JP4249013B2 - Pd−1に対し特異性を有する物質 - Google Patents
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Description
本発明は、PD−1を認識する物質、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質およびリンカーからなる物質に関する。
背景技術
免疫システムは多様な外来抗原に対し応答できる機構を獲得した。その機構とはT細胞、B細胞においてV(D)J断片の組替えにより抗原レセプターの多様性をもたらすものである。この機構は同時に自己反応性リンパ球を産出する結果となったが、これら自己反応性リンパ球は胸腺や骨髄における負の選択によって除かれ、更に末梢においてもクローン除去やアナジーという自己免疫寛容機構により制御されている。
自己免疫疾患は、自己免疫寛容の破綻により発症すると考えられるが、その発症機序の解明に向けて様々な疾患モデルマウスを用いた研究がなされてきた。しかし、自己免疫疾患の病因学的解明や自己免疫寛容の分子機構に関しては依然不明な点が多い。このような状況において、単一遺伝子欠損にて自己免疫疾患を発症するマウスの存在は、分子生物学的な観点から病因学的考察を図る上で極めて重要である。致死性全身性リンパ球浸潤を起すCTLA4−/−マウス(Waterhouse、P.et.al.:Science 270:985〜988,1995,Tivol,E.A.et.al.:Immunity,3:541〜547,1995)SHP−1欠損mothaten mice(Shulltz,L.D.et.al.:Cell,73:1445〜1454,1993)、TGF−β−1ノックアウトマウス(Shull.M.M.et.al.:Nature,359:693〜699,1992)や、糸球体腎炎を発症するlyn−/−マウス(Hibbs,M.L.et.al.:Cell,83:301〜311,1995)、及びFCRIIB−/−マウス(Bolland,S.& Ravetch,J.V.:Immunity,13:277〜285,2000)等はその代表であり、これらの分子と自己免疫寛容との関連が研究されている。
PD−1は免疫グロブリンファミリーに属する55kDのI型膜タンパクである。マウスPD−1とヒトPD−1は共に288個のアミノ酸からなり、N末端のシグナルペプチド(20アミノ酸)と中間部位に細胞膜貫通領域である疎水性領域を有する(The EMBO J.,vol.11(11),3887〜3895(1992);特開平5−336973号;EMBL/GenBank/DDJB Acc.No.X 67914、Genomics23:704(1994);特開平7−291996号(米国特許第5629204号))。
PD−1の発現は、胸腺細胞においてはCD4−CD8−からCD4+CD8+細胞に分化する際に認められる(Nishimura,H.et.al.:Int.Immunol.,8:773〜780,1996,Nishimura,H.et.al.:J.Exp.Med.,191:891〜898,2000)。また、末梢においてPD−1の発現は、抗原レセプターからの刺激により活性化したT細胞、B細胞(Agata,Y.et.al.:Int.Immunol.,8:765〜772,1996)及び活性化マクロファージを含む骨髄細胞に認められる。
PD−1は、その細胞内領域にITIM(Immunoreceptor tyrosine−based inhibitory motif)を有し、従って免疫反応における負の制御因子と考えられる。PD−1欠損マウスにおいて糸球体腎炎、関節炎といったループス様自己免疫病(C57BL/6遺伝子背景)(Nishimura,H.et.al.:Int.Imuunol.,10:1563〜1572,1998,Nishimura,H.et.al.:Immunity,11:141〜151,1999)や、拡張性心筋症様疾患(BALB/c遺伝子背景)(Nishimura,H.et.al.:Science,291:319〜322,2001)を発症することから、PD−1が自己免疫疾患発症の、特に末梢自己免疫寛容の制御因子であることが明らかとなった。
発明の開示
PD−1は様々な自己免疫疾患の制御因子であり、自己免疫疾患の原因遺伝子の一つであると考えられる。PD−1の機能を制御することにより、免疫機能の低下または亢進、感染症、移植時の拒絶反応、腫瘍等の治療や診断を行えると考えて、鋭意検討を重ねた結果本発明者らはPD−1の機能を制御する物質に係る本発明に到達した。
免疫を司るリンパ球への刺激は主にT細胞の場合T細胞受容体(TCR)を、B細胞の場合B細胞受容体(BCR)を介し伝わり、その分子機構には細胞内リン酸化反応が重要な役割を担っている。
PD−1が免疫系においてリンパ球や骨髄系細胞等様々な免疫担当細胞を負に制御していることが明らかとなり、またPD−1の細胞内領域にITIM(Immunoreceptor tyrosine−based inhibitory motif)を有することから、本発明者らは、PD−1の抑制性シグナル伝達における分子機構は脱リン酸化酵素のリクルートと考えた。従って、TCRやBCRの近傍にPD−1を位置させることによって、PD−1の機能を発現させることができると考えるに至った。本発明者らは、PD−1とTCRあるいはBCRを架橋した物質によってPD−1の抑制性シグナルが伝わることを確認し、本発明を完成した。
本発明者らは、まず抗PD−1抗体と抗BCR抗体あるいは抗CD3抗体を用いて上記の考えが正しいことを確認した。CD3とはT細胞に発現する膜タンパクであり、TCRを構成する複合体の一つである。抗PD−1抗体と抗BCR抗体あるいは抗CD3抗体を架橋し、2価抗体を作製した。本発明では、この2価抗体をハイブリッド抗体と呼ぶ。本ハイブリッド抗体は、本発明者により初めて作製されたものである。
また、この本ハイブリッド抗体で2種の受容体を架橋することによりシグナルが伝達するとの知見も、今回初めて得られたものである。
すなわち本発明は、
1.PD−1を認識する物質、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質およびリンカーからなる物質、
2.PD−1を認識する物質、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質およびリンカーからなる2価物質である前記1記載の物質、
3.膜タンパクが、T細胞膜またはB細胞膜に存在するタンパクである前記1または2に記載の物質、
4.PD−1を認識する物質、T細胞受容体複合体を構成するタンパクを認識する物質またはB細胞受容体複合体を構成するタンパクを認識する物質およびリンカーからなる前記1または2に記載の物質、
5.PD−1を認識する物質およびタンパクを認識する物質が、各々2から5量体である前記1乃至4のいずれかに記載の物質、
6.PD−1を認識する物質およびタンパクを認識する物質の片方あるいは両方が抗体である前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
7.PD−1を認識する物質およびタンパクを認識する物質の片方あるいは両方が、抗体のFab部分である前記6のいずれかに記載の物質、
8.リンカーが有機化合物からなる前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
9.リンカーがペプチドからなる前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
10.PD−1を認識する物質およびタンパクを認識する物質が、各々ペプチドである前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
11.PD−1を認識する物質およびタンパクを認識する物質が、各々抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む複数のペプチドで構成される前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
