SK283088B6 - Spôsob získania antigénu, ktorý imunologicky reaguje s protilátkami proti B burgdorferi antigénom a spôsob výroby vakcíny obsahujúcej takýto antigén - Google Patents
Spôsob získania antigénu, ktorý imunologicky reaguje s protilátkami proti B burgdorferi antigénom a spôsob výroby vakcíny obsahujúcej takýto antigén Download PDFInfo
- Publication number
- SK283088B6 SK283088B6 SK1510-98A SK151098A SK283088B6 SK 283088 B6 SK283088 B6 SK 283088B6 SK 151098 A SK151098 A SK 151098A SK 283088 B6 SK283088 B6 SK 283088B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antigen
- burgdorferi
- mice
- ospa
- antibody
- Prior art date
Links
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 58
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 4
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 2
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102100039352 Immunoglobulin heavy constant mu Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026044 Biotinidase Human genes 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Je opísaný spôsob získania antigénu, ktorý imunologicky reaguje s protilátkou proti 31 kD antigénu (OspA) B. burgdorferi a obsahuje určenú aminokyselinovú sekvenciu alebo imunogénny epitop z tejto sekvencie, pričom DNA sekvencia, ktorá kóduje túto aminokyselinovú sekvenciu, sa zavádza do hostiteľskej bunky, kde sa exprimuje, a následne sa izoluje antigén. Okrem toho sa opisuje spôsob výroby aktívnej vakcíny proti Lymskej borelióze.ŕ
Description
Oblasť vynálezu
Vynález sa týka spôsobu získania antigénu, ktorý' imunologický reaguje s protilátkou proti 31kD antigénu (OspA) B. burgdorferi a obsahuje určenú aminokyselinovú sekvenciu alebo imunogénny epitop z tejto sekvencie, pričom DNA sekvencia, ktorá kóduje túto aminokyselinovú sekvenciu, sa zavádza do hostiteľskej bunky, kde sa exprimuje, a následne sa izoluje antigén. Okrem toho vynález opisuje spôsob výroby aktívnej vakcíny proti Lymskej borelióze.
Doterajší stav techniky
Lymská borelióza je v súčasnosti najčastejším infekčným ochorením, ktoré sa prenáša kliešťami. Toto ochorenie je vyvolávané spirochétou Borrelia burgdorferi, tento mikroorganizmus sa prenáša na človeka predovšetkým kliešťami kmeňa Ixodes. Lymská borelióza je chronická progresívna infekcia, napádajúca množstvo orgánov, ako je koža, centrálny a periférny nervový systém, srdce, pečeň, ľadviny a svalový a kostný systém. Vzhľadom na to, že dostatočná liečba tohto ochorenia antibiotikami je ťažká, je v súčasnosti uskutočňovaný celý rad výskumov, ako zmeniť a zvýšiť imunologickú odpoveď na infekciu uvedeným mikroorganizmom.
D. Wilske a ďalší (Ann. N. Y. Acad. S. 539, str. 126 až 143 (1988)) opisujú imunochemickú analýzu B. burgdorferi proteínov použitím monoklonálnych a polyklonálnych protilátok vo Westem blote. Zistili variabilitu hlavných povrchových antigénov OspA a OspB v severoamerických a európskych kmeňoch. Hlavné povrchové antigény OspA a OspB sa neexprimovali ako významný imunogén charakteristický pre chorého človeka.
U ľudí s Lymskou boreliózou bol zistený vysoký titer protilátok proti B. burgdorferi, táto skutočnosť však nebola žiadnym ukazovateľom ochrany proti infekcii. Je pravdepodobné, že pôvodca infekcie prechádza veľmi rýchlo z krvných ciest do tkanív, kde už nie je pre imunologický systém bezprostredne dosiahnuteľný. To znamená, že protilátková ochrana je možná len bezprostredne po začiatku infekcie, keď sa mikroorganizmus nachádza ešte v krvných cestách.
Skutočnosť, že prirodzená infekcia B. burgdorferi bola zistená u množstva živočíšnych druhov, viedla k pokusom vytvoriť laboratórne modely pre Lymskú boreliózu až doteraz s obmedzeným úspechom. Pri niektorých pokusoch so špecifickou odpoveďou proti B. burgdorferi u myši bolo preukázané, že infekcia u inbredných myších kmeňov, pestovaných už dlhší čas s izolátom B. burgdorferi, viedla k miernym, ale významným patomorfologickým zmenám rôznych orgánov, ako je mozog, srdce, pľúca a ľadviny, pričom tieto zmeny boli porovnateľné so zmenami u ľudí s Lymskou boreliózou, ako bolo uvedené v publikácii Schaible a ďalší, (1988), Infect. Immun. 1,41. Skutočnosť, že sa vytvorili len mierne zmeny, bola asi spôsobená poklesom schopností vyvolať protilátky a zníženou virulenciou mikroorganizmu, už dlho pestovaného in vitro alebo schopnosťami myší vyvinúť dostatočnú imunologickú odpoveď, ako to bolo opísané v publikáciách Johnson a ďalší, /1984/, J. Clin. Microbiol. 20, 747, Schwan a ďalší /1988/, Infect. and Immun. 56,1837.
Vynález si kladie za úlohu pripraviť účinnú očkovaciu látku proti Lymskej boreliózc. Na tento účel je potrebné najprv získať vhodný laboratórny model. Bolo navrhnuté použiť kmeň myší bez funkčných T- a B-buniek, tzv. kmeň
Scid-myší opísaný v publikácii Bosma a ďalší, /1983/Náture 10, 52, pretože tieto myši vyvinú po infekcii B. burgdorferi vo forme izolátov viacsystémové ochorenie a prevažne polyartritídu a karditídu. Na tomto modeli je možné po prvýkrát skúšať účinnosť očkovacích látok proti Lymskej borelíóze.
Podstata vynálezu
Predmetom predloženého vynálezu jc spôsob získania antigénov, ktoré imunologický reagujú s protilátkou proti 31kD antigénu (OspA) B. burgdorferi ZS7, a zahŕňajú aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1 alebo imunogénny epitop z tejto sekvencie, a to tak, že DNA sekvencia kódujúca uvedenú aminokyselinovú sekvenciu sa zavádza do hostiteľskej bunky, kde sa exprimuje, a následne sa izoluje antigén.
Ďalším predmetom vynálezu je spôsob získavania antigénov B. burgdorferi ZS7 prostredníctvom preskúmavania B. burgdorferi ZŠl génovej banky s jednou alebo niekoľkými monoklonálnymi protilátkami, ktoré špecificky reagujú s 31kD antigénom (OspA) alebo 34 kD antigénom (OspB) B. burgdorferi.
