（Merck,Darmstadt,BRD）中に埋め込み、すぐに蛍
光顕微鏡で検査した。未処置の血液滴を空気中で乾燥
し、メタノール中で固定し、ギームザ（0.1％、Merck,D
armstadt,BRD）で染色し、PBS中で脱色し、エンテラン
（Entellan;Merck,Darmstadt,BRD）中に埋め込む。

組織学的標本作製及び染色法 あらかじめB.ブルグドルフェリで感染させたマウスか
ら種々の内部器官（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓及
び関節）を感染後の種々異なる時点で取り出し、凍結薄
片の調製のために液体窒素中で保存するか、又はパラフ
ィン又はメタクリレート中への埋め込みのために５％ホ
ルムアルデヒド（PBS中）中で保存する。４〜７μｍの
薄片を製造し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、エ
ンテラン（Entellan;Merck社、ダルムシュタット、BR
D）中に埋め込む。免疫組織学をストレプトアビジン／
ビオチン／ペルオキシダーゼシステムを使用して実施し
た（Kramer等著、1989年、Eur.J.Immunol.第19巻、第15
1頁）。

第１表は単離体ZS7及びB31のB.ブルグドルフェリ生物
体が、あらかじめ生存可能な生物体を接種したScid−マ
ウスの血液中に全実験期間の間検出されたことを示す。
いずれにせよ、試験管内においては、菌株ZS7のスピロ
ヘーターのみを再培養することができ、菌株B31を再培
養することはできなかった。再培養した生物体と最初の
B.ブルグドルフェリZS7単離体との比較の際に、蛋白質
含量において又はプラスミドプロフィルにおいて全く変
化を確認することはできなかった。B.ブルグドルフェリ
で感染したScid−マウス中には全監察期間の間、重要で
ない抗体の力価は全く検出されなかったか、又は著しく
僅かであった。この動物中では、B.ブルグドルフェリ特
異的IgM−又はIgG−抗体は全く見い出されなかった（第
１表）。これに対し、B.ブルグドルフェリで感染したす
べてのC.B−17−対照マウスは多量の全−Ig及びB.ブル
グドルフェリ特異的IgM−及びIgG−抗体の高められた力
価を示した。B.ブルグドルフェリZS7での感染７日〜20
日後に、Scid−マウスは関節炎の第１次臨床症状（両方
の脛骨足根骨関節の発赤及びはれ）を示し、これは時間
と共にひどくなった。これに対してUV−照射B.ブルグド
ルフェリZS7で又は生存可能なB.ブルグドルフェリB31生
物体で感染したScid−マウス及び生存可能なB.ブルグド
ルフェリZS7生物体で感染したC.B−17−対照マウスには
全く関節炎の症状は見い出されなかった。

組織病理学も、生存可能なB.ブルグドルフェリZS7で
感染したScid−マウス中での関節炎による関節変化を証
明した（第１表）。軟骨組織及び／又は骨の糜爛及び破
壊を伴なう、形成過度の炎症性関節液−被覆細胞の存在
により特徴付けられる重症の関節障害が確認された。更
に心内膜、心筋層及び心膜中への単核細胞の浸潤を伴な
う心臓全壁炎が確認された。同様に、肝臓の進行性の炎
症が確認され、この際、門脈域及び中心静脈に限定され
た単核細胞の浸潤、肉芽腫症反応及び最後に肝臓線維症
が確認された。更に、腎臓、肺、脳及び横紋筋中で僅か
な障害が確認された。

例 ２ Scid−マウスのライム・ボレリオース（Lyme−Borrelio
se）の経過に対するB.ブルグドルフェリ31kD抗原にとっ
て特異的なモノクローナル抗体の作用 モノクローナル抗体の製造 完全な免疫システムを有するマウスをB.ブルグドルフ
ェリ生物体で免疫にする際に、B.ブルグドルフェリに特
異的であるポリクローナル抗体が表現される（第１表参
照）。

生後10週の、同血統交配種BALB/cの雌マウスを超音波
ホモジナイズドボレリエン（Borrelien;B.ブルグドルフ
ェリ、B31株;ATCC35210）で免疫にする。