12.PD−1を認識する物質、タンパクを認識する物質およびリンカーが、各々ペプチドである前記1乃至5のいずれかに記載の物質、
13.前記1に記載の物質を、PD−1が関与する疾患の治療および/または予防に有効な量含有する薬学的組成物、
14.疾患が神経変性疾患、自己免疫疾患、臓器移植片拒絶反応、腫瘍および感染症からなる群から選ばれる疾患である前記13に記載の薬学的組成物、
15.神経変性疾患が、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャドジェセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルトヤコブ病からなる群から選ばれる前記14に記載の薬学的組成物、および
16.自己免疫疾患が、糸球体腎炎、関節炎、拡張性心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾鮮、アレルギー性接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節せい動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病および橋本病からなる群から選ばれる前記14に記載の薬学的組成物に関する。
本発明で言うPD−1を認識する物質とは、特異的にPD−1を認識する物質であれば良く、例えば、抗PD−1抗体、抗PD−1抗体の断片、PD−1自体、PD−1の断片、PD−1のリガンド(PD−L1(Freeman,G.J.et.al.:J.Exp.Med.,192:1027−1034,2000)、PD−L2、PD−H3)、それらの断片、低分子有機化合物等が挙げられる。
より具体的には、2001年5月30日付で日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに第FERM P−18356号として寄託され、2002年7月16日付で、国際寄託番号FERM BP−8118として国際寄託に移管されている「J43」と命名したハイブリドーマが産生する抗PD−1抗体である。
好ましくは、この抗体のFab部分であるが、これに限定されるものではない。
本発明で言うPD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質とは、特異的にその膜タンパクを認識する物質であれば良く、例えば、T細胞上に発現するT細胞受容体(TCR)を構成する複合体(TCR複合体)等、B細胞上に発現するB細胞受容体(BCR)を構成する複合体(BCR複合体)等を特異的に認識する物質を意味し、例えば、TCR複合体を構成するタンパクの断片、抗TCR抗体、抗TCR抗体の断片、BCR複合体を構成するタンパクの断片、抗BCR抗体、抗BCR抗体の断片等が挙げられる。
好ましくは、抗TCR抗体のFab部分、抗BCR抗体のFab部分であるが、これに限定されるものではない。
抗TCR抗体および抗BCR抗体は、市販されているものを使用することができる。例えば、抗TCR抗体としては、抗CD3抗体(α−CD3εmAb、Pharmingen社製)、抗BCR抗体としては、抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体(Zymed社製)が入手可能である。
本発明で言うリンカーとは、上記のPD−1を認識する物質およびPD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質を適切な距離を保って繋ぐことができるもので有れば特に限定されない。より具体的には、ペプチド、アミド等が挙げられる。
リンカーは、市販されているものを使用することができ、例えば、フェニレンジマレイミド(Phenylenedimaleimide、Aldrich社製)が入手可能である。
本発明の主体であるPD−1に対する特異性を有する物質は、例えば以下のようにして作製することができる。
PD−1を特異的に認識する物質として抗体を選び、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパク(以後、単に膜タンパクと省略する。)を特異的に認識する物質も抗体である物質を本発明では、ハイブリッド抗体と呼ぶ。このハイブリッド抗体の作製法について説明する。
(1)PD−1あるいは膜タンパクを免疫抗原として、動物に感作し、
(2)感作動物の脾細胞と感作動物由来のミエローマ細胞を細胞融合し、
(3)得られたハイブリドーマより、感作抗原(PD−1あるいは膜タンパク)に対するモノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングし、
(4)目的とする抗体産生ハイブリドーマをクローニングし、
(5)クローン化された抗体産生ハイブリドーマを増殖させ、
(6)産生された抗体を分離精製し、
(7)得られた抗PD−1抗体と抗膜タンパク抗体をリンカーで架橋して作製することができる。
あるいは、(8)F(ab’)2を得るため、更にペプシン処理をし、分離精製し、
(9)調製したそれぞれのF(ab’)2を還元し、分離精製し、
(10)調製したそれぞれのFabSHをリンカーで架橋して作製することができる。
PD−1とPD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパク(膜タンパク)をそれぞれ特異的に認識する物質として、両方あるいは片方が低分子有機化合物である場合は、
(11)上記の手法で作製した抗体を用い、それぞれの抗原であるPD−1あるいは膜タンパクとの結合を適当な検出装置によって測定することによりその結合を阻害する低分子を見出し、
(12)その低分子同士あるいは抗体またはFabをリンカーによって架橋して作製することができる。
より具体的に各ステップを説明すると以下のようになる。
(1)感作の工程では、PD−1あるいは膜タンパクは感作動物に腹腔内投与あるいはフットパットに投与することが好ましい。また感作動物は、マウス、ラットなどの一般にモノクローナル抗体が得られている動物であれば特に限定されない。抗原の投与量は、例えばマウスの場合、1回につき10〜200μgを投与すれば十分である。
(2)の細胞融合は、(1)で免疫感作した感作動物のうち、抗体価が十分に上昇してきた感作動物の脾臓を摘出し、常法に従って、脾細胞の懸濁液を調製し、次に得られた脾細胞と感作動物由来のミエローマ細胞との混合物に37℃でポリエチレングリコール(好ましくは、PEG4000)を加えることによって行なわれる。マウスミエローマ細胞にはP3×63Ag8、P3/NS1/1−Ag4−1、SP−2/0−Ag−14など数種類が知られており、いずれも容易に入手可能である。
ミエローマ細胞はHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地)では生存できないHGPRT(ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ)欠損細胞株が有用であり、さらにミエローマ細胞自身が抗体を分泌しない細胞株であることが望ましい。好適にはSP−2/0−Ag−14が用いられる。
次に、得られた細胞融合の混合物を、低細胞密度で96マイクロウェルプレートに分注し、HAT培地で培養する。1〜2週間の培養で未融合のミエローマ細胞、ミエローマ細胞同志のハイブリドーマ、さらに未融合の脾細胞、脾細胞同志のハイブリドーマは生存条件が満足されないため死滅し、脾細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが増殖してくる。
(3)のスクリーニングは、ハイブリドーマ培養上清と固相化した抗原を反応させ、抗原に特異的に吸着した上清中の抗体を、標識された第2抗体を用いて定量することによって、PD−1あるいは膜タンパクに対する抗体を産生しているハイブリドーマか否かを判定する。