Vynález ďalej opisuje spôsob výroby aktívnej vakcíny proti Lymskej borelíóze, ktorá ako účinnú látku obsahuje jeden alebo viacero antigénov, ktoré imunologický reagujú s protilátkou proti 31kD antigénu (OspA) B. burgdorferi alebo s protilátkou proti 34kD antigénu (OspB) B. burgdorferi.
Predmetom vynálezu je taktiež hybridómová bunková línia (uložená v European Collection of Animal Celí Cultures 13.09.1989, pod číslom ECACC 89 09 1302) produkujúca protilátku LA-2 proti OspA (IgG2b). Predmetom vynálezu je tiež hybridómová bunková línia ECACC 90050406 (uložená 04.05.1990) produkujúca protilátku LA-26.1 proti OspA (IgGl), a aj hybridómové bunkové línie ECACC 90050405 a ECACC 90050407 (uložené 04.05.1990) produkujúce protilátky LA-25.1, respektíve LA-27.1 proti OspB (IgG2b, respektíve IgGl).
Vynález sa rovnako týka patogénneho kmeňa B. burgdorferi ZS7 (uložený v Dcutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 19.09.1989, pod číslom DSM 5527).
Predmetom vynálezu je taktiež antigén reagujúci s monoklonálnymi protilátkami podľa vynálezu. Ide o antigén, ktorý obsahuje celý reťazec aminokyselín OspA alebo OspB alebo jeho imunologický účinnú časť (immunogénny epitop). Potenciálny imunogénny epitop môže zistiť bez problémov každý odborník štrukturálnou analýzou OspA (napríklad podľa Chou-Fassmannovej metódy), potom je možné tieto fragmenty skúmať a zisťovať ich účinnosť.
Predmetom vynálezu je taktiež rekombinantný antigén, ktorý reaguje s protilátkou podľa vynálezu, pričom DNA sekvencia kódujúca antigén je vložená v rekombinantnom vektore, výhodne prokaryotickom, vhodnom na expresiu bielkovín.
Zvláštnym predmetom vynálezu je antigén z B. burgdorferi 7.S7, ktorý špecificky reaguje s protilátkou podľa vynálezu, s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 1 alebo s imunogénnym epitopom tejto sekvencie. Vynález sa týka aj rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje 1) sekvenciu uvedenú na obr. 1, 2) zodpovedajúcu nukleokyselinovú sekvenciu berúc do úvahy degenerovanosť genetického kódu alebo 3) sekvenciu, ktorá v stringentných podmienkach hybridizuje so sekvenciou 1) a/alebo 2), pričom všetky tieto sekvencie kódujú antigén 31 kD z B. bur gdorferi ZS7 alebo jeho imunogénny epitop. Stringentné hybridizačné podmienky sú vysvetlené v publikácii Maniatis a ďalší, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Obzvlášť výhodný je antigén podľa vynálezu, ktorý je rekombinantným nefuzovaným proteínom alebo rekombinantným proteínom fuzovaným s β-galaktozidázou.
Vynález sa taktiež týka rekombinantného vektora obsahujúceho jednu alebo viac kópií rekombinantnej DNA podľa vynálezu. Môže ísť o prokaryotický a/alebo eukaryotický vektor, výhodne prokaryotický vektor. Rekombinantný vektor môže byť uložený v bunke mimo chromozómov, napríklad plazmid, alebo môže byť integrovaný do genómu bunky, napríklad bakteriofág lambda. Výhodný je plazmid a najmä rekombinantný vektor pZS-7/31 -2 (DSM 5528).
Vynález sa týka aj spôsobu získavania uvedených antigénov skúmaním génovej banky B. burgdorferi použitím protilátok podľa vynálezu, pričom sa izolujú klony poskytujúce pozitívnu imunologickú reakciu s použitou protilátkou.
Pretože antigén podľa vynálezu je možné použiť tiež samotný na aktívnu imunizáciu, t. j. na indukciu tvorby protilátok v organizme, týka sa vynález aj aktívnej očkovacej látky obsahujúcej ako účinnú zložku uvedený antigén a prípadne bežné nosiče a pomocné látky. Výhodne sa tento antigén získa technológiou genetického inžinierstva.
Bolo možné dokázať, že podanie natívneho alebo rekombinantného OspA normálnym myšiam vyvolá tvorbu protilátok, ktoré po pasívnom prenose na Scid-myši, chránia tieto myši pred Lymskou boreliózou. Obzvlášť bolo dokázané, že rekombinantné OspA, vyvoláva imunologickú odpoveď, porovnateľnú s odpoveďou na natívne OspA, takže je možné túto látku použiť na výrobu vakcíny proti Lymskej borelióze u ľudí.
Vynález bude ďalej vysvetlený v príkladoch uskutočnenia na základe priložených výkresov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obrázku 1 je znázornená DNA sekvencia a aminokyselinová sekvencia 31kD antigénu (OspA) z B. burgdorferi ZS7.
Na obrázku 2 je znázornená imunologická charakteristika rekombinantnej bielkoviny rZS7/31 -2.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Indukcia artritídy, karditídy a hepatitídy u Scid-myši prostredníctvom infekcie kmeňom B. burgdorferi ZS7
Infekcia myší B. burgdorferi
Dospelé myši kmeňa C.B-17 Scid (homozygot pre Scid-mutáciu) a C.B.-17 sa infikujú podkožnou injekciou 1x105, 5x105, lxlO6 alebo lxlO8 životaschopných alebo usmrtených (UV-svetlo) B. burgdorferi do koreňa chvostu.
Izolácia B. burgdorferi z kliešťov a myší
Výskumy boli uskutočňované s už dlho pestovaným kmeňom B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátom ZS7, DSM 5527, ktorý bol izolovaný zo samice kliešťa kmeňa Ixodes ricinus. Všetky kmene B. burgdorferi boli pestované v modifikovanom Kellyho prostredí podľa publikácie Barbour a ďalší, (1983) Switzerland. Curr. Microbiol. 8, 123. Organizmy izolované zo stredného čreva kliešťov, sterilizovaných etanolom alebo z krvi infikovaných myší boli spočiatku pestované v Kellyho prostredí s pridaním 8 pg/ml kanamycinu a 230 pg/ml fluóruracilu podľa publikácie Johnson a ďalší, (1984) J. Clin. Microbil. 1,81.
Sérologické testy
Zistenie špecifických protilátok proti B. burgdorferi sa uskutočňuje bežným testom ELISA podľa publikácie Justus a ďalší, (1988) Wehrmed. Mschr. 32, 263. Štandardná krivka pre obsah imunoglobulinu (Ig) bola získaná prevrstvením vyhĺbenia Ig proti myšiam (riedenie 1 : 500 roztoku séra, Paesel, Frankfurt, SNR) a titráciou obsahu celkového množstva IgG alebo IgM proti myši (Calbiochem, LaJolla, USA). Obdobným spôsobom bol meraný celkový obsah IgM a IgG v sére. Koncentrácia týchto špecifických protilátok sa udáva v pg/ml séra, vzťahuje sa na Ig.
