CN109402067A - 一株55型腺病毒及其制备的疫苗制品 - Google Patents
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Abstract
本发明“一株55型腺病毒及其制备的疫苗制品”，属于医药领域，其毒株编号为DW55‑C20，保藏号为CGMCC No.13790。该毒株培养制得的纯病毒液滴度可到7.8±0.5LgCCID50/ml。制成的含有辅料的剂型，其病毒含量不低于4.5LgCCID50/mL。制成的疫苗制剂，纯度高，免疫活性高，具有良好的应用前景；本发明还提供了上述疫苗的制备方法，以及高效腺病毒毒株的筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒疫苗技术，更具体地涉及一株55型腺病毒及其制备的疫苗制品。
技术背景
腺病毒是一种常见的呼吸道和消化道病原体，可以引起各种症状表现，常在军营和学校爆发流行。在美国军队，腺病毒引起的急性发热呼吸道感染是一个重要的死亡原因。在健康的新兵中，超过50％的发热呼吸道感染和超过90％的肺炎由腺病毒引起。美国新兵训练营多次有腺病毒感染爆发流行，常有死亡病例报道，病死原因多为并发肺炎。根据国外文献报道，腺病毒感染引起的肺炎如果不进行治疗，死亡率可以高达50％。
腺病毒于1953年从人的增殖腺分离出来的，是一种无包膜的DNA病毒，可感染人和畜禽。腺病毒科分为哺乳动物腺病毒属和禽类腺病毒属，具有严格的寄主特异性，不感染其他动物，迄今共发现100余个血清型，其中人腺病毒有57种，分为7个亚群。
腺病毒是呈二十面体对称的线性双链病毒，病毒颗粒直径约65～80nm，由蛋白衣壳、核心蛋白和DNA组成。蛋白衣壳由六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤突(fiber)三种主要的蛋白构成，共252个壳粒，二十面体12个顶角的壳粒即为五邻体，每个五邻体上有1条纤突，剩下240个非顶角壳粒为六邻体。蛋白衣壳的表面有四种小蛋白IIIa，VI，VIII和IX。病毒核心有六种结构成分，分别是V、VII、TP、μ、IVa2和ATP，前五种与双链DNA的基因组有关，ATP在病毒粒子装配过程中至关重要的蛋白酶。Fiber蛋白的结构包括球部、柄部和尾部，长度约为10～30nm，纤突球部有HAdV不同组别和型别的抗原表位，且不同的HAdV 血清型纤突的长度和弯曲度均不同。每个六邻体蛋白是由基底部的五面体和塔尖的三角形组成，塔区有Loop1～Loop4四个环状结构构成，其中Loop1结构包括6个高变区，Loop2上有 1个高变区，7个高变区含有血清型特异的抗原决定簇。因此，编码六邻体和纤维蛋白的基因序列适用于人腺病毒血清型间基因差异分析。
历史上，腺病毒7型和腺病毒4型腺病毒在美国军队中是引起发热呼吸道感染的重要病原体。但是，近年来一个新的腺病毒亚型14型引发了一系列发热呼吸道感染，而且腺病毒 14型成为美军中腺病毒感染的主要亚型。在2004年到2007年期间,美国的传染病监测系统检测到17次腺病毒14型疫情，其中十例(60％)来源于美国军队。上述情况说明14型腺病毒在美国军队发病率较高。2006-2007年间美国New York，Oregon，Washington,Texas等四个州共确诊140例腺病毒14型腺病毒引起的呼吸系统感染，其中53例(38％)住院，24例(17％) 进入ICU，9例(5％)死亡。这些数字表明14型腺病毒具有较强的致病力。
腺病毒55型是由腺病毒14型演化而来，它的基因组的绝大部分区域和腺病毒14型高度同源，只有保护性抗原Hexon基因大部分来源于腺病毒11型，因此腺病毒55型为一种新型的重组腺病毒，该病毒的定型是由美国国立卫生研究院人类腺病毒专业委员会主席、中国病原微生物生物安全国家重点实验室客座教授Donald Seto于2010年正式定名。由于该病毒在抗原性及其编码基因上与11型腺病毒更加接近，过去被错误的定名为11a型。事实上，腺病毒55型与腺病毒14型的同源性远远高于和11型的同源性，而且从过去的几次在亚洲的流行特点来看，其感染特性和毒力也与腺病毒14型比较接近。
虽然腺病毒55型只是在2010年才被定名，但是从NCBI核酸序列数据库的检索分析结果进行推测，可知该新型病毒早在2001年和2002年的台湾地区就已经出现，较大的疫情是在2004 年4月，土耳其军营发生一次55型腺病毒疫情，该军营共有2,250名18-40岁男性参加了军事训练，几百人出现发病症状，一名26岁男性死亡，其中两名军人随后在德国被证实感染 55型腺病毒(当时命名为腺病毒11a型)。
另外一次腺病毒55型暴发疫情发生在新加坡，时间为2005年2-6月及10月，当时在招 募的226名新兵中共监测到30例腺病毒阳性的临床病例，核酸序列分析证实其该腺病毒与 2006年中国陕西分离的腺病毒毒株同源性为99.9％。
