PL169804B1 - Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PLInfo
- Publication number
- PL169804B1 PL169804B1 PL90286918A PL28691890A PL169804B1 PL 169804 B1 PL169804 B1 PL 169804B1 PL 90286918 A PL90286918 A PL 90286918A PL 28691890 A PL28691890 A PL 28691890A PL 169804 B1 PL169804 B1 PL 169804B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antigen
- ospa
- burgdorferi
- immunized
- immunization
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title description 3
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 title 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 62
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 56
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims 1
- 101001086191 Borrelia burgdorferi Outer surface protein A Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 11
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 11
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 11
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 8
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940097269 borrelia burgdorferi Drugs 0.000 description 1
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016523 tick-borne infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme, znamienny tym, ze zwierzeta doswiadczalne, zwlaszcza myszy, uodpamia sie antygenem, który daje reakcje immunologiczna z przeciwcialem monoklonalnym przeciw antygenowi OspA o wielkosci 31 kD Borrelia burgdorferi i z uodpornionych zwierzat otrzymuje sie zwyklym sposobem przeciwciala poliklonalne lub monoklonalne ochronne przeciw antygenowi OspA. 7. Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme, znamienny tym, ze zwierzeta doswiadczalne, zwlaszcza myszy, uodpamia sie antygenem, który daje reakcje immunologiczna z przeciwcialem monoklonalnym przeciw antygenowi OspA o wielkosci 31 kD i/lub OspB o wielkosci 34 kD Borrelia burgdorferi i z uodpornionych zwierzat otrzymuje sie zwyklym sposobem przeciwciala poliklonalne lub monoklonalne ochronne przeciw antygenom OspA i/lub OspB. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme.
Borelioza z Lyme jest najczęstszą przenoszoną przez kleszcze chorobą zakaźną w umiarkowanych szerokościach geograficznych. WywołujejąkrętekBorreliaburgdorferi, przenoszony na człowieka przede wszystkim przez kleszcze rodzaju Ixodes. Choroba jest przewlekłym postępującym zakażeniem obejmującym liczne narządy, jak skóra, ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, serce, wątrobę, nerki i układ mięśni szkieletowych. Ponieważ skuteczne leczenie tego schorzenia antybiotykami jest trudne, podejmuje się duże wysiłki dla zbadania samego zarazka oraz odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie B. burgdorferi. Wprawdzie u osób dotkniętych chorobą Lyme stwierdza się wysokie miano przeciwciał przeciw B. burgdorferi, nie stanowi ono jednak ochrony przeciw zakażeniu. Przyjmuje się, że zarazek bardzo szybko przechodzi z krążenia krwi do tkanek, gdzie staje się niedostępny bezpośrednio dla układu immunologicznego. Znaczyłoby to, że ochrona poprzez przeciwciała jest możliwa tylko na samym początku po zakażeniu, tak długo, jak długo zarazek krąży jeszcze we krwi.
Fakt, że naturalne zakażenie B. burgdorferi stwierdzono u różnych gatunków zwierząt, doprowadził do prób ustalenia modelu laboratoryjnego boreliozy z Lyme. Dały one ograniczone powodzenie. W doświadczeniach, których celem było wywołanie swoistej odpowiedzi immunologicznej myszy na B. burgdorferi stwierdzono, że zakażenie wsobnych szczepów myszy izolatem B. burgdorferi hodowanym przez dłuższy czas prowadzi do umiarkowanych, ale wyraźnych zmian patomorfologicznych w różnych narządach, takich jak mózg, serce, płuca i nerki. Zmiany te były porównywalne ze zmianami obserwowanymi u pacjentów z boreliozą z Lyme (Schaible i in., 1988, Infect. Immun. 1, 41). Rozwój pierwotnego obrazu choroby u zwierząt jest przypuszczalnie hamowany przez obronę immunologiczną gospodarza i/lub na skutek zmniejszonej zjadliwości krętków hodowanych przez dłuższy czas in vitro (Johnsos i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 20,747, Schwan i in., 1988, Infect. and Immun. 56, 1837).
U podstaw wynalazku leży zadanie przygotowania skutecznej szczepionki przeciw boreliozie z Lyme. W tym celu jednak potrzebne jest opracowanie odpowiedniego zwierzęcego modelu laboratoryjnego. Założono obecnie, że szczep myszy pozbawionych czynnych komórek B i T, tak zwane myszy Scid (Bosma i in., 1983, Nature 1θ, 52), mogą służyć jako model zwierzęcy, ponieważ u tych myszy po zakażeniu patogennym B. burgdorferi izolatem rozwija się choroba wieloukładowa, a mianowicie głównie zapalenie wielowarstwowe i stan zapalny serca. Na tym modelu zwierzęcym stało się dopiero możliwe wypróbowanie działania szczepionek przeciw boreliozie z Lyme.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme, która zawiera jedno lub więcej przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych przeciw antygenowi OspA (31 kD) i/lub antygenowi OspB (34 kD) Borrelia burgdorferi.
169 804
Najlepszajest szczepionka zawierająca przeciwciała klasy IgG, zwłaszcza podklasy IgG2b lub IgG1. W przeciwieństwie do podania innego przeciwciała, na przykład przeciwciała przeciw antygenowi powierzchniowemu 41 kD B. burgdorferi (flagellina), podanie szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku immunodefektywnym zwierzętom doświadczalnym, w szczególności myszom Scid, zakażonym żywym patogennym zarazkiem B. burgdorferi, w szczególności B. burgdorferi ZS7, powoduje, że rozwój zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby zostaje całkowicie lub przynajmniej znacznie zahamowany.
Szczepionka wytwarzana sposobem według wynalazku może zawierać, obok przeciwciałajako substancji czynnej, również zwykle stosowane nośniki, wypełniacze i substancje pomocnicze.
Według wynalazku sposób wytwarzania szczepionki przeciw boreliozie z Lyme polega na tym, że zwierzęta doświadczalne, zwłaszcza myszy, uodparnia się antygenem, który daje reakcję immunologiczną z przeciwciałem monokłonalnym przeciw antygenowi OspA o wielkości 31 kD i/lub przeciw OspB o wielkości 34 kD Borrelia burgdorferi i z uodpornionych zwierząt otrzymuje się przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne ochronne przeciw antygenowi OspA i/lub OspB.
Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się z tak uodpornionych zwierząt przez fuzję limfocytów lub komórek śledziony zwierzęcia doświadczalnego, w szczególności myszy, wytwarzając linię komórkową hybrydomy, która produkuje przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu OspA i/lub OspB Borrelia burgdorferi i prowadzenie hodowli wytworzonej linii komórkowej hybrydomy.
Linia komórkowa hybrydomy ECACC 89 09 1302 produkuje przeciwciało LA-2 przeciw OspA (IgG2b). Linia komórkowa hybrydomy ECACC 90050406 produkuje przeciwciało LA-26.1 przeciw OspA (IgG1), a linie komórkowe hybrydomy ECACC 90050405 i ECACC 90050407 produkują przeciwciała odpowiednio LA-25.1 i LA-27.1 przeciw OspB (IgG2b względnie IgG1).
Przez antygen, który daje reakcję immunologiczną z monoklonalnym przeciwciałem przeciw OspA lub OspB należy rozumieć antygen, który zawiera całkowitą sekwencję aminokwasową OspA względnie OspB, lub tylko część tej sekwencji czynną jako immunogen (immunogenny epitop). Potencjalne immunogenne epitopy tego białka specjalista może bez trudności wykryć przez analizę strukturalną białka OspA (na przykład analizę Chou-Fassmanna), po czym zbadać doświadczalnie ich czynność. Antygeny OspA i OspB z B. burgdorferi są znane i znana jest ich sekwencja aminokwasowa, natomiast dotychczas nie było znane, że skierowane przeciw tym antygenom przeciwciała stanowią skuteczną ochronę przeciwko borieliozie z Lyme, a zatem, że antygeny te lub ich immunogenne epitopy można wykorzystać do wytwarzania skutecznej szczepionki do biernego uodpamiania. Korzystnie do uodpornienia stosuje się antygen OspA i/lub OspB szczepów B31 (ATCC 35210) i/lub ZS7 (DSM 5527) B. burgodorferi.
Korzystnie do uodpornienia stosuje się antygen B. burgdorferi ZS7, który zawiera sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 lub immunogenny epitop tej sekwencji.
Szczególnie korzystnie stosuje się antygen wytworzony metodą rekombinacji DNA, zwłaszcza, który jest rekombinowanym białkiem fuzyjnym sprzężonym z beta-galaktozydazą lub białkiem niesprzężonym.
Na fig. 1 przedstawiono także sekwencję kwasów nukleinowych rekombinanta DNA kodującego antygen 31 kD B. burgdorferi ZS7 lub jego immunogenny epitop. Rekombinant DNA, który koduje alternatywnie może zawierać sekwencję odpowiadającą sekwencji kwasów nukleinowych według fig. 1 wynikającą z degeneracji kodu genetycznego lub sekwencję, która hybrydyzuje z sekwencją według fig. 1 lub z sekwencją wynikającą z degeneracji kodu genetycznego, w ostrych warunkach hybrydyzacji. Pojęcie ostre warunki hybrydyzacji należy rozumieć według Maniatisa i in., Molecular Cloning, A laboratory Manual (1982) Cold Spring Lab., New York.
Opisane powyżej antygeny wytwarza się w ten sposób, że pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) lub dla antygenu 34 kD (OspB) Borrelia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i eksprymuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów. Kodująca antygen sekwencja
169 804
DNA znajduje się w wektorze, zwłaszcza w wektorze prokariotycznym, odpowiednim dla ekspresji białka. Rekombinantowy wektor może być zlokalizowany w komórce gospodarza pozachromosomalnie (na przykład plazmid), albo może być zintegrowany z genomem komórki gospodarza (na przykład bakteriofag Lambda). Szczególnie korzystny jest rekombinantowy wektor pZS-7/31-2 (DSM 5528).
Wykazano, że podanie natywnego względnie rekombinantowego OspA normalnym myszom indukowało wytwarzanie ochronnych przeciwciał, które po przeniesieniu na myszy Scid chroniły je biernie przeciw chorobie Lyme. W szczególności stwierdza się, że rekombinantowy OspA indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA, dlatego też jest on potencjalnym kandydatem do szczepionki przeciw boreliozie z Lyme u ludzi.
Podane poniżej przykłady oraz fig. 1 i fig. 2 objaśniają wynalazek.
Figura 1 Sekwencja DNA i sekwencja aminokwasów antygenu 31 kD (OspA)
B. burgdorferi ZS7
Figura 2 Charakterystyka immunologiczna rekombinantowego białka rZS7/31 -2.
Przykład I. Wywoływanie zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby u myszy Scid przez zakażenie szczepem ZS7 B. burgdorferi
Traktowanie myszy B. burgdorferi
Dorosłym myszom C.B-17 Scid (homozygotyczne pod względem mutacji Scid) i C.B-17 wstrzyknięto podskórnie u nasady ogona dawki lxl05, 5x105, 1x106 lub 1x108 żywych lub zabitych (promienie UV) komórek B. burgdorferi.
Izolacja B. burgdorferi z kleszczy i myszy
Badania przeprowadzono używając hodowanego przez dłuższy czas szczepu B31 (ATCC 35210) oraz szczepu ZS7 (DSM 5527) B. burgdorferi świeżo izolowanego z samicy kleszcza Ixodes ricinus. Wszystkie szczepy B. burgdorferi hodowano w zmodyfikowanym podłożu Kelly (Barbour i in. 1983, Switzerland Curr. Microbiol., 8, 123). Komórki B. burgdorferi, izolowane z przewodu pokarmowego kleszczy uprzednio wyjałowionych etanolem lub z krwi zakażonych myszy, hodowano początkowo w podłożu Kelly z dodatkiem 8 gl/ml kanamycyny i 230 gg/ml fluorouracylu (Johnson i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 1,81).
Odczyny serologiczne
Swoiste przeciwciała przeciw B. burgdorferi wykrywano konwencjonalną metodą ELISA (Justus i in., 1988, Wehrmed. Mschr. 32,263). Krzywą standardową dla zawartości immunoglobulin (Ig) otrzymywano przez powlekanie płytki anty-mysią IgG (rozcieńczenie 1:500, roztwór surowicy firmy Paesel, Frankfurt, RFN) i miareczkowanie całkowitej zawartości mysiej IgG lub IgM (Calbiochem, LaJolla, USA). Całkowitą IgM i IgG w surowicy oznaczono podobnie. Stężenie przeciwciał IgM lub IgG swoistych dla B. burgdorferi podano w gg/ml.