Imunofluorescencia a farbenie podľa Gimmsa pl krvi sa napipetuje do skúmaviek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a potom sa odstredí pri 5000 ot./min. v odstredivke pre hematokrit (ECCO, NSR). Skúmavky sa rozrežú vo fáze medzi sérom a erytrocytmi a 5 μΐ séra sa nanesie na nosič (Superior, Bad Mergentheim, NSR). Nosič so vzorkou séra sa suší na vzduchu a potom sa fixuje 100 % etanolom 1 minútu pri -20 °C. Po inkubácii 1 hodinu s králičím hyperimúnnym sérom proti B. burgdorferi v riedení 1 : 100 pri laboratórnej teplote sa nosič päťkrát premyje s PBS a potom sa 1 hodinu farbí použitím kozieho antiséra proti králikom, konjugovaného s FITC (riedenie 1 : 20, Jackson Lab., West Grove, USA). Potom sa nosič premyje, uloží do zmesi glycerolu a želatíny (Merck, Darmstadt, NSR) a okamžite sa sleduje vo fluorescentnom mikroskope. Neošetrené kvapky krvi sa usušia na vzduchu, fixujú v metanole, farbia sa podľa Giemsa (0,1 %, Merck, Darmstadt, NSR), odfarbia v PBS a uložia do prostriedku Entellan (Merck, Darmstadt, NSR).
Histologické preparáty a postupy pri farbení
Rôzne vnútorné orgány, ako mozog, srdce, pľúca, pečeň, ľadviny, slezina a kĺby myší, infikovaných B. burgdorferi sa v rôznych časoch po infekcii odstránia a uchovávajú buď v kvapalnom dusíku na prípravu zmrazených rezov alebo v 5 % formaldehyde v PBS na uloženie do parafínu alebo metakrylátu.
Potom sa vytvárajú rezy s hrúbkou 4 až 7 pm, ktoré sa farbia Hematoxylínom-Eozínom a potom sa ukladajú do prostriedku Entellan (Merck AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické sledovanie sa uskutočňuje použitím systému s obsahom streptavidínu, biotínu a peroxidázy podľa publikácie Kramer a ďalší, (1989) Eur. J. Immunol. 19,151. Nasledujúca tabuľka 1 ukazuje, že organizmy B. burgdorferi, izoláty ZS7a B31, bolo možné zistiť v krvi Scid-myši, ktorým boli naočkované životaschopné mikroorganizmy, počas celého pokusu. Inak bolo možné rekultivovať len spirochéty kmeňa ZS7, ale nie kmeňa B31 in vitro. Pri porovnaní rekultivovaných organizmov s primárnym izolátom ZS7 nebolo možné preukázať žiadne zmeny v obsahu bielkovín alebo v profile plazmidu. Po celý čas pozorovania bolo možné u Scid-myši, infikovaných B. burgdorferi, preukázať len veľmi malý alebo žiadny titer irelevantných protilátok. Nebolo možné dokázať žiadne protilátky typu IgM alebo IgG, špecifické proti uvedenému mikroorganizmu. Naproti tomu dochádzalo u kontrolných myší C.B.-17, rovnako infikovaných, k expresii veľkého množstva celkových protilátok Ig a súčasne bolo možné dokázať vysoký titer špecifických protilátok IgM a IgG proti B. burgdorferi.
Medzi 7 a 22 dňom po infekcii izolátom ZS7 bolo možné pozorovať u Scid-myší prvé klinické príznaky zápalu kĺbov, a to sčervenanie a opuch oboch tibioterálnych kĺbov, stav sa zhoršoval. Nebolo však možné pozorovať žiadne také príznaky u Scid-myší, infikovaných izolátom ZS7, po jeho ožiarení UV-svetlom, alebo izolátom B31, a to životaschopným, ani u kontrolných myší C.B.-17, infikovaných životaschopným izolátom ZS7.
Tiež histopatologicky bolo možné dokázať kĺbové zmeny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátom ZS7, ako je zrejmé z tabuľky 1. Bolo možné dokázať ťažké poškodenie kĺbov, ktoré sa prejavovalo zápalovou hyperpláziou synoviálnej výstelky, spojené s rozrušením chrupavky a/alebo kosti. Ďalej bol zistený zápal celého srdca a prienikom mononukleámych buniek do endokardu, myokardu a perikardu. Ďalej bolo možné pozorovať progresívny zápal pečene, pričom bolo možné pozorovať vznik pečeňovej fibriózy, infiltrácia mononukleámych buniek bola obmedzená na oblasť portálnej žily a veľkých žíl. Okrem toho bolo možné pozorovať menšie poškodenie hlavy, pľúc, mozgu a priečne pruhovaných svalov.
Tabuľka 1
| Myši | B. burgdorferi | B. burgdorferi | Artridída | Protilátky (pg/ml)00 | |||||||
| Kmeň | Počet | Dni po infekcii | Detek. v krvi* | Izolácia** | Klinická 0 | Histopatologická | Celkové Ig μ T | špecifické Ig μ r | |||
| C.B-17 | ZS7 | 5x10' | 7 | + | - | - | - | 20 | |||
| Scid | 36 | + | +B | + | -i- | 21 | |||||
| (n=l) | 49 | + | +B | + | + | 26 | |||||
| 59 | + | +B | + | + | 396 | ||||||
| ZS7 | lxlO8 | 7 | + | - | + | + | 108 | ||||
| 23 | + | +B | + | + | 54 | ||||||
| ZS7 | lxlO5 | - | n.b. | n.b. | 4- | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | |
| lxlO6 | - | n.b. | n.b. | + | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | n.b. | ||
| lxlO8 | 16 | + | + | + | + | - | - | ||||
| ZSuvtr | lxlO8 | 16 | - | - | - | ||||||
| B31 | lxlO8 | 22 | + | 26 | 37 | ||||||
| 29 | + | - | - | ||||||||
| - | 22 | - | 47 | ||||||||
| - | 29 | 54 | 364 | ||||||||
| C.B-17 | ZS7 | lxlO8 | 16 | 2,515 | 5,963 | 438 | 56 | ||||
| (n=7) | 24 | 2,145 | 6,374 | 506 | 94 | ||||||
| - | - | - | - | 304 | 3,804 | - | - | ||||
| - | - | - | - | 216 | LÍ52 | - | - |
*: Giemsove farbenie alebo imunofluorescencia, **: izolácia z krvi (B) alebo kĺbov (G) °: + znamená sčervenanie a opuch tibiotarsálnych kĺbov, °°: - znamená menej ako 7,5 pg/ml séra n.b. : nebolo prevedené
Príklad 2
Účinnosť špecifickej monoklonálnej protilátky proti antigénu B. burgdorferi 31kD na priebeh Lymskej boreliózy u Scid-myší.
