CN114657148A - 一种口服55型腺病毒疫苗制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口服55型腺病毒疫苗制备方法及应用，所述制备方法具体为：55型腺病毒源分离自感染者咽拭子标本，采用HEp‑2细胞培养法进行分离培养，利用无血清悬浮培养的Vero细胞，培养至5×106cells/mL，接种55型腺病毒，培养至75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集培养液，将培养液采用离心和超滤法进行纯化；所述应用为制备所得疫苗能够被应用到55型腺病毒免疫方面。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体的说，一种口服55型腺病毒疫苗制备方法及应用。
背景技术
人腺病毒（human adenovirus，HAdV）是一类无包膜的双链DNA病毒，分为A-G 7个血清学组，其中B组腺病毒感染目前己成为急性呼吸系统疾病的重要因素。B组又可分为B1和B2亚组，B1主要包括3、7、16、21、51型；B2包括14、34、35及55型。近年来，HAdV-55是成人社区获得性肺炎的重要病因之一，在儿童呼吸道感染中也占有一定比例，可引起校园、社区等聚集性传播。腺病毒感染没有特效药物及疗效显著的治疗方法，目前也没有疫苗进行预防，主要依靠机体自身免疫系统消灭病毒而痊愈。先前的研究已表明，机体产生的腺病毒抗体对同型腺病毒具有长久而稳定的保护性。因此，开发高效、安全低价的腺病毒疫苗是预防腺病毒感染的有效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种口服55型腺病毒疫苗制备方法及应用，所述制备方法能够制备出口服进行免疫55型病毒的口服55型腺病毒疫苗，所述应用能够将制备所得的口服55型腺病毒疫苗进行55型腺病毒的免疫，且直接采用口服的模式进行免疫。
本发明通过下述技术方案实现：一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，包括下述步骤：
1）从感染者咽拭子标本中分离出55型腺病毒源，采用HEp-2细胞培养法进行分离培养；
2）55型腺病毒的无血清培养；
3）55型腺病毒的纯化。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤1）包括下述具体步骤：
1.1）体外培养HEp-2细胞，传代培养3次，采用生长状态良好的HEp-2细胞接种24孔板，接种密度1.5×105个/孔，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培养18~24h；
1.2）弃去细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入300μl含2%FBS的RPIM 1640培养基，并加入咽拭子标本100μl/孔，置于37℃ 5% CO2饱和湿度孵箱内孵育6 h，弃去孵育液，更换为含2%FBS的RPIM 1640培养基500μL；
1.3）持续培养并逐日观察细胞生长状态，当75%以上的细胞出现典型细胞病变效应（CPE）时，收集细胞上清，5000×g离心5min去除细胞碎片，取上清病毒液保存。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤2）具体为：将步骤1）所得利用无血清悬浮培养的Vero细胞，培养至5×106cells/mL，接种55型腺病毒，培养至75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集培养液。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤3）包括下述具体步骤：
3.1）取步骤2）所得，以5000×g离心力离心5min，用移液管吸取离心后的上清，加入10000MWCO超滤管中，以5000×g离心力离心20min；
3.2）在步骤3.1）的浓缩液中加入无菌PBS至原体积；
3.3）经步骤3.2）后，以5000×g离心力离心20min；
3.4）重复步骤3.2）、步骤3.3）3次，吸取浓缩液于无菌管中，即得到纯化的55型腺病毒。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：还包括对55型腺病毒的检测，具体为：采用病毒核酸提取试剂盒提取离心后的上清中病毒DNA，采用荧光定量PCR方法进行核酸检测。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：还包括将纯化后的55型腺病毒保存于-70℃冰箱内。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：所述55型腺病毒的分离培养在BSL-2实验室完成。
一种口服55型腺病毒疫苗的应用，一种口服55型腺病毒疫苗制备方法所制备的口服55型腺病毒疫苗在55型腺病毒方面的口服免疫应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明所述制备方法能够制备出口服进行免疫55型病毒的口服55型腺病毒疫苗，所述应用能够将制备所得的口服55型腺病毒疫苗进行55型腺病毒的免疫，且直接采用口服的模式进行免疫。
本发明利用无血清悬浮培养的Vero细胞扩增55型腺病毒，能够最大限度地降低后续纯化工艺和成本，提高病毒纯度。口服免疫方式耐受性好，便于接种，人群依从性好，能够实现大规模人群的快速免疫。
本发明的55型腺病毒源分离自感染者咽拭子标本，采用HEp-2细胞培养法进行分离培养。
本发明所获得的55型腺病毒感染无血清悬浮培养的Vero细胞，用于收集感染细胞上清。
本发明在进行病毒纯化时采用离心和超滤法，并将获得的毒株采用PBS溶液进行重悬；在对55型腺病毒进行定量时采用荧光定量PCR方法。
附图说明
图1为55型腺病毒免疫小鼠血清中和试验。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横 向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、 “竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
值得注意的是，在该技术领域内，当存在部分材料重叠的情况下，不能简单的认为其中的参数量变化仅仅是通过有限次实验即可完成，从而否定了技术方案的创造性。
实施例1：
一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，能够制备出口服进行免疫55型病毒的口服55型腺病毒疫苗，包括下述步骤：
1）从感染者咽拭子标本中分离出55型腺病毒源，采用HEp-2细胞培养法在BSL-2实验室进行分离培养；
2）55型腺病毒的无血清培养；
3）55型腺病毒的纯化。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：所述步骤1）包括下述具体步骤：
1.1）体外培养HEp-2细胞，传代培养3次，采用生长状态良好的HEp-2细胞接种24孔板，接种密度1.5×105个/孔，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培养18~24h；
