PT1543038T - Purificação de proteína - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere"se, de modo geral, à purificação de proteína. Em particular, a invenção refere" se a um método para purificar um polipéptido (por exemplo, um anticorpo) a partir de uma composição que compreende o polipéptido e pelo menos um contaminante que utiliza o método de cromatografia de permuta de iões.

Descrição da Técnica Relacionada A purificação de proteínas económica, em larga escala é um problema crescentemente importante para a indústria de biotecnologia. Em geral, as proteínas são produzidas por cultura de célula que utiliza linhagens celulares eucariótica ou procariótica geneticamente modificadas para produzir a proteína de interesse por inserção de um plasmídeo recombinante que contém o gene para aquela proteína. Visto que as células tipicamente utilizadas são organismos vivos, as mesmas precisam de ser alimentadas com um meio de cultura complexo que contém açúcares, aminoácidos e fatores de cultura, geralmente supridos a partir de preparações de soro de animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos alimentada às células e dos subprodutos das próprias células para uma pureza suficiente para utilização como um terapêutico humano apresenta um grande desafio.

Os procedimentos para a purificação de proteínas a partir de restos de célula dependem inicialmente do local de expressão da proteína. Algumas proteínas podem ser levadas a serem secretadas diretamente a partir da célula nos meios de cultura circundantes; outras são produzidas intracelularmente. Para as últimas, a primeira etapa de um processo de purificação envolve lise da célula, o que pode ser feito através de uma variedade de métodos, o que inclui cisalhamento mecânico, choque osmótico ou tratamentos enzimáticos. Tal rutura liberta todo o conteúdo da célula no homogenado e, adicionalmente, produz fragmentos subcelulares que são difíceis de remover devido a seu tamanho pequeno. Os mesmos geralmente são removidos por centrifugação diferenciada ou por filtragem. 0 mesmo problema surge, embora em pequena escala, com as proteínas secretadas diretamente devido à morte natural de células e libertação de proteínas de célula hospedeira intracelular no curso da execução de produção de proteína.

Uma vez que uma solução clarificada que contém a proteína de interesse foi obtida, ao experimentar sua separação das outras proteínas produzidas pela célula com a utilização de uma combinação de diferentes técnicas de cromatografia. Essas técnicas separam misturas de proteínas com base em sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho. Diversas resinas de cromatografia diferentes estão disponíveis para cada uma dessas técnicas, o que permite uma formatação precisa do esquema de purificação para a proteína particular envolvida. A essência de cada um desses métodos de separação é que proteínas podem ser levadas a moverem"se em taxas diferentes por uma coluna longa, alcançando uma separação física que aumenta à medida que as mesmas passam pela coluna, ou a aderirem seletivamente ao meio de separação, sendo depois eluídas diferentemente por solventes diferentes. Em alguns casos, a proteína desejada é separada das impurezas quando as impurezas aderem especificamente à coluna e a proteína de interesse não adere, isto é, a proteína de interesse está presente no ífluxoí. A cromatografia de permuta de iões é uma especialidade cromatogrãfica que é comummente utilizada para a purificação de prote0 nas. Na cromatograf ia de permtia de iões, placas carregadas na superfície do soluto são atraídas por placas opostas até uma matriz de cromatografia, contanto que a força iónica do tampão circundante seja menor, A eluição geralmente é alcançada ao aumentar a força iónica (isto é, condutividade) do tampão para competir com o soluto pelos locais carregados da matriz de permuta de iões. Ao mudar o pH e, portanto, ao alterar a carga do soluto é outro modo se alcançar a eluição do soluto. A mudança na condutividade ou pH pode ser gradual (eluição gradiente) ou por etapas (eluição por etapas). No passado, essas mudanças foram progressivas; isto é, o pH ou condutividade é aumentado ou diminuído numa única direção.

Os documentos de Patente n- US 6.339. 142 e 6.417.355 (Basey et ai.) descrevem cromatografia de permuta de iões para purificar polipéptidos.

Os documentos de patente n£ US 6.127. 526 e 6.333.398 (Blank, G.) descrevem proteínas de purificação, tal como anticorpos anti'!HER2, por cromatograf ia de Proteína A. 0 documento WOQQ/55184 (Novo Nordisk A/S) descreve um processo de cromatografia de permuta de iões para purificar um péptido a partir de uma mistura que contém o péptido e impurezas relacionadas, que utiliza uma solução que contém um modificador orgânico (por exemplo, um álcool) para eluir impurezas, e revela que um meio de eluição aquoso suporta uma distribuição de carga de rede no péptido que difere da carga de rede das impurezas. 0 documento WO00/02921 (Biopure Corporation) descreve purificação de hemoglobina por cromatografia por permuta de iões que utiliza um gradiente de pH graduado. 0 documento WO98/30694 (Human Genome Sciences) descreve recetores de fator de necrose de tumor 6 e 6. Um exemplo de purificação de um polipéptido recetor de TNF que utiliza cromatografia de permuta de catiões é dado, o que inclui eluição com NaCl de um modo em etapas.

Harris et al,, em J. Chromatography 752: páginas 233 a 245 2001, descreve formas variantes de anticorpo rhuMAb HER2 terapêuticos trastuzumab) e sua separação que utiliza cromatografia de permuta de catiões com um gradiente de sal linear.

Sumário da invenção

Num aspeto, a presente invenção fornece um método para purificar um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e contaminantes. A composição é carregada numa resina de permuta de iões com um tampão de equilíbrio que tem uma primeira concentração de sal. A resina de permuta de iões é lavada com um tampão de lavagem até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo. Durante a lavagem, a concentração de sal do tampão de lavagem aumenta a partir de uma segunda concentração de sal inicial que é maior do que a concentração de sal do tampão de equilíbrio, até uma terceira concentração de sal final. Então, um volume fixo de tampão de lavagem na terceira concentração de sal final é passado através da resina. Finalmente, o polipéptido é eluído a partir da resina de permuta de iões com tampão de eluição que tem uma concentração de sal que é maior do que a concentração de sal final do tampão de lavagem.

Numa forma de realização, a resina de permuta de iões é uma resina de permuta de iões. Em outra forma de realização, a resina de permuta de iões é uma resina de permuta de catiões. Preferencialmente, a resina de permuta de catiões compreende sulfopropil imobilizado em agarose.

Em outra forma de realização, o tampão de eluição tem uma condutividade mais alta do que o tampão de equilíbrio. Numa forma de realização particular, o tampão de eluição compreende cerca de 14 5 mM de Na/HOAc e o tampão de equilíbrio compreende cerca de 70 mM de Na/HOAc. Em outra forma de realização, o tampão de eluição compreende cerca de 100 mM de NaCl e o tampão de equilíbrio compreende cerca de 45 mM de NaCl. 0 tampão de lavagem compreende, preferencialmente, uma mistura de tampão de equilíbrio e tampão de eluição. Portanto, numa forma de realização, o aumento na concentração de sal do tampão de lavagem durante a etapa (b) é alcançado ao aumentar a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem. A proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem pode ser aumentada a uma taxa constante. Numa forma de realização, o aumento na proporção de tampão de eluição leva a concentração de sal do tampão de lavagem a aumentar a uma taxa constante de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 3 mM por volume de coluna de tampão de lavagem.

Em outra forma de realização, a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta em duas ou mais taxas diferentes durante o decurso de lavagem na etapa (b). Por exemplo, a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta a uma primeira taxa para um primeiro segmento da lavagem, a uma segunda taxa para um segundo segmento da lavagem e a uma terceira taxa para um terceiro segmento da lavagem.

Numa forma de realização, o polipéptido que é purificado é um anticorpo. Nesse caso, o contaminante pode ser uma variante desaminada do anticorpo. Numa forma de realização particular, o anticorpo se liga a HER2. Numa forma de realização, a quantidade de anticorpo na composição carregada na resina de permuta de iões é a partir de cerca de 15 mg a cerca de 45 mg por mL de resina de permuta de catiões.

Numa forma de realização, a concentração de proteína predeterminada corresponde a uma DO de 0,6 medida a 280 nm. Em outra forma de realização, a partir de cerca de 0,4 a cerca de 1 volume de coluna de tampão de lavagem é passado através da resina de permuta de iões na etapa (c) . Numa forma de realização adicional, o pH do tampão de equilíbrio, tampão de lavagem e tampão de eluição é aproximadamente o mesmo, de preferência, aproximadamente, 5,5.

Em outra forma de realização, o método de purificação de um polipéptido compreende adicionalmente submeter a composição que compreende o polipéptido a uma ou mais etapas de purificação adicionais, de modo a obter uma preparação homogénea do polipéptido. Numa forma de realização adicional, uma composição farmacêutica é preparada ao combinar a preparação homogénea do polipéptido com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra forma de realização, o polipéptido purificado é conjugado com uma molécula heterõloga, por exemplo, polietileno glicol, um marcador ou um agente citotóxico.

Em outro aspeto, a invenção fornece um polipéptido que foi purificado de acordo com o método fornecido no presente documento.

Num aspeto adicional, a invenção fornece um método para purificar um anticorpo a partir de uma composição que compreende o polipéptido e um contaminante. 0 anticorpo é ligado a um material de permuta de catiões com um tampão de equilíbrio a uma primeira condutividade. 0 material de permuta de catiões é lavado com um tampão de lavagem, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta a partir de uma segunda condutividade que é maior do que a primeira condutividade para uma terceira condutividade durante a lavagem. Então, um volume fixo de tampão de lavagem na terceira condutividade é passado pelo material de permuta de catiões e o anticorpo é eluído a partir do material de permuta de catiões com um tampão de eluição a uma quarta condutividade que é maior do que a terceira condutividade. Preferencialmente, a resina de permuta de catiões compreende sulfopropil imobilizado em agarose. Numa forma de realização, o volume fixo de tampão de lavagem passado pelo material de permuta de catiões está entre cerca de 0,4 volume de coluna e cerca de 1,0 volume de coluna. O método pode incluir também a etapa de lavagem do material de permuta de iões com um tampão de regeneração subsequente à eluição do anticorpo.

Numa forma de realização, a condutividade do tampão de lavagem aumenta a uma taxa constante a partir da segunda condutividade para a terceira condutividade, enquanto em outra forma de realização, a condutividade do tampão de lavagem aumenta em duas ou mais taxas diferentes a partir da segunda condutividade para a terceira condutividade. Numa forma de realização particular, a condutividade do tampão de lavagem aumenta a uma primeira taxa para um primeiro segmento da lavagem, a uma segunda taxa para um segundo segmento da lavagem e numa terceira taxa para um terceiro segmento da lavagem.

Preferencialmente, o tampão de lavagem compreende uma mistura de tampão de equilíbrio e tampão de eluição. Nesse caso, a condutividade do tampão de lavagem pode ser aumentada ao aumentar a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem. Numa forma de realização, a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta a uma taxa constante de cerca de 6% durante o primeiro segmento, a uma taxa constante de cerca de 3,5% durante o segundo segmento e a uma taxa constante de cerca de 2% durante o terceiro segmento. Em outra forma de realização, a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta a partir de cerca de 26% a cerca de 54% durante o primeiro segmento, a partir de cerca de 54% a cerca de 61% durante o segundo segmento e a partir de cerca de 61% a cerca de 74% durante o segundo segmento.