Získanie monoklonálnej protilátky
Pri imunizácii myši s neporušeným imunologickým systémom dochádza pri infekcii B. burgdorferi k expresii polyklonálnych protilátok špecifických pre B. burgdorferi, ako je zrejmé z tabuľky 1.
Myšie samice inbredného kmeňa BALB/c vo veku 10 týždňov boli imunizované B. burgdorferi, kmeňom B31, ATCC 35 210, kmeň bol homogenizovaný ultrazvukom. Imunizácia bola uskutočňovaná nasledujúcim spôsobom:
Deň 0: 200 pg antigénu Borrelia v úplnom Freundovom pomocnom prostriedku podkožné.
Deň 21, 35, 49, 63: ďalších 100 pg antigénu intraperitoneálne vo fyziologickom roztoku chloridu sodného, ktorý obsahuje fosfátový tlmivý roztok.
Deň 66: vybratie sleziny a získanie suspenzie jednotlivých buniek.
Imúnne slezinné bunky boli podrobené fúzii s myelómovou bunkovou líniou Ag8-PAI štandardným spôsobom použitím polyetylénglykolu podľa publikácie J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, Monoklonale Antikorper, SpringerVerlag, Heidelberg.
Produkty fúzie boli naočkované na 96-jamkové platne. Po ôsmich dňoch boli supernatanty kultúry' testované skúškou ELISA v pevnej fáze na prítomnosť špecifických monoklonálnych protilátok proti B. burgdorferi podľa uvedenej publikácie J. H. Peters a ďalších.
Hybridómové bunky z kultúr produkujúcich protilátky boli po zriedení ďalej klonované. Supernatanty kultúr jednotlivých klonov boli znovu testované skúškou ELISA v pevnej fáze, analýzou Western-Blot a immunofluorescenciou. Monoklonálne protilátky LA-2 podtriedy IgG2b boli produkované monoklonálnou hybridómovou líniou a táto línia ich aj vylučovala, a reagovali pri skúške Western-Blot s 31kDa štruktúrou(Osp-A) zo všetkých vyšetrovaných kmeňov B. burgdorferi, (okrem iných aj z izolátmi ZS7 a B31), keď sa uviedli do kontaktu s B. burgdorferi proteínmi prostredníctvom Westem blotu, pričom tieto proteíny boli rozdelené elektroforézou na SDS-géli a prenesené na membrány. Monoklonálne protilátky LA-26.1C (anti-OspA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigén, IgG2b) a LA 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigén, IgGl) je možné získať a charakterizovať analogickým spôsobom.
Infekcia myší B. burgdorferi ZS7
Scid-myši C.B.-17 boli infikované podkožné v oblasti koreňa chvostu množstvom lxlO8 životaschopných jedincov izolátu B. burgdorferi ZS7.
Ošetrenie myší antisérom
Infikované Scid-myši boli ošetrené 2x týždenne rôznymi antisérami. Prvej skupine bolo podané sérum NMS (normálne myšie sérum), druhej skupine sérum IMS (imúnne myšie sérum) a tretej skupine bolo podané sérum s obsahom monoklonálnej protilátky LA-2 proti antigénu 31kD B. burgdorferi. Dávka antiséra bola v prvom týždni 100 pl alebo 100 pg pre LA-2, v druhom týždni 200 μΐ alebo 200 pg pre LA-2 a v treťom týždni 300 pg alebo 300 pl pre LA-2.
Z nasledujúcej tabuľky 2 je zrejmé, že myši Scid, neošetrené alebo ošetrené NMS mali po 12 dňoch klinické a histopatologické prejavy zápalu kĺbov, srdca a pečene. Oproti tomu monoklonálna protilátka LA-2 podstatne obmedzila tieto príznaky. Klinicky došlo len k ľahkému sčervenaniu a histopatologicky len k marginálnym zmenám. Pri podaní IMS nebolo možné pozorovať žiadne klinické prejavy.
Dôkaz B. burgdorferi kultiváciou in vitro bolo možné získať len u neošetrených myší alebo myší, ošetrených NMS, nie však v prípade LA-2 alebo IMS.
Tabuľka 2
Ošetrenie Scid-myši C.B-17 antisérom po infekcii B. burgdorferi
| ScidC.b-17 | Antisérum | zápal kĺbov po 12 dňoch | karditída/ hepatitída | preuk. B. burgdorferi kultiváciou | |
| klinicky | histopatologicky | histopatologicky | |||
| n=3 | - | + | + | + | + |
| n=3 | NMS | 4- | 4- | 4- | 4- |
| rrf | IMS | - | - | - | - |
| n=3 | LA-2 | X | XX | - | - |
x ľahké sčervenanie kĺbov xx len marginálne zmeny
Príklad 3
Klonovanie a expresia antigénu 31 kD (OspA) z B. burgdorferi ZS 7
Príprava DNA
Vysokomolekulárna DNA z kmeňa B. burgdorferi ZS7 bola čistená po kultivácii v modifikovanom Kellyho prostredí. Spirochéty boli peletované odstredením pri 10000 ot./min. a trikrát premyté PBS - tlmivým roztokom. Vysušený pelet sa znovu suspendoval v 10 ml TE s obsahom 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA pri pH 4, potom bol na 15 minút pri teplote 30 °C pridaný lyzozým v množstve 5 mg/ml, načo bola DNA uvoľnená pridaním 1 ml 20 % SDS. Po pridaní 1,5 ml roztoku NaCl s obsahom 5 mol/1 bol roztok extrahovaný rovnakým objemom fenolu a potom chloroformom. DNA potom bola vyzrážaná pridaním dvoch objemov absolútneho etanolu s následnou inkubáciou cez noc pri teplote -20 °C. Po odstredení bol zvyšok rozpustený v 0,5 ml TE, potom bol inkubovaný s DNAázou, jednoduchou RNA-ázou A (20 pg/ml) počas 45 minút pri teplote 55 °C, načo bola na 1 hodinu pri teplote 37 °C pridaná proteináza K v množstve 0,1 pg/ml. Potom bol pridaný NaOAc do koncentrácie 0,3 moí/1 a zmes bola ako extrahovaná fenolom a chloroformom, ako bolo uvedené. Po vyzrážaní etanolom bola DNA znovu rozpustená v TE.
