JPH06500992A - エチノコーカス グラニューロサスの免疫原性ペプチド配列、このペプチド配列をコードする ｄｎａ配列及び診断及び治療用途 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 エチノコーカス　ゲラニューロサスの免疫原性ペプチド配列、このペプチド配列 をコードするＤＮＡ配列及び診断及び治療用途本発明は、エチノコーカス　ゲラ ニューロサス　（ＥｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓＬｕ社匹旦）の免疫原性ペプチド配 列、このペプチド配列をコードするＤＮＡ配列及びまた、そのペプチド配列の診 断及び治療的適用に関する。

単房性色土症又は色土化は、小さな条虫類、すなわちエチノコー、立２−−〆う 三：５Ｏ９Ｘの幼虫形のヒト及びまた家畜における成長による寄生体疾患である 。犬は、寄生体成虫の保有生物を表わす。

この寄生体化は、医学的及び獣医学的分野において経済的反響が存在する、アフ リカ、ラテンアメリカ及びオーストラリアにおける飼育国々並びに地中海沿岸の 国々において真の疫病である。はとんどの診断試験は現在、動物のために利用で きないが、医学的診断は観察される症状の非特異性のために複雑である。他方、 いくつかの標準免疫学的方法、たとえば血球凝集反応及び補体結合反応が抱土化 の検出のために行なわれて来た。抗原の源として使用される色土流体は、他の寄 生体に共通する寄生虫の代謝の生成物の他に、宿主のいくつかの成分を含む（Ｃ ＡＰＩ？ＯＮ　Ａ、など、（１）　、ＲＵＳＳＩ　Ｓ、など、（２）、ＢＥＮ、 ＩＳＭＡＥＬ　Ｒ，など、（３））。これは、誤った陽性反応の問題を引き起こ す、しかしながら、抗原５と命名される抗原を沈殿せしめる抗体のほとんど一定 した存在が免疫電気泳動技法により示された（ＣＡＰＲＯＮ　Ａ、など、（４） 及び（５））。それ以来、この試験は、抱土化のいづれか疫学的研究のための最 良の免疫学的参照試験の１つを残した。高い免疫原性である抗原５は、それが約 ６０ｋＤａの相対的分子ｉｔの、コンカナバリンＡに結合できる熱不安定性リポ タンパク質であることを示すいくつかの研究の対象を形成した（ＯＲＩＯＬ　Ｒ ，など。

（６）、ＢＯｌｌＴ　Ｄ、など、（７）、ＰＩＡＮ置ＬＩ　Ｍ、　（８））。還 元条件下で分析される場合、この抗原は３７及び２２ＤＫａの２つのサブユニッ トに分解する。より敏感な技法、たとえばＥＬＩＳＡを用いれば、精製された抗 原５の診断能力が十分に確かめられた。抗−抗原５抗体はまた、Ｅ、マルチロキ ュラリス（Ｅ、−ｕｌｔｉ　Ｉｏｃｕｌａｒｉｓ）又は他の条虫類、たとえば　 エニア　ヒダチゲナ（ｂμ＋ｉａ　ｈ　ｄａｔｉ　ｅｎａ　）　、Ｔ、　：ｔヒ ス（Ｔ、ｏｖｉｓ）及びＴ、ツリウム（Ｔ、ｓｏｌｉｕｍ）により感染された患 者又は動物の血清に検出された。しかしながら、それらのレベルは低いままであ った。これらの少ない観察された誤った陽性反応は、抗原５上でのホスホリルコ リンエピトープの存在に一部寄与されて来た。

現在の問題は、診断試験のために十分に標準化され、そして十分な量で存在する 特異的寄生抗原を随意に有することができることである。これは、研究が現在、 抱土化に対して行なわれ、そしてモノクローナル抗体に基づかれ、並びに遺伝子 工学的技法が高い程度の特異性を有する寄生成分を単離し、そして同定すること に努めている観点である。

本発明の目的は色土化に対して特異的な寄生抗原を供給することである。

本発明者は、抗原５により担持されるタンパク質エピトープに対して向けられ、 そして−乳、」４う三Ｑｓ　Ｏ竺ノ、に対して特異的な、ＥＧ　０２１５４／１ ２として命名されたＩｇＧ、イソタイプモノクローナル抗体を特徴づけた。

このモノクローナル抗体は、Ｅｒうニーｘ　Ｏ’＋ノヨ前Ｈ’ｔｆダムシの■Ｒ ＮＡから得られる相補的ＤＮＡライブラリィ−から、モノクローナル抗体ＥＧ　 ０２１５４／１２により認識されることが示されたペプチド配列に相当する、Ｅ ｇ６及び８ｇ１４と命名されたクローンを単離することを可能にした。

本発明の目的は１．互ｌコ仁ツ：コ１スー二乙ラニミと−ａ竺ノ、の抗原５の免 疫原性ペプチド配列であり、それは宿生化を有する患者の血清により、及びＮｏ 、　１−９５７として１９９０年６月２５日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリド ーマＥＧ　０２１５４／１２により生成されるｒｇｃ、イソタイプモノクローナ ル抗体により認識されることを特徴とする。