Barwienie immunofluorescencyjne i metodą Giemsy
Porcje po 50 gl krwi umieszczano pipetą w probówkach hematokrytowych (Bector-Dickinson, Reidelberg, RFN) i wirowano w wirówce hematokrytowej przy 5000 g (ECCO, RFN). Probówki przecinano na granicy między surowicą i erytrocytami i 5 gl i surowicy nakładano na szkiełko podstawowe (Superior, Bad Mergentheim, RFN). Szkiełko z naniesionymi próbkami surowicy suszono na powietrzu i utrwalano w 100% etanolu przez 1 minutę w -20°C. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z hiperimmunizowaną surowicą króliczą przeciw B. burgdorferi (rozcieńczenie 1:20) szkiełka przemywano PBS i barwiono przez godzinę kozią surowicą antykróliczą koniugowaną z PITC (rozcieńczenie 1:20, Jackson Lab., West Grove, USA). Szkiełka przemywano, pokrywano gliceryną-żelatyną według Kaisera i natychmiast badano w mikroskopie fluorescencyjnym. Krople krwi niczym nie traktowane suszono na powietrzu, utrwalano w metanolu, barwiono odczynnikiem Giemsy (0,1%, Darmstdt, RFN), odbarwiano PBS i zatapiano w entellanie (Merck, Darmstadt, RFN).
Preparaty histologiczne i ich barwienie
W różnych okresach czasu po zakażeniu myszy B. burgdorferi pobierano narządy wewnętrzne (mózg, serce, płuca, wątroba, nerki, śledziona, stawy) i przechowywanoje albo w ciekłym azocie dla przygotowywania skrawków mrożonych, albo w 5% formalinie (w PBS) dla zatopienia w parafinie lub metakrylanie. Skrawki grubości 4 do 7 gm barwiono hematoksyliną-eozyną i zatapiano w
169 804 entellanie (Merck AG, Darmstadt, RFN). Badania immunohistologiczne wykonano używając systemu Streptawidyna-Biotyna-Peroksydaza (Kramer i in., 1989, Eur. J. Immunol., 19, 151).
Jak pokazuje tabela 1, u myszy Scid zakażonych żywymi zarazkami, obecność B. burgdorferi ZS7 i B31 we krwi stwierdzano przez cały okres doświadczenia. Tylko krętki szczepu ZS7 udało się po izolacji hodować in vitro, natomiast nie udało się to ze szczepem B31. Porównanie rekultywowanych komórek z pierwotnym izolatem B. burgdorferi ZS7 nie wykazało żadnych zmian w zawartości białka i obrazie plazmidów. W czasie całego okresu obserwacji u myszy Scid zakażonych B. burgdorferi nie stwierdzono przeciwciał lub tylko nieznaczne ich miano. U tych zwierząt nie znaleziono przeciwciał IgM lub IgG swoistych dla B. burgdorferi (Tabela 1). Natomiast wszystkie myszy kontrolne C.B-17, zakażone B. burgdorferi, wytworzyły duże ilości całkowitych Ig i podwyższone miano przeciwciał IgM i IgG swoistych dla B. burgdorferi. Między 7 a 20 dniem po zakażeniu B. burgdorferi ZS7 myszy Scid wykazały pierwsze kliniczne objawy zapalenia stawów (zaczerwienienie i obrzmienie obu stawów goleniowo-stępowych), które nasilały się z czasem. Nie stwierdzono natomiast objawów zapalenia stawów u myszy Scid, którym podano komórki B. burgdorferi ZS7 naświetlone promieniami UV albo żywe komórki B. burgdorferi B31, a także u myszy kontrolnych C.B-17 zakażonych żywymi komórkami B. burgdorferi ZS7.
Zmiany zapalne stawów stwierdzono również histopatologicznie u myszy Scid zakażonych żywym zarazkiem B. burgdorferi ZS7 (Tabela 1). Stwierdzono ciężkie uszkodzenia stawów manifestujące się obecnością przerostowych zmian zapalnych komórek błony maziowej, połączonych z erozją i zniszczeniem tkanki chrzęstnej i/lub kości. Następnie obserwowano ogólne zapalenie serca, z naciekami komórek jednojądrzastych we wsierdziu, mięśniu sercowym i osierdziu.
Obserwowano także postępujące zapalenie wątroby wraz z naciekiem komórek jednojądrzastych w okolicy żyły wrotnej i żyły centralnej, odczyny ziarninowe i w końcu wystąpienie zwłóknienia wątroby. Ponadto stwierdzono nieznaczne uszkodzenie nerek, płuc, mózgu i mięśni prążkowanych.
169 804
Tabela 1
Zakażenie myszy C.B-17 Scid i myszy kontrolnych C.B-17 B. burgdorferi Rcizolacja krętków z tkanek, miano przeciwciał i rozwój zapalenia stawów
| B. burgdorferi | B. burgdorferi | Zapalenie stawów | Przeciwciała (gg/ml) | ||||||||
| szczep myszy | szczep | dawka zakażająca | dzień po zakażeniu | detekcja we krwi* | izolacja** | klinicznie° | histopatologicznie | całkowite | Sil k-K | swoiste | I 1 GO t—1 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| C.B-17 | ZS7 | 5x105 | 7 | + | - | - | - | - | 20 | - | - |
| Scid | 36 | + | +B | + | + | - | 21 | - | - | ||
| (n= 1) | 49 | + | +B | + | + | - | 26 | - | - | ||
| 59 | + | +B | + | + | 336 | - | T | ||||
| 1 | ZS7 | 1x108 | 7 | + | - | + | + | - | 108 | - | - |
| 23 | + | +B | + | + | - | 54 | - | , - | |||
| ZS7 | 1x108 | 22 | + | - | + | + | - | 41 | - | - | |
| 29 | + | +G | + | + | - | - | - | - | |||
| 87 | + | +B/G | + | + | - | - | - | - | |||
| ZS7 | 1-x105 | - | n.b. | n.b. | + | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | |
| - | n.b. | n.b. | + | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | |||
| ZS7 | 1x106 | 16 | + | + | - | + | - | - | - | - | |
| ZS7 | • lx108 | 16 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| B31 | 1x108 | 22 | + | - | - | - | 26 | 32 | - | - | |
| B31 | 1x108 | 29 | + | - | - | - | - | - | - | - | |
| 22 | - | - | - | - | - | 47 | - | - | |||
| C.B-17 | - | 29 | - Z | - | - | - | 54 | 364 | |||
| n=7 | ZS7 | 1x11)8 | 16 | - | - | - | - | 2,515 | 5,963 | 438 | 56 |
| - | - | - | 24 | - | ' - | - | - | 2,145 | 6,374 | 506 | 94 |
| - | - | - | - | - | - | - | 304 | 3,804 | - | - | |
| - | - | - | - | - | 216 | 1,9522 | - | - |
* Zabarwienie metodą Giemsa lub immunofluorescencja, ** Izolacja z krwi (B), stawów (G), °+ Zaczerwienienie i obrzmienie stawów goleniowo-stępowych 00 -<7,5 gg/ml surowicy
Przykład II. Wpływ przeciwciała monoklonalnego swoistego dla antygenu 31kD B. burgdorferi na przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid
Wytworzenie przeciwciała monoklonalnego
Mysz posiadająca sprawny układ immunologiczny, uodporniona komórkami B. burgdorferi, wytworzyła przeciwciała poliklonalne swoiste dlaB. burgdorferi (patrz tabela 1).