Príprava génovej banky
Vysokomolekulárna DNA bola štatisticky rozdelená na menšie časti pôsobením ultrazvuku počas 3 sekúnd. Potom bola použitá T4-DNA-polymeráza (30 minút pri 37 °C) a Klenowov enzým (5 minút pri 20 °C) na zatupenie zakončení vzniknutých fragmentov. Vzniknutá DNA bola potom vligovaná do BamHI štiepneho miesta expresného vektora pUEXl, pričom bola použitá adapterová stratégia klonovania podľa publikácie Bresan and Stanley (1987) Nucl. Acid. Res., str. 1056. Po selekcii podľa veľkosti použitím chromatografie s molekulárnym sitom na Sephacryl S-1000 a po transformácii kompetentných buniek E. coli MC 1061 bol podiel rekombinantných jednotiek na tvorbu plakov /pfu/ stanovený nasledujúcim spôsobom. Náhodne zvolené kolónie boli odobraté a pestované v 2 ml selekčného pros tredia LB s 25 pg/ml ampicilínu až do nasýtenia. Plazmidová DNA sa potom izolovala bežnou alkalickou lyzačnou metódou a potom bola rozštiepená enzýmom BamHI. Viac než 50 % analyzovaného plazmidu obsahovalo včlenené reťazce DNA so stredným priemerom >1,5 kb.
Pestovanie na platniach a skríning génovej banky B. burgdorferi ZS7
Bunky boli nanesené na platne s rozmerom 24x24 cm v množstve 7000 pfú na jednej platni a boli inkubované cez noc pri teplote 30 °C. Po prenose kolónií na nitrocelulózový filter (NC) bola indukovaná expresia proteínu fúzovaného s β-galaktozidázou dvojhodinovou inkubáciou pri teplote 42 °C. Filter bol prenesený na papier Whatman 3MM, dopredu spracovaný 5 % SDS a papier bol inkubovaný 25 minút pri teplote 95 °C. Potom boli bielkoviny podrobené elektroblotu použitím bežného zariadenia na uskutočňovanie Westem blotu použitím čiastočne vysušeného materiálu. Po spracovaní NC-filtrov DNA-ázou boli imunoreaktívne klony identifikované použitím monoklonálnych protilátok. Nešpecifické väzbové miesta na NC-filtroch boli nasýtené štvorhodinovou inkubáciou s PBS s obsahom 0,2 % hmotnostných želatíny a 3 mmol/1 NaN3 pri laboratórnej teplote. Nakoniec boli filtre inkubované 18 hodín za stáleho pretrepávania so supematantmi kultúry anti-31kD monoklonálneho klonu LA-2. Po dôkladnom premytí (PBS + 1% (v/v) Tritonu X-100; PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného; PBS + 1 mol/1 chloridu sodného; každý stupeň trval 10 minút) boli filtre inkubované 1,5 hodín pri laboratórnej teplote za stáleho pretrepávania s peroxidázou značeným F(ab)2 prípravkom z králičej protimyšej IgG protilátky v riedení 1:10 000. Filtre boli znovu premyté, ako bolo uvedené, a potom boli inkubované s diaminobenzidínom ako substrátom na peroxidázu. Z 104 rekombinantných pfu reagovalo 20 klonov s monoklonálnou protilátkou LA-2.
Analýza sekvencie 31 kD antigénu (OspA) Bežným spôsobom bola izolovaná včlenená DNA rekombinantného kmeňa E. coli, klonu s pozitívnou reakciou s protilátkou LA-2. Včlenená DNA tohto klonu obsahovala gén OspA, ktorý kóduje 31kD antigén B. burgdorferi v ce lej jeho dĺžke. Plazmid, ktorý obsahoval túto sekvenciu, bol označený pZS-7/31-2 a bol označený podľa Budapeštianskej zmluvy a bol uložený do verejnej zbierky pod číslom DSM 5528 19.09.1989.
Rekombinantná bielkovina produkovaná týmto pozitívnym klonom bola označená rZS7/31-2 a bola stanovená kódujúca DNA sekvencia génu OspA. Táto sekvencia je uvedená na obrázku 1 spoločne s odvodenou aminokyselinovou sekvenciou proteínu OspA.
Z obrázku 1 je taktiež zrejmé, že 31kD antigén z B. burgdorferi je bielkovina, ktorá obsahuje 273 aminokyselín.
Príprava nefúzovanej bielkoviny
AJ Kloň exprimujúci imunoreaktívnu bielkovinu rZS7/31-2 bol pestovaný cez noc pri 30 °C v 10 ml LB média s ampicilínom. 1 ml kultúry bol potom pridaný ku 100 ml selekčného média a materiál bol pestovaný pri 30 °C za prevzdušňovania až do hustoty 8 x 107 buniek v 1 ml (A6oo=O,2). Expresia rekombinantných bielkovín bola dosiahnutá prenesením buniek do teploty 42 °C. Po schladení a odstredení boli bunky premyté tlmivým roztokom STE, ktorý obsahoval 10 mmol/1 tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA pri pH 8,0 a získaný materiál bol znovu rozsuspendovaný v 0,6 ml lyzačného tlmivého roztoku s obsahom 25 % sacharózy' a 50 mmol/1 tris, pH 8,0. Po pridaní 150 μΐ roztoku s obsahom 10 mg/ml lyzozýmu bola zmes inkubovaná 15 minút v ľade a potom ešte ďalších 15 minút v ľade za prítomnosti 18 μΐ roztoku s obsahom 10 mg/ml DNA-ázy 1 za prítomnosti 5 μΐ 1 mol/1 chloridu horečnatého. Potom bolo pridaných 250 μΐ 4x detergenčnej zmesi (1 % Triton X 100, 0,5 % Deoxycholátu, 0,1 mol/i NaCl, 10 mmol/1 tris, o pH 7,4) a zmes bola znovu inkubovaná 5 minút v ľade. Po odstredení bola usadenina dvakrát premytá tlmivým roztokom A (50 mmol/1 tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a potom bol materiál znovu rozsuspendovaný v deviatich objemoch tlmivého roztoku A s obsahom 8 M močoviny a zmes bola 1 hodinu inkubovaná pri laboratórnej teplote. Potom bola vzorka zriedená deviatimi dielmi tlmivého roztoku B (50 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), zmes sa ešte 30 minút miešala pri laboratórnej teplote a pH sa udržiavalo hydroxidom draselným na hodnote 10,7. Potom sa pH roztoku upravilo na 7,0 pridaním kyseliny chlorovodíkovej a vzorka sa dialyzovala cez noc proti tlmivému roztoku A pri teplote 4 °C, potom 10 minút pri teplote 4 °C, načo sa odstreďovala 10 minút pri teplote 4 °C a 10 000 ot./min. (rotor SS34). Supernatant s obsahom rekombinantnej bielkoviny sa skladoval pri -20 °C.
B/ Vzhľadom na to, že tento kloň vylučuje imunoreaktívnu bielkovinu rZS7/31-2 tiež do živného prostredia, je možné čistenie (afinitnou chromatografiou) priamo zo supematantu kultúry.