本発明の目的はまた、５ｇ６として命名される下記ヌクレオチド配列を含んで成 るＤＮＡ配列でもある： 本発明の目的はまた、下記配列のすべて又は一部及び１又はｆｆｌ数のアミノ酸 によりそれらとは異なり、そして類似する免疫原性活性を有する配列を含んで成 る、上記ヌクレオチド配列によりコードされる、ペプチド配列εｇ６として命名 される、Ｅ、ゲラニューロサスの抗原５の免疫原性ペプチド配列でもある：Ｇｌ ｕＰｈｅＶａ１人１ｐｆｌｅＡｓｎ工１ｅＡｌａ５ｅｒＬｙｓＶａｌ入１ａＡｓ ｐＡ１ａＰｈｅＧ１ｒ＋ＬｙｓＡｇｎＬｙｓＧｌｕＬｙｓ工Ｌ＠ＴｈｒＴｈｒＴ ｈｒＡｓｐＬｙｓＬｅｕＧ１ｙＴｈｒ入１ａＬｅｕＧｌｕＧ１ｎＶａｌＡｌａＳ ｅｒＧ１ｎＳｅｒにＬｕ１、ｙｇλ１ａ入１ａＰｒｏＧｌｎムｅｕｓｅｒＬｙｓ ＭＥ工ｔ、ｅｕＴｈｒＧｌｕＡｌａｓｅｒλ５ｐｖａｌ）Ｉｉ濁ＧｌｎＡｒａｄ 夏！Ａ１ａＴｈｒ入１ａＡｒｇＬｙｓＡｇｎＰｈ＠λｍｎ５ｅｒＧ１ｕｌ／ａｌ Ａｊｎ？ｈｒτｈｒＰｈ＠１１ｇＧｌｕＡｎｐムーＵムｙｇ入ｍｎＰｈｅム＠Ｉ ＩＡｊｌｎ？ｈｒ？ｈｒ！ａ＠ｕＳ　−ｒＧｌｕＡｌａＧＬｆｌＬ７１１Ａｌ＆ Ｌ７１１丁ｈｒＬ＋ｙｓム瘤ｕＧｌｕＧPｕＶａｌ 入ｔｉｌｌ＠ｕ＾７１ｐ１４１ＪＡｊｐ５＠ｒＡｊｌｐムｙｓτｈｒＬｙｓムｍ ｕムｙｓ入１ｎ入１ａＬｙｇＴｈｒ入１ａＧｌｕにＬｎＬｙ■ 入１ａＬｙｓＴｒｐＧｌｕ入１ａＧ１ｕＶａｌ入ｒｇムＹ３入ｓｐＧ１ｕｇｓｒ ＡｇｐＰｈ＊Ａｇｐ入ｒｇＶａｌ！ｉｉｇＧｌｎＧ１ｕ＄＠ｒＬａｕＴｈｒｘｌ ＠ＰｔｓｅＧ１ｕＬｙｇＴｈｒＣｙ−ムｙｓＧｌｕＦｈ＊クローンＥｇ６の配列 から、その配列がそれぞれ、アミノ酸１〜２５゜１２〜３４．２２〜４４．３５ 〜４８．４１〜６３．４６〜６５．６０〜９１．６６〜９６．８９〜１２２、　 ９３〜１１５．　９８〜１２９．１１８〜１５２及び１３０〜１５２に対応し、 そして下記の通りである１３価のペプチドの合成を予想することが可能ＩＴＴ’ ｒＤＫＬＧＴＡＬＥＱＶＡＳＱＳＥＫＡＡＰＶＡＳＱＳＥＫＡＡＰＱＬＳＫ ＫＡＡＰＱＬＳＫＭＬＴＥＡＳＤＶＨＱＲＭｋＴＡＩ、ＳＫＭＬＴＥＡＳＤＶＨ ＱＲＭＡＴＡＲＫＥＥＶＲＬＤＬＩ）ＳＤＫＴＫＩ５ＡＫＴＡＥＱＫＡＫＷＥＡ ＥＶＲＫＥＱＫＡＫＷＥＡＥＶＲＫＤＥＳＤＥ”ＤＲ■ＱＥＳＬＴＸＹＥＫＴＣ ＫＸＴＫＤＥＳＤＦ’ＤＲＶＨＱＥＳＩ、ＴＩＦＥＫＴＣＫＥＦ下記配列８９〜 １２２が特に好ましい：ＥＡＱＫＡＫＴＫＬＥＥＶＲＬＤ［Ｊ）ＳＤＫＴＫＬＫ ＮＡＫＴＡＥＯＫＡＫ８９／１２２と命名されたその対応するペプチドは、ヌク レオチド配列が下記の通りである、Ｅ−外因三λＺロサスのｃＤＮＡライブラリ ィ次構造（α−ヘリックス）に関して強い相同性を示すので特に好都ＧＡＡ　Ｔ ｒＣＡＴＴ　ＣＧ入　λ入Ｇ？入丁　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧｃ　λ入丁　ＡＡＡ 　ＧＧＣＡＡＧ　入ＴＣ入入ＣＴＴＧ　にＡＡ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　１０丁　Ｇ（ Ｔ　ＡＴＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡｅＣ ｌの０　１１＠　１２＠　１３＠ ＡＧＴ　ＡＧＡ　Ｇｅｅ　ＴＣ入　入’ｒＧ　入ＧＣ（Ｇλ　丁Ｇλ　入ＧＣＡ ＴＴ　τλλ　入入丁　τＡＴＧＡＧ　ＡＡＴ本発明のもう１つの目的はまた、 上記クローンＥｇ１４の配列を含ん活性を有する配列を含んで成る、Ｅｇ１４に よりコードされる巳、グ孟ニューロサスの抗原５の免疫原性ペプチド配列でもあ る：Ｅ　Ｆ　Ｘ　Ｆ、Ｋ　Ｙ　Ｄ　Ｋ　Ｇ　Ｎ　Ｋ　Ｇ　Ｋ　工　ＮＬＥＥＬＴ ＡＭＬＤＳＶＨＲＫＴ ＳＲ入　Ｓ　性　ＳＲ 本発明において、本発明者は最初に、次の操作により相補的ＤＮＡＥｇ６を得た ； −−二　−口　前駆サナダムシのＲＮＡの抽出、−メツセンジャーＲＮＡから一 本鎖の相補的ＤＮＡ、次に二本鎖の相補的ＤＮＡの生成、 一ベクター、たとえばバタテリオファージλｇｔＩｔ中への挿入、−ライブラリ ィ−のスクリーニング及び陽性＆ｌＩ換えクローンの選択、 一選択されたｃＤＮＡを増幅するためにそれのファージベクター中への移行、そ れの精製及びその配列決定の実施。

本発明のペプチド配列は、従来のペプチド合成により、ＡｐｐＩｉｅｄＢｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓの方法を用いることにより又は遺伝子工学技法の通用により得られ 、その方法は本発明のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の発現ベクター、た とえばプラスミド中への挿入、及びこの発現ベクターによる細胞の形質転換を含 んで成る。

本発明の目的はまた、本発明のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含んで成 るプラスミド及び発現ベクター、並びにこのベクターにより形質転換された宿主 にも間する。

本発明の目的はまた、ヒト又は動物起源の生物学的サンプルにおける上記のよう な免疫原性ペプチド配列に対して指図された抗体の表示により、ヒト又は動物に おける抱土化のインビトロ診断のだめの方法にも関し、ここでペプチド配列が、 前記抗体を含むことができるヒト又は動物起源の生物学的サンプルと接触せしめ られ、そして結合された抗体の存在が可視化される。

この方法は、ＲＩＡ、　ＲＩＰＡ又はＩＩｌ？ＩＡタイプの放射性免疫学的方法 、又はストリップ上でのｄＥＳＴＥＲＮ　ＢＬＯＴタイプ又はＥＬＩＳＡタイプ の免疫酵素方法に基づかれる。

本発明の目的はまた、上記方法を実施するための、抱土化のインビトロ診断のた めのキットにも関し、ここで前記キットは、上記のような少なくとも１つの免疫 原性ペプチド配列及びさらに、免疫グロブリンイソタイプに対して特異的な抗体 を含んで成る。

本発明の目的はまた、ヒト又は動物における抱土化の処置及び予防のために向け られたワクチンにも間し、ここでワクチン化物質は、上記のような免疫原性ペプ チド配列から成る。

免疫原性ペプチド配列とは異なって、ワクチンは免疫刺激性質を付与するアジュ バントを含むことができる。

使用され得るアジュバントは、無機塩、たとえば水酸化アルミニウム、疎水性化 合物又は界面活性剤、たとえば不完全フロインドアジュバント、スクアラン又は リポソーム、合成ポリヌクレオチド、微生物又は微生物の成分、たとえばムラブ チド（ｍｕｒａｂｕｔｉｄｅ）　、合成の人工的分子、たとえばイムチオール又 はレバミゾール、又はサイトカイン、たとえばα−１β−１及びＴ−インターフ ェロン又はインターロイキンを包含する。

本発明の目的はさらに、上記のような免疫原性ペプチド配列に対して向けられた モノクローナル抗体にも関する。

本発明のモノクローナル抗体は従来の技法に従って調製され得る。

このためには、ポリペプチドは、必要なら、カップリング剤、たとえばグルタル アルデヒド、カルボジイミド又はビス−ジアゾ化ベンジジンにより免疫原性物質 、たとえばラタヌヌアナトキシンに結合され得る。

本発明の目的を構成する、Ｎｏ、　１−９５７として１９９０年６月２５日にＣ ＮＣＨに寄託されたハイプリドーマＥＧ　０２１５４／１２から得られたＩｇＧ 。

サブクラスのモノクローナル抗体を付与することが特に好ましい。

次のことが下記により詳細に記載されるであろうニー抗体εＧ　０２１５４／１ ２の生成；一本発明のペプチド配列をコードするｃＤＮＡ　２ｇ６及びｃＤＮＡ 　Ｅｇ１４の生成、参照は添付図面に存在し、ここでニー図１はウサギ骨格筋ミ オシンのＨ鎖（Ａ）、及び組換えタンパクｆＥｇ６（Ｂ）及び８ｇ１４（Ｃ）の 疎水性基の分析の後（疎水性クラスター分析（ＨＣＩ））に得られる代表物を示 す。隣接する疎水性残基は輪により囲まれている。いくつかの残基は、記号：　 （Ｐ　（＊）、　Ｇ（◆）、ＴＣ口）、Ｓ（ロ））により示されている。２ｇ６ とＥｇ１４との間の地形学的単位の相同性は線形で示され；−図２はクローンＥ ｇ１４のアミノ酸配列とクローンＥｇ６のアミノ酸配列との間の相同性を示す。