目前没有针对腺病毒的特效治疗药物，治疗原则主要是对症治疗，采用支持疗法。研究显示，针对14型腺病毒，目前常见的抗病毒治疗药物疗效并不显著，更昔洛韦(Ganciclovir) 体外抗病毒作用显著，但临床治疗无效。西多福韦(Cidofovir，CDV)是一种能抑制DNA 多聚酶的广谱抗病毒药(包括单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等)，经临床试验证实该药对腺病毒感染病例有效。缺点是只能静注，并且具有较严重的不可逆肾脏毒性。
腺病毒感染的防控。腺病毒既可以通过呼吸道传播，也可以通过消化道传播，在防控上难道较大，通过控制传染源：早期发现患者，及时进行隔离治疗，对密切接触者进行医学观察和预防用药。切断传播途径：避免集体活动，减少人员外出，进行环境消毒，勤通风换气，保护易感人群：注意劳逸结合，提高机体免疫力。
针对腺病毒引起的聚集性的急性上呼吸道感染流行状况，通过接种疫苗的方式，是有效预防腺病毒引起的急性上呼吸道感染疾病的爆发的理想方案，因此有必要筛选并鉴别出具有良好功效的用于预防腺病毒导致的急性上呼吸道感染的病毒株。
发明内容
本发明针对上述领域的需求，开发了用于预防腺病毒感染的急性呼吸道传染病的疫苗，经试验证明，所发明的疫苗具有有效的免疫活性，具体如下：
本发明的一方面，公开了一种人工筛选获得的55型腺病毒，其毒株编号为DW55-C20，保藏号为CGMCC No.13789。
另一方面，公开了一种腺病毒疫苗原液,是上述55型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液经过滤去除细胞碎片和杂菌之后收集的病毒液。所述55型腺病毒DW55-C20的滴度值不低于7.8±0.5LgCCID50/ml。
再另一方面，提供了一种腺病毒疫苗制品，其特征在于：由免疫活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述免疫活性成分是上述7型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液，经过滤去除细胞碎片和杂菌之后的纯化产物
进一步地，疫苗制品为口服包芯片，所述药学上可接受的辅料指作为冻干保护成分的脱脂牛奶和乳糖；作为包衣成分的微晶纤维素和乳糖；每片包芯片指，所述55型腺病毒DW55-C20病毒不低于4.5LgCCID50/mL。
进一步地，提供一种腺病毒疫苗制品，其特征在于：为半成品，是在上述55型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液经过滤去除细胞碎片和杂菌之后的病毒液中加入终浓度为w/w 4-10％的蔗糖和w/w 1-5％的人血白蛋白，经混匀、冻干制得的冻干制品。
进一步地，提供一种腺病毒疫苗制品，其特征在于，为包芯片剂，是在上述半成品中加入赋形剂、崩解剂、助流剂混合制成；所述55型腺病毒含量不低于6.5±1.0Lg CCID50。
所述赋形剂为无水乳糖，在所述包芯片片剂中质量百分比为15－20％；所述崩解剂包括微晶纤维素和甲基丙烯酸二乙烯基苯聚合物，在所述包芯片片剂中质量百分比分别为 15-25％、2-4％；所述助流剂为硬脂酸镁，在所述包芯片片剂中质量百分比为0.3-0.6％；其余为所述冻干制品。
本发明的另一方面，提供了上述任一疫苗制品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的腺病毒毒株接种细胞，收集的病毒工作种子液，
(2)所述工作种子液按照0.1MOI分别接种到长满单层细胞的培养瓶中，在35℃条件下培养7到14天，细胞发生50％以上病变后收获病毒液；
(3)病毒液用0.8/0.45μm过滤，去除细胞碎片；
(4)用孔径为0.22μm的滤器过滤病毒液以过滤除菌得到所述疫苗原液。
本发明的再另一方面，提供了一种筛选腺病毒疫苗毒种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在发生目标亚型腺病毒所致疫情的区域获得腺病毒样本和准备用于培养病毒的细胞；
(2)将腺病毒样本接种到所述细胞生长液中培养；
(3)当75％～100％细胞出现细胞病变特征时收获病毒培养液并进行PCR验证；
(4)蚀斑克隆：将验证阳性的所述病毒培养液进行系列稀释，稀释液接种到长满单层细胞的容器中进行蚀斑克隆，筛选出不同的病毒克隆，具体为：选择出现白色斑点并且周围没其他病变点的区域，用吸管将斑点上方的营养琼脂吸出；将选出的病毒克隆分别接种于长满单层细胞的病毒分离管中，当细胞病变达到100％时，收获病毒培养物悬液；
(5)传代并筛选出原始种子库：所述病毒培养物悬液冻融1-3次，接种到长满单层细胞的病毒分离管进行扩大培养，每10ml细胞培养液中加入1ml病毒培养物悬液，当细胞病变达到完全病变时，收获病毒培养物悬液；此步骤重复8个循环，即传8代得病毒原始种子。
其中腺病毒样本(咽拭子)记为P0代，从咽拭子分离病毒通常成功率基本在30％左右，分离的第一代病毒记为P1代，滴度低，体积少，按照1:10或者更高的比例接种扩增病毒，在P3代才能积攒出足够用于蚀斑克隆的病毒量，蚀斑后，病毒增加1代，记为P4代，从一个蚀斑扩增至P8代以后，病毒滴度稳定下来，体积数量能够满足检定的需要，可以在P8代以后建立原始种子库。
优选地，腺病毒样本取自发病3天内的患者的咽拭子和/或鼻拭子，采集后立即置于-20℃冻存。
