CN116350766A - 手足口病的多价疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预防或治疗手足口病的疫苗，包括灭活的柯萨奇病毒A组4型毒株、柯萨奇病毒A组24型毒株、柯萨奇病毒B组4型毒株和/或埃可病毒6型毒株。本发明的疫苗还可以包括肠道病毒71型毒株、柯萨奇病毒A组16型毒株、柯萨奇病毒A组10型毒株和/或柯萨奇病毒A组6型毒株。本发明还公开了所述疫苗的制备方法和应用。

Description

手足口病的多价疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种预防或治疗手足口病的疫苗，及其制备方法和应用。
背景技术
手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病，以婴幼儿发病较为常见。手足口病的主要表现为口腔、手、足部位皮疹，可并发脑膜炎、脑炎、肺水肿、循环衰竭等导致死亡的重症。
引起手足口病的病毒除肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)及柯萨奇病毒16型(Coxasckievirus A16，CA16)较为常见外，还包括柯萨奇病毒A组(CA)的2、4、5、6、10、24型等，柯萨奇病毒B组(CB)的1、2、3、4、5型等，肠道病毒68型(EV68)，以及埃可病毒(Echovirus，Echo)的6、25、30型等。EV71和CA16为引起HFMD爆发的主要病原体，近年来由CA10、CA24和CA6引起HFMD爆发的报道逐渐增多，甚至在某些地区已经成为主要的流行血清型。
手足口病已成为严重威胁儿童健康和社会稳定的公共卫生问题之一。目前，临床上尚无有效的治疗手足口病的抗病毒药物。虽然现有已获批的EV71灭活疫苗上市，但由于HFMD肠道病毒病原谱的改变以及导致HFMD高发的主导毒株类型多样，且病毒株之间不存在交叉免疫保护作用，无法实现对感染其他型手足口病毒的机体的保护，对防控HFMD提出了新的挑战。接种EV71灭活疫苗难以控制CA16、CA10、CA6和Echo等引起的手足口病的爆发和流行。
因此，亟需一种能够更大范围的预防手足口疾病的多血清型疫苗，以应对HFMD的爆发和重症疾病的流行。
发明内容
为了解决上述问题，本发明筛选出了具有良好免疫效果的可用于预防、治疗或抵抗手足口病的新的病毒株。在此基础上，开发了用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗手足口病的疫苗，所述疫苗包括灭活的柯萨奇病毒A组4型病毒(CA4)毒株、灭活的柯萨奇病毒A组24型病毒(CA24)毒株、灭活的柯萨奇病毒B组4型病毒(CB4)毒株和/或灭活的埃可病毒6型(Echo6)毒株。
根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒A组4型病毒(CA4)毒株于2021年12月02日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO:45051。
根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒A组24型病毒(CA24)毒株于2021年12月02日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO:45052。
根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒B组4型病毒(CB4)毒株于2021年12月02日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO:45053。
根据本发明的一些实施方式，所述埃可病毒6型(Echo6)毒株于2021年12月02日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO:45054。
根据本发明的一些实施方式，所述疫苗还包括灭活的肠道病毒71型病毒(EV71)、灭活的柯萨奇病毒A组16型病毒(CA16)、灭活的柯萨奇病毒A组10型病毒(CA10)和/或灭活的柯萨奇病毒A组6型病毒(CA6)。根据本发明的一些实施方式，所述疫苗包括灭活的CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和CA6。
根据本发明的一些实施方式，所述肠道病毒71型病毒(EV71)毒株的保藏编号为CGMCC No.3544。根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒A组16型病毒(CA16)毒株的保藏编号为CGMCC NO:18886。根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒A组10型病毒(CA10)毒株的保藏编号为CGMCC NO:18887。根据本发明的一些实施方式，所述柯萨奇病毒A组6型病毒(CA6)毒株的保藏编号为CGMCC NO:18888。