Dziesięciotygodniowe samice myszy szczepu wsobnego BALB/c uodporniono krętkami zhomogenizowanymi przez sonikację (B. burgdorferi szczep B31, ATCC 35210). Schemat uodpornienia
Dzień 0: 200 gg antygenu krętkowego z pełnym adjuwantem Freunda podskórnie
Dzień 21, 35, 49, 63: dawka przypominająca 100 gg antygenu krętkowego w roztworze soli buforowanym fosforanami dootrzewnowo
Dzień 66: pobranie śledziony i przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny.
169 804
Immunizowane komórki śledziony poddano fuzji z komórkami linii szpiczaka Ag8-PAI, metodami standardowymi przy użyciu glikolu polietylenowego (J.H. Peters, H. Baumgarten, H. Schulze Monoklonale Antikorper Springer Verlag, Heidelberg).
Produkty fuzji wysiewano na płytki o 96 dołkach. Po 8 dniach hodowle komórkowe badano na obecność przeciwciał monoklonalnych swoistych dla B. burgdorferi metodą ELIS A na fazie stałej (J.H. Peters i in., j.w.).
Komórki hybrydoma z hodowli produkujących przeciwciała klonowano metodą granicznych rozcieńczeń. Charakterystykę komórek potomnych poszczególnych klonów określano ponownie testem ELISA na fazie stałej a także analizą Westem-Blot i badaniem immunofluorescencyjnym. Przeciwciało monoklonalne LA-2 podklasy IgG2b było produkowane i wydzielane przez jedną monoklonalną linię hybrydoma i reagowało w Westem-Blot ze strukturą 31kDa (OspA) wszystkich badanych szczepów B. burgdorferi (m.in. z izolatem ZS7 i B31) przy kontakcie z białkami B. burgdorferi rozdzielonymi elektroforetycznie na żelu z SDS i przeniesionymi na błonę przy pomocy Westem-Blot. Przeciwciała monoklonalne LA-26.1C (anti OspA IgG1), LA-25.1 (anti OspB (antygen 34 kD) IgG2b) i LA-27.1 (anti OspB (34 kDa antygen) IgG1) otrzymywano i charakteryzowano w sposób analogiczny.
Zakażenie myszy B. burgdorferi ZS7
Myszy C.B-17 Scid zakażono dawką 1x108 żywych komórek B. burgdorferi ZS7 podskórnie w okolicy nasady ogona.
Traktowanie myszy antysurowicami
Zakażone myszy Scid otrzymywały dwa razy w tygodniu różne antysurowice. Jednej grupie podawano NmS (normalna surowica mysia), drugiej IMS (surowica mysia odpornościowa), trzeciej przeciwciało monoklonalne LA-2 (przeciw antygenowi 31 kD B. burgdorferi). Dawki podawanych antysurowic wynosiły w pierwszym tygodniu 100 μΐ względnie 100 μ dla LA-2, w drugim tygodniu 200 μl względnie 200 μl dla LA-2, w trzecim tygodniu 300 μΐ względnie 300 μΐ dla LA-2.
Jak widać w tabeli 2 myszy Scid niczym nie traktowane lub te, którym podano NMS po 12 dniach wykazały kliniczne i histopatologiczne objawy zapalenia stawów względnie stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Natomiast po podaniu myszom Seid przeciwciała monoklonalnego LA-2 objawy były wyraźnie słabsze. Klinicznie obserwowano tylko lekkie zaczerwienienia stawów, zaś histopatologicznie tylko nieznaczne zmiany. Myszy traktowane IMS nie wykazały klinicznych znamion zapalenia stawów.
Zarazki B. burgdorferi stwierdzono w hodowli in vitro tylko u myszy niczym nie traktowanych lub tych, które otrzymały NMS. U myszy, którym podano LA-2 lub IMS B. burgdorferi nie stwierdzono (Tabela 2).
Tabela 2
Podawanie B. burgdorferi oraz antysurowicy myszom C.B-17 Scid
| Szczep myszy C.B-17 Scid | Podanie antysurowicy | Zapalenie stawów (po 12 dniach) kliniczne histopat. | Zapalenieserca/ zapalenie wątroby histopat. | Izolacja B. burgdorferi | |
| klinicznie | histopatolog. | ||||
| n = 3 | - | + | + | + | + |
| n = 3 | NMS | + | + | + | |
| n = 2 | IMS | - | - | - | |
| n = 3 | LA-2 | -** | - | - |
* lekkie zaczerwienienie stawów ** tylko nieznaczne zmiany
169 804
Przykład III. Klonowanie przez ekspresję antygenu 31kD (OspA) B. burgdorferi
Przygotowanie DNA
Wysokocząsteczkowy DNA oczyszczano z hodowli szczepu ZS7 B. burgdorferi w zmodyfikowanym podłożu Kelly. Krętki pelletowano przez wirowanie przy 10 000 g i przemywano trzykrotnie buforem PBS. Wysuszony pellet krętków zawieszano w 10 ml TE (10 mmol/ł Tris, mmol/1 EDTA, pH 7,4), traktowano lizozymem (5 mg/ml) przez 15 minut w 30°C i DNA uwalniano przez dodanie 1 ml 20% SDS. Po dodaniu 1,5 ml NaCl (5 mol/l) roztwór ekstrahowano równą objętością fenolu, a następnie chloroformem. DNA wytrząsano przez dodanie 2 objętości etanolu absolutnego i inkubację w -20°C przez noc. Po odwirowaniu osad rozpuszczono w 0,5 ml TE i inkubowano z RNAzą A wolną od DNA-azy (20 pl/ml) przez 45 minut w 55°C, następnie trawiono przez godzinę proteazą K(0,1 pg/ml) w 37°C. Do roztworu dodawano 0,3 mol/l NaOAc i ponownie ekstrahowano feroleru-chloroformem jak wyżej. Po wytrąceniu etanolem DNA rozpuszczono w TE.
