CN1450164A - 一种新型冠状病毒株及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物病毒领域，涉及冠状病毒的新毒株及其用途。本发明通过对确诊SARS病人的咽拭细胞培养，分离出新型冠状病毒，命名SARS冠状病毒复旦I株，经感染Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，本毒株，可以对可疑SARS病原变异进行比较，为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
Description
技术领域
本发明属微生物病毒领域，涉及新型冠状病毒的新毒株及其医药用途。
背景技术
2002年12月6日-2003年2月9日，我国广东省发现300余例不明原因的急性呼吸综合症，其中5例死亡。调查发现，该病主要波及病人的家庭成员和医务人员。流行于我国广东省的非典型肺炎，于2003年2月11日向全球报道。最初认为病原体可能是一种新现的禽类流感病毒，2003年2月19日，研究者从香港一儿童病例中分离出一种禽类流感病毒(H5N1)。该病毒与起源于鸟类的流感病毒相似，1997年曾在香港引起人群疾病爆发，但是其后的研究排除了这一病原学推断。2003年2月下旬，香港和越南爆发严重肺炎，被称为“严重急性呼吸道综合症”或者SARS。大约同时，中国报道在一个广东SARS死亡病例的组织中，通过电镜发现衣原体。这个发现同样没有得到其他国家实验室的支持。香港、德国和美国的实验室通过细胞分离培养、电镜检查、PCR检测特殊基因序列以及微阵列技术、间接荧光免疫抗体实验等，有关报道有，Drosten C，Gunther S，Preiser W，et al.Identification of a NovelCoronavirus in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome.N Engl J Med[early online release 2003 Apr 10].Available：(accessed 2003 April 29)；Ksiazek TG，Erdman D，Goldsmith CS，Zaki SR，Peret T，Emery S，et al.A novel coronavirusassociated with severe acute respiratory syndrome.N Engl J Med[early online release2003 Apr 10].Available；Peiris JSM，Lai ST，Poon LLM，Guan Y，Yam LYC，LimW，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.Lancet[early online release 2003 Apr 8].Available，发现一种新型冠状病毒是导致SARS的病原体。2003年4月16日在日内瓦会议上，世界卫生组织正式宣布以前从未在人类和动物中发现的新冠状病毒是SARS的病原。新病毒命名为SARS-CoV。SARS-CoV多数是具有放射状表面的颗粒物，直径为60-130nm。加拿大实验室和疾病控制中心公布了新冠状病毒的基因序列，Marra MA，Jones SJM，Astell CR，et al.The Genome Sequence of theSARS-Associated Coronavirus.Science 2003.Published online 1 May 2003；Rota PA，Oberste MS，Monroe SS，et al.Characterization of a Novel Coronavirus Associated with SevereAcute Respiratory Syndrome.Science 2003.Published online 1 May 2003，表明上述病毒不属于任何已知的冠状病毒株。此后不久，研究者陆续报道，引起SARS的病原新冠状病毒存在不同变异毒株。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒毒株，提供地区SARS病毒代表毒株，可以对可疑SARS病原变异进行比较。
本发明的另一目的是采用新型冠状病毒毒株制备SARS诊断试剂、抗SARS疫苗、药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物。
上海市于2003年3月上旬开始SARS的监控，由于当时对SARS的病原不明，本发明对SARS可疑病例进行了检验。本发明检测了流感病毒、禽类流感病毒、呼吸道合胞病毒与衣原体为主的病原学细胞培养、鉴定，对可疑SARS病例进行了诊断排除。本发明在最初的上海23例发热病例中，检测出了A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒以及肺炎球菌等病原体。通过对上海市第一例确诊SARS病例，患者李某，女，40岁，2003年3月27日发病，2003年3月31日诊断为SARS疑似病例，2003年3月31日采样，标本为咽试，2003年4月3日临床确诊SARS病例。
咽拭标本于2003年4月3日按本领域公知技术进行Vero E6细胞培养，2003年4月8日结果显示了细胞病变，分离出直径60-100nm的冠状病毒样颗粒，感染的Vero E6细胞和病人血清间接荧光抗体显示阳性，排除A型、B型流感病毒，呼吸道合胞病毒等病原体后，证实所分离的冠状病毒为新冠状病毒的变异毒株，於2003年6月6日保藏，命名SARS冠状病毒复旦I株(冠状病毒SARS-CoV-Fudan-I株)CGMCC NO.0942。
本发明采用的细胞系为本领域公知的Veroe E6细胞、HEP-2细胞。