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活肠道病毒71型病毒的抗原含量为100～1000U/mL，优选为500～1000U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒A组16型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为200～1600U/mL，更优选为800～1200U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒A组10型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为200～1600U/mL，更优选为800～1200U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒A组6型的抗原含量为1000～3000U/mL，优选为1500～3000U/mL，更优选为1600～2400U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒A组4型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL，更优选为1600～2400U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒A组24型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL，更优选为1600～2400U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活柯萨奇病毒B组4型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL，更优选为1600～2400U/mL。
根据本发明的一些实施方式，在所述疫苗中，所述灭活埃可病毒6型的抗原含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL，更优选为1600～2400U/mL。
根据本发明的具体实施方式，所述疫苗还包括铝佐剂。根据本发明的一个具体实施方式，所述铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。根据本发明的具体实施方式，所述铝佐剂的铝含量终浓度以铝离子计为0.1～1.0mg/mL，优选为0.2～0.8mg/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述疫苗为液体剂型。
根据本发明的又一方面，还提供了所述疫苗的制备方法。根据本发明的一些实施方式，所述方法包括以下步骤：分别制备灭活的CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6病毒原液，将所述原液分别吸附于铝佐剂，制备病毒铝吸附产物，然后将铝吸附产物混合制备疫苗。
根据本发明的具体实施方式，可通过以下步骤制备得到疫苗病毒纯化液：
(1)分别将CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6病毒灭活，超滤浓缩；
(2)分别对经超滤浓缩的CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6病毒浓缩液，进行蔗糖密度梯度离心；
(3)收集离心液，合并。
根据本发明的具体实施方式，可预先制备CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6的病毒纯化液。
根据本发明的具体实施方式，EV71原液可通过以下步骤来制备：将EV71病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用微载体发酵罐逐级放大或细胞工厂平面培养5～9天；收获病毒液；对病毒液采用甲醛灭活；采用100～500KD的超滤膜进行超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液；通过超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质，得到EV71病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CA16原液可通过以下步骤来制备：将CA16病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养4～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心，以去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液；通过超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质；采用甲醛进行灭活，得到CA16病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CA10原液可通过以下步骤来制备：将CA10病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养2～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心，以去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质；采用甲醛进行灭活，得到CA10病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CA6原液可通过以下步骤来制备：将CA6病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养3～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心，以去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质；采用甲醛进行灭活，得到CA6病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CA4原液可通过以下步骤来制备：将CA4病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养2～