(4)の工程は、抗体産生ハイブリドーマを軟寒天培養法(Monoclonal Antibodies,372(1980))に従ってクローニングすることによって行なわれる。この際、限界希釈法を用いることも可能である。
(5)の工程は、クローン化されたハイブリドーマを通常の培地で培養し、その培養上清から分離精製することにより得られるが、より大量の抗体を効率よく得るにはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、増殖させ、その腹水中より分離精製する方法が用いられる。
(6)の工程は、通常の方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製できるが、より効果的にはプロテインA−セファロースCL−4B(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いたアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。
本発明のハイブリッド抗体は、PD−1を特異的に認識するので、PD−1の精製および濃縮、例えばアフィニティークロマトグラフィーなどに利用することができる。
(7)の工程は、架橋剤として、例えばスルフォ−EMCS(N−(6−マレイミドカプロキシ)スルフォスクシンイミドナトリウム塩)を抗体のアミド基またはSH(メルカプト)基に結合させることで架橋できる。どちらか一方の抗体をまずsulfo−EMCSとアミドカップリング結合させ、未反応のsulfo−EMCSをゲルろ過で分離し、2−メルカプトエチルアミンなどで還元した他方の抗体のSH(メルカプト)基と最初の抗体に結合したsulfo−EMCSのマレイミド基を反応させ、ゲルろ過で2種の抗体同士が架橋されたものを分取する。
(8)の工程は、行程(6)で得られたそれぞれの抗体にペプシンを加え、37℃で48時間消化する。ペプシン消化されたF(ab’)2の分離精製には、通常の方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製できるが、より効果的にはセファクリルS−200(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いたゲルろ過が用いられる。
(9)の工程は、F(ab’)2に2−メルカプトエタノールを加え、30℃で30分間還元する。還元されたFabSHの分離精製には、通常の方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製できるが、より効果的にはセファクリルS−200を用いたゲルろ過が用いられる。
(10)の工程は、一方の抗体のFabSH画分にリンカーを結合させる。架橋剤としてFabSHのメルカプト(SH)基に結合できるものであれば良く、例えばフェニレンジマレイミドを加え、室温で30分間反応させる。次に、他方のFabSHを1.3倍量加え、室温で4時間反応させる。得られる2価の特異性を有する物質の分離精製は、通常の方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製できるが、より効果的にはセファクリルS−200を用いたゲルろ過が用いられる。
(11)の工程は、工程(6)で得られた抗体をそのまま用いるか、常法により適当に標識(例えばビオチン化標識、FITC標識等)して用いることができる。ELISA法を用いる場合は、常法により抗原を固相化し、抗体を添加する。次に酵素標識した2次抗体、ビオチン化標識した抗体を用いる場合は、酵素標識したストレプトアビジンを添加した後、抗体と抗原との特異的結合を、クロモフォー産生物質存在下で吸光光度計により測定する。このアッセイ系を用いることによって、PD−1あるいは膜タンパクを特異的に認識する低分子が得られる。
(12)の工程は、片方が抗体あるいはFabである場合、得られた低分子に適当な官能基を導入することで、抗体あるいはFabと結合させることができる。例えば、マレイミド基を導入すれば、抗体あるいはFabのメルカプト(SH)基に結合させることが可能である。また、低分子同士であれば、両物質を含む分子を合成することが可能である。
PD−1を特異的に認識する物質として抗体を、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを特異的に認識する物質としても抗体を選び、これらを一つのペプチド中に含有する物質を本発明では、バイスペシフィック抗体と呼ぶ。このバイスペシフィック抗体の作製法について説明する。
(1)抗PD−1抗体および抗膜タンパク抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子を単離し、
(2)抗PD−1抗体遺伝子の可変領域と抗膜タンパク抗体遺伝子の可変領域をリンカーDNAを用いて連結し、連結したDNA断片を発現ベクターに組み込み、細胞に発現ベクターを導入して増殖させ、
(3)産生されたタンパクを分離精製してバイスペシフィック抗体を作製することができる。
より具体的に各ステップを説明すると以下のようになる。
(1)の工程は、ハイブリドーマ細胞からRNAを単離し、抗体遺伝子またはその部分ペプチドをコードするcDNAを単離する工程からなる。
ハイブリドーマ細胞から全RNA(total RNA)またはmRNAを単離する工程は、公知の方法(以下、公知の方法は特に記載がなければMolecular Cloning(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊)またはCurrent Protocol in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、John Wiley & Sons,Inc.より発刊)に記載の方法)に従って行うことができる。
本発明の抗体遺伝子またはその部分ペプチドをコードするcDNAのクローニングの手段としては、本発明の抗体タンパク質の部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;以下、PCR法と略称する。)によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだcDNAを本発明の抗体タンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は公知の方法に従って行うことができる。抗体遺伝子は、全RNA(total RNA)またはmRNAを用いて直接、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction;以下、RT−PCR法と略称する。)によって増幅することもできる。
(2)本発明のバイスペシフィック抗体を取得する方法としては、
i)ペプチド合成する方法、または
ii)遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的にはii)に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてペプチドを生産するための発現系(宿主−ベクター系)としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、例えば、配列番号28で示される塩基配列の5’末端に開始コドン(ATG)を付加し、得られたDNAを、適当なプロモーター(例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、λPLプロモーター、T7プロモーター等)の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター(例えば、pBR322、pUC18、pUC19等)に挿入して発現ベクターを作製する。