Numa forma de realização adicional, o material de permuta de catiões é lavado com cerca de 5 volumes de coluna de tampão de lavagem no primeiro segmento, cerca de 2 volumes de coluna de tampão de lavagem no segundo segmento e cerca de 6 volumes de coluna de tampão de lavagem no terceiro segmento. A condutividade do tampão de lavagem pode ser aumentada ao aumentar a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem. Em outra forma de realização, a condutividade do tampão de lavagem é aumentada ao aumentar a concentração de sal no mesmo.

Num aspeto adicional, a invenção fornece um método para purificar um anticorpo a partir de uma composição que compreende o anticorpo e um contaminante. Preferencialmente, a composição é carregada num material de permuta de cat. iões, o material de permuta de catiões é lavado com um tampão de lavagem com uma condutividade que aumenta a uma primeira taxa a partir de uma primeira condutividade para uma segunda condutividade, a uma segunda taxa a partir da segunda condutividade para uma terceira condutividade e a uma terceira taxa a partir da terceira condutividade para uma quarta condutividade, e o anticorpo é eluído a partir do material de permuta de iões. Preferencialmente, a quantidade de anticorpo na composição carregada no material de permuta de catiões é de a partir de cerca de 15 mg a cerca de 45 mg do anticorpo por mL de material de permuta de catiões.

Num aspeto adicional, a presente invenção fornece um método para purificar um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e um contaminante que compreende carregar a composição num material de permuta de iões, lavar o material de permuta de catiões com tampão de lavagem que utiliza um gradiente de inclinação múltipla até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo, e eluir o polipéptido a partir do material de permuta de iões.

Numa forma de realização, o gradiente de inclinação múltipla compreende dois ou mais segmentos. Preferencialmente, cada segmento do gradiente de inclinação múltipla tem uma inclinação mais rasa.

Em outra forma de realização, o método compreende adicionalmente a etapa de lavagem da coluna com a partir de 0,4 a 1 volume de coluna de tampão de lavagem depois da lavagem de gradiente de inclinação múltipla e antes de eluir o polipéptido. Preferencialmente, o tampão de lavagem utilizado nessa etapa adicional tem a composição do tampão de lavagem no final do gradiente de inclinação múltipla. Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras IA e 1B mostram as sequências de aminoácidos de humMAb4D5!!8 de cadeia leve (SEQ ID NO: 1) e humMAb4D5" 8 de cadeia pesada (SEQ ID MO: 2), respetivamente. A Figura 2 é um gráfico que ilustra um processo de cromatografia com uma etapa de lavagem de gradiente 1inear. A Figura 3 é um gráfico que ilustra um processo de cromatografia com uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla.

Descrição Detalhada da Forma de Realização Preferencial Definições: A "composição" a ser purificada no presente documento compreende o polipéptido de interesse e um ou mais contaminantes. A composição pode ser "parcialmente purificada" (isto é, ter sido submetida a uma ou mais etapas de purificação, tal como Cromatografia de ProteS na A) o pode ser obtida diretamente a partir de uma célula hospedeira ou organismo que produz o polipéptido (por exemplo, a composição pode compreender fluido de cultura de célula colhida).

Conforme utilizado no presente documento, "polipéptido" refereKI se geralmente a péptidos e prOeS nas que têm mais do que cerca de dez aminoácidos. Preferencialmente, o polipéptido é uma proteína de mamífero, cujos exemplos incluem: renina; uma hormona de crescimento, o que inclui hormona de crescimento humano e hormona de crescimento bovino; fator de libertação de hormona de crescimento; hormona paratiroide; hormona estimulante de tiroide; lipoproteínas; alfa"l"antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró"insulina; hormona estimulante de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagom; fatores coagulantes tais como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido e fator von Willebrands; fatores anticoagulantes tal como Proteína C; fator natriurético atrial; tensioativo de pulmão; um ativador de plasminogénio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogénio tipo tecido (t"PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; fator de necrose de tumor"alfa e beta; encefalinase; RANTES (célula T normalmente regulada na ativação expressa e secretada); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP"1"alfa); uma albumina de soro tal como albumina de soro humano; substância de inibição de Muellerian; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró"relaxina; péptido associado a gonadotropina de murganho; uma proteína microbiana, tal como beta" lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a linfócito T citotóxico (CTLA), tal como CTLA"4; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); recetores para hormónios ou fatores de crescimento; Proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrõfico tal como fator neutrófico derivado de osso (BDNF), neurotrof in" 3, "4, "5, ou "6 (NT"3, NT"4, NT"5 ou NT"6), ou um fator de crescimento de nervo tal como NGF"; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento de epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) tal como TGF"alfa e TGF"beta, o que inclui TGF"pl, TGF"p2, TGF"p3, TGF"p4, ou TGF"p5; fator de crescimento tipo insulina"! e "II (IGF"I e IGF"II) ; des(l" 3)»igf"I (IGF"I cerebral), proteínas de ligação de fator de crescimento tipo insulina (IGFBPs); proteínas CD tal como CD3, CD4, CDS, CD 19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfonenética de osso (BMP) ; um interferão tal como interferão!!alfa, "beta, e "gama; fatores de estimulação de colónia (CSFs), por exemplo, interleucinas M"CSF, GM"CSF e G"CSF; (ILs), por exemplo, IL"1 a IL"10; superóxido dismutase; recetores de célula T; proteínas de membrana de superfície; fator de aceleração de deterioração; antígeno virai como, por exemplo, uma porção do envelope de SIDA; proteínas de transporte; recetores de migração; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, uma ICAM, VLA"4 e VCAM; um antígeno associado a tumor tal como HER2, HER3 ou recetor HER4; e fragmentos e/ou variantes de quaisquer dos polipéptidos listados acima. É mais preferível um anticorpo de comprimento completo que se liga ao HER2 humano.

Um 0 contaminante" é um material que é diferente do produto de polipéptido desejado. 0 contaminante pode ser, sem limitação, uma variante, fragmento, agregado ou derivado do polipéptido desejado (por exemplo, uma variante desaminada ou uma variante de amino"aspartato), outro polipéptido, ácido nucleico, endotoxina, etc.

Uma 0 variante" ou E variante de sequência di aminoácidos" de um polipéptido de partida é um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos diferente daquela do polipéptido de partida. Em geral, uma variante terá pelo menos 80% de identidade de sequência, de preferência, pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente, pelo menos 95% de identidade de sequência, e com mais preferência, pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipéptido nativo. A percentagem de identidade de sequência é identificada, por exemplo, por Fitch et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80: 1382 a 1386 (1983), versão do algoritmo descrito por

Needleman et al. , J. Mol. Biol. 48: 443 a 453 (1970), depois de alinhar as sequências para fornecer homologia máxima. As variantes de sequência de aminoácidos de um polipéptido podem ser preparadas ao introduzir mudanças de nucleótidos apropriadas no ADN codificador do polipéptido, ou por síntese de péptido. Tais variantes incluem, por exemplo, exclusões de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipéptido de interesse. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar no constructo final, contanto que o constructo final tenha as características desejadas. As mudanças de aminoãcido também podem alterar o processamento pós'! translação do polipéptido, tal como ao utilizar o número ou posição de locais de glicosilação. Outras modificações pós!! translacionais incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos de seril, treonil ou tirosil, metilação dos grupos «"amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman Ê Co., São Francisco, páginas 79 a 86 (1983)). Os métodos para gerar variantes de sequência de aminoácidos de polipéptidos são descritos no documento de patente n2 US 5.534. 615, expressamente incorporado no presente documento a título de referência, por exemplo.

Uma S variante ácida" é uma variante de um polipéptdo de interesse que é mais ácida (por exemplo, conforme determinado pela cromatografia por permuta de catiões) do que o polipéptido de interesse. As variantes ácidas podem ser produzidas pela ação de células hospedeiras recombinantes no polipéptido expresso. Um exemplo de uma variante ácida é uma variante desaminada. Resíduos de glutaminil e aspariginil são frequentemente deaminados pôs" translacionamente para os resíduos de glutamil e aspartil correspondentes.

Uma variante 0 deaminada" de uma molécula de polipéptido é um polipéptido em que um ou mais resíduos de asparagina do polipéptido original foram convertidos para aspartato, isto é, a cadeia lateral de amida neutra foi convertida para um resíduo com um caráter ácido geral. Por exemplo, 0 DNase humana deaminada" conforme utilizad no presente documento significa no DNase humana que é deaminada no resíduo de asparagina que ocorre na posição 74 na sequência de aminoácidos de DNase humana madura nativa (documento de Patente n9 US 5.279. 823; expressamente incorporado no presente documento a título de referência). 0 anticorpo huMAb4D5 deaminado a partir dos Exemplos abaixo tem Asn30 em CDR1 de qualquer uma ou ambas as regiões VL do mesmo convertido para aspartato.

Em formas de realização preferenciais da invenção, o polipéptido é um polipéptido recombinante. Um 0 polpéptido recombinante" é um que foi produzido numa célula hospedeira que foi transformada ou transfectada com ácido nucleico codificando o polipéptido, ou produz o polipéptido como um resultado de recombinação homóloga. 0 Transformação" e 0 transfeção" são utilizadas intercambiavelmente paa referir"se ao processo de introdução de ácido nucleico numa célula. Em seguida à transformação ou transfeção, o ácido nucleico pode se integrar ao genoma da célula hospedeira, ou pode existir como um elemento extracromossómico. A 0 célula hospedeira" inclui uma célula numa cultura de célula in vitro assim como uma célula dentro de um animal hospedeiro. Métodos para produção recombinante de polipéptidos são descritos no documento de Patente n9 US 5.534. 615, expressamente incorporado no presente documento a título de referência, por exemplo. 0 termo 0 anticorpo" é utilizado no sentido mais amjbo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (o que inclui anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo contanto que os mesmos exibam a atividade biológica desejada. 0 anticorpo no presente documento é direcionado contra um íant® geno" de interesse. Preferencialmente, o ah® geno é um polipéptido biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mam® fero que sofre de uma doença ou distúrbio pode resultar num benefit cio terapêutico esse mam® fero. Contudo, anticorpos direcionados contra at® genos não polipéptidos (tal como ant® genos de glicol® pid< associados a tumor; veja"se o documento de Patente n- US 5.091. 178) também são contemplados. Quando o ant® §no é um polipéptido, pode ser uma molécula transmembranar (por exemplo, recetora) ou ligante tal como um fator de crescimento. Ant® genos exemplificativos incluem aqeles polipéptidos discutidos acima. Alvos moleculares preferenciais para anticorpos englobados pela presente invenção incluem polipéptidos CD tais como CD3, CD4, CD8, CD 19, CD20 e CD34; membros da fam® lia de recetor HR tal como o recetor de EGF, HER2, HER3 o HER4; moléculas de adesão de célula tais como LFA"1, Macl, pl5Q, 95, VLA"4, ICAM"1, VCAM e integrina av/b3 o que inclui subunidades a ou b das mesmas (por exemplo, anticorpos anti"CD 11a, anti" CD 18 ou anti"CDllb); fatores de crescimento tal como VEGF; IgE; ant® genos de grupo sangu® neo; recetor de flkÊ|t3; recetor de obesidade (OB) ; recetor de mpl; CTLA"4; polipéptido C etc. Ant® genos solúveis ou fragmentos do mesmo, opcionalmente conjugados a outras moléculas podem ser utilizados como imunogénios para gerar anticorpos. Para moléculas transmembrana, tais como recetores, fragmentos das mesmas (por exemplo, o dom® nio extracelular de um recetor) podem ser utilizado como o imunogénio. Alternativamente, células que expressam a molécula transmembranar pode ser utilizada como o imunogénio. Tais células podem ser derivadas a partir de uma fonte natural (por exemplo, linhagens de células cancer® genas) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. 0 termo 0 anticorpo monoclonal" conforme utilizado q presente documento refere"se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e são direcionados contra um local antigénico único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um determinante único no antígeno. 0 modificador 0 monoclonal" indica o caráèr do anticorpo de ser obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al. , Nature 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de ADN recombinante (veja"se, por exemplo, documento de Patente n- U. S. 4.816.567) . Em uma forma de realização adicional, 0 anticorpos monolonais" podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo geradas que utilizam as técnicas descritas em McCafferty et al. , Nature, 348: 552 a 554 (1990) . Clackson

et al. , Nature, 352: 624 a 628 (1991) e Marks et al. , J

Mol. Biol., 222: 581 a 597 (1991) descrevem o isolamento de murino e anticorpos humanos, respetivamente, que utiliza bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por embaralhamento de cadeia (M arks et al.,