优选地，所述细胞为MRC-5细胞或WI-38细胞。
优选地，所述蚀斑克隆过程中，将步骤3中所获得的病毒培养液的稀释液1ml接种至长满所述细胞的细胞板中，吸附2小时，吸附完成后将液体吸弃，再将配制好的A液和 B液等体积混合，在温度下，加入6孔板中，每孔添加3.0ml，倒置于，5％的CO2孵箱中培养2天，然后将A液和C液混合，温度控制在，在每孔中加入3.0ml染色，再将6孔板倒置于，5％的CO2孵箱中培养2-8天，从染色后的第2天起始每天观察6孔板，确认出现所述白色斑点；其中：
A液：2×DMEM 50ml+8％NaHCO33ml+牛血清10ml；
B液：琼脂0.75g+注射用水50ml；
C液：琼脂0.75g+注射用水50ml+1％中性红0.5ml。
优选地，所述方法还包括病毒滴度测试筛选步骤，将病毒原始种子用DMEM液10倍系列稀释，从10-4稀释度开始取至少三个连续稀释度分别接种于A549细胞，每个稀释度接种8 孔细胞，36±1℃培养7天，按Karber法计算病毒滴度，滴定扩增起来的病毒，蚀斑选择病毒滴度大于7.3Lg CCID50/ml的病毒原始种子作为毒种。
优选地，所述方法还包括采用免疫血清效价测定方法对所述病毒原始种子或其冻干半成品进行测定和筛选，选择中和效价大于1:8的抗血清对应的病毒种子为毒种。
优选地，所述方法包括制备免疫血清：
免疫动物为新西兰大白兔2只。
初次免疫：第0天，用注射器吸取弗氏佐剂+病毒液，于家兔背部皮下多点注射每只6ml；
第二次免疫：第14天，用注射器吸取弗氏不完全佐剂，于家兔背部皮下多点注射，每只 4ml；
第三次免疫在第21天，同第二次操作
第6周试血：取耳缘静脉血0.5-1mL，待凝固后分离血清，用双扩试验测定免疫血清的抗体效价，效价至少达到1:16以上时，采集血，离心分离血清。；
如效价未达到要求，用不加佐剂的ADV液耳静脉内注射免疫，一周三次，剂量分别为 0.1mL，0.3mL，0.5mL，间隔一周再试血或用弗氏不完全佐剂乳化的病毒液补充免疫1-2次，免疫部位和剂量同第二次免疫，间隔一周后再试血，如效价达到要求立即放血，如抗体效价达到较高水平时，心脏放血，分离血清，抗体水平大于1:8为阳性，效价大于1:16以上时符合采血要求。
优选地，所述所述目标亚型腺病毒为腺病毒3型、4型、7型、11型、14型、55型。
优选地，所述筛选方法还包括对筛选到病毒原始种子进行基因鉴定；其中：
腺病毒7型采用Seq ID No.1-6所示的三对引物进行实时定量PCR鉴定；
腺病毒55型采用Seq ID No.7-12所示的三对引物进行实时定量PCRPCR扩增鉴定；
内参成立的情况下，当样本Ct值<35时，视为阳性；当35<样本Ct值<40时，应进行重复测定或重新提取DNA后测定，再次测定结果<40时，视为阳性，否则视为阴性样本。
本发明提供的筛选方法所获得的病毒来源于单个病毒感染单位克隆，病毒均一；稀释后挑选单个病毒蚀斑，可以有效去除可能的其他外源病毒污染，这一点对于制备活疫苗尤为重要；使用玻璃吸管直接扎取单个病变点，可以避免咽拭子样品中潜在的细菌、支原体等微生物的污染；挑取单一克隆的病毒株，传代过程中滴度稳定，批间差异小，适于标准化生产。
本发明提供用于筛选腺病毒疫苗毒株的方法，通过在样本采集方法、克隆筛选、传代方法方面进行改进，提供了一种能够筛选到优势腺病毒毒株的方法。
本发明中，优选采集来自发病3天以内的患者的样本，样本采集后应立即放入适当的采 样液中低温保存。病毒分离成功与否很大程度上取决于临床样本的采集时间、质量及其保存 和运输等环节。目前对于选育病毒没有常规的已知的标准方法。本发明提供的适合于腺病毒 各亚型的筛选能保障疫苗株满足安全性和有效性的标准，可有效去除外源污染，并获得单一 克隆的毒株。
本发明的实施例中记载了筛选到的腺病毒7型和腺病毒55型优势毒株，申请人于2017年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)对其进行了保藏，腺病毒7型的原始编号：DW7-Y19，分类命名为：人 腺病毒7型，保藏号为CGMCC No.13789；腺病毒55型原始编号DW55-C20，分类命名为： 人腺病毒55型，保藏号为CGMCC No.13790。
附图说明
图1.咽拭子采样区域示意图；
图2.腺病毒7型样本感染WI-38细胞培养第4天出现病变；
图3.腺病毒55型样本感染WI-38细胞培养第7天出现病变；
图4.7型腺病毒RT-PCR结果；
图5.55型腺病毒RT-PCR结果；
图6.腺病毒增殖曲线；
图7.病毒种子免疫血清的中和效价；
图8.基因检测验证结果：
其中A图：腺病毒7型和55型六邻体结构蛋白；B图腺病毒7型和55型五邻体结构蛋白；C图：腺病毒7型和55型纤突蛋白。
具体实施方式
实施例1.筛选培养获得稳定腺病毒毒株
步骤1.按照常规方法培养WI-38细胞(ATCC CCL-75)
细胞复苏方法：将细胞种子从液氮中取出，1000rpm离心5分钟，用含有20％牛血清的DMEM培养基重悬细胞，将重悬的细胞以约1.0×106细胞/瓶的数量接种于面积为75cm2的培养瓶中，在37℃下培养过夜，然后，更换生长液(含有10％牛血清)，继续培养至单层。