次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌(例えば、E.Coli DH1、E.Coli JM109、E.Coli HB101株等)を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド(例えば、pelBのシグナルペプチド)を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするペプチドを分泌することもできる。さらに、他のペプチドとのフュージョン・プロテイン(fusion protein)を生産することもできる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号28で示される塩基配列を適当なベクター(例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、SV40系ベクター等)中の適当なプロモーター(例えば、SV40プロモーター、LTRプロモーター、メタロチオネインプロモーター等)の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞(例えば,サルCOS−1細胞、COS−7細胞、チャイニーズハムスターCHO細胞、マウスL細胞、293T細胞等)を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするペプチドが分泌される。
大腸菌を形質変換するには、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),vol.69,2110(1972)やGene,vol.17,107(1982)などに記載の方法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8新細胞工学実験プロトコール,263(秀潤社より1995年に発行)やVirology,vol.52,456(1973)などに記載の方法に従って行うことができる。
遺伝子組み換え技術を用いて直接バイスペシフィック抗体を作製する技術が知られている。例えば、Altら、FEBS Letter,vol.454,90(1999)によって、癌胎児抗原および大腸菌β−ガラクトシダーゼに対するバイスペシフィック抗体(シングルチェーンダイアボディーと呼ばれる。)の作製が報告されている。該断片は同一鎖上の2つの連続したドメイン間で対合するには短すぎるリンカーによって一方の重鎖可変ドメイン(VH)と他方の軽鎖可変ドメイン(VL)が連結されている。そのため、該断片のVHおよびVLドメインは、別の断片の相補的VLおよびVHドメインと対合することを余儀なくされ、それにより2つの抗原結合部位を形成する。
ペプチドリンカーは3−12アミノ酸残基が好ましいが、配列は特に限定されない(Hudsonら、J.Immunol.Met.,vol.231,177(1999))。
(3)以上のようにして得られたペプチドは、通常の方法、例えば塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどにより精製できる。
本発明のバイスペシフィック抗体もまた、PD−1を特異的に認識するので、PD−1の精製および濃縮、例えばアフィニティークロマトグラフィーなどに利用することができる。
産業上の利用可能性
[医薬品への適用]
本発明のPD−1に対し特異性を有する物質の最大かつ重要な利用方法は下記の疾患の治療に用いることである。
本発明のPD−1に対し特異性を有する物質は、例えば、神経変性疾患(パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャドジェセフ病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルトヤコブ病等)等の疾患の治療および/または予防に有用である。
また、本発明のPD−1に対し特異性を有する物質は、PD−1が関与し、免疫反応が亢進することによる疾患、例えば、自己免疫疾患(糸球体腎炎、関節炎、拡張性心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾鮮、アレルギー性接触性皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節せい動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病等)、臓器移植片拒絶反応、アレルギー等の疾患の治療および/または予防に有用である。
また、本発明のPD−1に対し特異性を有する物質は、PD−1が関与し、免疫反応が低下することによって引き起こされる疾患、例えば、腫瘍、感染症等の疾患の治療および/または予防に有用である。
本発明のPD−1に対する特異性を有する物質を上記の目的で用いるには、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、1回につき、0.1mgから100mgの範囲で、1日1回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、1回につき、0.01mgから30mgの範囲で、1日1回から数回非経口投与(好ましくは、静脈内投与)されるか、または1日1時間から24時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤、および非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
このような内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質がそのままか、または賦形剤(ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等)、結合剤(ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等)、崩壊剤(繊維素グリコール酸カルシウム等)、滑沢剤(ステアリン酸マグネシウム等)、安定剤、溶解補助剤(グルタミン酸、アスパラギン酸等)等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤(白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等)で被覆していてもよいし、また2以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤(精製水、エタノールまたはそれらの混液等)に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤(グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート80(登録商標)等)、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造、調製される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
非経口投与のための、その他の製剤としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏剤、塗布剤、吸入剤、スプレー剤、坐剤および膣内投与のためのペッサリー等が含まれる。
スプレー剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,355号に詳しく記載されている。
PD−1は、免疫反応に関与していることから、本発明のPD−1に対する特異性を有する物質を用いて、PD−1の発現を測定することによって、免疫反応に関与する物質のスクリーニング等にも利用することができる。
[発明の効果]
本発明のPD−1に対する特異性を有する物質は、PD−1を認識する物質、PD−1が発現している細胞膜に存在する膜タンパクを認識する物質およびそれらを繋ぐリンカーからなり、PD−1および膜タンパクを特異的に認識し、PD−1シグナルを伝達することができる優れた物質である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