Wytworzenie puli genów
Wysokocząsteczkowy DNA został losowo rozerwany przez działanie ultradźwięków przez trzy sekundy. Zastosowano polimerazę TA-DNA (30 minut w 37°C) i enzym Klenowa (5 minut w 20°C) celem wyrównania końców otrzymanych fragmentów DNA. dNa o tępych końcach ligowano z wektorem ekspresji pUEXl w pozycji BamHI według strategii klonowania dopełniającego (Bresan i Stanley 1987, Nuci. Acid. Res., str. 1056). Po selekcji według wielkości przy pomocy chromatografii na sicie molekularnym Sephacryl S-1000 i transformacji kompetentnych komórek E. coli (MC 1061) udział powstałych w wyniku rekombinacji jednostek tworzących łysinki (pfu) oznaczono następująco: losowo wybrane kolonie przeniesiono do podłoża selekcyjnego (2 ml) (LB z 25 pg/ml ampicyliny) i hodowano do nasycenia. DNA plazmidowy izolowano zwykłą metodą lizy zasadowej i cięto przy pomocy BamHI. Ponad 50% analizowanych plazmidów zawierało inserty DNA średniej długości > 1,5 kb.
Wysiew na płytki i screening puli genów B. burgdorferi ZS7
Na płytki 24 x 24 cm wysiewano komórki o gęstości 7 000 pfu na płytkę i inkubowano przez noc w 30°C. Kolonie przenoszono na filtr nitrocelulozowy (NC) i przez dwugodzinną inkubację w 42°C indukowano ekspresję białka sprzężonego z beta-galaktozydazą w wyniku fuzji. Filtry umieszczano na bibule Whatma 3MM, uprzednio nasączonej 5% SDS, i inkubowano około 25 minut w 95°C. Następnie białka rozdzielano elektrycznie przy użyciu zwykłej aparatury do Westemblotting. Po obróbce filtra NC DNS-azą klonu immunoreaktywne identyfikowano przy pomocy przeciwciał monoklonalnych przez screening produktów ekspresji. Miejsca nieswoistego wiązania na filtrach NC eliminowano przez czterogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,2% (w/v) żelatyny i 3 mmol/1 NaNi. Na koniec filtry z pozostałymi na nich hodowlami klonu LA-2 produkującego przeciwciało monoklonalne anty-31 kD inkubowano przez 18 godzin stale wstrząsając. Po dokładnym przemyciu (PBS + 1% v/v Triton X-100,PBS + 0,5mol/lNaCl,PBS +1 mol/l NaCl, każdy etap 10 minut) filtry inkubowano
1,5 godziny w temperaturze pokojowej stale wstrząsając, z rozcieńczonym 1:10 000 znakowanym peroksydazą preparatem F(ab)2 z króliczych przeciwciał przeciw mysiej IgG. Filtry ponownie przemywano jak wyżej i inkubowano z dwuaminobenzydyną jako substratem peroksydazy. Na 104 rekombinantów PFU 20 klonów reagowało z przeciwciałem monoklonalnym LA-2. Analiza sekwencji antygenu 31 kD (OspA).
Insert DNA klonu rekombinanta E. coli wykazującego dodatnią reakcję przeciwciała z LA-2 izolowano w zwykły sposób. Insert tego klonu zawierał całą długość genu OspA kodującego antygen 31 kDB. burgdorferi. Plazmid zawierający ten insert został oznaczony pZS-7/31-2 i zgodnie z konwencją budapeszteńską zdeponowany w DSM (pod numerem DsM 5528).
Rekombinowane białko produkowane przez ten immunododatni klon oznaczono rZS7/31-2. Oznaczono kodującą sekwencję DNA genu OspA. Jest ona przedstawiona na fig. 1.1-1.5 wraz z odpowiadającą jej sekwencją aminokwasów białka OspA.
Jak widać na fig.1 antygen 31 kD B. burgdorferi odpowiada białku zawierającemu 273 aminokwasy.
169 804
Wytwarzanie białka niesprzężonego w wyniku fuzji
a) Klon wytwarzający immunoreaktywne białko rZS7/31-2 hodowano przez noc w 30°C w 10 ml LB z ampicyliną. 1 ml hodowli przeniesiono do 100 ml podłoża selekcyjnego i hodowano w 30UC przy dobrym napowietrzeniu do gęstości 8x10 komórek na mi (A600=0,2). Ekspresję rekombinowanego białka osiągnięto przenosząc komórki gospodarza do 42°C. Po ochłodzeniu i odwirowaniu komórki przemyto buforem STE (10 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA pH 8,0) i osad zawieszono w 0,6 ml buforu litycznego (25% sacharoza, 50 mmol/1 Tris pH 8,0). Po dodaniu 150 μl lizozymu (10 mg/ml) mieszaninę inkubowano 15 minut na lodzie, po czym przez następne 15 minut na lodzie po dodaniu 18 μl DNA-azy 1(10 mg/ml) w obecności 5 μl 1 mol/l - chlorku magnezu. Następnie dodano 250 μl mieszanki detergentowej 4x (1 % Triton X 100, 0,5% dezoksycholanu, 0,1 mol/l NaCl, 10 mmol/l Tris, pH 7,4) i inkubowano 5 minut na lodzie. Po odwirowaniu osad przemyto dwukrotnie buforem A (50 mmol/1 Tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0), zawieszono w 9 objętościach buforu A z dodatkiem 8 M mocznika i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Próbę rozcieńczono 9 częściami buforu B (50 mmol/1 KH2HPO4/K2HPO4,50 mol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 10,7) i mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej utrzymując pH 10,7 przez dodawanie KOH. Następnie pH roztworu obniżono do 7,0 dodając HCl. Próbę dializowano przez noc w 4°C wobec buforu A i wirowano 10 minut w 4°C przy 10 000 obr/min. w roztworze SS34. Nadsącz, zawierający rekombinowane białko, przechowywano 2-20°C.
b) Ponieważ klon wydziela immunoreaktywne białko rZS7/'31 -2 do podłoża hodowlanego, możliwe jest oczyszczenie go bezpośrednio z podłoża (chromatografia powinowactwa).