BiolTechnology, 10: 779 a 783 (1992)), assim como infeção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al. , Nuc. Acids. Res., 21: 2.265 a 2.266 (1993)). Portanto, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. Alternativamente, agora é possível produzir animais transgénicos (por exemplo, murganhos) que têm capacidade para, na imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a exclusão de homozigoto do gene de região de junção de cadeia pesada de anticorpo (JH) em murganhos mutantes de linhagem de germinal ou quimérica resulta em inibição completa de produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo genético de imunoglobulina de linhagem germinal humana em tais murganhos mutantes de linhagem germinal resultará na produção de anticorpos humanos no desafio de antígeno. Veja"se, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 2551 (1993); Jakobovits et ai., Nature, 362: 255 a 258 (1993); Bruggermann et ai., Year in Immuno. , 7: 33 (1993); e Duchosal et ai. Nature 355: 258 (1992).

Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos S quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica e ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico a ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que os mesmos exibam a atividade biológica desejada (documento de Patente n£ U. S. 4.816.567; e Morrisonetal., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 6.851 a 6.855 (1984)). 0 termo íregião hipervariável" quando utilizado no presente documento refere"se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido a partir de uma íregião de determinação de complementariedade" ou íCDRí (isto é, resíduos 24 a 34 (Ll) , 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (Hl), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada,* Kabat et ai. , Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5~ edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/'ou aqueles resíduos a partir de um ciclo íhipervariávelí (isto é, resíduos 26 a 32 (Ll) , 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (Hl), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk J: Mol. Biol. 196: 901 a 917 (1987)). Resíduos de íframework" ou íFR" são aqueles resíduos de domínio variável além daqueles resíduos da região hipervariável conforme definido no presente documento. Os resíduos de CDR e FR do anticorpo rhuMAb HER2 do exemplo abaixo (humAb4D5!!S) são identificados em Carter et al. , Proc. Nat.1. Acad. Sei. EUA 89: 4285 (1992).

Formas íhumanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. A maior parte dos anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (recipientes de anticorpo) em que resíduos a partir de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos a partir de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como murganho, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região íframeworkí Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações sâo feitas para definir adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma não imunoglobulina humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência humana de imunoglobulina. 0 anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve quanto pesado, a serem utilizados na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o chamado método de "melhor encaixei, a sequência do domKI nio variável de um anicorpo de roedor é examinada em comparação com a biblioteca inteira de sequências de domB nio variável humano. Htão, a sequência humana que é mais próxima àquela do roedor é aceita como o íframeworkí (FR) humano para o anticorpo humanizado (Sims et al. , J Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et aL, J MoL BioL, 196: 901 (1987).

Outro método utiliza um íframeworkí particular derivado a partir da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve e pesada. 0 mesmo íframeworkí pode ser utilizado para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 4285 (1992); Presta et al.,: Imnnol., 151: 2623 (1993). É adicionalmente importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo com um método preferencial, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados concetuais com a utilização dos modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comummente disponibilizados e são familiares para os peritos na especialidade. Os programas de computador estão disponíveis os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina de candidato selecionado. A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina de candidato, isto é, a análise de resíduos que influencia a capacidade da imunoglobulina de candidato de ligar seu antígeno. Desse modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e sequências de importação de modo a alcançar a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antígeno (ou antígenos) alvo. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos na ligação de antígeno de influência. 0 Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção deum anticorpo de comprimento completo, geralmente a ligação de antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab!, F(ab')2# e fragmentos de Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja"se, por exemplo, Morimoto et al., Journal of

Biochemical and Biophysical Methods 24: 107 a 117 (19S2) e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985). Contudo, agora, esses fragmentos podem ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir do anticorpo, bibliotecas de fago discutidos acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'"SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163 a 167 (1992)) . Em outra forma de realização, o F(ab')2 é formado com a utilização do GCN4 compactador de leucina para promover a montagem da molécula de F(ab!)2- De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo ficarão evidentes para o profissional perito.

Em outras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja"se, o documento WO 93/16185. Fragmentos de anticorpo de 0Fv de cadeia única" ou 0 sFv" compreendem os domínios VH eVL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptido única. Geralmente, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv veja"se Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg e Moore eds. Springer"Verlag, Nova Iorque, páginas 269 a 315 (1994). 0 termo H diacorpos" refere"se a pequenos fragmentosde anticorpo com dois locais de ligação de antígeno, sendo que os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipéptido (VH"VL). Ao utilizar um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados ao emparelhamento com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos de modo mais completo, por exemplo, no documento η- EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 6444 a 6448 (1993). A expressão íanticorpos lineares" quando utilizada ao longo desse relatório descritivo refere"se aos anticorpos descritos em Zapata et al. Polypeptide E7ng. 8 (10): 1.057 a 1.062 (1995). Resumidamente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd consecutivos (VH"CH1"VH"CH1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. S Anticorpos multiespecíficos" têm especificidades á ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, em que os epítopos são geralmente de diferentes antígenos. Embora tais moléculas normalmente irão de ligar apenas a dois antígenos (isto é, anticorpos biespecíficos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecíficos são englobados por essa expressão quando utilizada no presente documento. Exemplos de BsAbs incluem aqueles com um braço direcionado contra um antígeno de célula tumoral e o outro braço direcionado contra uma molécula de acionamento citotóxico tal como anti" FcyRI/anti"CD15, anti" pl85/FcyRIII (CD16), anti"CD3/anti" célula B maligna (1D10) , anti"CD3/anti"pl85!lER2, anti" CD3/anti"p97, anti"CD3/anti"carcinoma de célula renal, anti"CD3/anti"OVCAR"3, anti"CD3/L" Dl (anti"carcinoma de cólon), anti"CD3/análogo de hormona de estímulo anti" melanócito, recetor anti"EGF/anti"CD3, anti"CD3/anti"GAMAI, anti"CD3/anti"CD19, anti"CD3/MoV18, molécula anti"adesão de célula neural (NCAM)/anti"CD3, proteína de ligação anti" folato (FBP) /anti"CD3, antígeno associado a anti"pan carcinoma (AMOC'31) /anti"CD3 ; BsAbs com um braço que se liga especificamente a um antígeno de tumor e um braço que se liga a uma toxina tal como anti" saporina/anti" Id” 1, anti"CD22/anti"saporina, anti"CD7/anti"saporina, anti" CD38/anti " saporina, anti "CEA/cadeia A de anti"ricina, anti!! interferão"a (IFN"a) /idiótipo anti"hibridoma, anti" CEA/alcalóide anti"vinca; BsAbs para converter pró"fármacos ativados por enzima tais como anti "CD30,/anti "alcalina fosfatase (que catalisa a conversão de pró"fármaco de fosfato de mitomicina para álcool de mitomicina); BsAbs que pode ser utilizado como agentes fibrinolíticos tais como ativador de plasminogénio anti"fibrina/anti"tecido (tPA), ativador de plasminogénio tipo anti" fibrina/anti" uroquinase (uPA); BsAbs para alvejar complexos imunológicos para recetores de superfície de célula tal como anti" lipoproteína de densidade baixa (LDL) /'recetor anti"Fc (por exemplo, FcyRI, ou FcyRIII); BsAbs para utilização em terapia de doenças infeciosas tais como vírus anti" CD3/anti"vírus do herpes simples (HSV), recetor anti"célula T: complexo CD3/anti"influenza, anti"FcyR/anti"HIV; BsAbs para detecção de tumor in vitro ou in vivo tal como anti" CEA/anti"EOTUBE, anti"CEA/anti" DPTA, anti"pl85HER2/anti" hapteno; BsAbs como adjuvantes de vacina; e BsAbs como ferramentas de diagnóstico tais como IgG anti"coelho/anti" ferritina, anti"peroxidase do rábano silvestre (HRP)/anti" hormona, anti" somatostatina/anti"substância P, anti" HRP/anti"FITC, anti"CEA/anti"p"galactosidase. Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem anti"CD3/anti"CD4/anti" CD37, anti"CD3/anti"CD5/anti"CD37 e anti"CD3/anti"CD8/anti" CD37. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab!)2) · Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na especialidade. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo tem base na coexpressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada e de cadeia leve, em que as duas cadeias têm diferentes especificidades (Millstein et al. , Nature, 305: 537 a 539 (1983)). Devido ao sortimento aleatório de imunoglobulina de cadeias pesada e leve, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 diferentes moléculas de anticorpo, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que geralmente é feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante difícil e os rendimentos de produto são muito baixos. Procedimentos similares são revelados no documento WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBOJ, 10: 3.655 a 3.659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de anticorpo e antígeno) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão de é preferência com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos parte das regiões CH2 e CH3 articuladas. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. ADNs codificadores das fusões de imunoglobulina de cadeia pesada e, se desejado, a imunoglobulina de cadeia leve, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfetados num organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em formas de realização quando proporções desiguais das três cadeias de polipéptido utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as cadeias de polipéptido num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não têm significância particular.