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质残留；采用甲醛进行灭活，得到CA4病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CA24原液可通过以下步骤来制备：将CA24病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养3～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质残留；采用甲醛进行灭活，得到CA24病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，CB4原液可通过以下步骤来制备：将CB4病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养2～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质残留；采用甲醛进行灭活，得到CB4病毒原液。
根据本发明的具体实施方式，Echo6原液可通过以下步骤来制备：将Echo6病毒按照一定的MOI(感染复数)接种Vero细胞，采用发酵罐微载体逐级放大或细胞工厂平面培养2～9天；收获病毒液；采用100～500KD的超滤膜，对病毒液进行澄清，超滤浓缩；对超滤浓缩后的病毒液，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化去除杂质；合并收集到的目的病毒液，采用超滤方式进行脱糖处理；采用非限制性内切酶处理脱糖后的病毒液，超滤去除宿主细胞DNA；采用分子筛层析，去除内切酶等杂质残留；采用甲醛进行灭活，得到Echo6病毒原液。
病毒液纯化过程中全部采用物理方法进行，有效去除了宿主蛋白、宿主DNA、内切酶等杂质残留，为疫苗安全提供了保障。
将五种血清型的原液分别用铝佐剂吸附后，按照一定的比例混合，配制成疫苗半成品，分装后制成成品疫苗。
根据本发明的又一方面，提供了本发明的疫苗在预防或治疗手足口病中的应用。
本文中使用的术语“手足口病”或“HFMD”是由多种肠道病毒引起的急性传染病。引起手足口病的病毒包括例如肠道病毒(EV)和柯萨奇病毒，其中以EV71和CA16较为常见。除此之外，柯萨奇病毒还包括柯萨奇病毒A组(CA)的2、4、5、6、10、24型等，柯萨奇病毒B组(CB)的1、2、3、4、5型等，肠道病毒68型(EV68)，以及埃可病毒(Echo)的6、25、30型等。
根据本发明的具体实施方式，所述疫苗可以预防或治疗由CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6引起的手足口病。除了上述病毒引起的手足口病，本发明的疫苗还能够更大范围地预防或治疗由其他肠道病毒引起的手足口疾病。
本文中使用的术语“细胞病变效应”或“CPE”指，在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间的培养后，可用显微镜观察到细胞变圆、坏死、从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。特征性的肠道病毒致细胞病变效应通常可表现为细胞变圆、折光增强、从瓶壁脱落等。
目前还没有CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6联用的多价疫苗研制的相关报道。本发明首次提供了CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6多价疫苗，特别是提供了CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和CA6联用的八价疫苗，能够很好地预防由CA4、CA24、CB4、Echo6、EV71、CA16、CA10和/或CA6病毒引起的手足口病的发生。研究表明，本发明的疫苗可以同时预防多种病原体的侵染，并且这些抗原之间不存在相互干扰的现象，相应的免疫原性较单独抗原激发的免疫原性不会降低，具有很好的免疫原性和安全性，且稳定性好，可长期保存。多价疫苗的使用可以明显简化疫苗接种程序，提高接种效率并降低成本。本发明的疫苗制苗工艺一致性良好，工艺稳定，经过大量实验，筛选出了最佳的灭活工艺参数，既能提高疫苗的安全性能，实现完全灭活，同时将甲醛的使用量控制在最小限度，节省成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明的这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1.毒株的分离
从多地疾病预防控制中心获得手足口病患者咽拭子或粪便，采用生理盐水进行稀释，离心，分别经0.45μm和0.22μm的滤器过滤除菌。选择细胞生长状态良好，汇合至单层的敏感细胞(Vero细胞或人二倍体细胞)。病毒培养液为含2％小牛血清的M199培养基(GIBCO)。按照一定比例接种处理好的咽拭子/粪便标本，置于32.0℃～36.5℃，5％CO2培养箱中静置培养。每日观察接种后的细胞是否有特征性肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现。如果出现CPE且CPE程度达+++(1+，＜25％；2+，25％-50％；3+，50％-75％；4+，75％-100％)以上时，收获细胞培养物，用细胞培养物继续传代两次。如果无CPE出现，培养至第7天，冻融一次，收获细胞培养物，用细胞培养物继续传代两次。设1支生长状态良好且未接种标本的细胞培养管作为细胞对照。若细胞对照无CPE出现，则试验成立。
经3次盲传，细胞出现CPE的标本判为病毒分离阳性，对病毒分离阳性的细胞培养物继续进行PCR鉴定。
实施例2.毒株的鉴定
分别采用Elisa酶联免疫法和PCR，对实施例1中分离获得的毒株从免疫学和分子学水平进行鉴定。