免疫法： ０日目：完全フロインドのアジュバント中のボレリエン
−抗原200μｇを皮下注射 21日目、35日目、49日目、63日目：燐酸塩緩衝食塩水中
のボレリエン−抗原100μｇで促進（腹腔内） 66日目：脾臓の取り出し、及び個々の細胞懸濁液の製造 この免疫脾臓細胞を骨髄腫細胞系Ag8−PAIとポリエチ
レングリコールの使用下に標準法により融合させた（J,
H.Peters、H.Baumgarten,M.Schulze著、“Monoklonale
Antikoerper"Springer−Verlag社、ハイデルベル
グ）。

融合生成物を96穴組織培養プレート中に播種した。８
日後、B.ブルグドルフェリ特異的モノクローナル抗体の
存在に関して細胞培養上澄を固層エリザを用いて調べた
（J,H.Peters等著、前記）。

抗体−生産性培養からのハイブリドーマ細胞を限界希
釈法によりクローン化した。引き続き、個々のクローン
の培養上澄を新たに固相エリザ中で、かつウエスタンブ
ロット分析により、かつ免疫蛍光試験により特徴付け
た。亜クラスIgG2bのモノクローナル抗体LA−２はモノ
クローナルハイブリドーマ系から生産され、分泌され、
かつウエスタンブロット法で、電気泳動法によりSDS−
ゲル上で分離され、ウエスタンブロット法で膜上に搬送
されたB.ブルグドルフェリ蛋白質と接触する際にすべて
の実験したB.ブルグドルフェリ菌株（特に、単離体ZS7
及びB31）からの31kDa−構造、（Osp−Ａ）と反応す
る。モノクローナル抗体LA−26.1c（抗−OspAIgG1）、L
A25.1（抗−OspB（34kDa抗原）;IgG2b）及びLA27.1（抗
−OspB（34kDa抗原）、IgG1）は同様に製造され、特徴
付けられた。

B.ブルグドルフェリZS7でのマウスの感染 C.B−17Scid−マウスに生存可能なB.ブルグドルフェ
リZS−７生物体１×10⁸を尻尾のつけ根に皮下注射し
た。

抗血清でのマウスの処置 感染したScid−マウスを種々の抗血清で１週間あたり
２回処置した。第１の群をNMS（正常マウス血清）で、
第２の群をIMS（免疫マウス血清）で、かつ第３の群を
モノクローナル抗体LA−２（B.ブルグドルフェリからの
31kD抗原に対する）で処置した。投与抗血清の量は第１
週目は100μもしくはLA−２において100μｇ、第２週
目は200μもしくはLA−２において200μｇ及び第３週
目は300μもしくはLA−２において300μｇであった。

第２表は未処置又はNMS処置Scid−マウスが12日後に
関節炎もしくは心臓炎及び肝炎の臨床的及び組織病理学
的徴候を現わしたことを示す。これに対してモノクロー
ナル抗体LA−２の投与がScid−マウスにおいて明らかに
症状の減少に作用した。臨床的には関節のわずかな発
赤、そして組織病理学的には辺縁の変化のみが確認され
た。IMSで処置したマウスは全く臨床的関節炎の所見を
示さなかった。

B.ブルグドルフェリ病原体の検出は、未処置又はNMS
処置のマウスにおいてのみ試験管内培養において得られ
た。LA−２又はIMS処置マウスにおいてはB.ブルグドル
フェリは検出されなかった（第２表）。

例 ３ B.ブルグドルフェリZS7からの31kD抗原（OspA）の発現
クローン化 DNA−調製 B.ブルグドルフェリ株ZS7からの高分子DNAを変性ケリ
ーの培地中で培養することにより精製した。このスピロ
ヘーターを10000gで遠心分離することによりペレットに
し、PBS−緩衝液中で３回洗浄する。乾燥したペレット
をTE（トリス10mmol/、EDTA1mmol/、pH7.4）10ml中
に再懸濁し、リゾチーム（5mg/ml）で30℃で15分間処置
し、20％SDS1mlを添加することによりDNAを遊離する。N
aCl 1.5ml（5mol/）の添加後、この溶液を同容量の
フェノールで抽出し、次いでクロロホルムでの抽出を行
なう。次いで、このDNAを無水エタノール２容量を添加
し、−20℃で１夜恒温保持することにより沈殿させた。
遠心分離後、残分をTE0.5ml中に溶かし、DNAse不含RNAs
eA（20μg/ml）と45分間55℃で恒温保持し、37℃でプロ
ティナーゼＫ（0.1μg/ml）で１時間の処置を行なっ
た。この溶液を0.3mol/ NaOAcで調節し、フェノール
−クロロホルムで前記のように抽出した。エタノールで
沈殿させた後、DNAを再びTE中に取り込む。