Em uma forma de realização preferencial dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma imunoglobulina híbrida de cadeia pesada com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de imunoglobulinas de cadeia pesada e de cadeia leve (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Constatou"se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado a partir de combinações de cadeia de imunoglobulina não desejadas, visto que a presença de uma imunoglobulina de cadeia leve e apenas metade da molécula biespecífica fornece um modo fácil de separação. Essa abordagem é revelada no documento WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, veja"se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzyrnology, 121: 210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita em W096/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser geneticamente modificada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de célula recombinante. A interface preferencial compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais cadeias laterais pequenas a partir da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à cadeia (ou cadeias) laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo ao substituir cadeias laterais de aminoãcido grandes por pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero nos outros produtos finais não desejados tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados o íheteroconjugadosí. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, e o outro à biotina. Por exemplo, tais anticorpos foram propostos alvejar células do sistema imunológico como células indesejadas (documento de Patente n- 4,676, 980), e para tratamento de infeção com HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089) , Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos ao utilizar quaisquer métodos de reticulação. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na especialidade, e são revelados no documento de Patente n£ 4.676. 980, junto com inúmeras técnicas de reticulação. Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados ao utilizar ligação química. Brennan et al. , Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2· Esses fragmentos são reduzidos na presença de arseninte sódica agente de complexificaçâo de ditiol para estabilizar ditiois vicinais e evitar formação de dissulfeto intermolecular. Então, os fragmentos Fab' gerados são convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Um dos derivados de Fab'"TNB é reconvertidos depois para o Fab'"tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab!"TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab!"SH a partir de E. coli que pode ser quimicamente acoplado para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217 a 225 (1992) descreve a produção de uma molécula de F(ab')2 de anticorpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente a partir de E, coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente a partir de cultura de célula recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos ao utilizar compactadores de leucina. Kostelny et al., J; Imm2xnol., 148 (5): 1.547 a 1.553 (1992). Os péptidos compactadores de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de articulação para formar monómeros e, depois, reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Esse método pode ser utilizado também para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 6.444 a 6.448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é curto demais para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parearem com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, o que forma dois locais de ligação de antígeno. Também foi citada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico através da utilização de dímeros de Fv de cadeia única (sFv). Veja-se Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).

Anticorpos com mais do que duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al. J: Immunol. 147: 60 (1991). A frase ’’material de permuta de iões" refere-se a uma fase de sólido que é negativamente carregada (isto é, uma resina de permuta de catiões) ou positivamente carregada (isto é, uma resina de permuta de iões) . A carga pode ser fornecida ao anexar um ou mais ligantes carregados à fase de sólido, por exemplo, por ligação covalente. Alternativa ou adicionalmente, a carga pode ser uma propriedade inerente da fase de sólido (por exemplo, como no caso da sílica, que tem uma carga negativa geral),

Por ífase de sólido" pretende"se que signifique uma matriz não aquosa à qual um ou mais ligantes carregados pode aderir. A fase de sólido pode ser uma coluna de purificação, uma fase descontínua de partículas discretas, uma membrana ou filtro etc. Exemplos de materiais para formar a fase de sólido incluem polissacãridos (tal como agarose e celulose) e outras matrizes mecanicamente estáveis tal como sílica (por exemplo, vidro de poro controlado), poli (estirenodivinil) benzeno, poliacrilamida, partículas de cerâmica e derivados de qualquer um acima.

Uma íresina de permuta de catiões" refere"se a uma fase de sólido que é negativamente carregada e tem catiões livres para permuta com catiões numa solução aquosa passada por cima ou através da fase de sólido. Um ligante negativamente carregado fixado à fase de sólido para forma a resina de permuta de catiões pode, por exemplo, ser um carboxilato ou sulfonato. Resinas de permuta de catiões comercialmente dispon® veis incluem carboximetilcelihose, BAKERBOND ABC, sulfopropil (SP) imobilizado em agarose (por exemplo, SP"SEPHAROSE DE FLUXO RÁPIDO, SP"SEPHAROSE DE FLUXO RÁPIDO XL ou SP" SEPHAROSE DE ALTO DESEMPENHO, a partir de Pharmacia) e sulfonil imobilizado em agarose (por exemplo, S"SEPHAROSE DE FLUXO RÁPIDO TM a partir de Pharmacia). 0 termo íresina de permuta de iões" é utilizado no presente documento para referir"se a uma fase de sólido que é positivamente carregada, por exemplo, que tem um ou mais ligantes positivamente adequados, tal como grupos amino quaternário, fixados à mesma. Resinas de permuta de iões comercialmente disponíveis incluem celulose DEAE, QAE SEPHADEX e Q SEPHAROSE RÁPIDA (Pharmacia).

Um 0 tampão" é uma solução que resiste a mudanças empH pela ação de seus componentes conjugados à base de ácido. Vários tampões que podem ser empregues dependendo, por exemplo, do pH desejado do tampão são descritos em Tampões. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem

Corporation (1975) . Em uma forma de realização, o tampão tern urn pH na faixa de a partir de cerca de 5 a cerca de 7 (por exemplo, como no Exemplo 1 abaixo) . Exemplos de tampões que controlarão o pH nessa faixa incluem tampões MES, MOPS, MOPSO, fosfato, acetato, citrato, sucinato e amónio, assim como combinações desses. Os tampões utilizados nos métodos revelados compreendem também tipicamente um sal, tal como NaCL, KC1 ou MaHOAc. "Tampões de equilíbrio" é o tampão que é utilizado para equilibrar a resina de permuta de iões. 0 tampão de equilíbrio pode ser também utilizado para carregar a composição que compreende a molécula de polipéptido de interesse e um ou mais contaminantes na resina de permuta de iões. 0 tampão de equilíbrio de preferência tem uma condutividade e/ou pH de modo que a molécula de polipéptido de interesse seja ligada à resina de permuta de iões. 0 termo B tampão de lavagem" é utilizado no presente documento para referir”se ao tampão que é passado através da resina de permuta de iões em seguida a carregar e antes de eluir a proteína de interesse. 0 tampão de lavagem pode servir para eluir um ou mais contaminantes a partir da resina de permuta de iões. A condutividade e/ou pH do tampão de lavagem é/são tais que os contaminantes são eluídos a partir da resina de permuta de iões, mas não quantidades significativas do polipéptido de interesse. 0 ítampão de lavagem" de preferência, compreende uma mistura de tampão de equilEI brio e tampão de eluição, e pode portanto, ser descrito pela percentagem de tampão de eluição que o mesmo compreende num determinado volume. íTampão de eluição" é utilizado para eluir o polipéptido de interesse a partir da fase de sólido. A condutividade e/ou pH do tampão de eluição é/são tais que o polipéptido de interesse é elulEI do a partir da resia de permuta de iões.

Um ítampão de regeneração" pode ser utilizado para regenerar a resina de permuta de iões de modo que a mesma possa ser reutilizada. 0 tampão de regeneração tem uma condutividade e/ou pH conforme exigido para remover substancialmente todos os contaminantes e o polipéptido de interesse da resina de permuta de iões. 0 termo ícondutividade" refere"se à capacidade de uma solução aquosa conduzir uma corrente elétrica entre dois elétrodos. Na solução, a corrente flui por transporte de ião. Portanto, com uma quantidade aumentada de iões presentes na solução aquosa, a solução terá uma condutividade maior. A unidade de medição para condutividade é mmhos (mS/cm), e pode ser medida ao utilizar um medidor de condutividade, tal como aqueles vendidos, por exemplo, por Orion. A condutividade de uma solução pode ser alterada ao mudar a concentração de iões na mesma. Por exemplo, a concentração de um agente de tamponamento e/ou a concentração de um sal (por exemplo, Na/HOAc, NaCl ou KC1) na solução pode ser alterada para alcançar a condutividade desejada. Preferencialmente, a concentração de sal dos vários tampões é modificada para alcançar a condutividade desejada.

Por ípurificar" um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e um ou mais contaminantes pretende"se que signifique aumentar o grau de pureza do polipéptido na composição ao remover (completa ou parcialmente) pelo menos um contaminante a partir da composição. Uma 0 etapa de purificação" pode ser pate de um processo geral de purificação que resulta numa composição íhomogéneaí. íHomogéneo" é utilizado no presente documento para referir"se a uma composição que compreende pelo menos cerca de 70% em peso do polipéptido de interesse, com base no peso total da composição, de preferência, pelo menos cerca de 80% em peso, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% em peso, e com ainda mais preferência, pelo menos cerca de 95% em peso.

Exceto de for indicado de outro modo, o termo ÍHER2" quando utilizado no presente documento refere "se à proteES na HER2 humana e ÍHER2" refere"se ao gene HER2 humano. 0 gene HER2 humano e a proteEI na HER2 são descritos em Semba et ai., PNAS (utiliza) 82: 6.497 a 6.501 (1985) e Yamamoto et ai. Nature 319: 230 a 234 (1986) (Número de acesso no Genebank X03363), por exemplo. 0 termo íhuMAb4D5"8" quando utilizado no presente documento refere"se a um anticorpo anti"HER2 humanizado que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2 ou variantes de sequência de aminoácidos das mesmas que retêm a capacidade de ligar HER2 e inibir crescimento de células tumorais que superexpressam HER2 (veja"se documento de Patente n° US 5.677. 171; expressamente incorporado no presente documento a tEI tulo de referência). 0 íplí ou íponto isoelétrico" de um polipéptido refere"se ao pH em que a carga positiva de polipéptido equilibra sua carga negativa: pi pode ser calculado a partir da carga de rede dos resEI duos de aminoácido do polipéptido ou pode ser determinado por focalização isoelétrica.

Por íligarí uma molécula a um material de permuta de iões pretende"se que signifique expor a molécula ao material de permuta de iões em condições apropriadas (pH/condutividade) de modo que a molécula seja reversivelmente imobilizada no ou sobre o material de permuta de iões em virtude de interações iónicas entre a molécula e um grupo carregado ou grupos carregados do material de permuta de iões.

Por ílavarí o material de permuta de iões pretendesse que signifique passar um tampão apropriado através ou sobre o material de permuta de iões.

Por íeluirí uma molécula (por exemplo, polipéptido ou contaminante) a partir de um material de permuta de iões pretende"se que signifique remover a molécula a partir do mesmo ao alterar a força iónica do tampão que circunda o material de permuta de iões de modo que o tampão compita com a molécula pelos locais carregados no material de permuta de iões. íTratamentoí refere"se tanto a tratamento terapêutico quanto profilático ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles que já tem o distúrbio assim como aqueles em que o distúrbio deve ser evitado.

Um ídistúrbio" é qualquer afeção que se beneficiaria de tratamento com o polipéptido purificado conforme descrito no presente documento. Isso inclui tanto distúrbios crónicos quanto agudos e doenças e aquelas afeções patológicas que predispõe o marnlEI fero ao difeúrbio em questão. A palavra ímarcadorí quando utilizada no presente documento refere"se a um composto detetável ou composição que é conjugada direta ou indiretamente ao polipéptido. 0 marcador pode ser ele mesmp detetável (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar alteração qu§ mica de um composto de substrato ou composição que é detetável. 0 termo íagente citotóxicoí conforme utilizado no presente documento refere"se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou leva à destruição de células. 0 termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I, 25, Y e Re), agentes quimioterãpicos e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, ou fragmentos das mesmas.

Um íagente quimioterápicoí é um composto quS mico útl no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5" fluorouracil, citosina arabinoside (íAra" Cí) , ciclofosfamida, tiotepa, busulfanp, citoxina, taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOLiM, Bristol"Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , e doxetaxel, toxotero, metotrexato, cisplatina, melfaleno, vinblastina, bleomicina, etoposide, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinsa, esperamicinas (veja"se o documento de Patente n- U. S. 4.675.187), melfalano e outras mostardas de azoto relacionadas. Também são incluS dos nessa definição agentes hormonais que age para regular ou inibir ação de hormona em tumores, tal como tamoxifeno e onapristona.