(1)Elisa酶联免疫法鉴定
EV71抗原检测系统：包被EV71兔多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清(兰州民海)进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入EV71型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CA16抗原检测系统：包被CA16兔多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CA16型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CA10抗原检测系统：包被CA10兔多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CA10型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CA6抗原检测系统：包被CA6多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CA6型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CA4抗原检测系统：包被CA4多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CA4型特异单克隆抗体北京科兴，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CA24抗原检测系统：包被CA24兔多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CA24型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
CB4抗原检测系统：包被CB4多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入CB4型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
Echo6抗原检测系统：包被Echo6多抗(北京科兴)，2～8℃过夜，采用10％小牛血清进行37℃封闭1～2小时，加入待鉴定病毒培养物，设置阴性对照孔，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，加入Echo6型特异单克隆抗体(北京科兴)，36～37℃温育1小时，洗板3～5遍，显色，终止反应。
分别采用以上八套抗原检测系统对实施例1中分离出的毒株，以及所使用的CA16、CA10、CA6、EV71毒株进行鉴定，结果如表1～表8所示。
表1.CA16毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71病毒 0.049 阴性
CA16病毒 2.015 阳性
CA10病毒 0.054 阴性
CA6病毒 0.061 阴性
Echo6病毒 0.052 阴性
CA24病毒 0.046 阴性
CA4病毒 0.058 阴性
CB4病毒 0.048 阴性
阴性对照孔 0.068 阴性成立
表2.CA10毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71毒株 0.056 阴性
CA16毒株 0.034 阴性
CA10毒株 1.875 阳性
CA6毒株 0.049 阴性
Echo6毒株 0.056 阴性
CA24毒株 0.066 阴性
CA4毒株 0.052 阴性
CB4毒株 0.060 阴性
阴性对照孔 0.058 阴性成立
表3.CA6毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
Figure BDA0003437456860000081
Figure BDA0003437456860000091
表4.Echo6毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71毒株 0.062 阴性
CA16毒株 0.040 阴性
CA10毒株 0.057 阴性
CA6毒株 0.045 阴性
Echo6毒株 1.966 阳性
CA24毒株 0.052 阴性
CA4毒株 0.049 阴性
CB4毒株 0.055 阴性
阴性对照孔 0.050 阴性成立
表5.CA24毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71毒株 0.058 阴性
CA16毒株 0.038 阴性
CA10毒株 0.061 阴性
CA6毒株 0.055 阴性
Echo6毒株 0.043 阴性
CA24毒株 2.136 阳性
CA4毒株 0.050 阴性
CB4毒株 0.048 阴性
阴性对照孔 0.062 阴性成立
表6.CA4毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
Figure BDA0003437456860000092
Figure BDA0003437456860000101
表7.CB4毒株的Elisa抗原系统鉴定结果+
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71毒株 0.052 阴性
CA16毒株 0.044 阴性
CA10毒株 0.059 阴性
CA6毒株 0.048 阴性
Echo6毒株 0.056 阴性
CA24毒株 0.045 阴性
CA4毒株 0.064 阴性
CB4毒株 1.985 阳性
阴性对照孔 0.061 阴性成立
表8.EV71毒株的Elisa抗原系统鉴定结果
抗原检测系统 OD值 结果判断