遺伝子バンクの製造 高分子DNAを３秒間の超音波処置により静力学的に破
砕する。T4−DNA−ポリメラーゼ（37℃で30分間）及び
クレノウ酵素（20℃で５分間）を、生じたDNA−フラグ
メントの末端を平面にするために使用した。平らな末端
を有するDNAを発現ベクターpUEX1のBamH I−位中にアダ
プター／クロン化法の適用下に連結する（Bresan及びSt
anley著、1987年、Nucl.Acid.Res.,第1056頁）。セファ
クリル（Sephacryl）Ｓ−1000を介するモレキュラーシ
ーブ・クロマトグラフィーによる大きさ選択工程及びコ
ンピテント宿主細胞大腸菌（MC1061）の形質転換の後、
組換えプラーク形成単位（pfu）の量を次のように測定
した：任意抽出クローンをとり出し、選択培地（25μg/
mlアンピシリンを有するLB）2ml中で飽和まで培養す
る。このプラスミド−DNAを常用のアルカリ性溶菌法に
より単離し、引き続きBamH Iで切断する。分析したプラ
スミドの50％より多くが平均1.5kbの長さのDNA−挿入
を有した。

B.ブルグドルフェリZS7−遺伝子バンクの平板培養及び
スクリーニング 細胞を24×24cmプレート上に、プレートあたり7000pf
uの密度で平板培養し、30℃で１夜恒温保持する。ニト
ロセルロースフィルター（NC）上にクローンを移した
後、β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質の発現を42℃で
２時間の恒温保持により誘発した。このフィルターを５
％SDS処置したワットマン（Whatman）3MM紙上に移し、9
5℃で約25分間恒温保持した。次いで、この蛋白質を、
常用の半乾燥ウエスタンブロット法装置を使用して電気
ブロットした。NC−フィルターをDNAse−処置した後、
免疫活性クローンをモノクローナル抗体の使用下に発現
スクリーニングにより同定した。NC−フィルター上の非
特異的結合位を0.2％（重量／容量）ゼラチンと3mmol/
NaN₃を含有するPBSと４時間恒温保持することによ
り飽和した。引き続き、このフィルターを抗−31kDモノ
クローナル抗体クローンLA−２の培養上澄と共に18時間
連続的な振盪下に恒温保持した。十分な洗浄（PBS＋１
％（容量／容量）トライトンＸ−100;PBS＋0.5mol/塩
化ナトリウム;PBS＋1mol/塩化ナトリウム；各工程10
分間）の後、このフィルターを家兎−抗−マウス−IgG
−抗体のペルオキシダーゼ標識Ｆ（ab）_２−調剤の1:10
000希釈と室温で1.5時間連続的振盪下に恒温保持した。
このフィルターを再び前記のように洗浄し、次いでペル
オキシダーゼ基質としてのジアミノベンチジンと共に恒
温保持する。組換PFU10⁴のうちの20クローンがモノクロ
ーナル抗体LA−２と反応した。

31kD抗原（OspA）の配列分析 LA−２との抗体反応プラスの組換え大腸菌の挿入DNA
を常法で単離した。このクローンのDNA−挿入分はB.ブ
ルグドルフェリ31kD抗原をコードするOspA−遺伝子を完
全な長さで含有する。この挿入分を有するプラスミドを
pZS−7/31−２と表わし、DSMにブタペスト条約にのっと
り寄託した（DSM5528）。

この免疫プラスのクローンから生産された組換蛋白質
はrZS7/31−２として示された。OspA−遺伝子のコード
したDNA−配列を決定した。この配列をこれから誘導し
たOspA蛋白質のアミノ酸配列と共に第１図に示した。