Modos para Realizar a Invenção A invenção no presente documento fornece métodos para purificar um polipéptido a partir de uma composição (por exemplo, uma solução aquosa) que compreende o polipéptido e um ou mais contaminantes. A composição geralmente é uma que resulta a partir da produção recombinante do polipéptido, mas pode resultar da produção do polipéptido por síntese de péptido (ou outro meio sintético) ou o polipéptido pode ser purificado a partir de uma fonte nativa do polipéptido. Preferencialmente, o polipéptido é um anticorpo, por exemplo, um que se liga ao antS geno HER2.

Para a produção recombinante do polipéptido, o ácido nucleico codificador do mesmo é isolado e inserido num vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN codificador do polipéptido é prontamente isolado e sequenciado ao utilizar procedimentos convencionais (por exemplo, quando o polipéptido é um anticorpo ao utilizar sondas de oligonucleótido que têm capacidade para se ligar especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes de vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição (por exemplo, conforme descrito na Patente n£ US 5.534. 615, especificamente incorporado no presente documento a título de referência). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vetores no presente documento são as células procariõticas, fungos ou eucarióticas superiores. Procarióticas adequadas para esse propósito incluem eubactéria, tal como organismos gram"negativos ou gram" positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Ef winia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, assim como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P revelado em DD 266,710 publicado 12 de abril 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Actionomicetos. Um hospedeiro de clonagem de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) e E. coli W3110 (ATCC 27,325) são adequadas. Esses exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

Adicionalmente a procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos ou levedura filamentosa são hospedeiros de expressão ou clonagem adequados os para vetores codificadores de polipéptido. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum é a mais comummente utilizada entre microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Contudo, inúmeros géneros, espécies e estirpes estão comummente disponíves e são úteis no presente documento, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiro Kluyveroniyces tal como, por exemplo, K. Iactis, K fragilis (ATCC 12,424), K bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolenans, e K marxianus; yarroMia (EP 402.226); Pichiapastoris (EP 183.070); Candida Trichoderma reesía (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tal como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptido glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de planta e inseto. Foram identificadas diversas estirpes baculovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (de frutas) e Bombyx. Uma variedade de estirpes virais para transfeção estão públicamente disponíveis, por exemplo, uma variante L"1 de Autographa californica NPV e a estirpe Bm"5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser utilizados como vírus no presente documento de acordo com a presente invenção, particularmente para a transfeção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de célula de planta de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser utilizadas também como hospedeiros.

Contudo, tem havido maior- inteirasse em células vertebradas, e a propagação de células vertebradas na cultura (cultura de tecido) tornou”se um procedimento de rotina. Sem limitação, os exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são as células de rim de macaco CV1 transformadas por SV4 0 (C0S"7, ATCC CRL 16 51); células de rim embriónicas humanas (293 ou 293 células subclonadas para o crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J: Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovário de hamster chinês/"DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77: 4216 (1980)); células sertoli de murganho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243 a 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ; células de rim de macaco verde africano (VERO"76, ATCC CRL"1587); carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de fígado de rato de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de murganho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al. , Annals N, Y. Acad. Sei. 383: 44 a 68 (1982)); células MRC 5; células FS4 e células de hepatoma humano (Hep G2). Células hospedeiras transformadas com a expressão descrita acima ou vetores de clonagem para produção de polipéptido e cultivadas em meios de nutriente convencionais modificado conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformant.es ou ampliar os genes codificadores das sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para produzir o polipéptido desta invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (DMEM), (Sigma), RPMI"1640 (Sigma), e Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Einz. 58: 44 (1979), Barnes et al. , Anal. Biochem. 102: 255 (1980), documentos de Patente n— U. S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; OU 5.122.469; documento WO 90/03430; WO 87/00195 ou documento de Patente n~ 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormónios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina o fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como fármaco GENTAMYCIN), elementos de traço (definidos como composto inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem ser também incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidos pelos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para os indivíduos de conhecimento comum na especialidade.

Ao utilizar as técnicas recombinant.es, o polipéptido pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico ou diretamente secretado no meio. Se o polipéptido for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos de particulado, células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, que resultam a partir da homogeneização), são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltragem. Quando o polipéptido é secretado no meio, os sobrenadantes a partir de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados ao utilizar um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon.

Depois, o polipéptido é submetido a uma ou mais etapas de purificação, o que inclui o método de cromatografia de permuta de iões conforme descrito no presente documento. Exemplos de procedimentos de purificação adicionais que podem ser realizados antes, durante, ou depois do método de cromatografia de permuta de iões incluem fracionamento numa cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, em fenyl sepharose), precipitação de etanol, focalização isoelétrica, HPLC de Fase Inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em HEPARIN SEPHAROSETM, cromatografiapo permuta de iões adicional e/ou cromatografia por permuta de catiões adicional, cromatofocalização, SDS"PAGE, precipitação de sulfato de amónio, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diãlise e cromatografia por afinidade (por exemplo, que utiliza proteína A, proteína G, um anticorpo, um substrato específico, ligante ou antígeno como o reagente de captura). A cromatografia por permuta de iões é realizada conforme descrito no presente documento. Uma decisão primeiro é feita em relação a se uma resina de permuta de iões ou catiões deve ser empregue. Em geral, uma resina de permuta de catiões pode ser utilizada para polipéptidos com pis maiores do que cerca de 7 e uma resina de permuta de iões pode ser utilizada para polipéptidos com pis menores do que cerca de 7. A resina de permuta de iões ou catiões é preparada de acordo com métodos conhecidos, segundo as instruções do fabricante. Geralmente, um tampão de equilíbrio é passado através da resina de permuta de iões antes de carregar a composição que compreende o polipéptido de interesse e um ou mais contaminantes sobre a resina. Convenientemente, o tampão de equilíbrio é o mesmo que o tampão de carregar, mas isso não é exigido. A composição de vários tampões utilizados para a cromatografia pode depender em parte de se uma resina de permuta de iões ou catiões é empregue.

Em seguida ao equilíbrio, uma solução aquosa que compreende o polipéptido de interesse e contaminante (ou contaminantes) é carregada na resina de permuta de catiões que utiliza um tampão que tem um pH e/ou condutividade de modo que o polipéptido e o contaminante se liguem à resina de permuta de catiões. Conforme discutido acima, o tampão de equilíbrio pode ser utilizado para carregar. Em uma forma de realização preferencial, o tampão de equilíbrio está numa primeira condutividade baixa (por exemplo, a partir de cerca de 4 a cerca de 5 mmhos) durante o carregamento. Um pH exemplificativo para o tampão de equilíbrio é cerca de 5,5. A quantidade do polipéptido de interesse carregado na resina pode depender de uma variedade de fatores, o que inclui, por exemplo, a capacidade da resina, o rendimento desejado e a pureza desejada. Preferencialmente, a partir de cerca de 1 mg de proteína/mL de resina a cerca de 100 mg de proteína/mL de resina, mais preferencialmente, a partir de cerca de 10 mg/mL a cerca de 7 5 mg/mL e ainda com mais preferência, a partir de cerca de 15 mg/mL a cerca de 45 mg/mL do polipéptido (por exemplo, de um anticorpo de comprimento completo) é carregado na resina de permuta de iões.

Depois de carregar, a resina de permuta de catiões é lavada. Durante o processo de lavagem, o tampão de lavagem é passado pela resina. A composição do tampão de lavagem é escolhida tipicamente para eluir tantos contaminantes quanto possíveis a partir da resina sem eluir uma quantidade substancial do polipéptido de interesse. Isso pode ser alcançado ao utilizar um tampão de lavagem com uma condutividade aumentada ou pH, ou ambos, em comparação com o tampão de equilíbrio. A composição do tampão de lavagem pode ser constante ou variável durante o processo de lavagem, conforme descrito abaixo.

Numa forma de realização, o tampão de lavagem compreende tampão de equilíbrio em que a concentração de sal foi aumentada. A concentração de sal pode ser aumentada por qualquer método conhecido na especialidade. Na forma de realização preferencial, o tampão de lavagem é uma mistura de tampão de equilíbrio e tampão de eluição. Nesse caso, a concentração de sal desejada no tampão de lavagem é alcançada ao aumentar a percentagem do tampão de sal superior no tampão de lavagem. 0 tampão de eluição tem tipicamente uma concentração de sal e condutividade maiores do que o tampão de equilíbrio. Por exemplo, na forma de realização preferencial, o tampão de eluição de preferência tem uma condutividade de entre cerca de 8 mS/cm e cerca de 10 mS/cm, mais preferencialmente, entre cerca de 8. 5 mS/cm e 9,5 mS/cm, enquanto o tampão de equilíbrio tem uma condutividade de entre cerca de 4 e 6 mS/cm, mais preferencialmente, entre cerca de 4,5 e 5,5 mS/cm. Portanto, à medida que a percentagem de tampão de eluição é aumentada, a concentração de sal e a condutividade do tampão de lavagem aumentam. 0 aumento na concentração de sal a partir do tampão de equilíbrio até o tampão de lavagem inicial pode ser por etapas ou gradual conforme desejado. A quantidade do aumento inicial dependerá da condutividade desejada do tampão de lavagem no início do processo de lavagem.

Preferencialmente, o aumento inicial na concentração de sal é alcançado por aumento em etapas na percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem. Um perito na especialidade terá capacidade para determinar uma quantidade do aumento no tampão de eluição com base na concentração de sal do tampão de equilíbrio, na concentração de sal do tampão de eluição e na condutividade desejada. 0 aumento é de preferência, a partir de cerca de 0% de tampão de eluição a uma percentagem inicial de entre cerca de 10% e 50% de tampão de eluição, mais preferencialmente, de entre cerca de 20% e 30% de tampão de eluição e ainda mais preferencialmente, a cerca de 25% de tampão de eluição. Na forma de realização preferencial, o aumento inicial é para uma percentagem inicial de cerca de 26% de tampão de eluição.

Um tampão de lavagem com uma concentração fixa de sal pode ser utilizado para toda a lavagem. Nesse caso, a composição do tampão de lavagem não irã variar significativamente a partir da composição inicial pela duração da lavagem. Preferencialmente, contudo, uma lavagem de gradiente é utilizada, em que a composição do tampão de lavagem muda durante o decurso do processo de lavagem.

Numa forma de realização, uma lavagem de gradiente de concentração de sal linear é utilizada. Nesse processo de lavagem, a concentração de sal do tampão de lavagem muda a uma taxa constante, geralmente constante aumentando a partir de uma primeira concentração inicial para uma segunda concentração maior, à medida que a lavagem progride. Um gradiente de concentração de sal linear é preferencialmente criado ao aumentar a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem a uma taxa constante. A taxa de aumento na concentração de sal do tampão de lavagem pode ser descrita pela inclinação da linha formada por plotagem da percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem contra volumes de coluna de tampão de lavagem que passaram sobre a coluna.