细胞传代方法：将单层细胞用PBS冲洗，去除细胞面上的牛血清，用胰蛋白酶(0.25％，含万分之一EDTA)的消化细胞，37℃消化4-6分钟，加入生长液终止消化，吹散细胞，按照分种率1:2或1:3分配细胞悬液到不同的培养瓶中，下一次传代时间为第2-3天，细胞生长过程中pH控制在7.2-7.3，可以使用CO2孵箱控制培养体系的pH值，将CO2的浓度控制在5％。
长满单层细胞的细胞瓶待用。
本研究中后续实验中所指的“细胞”，“细胞工厂”，“长满单层细胞的细胞瓶”中的细胞都是指本步骤中准备的WI-38细胞。这里仅仅是作为示例。本发明的实现并不依赖于这种细胞，实验人员可以选择其它细胞代替。比如MRC-5细胞。
步骤2.腺病毒样本采集
病毒分离成功与否很大程度上取决于临床样本的采集时间、质量及其保存和运输等环节。样本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
样本的采集：腺病毒样本优选咽拭子和/或鼻拭子。这种样本的采集易于实施，不需要仪器设备辅助，并且对患者刺激小，易被接受。
咽拭子的采集方法：嘱患者坐下，头后倾，嘴张开，呈发“啊”声姿态，若患者舌挡住咽喉部位，可用压舌板固定舌体，从无菌包装中取出拭子，用带有聚丙烯纤维头的拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，反复擦拭2～3次，收集粘膜和上皮细胞，应避免触及舌部、口腔粘膜和唾液。将拭子尾部折断，浸入病毒采样管的采样液中。
样本应优选在发病早期采集，此时病毒核酸检出率最高，一般患者发热3天内采集最佳。部分呼吸道病毒排毒周期尚未明确，也应尽量在发病早期采集。为提高检出率，可采用多部位取样检测，例如同时采集鼻拭子和咽拭子。
2012年采集自武汉的咽拭子Y19和2016年采集自陕西的标本，立即置于-20℃冻存，运至实验室。用于腺病毒7型(武汉样本)和55型(陕西样本)的分离。
步骤3：分离腺病毒病原
用40倍光学显微镜镜观察步骤1中细胞生长状态，选择处于对数生长期75～90％细胞用于病毒的分离。轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸适量pH 7.4～7.6的PBS液清洗细胞2遍。
临床样本的处理：临床采集样本送至实验室后，先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出；鼻咽抽取液等其他样本中含有少量粘液，用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，然后将样本4℃，2000rpm离心10min，以去除大部分杂质。若含有大量粘液，则需要液化后(按1:1体积比加入1％pH7.6的胰蛋白酶溶液，约 25℃环境中消化15～30min，取适量样本离心后用于接种细胞。
样本接种：用无菌的移液管将清洗细胞的PBS液从细胞培养瓶中移出，用无菌的移液管吸取500μL临床样品加入细胞培养瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培养瓶底。放入 5％CO2培养箱中在适当温度吸附1～2小时。然后，弃掉样本液，用10mL的无菌移液管吸取适量pH 7.4～7.6的PBS液清洗细胞，加入3mL相应病毒生长液于细胞培养瓶中，放置于5％CO2 培养箱培养。
每日观察细胞病变情况，病毒所致细胞病变效应(CPE)特征：细胞先变圆，进而成球形，折光性增强，许多病变的细胞聚集成一串串葡萄状。
病毒分离物的收获：当75％～100％细胞出现CPE特征时进行收获，腺病毒7型WI-38细胞培养第4天出现病变，见图2；腺病毒55型WI-38细胞培养第8天出现病变，见图3。
即使无细胞病变也应该于病毒最长传代时间进行收获。收获之前可以将细胞放于-80℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获样本的病毒滴度。
先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
收获的病毒液(病毒种子)应分装至冻存管中保存在-80℃冰箱待用。
步骤4：病毒分离株的验证
按标准操作规程从收获的病毒液中提取病毒基因组DNA，采用实时PCR/Real time(RT) –PCR方法进行检测验证。
实验以病毒DNA试剂盒进行样本处理，获得纯化的病毒DNA，置于–80℃保存，用于后续核酸检测。
实时PCR/Real time–PCR(RT-PCR)扩增：
试剂盒：实时一步法RT-PCR试剂盒；配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温装置中，如预冷的冰盒。
新合成的引物稀释前应短暂离心(12000rpm，15秒)。用无菌水进行溶解，加水量为(100×总摩尔数)微升，然后充分振荡混匀。此时引物浓度为10pmol/μL，即10μmol/L。例如：引物或探针合成量为2OD，4.5nmol，则加水量为100×4.5＝450μL。
在分装扩增反应液的反应管中分别加入样本DNA。
首先加入阴性对照管，然后分别加标本DNA，一些实施例中设置阳性对照DNA，最后加入。