第１図は、B.ブルグドルフェリの31kD抗原がアミノ酸
273を有する蛋白質に相当すること明らかにする。

非融合蛋白質の調製 ａ） 免疫反応性蛋白質rZS7/31−２を発現するクロー
ンをアンピシリンを含有するLB10ml中で30℃で一夜培養
した。培養物1mlを選択培地100ml中に装入し、良好な通
気下に30℃で密度８×10⁷細胞/ml（A600＝0.2）まで培
養した。組換蛋白質の発現を42℃への宿主細胞の移動に
より得た。冷却し、遠心分離した後、細胞をSTE−緩衝
液（10mmol/トリス、100mmol/塩化ナトリウム、1mm
ol/EDTA、pH8.0）中で洗浄し、残分を溶菌緩衝液（25
％蔗糖、50mmol/トリス、pH8.0）0.6ml中に再懸濁さ
せた。リゾチーム（10mg/ml）150μを添加し、この混
合物を氷上で15分間恒温保持した後、DNAse1（10mg/m
l）18μと共に1mol/塩化マグネシウム５μの存在
下に、更に恒温保持（氷上15分間）した。最後に４×洗
浄剤混合物（１％トライトン×100、0.5％デオキシコレ
ート、0.1mol/ NaCl、10mmol/トリス、pH7.4）250
μを添加し、氷上で５分間恒温保持した。遠心分離
後、残分を２回緩衝液Ａ（50mmol/トリス、50mmol/
NaCl、1mmol/ EDTA、pH8.0）で洗浄し、付加的に8
M尿素を含有する緩衝液A9容量中に再懸濁し、室温で１
時間恒温保持した。この試料を緩衝液Ｂ（50mmol KH₂P
O₄/K₂HPO₄、50mol/ NaCl、1mmol/ EDTA、pH10.
7）９部で希釈し、室温で30分間撹拌し、この際pH−値
をKOHの添加下に10.7に保持した。溶剤のpH値をHClの添
加により7.0に調節した後、この試料を一夜緩衝液Ａに
対して透析し（４℃で）、SS34−回転装置中で４℃、10
000rpmで10分間遠心分離した。組換蛋白質を含有する上
澄を−20℃で保存した。

ｂ） このクローンは免疫反応性蛋白質rZS7/31−２を
培地中にも分泌するので、培養上澄から直接精製（アフ
ィニティークロマトグラフィー）することも可能であ
る。

組換OspA（非融合）蛋白質の調製及びアフィニティー
クロマトグラフィー精製 引き続き組換蛋白質をアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した。この目的のためには精製したモノ
クローナル抗体LA−２を活性化セファロースCL4Bに共有
結合させた。組換蛋白質を含有する透析尿素抽出液をマ
ウスIgG−ゼファロースCL4Bに吸着し、引き続きLA−２
−セファロースCL4Bカラムを介して加えた。強力な洗浄
後、結合した組換蛋白質を0.1mol/グリセリン/HCl−
0.1mol/ NaCl、pH2.5で溶離した。集めたフラクショ
ンのpH値を0.5mol/ K₂HPO₄ 1/10容量の添加によ
り、すぐに中和した。蛋白質含有フラクションを濃縮
し、透析した。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を用いて精製の度合を測定した。

組換蛋白質rZS7/31−２の免疫学的特徴付け 組換蛋白質rZS7/31−２を免疫学的に調べた。比較の
ために組換蛋白質rB31/41−９（B.ブルグドルフェリ41k
D表面抗原）を用いた。

平板−マイクロ力価プレートを組換蛋白質rZS7/31−
２及びrB31/41−９の尿素抽出液で、もしくは遺伝子発
現のために使用した大腸菌株MC1061の尿素抽出液で塗布
した。非特異的結合位を燐酸塩緩衝食塩溶液中の0.2％
ゼラチンで封鎖した。このように準備したマイクロ力価
プレートの窪みを前記モノクローナル抗体LA−２（抗−
31kD、Osp−Ａ）、LA−１（抗−41kD、フラジェリン）
もしくはACHT−２（抗−α_１−抗キモトリプシン）で配
合した。結合したモノクローナル抗体をペルオキシダー
ゼ標識した種特異性抗−マウス免疫グロブリンと反応さ
せた。結合したペルオキシダーゼ標識抗体をペルオキシ
ダーゼ基質オルトフェニレンジアミンを使用して定量し
た。マイクロ力価プレート中で492nm（A₄₉₂）における
吸収を自動プレート測光機を用いて直接測定した。吸収
の強度は結合したモノクローナル抗体の量に関する尺度
である。