Uma lavagem de gradiente linear exemplificativa é retratada na Figura 2. Nesse caso, uma única inclinação define o gradiente de concentração de sal linear e, portanto, a taxa de mudança na concentração de sal durante a lavagem. A taxa de mudança e, portanto, a inclinação, é escolhida para alcançar o melhor rendimento do polipéptido de interesse com a pureza mais alta. Um perito na especialidade terá capacidade para determinar a inclinação ideal para um polipéptido e massa de carga particulares. Em geral, cargas com uma concentração de proteína maior exigirão uma inclinação mais ingrime, enquanto cargas menores exigem uma inclinação mais rasa para alcançar o rendimento desejado e pureza para uma determinada proteína.

Em outra forma de realização, uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla é utilizada. Nesse processo de lavagem, inúmeros gradientes de sal linear com diferentes inclinações são realizados consecutivamente. Portanto, a concentração de sal no tampão de lavagem passa sobre a coluna aumenta a uma primeira taxa para uma primeira porção da lavagem, ou segmento e numa ou mais taxas adicionais para outras porções definidas ou segmentos da lavagem. Um gradiente de sal de três segmentos é ilustrado na Figura 3 e descrito em mais detalhes abaixo.

Cada segmento de gradiente de sal linear conta para uma fração do volume de lavagem total que passa sobre a resina. A proporção do volume de lavagem total contado para cada segmento de gradiente particular variará dependendo do número e duração dos segmentos.

Um perito na especialidade reconhecerá que o número de segmentos não se limita de qualquer modo e será escolhido com base nas circunstâncias particulares. Os fatores que afetarão o número preferencial de segmentos incluem, por exemplo, a natureza da proteína que é eluída, o volume de lavagem total e a faixa de carga antecipada. Por exemplo, uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla permite um protocolo de lavagem único para ser eficaz por uma ampla faixa de carga. Portanto, se uma variedade de massas de carga diferentes será purificada ao utilizar o mesmo protocolo de lavagem, múltiplos segmentos irão resultar em rendimento mais consistente e pureza pela faixa de carga.

Cada segmento de uma lavagem de múltiplos segmentos de preferência termina quando uma condição predeterminada é atendida. Por exemplo, quando a concentração de proteína no fluxo alcança um nível predeterminado, ou quando o tampão de lavagem alcançou uma condutividade desejada. Na forma de realização preferencial, cada segmento termina quando o tampão de lavagem compreende uma percentagem predeterminada de tampão de eluição e, portanto, tem uma condutividade desej ada.

Adicionalmente, se a lavagem compreende mais de um segmento, a inclinação é preferencialmente maior no primeiro segmento do que em quaisquer segmentos adicionais. Como resultado, o aumento na condutividade do tampão de lavagem será maior no primeiro segmento do que em segmentos subsequentes. Se a concentração de sal for variada ao aumentar a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem, o aumento na percentagem de tampão de eluição por volume de coluna será maior no primeiro segmento do que em segmentos subsequentes. 0 gradiente de lavagem preferencialmente termina quando uma quantidade predetermina de proteína é detetada no fluxo na forma de realização preferencial, a lavagem de gradiente termina quando a concentração de proteína no fluxo alcança um nível correspondente a uma medida de densidade ótica de 0,6 a 2S0 nm. 0 processo de lavagem é opcionalmente completado ao passar uma quantidade fixa de tampão de lavagem sobre a coluna. Isso é denominado 0 volume de atraso de lavgem final". Em seguida ao último segmento de gradiente linear, um volume fixo do tampão de lavagem com a condutividade mais alta a partir da lavagem de gradiente é passado sobre a coluna. Com a utilização de um volume de atraso de lavagem final maior, aumenta a pureza da proteína eluída, mas pode causar um rendimento ligeiramente reduzido. Em contrapartida, diminuir o volume fixo causa um rendimento aumentado, mas pode produzir uma leve diminuição na pureza da proteína recuperada. Portanto, o volume fixo pode ser escolhido pelo perito na especialidade para alcançar o rendimento e pureza desejados. Preferencialmente, o volume de atraso de lavagem final é a partir de 0 até 2 volumes de coluna do tampão de lavagem final, mais preferencialmente, a partir de 0,2 a 1 volume de coluna.

Numa forma de realização preferencial, uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla com três segmentos é utilizada. Essa forma de realizaçao e ilustrada na Figura 3. 0 primeiro segmento de preferência apresenta cerca de um terço do volume de lavagem total, durante o qual a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta a partir de uma percentagem inicial de cerca de 26% a cerca de 50%, mais preferencialmente, cerca de 54%, o que resulta num aumento correspondente na concentração de sal e condutividade. Cerca de 5 volumes de coluna de tampão de lavagem são passados sobre a coluna durante esse primeiro segmento de gradiente linear. Isso representa uma mudança de entre cerca de 5% e 6% de tampão de eluição por volume de coluna, conforme pode ser visto na inclinação do primeiro segmento na Figura 3.

Um segundo segmento de gradiente linear é iniciado ao modificar a taxa de mudança da percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem. Na forma de realização preferencial, a taxa de mudança da percentagem de tampão de eluição é reduzida para cerca de 3,5% por volume de coluna. 0 segundo segmento preferencialmente continua por aproximadamente um sexto do volume de lavagem total. Portanto, cerca de 2 volumes de coluna são passados sobre a coluna durante o segundo segmento. Preferencialmente, o segundo segmento termina quando a percentagem de tampão de eluição aumentou para cerca de 60%, mais preferencialmente, cerca de 61%.

No terceiro segmento, a taxa de aumento de tampão de eluição é adicionalmente reduzida, de preferência, para cerca de 2% por volume de coluna, mais preferencialmente, para cerca de 2, 13% por volume de coluna. 0 terceiro segmento é o mais longo dos três e têm cerca de metade do volume de lavagem total com cerca de 6 volumes de coluna de tampão de lavagem que passam sobre a coluna. 0 terceiro segmento termina quando uma DO de 0,6 é medida no fluxo. Em toda a lavagem de gradiente, a percentagem de tampão de eluição aumentará cerca de 75%, mais preferencialmente, cerca de 74% quando uma DO de 0,6 for alcançada.

Em seguida ao processo de lavagem, uma quantidade predeterminada de tampão de equilíbrio é opcionalmente passada sobre a coluna. Preferencialmente, a partir de 0 a 2 volumes de coluna de tampão de equilíbrio são passados sobre a coluna. Mais preferencialmente, 1 volume de coluna de tampão de equilíbrio é passado sobre a coluna. A molécula de polipéptido desejada é subsequentemente eluída a partir da resina de permuta de iões. Isso é alcançado ao utilizar um tampão de eluição que tem um pH e/ou condutividade de modo que o polipéptido desejado não se ligue mais à resina de permuta de iões e, portanto, seja eluído a partir da mesma. Na forma de realização preferencial, a condutividade do tampão de eluição excede aquela do tampão de equilíbrio. Alternativa ou adicionalmente, o pH do tampão de eluição pode ser aumentado em relação ao tampão de equilíbrio (por exemplo, o pH do tampão de eluição pode ser cerca de 6,0). A mudança na condutividade e/ou pH do tampão de lavagem para o tampão de eluição pode ser por etapas ou gradual, conforme desejado. Conforme discutido acima, o tampão de eluição de preferência tem uma condutividade de entre cerca de 8 rnS/crn e cerca de 10 mS/cm, mais preferencialmente, entre cerca de 8,5 mS/cm e 9,5 mS/cm, Assim, o polipéptido desejado é recuperado a partir da resina de permuta de catiões nesse estágio no método.

As mudanças na condutividade são geralmente conforme descrito acima em relação tanto a uma resina de permuta de catiões quanto uma resina de permuta de iões. Um perito na especialidade terá capacidade para aperfeiçoar os métodos para qualquer tipo de resina.

Na forma de realização preferencial da invenção, um único parâmetro (isto é, condutividade ou pH) é alterado para alcançar eluição tanto do polipéptido quanto do contaminante, enquanto o outro parâmetro (isto é, pH ou condutividade, respetivamente) permanece constante. Por exemplo, embora a condutividade dos vários tampões possa diferir, o pH dos mesmos pode ser essencialmente o mesmo.

Numa forma de realização opcional da invenção, a resina de permuta de iões é regenerada com um tampão de regeneração depois da eluição do polipéptido, de modo que a coluna possa ser reutilizada. Geralmente, a condutividade e/ou pH do tampão de regeneração é/são tais que substancialmente todos os contaminantes e o polipéptido de interesse são eluídos a partir da resina de permuta de iões. Geralmente, o tampão de regeneração tem uma condutividade muito alta para eluir contaminantes e o polipéptido a partir da resina de permuta de iões. 0 método no presente documento é particularmente útil para dissolver uma molécula de polipéptido de interesse a partir de pelo menos um contaminante, em que o contaminante e molécula de polipéptido de interesse diferem apenas ligeiramente em carga iónica. 0 método pode ser também utilizado, por exemplo, para dissolver um polipéptido a partir de uma variante de glicosilação do mesmo, por exemplo, para dissolver uma variante de um polipéptido que tem uma distribuição diferente de ácido siãlico em comparação com o polipéptido não variante. A preparação de polipéptido obtida de acordo com o método de cromatografia de permuta de iões no presente documento pode ser submetida a etapas de purificação adicionais, se necessário. As etapas de purificação adicionais foram discutidas acima.

Opcionalmente, o polipéptido é conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas conforme desejado. Por exemplo, a molécula heteróloga pode ser uma que aumenta a meia"vida do soro do polipéptido (por exemplo, polietileno glicol, PEG), ou a mesma pode ser um marcador (por exemplo, uma enzima, marcador fluorescente e/ou radionuclídeo) ou uma molécula citotóxica (por exemplo, uma toxina, fãrmaco quimioterãpico ou isótopo radioativo, etc.).

Uma formulação terapêutica que compreende o polipéptido, opcionalmente conjugada com uma molécula heteróloga, pode ser preparada ao misturar o polipéptido que tem o grau desejado de pureza com veículoes farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16-edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículoes 0 farmaceuticamente aceitáveis", excipientes ou estabilizadores são não tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregues e, incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, o que inclui ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio; cloreto de hexametõnio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, butil ou álcool benzílico; parabenos alquil tais como parabeno de metil ou propil; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3"pentanol; e m"cresol); polipéptido de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, o que inclui glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra"iões formadores de sal tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn) e/ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG). 0 anticorpo humMAb4D5"8 de interesse particular no presente documento pode ser preparado como uma formulação liofilizada, por exemplo, conforme descrito no documento WO 97/04801; expressamente incorporado no presente documento a título de referência. A formulação no presente documento pode conter também mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência, aquelas com atividades complementares que não afetam adversamente uma à outra. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Por exemplo, para um anticorpo anti" HER2, um agente quimioterápico, tal como um taxoide ou tamoxifeno, pode ser adicionado à formulação.