EV71毒株 2.046 阳性
CA16毒株 0.039 阴性
CA10毒株 0.043 阴性
CA6毒株 0.038 阴性
Echo6毒株 0.040 阴性
CA24毒株 0.041 阴性
CA4毒株 0.045 阴性
CB4毒株 0.051 阴性
阴性对照孔 0.050 阴性成立
(2)分子水平的鉴定
采用RNA提取试剂盒(QIAGEN)提取病毒RNA，采用逆转录试剂盒(TAKARA)对提取的RNA进行一步法逆转录和PCR扩增，引物序列自行设计后由华大基因测序有限公司合成，1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。逆转录条件：
Figure BDA0003437456860000102
经PCR扩增，测序。将测序结果在NCBI数据库中比对，将实施例1中分离出的病毒株鉴定为相应型别的CA4、CA24、CB4、Echo6毒株。建立这些毒株的种子库，并送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，其中CA4毒株保藏编号为CGMCCNO:45051；CA24毒株保藏编号为CGMCC NO:45052；CB4毒株保藏编号为CGMCC NO:45053；Echo6毒株保藏编号为CGMCC NO:45054。
实施例3.单价原液的生产
130L发酵罐内微载体(GE Healthcare,Cytodex)投放量2～6g/L，按照细胞数量10～50×104个/mL接种Vero细胞，pH7.0～7.5，溶氧量约50％；35～37.5℃的条件下培养3～7天，根据细胞计数量，按照MOI 0.001～0.1的比例接种病毒，继续培养3～6天，收获含病毒的培养上清液。
采用100～500KD的超滤膜包对上清液进行澄清、超滤浓缩，去除杂质蛋白。超滤浓缩后的病毒液采用蔗糖密度梯度离心进行纯化，去除杂质和空实心病毒颗粒分离，超速离心条件为2～8℃，离心速度20000～50000rpm，离心8～18小时。合并收集超速离心的目的病毒，采用超滤方式进行脱糖处理。采用非限制性内切酶，于18～30℃的条件下搅拌处理脱糖后的病毒液。然后，超滤去除宿主细胞DNA，分子筛层析去除内切酶等杂质残留。采用1:2000～1:8000的甲醛溶液，于35～38℃的条件下灭活2～6天，直至病毒完全灭活。经过上述步骤得到灭活的CA6、CA16、CA10、CA4、CA24、CB4、Echo6型毒株的病毒原液。
EV71原液的生产采用发酵罐或细胞工厂培养，收获病毒后先灭活再纯化，其他工序段工艺与CA6、CA16、CA10、CA4、CA24、CB4、Echo6型毒株的相当。
实施例4.单价铝吸附疫苗的配制
单价铝吸附疫苗的制备：用0.85％生理盐水将铝佐剂稀释至3.0mg/mL(以Al(OH)3计)，用0.01M PBS将EV71抗原稀释至400～6000U/mL，将CA16和CA10抗原稀释至800～9600U/mL，将CA6抗原稀释至4000～18000U/mL，将CA4抗原稀释至3000～18000U/mL，将CA24抗原稀释至3000～18000U/mL，将CB4抗原稀释至3000～18000U/mL，将Echo6抗原稀释至800～15000U/mL。室温下，将稀释后的铝佐剂分别加入到稀释后的EV71、CA16、CA10、CA6、CA4、CA24、CB4、Echo6抗原中，使二者等体积进行吸附，边加边搅拌，完毕后继续室温混合30分钟，获得EV71、CA16、CA10、CA6、CA4、CA24、CB4、Echo6单价铝吸附疫苗。
实施例5.八价疫苗的配制
将上述八种型别的单价铝吸附产物按照一定的比例进行混合、分装，制备成成品八价手足口病疫苗。具体操作过程如下：
将上述获得的EV71、CA16、CA10、CA6、CA4、CA24、CB4、Echo6单价铝吸附疫苗按照一定的比例混合，根据疫苗原液的抗原含量，用0.01M PBS(pH 7.2)溶液和氢氧化铝溶液适当稀释，然后室温搅拌吸附20±10分钟，即得到疫苗半成品。在得到的疫苗半成品中，氢氧化铝的终浓度约为1.30mg/mL(换算成铝离子的终浓度为0.45mg/mL)，EV71的抗原含量为960U/mL，CA16的抗原含量为200～1600U/mL，CA10的抗原含量为200～1600U/mL，CA6的抗原含量为1000～3000U/mL，CA4的抗原含量为1000～3000U/mL，CA24的抗原含量为1000U/mL～3000U/mL，CB4的抗原含量为1000～3000U/mL，Echo6的抗原含量为200～2500U/mL，半成品中上述各抗原含量对应的蛋白剂量范围分别为1～8μg/mL，即八价半成品疫苗的总蛋白剂量为8～64μg/mL。之后对得到的疫苗半成品进行注射器灌装，得到疫苗成品。疫苗成品的剂量为0.5mL/人份，疫苗成品中各病毒组分蛋白质含量≤4μg/人份。
按照上述方法配制八价手足口病疫苗，具体参数如表9所示，每个参数进行连续三批疫苗的制备。
表9.八价疫苗的参数设置
Figure BDA0003437456860000121
实施例6.八价疫苗的评价
(1)八价疫苗成品的测试
分别检测上述八价手足口病疫苗1～15中的氢氧化铝含量、上清抗原含量、解离后抗原含量，计算吸附率及解离率，结果见表10。
Figure BDA0003437456860000131
Figure BDA0003437456860000141
(2)免疫原性测试
采用上述疫苗1的三批八价疫苗分别两针免疫大鼠和小鼠，检测血清中的中和抗体滴度。同时设立单价疫苗对照和阴性对照。重复三次。用微量细胞病变法检测中和抗体效价。检定用细胞为人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)细胞，细胞在37℃培养7天，观察细胞病变。中和抗体效价及阳转率结果见表11。疫苗中各病毒组份免疫原性分别与相对应单价疫苗进行统计学分析，结果见表12。根据统计分析，八价疫苗与单价疫苗的中和抗体的几何平均滴度(GMT)值均无显著性差异(P值均大于0.05)。