同一のアミノ酸は星印により示され；−図３は水及びトリフルオロエタノール（ ＴＦＥ）におけるペプチド８９〜１２２の円二色性スペクトルを示し；−図４は 合成ペプチド８９−１２２による、融合タンパク質ＦＰ６　（Ａ）又は色土ノウ 胞流体（Ｂ）へのキノクローナル抗体εＧｏ−２１５４／１２（ｍＡｂ）及び抱 土化を有する患者のヒト血清（Ｅｇ）の結合の阻害の曲線を示し； Ｐ、ファルシバラム（ムハ旦並肛憇）による感染の肝段階の抗原に対応するペプ チド（ＬＳＡ）が対照として使用され；−図５はＥＬＩＳＡ試験において固相抗 原の形で使用される合成ペプチド８’９−１２２と種々のヒト血清のＩｇＧ−Ａ −Ｍとの反応性を示す。

この結果は、４種のヒト血清：抗−一乳一ヨ乙う三、と−ＯＪＪ−２１（Ｅｇ） 、抗−巳二二７）ｂｆｏ±１ヨトユノ＝（Ｅ、ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ） （Ｅｍ）　、抗−エニー図６は旦工ｌ旦三上二二ｉス（６ｇ）　、Ｅ、マルチロ キューリス（Ｅｍ）　、Ｔ　サギナタ（Ｔｓ）　、Ｓ、マンソニ（Ｓ、ｌ１ａｎ ｓｏｎｉ　）（ＳＴ＠）及びヱーユ土グ（Ｔｇ）により感染された患者の血清、 及び正常なヒト血清（ＮＯ３）のＩｇＧ−Ａ−Ｍとペプチド８９−１２２とのＥ ＬＴＳＡ試験における反応性の分布を示す。！（−−−）は対照（フランスにお ける生存する非暴露個人）の血清から得られた平均＋３種の標準偏差値を用いて 決定されたカットオフ線を表わし；−図７はＥ　ゲラニューロサス（Ｅｇ）　、 Ｅ、フルチロキュー１ス（Ｅｍ）及びニーＵ±９　（Ｓｍ）により感染された患 者の血清及び正常なヒト血清（ＮＯ３）のＥＬＩＳＡ試験におけるＴｇＥとペプ チド８９−１２２及び色土ノウ胞流体の抗原（生抗原）との反応性の分布を示し ；カット−オフ線（１０種の対照血清の平均±３種の標準偏差値）に対応する線 （−−−）上の値は陽性であると思われた。

■）モノクローナル抗体ＥＧ　０２１５４／１２の調製ＢＡＬＢ／ｃマウスを、 集め、４０．００Ｏｒｐｍで超遠心分離し、次に凍結乾燥し、そして不完全フロ インドアジュバント（Ｖ／Ｖ）に取られた、動物の肝臓及び肺から除去された色 土ノウ胞からの羊色土流体の無菌タンピングにより得られた抗原性調製物（Ｓｌ ｆＦ　Ａｇ）　１００μｇにより腹腔的免疫化した。

最後の注射の後、２週間で、追加免疫化を、塩溶液中、ＳＨＦ　Ａｇ抗原性調製 物１００μｇによりマウスに行なった。３日後、肺臓細胞を収穫し、そして次に 、ＧＡＬＦＲＥなと、（９）により記載される技法に従って、ポリエチレングリ コール（ＰＥＧ　１５００）において１７５の割合での５Ｐ２１０骨ｖｉ細胞に より融合した。細胞をマイクロ培養プレート上のウェルに分配し、そして融合さ れた細胞をＨＡＴ（ヒドロキサンチンアミノプテリンチミジン）培地において選 択した。ハイブリッド細胞の密な増殖を示す個々のウェルの培養上清液を、５） ＩＦ　Ａｇ抗原性調製物に対しで向けられた抗体の存在についてＥＬＩＳＡ方法 により試験した。

ＳＨＦ　Ａｇ抗原性調製物とＥＬＩＳＡ試験において陽性的に反応するいくつか のモノクローナル抗体の中から、ＩｇＧ＋サブクラス抗体を生成するハイブリッ ド細胞系（ＥＧ　０２１５４／１２）を選択した。全体のＳＨＦ抗原性調製物に 対して向けられたウサギ血清に比べると、モノクローナル抗体ＥＧ　０２１５４ ／１２は、−鳳一」乙う」仁ニーｏ丈ノ、により感染された患者のヒト色土血清 から定義されるように抗原５に対応する単一の沈殿系を免疫−電気泳動において 示した。

沈殿は、Ｅ　マルチロキュー■ス色土ノウ胞流体の抗原に間して観察されなかっ た。

陽性のウェルを制限希釈法によりクローン化した。ハイブリドーマ細胞が添加さ れたマウス腹水を、ａ酸アンモニウム沈殿、続くＴｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦＯ５ ゲル（ＬＫＢ、　５ｉｉｅｄｅｎ）上での′ｆ１過により分別した。モノクロー ナル抗体を０ＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（ＬＫＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）上でのイ オン交換クロマトグラフィーにより精製し、そしてＩ（１ｍＭのリン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ）に対して透析した。

Ｕ）相補的ＤＮＡの生成 ■、　血清の獲得 患者の血清を、色土症についての標本の免疫診断試験：免疫電気泳動（ｒＥＰ） 及び血球凝集試験にゆだねた。それらはＥ、ゲラニューロサス及びＥ　フルチロ キュー１スに対して特徴づけられる。　ｒＥＰにおけるａｒｃ５の存在は、旦工 ｌ土玉五二旦二五の診断のために決定的である。さらに、その診断は、医学的試 験及び手術及び／又は治療処１により確かめられる。

２、　寄生体の調製 寄生物質を羊から収穫する。色土ノウ胞をその動物の肝臓又は肺から除去し、そ して無菌的にタップする。前駆サナダムシを、集められた液体のデカントにより 調製する。沈降ペレットを取り、そして生理的流体により数度洗浄する。頭節（ 条虫類の）を、沈降の後、それぞれ回収する。次にそれらを最少体積の液体窒素 において直接凍結する。

３、−乳＝！−と三」二二ジヱノ、前駆サナダムシからのＩ？ＮＡの抽出全１？ ＮＡを、ＣＨＩＲｉＩＮ　Ｊ、など、　（１０）の技法の変法に従って畜生幼虫 から抽出する。液体窒素に貯蔵された旦−１立三五二旦並ス前駆サナダムシの調 製物を、４．２Ｍのグアニジウムチオシアネート、２％Ｎ−ラウロイルサルコシ ン、ＩＯ＋ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８）　、５％の２−メルカプトエタノール及び ２０ｄの酢酸ナトリウム（９Ｈ４，５＞　の溶液に取る前、手動的に粉砕する。

この調製物を均質化し、その後、音波処理し、そして１０．０００ｒｐｙｌで２ ０分間、遠心分離する（Ｓｏｒｖａ　］　］Ｉ−ローターＩＢ−４）。次にその 上清液を２１の塩化セシウム溶液（ＣａＣ］、密度−１，７２，ＬＯｄのＥＤＴ Ａ、　ｐＨ８、５０１１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５）のクンシッン上に置 く、その管を、２８．０００ｒｐｍで２０時間、２０℃で遠心分離する＜Ｂｅｃ ｋｍａｎ−ローター籏４１）０次にＦＩＮＡペレフトを水に取り、そして−２０ ℃で無水エタノールにより沈殿せしめる。