Os ingredientes ativos podem ser também capturados em microcápsula preparada, por exemplo, por coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli" (metilmetacilato), respetivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16- edição, Osol, A. Ed. (1980). A formulação a ser utilizada para administração in vivo deve ser estéril. Isso é prontamente alcançado por filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

Preparações de libertação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o polipéptido variante, sendo que as matrizes estão na forma de artigos conformados, por exemplo, películas ou microcãpsula. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2"hidroxietil" metacrilato) ou poli (vinilãlcool)), poliláctidos (Documento de Patente n- U. S. 3.773.919), copolímeros de ácido glutâmico"L e γ etil!!L!'glutamato, acetato de vinil" etileno não degradável, copolímero de ácido glicólico e ácido lático degradável tal como o LUPRON DEPOTTM (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli "D" (") !! 3 "hdroxibutí rico. 0 polipéptido purificado conforme revelado no presente documento ou a composição que compreende o polipéptido e, então, um veículo farmaceuticamente aceitável é utilizada em utilizações de diagnóstico, terapêuticas ou outras conhecidas para tais polipéptidos e composições. Por exemplo, o polipéptido pode ser utilizado para tratar um distúrbio num mamífero ao administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido ao mamífero.

Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS

IgG rhuMAb HER2 de humano de comprimento completo (humAb4D5!!8 em Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 89: 4.285 a 4.289 (1992) que compreende a sequência de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2) foi produzido recombinantemente em células CHO. Em seguida à produção e secreção de proteína para o meio de cultura de célula, as células CHO foram separadas do meio de cultura de célula por filtragem de fluxo tangencial (PROSTACK). Depois, a cromatográfica de proteína A foi realizada ao aplicar o Fluido de Cultura de Célula Colhida (HCCF) a partir das células CHO diretamente para uma coluna PROSEP ATM equilibrada (Bioprocessing, Ltd).

Em seguida à cromatográfica de proteína A, a cromatografia por permuta de catiões foi realizada ao utilizar uma coluna de sulfopropil (SP"SEPHAROSE FLUXO RÁPIDO XL (SPXLFF) (Pharmacia) para separar adicionalmente a molécula de anticorpo anti"HER2 desejada. Uma coluna de SPXLFFTM coluna foi embalada. As dimensões foram: 100 cm de diâmetro e 35 cm de altura de leito. A condutividade da poça foi reduzida pela adição de um volume igual de água estéril para injeção (SWFI).

Os ciclos de cromatografia para esses estudos foram realizados com sistema FPLC UNICORN de Pharmacia, Inúmeros ciclos de cromatografia foram realizados com densidades de carga de 15,30 e 45 mg de rhuMAb HER2 por mL de resina SPXLFF. Adicionalmente, o volume de atraso em seguida à lavagem de gradiente foi variado. Os volumes de atraso de 1,0, 0,8, 0,6 e 0,4 volumes de coluna em seguida ao gradiente foram testados, A concentração de proteína de cada fração de cromatografia foi determinada por varreduras espectrométricas de cada amostra. Os resultados foram utilizados para calcular os rendimentos de recuperação de produto. 0 coeficiente de extinção para rhuMAb HER2 é 1,45. Cálculos utilizados para derivar os resultados são:

Concentração de Proteína (mg/mL)= .?^2iíSL x Fator de 1,45

Diluição

Massa de Proteína (mg) em Cada Fração = Concentração de Proteína (mg/mL) x Volume de Fração (mL) , „ Massa de Fraçioímg)

Rendimento i.%) = -:—: X 100

Mass a Total fiisg}

Variantes deaminadas e outras variantes ácidas de rhuMAb HER2 foram produzidas quando o anticorpo foi feito por tecnologia de ADN recombinante. As frações de cada uma das cromatografias de estudo foram testadas para a quantidade relativa de anticorpo variante por cromatografia HPIEC Dionex. As variantes de aminadas e outras variantes constituídas de cerca de 15 a cerca de 20% da composição obtida a partir da cromatografia de proteína A inicial. Foi descoberto que os métodos de permuta de iões descritos abaixo poderiam ser utilizados para substancialmente reduzir a quantidade de variantes deaminadas e outros ácidas na composição anti"HER2, tipicamente em cerca de 50% ou mais.

Exemplo 1: A coluna SPXLFF foi preparada para carregar por lavagens sequenciais com tampão de regeneração (0,5 N de NaOH) seguidas por tampão de equilíbrio (30 mM de MES/45 mM de NaCl, pH 5,6) . Depois, a coluna foi carregada com poça de proteína A ajustada para um pH de 5,60 ± 0,05 e uma condutividade de 5,8 ± 0,2 mmhos. A coluna foi lavada com a utilização de um gradiente de sal linear essencialmente conforme retratado na Figura 2. Antes de começar o gradiente linear, o tampão de eluição (30 mM de MES, 100 mM de NaCl, pH 5,6) foi misturado com o tampão de equilíbrio para produzir um tampão de lavagem inicial que compreendia cerca de 26% de tampão de eluição. A inclinação do gradiente linear foi variada em diferentes experimentos com taxas de aumento de concentração de sal de 1 mM de NaCl/Volume de coluna (VC), 2 mM/VC e 3 mM/VC utilizados. 0 gradiente linear continuou até uma DO de 0,6 a 280 nm ser medida no fluxo. Então, a coluna foi lavada com 1 VC do último tampão de lavagem.

Depois, rhuMAb HER2 foi eluído a partir da coluna com tampão de eluição (30 mM de MES/100 mM de NaCl, pH 5,6). Em seguida à eluição, a coluna foi regenerada com tampão de regeneração (0,5 N de NaOH).

Conforme pode ser visto na Tabela 1, o rendimento de etapa variou como um resultado de inclinação e massa de carga.

Tabela 1: Rendimento de Etapa como Função de Inclinação de

Gradiente e Massa de Carqa

A pureza foi medida em termos de variantes ácidas por HPIEC Dionex. Conforme pode ser visto na Tabela 2, a pureza geralmente aumentada com inclinação de gradiente crescente. A carga compreendeu 17% de variantes ácidas em todos os casos.

Tabela 2: Resultados de Pureza de Dionex HPIEC; % de

Variant PR Áriiiapí

Exemplo 2:

Uma coluna SPXLFF, conforme descrito acima, foi preparada para carregar por lavagens sequenciais com tampão de regeneração (0,5 N de NaOH) seguido pelo tampão de equilíbrio (30 mM de MES/70 mM de Na/HOAc, pH 5,5). Depois, a coluna foi carregada com poça de proteína A ajustada para um pH de 5,60 ± 0,05 e uma condutividade de 5,8+ 0,2 rnrnhos.

Em seguida ao carregamento, a coluna foi lavada ao utilizar um gradiente de sal com múltiplas inclinações com três segmentos distintos, sendo que cada um tem uma inclinação progressivamente mais rasa, essencialmente conforme ilustrado na Figura 3. Os parâmetros de gradiente são mostrados na Tabela 3 abaixo. A lavagem começou com um aumento por etapas inicial na concentração de sal do tampão de equilíbrio para formar o tampão de lavagem inicial. 0 tampão de lavagem inicial foi criado ao misturar o tampão de eluição (30 mM de MES, 145 mM de Na/HQAc, pH 5, 5) com tampão de equilíbrio para produzir um tampão que compreendeu 26% de tampão de eluição. Durante o primeiro segmento de gradiente linear, a coluna foi lavada com aproximadamente 4,9 volumes de coluna de tampão de lavagem, durante a qual a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumentou a uma taxa de cerca de 5. 71% por volume de coluna. Portanto, no final do primeiro segmento de gradiente linear, o tampão de lavagem compreendeu 54% de tampão de eluição.

Durante o segundo segmento de gradiente linear, 2,0 volumes de coluna de tampão de lavagem foram passados sobre a coluna. Durante esse segmento, a percentagem de tampão de eluição aumentada a uma taxa de 3,5%. Portanto, no final do segundo segmento o tampão de lavagem compreendeu 61% de tampão de eluição.

Finalmente, durante o terceiro segmento de gradiente linear, 6,1 volumes de coluna de tampão de lavagem foram passados sobre a coluna, sendo que a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumentou a uma taxa de 2,13% por volume de coluna. 0 terceiro segmento gradiente linear terminou quando uma DO de 0,6 a 280 nm foi medida no fluxo. Nesse momento, o tampão de lavagem compreendeu 74% de tampão de eluição.

Em seguida ao terceiro gradiente linear, um volume fixo do tampão de lavagem final (isto é, 74% de tampão de eluição) foi passado sobre a coluna. Volumes fixos de 0,8, 0,6 e 0,4 volumes de coluna foram utilizados em diferentes experimentos.

Então, rhuMAb HER2 foi eluído a partir da coluna com tampão de eluição (30 mM de MES/145 mM de Na/HOAc, pH 5,5). Em seguida à eluição, a coluna foi regenerada com tampão de regeneração (0, 5 N de NaOH).

Tabela 3: Parâmetros de Gradiente

O efeito de carga de rhuMAb HER2 e volume de atraso de lavagem final na recuperação de produto e qualidade de produto foi avaliado. Os resultados apresentados nas Tabelas 4 e 5 mostram que é possível alcançar rendimento consistente e remoção de variante ácida sobre uma ampla variedade de cargas ao utilizar uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla. Adicionalmente, os resultados demonstraram que a compensação entre rendimento e pureza pode ser ajustada conforme desejado através do ajuste do volume de atraso de lavagem final depois de uma DO de 0,6 ser alcançada.

Conforme pode ser visto na Tabela 4, para um determinado volume de atraso de lavagem final, o rendimento da etapa não varia significativamente. Um volume de atraso de lavagem final maior diminui de algum modo o rendimento em todas as massas de carga. Contudo, conforme mostrado na

Tabela 5, aumentar o volume de atraso de lavagem final aumenta a pureza da proteína eluída. Portanto, um perito na especialidade terá capacidade para selecionar um volume de atraso de lavagem final que alcança rendimento e pureza desej ados.

Tabela 4: Rendimento de Etapa como Função de Volume de Atraso de Lavagem e Massa de Carga

Tabela 5: Pureza Dionex HPIEC; % de Variantes Ácidas

Ao utilizar um gradiente de inclinação múltipla com três segmentos, cada um com uma inclinação progressivamente mais rasa, rendimento consistente e pureza pode ser alcançado através de uma faixa de carga ampla. Entre as faixas de 15 a 45 mg de anticorpo por mL de resina, há pouca variação no rendimento ou na qualidade de rhuMAb HER2 recuperado na poça de eluição para um determinado volume de atraso de lavagem de coluna.

LISTAGEM DE SEQUENCIA <110> GENENTECH, INC.