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入实时PCR仪，设置反应程序进行实时 RT-PCR扩增，退火温度按说明书默认条件设置，所用引物如表1所示。
表1急性呼吸道传染病病原(腺病毒)监测用引物和探针序列表
结果分析：根据所用试剂盒说明书设置基线值(baseline)或采用系统默认条件。荧光阈值(Threshold)设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为原则。使用仪器配套软件自动分析结果。内参成立的情况下，当样本Ct值<35时，视为阳性；当35<样本Ct值<40时，应进行重复测定或重新提取DNA后测定，再次测定结果<40时，视为阳性，否则视为阴性样本。
7型腺病毒样本的RT-PCR结果见图4；55型腺病毒样本的RT-PCR结果见图5。
步骤5病毒蚀斑克隆及传代建库
A液：2×DMEM 50mL+8％NaHCO33mL+牛血清10mL；
B液：琼脂0.75g+注射用水50mL。
C液：琼脂0.75g+注射用水50mL+1％中性红0.5mL。
对步骤3中检定为正确的病毒进行克隆纯化，即将步骤3中所获得的病毒种子稀释至10-2、 10-3、10-4、10-5稀释度，然后将稀释后的种子接种至长满WI-38细胞的6孔板，用PBS冲洗细胞板2次，每个孔接种病毒悬液1.0ml，35℃吸附2小时，每隔30分钟轻轻摇动6孔板，使得毒种分布均匀，吸附完成后将每孔中的液体吸出；
将配制好的A液和B液等体积混合，温度控制在43℃，加入6孔板中，每孔添加3.0ml，倒置于35℃，5％的CO2孵箱中培养2天；
然后将A液和C液混合，温度控制在45℃，在每孔中加入3.0ml染色，再将6孔板倒置于35℃，5％的CO2孵箱中培养2-8天，从染色后的第2天起始每天观察6孔板，确认出现白色斑点，并且周围没其他病变点，在白色斑点附近做出标记；
用吸管将斑点上方的营养琼脂吸出，接种于长满单层细胞的病毒分离管中，当细胞病变达到100％时，收获培养物悬液，冻融3次；
再次接种于长满单层的WI-38细胞进行扩大培养，接种的比例按照体积比计算1:10，即每10ml细胞培养液中加入1ml毒种，当细胞病变达到100％时，收获培养物悬液。
将病毒种子传至第8代时获得“病毒原始种子库”，所建立的毒种库保存于-70℃以下的冰箱。
步骤6病毒滴度测定
用DMEM液10倍系列稀释毒种，从10-4稀释度开始取至少三个连续稀释度分别接种于A549 细胞，每个稀释度接种8孔细胞，36±1℃培养7天，观察细胞病变，按Karber法计算病毒滴度，将病毒种子按照上述方法测定其病毒滴度，绘制病毒增殖曲线，结果如图6所示。
步骤7免疫血清效价测定
CFA-ADV制备过程：
先将弗氏佐剂与腺病毒原液按比例混合，佐剂和抗原体积比为1：1，制备成"油包水"乳状液。因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。具体操作是等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的“水包油”状态的CFA-ADV 液，滴在水面之上不散开为止。
初次免疫：第0天，用2ml注射器吸取CFA-ADV液，于家兔背部皮下多点注射6ml。第二次免疫：第2周，用2ml注射器吸取CFA-ADV液，于家兔背部皮下多点注射4ml。第三次免疫在第21天进行。第6周，试血：取耳缘静脉血0.5-1mL，待凝固后分离血清，用双扩试验(梅花孔型)测定免疫血清的抗体效价，效价至少达到1:16以上时才能采集全部血清。
如效价未达到要求，用不加佐剂的腺病毒原液耳静脉内注射免疫，一周三次，剂量分别为0.1mL，0.3mL，0.5mL，间隔一周再试血。也可用弗氏不完全佐剂乳化的ADV液补充免疫1-2次，免疫部位和剂量同第二次免疫，间隔一周后再试血，如效价达到要求立即放血。如抗体效价达到较高水平时，心脏放血，分离血清。
抗体水平大于1:8为阳性，7型和55型免疫血清效价测定结果见图7。
步骤7腺病毒Hexon、Penton、Fiber结构蛋白检定以及全基因组序列测定
使用的引物如下：
PCR体系：
| 试剂 | 25μL体系(μl) | 终浓度 |
| 2×Easy Taq mix | 12.5 | |
| 引物F(10μmol/L) | 1 | 0.4μmol/L |
| 引物R(10μmol/L) | 1 | 0.4μmol/L |
| cDNA(μL) | 2 | |
| ddH2O(μL) | 8.5 |
PCR反应程序：
琼脂糖凝胶电泳:
a.1.2％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖+100mL TAE，微波炉加热2-3min，沸腾溶化后冷却至 50℃～60℃时加入5μL Goldview，摇匀后倒胶。
b.分别取5～10μL PCR产物加入点样孔，其中Trans 2K plus marker 5uL
c.打开电泳仪，120V电泳30～40min，至染料跑过胶2/3处停止电泳，紫外成像系统观察。
d.选取出现预期大小目的片段的PCR产物进行测序，测序结果见Seqs ID No.13,14.