抗PD−1抗体と抗T細胞受容体抗体をリンカーで繋いだものを、以下、抗PD−1/抗TCRハイブリッド抗体、抗PD−1抗体と抗B細胞受容体抗体をリンカーで繋いだものを、以下、抗PD−1/抗BCRハイブリッド抗体と略記する。また、抗PD−1抗体のFabSH画分と抗T細胞受容体抗体のFabSH画分をリンカーで繋いだものを、以下、抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体、抗PD−1抗体のFabSH画分と抗B細胞受容体抗体のFabSH画分をリンカーで繋いだものを、以下、抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体と略記する。
実施例1
(1)抗PD−1/抗TCRハイブリッド抗体の調製
(1−A)抗マウスCD3εモノクローナル抗体のマレイミド化
抗マウスCD3εモノクローナル抗体をリン酸ナトリウム(0.1M,pH7.0)、NaCl(50mM)で置換した後、200倍量のsulfo−EMCS(同仁化学研究所製)を加え、20℃で1時間反応させた。その後、セファクリルS−300[リン酸ナトリウム(0.1M,pH7.0)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(1−B)抗PD−1抗体の還元
マウスPD−1に対するモノクローナル抗体(国際寄託番号FERM BP−8118として、国際寄託されている「J43」と命名したハイブリドーマが産生する。)をリン酸ナトリウム(0.1M,pH6.0)で置換した後、2−メルカプトエチルアミン(終濃度10mM)、EDTA(終濃度1mM)を加え、37℃で90分間還元した。セファクリルS−300[リン酸ナトリウム(0.1M,pH6.0)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(シングルチェーン画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(1−C)マレイミド化抗マウスCD3εモノクローナル抗体と還元抗PD−1抗体の架橋
マレイミド化抗マウスCD3εモノクローナル抗体と還元抗PD−1抗体を1:4の割合で混合し、15℃で18時間反応させた。その後、セファクリルS−300[リン酸ナトリウム(0.1M,pH7.0)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(2)抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体の調製
(2−A)抗PD−1抗体のF(ab’)2画分の調製
マウスPD−1に対するモノクローナル抗体(国際寄託番号FERM BP−8118として、国際寄託されている「J43」と命名したハイブリドーマが産生する。)をペプシン−バッファー[酢酸ナトリウム(0.1M,pH4.5)、NaCl(0.1M)]に置換したのち、ペプシン(終濃度0.2mg/mL)を加え、37℃で48時間消化した。その後セファクリルS−200[Tris−HCl(0.2M,pH8.0)、EDTA(10mM)]を用いてゲルろ過を行った。280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(F(ab’)2画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(2−B)抗PD−1抗体のFabSH画分の調製
F(ab’)2画分に2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間還元した。氷冷したのち、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(FabSH画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(2−C)抗マウスCD3εモノクローナル抗体のF(ab’)2画分の調製
抗マウスCD3εモノクローナル抗体(Pharmingen社製)をペプシンバッファー[酢酸ナトリウム(0.1M,pH4.5)、NaCl(0.1M)]に置換したのち、ペプシン(終濃度0.2mg/mL)を加え、37℃で48時間消化した。その後セファクリルS−200[Tris−HCl(0.2M,pH8.0)、EDTA(10mM)]を用いてゲルろ過を行った。280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(F(ab’)2画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(2−D)抗マウスCD3εモノクローナル抗体のFabSH画分の調製
F(ab’)2画分に2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間還元した。氷冷したのち、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(FabSH画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(2−E)PD−1抗体のFabSH画分と抗マウスCD3εモノクローナル抗体のFabSH画分の架橋
(2−A)で調製したPD−1に対する抗体のFabSH画分にフェニレンジマレイミド(Aldrich製)(終濃度4mM)を加え、室温で30分間反応させ、これをJ43Fabmal画分とした。J43Fabmal画分及び抗マウスCD3εモノクローナル抗体のFabSH画分を1:1.3の比で加え、室温で4時間反応させた。次にTris−HCl(1M,pH8.0)を適量加えることで反応溶液のpHを8.0にし、2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間反応させた。ヨードアセトアミド(SIGMA製)(終濃度25mM)を加え、遮光下、室温で10分間反応させた。
最終的に、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(BsAb画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
実施例2:抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体の細胞表面抗原(PD−1及びCD3)に対する反応性の確認
PD−1陽性CD3陰性細胞としてmPD−1/A 20IIA1.6、PD−1陰性CD3陽性細胞としてマウス脾臓細胞から調製したナイーブT細胞を用い、1×106個の各細胞を回収し、91μLのFACSバッファー(PBS(−)+0.5%BSA EDTA(2mM) 0.01%NaN3)と、5μLマウス血清、及び4μLのハイブリッド抗体(2μg)を添加し、30分間氷上で静止した。PBS(−)で、1回洗浄し、二次抗体をそれぞれ2μL(1μg)添加し、FACSバッファーで最終的に100μLにフィルアップ(fill up)し、30分間氷上で静止した。その後、FACScanを用いて解析を行った。その結果を図1に示す(なお、以下の図において、ハイブリッドFab抗体をHFAbと記す。)。
作製した抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体が実際に細胞表面抗原に反応するかどうかをFACSsort(ベクトンディキンソン製)を用いて、解析した結果、それぞれの表面抗原に反応することを確認できた。
実施例3:活性化T細胞に対する抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体の効果
(A)脾臓T細胞の調製
BALB/cマウスから脾臓を摘出し、赤血球を溶血させた後、PBS(−)で1回洗浄し、培地RPMI1640(10%FCS,antibiotics)に懸濁した(1×108cells/mL)。さらに培地により平衡化されたT細胞分離用ナイロンファイバーカラム(Wako製)を用いてT細胞の単離調製した。