Príprava rekombinantnej nefúzovanej bielkoviny OspA a čistenie afinitnou chromatografiou
Rekombinantná bielkoviny potom boli čistené afinitnou chromatografiou. Na tieto účely boli na aktivovanú Sepharose CL 4B kovalentne naviazané čistené monoklonálne protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny bol s rekombinantnou bielkovinou naviazaný na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakoniec bola táto zmes pridaná do stĺpca LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzívnom premytí bola naviazaná rekombinantná bielkovina podrobená elúcii zmesou 0,1 mol/1 glycínhydrochloridu a 0,1 mol/1 NaCl, pH 2,5. Potom bolo pH tejto frakcie neutrálizovane okamžitým pridaním 1/10 objemu 0,5 mol/1 K2HPO4. Frakcie s obsahom bielkoviny boli koncentrované a dialyzované. Pomocou elektroforézy na SDS-polyakrylaminovom géli bol stanovený stupeň čistoty.
Imunologická charakteristika rekombinantnej bielkoviny rZS7/31-2
Rekombinantná bielkovina rZS7/31-2 bola imunologický skúmaná. Na porovnanie bola použitá rekombinantná bielkovina rB31/41-9 (povrchový 41kD antigén B. burgdorferi).
Mikrotitračné platne s plochým dnom boli prevrstvené extraktom rekombinantnej bielkoviny rZS7/31-2 a rB31/41 -9 s použitím extraktu z močoviny, prípadne extraktom kmeňa E. coli MC 1061, ktorý bol použitý na expresiu génu. Nešpecifické väzbové miesta boli blokované 0,2 % želatínou v roztoku chloridu sodného s obsahom fosfátového tlmivého roztoku. Do jamiek takto pripravených mikrotitračných platní boli pridané monoklonálne protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-1 (anti-41 kD, flagclín) a ACHT-2 (antiaiAntichymotrypsín).
Naviazané monoklonálne protilátky boli uvedené do reakcie so špecifickými antimyšími imunoglobulinmi označenými pcroxidázou. Naviazané protilátky značené peroxidázou boli kvantitatívne stanovené pomocou orthofenyléndiamínu ako substrátu na peroxidázu. Absorpcia pri 492 nm (A492) bola stanovená priamo na mikrotitračnej platni pomocou automatizovaného fotometra. Veľkosť absorpcie je priamo úmerná množstvu naviazanej monoklonálnej protilátky.
Monoklonálna protilátka LA-2 špecificky reaguje s bielkovinou rZS7/31-2, ale nie s MC 1061 alebo rB31/41 -9. Kontrolná reakcia monoklonálnej protilátky LA-1 je špecifická pre rB31/41-9. Monoklonálna kontrolná protilátka ACHT-2 (negatívna kontrola) sa neviaže na žiadnu z uvedených bielkovín.
Na obrázku 2 je znázornené, že dochádza k expresii antigénneho epitopu rekombinantnej bielkoviny rZS7/31-2 klonovanej z genómu B. burgdorferi ZS1, pričom tento antigénny epitop je špecificky rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou LA-2.
Príklad 4
Porovnanie špecifických protilátok proti 31kD antigénu (OspA) a 34kD antigénu (OspB) s protilátkami, ktoré sú špecifické pre 41kD antigénu (Flagelín)
Monoklonálne protilátky LA-2 a LA-26.1 rozpoznávajú 31kD antigén OspA a je možné ich priradiť k izotypu IgG2b a IgGl. Monoklonálne protilátky LA-25.1 a LA27.1 rozpoznávajú 34kD antigén OspB a je možné ich priradiť k izotypu IgG2b a IgGl. Monoklonálne protilátky LA-10 a LA-21 sú špecifické pre periplazmatickú 41kD bielkovinu spojenú s bičíkmi B. burgdorferi a je možné ich priradiť k izotypu IgG2a a IgGl. Všetky uvedené protilátky je možné získavať spôsobom podľa príkladu 2. Malo byť stanovené, či aj monoklonálne protilátky proti inému antigénu B. burgdorferi poskytujú Scid-myšiam ochranu pred klinickými prejavmi infekcie.
Polyklonálne imúnne sérum anti-B31 (IMS) bolo odobraté z myší C57BL/6 91 dní po podkožnom podaní lxlO8 organizmov B. burgdorferi B31. Poiykĺonálna anti-ZS7 IMS bola odobratá z myší C57BL/6 po 68 dňoch po podkožnom naočkovaní lxlO8 organizmov B. burgdorferi ZS7. Obe séra obsahovali 60 pg/ml špecifických protilátok, ako bolo možné dokázať skúškou ELISA podľa publikácie Schaible a ďalší, J. Exp. Med. 170 (1989), 1427-1432.
Normálne myšie sérum (NMS) bolo odobraté z neinfikovaných myší C57BL/6.
Od naočkovania v intervaloch štyri dni boli uvedené protilátky alebo PBS tlmivý roztok podávané pasívne intraperitoneálnc Scid-myšiam nasledujúcim spôsobom:
Deti 0 a 3: 100 μΐ,
Deň 7 a 10: 200 μΐ,
Deň 13 a 17: 300 μΐ.
Scid-myši, ošetrené protilátkami anti-ZS7 IMS, antiB31 IMS alebo monoklonálnou protilátkou LA-2 nemali žiadne viditeľné klinické príznaky zápalu kĺbov, nedošlo ku sčervenaniu ani opuchu tibiotarzálnych kĺbov v priebehu 21 dní. Neobjavili sa ani príznaky zápalu srdca a pečene. Histopatologické vyšetrenie nedokázalo zmenu kĺbov, srdca a pečene u Scid-myší, ktoré dostali ktorúkoľvek z týchto protilátok.
Aj ďalšie OspA špecifické monoklonálne protilátky LA-26.1 (IgGl) a OspB špecifické protilátky LA-25.1 a LA-27.1 potláčali alebo zmierňovali všetky príznaky. Tu však došlo k ľahkým patologickým zmenám uvedených orgánov.
Naproti tomu mali Scid-myši po podaní tlmivého roztoku PBS, NMS alebo monoklonálnej protilátky proti Flagelínu (LA-10 alebo LA-21) klinické príznaky typickej artritídy, ako je zrejmé u neošetrených myší a ako je uvedené v tabuľke 3. Ťažké príznaky sa zvyšovali v priebehu času po naočkovaní a po celý čas pozorovania sa nezmiemili. Zo Scid-myší, dopredu ošetrených anti-ZS7 IMS alebo LA-2, nebolo možné izolovať spirochéty. Naproti tomu bolo možné dokázať spirochéty imunofluorescenciou a kultiváciou z krvi tých Scid-myší, ktoré boli ošetrené podaním tlmivého roztoku PBS, NMS alebo monoklonálnymi protilátkami LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 alebo LA-21.