モノクローナル抗体LA−２は特異的な方法でrZS7/31
−２と反応するが、MC1061もしくはrB31/41−９とは反
応しない。モノクローナル抗体LA−１の対照反応はrB31
/41−９に関して特異的である。モノクローナル対照抗
体ACHT−２（負対照）は蛋白質のいずれとも注目に値す
る反応を示さない。

第２図はモノクローナル抗体LA−２により特異的な方
法で認識される抗原エピトープがB.ブルグドルフェリZS
7のゲノムからクローン化された組換蛋白質rZS7/31−２
上に発現されることを示す。

例 ４ 31kD（OspA）もしくは34kD抗原（OspB）に関して特異的
な抗体と41kD抗原（フラジェリン）に特異的な抗体との
比較 モノクローナル抗体LA−２及びLA−26.1は31kD抗原Os
pAを認識し、アイソタイプIgG2bもしくはIgG1からのも
のである。モノクローナル抗体LA−25.1及びLA−27.1は
34kD抗原OspBを認識し、アイソタイプIgG2bもしくはIgG
1からのものである。モノクローナル抗体LA−10及びLA
−21はB.ブルグドルフェリのフラジェリン−結合41kDペ
リプラズム蛋白質に関して特異的であり、アイソタイプ
IgG2aもしくはIgG1からのものである。すべての前記抗
体は例２に記載された方法により得られた。この実験に
おいてはScid−マウス中の他のB.ブルグドルフェリに対
するモノクローナル抗体もライム−ボレリオース（Lyme
−Borreliose）の臨床的症状の保護に作用するかどうか
を確認した。

B.ブルグドルフェリB31−生物体１×10⁸での皮下接種
後91日でC57BL/6−マウスからポリクローナル抗−B31−
免疫血清（IMS）を採取した。B.ブルグドルフェリZS7
１×10⁸での皮下接種後68日でC57BL/6−マウスからポリ
クローナル抗−ZS7IMSを採取した。両方の血清はエリザ
−システムで測定したように特異的抗体60μg/mlを含有
した（Schaible等著、J.Exp.Med.,第170巻、1989年、第
1427〜1432頁）。正常マウス血清（NMS）を非感染C57BL
/6−マウスから採取した。

接種時及びこれに続き４日間の間隔で、前記抗体、IM
S、NMS又はPBS−緩衝液を次の記録によりScid−マウス
中に腹腔内に受動移動した： ０日目及び３日目:100μ ７日目及び10日目:200μ 13日目及び17日目:300μ 抗−ZS7IMS,抗−B31IMSで、又はモノクローナル抗体L
A−２で処置したScid−マウスは全く関節炎の臨床的症
状を示さなかった、すなわち21日間の監察期間の間、脛
骨足根骨関節の発赤及びはれは全く現われなかった。同
様に心臓炎及び肝炎の症状も全く確認されなかった。組
織病理学的検査は抗−ZS7−IMS、抗−B31−IMSで、又は
モノクローナル抗体LA−２で処置したScid−マウスの関
節、心臓及び肝臓に全く変化がないということを示し
た。

アイソタイプIgG1の他のOspA−特異的モノクローナル
抗体LA−26.1並びにOspB特異的抗体LA−25.1及びLA−2
7.1は関節炎、心臓炎及び肝炎の臨床的症状をやわらげ
る。ここでは検査した器官中に弱い病理学的変化が見ら
れた。

これとは反対に、PBS−緩衝液、NMS又はフラジェリン
に対するモノクローナル抗体（LA−10又はLA−21）を投
与されたScid−マウスは未処置のScid−マウスに典型的
な関節炎の臨床的徴候、病理学的変化を示した（第３
表）。最後にあげた動物の症状の重さは接種後時間と共
に上昇し、全監察期間の間低下しなかった。まず抗ZS7I
MSで、又は抗LA−２で処置したScid−マウスからは全く
スピロヘーターは単離されなかった。これとは反対に、
PBS−緩衝液、NMS又はモノクローナル抗体LA−25.1、LA
−26.1、LA−27.1、LA−10又はLA21で処置したScid−マ
ウスの血液からの免疫蛍光法により、かつ培養によりス
ピロヘーターの検出が可能である。