(B)活性化脾臓T細胞に対する抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体の効果
96wellプレートを0.5μg/mL及び5μg/mLの抗CD3抗体(クローン名KT3、Immuntech製)を37℃で3時間コートする。播種したT細胞(2×105cells/well/200μL)に、抗PD−1/抗TCRハイブリッド抗体(0.03、0.1、0.3、1、3μg/100mL)を加え、CO2インキュベーター内(37℃)で培養した。72時間後に回収した培養上清中のサイトカイン(IFN−γ、IL−2、IL−4、IL−10)の濃度をアッセイキット(R&D system製)を用いて測定した。
その結果は図2に示す通りであり、3μgの抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体を用いたときの72時間後において、0.5μg/mL及び5μg/mLのどちらの刺激においてIFN−g、IL−4、IL−10の産生を優位に抑制するという結果を得た。
実施例4:抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体の調製
(A)抗PD−1抗体のF(ab’)2画分の調製
マウスPD−1対するモノクローナル抗体(実施例1で用いたものと同じ抗体)をペプシンバッファー[酢酸ナトリウム(0.1M,pH4.5)、NaCl(0.1M)]に置換したのち、ペプシン(SIGMA製)(終濃度0.2mg/mL)を加え、37℃で48時間消化した。その後セファクリルS−200(AmarshamParmacia製)[Tris−HCl(0.2M,pH8.0)、EDTA(10mM)]を用いてゲルろ過を行った。280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(F(ab’)2画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(B)抗PD−1抗体のFabSH画分の調製
F(ab’)2画分に2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間還元した。氷冷したのち、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(FabSH画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(C)抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体のF(ab’)2画分の調製
ウサギ抗マウスIgG(H+L)ポリクローナル抗体(Zymed社製)をペプシンバッファー[酢酸ナトリウム(0.1M,pH4.5)、NaCl(0.1M)]に置換したのち、ペプシン(終濃度0.2mg/mL)を加え、37℃で48時間消化した。その後セファクリルS−200[Tris−HCl(0.2M,pH8.0)、EDTA(10mM)]を用いてゲルろ過を行った。280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(F(ab’)2画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(D)抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体のFabSH画分の調製
F(ab’)2画分に2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間還元した。氷冷したのち、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(FabSH画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
(E)抗PD−1抗体のFabSH画分と抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体のFabSH画分の架橋
PD−1に対する抗体J43のFabSH画分にフェニレンジマレイミド(Aldrich製)(終濃度4mM)を加え、室温で30分間反応させ、これをJ43Fabmal画分とした。J43Fabmal画分及び抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体のFabSH画分を1:1.3の比で加え、室温で4時間反応させた。次にTris−HCl(1M,pH8.0)を適量加えることで反応溶液のpHを8.0にし、2−メルカプトエタノール(終濃度20mM)を加え、30℃で30分間反応させた。ヨードアセトアミド(SIGMA製)(終濃度25mM)を加え、遮光下、室温で10分間反応させた。最終的に、セファクリルS−200[酢酸ナトリウム(50mM,pH6.3)、EDTA(1mM)]を用いてゲルろ過を行い、280nmの吸光度をモニターし、主要ピーク画分を分取した(BsAb画分)。また、同時に280nmの吸光度からタンパク量も算出した。
実施例5:B細胞株に対する抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体の効果
(A)マウスPD−1を強制発現させたA20IIA1.6(B細胞株)の作製
(1)マウスPD−1発現プラスミドの作製
EcoRIで切り出したmPD1−flagのDNA断片を、市販の発現ベクターのEcoRIサイトに組み込み、発現プラスミドmPD1−pAを構築した。
(2)トランスフェクション
1×107個のA20IIA1.6を325μlの氷冷した15%FCSを含むRPMIに懸濁した容液とScaI処理により直鎖状にしたPD−1発現プラスミドを10μlの蒸留水に懸濁した溶液をエレクトロポレーション用のキュベット(Gene Pulser Cuvette 0.4cm electrode gap、50、BIO RAD)に添加し、250V/960uF(Gene Pulser、BIO RAD)の設定で電圧をかけた。その後、10分間、室温で静置し、30mlの培地(RPMI1640中に10%FBS、50uM2−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシンを含む)に懸濁し、さらに30倍希釈し、96wellプレート103個/100μl/wellで分注した。
48時間後からファイナル(final)3μMのプロマイシンで選択を開始し、マウスPD−1発現細胞株を樹立した。
(B)マウスPD−1を強制発現させたA20IIA1.6に対する抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体の効果
マウスPD−1を強制発現させたA20IIA1.6を96wellプレートに播種した(5×105個/100μL)。抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体(0、1、3、10μg/100μL)を加えて10分後、抗マウスIgG(H+L)F(ab’)2(Zymed社製)(終濃度0.3、1、3μg/mL)を100μl分注して、CO2インキュベーター内(37℃)で12時間培養した。培養上清を回収し、培養上清中のIL−2の濃度をマウス(mouse)IL−2アッセイキット(R&G system製)を用いて測定した。その結果を図3に示す。
抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体及び抗BCR抗体F(ab’)2の投与量(dose)を変えて検討した結果、抗BCR抗体F(ab’)2の濃度にかかわらず、全ての場合において、ハイブリッドFab抗体において抑制効果が見られた。
(C)SHP−2動員の確認