４、　ファージλｇｔｌｌベクターにおけるｃＤＮ＾ＤＮＡラリイーの調製旦− ｌ立王五二三ニス前駆サナダムシから抽出された全ＲＮＡ　３００μｇから出発 して、相補的ＤＮＡ鎖を、オリゴ−６丁プライマーにより逆転写酵素の作用を通 して合成する０次にそのＲＮＡをリボヌクレアーゼＨにより攻撃し、それを孔開 けする０次に残るＲＮＡ片は、Ｅ。

コリＲＮＡポリメラーゼＩの作用のための開始剤として作用し、結果的に、ｃＤ ＮＡの第２鎖を合成する。↑４　ＤＮＡポリメラーゼの最終相におけるその使用 は、プラント末端化された相補的ＤＮＡを創造するために、まだ−末鎖で存在す る部分の消化を可能にする。ｃＤＮＡの合成のために必要とされる手段及び試薬 は、ファージベクターにおけるクローニングのための酵素のように、Ａｍｅｒｓ ｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｔｏｎａｌ（”ｃＤＮＡ合成システム“キット）によ り供給される。次に、ｃＤＮＡのＥｃｏＲ１部位を、ＥｃｏＲＩメチラーゼの作 用を用いてメチル化により保護する。

配列５　’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’の脱リン酸化された二本鎖合成オリゴヌ クレオチド（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、Ｔ４　ＤＩ ＩＡリガーゼを用いてｃＤＮＡのプラント末端に結合する。次にその結合するセ グメントのＥｃｏＲ１部位をＥｃｏＲＩ消化により開放する。過剰の結合セグメ ントをカラムクロマトグラフィー　（Ａｍｅｒｓｈａ＋ｍ　Ｉｒ＋Ｌｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ）処理により除去する。このようにして調製されたｃＤＮＡを、Ｅｃ ｏＲＩ−消化された及び脱リン酸化された形でＰｒｏＩｓｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ ’により市販されているｇｅｎ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　５ｙ ｓｔｅｆｆｉ”　ｓｙｓｔｅｍ−Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）　、次にライ ブラリィ−を、ＹＯＬＩＮＧ　Ｒ，ａｎｄ　ＤＡＶＩＳ　Ｒ，（１２）により記 載されるようにして、Ｅ、コリ株Ｙ　１０９０の接種により試験する。

５、　ライブラリィ−のスクリーニング及び陽性組換えクローンの選択 ｇｔｌｌに８けるこのライブラリィ−のサンプルを、５Ｘ１０’〜８×１０’ｐ ｆｕ　（プラーク形成単位）／ベトリ皿（直径９０ｍｍ）の濃度でＥ。

コリ株Ｙ　１０９０中に接種する。タンパク質の発現はＩａｃプロモーターの制 御下で存在し、そしてＩＰＴＧ　（イソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノン ド）の添加により誘発され得る。ＩＰＴＧは、ペトリ皿上に１０ｍＭのＩＰＴ［ 、により含浸されたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉ−ｃｈｅｒ　ａ ｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を置くことによって添加される。合成されたタンパク質 はフィルター上に吸収され、次にそれを、ＰＢＳＩ衝液（リン酸緩衝溶液：　１ ０ｍＭのＮａｚＨＰＯａ＋　ｌ０ｍＭのＮａ１（ｚＰＯａ、　１５０ｍＭのＮａ Ｃ１）　に１　／１００の希釈度（４゛Ｃで一晩）で、ライブラリィ−のスクリ ーニングのために意図された、Ｅ、ゲラニューロサスにより感染された、吃音の ５種の血清の混合物と共にインキュベートする。血清を、それらの免疫電気泳動 特徴に基づいて選択した（従来のＩＥＰにおいてａｒｃ５を包含する３〜６のａ ｒｃ）。次に、フィルターを洗浄し、そして結合された抗体を、ペルオキシダー ゼ（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　１１５００）によりラベルされた 第２の抗−ヒト免疫グロブリン抗体（抗〜ＩｇＧ、Ａ、Ｍ）により認識し、そし て試薬４−クロロ−１−ナフトール（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）により可視化する。

ライブラリィ−を構成する１、５Ｘ１０−個の組換え体のうち、約５×１０Ｓ個 のファージを試験し二患者の血清の混合物により認識されるエピトープを担持す るタンパク質又はタンパク質画分を合成する１３のクローンを選択した。アガロ ースゲルにおける電気泳動分析は、それらの個々のためにｃＤＮＡ挿入体の大き さの測定を可能にした：クローン１　：　１３０ｂｐの挿入体、クローン２　： 　１３８ｂρ、クローン３：２１６ｂｐ、及び他の１０のクローンのためには、 ４５６ｂｐの挿入体。

ライブラリィ−の第２スクリーニングは、モノクローナル抗体ＥＧ　０２１５１ ／１４により認識されるエピトープを含むタンパク質又はタンパク質百分を合成 する１４番目のクローン（Ｅｇ１４）の単離を可能にした。アガロ−スゲルにお ける電気泳動分析は、ｃＤＮＡ挿入体が１３７ｂｐを含み、そして３７個のアミ ノ酸をコードするｇｔｌｌと整合して単一の読み取り枠を有することを示した。

６、　ハイプリダイゼーシジン試験 ベクターＭ　１３ｍｐ１８のＥｃｏＲ１部位中へのクローニングの後、クローン ６のｃＤＮＡ挿入体（Ｅｇ　６−４５６ｂｐ）を精製し、そしてハイブリダイゼ ーション試験においてプローブとして使用した。

すべてのバックグラウンドの問題を回避するために、プローブとして使用される ｃ（１？／Ａ挿入体を、ベクターＭ１３ｒａρ１８のＥｃｏＲ１部位にあらかじ め組込み、そして次に、Ｍ１３組換えクローンから精製した。

プローブ（６０〜８０ｎｇ）を調製し、そしてＦＥＩＮＢＥＲＧ　ａｎｄ　ＶＯ ＧＥＬＳＴＥＩＮ（１３）の技法を用いてＣ”ｐ）−ｄｃｔｐによりラベルした 。クローンを培養し、そして個々のクローンの個々の同定を伴って、液滴の形で 同しペトリ皿上に沈積した。次に、ＤＮＡを溶菌プラークから直接的に、ニトロ セルロース上に吸着し、そしてＭＡＳＯＮ　ａｎｄ　Ｗ（ＬＬＩＡＭＳ　（１４ ）の手段に従って調製した。

ハイブリダイゼーシヨンを、問題の５　Ｘ　１０’ｃｐｓのプローブを用いて、 ４２°Ｃで、ＷＡＩＬなど、（１５）により記載される条件に従って行なった。

洗浄を、Ｑ、　ｌ　Ｘ　ＳＳＣ緩衝液、０．１％の５０５　（ＳＳＣＸ２０　： 　３　ＭのＮａＣ１、クエン酸ナトリウム・２ＨｔＯ、ｐＨ７に調整されてむ） る）により６５°Ｃで、高い緊縮条件下で行ない、ここでこれは最つとも厳格な 相同性について試験するために行なわれる。

シグナルは、クローン１．２及び３に対しては示されず、これは、後者が挿入体 ６とは異なる配列を有することを示唆する。対照的に、クローン４〜１３は、問 題のプローブとハイブリダイズすることが見出され、これは、類似する配列を示 唆する。さらに、ヌクレオチド配列の分析は、クローン４〜１３の厳格な同一性 を確かめた。