例 ５ OspAで免疫したマウスからの抗血清の、Scid−マウスの
ライム・ボレリオースの経過に対する作用 この実験において、天然OspA（B.ブルグドルフェリZS
−７から単離）又は組換OspA（組換プラスミドpZS−7/3
1−２（DSM5528）で形質転換した大腸菌から単離）の正
常マウス（マウス種C57BL/6）中への投与は保護ポリク
ローナル抗体を生産する。この抗体をScid−マウスに投
与する場合、ライム・ボレリオースに対する保護が生じ
る。この際、組換OspAは天然OspAと比較可能な保護免疫
応答を誘発することが確認される。この実験における結
果及び実施方法の詳細を第４表に記載する。

組換OspAの獲得は例３に記載した。

天然OspAの獲得並びにOspAでのマウスの免疫を次のよ
うに行なう： 天然31kDa OspAの富化 スピロヘーター3.2×10¹⁰をプロテアーゼ阻害剤（5mm
ol/ EDTA、5mmol/ベンズアミジン及び0.5mmol/
PMSF）の存在下にPBS5ml/7.5ml ｎ−ブタノール中で
２時間マグネットスターラーで撹拌する。その後、この
混合物を10000rpm及び４℃でゾルバル（Sorvall）−遠
心分離機（固定角度ローター）中で90分間遠心分離す
る。表面蛋白質を含有する水相を取り出し、クロロホル
ムで３回洗浄する。

蛋白質含量を280nmでの吸光により、もしくはBCA−テ
ストで測定する。

抗−B.ブルグドルフェリ家兎血清でのウエスタンブロ
ットもしくはジルベルゲル（Silbergel）法において
は、菌株ZS7にとって主バンドは31kDaの分子量範囲に、
かつ弱いバンドは20,34及び65〜68kDaに見い出された。
B.ブルグドルフェリ菌株B31のブタノール／水 調剤は
主バンドを31kDaに、弱いバンドを20及び34kDaに有す
る。

天然及び組換OspAでのマウスの免疫 C57BL6もしくはC.B−17マウスを７〜10日間の間隔で
３回アジュバント（ABM3;Sebak社、Aidenbach,BRD）100
μ中の５μｇ（菌株B31からの天然OspA）もしくは10
μｇ（菌株ZS7からの天然OspA、ZS7からの組換OspA）を
尻尾のつけねに皮下注射した。