Tabuľka 3
| Scid- C.B-17 počet myší | ošetrenie | subtyp IgG | Klinická artritída | Histopatologická periartritis/artritis | Karditída | preukáž. B. burgdorferi kultivácia a imunofluorescencia |
| n = 8 | PSB (neg. kontrola) | + | + | 4- | + | |
| n = 3 | NMS(neg. kontrola) | + | 4- | 4- | 4- | |
| n = 3 | anti-B31 IMS | -x | +° | |||
| n = + | anti ZS7 IMS | - | - | ’X | - | |
| n = 6 | LA-2 (OspA) | 2b | - | -X | -X | - |
| n = 3 | LA-10 (Flagelín) | 2a | 4- | 4- | + | +° |
| n = 3 | LA-21 (Flagelín) | 1 | + | 4- | +/- | 4- |
| n = 3 | LA-26.1 (OspA) | 1 | ± | ± | ± | +° |
| n = 3 | LA-25.1 (OspB) | 2b | ± | ± | ± | + |
| n = 3 | LA-27.1 (OspB) | 1 | ± | ± | +° |
χ
Stupeň patologických zmien je označovaný takto: - žiadny, — subklinický, +/- mierny, + ťažký 0 = dôkaz B. burgdorferi imunofluorescenciou nebol možný u všetkých jedincov
Príklad 5
Vplyv antiséra myší imunizovaných s OspA na priebeh Lymskej boreliózy u Scid-myší
V tomto pokuse bolo dokázané, že podanie natívneho OspA (izolovaného z B. burgdorferi ZS-7) alebo rekombinantného OspA (izolovaného z baktérií E. coli transformovaných rekombinantným plazmidom pZS-7/31-2 (DSM 5528)) vyvoláva u normálnych myší kmeňa C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálnych protilátok. V prípade, že tieto protilátky sú podané Scid-myšiam, chránia pred Lymskou boreliózou. Bolo teda možné dokázať, že rekombinantné OspA vyvoláva ochrannú imunologickú odpoveď, porovnateľnú s odpoveďou na natívne OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu sú uvedené v tabuľke 4.
Získanie rekombinantného OspA je uvedené v príklade
3.
Získanie natívneho OspA a imunizácia myší týmto materiálom bude ďalej opísaná.
Získanie natívneho 3 lkDa OspA
3,2xl010 spirochét sa miešalo 2 hodiny pri 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za prítomnosti inhibítora proteázy (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidínu a 0,5 mmol/1
PMSF) použitím magnetického miešadla. Potom sa zmes odstreďovala 90 minút pri 10 000 ot./min. a 4 °C v odstredivke (Sorvall). Vodná fáza s obsahom povrchovej bielkoviny sa izolovala a trikrát premyla chloroformom. Obsah bielkoviny sa zistil extinkciou pri 280 nm alebo testom BCA.
V géli s obsahom striebra alebo metódou Westem blotu s králičím sérom proti B. burgdorferi je možné dokázať pre kmeň ZS7 hlavný pás s molekulovou hmotnosťou 31 kDa a slabšie pásy pri 20, 34 a 65 až 68 kDa. V zmesi butanolu a vody poskytuje kmeň B31 hlavný pás pri 31 kDa a slabšie pásy 20 a 34 kj.
Imunizácia myší natívnym a rekombinantným OspA
Myši C57BL6 a myši C.B-17 boli očkované trikrát v odstupe 7 až 10 dní podaním 5 pg natívneho OspA kmeňa B31 alebo 10 mg natívneho OspA kmeňa ZS7 alebo rekombinantného OspA toho istého kmeňa v 100 μΐ pomocného prostriedku (ABM3, Fa. Sebak, Ainenbach, NSR) podkožné v oblasti koreňa chvostu. Najskôr 3 týždne po poslednom podaní bolo možné odoberať sérum 3 až 4 mesiace. Obsah špecifických protilátok bol stanovený metódou ELISA.
Tabuľka 4
Vplyv špecifických monoklonálnych a polyklonálnych protilátok proti B. burgdorferi na spírochetózu a vývoj zápalu kĺbov u infikovaných Scid-myší
| Scid-myší C.B.-17 počet | ošetrenie | vývoj zápalu kĺbov týždne | dôkaz B. burgdorferi | ||
| 1 | 2 | 3 | |||
| n = 6 | PBS (negat. kontrola) | ± | -h | 6/6 | |
| n - 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| n = 2 | anti OspA (natívna) IMS | - | - | 0/2 | |
| n = 3 | anti OspA (rekomb) IMS | - | - | - | 0/3 |
Prvá dávka protilátky bola podaná intraperitoneálne v objeme 100 pl v dni 0, t. j. súčasne s infekciou B. burgdorferi ZS-7 (lxlO8 organizmov podkožné do oblasti koreňa chvostu). Ďalšie dávky protilátok boli podané v dňoch 4 (100 pl), 7 (200 μΐ), 11 (200 μΐ), 14 (300 μΐ), 18 (300 μΐ), vždy intraperitoneálne.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob získania antigénu, ktorý imunologický reaguje s protilátkou proti 31kD antigénu (OspA) B. burgdorferi a obsahuje nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu alebo imunogénny epitop z tejto sekvencie:M KV S L V L E A DV F S T D GV L K E L N S T N T E 1K Y S L S K L K K S K E E E T R K S G T D T L T I T T KL L D E E K G T K V D G K F L EV VV T D S I TV Q L DG I K N N K S D K L K T N EY T L E L S S AV N Q YE IG L S V D GK N T IL V K GE IG TK NA T S KD S K NI L S V K Y N G S D S K E V K S L T I S K K K T N G A LA L D L D L S G D L K V S E D G A E K S T A K D T K K *I AP G I AV L G Q T S K 1 S G K T G E A W L V L EC K E M T V E G T T K D I T K A T L V S N S F T G SQ NN VD KV KL EK SR AK EV VV EG TK EA V vyznačujúci sa tým, že DNA sekvencia, ktorá ju kóduje, sa zavádza do hostiteľskej bunky, v hostiteľskej bunke sa táto DNA sekvencia exprimuje a izoluje sa antigén.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že DNA sekvencia, ktorá kóduje antigén, je umiestnená vo vektore, výhodne prokaryotickom vektore, ktorý je vhodný na proteínovú expresiu.
- 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že antigén je protein fúzovaný s β-galaktorzidázou alebo nefúzovaný protein.