e.电泳结果见图8：A图：腺病毒7型和55型六邻体结构蛋白；B图腺病毒7型和55型五邻体结构蛋白；C图：腺病毒7型和55型纤突蛋白。
f.取腺病毒5mL，56℃灭活，送基因测序公司，按照常规方法全基因组测序。
步骤9.建立病毒库，送保藏
将来自“病毒原始种子库”的病毒按照1:10(体积比)接种至长满单层细胞的细胞瓶中，培养基是含有2％的胎牛血清DMEM维持液，并置于37℃下培养，每天观察细胞病变(CPE)。当有80％的细胞表现为CPE状态时，将培养物置于-20℃冷冻，室温融化，重复一次；
将冻融物再按照上述操作程序接种至新的单层细胞，开始新的传代，每一批收获物即为1代；
验证获得的腺病毒7型，腺病毒55型传代至病毒滴度稳定，滴度值在7.8±0.5LgCCID50/ml。稳定后，建立病毒主种子(第10代)和工作种子库(第13代)(病毒工作种子)，工作种子库部分送保藏。
实施例2：口服疫苗制备
将获得的病毒工作种子接种细胞工厂，采用含有2％血清的DMEM培养基35℃培养7天，然后进行病毒收获，经0.8/0.45μm的滤器过滤除去细胞碎片，再与脱脂牛奶(半成品中终浓度为3-8％)和乳糖(半成品中终浓度为1-3％)混合，总固体含量控制在10％-15％，冻干制备半成品，再使用微晶纤维素以及乳糖、制备包芯片，即为口服腺病毒疫苗。
每片口服腺病毒疫苗病毒不低于4.5LgCCID50/mL。
实施例3：制备腺病毒7型和55型疫苗原液
将实施例1获得的腺病毒7和55型工作种子(实施例1步骤9获得)按照0.1MOI分别接种到长满单层细胞瓶中，在35℃条件下培养7到14天，等细胞发生50％以上病变后收获病毒液。将细胞悬液合并收集到瓶中，置于-20℃冷冻，备用。
病毒的初步纯化：将上述制备的腺病毒7型和55型病毒收获液用(0.8/0.45μm)过滤，去除细胞碎片；用孔径为0.22μm的滤器过滤病毒液以过滤除菌，收集滤液为病毒除菌液，即得病毒原液(疫苗原液)。
实施例4.制备腺病毒7型和55型疫苗半成品
将实施例3所制得的病毒原液加入终浓度为4-10％蔗糖和1-5％人血白蛋白，冻干即为半成品。
实施例5腺病毒疫苗7型和55型成品包芯片的制备
实施例4制得的疫苗半成品与赋形剂、崩解剂、助流剂等按比例混合后制成包芯片。
赋形剂为无水乳糖，崩解剂为微晶纤维素和甲基丙烯酸二乙烯基苯聚合物，助流剂为硬脂酸镁，配方如下：
对制备的片剂测试
热稳定性试验：37℃放置48小时后，将病毒用DMEM液10倍系列稀释，从10-4稀释度开始取至少三个连续稀释度分别接种于A549细胞，每个稀释度接种8孔细胞，36±1℃培养7天，观察细胞病变，按Karber法计算病毒滴度，进行病毒滴定。病毒滴度不应低于4.5LgCCID50,病毒滴度下降不高于1.0Lg。
病毒鉴别试验：用腺病毒7型和55型特异高效价免疫血清(非人源)或者单克隆抗体和腺病毒抗体阴性血清分别与50-200CCID50/mL腺病毒等量混合，置37±1℃水浴60分钟，接种A549 细胞，36±1℃培养7天观察细胞病变。
结果显示：经腺病毒特异高效价免疫血清中和的细胞无细胞病变，经腺病毒抗体阴性血清中和的，病毒未得到有效中和，而致使产生细胞病变。
病毒分布均匀度：每批抽查10片以上，测定疫苗片剂的病毒分布均匀度。
逐片滴定病毒含量，所测的病毒含量是6.5±1.0Lg CCID50，各片之间的病毒含量差不超过0.5Lg。
微生物限度检查：同一天制备的片剂为1个供试品，每个容器中取样不得少于10片，按微生物计数法检测，每片菌数不超过300个(依据通则1105、通则1106与通则1107)。
致病菌检查：不含有乙型溶血性链球菌、肠道致病菌以及大肠杆菌。
乙型溶血性链球菌检査：
取经10倍稀释供试品0.5ml，接种肉汤培养基1支，置37℃培养24小时，再用划线法移种血平皿1个，37℃培养24小时，无乙型溶血性链球菌生长。
肠道致病菌检查：
取经10倍稀释的供试品1.0mL，接种GN或肉汤增菌培养基1管，置37℃培养，于 小时内用划线法转种鉴别培养基平皿1个，37℃培养24小时，如有革兰氏阴性杆菌，应进一步鉴定是否为肠道致病菌。
大肠杆菌检查：取经10倍稀释的供试品，接种普通克斯列或麦康凯肉汤培养基3管，每管2mL，置37℃培养48小时，不应有产酸、产气现象。如有产酸、产气现象，应进一步鉴别是否为大肠杆菌。
实施例6疫苗的免疫原性
将实施例4制备的疫苗冻干粉半成品，使用注射用水溶解制备悬液，免疫ICR小鼠，考察疫苗的免疫原性。具体为：
将实施例4中制备的疫苗冻干粉半成品按照64000CCID50/mL、32000CCID50/mL、16000 CCID50/mL、8000CCID50/mL的剂量配制4批疫苗，选用18～22克ICR小鼠，每组10只，采用腹腔注射方法，分别于0和14天接种小鼠，每次接种剂量为0.5mL。