表11.中和抗体效价及阳转率
Figure BDA0003437456860000151
表12.八价疫苗与单价疫苗免疫原性的结果统计学分析
Figure BDA0003437456860000152
(3)安全性评价
在评估各疫苗免疫原性的整个实验期内，所有动物均健康存活，临床表现无异常。对疫苗1的三批EV71/CA16/CA10/CA6/CA4/CA24/CB4/Echo6八价疫苗进行异常毒性试验，以验证其动物安全性评价。
异常毒性试验包括小鼠试验和豚鼠试验。小鼠试验中，EV71/CA16/CA10/CA6/CA4/CA24/CB4/Echo6八价疫苗注射18～22g小鼠5只，0.5mL/只，观察7天。观察期内，小鼠全部健存，且无异常反应，到期时小鼠体重增加。豚鼠试验中，EV71/CA16/CA10/CA6/CA4/CA24/CB4/Echo6疫苗注射250～350g豚鼠2只，5mL/只，观察7天。观察期内，豚鼠全部健存，且无异常反应，到期时豚鼠体重增加。
(4)稳定性评价
将疫苗1的三批联苗成品储存在2～8℃环境下，按时间点取样检测抗原含量、外观、装量、pH值、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、甲醛含量等。记录数据至12个月，并在第12月检测疫苗的异常毒性及免疫原性。疫苗成品2～8℃放置12个月，各项检测指标均未见明显下降。结果见表13～表15。
表13.八价疫苗成品在2～8℃保存一段时间后的抗原含量检测结果。
Figure BDA0003437456860000161
表14.八价疫苗成品在2～8℃保存一段时间后的pH值、渗透压摩尔浓度和无菌检验。
Figure BDA0003437456860000171
表15.八价疫苗成品在2～8℃保存一段时间后的毒性和中和抗体GMT。
Figure BDA0003437456860000172
注：“/”表示未进行此项检测。
除疫苗1外，疫苗2～15也均进行了免疫原性测试，同时也进行安全性评价和稳定性评价。结果表明疫苗2～15与单价疫苗的中和抗体GMT值均无显著性差异，同时疫苗2～15与疫苗1类似，均具有安全性好且稳定性高的优势。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种用于预防或治疗手足口病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括灭活的柯萨奇病毒A组4型毒株、灭活的柯萨奇病毒A组24型毒株、灭活的柯萨奇病毒B组4型毒株和/或灭活的埃可病毒6型毒株，
所述柯萨奇病毒A组4型毒株的保藏编号为CGMCC NO:45051；
所述柯萨奇病毒A组24型毒株的保藏编号为CGMCC NO:45052；
所述柯萨奇病毒B组4型毒株的保藏编号为CGMCC NO:45053；
所述埃可病毒6型毒株的保藏编号为CGMCC NO:45054。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括灭活的肠道病毒71型毒株、灭活的柯萨奇病毒A组16型毒株、灭活的柯萨奇病毒A组10型毒株和/或灭活的柯萨奇病毒A组6型毒株。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，
所述肠道病毒71型毒株的保藏编号为CGMCC No.3544；
所述柯萨奇病毒A组16型毒株的保藏编号为CGMCC NO:18886；
所述柯萨奇病毒A组10型毒株的保藏编号为CGMCC NO:18887；
所述柯萨奇病毒A组6型毒株的保藏编号为CGMCC NO:18888。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其特征在于，在所述疫苗中，
所述灭活的柯萨奇病毒A组4型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL；
所述灭活的柯萨奇病毒A组24型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL；
所述灭活的柯萨奇病毒B组4型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL；
所述灭活的埃可病毒6型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为1000～3000U/mL。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的疫苗，其特征在于，在所述疫苗中，
所述灭活的肠道病毒71型毒株的含量为100～1000U/mL，优选为500～1000U/mL；
所述灭活的柯萨奇病毒A组16型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为200～1600U/mL；
所述灭活的柯萨奇病毒A组10型毒株的含量为200～3000U/mL，优选为200～1600U/mL；
所述灭活的柯萨奇病毒A组6型毒株的含量为1000～3000U/mL，优选为1500～3000U/mL。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括铝佐剂，所述铝佐剂优选地选自氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述铝佐剂的铝含量终浓度以铝离子计为0.1～1.0mg/mL，优选为0.2～0.8mg/mL。
8.一种制备如权利要求1至7中任一项所述的疫苗的方法。
9.权利要求1至7中任一项所述的疫苗在制备预防或治疗手足口病的药物中的应用。
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