Preparacja rekombinowanego białka OspA (niesprzężonego) i oczyszczanie chromatografią powinowactwa
Rekombinowane białka na koniec oczyszczano chromatografią powinowactwa. W tym celu oczyszczone przeciwciała monoklonalne LA-2 zostały związane kowalencyjnie na aktywowanej Sepharozie CL 4B. Dializowany wyciąg mocznikowy z rekombinowanym białkiem adsorbowano na Sepharozie CL 4B sprzężonej z mysią IgG i nakładano na kolumnę LA-2 Sepharoza CL 4B. Po intensywnym płukaniu związane białko eluowano 0,1 mol/l glicyną - 0,1 mol/l NaCl, pH 2,5. Wartość pH zebranych frakcji zobojętniano przez natychmiastowe dodanie 1/10 objętości 0,5 mol/l K2HPO4. Frakcje zawierające białko zatężano i dializowano. Stopień oczyszczenia oznaczano elektroforezą w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Charakterystyka immunologiczna rekombinowanego białka rZS7/31-2
Białko rZS7/31-2 zbadano immunologicznie. Dla porównania włączono do badań rekombinowane białko rB31/41-9 (antygen powierzchniowy 41 kD B. burgdorferi).
Płytki mikrotitracyjne z dołkami o płaskim dnie powlekano wyciągami mocznikowymi rekombinowanych białek rZS7/31 -2 lub rB31/41-9, względnie wyciągiem mocznikowym szczepu MC 1061 E. coli, użytym do ekspresji genów. Nieswoiste miejsca wiązania blokowano 0,2% żelatyną w buforowanym fosforanami roztworze soli. Dołki tak przygotowanych płytek mikrotitracyjnych wypełniono podanymi przeciwciałami monoklonalnymi LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD, flagellina), oraz ACHT-2 (anti-alfai-antychymotrypsyna).
Związane przeciwciała monoklonalne reagowały z gatunkowo swoistymi immunoglobulinami anti-mysimi znakowanymi peroksydazą. Związane przeciwciała znakowne peroksydazą oznaczono ilościowo stosując substrat peroksydazy ortofenylodiaminę. Absorpcję przy 492 nm (A492) mierzono bezpośrednio na płytkach przy pomocy automatycznego czytnika. Natężenie absorpcji jest miarą ilości związanych przeciwciał monoklonalnych.
Przeciwciało monoklonalne LA-2 reaguje swoiście z rZS7/31-2, nie reaguje natomiast z MC 1061 względnie rB31/41-9. Reakcja kontrolna przeciwciała monoklonalnego LA-1 jest swoista dla rB31/41-9. Kontrolne przeciwciało monoklonalne ACHT-2 (kontrolna ujemna) nie wykazuje reakcji z żadnym z tych białek.
Jak widać na fig. 2, epitop antygenowy rozpoznawany swoiście przez przeciwciało monoklonalne LA-2 wchodzi w skład białka rekombinanta rZS7/31-2 sklonowanego z genomu B. burgdorferi ZS7.
Przykład IV. Porównanie przeciwciał swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) względem antygenu 34 kD (OspB) z przeciwciałami swoistymi dla antygenu 41 kD (flagellina).
169 804
Przeciwciała monoklonalne LA-2 i LA-26.1 rozpoznają antygen 31 kD OspA i należą do izotypu (podklasy) IgG2b lub IgG 1. Przeciwciała monoklonalne LA-25.1 i LA-27.1 rozpoznają antygen 34 kD OspA i należą do izotypu (podklasy) IgG2b lub IgG1. Przeciwciała monoklonalne LA-10 i LA-21 są swoiste dla związanego z rzęskami białka periplazmatycznego 41 kD B. burgdorferi i należą do izotypu lgG2a lub IgG 1. Wszystkie wymienione przeciwciała otrzymano w .sposób opisany w przykładzie Π. W obecnym doświadczeniu chodziło o ustalenie, czy również przeciwciała monoklonalne przeciw innemu antygenowi B. burgdorferi powodują ochronę myszy Scid przeciw objawom boreliozy z Lyme.
Poliklonalną surowicę odpornościową anti B31 pobierano od myszy C57BL/6 91 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x108 komórek B31 B. burgdorferi. Poliklonalną IMS anti ZS7 pobierano od myszy C57BL/6 68 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x108 komórek B. burgdorferi ZS7. Obie surowice zawierały 60 pg/ml swoistych przeciwciał, co stwierdzono metodą ELISA (Schaible i in., J. Exp. Med. 170 (1989), 1427-1432). Normalną surowicę mysią (NMS) pobierano od myszy C57BL niczym nie traktowanych.
W dniu inokulacji myszy B. burgdorferi i później w odstępach co4 dni myszy Scid otrzymywały dootrzewnowo podane wyżej przeciwciała IMS, NMS’ lub PBS według następującego schematu:
Dzień 0 i dzień 3: 100 pl
Dzień 7 i dzień 10: 200 pil
Dzień 13 i dzień 17: 300 pl
Myszy Scid, które otrzymały anti-ZS71MS, anti-B31IMS lub przeciwciało monoklonalne LA-2 nie wykazały widocznych klinicznych objawów zapalenia stawów, to znaczy nie wystąpiło zaczerwienienie i obrzęk stawów goleniowo-stępowych w ciągu 21 obserwacji. Również nie stwierdzono objawów stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Badania histopatologiczne nie wykazały zmian w stawach, sercu i wątrobie myszy Scid, którym podano antI-ZS7 IMS, anti-B31 IMS lub przeciwciało monoklonalne LA-2.
Również inne przeciwciało monoklonalne swoiste dla OspA, LA-26.1 izotypu IgGl, a także swoiste dla OspB przeciwciała LA-25.1 i LA-27.1 powodowały złagodzenie objawów zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Wystąpiły tu lekkie zmiany patologiczne w badanych narządach.
W przeciwieństwie do tego, myszy Scid, którym podano bufor PBS, NMS lub przeciwciała monoklonalne przeciw flagellinie (LA-10 lub LA-21) wykazały kliniczne znamiona zapalenia stawów i zmiany patologiczne typowe dla myszy Scid niczym nie traktowanych (Tabela 3). U tych ostatnich zwierząt objawy nasilały się z upływem czasu po inokulacji zarazka i nie uległy złagodzeniu do końca okresu obserwacji. U myszy Scid uprzednio traktowanych anti-ZS7IMS lub przeciwciałem LA-2 nie udało się izolować krętków. Natomiast wykryto krętki immunofluorescencyjnie lub izolacją z krwi u myszy Scid traktowanych buforem PBS, NMS lub przeciwciałami monoklonalriymi LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 i LA-21.