3×106cells/100μLのマウスPD−1強制発現A20IIA1.6(B細胞株)に抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体(0、1、3、10μg/100μL)を加えた。10分後、抗マウスIgG(H+L)F(ab’)2(終濃度0.3、1、3μg/mL)を100μL添加し、5分間室温で反応させた。遠心して上清を除去した後、細胞を200μLのライシス・バッファ(Lysis buffer)(組成:Tris−HCl(20mM,pH7.4)、NaCl(150mM)、Na2EDTA(1mM)、EGTA(1mM)、1%Triton−×100、ピロリン酸ナトリウム(2.5mM)、β−グリセロリン酸ナトリウム(1mM)、Na3VO4(1mM)、ロイペプチン(1μg/mL)、PMSF(1mM))に懸濁し、氷上に静置した。30分後、遠心して上清を回収し、20μLのプロテインGセファロースビーズ(アマシャムバイオサイエンス社製)を加え、4℃で30分間反応させた。遠心して上清を回収し、あらかじめ抗FLAG抗体(SIGMA製)を結合させておいたプロテインGセファロースビーズを20μL添加し、4℃で一晩混合させた。
ビーズを400μLのライシス・バッファで5回洗浄したのち、20μLのライシス・バッファ及び20μLの2×SDSサンプルバッファを添加し、100℃で5分間煮沸した。遠心によりビーズを除去して、うち15μLを4−20%SDS−ポリアクリアミドゲル電気泳動する。泳動後、ゲルをブロッティングバッファに置換してから、PVDF膜(BIO RAD製)に転写した。転写後、膜を室温で1時間ブロック・エース(Block Ace)(大日本製薬製)でブロッキングした。
200倍に希釈した抗SHP−2抗体(SANTA CRUZ製)を、室温で1時間反応させた後、TBS−Tで10分間、3回洗浄した。その後、2000倍に希釈されたHRP標識抗ラビット(rabbit)Ig抗体(アマシャムバイオサイエンス社製)を室温で1時間反応させた後、TBS−Tで10分間、3回洗浄した。最終的にECLプラス・ティテェクション・キット(ECL plus detection kit)(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて発光させ、ルミノイメージャーLAS1000プラス(plus)(FUJI Film製)で解析した。
抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体が、抗BCR抗体刺激からのIL−2産生を抑制するという結果から、その効果が、脱リン酸化酵素SHP−2のPD−1のITIMへの動員によるものかどうかを証明するために評価を行った。図4に示すように、PD−1の量をコントロールとし、サンプル量を調製し、SHP−2の動員を定量した結果、コントロールハイブリッド抗体に対し、1及び10μgにおいて、明らかなSHP−2の動員が確認された。
実施例6:抗マウスPD−1抗体J43のcDNAクローニング
(1)抗マウスPD−1抗体J43の調製
37℃、5%CO2条件下、抗マウスPD−1抗体産生ハイブリドーマ(J43)を、Hybridoma SFM培地(インビトロジェン製)で培養し、数日後ハイブリドーマの培養上清を回収した。回収した培養上清より、HiTrap Protein G(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて、IgG画分を精製した。
(2)ペプチドシークエンス
J43IgGを10−20%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、泳動後のゲルからIgGをPVDF膜(バイオラッド製)に電気的に転写した。転写された膜をクマシー染色し、J43IgG軽鎖を含む膜を切り取り、ペプチドシークエンサーProcise492(アプライドバイオシステムズ製)を用いて、軽鎖のアミノ末端の配列15残基を決定した(配列番号1)。
(3)RNAの抽出
5×106個のハイブリドーマを1mLのTRIzol(インビトロジェン製)で溶解した。以下の操作は添付書に従い、全RNA(total RNA)を調製した。さらに調製した全RNA(total RNA)より、Oligotex−MAG mRNA Purification kit(宝酒造製)を用いて、mRNAを精製した。
(4)軽鎖cDNAのクローニング(3’RACE)
ペプチドシークエンスにより決定した軽鎖のアミノ末端の配列(YELTQPPSASVNVGE)より縮重プライマー(プライマーNo.1)を設計した。3’−Full RACE Core Set(宝酒造製)を用いて、以下に示した反応条件により、3’RACEを行った。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を1%アガロースゲル電気泳動後、ゲルをEtBr染色した。ゲルからDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(キアゲン製)を用いて回収し、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造製)を用いて、回収したDNA断片とpGEM−T Easy Vector(プロメガ製)を連結した。連結されたプラスミドを用いて、大腸菌DH5αを形質転換させた。最終的に、大腸菌よりプラスミドを精製して、J43IgG軽鎖cDNAの塩基配列を決定した(配列番号3)。cDNAから推定されるアミノ酸配列を配列表に示す(配列番号4)。
(5)重鎖cDNAのクローニング(5’RACE)
5’RACEを行うために、既報のハムスターIgG重鎖cDNA配列情報(GenBank Accession No.U17166)に基づき、定常領域のプライマーを設計した。5’−Full RACE Core Set(宝酒造製)を用いて、以下に示した反応条件により、5’RACEを行った。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を1%アガロースゲル電気泳動後、ゲルをEtBr染色した。ゲルからDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(キアゲン製)を用いて回収し、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造製)を用いて、回収したDNA断片とpGEM−T Easy Vector(プロメガ製)を連結した。連結されたプラスミドを用いて、大腸菌DH5αを形質転換させた。最終的に、大腸菌よりプラスミドを精製して、J43IgG重鎖cDNAの塩基配列を決定した(配列番号10)。cDNAから推定されるアミノ酸配列を配列表に示す(配列番号11)。
実施例7:抗マウスCD3ε抗体のcDNAクローニング
(1)RNAの調製
37℃、5%CO2条件下、抗マウスCD3ε抗体産生ハイブリドーマ(145−2C11:Pharmingen製)を、Hybridoma SFM培地(インビトロジェン製)で培養し、数日後5×106個のハイブリドーマを1mLのTRIzol(インビトロジェン製)で溶解した。以下の操作は添付書に従い、全RNA(total RNA)を調製した。
(2)cDNAライブラリーの作製
Ready−To−Go You−Prime First−Strand Beads(アマシャムファルマシア製)を用いて、ハイブリドーマ(145−2C11)から抽出した全RNA(total RNA)2.5μgから、オリゴdTプライム法によりcDNAを作製した。操作・手順については、添付書に従った。
(3)重鎖および軽鎖のcDNAクローニング