本发明采用的单克隆抗体、第1抗体为确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，所用荧光标记第2抗体购自CHEMICON公司产品。
本发明通过下述方法进行分离、培养、鉴定。
1)病原体分离培养：咽拭标本经用青、链霉素、两性霉素处理后，接种Veroe E6细胞、HEP-2细胞，在CO2 33℃条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察，经培养5-7d后，病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。
2)间接免疫荧光：以分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO2 33℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干，冷藏备用。
结果显示，
(1)、标本感染Vero E6细胞，细胞有病变现象，将发生病变的细胞从培养瓶中取出，经Giemsa细胞染色，显微镜下见细胞发生融合，细胞核试验破碎，高尔基体形成的现象；标本感染HEP-2细胞，从相差显微镜下观察到细胞生长过程，细胞经培养见细胞从单个生长良好的状态形成网状，絮状相联。
(2)电镜负染病毒形态观察，感染细胞经培养5-7天后，蔗糖梯度超速离心，电镜负染观察，显示具有放射状表面的冠状病毒样颗粒(coronavirus-like particles)，直径在60-100nm。冠状病毒在细胞膜边缘的细胞质和粗糙的内质网网状组织的囊腔中。细胞外的颗粒堆积成簇，常沿着质膜表面分布。荧光染色呈阳性反应，病毒形态符合SARS-CoV。
(3)荧光抗体染色，标本感染的Vero E6细胞，经间接免疫荧光染色，见感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。
附图说明
图1为接种72小时发生病变的Vero E6细胞。
图2为72小时正常Vero E6细胞。
图3Giemsa细胞染色，其中可见融合的细胞。
图4电镜负染色可见冠状病毒样颗粒。
图5感染Vero E6细胞间接荧光染色呈阳性反应。
本发明从上海市首例确诊SARS患者分离、培养成功新型冠状病毒“SARS-CoV-Fudan-I株”，并且可被传代培养。所述确诊SARS患者病原学培养检测，排除了呼吸道常见的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒感染。
本发明提供的新型冠状病毒毒株冠状病毒复旦I株，为地区SARS病毒标准株，能确定病原，诊断SARS疾病，可以对可疑SARS病原变异进行比较，作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。为SARS诊断试剂制备、抗SARS疫苗的研究与生产、抗SARS药物的筛选、抗SARS病毒的消毒药物提供基础和依据。
具体实施方式
实施例1
取确诊的SARS病人咽拭标本，用青霉素50微克/毫升、链霉素50微克/毫升、两性霉素1微克/毫升处理后，分别接种Vero E6细胞、HEP-2细胞，在CO2 35℃条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察，经培养7天后，将病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察，可见到冠状病毒样颗粒其直径在60-100nm，病毒形态符合新型冠状病毒(SARS-CoV)。
实施例2
将分离感染病毒发生病变的Vero E6细胞制细胞片，细胞发生病变时，取出感染细胞滴片，放入CO2 35℃条件下培养，使细胞贴壁。取出玻片，以PBS漂洗，去除未贴壁的细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃ 30min，凉干。滴入1∶10稀释的来自确诊的SARS病人三周后的恢复期血清，放入温盒内37℃作用30min，用0.0lmol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。滴加荧光标记羊抗人IgG抗体，购自CHEMICON公司，放入温盒内37℃作用30min，用0.01mol/L pH7.2 PBS洗三次，吸去液体。经间接免疫荧光染色，可见到感染细胞边缘呈半月状着色，荧光明显。正常Vero E6细胞则无荧光着色细胞。表明病变的Vero E6细胞被感染病毒。上述方法能确定病原，诊断疾病，可作为SARS病原学诊断与SARS抗体诊断方法的金标准。
Claims (5)
1、一种新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株CGMCC NO.0942，其具有下述特征，
①感染细胞有病变，包括细胞发生融合，细胞核试验破碎，
高尔基体形成形成网状，絮状相联；
②病毒在细胞质和内质网组织囊腔中，细胞外颗粒成簇，沿
质膜表面分布；
③荧光染色呈阳性反应，电镜负染显示具有放射状表面的冠
状病毒样颗粒。
2、根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株，其特征是所述病毒株直径在60-100nm。
3、权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备SARS诊断试剂中的用途。
4、权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS疫苗中的用途。
5、权利要求1和2所述的新型冠状病毒SARS冠状病毒复旦I株在制备抗SARS病毒的消毒药物中的用途。
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