Tabela 3
| Szczep C.B-17 Scid (liczba myszy) | Podano | Podklaaa IgG | Kliniczna zapalenie stawów | Histopatologia | Wykrywalnośa B. burgdorferi (hodowL i lmmunofluor. | |
| zapalenie okołostawowe stawów | zapalenie serca | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| n=8 | PBS (kontrola ujemna) | + | + | + | + |
169 804
Tabela 3 (ciąg dalszy)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ----4 n = 3 | NMS (kontrola ujemna) | + | + | + | + | |
| n = 3 | anti-B31 IMS | - | -* | +° | ||
| n = 2 1 i | anti-ZS7 IMS | - | -* | - | ||
| 1-1 n = 6 | LA-2 (OspA) | 2b | -* | - | ||
| n = 3 | LA-10 (flagellina) | 2a | + | + | + | +° |
| n = 3 | LA-21 (flagellina) | 1 | + | + | +/- | + |
| n - 3 | LA-26.1 (OspA) | 1 | + | + | + | +° |
| n = 3 | LA-25.1 (OspB) | 2b | + | + | + | + |
| n = 3 | LA-27.1 (OspB) | 1 | + | + | + | +° |
Stopień zmian histopatologicznych oznaczono: - brak,
-* subkliniczne, +/- umiarkowane, + ciężkie, ° Badanie immunofluorescencyjne było możliwe nie u wszystkich osobników
Przykład V. Wpływ surowicy odpornościowej myszy uodpornionych OspA ma przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid
W tym doświadczeniu można było wykazać, że podanie natywnego OspA (izolowanego z B. burgdorferi ZS7) lub rekombinowanego OspA (izolowanego z E. coli bakterii transformowanych rekombinantowym plazmidem pZS-2/31-2 (DSM 5528) indukuje u normalnych myszy C57BL/6 wytwarzanie ochronnych przeciwciał poliklonalnych. Po podaniu tych przeciwciał występuje u myszy Scid ochrona przeciw boreliozie Lyme. Stwierdzono przy tym, że rekombinowany OspA wywołuje ochronną odpowiedz immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA. Wyniki i szczegółowy przebieg doświadczenia podano w tabeli 4. Otrzymywanie rekombinanta OspA opisano w przykładzie III. Otrzymywanie OspA oraz uodpornienie myszy OspA przebiegało jak niżej:
Krętki w ilości 3,2x1010 mieszano przez dwie godziny na mieszadle magnetycznym w 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu, w obecności inhibitorów proteaz (5 mmol/l EDTA, 5 mmnl/l benzamidyny i 0,5 mmol/1 PMSF). Następnie mieszaninę wirowano przez 90 minut w 4°C przy 10 000 obr./min. w wirówce Sorvall (rotor kątowy). Fazę wodną, zawierającą białka powierzchniowe, zbierano i przemywano trzykrotnie chloroformem. Zawartość białka oznaczano mierząc ekstynkcję przy 280 nm, lub testem BCA.
W żelu srebrowym lub metodą Westemblot z surowicą króliczą anti B. burgdorferi stwierdzono dla szczepu ZS7 główny prążek w zakresie ciężaru cząsteczkowego 31 kDa, oraz słabe prążki w zakresie 20,34 i 65-68 kDa. Preparat butanolowo-wodny szczepu B31B. burgdorferi wykazał prążek przy 31 kDa oraz słabe prążki przy 20 i 34 kDa.
Uodpornienie myszy natywnym i rekombinowanym OspA
Myszom C57BL/6 C.B-17 wstrzykiwano podskórnie w okolicy nasady ogona, 3x w odstępach 7 do 10 dni 5 gg (natywny OspA szczepu B31) lub 10 gg (natywny OspA szczepu
169 804
ZS7, rekombinowany OspA ZS7) w 100 μl adjuwantu (ABM3, Fa, Sebak, Aidenbach, RFN). Począwszy od 3 tygodni po ostatniej dawce surowice można było pobierać przez 3 do 4 miesięcy. Zawartość swoistych przeciwciał oznaczano metodą ELISA.
Tabela 4
Wpływ monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał swoistych dla B. burgdorfen na wykrywalność krętków i rozwój zapalenia stawów u myszy Scid zakazonych B. burgdorfen ! Szczep C.B-17 l ! Rozwój zapalenia stawów tygodnie I Wykrywalność1
| liczba myszy | Podano | 1 | 2 | 3 | B. burgdorferi |
| n = 6 | PBS (kontrola ujemna) | + | + | + | — 6/6 |
| n = 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| n= 2 | anti OspA IMS (natywny) | - | - | - | 0/2 |
| n = 3 | anti OspA IMS (rekomb) | - | - | - | 0/3 |
Pierwsza dawka przeciwciał dootrzewnowo (10 μΐ) w dniu 0 (dzień zakażenia B. burgdorferi ZS7 1x108 komórek podskórnie u nasady ogona). Następne dawki przeciwciał dzień 4 (100 μ!, dzień 7 (200 μΠ, dzień 11 (200 μθ, dzień 14 (300 μθ, dzień 18 (300 μ!) dootrzewnowo.
Fig. 2 i-----------1 rZS 7/31-2 MC 1061 r8 31/41-9
169 804
Fig.1 atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat mkkyllgiglilaliackqn gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacgtt VS SLDEKNSVSVDLPGEMNV cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatotaattgcaacagtagacaag
LVSKEXNKDGKYDLIATVDK cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa
LELKGTSDKNNGSGVLEGVK gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa
ADKSKVKLTISDDLGQTTLE
VFKEDGKTLVSKKVTSKDKS tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca
STEEKFNEKGEVSEKIITRA oacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag 'dgtrleyteiksdgsgkake gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt
VLKSYVLEGTLTAEKTTLVV aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa KEGTV T-LSKNISKSGEVSVE cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact
LNDTDSSAATKKTAAWNSGT tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa
STLTITVNSKKTKDLVFTKE aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt
NTITVQQYDSNGTKLEGSAV gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa
EITKLDEIKNALK*
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodpamiania przeciw boreliozie z Lyme, znamienny tym, że zwierzęta doświadczalne, zwłaszcza myszy, uodpamia się antygenem, który daje reakcję immunologiczną z przeciwciałem monoklonalnym przeciw antygenowi OspA o wielkości 31 kD Borrelia burgdorferi i z uodpornionych zwierząt otrzymuje się zwykłym sposobem przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne ochronne przeciw antygenowi OspA.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monoklonalne przeciwciała otrzymuje się przez fuzję limfocytów lub komórek śledziony uodpornionego zwierzęcia doświadczalnego, w szczególności myszy, wytwarzając linię komórkową hybrydomy, która produkuje przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu OspA Borrelia burgdorferi i prowadzenie hodowli wytworzonej linii komórkowej hybrydomy.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do uodpornienia stosuje się antygen OspA szczepów ZS7.(Ł)SM 5527) i/lub B31 (ATCC 35210).