７、　ヌクレオチド配列及び対応するタンパク質配列の決定クローンの全ファー ジＤＮＡを、阿＾ＮＩＡＴＩＳ　Ｔ、など、（１６）に記載される技法に従って 調製し、次にＥｃｏＲＩにより消化し、そして低溶融アガロースゲル上での電気 泳動により分析する。ｃＤＮＡ挿入体をホットフェノール技法により抽出する０ 次に、それらをファージベクタＭ１３ｍｐ１８　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ）に組込む、ｌエユ悲株ＴＧＩの形質転換の後、組換えベク ターの一本鎖鋳型を調製する。その配列決定技法は、５ＡＮＧＥＲＰ、など、（ １７）により記載されるような及び発光プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結原理に基づかれる。ＤＮ Ａフラグメントの螢光を３７０ＡＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の自動配列決定機により検出し、そして従って、そ のヌクレオチド配列を、ＳＭＩＴＨＬ、など、　（１８）により記載されるよう にして決定する。次に、その対応するタンパク質配列をコンピューター分析（Ｐ ＣＧｅｎｅソフトウェア−）により推定する。その配列相同性を、Ｓｉ＋１ｓｓ ｐｒｏｔ　（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のコンピューター及び鑑定及びＮＢＲＦ 　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｇｄａ− ｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，）データベースにより試験する。

Ｅ、ゲラニューロサスのクローン６のｃＤＮＡ挿入体をファージベクターＭ　１ ３ｍｐ１８中にサブクローンし、そしてそのヌクレオチド配列を決定した（４５ ６ｂρ）、その５′及び３′末端はたぶん、ｃＤＮＡメチル化反応の間、保護さ れていない内部ＥｃｏＲ１部位に対応し、ここで結合セグメントの配列は見出さ れていない、単一の読み取り枠がλベクターに整合して検出され、これは計算さ れた分子量１７．３ｋＤａのポリペプチド鎖に対応する。その核酸及びタンパク 質配列が上記に示されている。コンピューター分析は、問題のペプチドのα−ら せん状（９０％以上の程度）の二次構造体を示す、アミノ酸７２及び８４上に存 在するグリコジル化部位が見出された。配列相同性を、データベースの鑑定によ り試験した。最高程度の相同性（１１７ＡＡのうち２０％）を、ウサギ骨格筋ミ オシンのＨ鎖（ＡＡ１００〜２１６）及びウサギ心筋ミオシンのＨ鎖ｂ　（ＡＡ ５０８〜６２０）に比較することにより得た。

Ｅ、ゲラニューロサスのクローン１４のｃＤＮＡ挿入体をサブクローンし、そし てクローン６のために使用される方法と厳格に同一である方法に従って配列決定 した。

８、溶加性構造体−融合タンパク質の発現溶加性構造体を、ＹＯＵＮＧ　１１． 　＆　ＤＡＶＩＥＳ（１２）　ニより記載されるようにしてＥ、コリ株Ｙ１０８ ３細菌を問題のクローンの５倍もの多くのｇｔｌｌファージにより感染すること によって得る。この細菌株は、ＩＰＴＧが培地中に導入されるまで、融合タンパ ク質の発現を阻害するＩａｃリプレνサ−（Ｉａｃ　Ｉ遺伝子生成物）を有する 。さらに、ファージに溶加性相を得ることが、その特ｆｆ１（ｈｆｌＡ　１５０ （高頻度の溶加性）−５ｕｐｌ”　）により可能にされる。温厚性コロニーを、 感温性のそれらの特＠（ファージのリプレッサーは４２°Ｃで非機能的になる） について選択する。融合タンパク質を含む細菌溶解物を、ＨｌｌＹＮＴＨＴ。

など、　（１９）により記載される手段に従って調製する。

クローン６のための１１換え温厚性コロニーの選択の後、融合タンパク質の発現 を誘発し、そして溶加性抽出物を調製した。ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル分 析は、実際、１５２−　ＡＡポリペプチドとβ−ガラクトシダーゼとの融合体の 予想される分子量に対応する、問題の融合タンパク質のために１３３ｋＤａの見 掛分子量を示した。

９、　５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノフ゛口・ント溶加性 抽出物を、３％濃縮ゲル及び７％分離ゲルを用いて還元条件下で、ＬＡＥＭＭＬ ｒ　Ｕ、（２１）により記載される条件に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル上で分析する。ゲルを、電気泳動の後、クーマシーブルーにより染色し、又は ＴＯＷＢｒＮなど、　（２０）の条件に従ってエレクトロトランスファーにゆだ ねる。３％ミルク／ＰＢＳによる飽和の後、ニトロセルロースを、一旦、二乙立 三、と二Ｃ１＋２１及びＥ、マルチ旦土王ｉユ久により感染された患者の血清及 び１％ミルり／ＰＢＳと共に４°Ｃで一晩インキユベートする。洗浄の後、ペル オキシダーゼによりラベルされた第２特異的抗体をインキュベートする（Ｐａｓ ｔｅｕｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ−抗−ヒトｒｇ　１１５００−抗一マウスＩｇＧ 　１１５００）、可視化を、ライブラリィ−のスクリーニングのために、前記７ に記載されるのと同じ条件下で行なう、モノクローナル抗体ＥＧ　０２１５４／ １２を、免疫グロブリン濃度に従って１１５０〜１　／１００に希釈する。血清 は、旦−ユ丈タンパク質の全抽出物及び精製されたｂ−力゛ラクトシダーゼ（Ｓ ｉｇｍａ）の溶液と共にバンクグラウンドを滅しるために前もって常にインキュ ベートされる。

一部のタンパク質分解性劣化がそれらの試験におし葛で観察された。

１４人のヒト抗−Ｅ　−ニューロ　ス血清のうち１１人の血清（試験される血清 の８０％に等しい）が、組換え１３３　ｋＤａのタン）＜り質並びに、たぶん劣 化生成物に対応する８１ｋＤａのもう１つの分子を認識する。　１０４ｋＤａの 第２バンドがまた、一層弱く可視化された。同じフイツトが、−乳一二？ＪＬｔ ｆＯ先上」Ｌ男ノー感染の血清のうち９人の血清力）ら検出された。

続いて、融合タンパク質の免疫反応性を、抗原５　、ＥＧ　０２１５４／１２に 対するモノクローナル抗体に関して分析した。この抗体番よ、１３３　ｋＤａの 組換えタンパク質ＦＰ６及びまた、１０４ｋＤａ及び８１ｋＤａの２種の他の分 子（初めのタンパク質の劣化生成物）の認識を示した。

同じ条件下で分析すると、抗原５（１つのａｒｃ＝　ａｒｃ５　）に対してＩＥ Ｐにおいて特異的なヒト血清は同様に、１３３．１０４及び８１ｋＤａのｔｓｌ ンドを認識した。他方、モノクローナル抗体ＥＧ　０２１５４／１２及び感染の 血清を、Ｅ　コリ及び精製されたβ−ガラクトシダーゼのタンパク質成分に関し て試験し、そして劣化生成物又は融合タン、＜り質に対応する分子質量のいづれ のバンドも可視化されな力１つだ。

１０、ペプチドの合成 ペプチドを、ヘンズヒドリルアミン型樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）上でＢＯＣ−ＴＦＡ　（ブトキシ−カルボニル−トリフルオロアセテート ）手段に従って、自動ペプチド合成装ｆ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＊ ｓモデル４３０ａ、　Ｆｅ５ｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、　ＣＡ）で断続的面相法（２２ ）に従って合成した。

三官能アミノ酸を、次の態様で保護した：　Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ａｓｐ（ＯＢ ｚｌ）。

Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、　Ｌｙｓ（２−ＣＩＺ（クロロベンジルオキシカルボニル （０８２１）。ＤＭＦ中、対称無水物による活性化に続いて（１回のカップリン グ）、アミノ酸を導入した。但し、ｏｃｃ／ＨＯＢｔ　（ジシクロカルボジイミ ド／ブタノール）活性化手段を用いて導入されるＧＩｎの場合除く、ペプチジル 樹脂の最終保護解除及び切断は、高いＨＦ含有率の方法に従って、０°Ｃで１時 間行なわれた。保護解除され、切断されたペプチドが、冷ジエチルエーテルによ り沈殿せしめられ、次に１００°Ｃで酢酸に溶解され、そして凍結乾燥せしめら れた。粗ペプチドを、ゲル濾過（ＴＳＫ　Ｈ縁４０５．　ＭＥＲＣＫ）により精 製し、続いて、２１／ｍ１１の流速で、緩衝液ＡＩ（水中、０．０５％のトリフ ルオロ酢酸）〜６０％の緩衝液Ｂｌ（０，０５％のトリフルオロ酢酸／７５％の アセトニトリル／２５％の水）の高分解グラジェントを用いて、Ｎｕｃｌｅｏｓ ｉｌ　Ｃ１８＋３００人、５．５．カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ　Ｎａｇｅｌ）（ １２，７ｍｍＸ５００ｍｍ）上で３時間にわたって逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ ィー処理した。ペプチドの塩酸塩形を、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃｌ８．３００人 、５μカラム（１２，７１１１ｍＸ７５＋ｗｍ）上で緩衝液Ａ２（ｐＨ３、水中 、）ＩｃＩ）〜緩衝液Ｂ　２　（ｐＨ３，５０％ＨＣｌ１５０％イソプロパツー ル）の段階的グラジェントを用いて得た。ペプチドを、逆相分析ＨＰｔ、Ｃによ りそれらの相同性について、及びアミノ酸分析及び分子質量の決定によりそれら の同一性について分析した。

らせん状構成は、長いペプチドにより適切に模倣され得る（Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓ ｅなど、　（２４））。

２ｇ６及びＥｇ１４ｆ７）配列を、ＬＥＭＥＳＬＥ−ＶＡＲＯＯＴ　（２３）に より記載される疎水性クラスター分析技法を用いて表わした（図ＩＢ、ＩＣ）、 この技法、及び２次構造体を示すための他の従来の技法は、らせん状バンドの形 での構成を示す。そのらせん状バンドにそっての疎水性基の縦分布は、ウサギ骨 格筋ミオシンのＨ鎖の構造のようなコイル巻きされたらせん状構造を強く暗示す る（図ＩＡ）。

それらの通常の構造性質の他に、クローンＥｇ１４及び２ｇ６は、限定された配 列相同性を示す（図２）。しかしながら、図での表示において、それらの断続的 な配列相同性は、ＥＧ　０２１５４／１２により観察される交叉反応性を説明で きる両フラグメント上に存在する地形学的単位を形成する。さらに、それらの相 同構造体における極性又は荷電された残基の高い割合は、生来の抗原の優先的に 暴露された領域におけるそれらの存在を示す。

従って、本発明者は、アミノ酸８９〜アミノ酸１２２のクローンＥｇ６の配列を 再生しく図２）、そしてそれらの２つの相同単位を一緒にする（図ＩＢ）、３４ 個のアミノ酸のペプチドを選択し、そして合成した。８９−１２２と命名された このペプチドの末端とへワックスの二極との間に安定する電荷相互作用を導入す るために、それらはＮ−末端で負に荷電されたグルタミン酸残基及びＣ−末端で 正に荷電されたりシン残基を導入した。

１１、円二色性（ＣＤ）の研究 ＣＤスベクトルを、室温でＲＯＵＳＳＥＬ　ＪＯＵＡＮ　１８５　モデル■装置 に基づいて記録した。ペプチド濃度を、完全な酸加水分解の後、定量的なアミノ 酸分析により原溶液から調整した。　ＣＤ研究は、０．１−の光学路の長さを伴 って、２００ｍＭのＮａＣｌ中、１ｈＨの濃度で、又は１ｍｓの光学路の長さを 伴って、１ｓＭのトリフルオロエタノール中、１膳りの濃度で、ペプチドの塩酸 塩形に対して行なわれた。そのＣＤ結果は、ｄｅｇ−ｄｗｏｌ−’・ｃｍ”で表 わされる残基（θ）の平均的ならせん構造で表わされた。そのらせん含有率は、 １００％のらせん構造に関して（θ）２２２＝　３５．７００　ｄｅｇ−ｄ＋ｍ ｏｌ−’　・ｃｍ”を取って、ＣＤスヘクト／Ｌ／から計夏された。

ペプチドのらせん構成を、水溶液又はトリフルオロエタノールの水溶液において 室温で行なわれる円二色研究により確証した０図３に示される結果は、両スペク トルが、２０２　２０７ｎｍ及び２２２−２２３ｎｍで最少値及び２９０ｎｍ近 くで正の値を体って、らせん構成の特徴を存することを示す。１００％のらせん 構造のためにθ２□２−−３５．７００ｄｅｇ−ｃｆｆｉ”　／　ｄｍｏｌを取 る場合、水溶液における１４％のらせん割合及び水性トリフルオロエタノールに おける７４％のらせん割合が見出された。

１２、ＥＬＩＳＡ及び阻害試験 プレー）　（Ｎｕｎｃ）を、５μｇ／ｎ＋］のタンパク質の割合での色土ノウ胞 流体又は細菌抽出物（？８原体（ＦＰ６））のＡｇ　１００μｌにより被覆した 。ヒト血清を１　／１００の希釈度で使用し、そして結合された抗体を、Ｉ（Ｒ Ｐ　（ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＤＩＡＧ〜０５ＴＩＣ５ＰＡＳＴ ＥＵＲ）により接合される抗−ヒト１ｇＧ−Ａ−Ｍを用いて検出した。

ヒト血清又は抗体ＥＧ　０２１５４／１２を、異なった濃度の合成ペプチドと共 に４°Ｃで一晩、ブレインキュベートした。ＴｇＥによるＥＩｊＳＡ試験を、リ ン酸緩衝溶液において１／１０に希釈されたヒト血清により行ない、そしてペプ チド８９／１２２をウェル当り１μｇの割合で広げた。マウス抗−（ヒト［ｇＥ ）　ＩｇＧ＋を５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏ−ｃ ｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、（ＢｒｒＩｘｉｎｇｈａｔｍ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇ ｄｏｍ）から得た。得られた値（平均又はダブレット）は、４９２ｎｍでの光学 密度（ＯＤ）±標準偏差（ＳＤ）として表わされた。

色土化の診断においてペプチドＥｇ６により得られた結果が下記に与えられる。

ＰＶＣマイクロプレートに直接的に結合される２ｇ６のペプチド８９−１２２は 、下記表Ｉにおける光学密度の測定により示されるように、モノクローナル抗体 εＧ　０２１５４／１２Ｃより、並びにＥ、グラニュー二二スにより感染された 患者の血清によりＥＬＩＳＡ試験において十分に認識される。良好な相互関係が 、抗体による融合タンパク質ＦＲ６の認識とペプチドＥｇ６へのそれらの結合と の間で得られた。

犬−一り 正常なヒト血清（ｎ＝　５　）　０．２２　０．０７さらに、モノクローナル抗 体ＥＧ　０２１５４／１２及び色土化を有する患者のヒト血清のタンパクｔＦＰ 　６又は色土ノウ胞流体の抗原に対する結合におけるこのペプチドの阻害力を、 ＥＬＩＳＡ試験で測定した。