- 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že DNA sekvencia obsahuje 1) uvedenú nukleokyselinovú sekvenciu alebo 2) sekvenciu, ktorá jej zodpovedá berúc do úvahy degenerovanosť genetického kódu: atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaa atgttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatg aacgttcttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaa cagtagacaagcttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagta cttgaaggcgtaaaagctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatcta ggtcaaaccacacttgaagttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaa agtaacttccaaagacaagtcatcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaa gtatctgaaaaaataataacaagagcagacggaaccagacttgaatacacagaa attaaaagcgatggatctggaaaagctaaagaggttttaaaaagctatgttcttgaa ggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggttaaagaaggaactgttacttt aagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaacttaatgacactgacagt agtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcacttcaactttaacaatt actgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaaaacacaattaca gtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagttgaaatta caaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa.
- 5. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že vektorom je plazmid.
- 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že vektorom je pZS-7/31 (DSM 5528).
- 7. Spôsob získania antigénov z B. burgdorferi ZS7, vyznačujúci sa tým, že B. burgodrferi ZS7 (DSM 5527) génová banka sa skúma jednou alebo niekoľkými monoklonáínymi protilátkami, ktoré sú špecifické pre 31kD antigén (Ospí) alebo 34kD antigén (OspB) B burgdorferi, a izolujú sa klony, ktoré majú pozitívnu imunologickú reakciu s protilátkou alebo s protilátkami.
- 8. Spôsob výroby aktívnej vakcíny proti Lymskej borelióze, vyznačujúci sa tým, že jeden alebo niekoľko antigénov, ktoré imunologický reagujú s protilátkou proti 31kD antigénu (OspA) B. burgdorferi alebo s protilátkou proti 34kD antigénu (OspB) B. burgdorferi, sú formulované ako účinná látka, voliteľne spolu s bežnými nosičmi, plnivami a pomocnými látkami, do farmaceutického prostriedku.
- 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa použije antigén podľa nároku 1.
- 10. Spôsob podľa nároku 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že antigén sa získa genetickým inžinierstvom.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK151098A3 SK151098A3 (en) | 1999-04-13 |
| SK283088B6 true SK283088B6 (sk) | 2003-02-04 |
Family
ID=25885304
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1511-98A SK283089B6 (sk) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Patogénny mikroorganizmus B.burgdorferi a spôsob jeho izolácie a rekultivácie |
| SK1510-98A SK283088B6 (sk) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Spôsob získania antigénu, ktorý imunologicky reaguje s protilátkami proti B burgdorferi antigénom a spôsob výroby vakcíny obsahujúcej takýto antigén |
| SK4560-90A SK280285B6 (sk) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovacia látka proti borelióze a spôsob jej výrob |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1511-98A SK283089B6 (sk) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Patogénny mikroorganizmus B.burgdorferi a spôsob jeho izolácie a rekultivácie |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK4560-90A SK280285B6 (sk) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovacia látka proti borelióze a spôsob jej výrob |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (sk) |
| EP (5) | EP0861664A3 (sk) |
| JP (3) | JP3205932B2 (sk) |
| KR (2) | KR100205462B1 (sk) |
| AT (4) | ATE175576T1 (sk) |
| AU (1) | AU651560B2 (sk) |
| CA (1) | CA2025597C (sk) |
| CZ (2) | CZ284616B6 (sk) |
| DE (5) | DE4015911A1 (sk) |
| DK (4) | DK0418827T3 (sk) |
| ES (4) | ES2129551T3 (sk) |
| FI (1) | FI102248B (sk) |
| GR (3) | GR3018995T3 (sk) |
| HK (2) | HK1002405A1 (sk) |
| HR (1) | HRP940545B1 (sk) |
| HU (2) | HU212716B (sk) |
| IE (1) | IE903377A1 (sk) |
| NO (2) | NO311767B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ235260A (sk) |
| PL (2) | PL169804B1 (sk) |
| PT (1) | PT95349B (sk) |
| SI (1) | SI9011773B (sk) |
| SK (3) | SK283089B6 (sk) |
| YU (2) | YU48250B (sk) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| JPH06501382A (ja) | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP1016416A3 (en) * | 1990-07-06 | 2002-10-23 | Wyeth | Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| JPH07501687A (ja) * | 1991-08-15 | 1995-02-23 | スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） | ボレリア・ブルグドルフェリのサブグループのｏｓｐ ａ 蛋白、それをコードしている遺伝子およびワクチン |
| US6676942B1 (en) * | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| PT100980B (pt) * | 1991-10-18 | 1999-07-30 | Connaught Lab | Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao |
| EP0540457A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-05 | Symbicom Ab | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| ATE301716T1 (de) | 1996-02-21 | 2005-08-15 | Univ Texas | Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia |
| DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| DK1100922T3 (da) | 1998-07-31 | 2008-06-16 | Gundersen Lutheran Medical Fou | Anvendelser af én eller flere borreliacide epitoper på ydermembranprotein C fra Borrelia burgdorferi (OspC) som vaccine |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| AU4800500A (en) | 1999-06-21 | 2001-01-09 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| DK1311540T3 (da) | 2000-08-18 | 2008-04-28 | Brookhaven Sciences Ass Llc | Ændret OspA af Borrelia Burgdorferi |
| AU2003299872A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Vmp-like sequences of pathogenic borrelia species and strains |
| KR101192127B1 (ko) | 2006-11-03 | 2012-10-17 | 쉐링-프라우 리미티드 | 개 라임병 백신 |
| EP2361930A3 (en) | 2007-03-26 | 2011-10-26 | Dako Denmark A/S | Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases |
| EP2167536A1 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| WO2010037402A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| WO2011063003A2 (en) * | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| ATE140461T1 (de) * | 1989-12-22 | 1996-08-15 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff |
| JPH06501382A (ja) * | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP1016416A3 (en) * | 1990-07-06 | 2002-10-23 | Wyeth | Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| JPH07501687A (ja) * | 1991-08-15 | 1995-02-23 | スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） | ボレリア・ブルグドルフェリのサブグループのｏｓｐ ａ 蛋白、それをコードしている遺伝子およびワクチン |
| DK0642574T3 (da) * | 1991-08-27 | 1999-08-16 | Novo Nordisk As | Detergentsammensætninger |
| PT100980B (pt) * | 1991-10-18 | 1999-07-30 | Connaught Lab | Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao |
| EP0625052A4 (en) * | 1991-10-21 | 1995-07-19 | Medimmune Inc | SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR. |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK280285B6/sk unknown
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK283088B6 (sk) | Spôsob získania antigénu, ktorý imunologicky reaguje s protilátkami proti B burgdorferi antigénom a spôsob výroby vakcíny obsahujúcej takýto antigén | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5807685A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi | |
| Jonson et al. | Epitope differences in toxin-coregulated pili produced by classical and El Tor Vibrio cholerae O1 | |
| MX2010010614A (es) | Composiciones, metodos y kits. | |
| US5543304A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| IE83340B1 (en) | Vaccine against lyme disease |