1.2）弃去细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入300μl含2%FBS的RPIM 1640培养基，并加入咽拭子标本100μl/孔，置于37℃ 5% CO2饱和湿度孵箱内孵育6 h，弃去孵育液，更换为含2%FBS的RPIM 1640培养基500μL；
1.3）持续培养并逐日观察细胞生长状态，当75%以上的细胞出现典型细胞病变效应（CPE）时，收集细胞上清，5000×g离心5min去除细胞碎片，取上清病毒液保存。
实施例2：
本实施例是在上述实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，2）55型腺病毒的无血清培养，具体为：将上清病毒液利用无血清悬浮培养的Vero细胞，培养至5×106cells/mL，接种55型腺病毒，培养至75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集培养液。
实施例3：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，3）55型腺病毒的纯化包括下述具体步骤：
3.1）取实施例2所得培养液，以5000×g离心力离心5min，用移液管吸取离心后的上清，加入10000MWCO超滤管中，以5000×g离心力离心20min；
3.2）在步骤3.1）的浓缩液中加入无菌PBS至原体积；
3.3）经步骤3.2）后，以5000×g离心力离心20min；
3.4）重复步骤3.2）、步骤3.3）3次，吸取浓缩液于无菌管中，即得到纯化的55型腺病毒。
实施例4：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：还包括对55型腺病毒的检测，具体为：采用病毒核酸提取试剂盒提取离心后的上清中病毒DNA（具体步骤依照试剂盒说明书进行），采用荧光定量PCR方法进行核酸检测（具体步骤依照试剂盒说明书进行）。
实施例5：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，进一步的为更好地实现本发明所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，特别采用下述设置方式：还包括将纯化后的55型腺病毒保存于-70℃冰箱内。
实施例6：
本实施例是在上述任一实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，一种口服55型腺病毒疫苗的应用，一种口服55型腺病毒疫苗制备方法所制备的口服55型腺病毒疫苗在55型腺病毒方面的口服免疫应用。
实施例7：
该实施例示出口服55型腺病毒疫苗的应用（具体为对小鼠进行免疫），该免疫方法具体为：
取6周龄BABL/c小鼠，雌性。口服免疫小鼠采用灌胃针通过灌胃法给予纯化后的55型腺病毒100μL，病毒滴度为109copies/ml。免疫2周后，采用同样的方式进行加强免疫。
实施例8：
该实施例示出口服55型腺病毒疫苗的中和抗体检测（实验对象依然选取小鼠），结合图1所示55型腺病毒免疫小鼠血清中和试验。
末次免疫后1周，经内眦静脉采血，离心法分离血清。将HEp-2细胞铺板，培养过夜。分别取免疫小鼠血清和对照组小鼠血清，先用PBS等比稀释，过滤除菌，56℃灭活30min。每份血清再按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160倍比稀释，与100倍TCID50 55型腺病毒等体积混匀，37℃孵育2h，接入96孔板，每份标本感染3个孔，同时设病毒对照组（virus control，VC）和细胞对照组（cell control，CC），37℃，5％CO2静置培养，以免疫荧光和ELISA试验检测病毒中和效果。结果显示免疫组血清能够明显降低腺病毒的感染。
在图1中，Sera #1、Sera #2为免疫组小鼠血清；VC为病毒感染对照孔；CC为细胞对照孔。由图1可看出，随着免疫血清的稀释，其对腺病毒感染的抑制作用减弱。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
1）从感染者咽拭子标本中分离出55型腺病毒源，采用HEp-2细胞培养法进行分离培养；
2）55型腺病毒的无血清培养；
3）55型腺病毒的纯化。
2.如权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤1）包括下述具体步骤：
1.1）体外培养HEp-2细胞，传代培养3次，采用生长状态良好的HEp-2细胞接种24孔板，接种密度1.5×105个/孔，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培养18~24h；
1.2）弃去细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入300μl含2%FBS的RPIM 1640培养基，并加入咽拭子标本100μl/孔，置于37℃ 5% CO2饱和湿度孵箱内孵育6 h，弃去孵育液，更换为含2%FBS的RPIM 1640培养基500μL；
1.3）持续培养并逐日观察细胞生长状态，当75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集细胞上清，5000×g离心5min去除细胞碎片，取上清病毒液保存。
3.如权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤2）具体为：将步骤1）所得利用无血清悬浮培养的Vero细胞，培养至5×106cells/mL，接种55型腺病毒，培养至75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集培养液。
4.根据权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤3）包括下述具体步骤：
3.1）取步骤2）所得，以5000×g离心力离心5min，用移液管吸取离心后的上清，加入10000MWCO超滤管中，以5000×g离心力离心20min；
3.2）在步骤3.1）的浓缩液中加入无菌PBS至原体积；
3.3）经步骤3.2）后，以5000×g离心力离心20min；
3.4）重复步骤3.2）、步骤3.3）3次，吸取浓缩液于无菌管中，即得到纯化的55型腺病毒。
5.根据权利要求4所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：还包括对55型腺病毒的检测，具体为：采用病毒核酸提取试剂盒提取离心后的上清中病毒DNA，采用荧光定量PCR方法进行核酸检测。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：还包括将纯化后的55型腺病毒保存于-70℃冰箱内。
7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述55型腺病毒的分离培养在BSL-2实验室完成。
8.一种口服55型腺病毒疫苗的应用，其特征在于：如权利要求1~7任一项所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法所制备的口服55型腺病毒疫苗在55型腺病毒方面的口服免疫应用。
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