［Ｕ４Ａに示されるように、モノクローナル抗体（８０％）及び色土化を有する 患者のヒト血清（６０％）のタンパク質ＳＰ６への結合の実質的な阻害はベプチ ｌ″８９−１２２により得られた。このペプチドはまた、それぞれ色土ノウ胞流 体の抗原へのそれらの抗体の結合を有意に阻害することができる（６５及び４５ ％、図４Ｂ）。その結合の阻害は、色土化を有する患者のヒト血清のためにより もモノクローナル抗体のためにより効果的である。ヱーヱエ及２パ立人（ｈハ旦 並肛憇）（２７）による感染の肝性段階に対応するらせん形（４１個のアミノ酸 ）を形成する末関係の合成ペプチド（２６）に関しては、有意な阻害は観察され ない。

これらの結果は、ペプチド８９−１２２が、モノクローナル抗体ＥＧ０２１５４ ／１２及び色土化を有する患者のヒト血清により特異的に認識される結合部位を 模倣することができることを示唆する。

結合された抗原として使用されるペプチド８９−１２２に関して、Ｌ−グｊ三と 工！ヨ又は他の寄生体により感染された患者の血清の反応性がまた、εＩＪｓＡ 試験により測定された。

異なった希釈度の血清を用いれば、抗体への有意な結合が、図５に示されるよう に、抗−一鳳一！−ムミに一一並ノヨ血清に５１でノミ化じることが観察される 。抗−Ｅ　マル千ロキューＩス、抗−Ｔ　サ玉±叉及び抗−３マンソニ血清の結 合のレベルは、正常なヒト血清により得られる値よりも低かった。

末関係の合成ペプチドに関する試験においては、これらの血清は類似する応答レ ベルを示した。

ＥＬＩＳＡ試験をまた、ペプチド８２−１２２の免疫診断値を示すために行なっ た。２種のタイプのヒト抗体（ＩｇＧ−Ａ−Ｍ及びＩｇ−Ｅ）応答が分析された 。定義された１塵の正の値、すなわち対照グループから得られた平均値以上の３ 種の標準偏差値を用いれば、高怒度の結合（８５％）及び良好な特異性（８６％ ）がＩｇＧ−Ａ−Ｍ応答において観察される（図６）、これらの結果を、ＦＰ６ に関するウェスターンプロットで得られた結果と比較し、そして特異性の改良が 観察され、これは、色土化の診断において特別に好都合な８９−１２２を示す。

その結果は、下記表■に示される。

表−−１ 肺胞の色土症　４（２８，５）　２（１４）　０．４二〇、１４　０（０）　− 表に示されるように、ペプチド８９〜１２２に間してのｒｇＥ応答は、Ｅ、ゲラ ニューロサスにより感染された患者に関して高い特異性（１００％）を示す、ｒ ｇＥタイプの反応性は、他の寄生体疾患を存する患者から得られた５２の血清に 関しては検出され得す、そして色土化を有する患者のヒト血清の６０％（２４／ ４０）は、ＩｇＥ　−ＥＬＩＳＡ試験において陽性であることがわかった。末関 係の合成ペプチド（ＬＳＡ）に関して行なわれた対照試験は、２回のＥＬＩＳＡ 試験において有意な活性を示さなかった。

この試験の感度及び特異性を、色土体流体の全抗原により行なわれたＥＬＩＳＡ 　−１ｇ　Ｅ試験と比較した（図７）。ペプチド８９−１２２に関するＩｇＥの 反応性は、旦−１±三五二三二五に対してより特異的（１００％）であるように 思われ、そして条虫により感染された血清の３２％（６／１９）が色土ノウ胞流 体の抗原との交叉反応を示した。４０のうち２９のＩｇＥ抗体（−Ａｍ」乙旦三 仁と二〇＋Ｘにより感染された患者の７２％）は、色土体流体の抗原と反応した 。ペプチド８９−１２２により観察されるεＬＩＳＡ−１ｇＥの感度（６０％） は、生来の色土体抗原により得られた感度に比較して高い。

アミノ　についてのｆ′ Ｄ　Ａｓ２　アスパラギン酸 Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｙ　Ｔｙｒ　チロシン 又−一」跋 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉａｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１２．１０６１０６１Ｂｉｏ ｌｏ　１Ｂ、３５フ フーＢｏｕｔ　Ｄ、、Ｆｒｕｉｔ　Ｊ、、Ｃａｐｒｏｎ入’＋　（１９７４）Ｐ ｕｒ土ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｄ’ｕｎＪｌｎｔｉφｂｎａ　５ｐ６ｃｉｆｉｑｕｅ 　ｄｕ　１ｉｑｕｉｄｅ　ｈｙｄａｔｉｑｕｅ、（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏ ｆ　ａｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　ｈｙｄａｔｉｄ　ｆｌｕ ｉｄ、）　Ａｎｎａユａｙｓ　ｄｅ１’ｉｎｍｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｓｔｅｏｒ　 （−１川ｏ１ｏｇｙ）　１２５Ｃ，７７５８−　ｐｉａｎｔｅｌｌ工Ｍ、　、　 Ｐｏｚｚｕｏｌｉ、　Ｒ−、Ａｒｒｕ　Ｅ、　、　ＭｕｓＬａｎｉ　Ｐ、（１９ ７７）０　Ｂ　：　工ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　 ｏｆｍａｊｏｒ　ａｎｔｉｇ＊ｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｘＭｎｕｎｏｌｏ ｇｙ　１１９．１３８２９　−　Ｇ＋ａｌｆｒ＠Ｂ、に、、Ｈｏｗ　Ｓ、Ｃ＋、 Ｍｉｌｇｔｅｉｎ　Ｃ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ　Ｇ、！−。

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Ｓｃｉ　ＵＳＡ８０，１１９４−１１９８１２　−　ＹＯＵＮＧ　Ｒ，ｌ　＆　 ＤＡＶＴＳ　Ｒ，Ｗ、（ユ９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２．　７７８−７８２ １３−ＰＨ工ＮＢｆｆｉＲＧ　Ａ、Ｐ、＆　ＶＯＧＥＬＳＴＥ工Ｎ　Ｂ−（１９ ８３）　Ａｎｎ、Ｂ工ｏｃｈａｃ＋ｔＤ２，６−１３ １４　−　ＭＡｓＯＮ　Ｐ−Ｊ、ｂ　ｗＸＬＬＬすＳＪ、Ｇ、（１９８５）　工 ｎ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｂｄ、　Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍ ｅｓ＆　Ｓ、１＋Ｈ工ｇｇｉｎａ　、工ＲＬ　Ｐｙ：ｅｓｓ、　１１ト１５−　 Ｗａｎ、　Ｇ、Ｍ、　、　ｉｓＴ’！Ｒｊｆ　Ｍ、　≦５ＴＪＲＫＧ　Ｒ，（１ ９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６（８）、３６８３−３６８７１６−　）ＱＮＩ ＡＴ工Ｓ　Ｔ、、　Ｆ［ＴＳ（ＪＩ　Ｅ、Ｆ−＆　ＳＡＭＢ紅）ＯＫ　Ｊ、（１ ９８２）　Ｘｎ：Ｍｏ１ｅｃｕ１．ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｌｉｄ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、５４５　ｐ−１７−５ＡＮ（ＪＲＦ、、　ＮｘＣＸＬＪ Ｎ　ｓ、　＆　Ｃ０ｔＬＳＯＮ　Ａ、Ｒ，（１９７７）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　（１２）　５４６３−５４６７１ Ｂ　−ＳＡＷ　Ｌ、！、　、　隨即ＥＲ８Ｊ、　ＺＪ、　ＫＡＩＳＥＲＲ，Ｊ、 　、　Ｅ１１７ＧＥｉｌｌ！Ｓ　Ｐ、　。