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do uodpornienia stosuje się antygen wytworzony techniką rekombinacji DNA.
- 5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że do uodpornienia stosuje się antygen, który zawiera następującą sekwencję aminokwasów lub immunogenny epitop tej sekwencji:atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatMKKYLLGIGLILALIACKQN gttagcagccttgacgagaaćoacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacgttVSSLDEKNSVSVDLPGEMNV cttgtaagcaaagBaaaaaacaaaga.cggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaagLVSKEKNKDGKYDLIATVDK cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaaLELKGTSDKNNGSGVLEGVK gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaaADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKS tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagcaSTEEXFNEKGEVSEKIITRA gacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagagDGTRLEYTEIKSDGSGKAKE gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggttVLKSYVLEGTLTAEKTTLVV aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa KEGTVT LSKNISXSGEVSVE cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcactLNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKXTXDLVFTKE aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagttNTITVQQYDSNGTKLEGSAV gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataaEITKLDEIKHALK*
- 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje antygen, który jest białkiem fuzyjnym sprzężonym z beta-galaktozydazą lub białkiem niesprzężonym.169 804Ί. Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme, znamienny tym, że zwierzęta doświadczalne, zwłaszcza myszy, uodpamia się antygenem, który daje reakcję immunologiczną z przeciwciałem monoklonalnym przeciw antygenowi OspA o wielkości 31 kD i/lub OspB o wielkości 34 kD Borrelia ourgdoneri i z uodpornionych zwierząt otrzymuje się zwykłym sposobem przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne ochronne przeciw antygenom OspA i/lub OspB.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że przeciwciała monoklonalne otrzymuje się przez fuzję limfocytów lub komórek śledziony uodpornionego zwierzęcia doświadczalnego, w szczególności myszy, wytwarzając linię komórkową hybrydomy, która produkuje przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu OspA i/lub OspB Borrelia burgdorferi.
- 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do uodpornienia stosuje się antygen OspA i/lub OspB szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35210).
- 10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do uodpornienia stosuje się antygeny wytworzone techniką rekombinacji DNA.
- 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się antygen, który jest białkiem fuzyjnym sprzężonym z beta-galaktozydazą lub białkiem niesprzężonym.* * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL169804B1 true PL169804B1 (pl) | 1996-09-30 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90307358A PL170229B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania antygenów PL PL |
| PL90286918A PL169804B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90307358A PL170229B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania antygenów PL PL |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (pl) |
| EP (5) | EP0643974B1 (pl) |
| JP (3) | JP3205932B2 (pl) |
| KR (2) | KR100205462B1 (pl) |
| AT (4) | ATE191499T1 (pl) |
| AU (1) | AU651560B2 (pl) |
| CA (1) | CA2025597C (pl) |
| CZ (2) | CZ284538B6 (pl) |
| DE (5) | DE4015911A1 (pl) |
| DK (4) | DK0418827T3 (pl) |
| ES (4) | ES2082812T3 (pl) |
| FI (1) | FI102248B1 (pl) |
| GR (3) | GR3018995T3 (pl) |
| HK (2) | HK1002405A1 (pl) |
| HR (1) | HRP940545B1 (pl) |
| HU (2) | HU212716B (pl) |
| IE (1) | IE903377A1 (pl) |
| NO (2) | NO311767B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ235260A (pl) |
| PL (2) | PL170229B1 (pl) |
| PT (1) | PT95349B (pl) |
| SI (1) | SI9011773B (pl) |
| SK (3) | SK283089B6 (pl) |
| YU (2) | YU48250B (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014065679A1 (en) | 2012-10-22 | 2014-05-01 | Instytut Chemiii Bioorganicznej Pan | Lyme disease vaccine |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| SG47447A1 (en) | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ATE196425T1 (de) * | 1990-07-06 | 2000-10-15 | American Home Prod | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6676942B1 (en) | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0877085A1 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-11 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OspA protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| EP0540457A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-05 | Symbicom Ab | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| US6437116B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-08-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic borrelia |
| DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) * | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| WO2000006745A1 (en) | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| WO2000078345A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| ES2298249T3 (es) | 2000-08-18 | 2008-05-16 | Research Foundation Of State University Of New York | Ospa modificada de borrelia burgdorferi. |
| US7847084B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains |
| SG176451A1 (en) | 2006-11-03 | 2011-12-29 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine |
| EP2361930A3 (en) | 2007-03-26 | 2011-10-26 | Dako Denmark A/S | Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases |
| EP2167536A1 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| CA2781110C (en) * | 2009-11-17 | 2018-07-31 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| WO1991009870A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff |
| SG47447A1 (en) * | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ATE196425T1 (de) * | 1990-07-06 | 2000-10-15 | American Home Prod | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0877085A1 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-11 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OspA protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| WO1993004157A1 (en) * | 1991-08-27 | 1993-03-04 | Novo Nordisk A/S | Detergent compositions |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| WO1993007897A1 (en) * | 1991-10-21 | 1993-04-29 | Medimmune, Inc. | Bacterial expression vectors containing dna encoding secretion signals of lipoproteins |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK456090A3/sk unknown
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014065679A1 (en) | 2012-10-22 | 2014-05-01 | Instytut Chemiii Bioorganicznej Pan | Lyme disease vaccine |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL169804B1 (pl) | Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PL | |
| Simon et al. | Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in mice | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| SK279250B6 (sk) | Vakcína s obsahom proteínu pc na prevenciu lymskej | |
| US5807685A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi | |
| KR20100139096A (ko) | 조성물, 방법 및 키트 | |
| US20040258695A1 (en) | Transferrin binding peptides and uses thereof | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| EP0492525A2 (en) | Babesial protease antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050918 |