在末次接种后的14天采血，分离免疫血清，按照常规试验方法将血清系列稀释后，与 100CCID50/0.05mL(0.05mL是指病毒液的体积)的相应血清型病毒混合，置于37℃孵育2小时，然后将其接种至A549细胞，并在37℃培养5～7天，同时观察细胞病变，其中以出现细胞病变的血清最高稀释度为血清中和效价。中和用毒株为工作种子库的病毒，经稀释分装，定量后，专供检定标准毒种使用，阳性判定指标：中和效价大于1:8；阴性对照血清效价小于1:4，试验成立。
结果见下表：
GMT:中和抗体的几何平均滴度
结果表明：疫苗免疫小鼠中和抗体阳转率达到100％。
疫苗，接种18-22g ICR小鼠10只，一针免疫，每只腹腔接种1.0ml。
免疫后第28天采血，分离血清，检测血清中腺病毒中和抗体滴度，中和抗体阳转率(中和抗体滴度≥1:8为阳转)，结果显示，阳转率不低于80％。
实施例7猴体神经毒力试验
对主种子批或工作种子批的毒种应进行猴体神经毒力试验，以测试神经毒力。
每次至少用10只腺病毒抗体阴性的易感猴，每侧丘脑注射0.5ml实施例3所得的疫苗原液(不低于1个人用剂量的病毒量)，观察17～21天，没有有麻痹及其他神经症状出现。
注射后48小时内猴死亡数不超过2只可以更换；如死亡超过20％，即为非特异性死亡，试验也不能成立，应重新挑选一组试验用猴，再进行试验。
观察期末，每只猴釆血测腺病毒抗体，阳转率不低于80％，并处死解剖，对大脑和脊髓的适当部位做病理组织学检查，为阴性。
每次试验同时有4只易感猴作为对照，待试验猴处死后10天，第2次采血，对照猴腺病毒抗体仍为阴性。
序列表：
Seq ID No.13中国7型腺病毒疫苗株全基因组序列
CATCATCAATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGCAAATGAGGTAATTTAAAAAAGTGCGCGCTGTGTGGTGATTGGCTGTG GGGTGAACGGCTAAAATGGGCGGGGCGGCCGTGGGAAAATGACGTGACTTATGTGGGAGGAGCTATGTTGCAAGTTATTGCGGTAAAT GTGACGTAAAACAAGGTGTGGTTTGAACACGGAAGTAAACAGTTTTCCCACGCTTACTGACAGGATATGAGGTAGTTTTGGGCGGATGC AAGTAAAAATTCTCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAATTTCTGAGTCATTTCGCGGTTATGACAGGGTGGAGTATTTGCC GAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGTTTACGTGGAGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCTGTG TTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGTATTTAAACCTGACGAGTTCCGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTT TTCTCCTCCGCGCCGCAAGTCAGTTCTGCGCTTTGAAAATGAGACACCTGCGTTTCCTGCCACAGGAGATTATCTCCAGTGAGACCGGG ATCGAAATACTGGAGTTTGTGGTAAATACCCTAATGGGAGACGACCCGGAACCGCCAGTGCAGCCTTTCGATCCACCTACGCTGCACGA TCTGTATGATTTAGAGGTAGACGGGCCTGAGGATCCCAATGAGGAAGCTGTGAATGGGTTTTTTACTGATTCTATGCTGCTAGCTGCCGA TGAAGGATTGGACATAAACCCTCCTCCTGAGACCCTTGTTACCCCAGGGGTGGTTGTGGAAAGCGGCAGAGGTGGGAAAAAATTGCCT GATCTGGGAGCAGCTGAAATGGACTTGCGTTGTTATGAAGAGGGTTTTCCTCCGAGTGATGATGAAGATGGGGAAACTGAGCAGTCCAT 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Seq ID No.14中国55型腺病毒疫苗株全基因组测序序列