最後の免疫の後、早くても３週間後、３〜４ケ月の血
清を取り出すことができた。特異的な抗体の含量はエリ
ザシステムで測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図はB.ブルグドルフェリZS7からの31kD抗原（Osp
A）のDNA配列及びアミノ酸配列を示す図であり、第２図
は、組換え蛋白質rZS7/3−２の免疫学的特徴を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 マルクス・エム・ジモン ドイツ連邦共和国フライブルク・カルト イザーシユトラーセ 35 (72)発明者 ウルリツヒ・エー・シヤイブレ ドイツ連邦共和国フライブルク・ツエー リンガー シユトラーセ ２ (72)発明者 クラウス・アイヒマン ドイツ連邦共和国フライブルク・ロイテ バツハガツセ 38 エフ (72)発明者 ミヒアエル・クラマー ドイツ連邦共和国ハイデルベルク・イ ム・ノイエンハイマー・フエルト 324 (72)発明者 ヴアリツヒ・ラインハルト ドイツ連邦共和国ハイデルベルク・ウン テレン・ロンバツハ ６ アー (56)参考文献 Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ，539（1988）ｐ．126− 143 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏｇｙ，３（1989）ｐ．479−486 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/20 ZNA A61K 39/00 A61K 39/395 AFB C07K 16/12 C12N 15/09 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ボレリア・ブルグドルフェリの31kD抗原
   （OspA）又は34kD抗原（OspB）に対して特異的なモノク
   ローナル抗体１種以上を含有することを特徴とする、ラ
   イム病に対するワクチン。
2. 【請求項２】抗体は、菌株ZS7（DSM5527）又は／及びB3
   1（ATCC35210）のボレリア・ブルグドルフェリの31kD又
   は34kD抗原に対して特異的である、請求項１記載のワク
   チン。
3. 【請求項３】IgG群、有利にIgG2b又はIgG1亜群のモノク
   ローナル抗体を作用物質として含有する、請求項１又は
   ２記載のワクチン。
4. 【請求項４】生存可能な病原性B.ブルグドルフェリ生物
   体で感染された免疫欠失実験動物において、関節炎、心
   筋炎及び肝炎の発症を阻止する、請求項１から３までの
   いずれか１記載のワクチン。
5. 【請求項５】生存可能なB.ブルグドルフェリ生物体菌株
   ZS7で接種された免疫欠失Scid−マウスにおいて、関節
   炎、心筋炎及び肝炎の発症を阻止する、請求項１から４
   までのいずれか１記載のワクチン。
6. 【請求項６】B.ブルグドルフェリ生物体又はその１部で
   免疫化されている実験動物のリンパ細胞又は脾臓細胞か
   らのライム病に対するワクチンを取得する方法におい
   て、リンパ細胞又は脾臓細胞融合物から、請求項１から
   ５までのいずれか１記載のモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマを得ることを特徴とする、ライム病に
   対するワクチンの取得法。
7. 【請求項７】免疫化のために、完全B.ブルグドルフェリ
   B31又は／及びZS7生物体を使用する、請求項６記載の方
   法。
8. 【請求項８】ハイブリドーマ−セルラインECACC9005040
   6から分泌された、OspAに対するモノクローナル抗体LA2
   6.1。
9. 【請求項９】ハイブリドーマ−セルラインECACC9005040
   5から分泌された、OspBに対するモノクローナル抗体LA2
   5.1。
10. 【請求項１０】ハイブリドーマ−セルラインECACC90050
    407から分泌された、OspBに体するモノクローナル抗体L
    A27.1。
11. 【請求項１１】請求項１から５までのいずれか１項に記
    載の菌株ZS7のB.ブルグドフェリのOspAに対する抗体と
    免疫反応し、次のアミノ酸配列： を含有することを特徴とする抗原。
12. 【請求項１２】それを暗号化するDNA−配列が、蛋白質
    表現のために好適であるベクター上に存在する、請求項
    11記載の抗原。
13. 【請求項１３】β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質又は
    非融合蛋白質である、請求項11記載の抗原。
14. 【請求項１４】請求項11、12又は13のいずれか１項に記
    載の抗原を暗号化し、 （１） 次に記載の核酸配列： 又は （２） 遺伝子コードの変性の範囲内でそれに相応する
    配列 を含有することを特徴とする、組換えDNA。
15. 【請求項１５】請求項14記載の組換えDNAの１以上のコ
    ピーを含有することを特徴とする、組換えベクター。
16. 【請求項１６】原核性ベクターである、請求項15記載の
    組換えベクター。
17. 【請求項１７】プラスミドである、請求項16記載の組換
    えベクター。
18. 【請求項１８】組換えベクターpZS−7/31−２（DSM552
    8）。
19. 【請求項１９】請求項11から13までのいずれか１項記載
    の抗原を得るために、請求項１から５までのいずれか１
    項記載の抗体１種以上を用いて菌株ZS7のB.ブルグドル
    フェリ遺伝子バンクを検査し、抗体と正の免疫反応を示
    すクローンを単離することを特徴とする、請求項11から
    13までのいずれか１項記載の抗原の取得法。
20. 【請求項２０】ライム病に対する活性ワクチンにおい
    て、作用物質としての請求項１から５までのいずれか１
    項記載のOspA−抗原に対する抗体と免疫反応する抗原１
    種以上を、場合によっては慣用の担持剤、充填剤及び助
    剤と共に含有することを特徴とする、ライム病に対する
    活性ワクチン。
21. 【請求項２１】抗原を遺伝子工学的方法で取得した、請
    求項20記載のワクチン。
22. 【請求項２２】OspA−抗原は組換え非融合タンパク質で
    ある、請求項20又は21項に記載のワクチン。
23. 【請求項２３】ライム病に対するワクチンを得るため
    に、実験動物を請求項12から13までのいずれか１項記載
    の抗原で免疫化させ、この免疫化された実験動物から慣
    用法で、OspA及び／又はOspBに対する保護性の、ポリク
    ローナル又はモノクローナル抗体を取得することを特徴
    とする、ライム病に対するワクチンを取得する方法。