ＤＯＯＮ　Ｃ，、Ｃｏ！０ｆＫＬ　Ｃ，Ｒ，、ＤＩＮＥＲＣ，、ＫＥＩＩＴ　Ｓ 、Ｂ、１（、＆　Ｈ■Ｄ　ＬＪ。

（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．　６フ４−６７９１９−　ｆｍｎｌＨ’ Ｉ’、Ｖ、、ＹＯＤＮＧ　Ｒ−Ａ、＆　ＤＡ７！Ｓ　Ｒ，Ｗ、（１９Ｅ１５）　 Ｉｎｓ　ＤＭＡＤ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、工ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄｔｉ ｏｒｕｔ、ＰｒｏｃｅｅｄＬｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ ｄ値つｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）　７６、４３５０ ２１−　Ｌａ５ｒａａｌｉ　ｖ、ｘ＋（１９７０）　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　 ５Ｅｒｕｅｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅオソｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ、　ａｓｓｅｍｂ ｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｔｈ＠ｂａｃｔａｒｉｐｈａｇｅ　Ｔ４ ゜Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０ ８５：２１４９−２１５５ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＋　Ｂｉｏａｈｉ！ＩＬｉｅ、７２！５５５−５７４２６　 −　Ａｒｔｕｒｏ　ＬＯｎｄｏｎｏ　Ｊ、ｔ　Ｇｒａｓ−均■ｓｓ　Ｈｏ、Ｃ， ）辻冶ａｔ１Ａ−Ｔａｒｔａｒ　ａｎｄ　ｐ、Ｄｒｕｉｌｈｅ−１９９０−５ｅ ｃｏｎｄａｒｙ　ｇｔｒｕｃｔｕｒ＊　ａｎｄＪ、論ｕｎｏＬ、１４５＝　１５ ５７−１５６３２７　−　Ｇｕｅｒｉｎ　Ｃ，、Ｐ、　Ｄｒｕｉｌｈｅ、　Ｂ、 　Ｇａ１ｅｙ、　Ｊ、Ａ、　シｎｄｏｎｏ。

Ｊ、　ＰａｔａｒａｐｏｔｉＪＣｕｌ、　Ｒ−Ｌ、　Ｂａａｕｄｏ工ｎ、　Ａ、 　Ｔａｘｔａｘ、　Ｏ，Ｍａｒｃａｒｅａｕ−Ｐｕｉｊａユｏｎ　ａｎｄ　Ｇ− Ｌａｎｇｇｌａｙ、１９８７．　Ａ　ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅ−ｇｐｅｃ土ｆ土 Ｃく　ロ 寸１ ２００２１．０　２２０２３０２４０２５０″＆　（ｎｍ） ％阻害率 生　Ａ９　ペプチド 国際調査報告 ｌｍｍ−＋Ａｍｋ６Ｍｌｌａ、Ｐｅｆ７ＦＲ９１１０Ｏｓ６３フロントページの 続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　 ＺＮＡ　８６１９−４ＨＣ１２Ｎ　１５／１２ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０ −２Ｊ３３１５６９　Ａ　９０１５−２Ｊ ／／　Ｃ０７Ｋ　９９：００ （７２）発明者　ファコン、ブリジットフランス国、　６０２００　コンビーニ ュ、リュデュ　ドクトール　力ルメット　４ （７２）発明者　シャメク、ムスタファフランス国、　５９８００　リール、ブ ールバール　力ルメット　２ （７２）発明者　デス−、コレット フランス国、　５９２６２　サンシン　エン　メラントワ、アレ　デ　シンフォ リーヌ　７Ｉ （７２）発明者　カプロン、アンドレ フランス国、　５９１３３　ファレンパン、リュデュ　力ピテーヌ　ジャスミン 、５８ （７２）発明者　タルタル、アンドレ フランス国、　６２４９０　ビトリ一一エンーアルトワ、リュ　デュ　ムーラン 　（番地なし） （７２）発明者　グラ　マス、エレーヌフランス国、　５９７１０　メリニー、 リュ　デュ　ラ　口シエール、２９

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．エチノコーカス　グラニユーロサスの抗原５の免疫原性ペプチド配列であっ て、包虫化を有する愚者の血清により及びＮｏ．１−９５７として１９９０年６ 月２５日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ　ＥＧ０２　１５４／１２によ り生成されるＩｇＧ１インタイプモノクローナル抗体により認識されることを特 徴とする免疫原性ペプチド配列。
2. ２．下記配列のすべて又は一部： 【配列があります】 及び１又は複数のアミノ酸によりそれらとは異なり、そして類似する免疫原性活 性を有する配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の免疫原性ペプチド配列。
3. ３．下記配列： 【配列があります】 から選択された配列を含んで成る請求の範囲第２項記載の免疫原性ペプチド配列 。
4. ４．下記配列： 【配列があります】 から成ることを特徴とする請求の範囲第３項記載の免疫原性ペプチド配列。
5. ５．下記配列のすべて又は一部： 【配列があります】 及び１又は複数のアミノ酸によりそれらとは異なり、そして類似する免疫原性活 性を有する配列を含んで成ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の免疫原性 ペプチド配列。
6. ６．請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載のペプチド配列をコードするヌクレ オチド配列を含んで成るＤＮＡ配列。
7. ７．下記配列： 【配列があります】 を実質的に含んで成る、請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載のペプチド配列 をコードするＤＮＡ配列。
8. ８．下記配列： 【配列があります】 を実質的に含んで成る、請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載のペプチドをコ ードするＤＮＡ配列。
9. ９．請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載のペプチド配列をコードするＤＮＡ 配列を含んで成るプラスミド。
10. １０．請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載のペプチド配列をコードするＤＮ Ａ配列を含んで成る発現ベクター。
11. １１．請求の範囲第１０項記載のベクターにより形質転換された宿主。
12. １２．ヒト又は動物起原の生物学的サンプルにおける請求の範囲第１〜５のいづ れか１項記載の免疫原性ペプチド配列に対して指図された抗体の表示により、ヒ ト又は動物における包虫化のインビトロ診断のための方法であって、ここで前記 ペプチド配列が、前記抗体を含むことができるヒト又は動物起原の生物学的サン プルと接触せしめられ、そして結合された抗体の存在が可視化されることを特徴 とする方法。
13. １３．ＲＩＡ，ＲＩＰＡ又はＩＲＭＡタイプの放射性免疫学的方法、又はストリ ップ上での又はＥＬＩＳＡタイプのウェスターンブロットタイプの免疫酵素方法 から成ることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の診断方法。
14. １４．請求の範囲第１２又は１３項記載の方法で実施するために、包虫化のイン ビトロ診断のためのキットであって、請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の 少なくとも１つのペプチド配列を含んで成ることを特徴とするキット。
15. １５．さらに、免疫グロブリンインタイプに対して特異的な抗−抗体を含んで成 ることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の診断用キット。
16. １６．ヒト又は動物における包虫化の処置及び予防のためのワクチンであって、 ワクチン形成体が請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の免疫原性ペプチド配 列から成ることを特徴とするワクチン。
17. １７．請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の免疫原性ペプチド配列に対して 向けられたモノクローナル抗体。
18. １８．Ｎｏ．１−９５７として１９９０年６月２５日にＣＮＣＭに寄託されたハ イブリドーマＥＧ　０２　１５４／１２から得られることを特徴とする請求の範 囲第１７項記載のモノクローナル抗体。
19. １９．Ｎｏ．１−９５７として１９９０年６月２５日にＣＮＣＭに寄託された、 ＩｇＧ１タイプモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマＥＧ　０２　１５ ４／１２。