CATCATCAATAATATACCTTATAGATGGAATGGTGCCAATATGTAAATGAGGTGATTTTAAAAAGTGTGGGCTGTGTGGTAATTGGCTGTG GGGTTAACGGCTAAAAGGGGCGGCGCGGCCGTGGGAAAATGACGTTTTTTGGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAGTTGTCGCGGTAAATGT GACGTAAACAAAGGCTTTTTTTCTCACGGAACTACTTAGTGTTCCCACGGTATTTAACAGGAAATGAGGTAGTTTTGGCCGGATGCAAGT AAAAATTGTTCATTTTCGCGCGAAAACTAAATGAGGAAGTGGTTTTCTGAATAATGCGGTATTTATGGCAGGGTGGAGTATTTGTTCAGG GCCAGGTAGACTTTGACCCATTACGTGGAGGTTTCGATTACCGCGGAGGTTTCGATTACCGTGTTTTTTACCTAAATTTCCGCGTACCGTG TGAAAGTCTTCTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTACGGTATTTATACCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCA GCGAGAAGAGTTTTCTCCTCTGCGCCGGCAGTTTAATATTAAAAAAATGAGACACTTGCGATTTCTGCCTCAGGAAATAATTTCTGCTGA GACTGGAAACGAAATACTGGAGTTTGTGGTGCACGCCCTGATGGGAGACGATCCGGAGCCACCTGTGCAGCTTTTTGAGCCTCCTACG CTTCAGGAACTGTATGATTTAGAGGTAGAGGGATCGGAGGATTCTAATGAGGAAGCTGTGAATGGCTTTTTTACCGATTCTATGCTTTTAG CTGCTAATGAAGGATTAGAATTAGATCCGCCTTTGGACACTTTCGATACTCCAGGGGTGATTGTGGAAAGCGGTACAGGTGTAAGAAAA TTACCTGATTTGGGTTCCGTGGACTGTGATTTGCACTGCTATGAAGACGGGTTTCCTTTGAGTGATGAGGAGGACCGTGAAAAGGAGCA 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Claims (9)
1.一株55型腺病毒，毒株编号DW55-C20，保藏号为CGMCC No.13790。
2.一种腺病毒疫苗原液,是权利要求1所述的55型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液经过滤去除细胞碎片和杂菌之后收集的病毒液，其滴度值可到7.8±0.5LgCCID50/ml。
3.一种腺病毒疫苗制品，其特征在于：由免疫活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述免疫活性成分是权利要求1所述55型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液，经过滤去除细胞碎片和杂菌之后的纯化产物。
4.根据权利要求3所述的疫苗制品，其特征在于，为口服包芯片，
所述药学上可接受的辅料指作为冻干保护成分的脱脂牛奶和乳糖；作为包衣成分的微晶纤维素和乳糖；每片包芯片中所述55型腺病毒DW55-C20病毒不低于4.5LgCCID50/ml。
5.一种腺病毒疫苗半成品，其特征在于：是在权利要求1所述55型腺病毒接种到细胞工厂中产生的收获液，经过滤去除细胞碎片和杂菌之后的病毒液中加入终浓度为w/w 4-10％的蔗糖和w/w 1-5％的人血白蛋白，经混匀、冻干制得的冻干制品。
6.一种腺病毒疫苗制品，其特征在于，为包芯片剂，是权利要求5所述的半成品中加入赋形剂、崩解剂、助流剂混合制成；
所述55型腺病毒含量不低于6.5±1.0Lg CCID50。
7.根据权利要求6所述的腺病毒疫苗制品，其特征在于，
所述赋形剂为无水乳糖，在所述包芯片片剂中质量百分比为15－20％；
所述崩解剂包括微晶纤维素和甲基丙烯酸二乙烯基苯聚合物，在所述包芯片片剂中质量百分比分别为15-25％、2-4％；
所述助流剂为硬脂酸镁，在所述包芯片片剂中质量百分比为0.3-0.6％；
其余为所述冻干制品。
8.权利要求2-7任一所述疫苗制品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的腺病毒毒株接种工作细胞，收集的病毒工作种子液，
(2)所述工作种子液按照0.1MOI分别接种到长满单层细胞的培养瓶中，在35℃条件下培养7到14天，细胞发生50％以上病变后收获病毒液；
(3)病毒液用0.8/0.45μm过滤，去除细胞碎片；
(4)用孔径为0.22μm的滤器过滤病毒液以过滤除菌得到所述疫苗原液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，所述工作细胞为MRC-5细胞或WI-38细胞。
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