既報の145−2C11重鎖可変領域cDNA配列情報(GenBank Accession No.AF000357)に基づき、ハイブリドーマ145−2C11重鎖可変領域のプライマーNo.7およびNo.8を、また145−2C11軽鎖可変領域cDNA配列情報(GenBank Accession No.AF000356)に基づき、ハイブリドーマ145−2C11軽鎖可変領域のプライマーNo.9およびNo.10を設計した。ハイブリドーマ145−2C11cDNAライブラリーを鋳型とし、これらのプライマーを用いて、PCRを行った。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を1%アガロースゲル電気泳動後、ゲルをEtBr染色した。ゲルからDNA断片をMinElute Gel Extraction Kit(キアゲン製)を用いて回収し、回収したDNA断片をDNA Ligation kit ver.2(宝酒造製)を用いてpGEM−T Easy Vector(プロメガ製)に連結し、DNA Ligation kit ver.2(宝酒造製)を用いて、回収したDNA断片とpGEM−T Easy Vector(プロメガ製)を連結した。連結されたプラスミドを用いて、大腸菌DH5αを形質転換させた。最終的に、大腸菌よりプラスミドを精製して、DNAの塩基配列を決定し、GenBank Accession No.AF000357およびGenBank Accession No.AF000356と同一の配列であることを確認した。
実施例8:J43−2C11バイスペシフィック抗体発現プラスミドの構築
J43IgG重鎖cDNAと145−2C11IgG軽鎖cDNAをリンカーNo.1、No.2およびプライマーNo.11、No.12を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により連結して、フラグメント1(図5参照)を作製した。次に145−2C11IgG軽鎖cDNAと145−2C11IgG重鎖cDNAをリンカーNo.3、No.4およびプライマーNo.13、No.14を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により連結して、フラグメント2(図5参照)を作製した。145−2C11IgG重鎖cDNAとJ43IgG軽鎖cDNAをリンカーNo.5、No.6およびプライマーNo.15、No.16を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により連結して、フラグメント3(図5参照)を作製した。
DNAフラグメント1、2、3とプラスミドpBluescriptII SK(+)(ストラテジーン製)をそれぞれ、制限酵素EcoRI・KpnI、KpnI・SphI、SphI・XhoI、EcoRI・XhoIを用いて消化し、1%アガロース電気泳動を行った後、DNA断片をMinElute Gel Extraction Kitを用いてゲルから精製した。次に、この3個のフラグメントとプラスミドpBluescriptII SK(+)(ストラテジーン製)をDNALigation kit ver.2(宝酒造製)を用いて連結し、連結されたプラスミドを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。大腸菌よりプラスミドJ43−2C11scDb−pBluescriptII SK(+)を調製し、挿入部分の塩基配列を確認した(配列番号28)。塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表に示す(配列番号29)。
J43−2C11scDb−pBluescriptII SK(+)を制限酵素BamHIおよびXhoIで切断し、切断されてできたBamHI−XhoI断片とBamHI−BamHI断片のうち、最初にBamHI−XhoI断片をBamHIおよびXhoIで切断した哺乳動物細胞発現用ベクターpSecTag2/HygroB(インビトロジェン製)と連結した。次にBamHI−XhoI断片と連結したpSecTag2/HygroBを再び制限酵素BamHIで切断し、もう一方のBamHI−BamHI断片と連結した。連結したプラスミドを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。最終的に、大腸菌よりプラスミドJ43−2C11scDb−pSec/hygroBを調製し、作製したJ43−2C11バイスペシフィック抗体の塩基配列を確認した(配列番号30)。塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列表に示す(配列番号31)。
実施例9:J43−2C11バイスペシフィック抗体の発現
6×106個の293T細胞を20mLの培地(10%ウシ胎児血清を含むDMEM)に懸濁し、Type Icコラーゲンをコートした150mmディシュに播種した。翌日、細胞を10mLのDMEMで洗浄した後、LipofectAMINE−plusを用いてJ43−2C11scDb−pSec/hygroBを遺伝子導入した。3時間後、5mLの40%ウシ胎児血清を含むDMEMを添加した。2日目に細胞を10mLのDMEMで洗浄して新たな20mLのDMEMを添加し、4日目に培養上清を回収した。
遠心により細胞を除去後、0.22μmPVDFフィルターを通した。上清を、透析チューブにいれ40%PEG20000を含むPBS中で透析し、濃縮した。濃縮した上清をHiTrap chelating HP column(アマシャムファルマシア製)を用いて精製した。さらに、精製度を高めるためにHiprep 16/60 Sephacryl S−200 High Resolution(アマシャムファルマシア製)を用いて、ゲルろ過精製した。
実施例10:T細胞の活性化の抑制
BALB/cマウスから脾臓を摘出後、脾臓をセルストレイナー(70μm Nyron)を通して細胞を調製した。調製した細胞を遠心して回収後、溶血バッファー[NH4Cl(0.8%)、KCO3(0.1%)、EDTA(1mM)]を加え、赤血球を溶血させた。その細胞をPBS(−)で1回洗浄後、mouseCD3+T cell enrichment column kit(R&D製)を用いてT細胞を精製し、5×106個/mLの割合で培地(10%ウシ胎児血清を含むPRMI1640)に懸濁した。予め5μg/mLの抗CD3抗体(クローン名KT3)を37℃で3時間コートした96wellプレートに、先に調製したT細胞を2×105個/100μL/wellの割合で播種し、さらに培地で希釈したJ43−2C11バイスペシフィック抗体(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/100μL)を添加して、37℃、5%CO2条件下で72時間培養した。72時間後、培養上清を回収し上清中のIFN−rの濃度をQuantikine Immunoassay Kit(R&D製)を用いて定量した。
図6に示すように、J43−2C11バイスペシフィック抗体はインビトロ(in vitro)において活性化させたマウス脾臓T細胞の産生するIFN−rの量を用量依存的に減少させた。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体のFACS解析を示す。
図2は、活性化T細胞に対する抗PD−1/抗TCRハイブリッドFab抗体の効果を示す。
図3は、抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体による抗BCR抗体刺激に対するIL−2産生抑制効果を示す。
図4は、抗PD−1/抗BCRハイブリッドFab抗体による抗BCR抗体刺激後のSHP−2動員効果を示す。
図5は、J43−2C11バイスペシフィック抗体発現プラスミドJ43−2C11scDb−pSec/hygroBを示す。
図6は、活性化マウス脾臓T細胞のIFN−r産生に対するJ43−2C11バイスペシフィック抗体の効果を示す。
Claims (4)
- 配列番号31で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二重特異性抗体。
- 配列番号29で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより構成される二重特異性抗体。
- 配列番号30で示される塩基配列からなる、請求項1記載の二重特異性抗体をコードするcDNA。
- 配列番号28で示される塩基配列からなる、請求項2記載の二重特異性抗体をコードするcDNA。
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