<12G> PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA <130> SMW/FP6284038 <140> EP 03795664,6 <141> 08"09”2003 <150> PCT/US2003/028064 <151> 08"09"2003 <150> 60/410.334 <151> 11"09"2002 < 16 0 > 2 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

< 210 > 1 <211> 214 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Polipéptido Sintético <400> 1

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Sex Ser Leu Sex Ala Ser Vai Gly l 5 10 15

Asp Acg Val Th.r He Thr Cys Arq Ala S«r Gin Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Fro Gly Lys Ala Pro Lys Lou Leu He 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ssr Arg Phe $er Gly SO 55 60

Set Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65 ?0 75 SO

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr: Cys Gin Gin Bis; Tyr Thr Thr Pro Fro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Gin He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 ' 110

Pro Ser Vai. phe He Phe Pro Fro Ser .Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asη Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Sex Val Thr Glu Gin Arp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr' Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185» 190

Ala Cys Glu Val Thr Bis Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys; Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Polipéptido Sintético <400> 2

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Fro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Set Cys Ala Ala Ses Gly Pise Asn He Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr He His 'Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Arg He Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 ’ 5S 60

Lys Gly Arg Pile Thx He S«r Ala Asp Thr Ser Lys As» Thr Ala Tyr

65 70 75 SO

Leu Gin Met Asn. Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95- 30 35

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin

100 105 HO

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Sex Ala Ser Thr Lys Gly Pro Set Val 115 .120 125 phe-p.ro Leu Ala Pro Sex $er Lys Set Thr Ser Giy Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 ISO 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Sex Gly Val His Thr Phs Pro Ala Val 165 170 175

Leu Sirs Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 18Õ 185 130

Ser Sar Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro See Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Lev Gly Gly 225 ' 230 ' 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lett Met He 245 250 255 $er Axg Thr- Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 ’ 270

Asp Pro Gits Val Lys Fhe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 ' 280 285

Asn. Ala Lys Thr Lys Pro Axg Glu Glu Gin Tyr Asn Sex Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Va.l Sex Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 3Q5 310 31¾ 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Ley Pro Ala Pro He Glu 32S 330 335

Lys Thr I Lê Ser Lyê Alâ LyS Gly Gin Pro Arg Gly Pro Gift Val Tyr 340 345 350

Thr Leo Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Set Leo 3SS 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Fhe Tyr Pro Ser .Asp He Ala Val Glu Trp 3?0 3?5 3S0

Gits See Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 330 395 ' 400

Leo Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lea Tyr Ser Lys Leu Thr Vsl Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val phe Ser Cys Ser Val Met Sis 420 425 430

Glu Ala Leu Bis Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 * 440 ~ 445

Gly

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6339142 B [0006] • US 6417355 B, Basey [0006] • US 6127526 A [0007] • US 6333398 B, Blank, G. [0007] • WO 0055184 A [0008] • WO 0002921 A [0009] • WO 9830694 A [0010] • US 5534615 A [0034] [0037] [0084] • US 5279823 A [0036] • US 5091178 A [0039] • US 4816567 A [0040] [0041] • WO 9316185 A [0048] • EP 404097 A [0049] • WO 9311161 A [0049] • WO 9308829 A [0052] • WO 9404690 A [0054] • WO 9627011 A [0055] • US 4676980 A [0056] • WO 9100360 A [0056] • WO 92200373 A [0056] • EP 03089 A [0056] • US 5677171 A [0073] • US 4675187 A [0082] • DD 266710 [0085] • EP 402226 A [0086] • EP 183070 A [0086] • EP 244234 A [0086] • US 4767704 A [0090] • US 4657866 A [0090] • US 4927762 A [0090] • US 4560655 A [0090] • US 5122469 A [0090] • WO 9003430 A [0090] • WO 8700195 A [0090] • US RE30985 E [0090] • WO 9704801 A [0122] • US 3773919 A [0126] • EP 03795664 A [0148] • US 2003028064 W [0148] • US 60410334 B [0148]

Documentos de não patente citados na descrição • HARRIS et al. J. Chromatography, 2001, vol. 752 , 233 " 245 [0011] • FITCH et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, vol. 80, 1382"1386 [0034] • NEEDLEMAN et al. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443"453 [0034] • T.E. CREIGHTON. Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman Ê Co, 1983, 79"86 [0034] • KOHLER et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0040] • MCCAFFERTY et al. Nature, 1990, vol. 348, 552"554 [0040] • CLACKSON et al. Nature, 1991, vol. 352, 624"628 [0040] • MARKS et al. J. Mol. Biol. , 1991, vol. 222, 581"597 [0040] • MARKS et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779"783 [0040] • WATERHOUSE et al. Nuc. Acids. Res. , 1993, vol. 21, 2265 "2266 [0040] • JAKOBOVITS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, voi. 90, 2551 [00403 • JAKOBOVITS et al. Nature, 1993, vol. 362, 255"258 [0040] • BRUGGERMANN et al. Year in Immune., 1993, vol. 7, 33 [0040] • DUCHOSAL et al. Nature, 1992, vol. 355, 258 [0040] • MORRISON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851 "6855 [0041] • RABAT et al. Sequences of Polypeptides of Immunological Interest. Public Health Service, National Institutes of Health, 1991 [0042] • CHOTHIA ; LESK. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901"917 [0042] • CARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0042] [0045] • SIMS et al. J. Immunol, 1993, vol. 151, 2296 [0044] • CHOTHIA et al. J. Mol. Biol. , 1987, vol. 196, 901 [0044] • PRESTA et al. J. Immnol., 1993, vol. 151, 2623 [0045] • MORIMOTO et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, vol. 24, 107"117 [0047] • BRENNAN et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0047] [0057] • CARTER et al. Bio/Techno1ogy, 1992, vol. 10, 163 "167 [0047] • PLUCKTHUN. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer"Verlag, 1994, vol. 113, 269"315 [0048] • HOLLINGER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444 "6448 [0049] [0059] • ZAPATA et al. Polypeptide Eng. , 1995, vol. 8 (10) , 1057"1062 [0050] • MILLSTEIN et al. Nature, 1983, vol. 305, 537"539 [0052] • TRAUNECKER et al. EMBO J. , 1991, vol . 10, 3655 "3659 [0052] • SURESH et al. Methods in Enzynology, 1986, vol. 121, 210 [00543 • SHALABY et al. J. Exp. Med. , 1992, vol. 175, 217 "225 [0058] • KOSTELNY et al. J. Immunol, 1992, vol . 148 (5) , 1547" 1553 [0059] • GRUBER et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0059] • TUTT et al. J. Immunol, 1991, vol. 147, 60 [0060] • BUFFERS. A. Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,. Calbiochem Corporation, 1975 [0065] • SEMBA et al. PNAS (USA) , 1985, vol . 82, 6497"6501 [0072] • YAMAMOTO et al. Nature, 1986, vol. 319, 230"234 [0072] • GRAHAM et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0088] • URLAUB et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0088] • MATHER. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243 "251 [0088] • MATHER et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44" 68 [0088] • HAM et al. Meth. Enz., 1979, vol. 58, 44 [0090] • BARNES et al. Anal. Biochem. , 1980, vol. 102, 255 [0090] • Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0122] [0124] • CARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1992, vol. 89, 4285"4289 [0129]

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método para purificar um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e contaminantes, sendo que o método compreende as etapas sequenciais de: (a) carregar a composição numa resina de permuta de iões com um tampão de equilíbrio que tem uma primeira concentração de sal; (b) lavar a resina de permuta de iões com um tampão de lavagem até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo, em que a concentração de sal do tampão de lavagem aumenta a partir de uma segunda concentração de sal inicial que é maior do que a concentração de sal do tampão de equilíbrio, até uma terceira concentração de sal final e em que a concentração de proteína predeterminada corresponde a uma DO de 0,6 medida a 280 nm; (c) passar um volume fixo de 0,4 a 1 volume de coluna de tampão de lavagem na terceira concentração de sal final através da resina de permuta de iões; e (d) eluir o polipéptido a partir da resina de permuta de iões com tampão de eluição que tem uma concentração de sal que é maior do que a concentração de sal final do tampão de lavagem. 2. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que a resina de permuta de iões é uma resina de permuta de aniões. 1 1 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que a resina de permuta de iões é uma resina de permuta de catiões. 4. 0 método, de acordo com a reivindicação 3 em que a resina de permuta de catiões compreende sulfopropil imobilizado em agarose. 5. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão de eluição tem uma condutividade mais alta do que o tampão de equilíbrio. 6. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão de eluição compreende 145 mM de Na/HOAc e o tampão de equilíbrio compreende 70 mM de Na/HOAc. 7. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão de eluição compreende 100 mM de NaCl e o tampão de equilíbrio compreende 45 mM de NaCl. 8. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que (b) compreende uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla, em que o gradiente de inclinação múltipla compreende mais de um segmento e o aumento na concentração de sal do tampão de lavagem é maior no primeiro segmento do que em qualquer segmento adicional. 9. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão de lavagem compreende uma mistura de tampão de equilíbrio e tampão de eluição. 10. 0 método, de acordo com a reivindicação 9, em que o aumento na concentração de sal do tampão de lavagem durante a etapa (b) é alcançado ao aumentar a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem. 11. 0 método, de acordo com a reivindicação 10, em que a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta numa taxa constante. 12. 0 método, de acordo com a reivindicação 11, em que o aumento na proporção de tampão de eluição leva a concentração de sal do tampão de lavagem a aumentar a uma taxa constante de desde 1 mM até 3 mM por volume de coluna de tampão de lavagem. 13. 0 método, de acordo com a reivindicação 10, em que a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta em duas ou mais taxas diferentes durante o decurso de lavagem na etapa (b). 14. 0 método, de acordo com a reivindicação 13, em que a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta numa primeira taxa para um primeiro segmento da lavagem, numa segunda taxa para um segundo segmento da lavagem e a uma terceira taxa para um terceiro segmento da lavagem. 15. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido é um anticorpo. 16. 0 método, de acordo com a reivindicação 15, em que o anticorpo se liga a HER2. 17. 0 método, de acordo com a reivindicação 15, em que o contaminante é uma variante desaminada do anticorpo. 18. 0 método, de acordo com a reivindicação 15, em que a quantidade de anticorpo na composição carregada na resina de permuta de iões é desde 15 mg até 45 mg por mL de resina de permuta de catiões. 19. 0 método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pH do tampão de equilíbrio, tampão de lavagem e tampão de eluição é o mesmo.
2. 20. O método, de acordo com a reivindicação 19, em que o pH do tampão de equilíbrio, tampão de lavagem e tampão de eluição é 5,5.
3. 21. Um método, para purificar um anticorpo a partir de uma composição que compreende o anticorpo e um contaminante, sendo que o método compreende as seguintes etapas realizadas sequencialmente: (a) ligar o anticorpo a um material de permuta de catiões com um tampão de equilíbrio numa primeira condutividade; (b) lavar o material de permuta de catiões com um tampão de lavagem até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta a partir de uma segunda condutividade que é maior do que a primeira condutividade para uma terceira condutividade durante a lavagem, e em que a concentração de proteína predeterminada corresponde a uma DO de 0,6 medida a 280 nm; (c) passar um volume fixo entre 0,4 e 1 volume de coluna de tampão de lavagem na terceira condutividade pelo material de permuta de catiões; e (d) eluir o anticorpo a partir do material de permuta de catiões com um tampão de eluição numa quarta condutividade que é maior do que a terceira condutividade. 22. 0 método, de acordo com a reivindicação 21, em que a resina de permuta de catiões compreende sulfopropil imobilizado em agarose. 23. 0 método, de acordo com a reivindicação 21, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta a uma taxa constante a partir da segunda condutividade até à terceira condutividade. 24. 0 método, de acordo com a reivindicação 21, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta em duas ou mais taxas diferentes a partir da segunda condutividade até à terceira condutividade. 25. 0 método, de acordo com a reivindicação 24, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta numa primeira taxa para um primeiro segmento da lavagem, numa segunda taxa para um segundo segmento da lavagem e numa terceira taxa para um terceiro segmento da lavagem. 26. 0 método, de acordo com a reivindicação 21, em que (b) compreende uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla, em que o gradiente de inclinação múltipla compreende mais de um segmento e o aumento na condutividade do tampão de lavagem é maior no primeiro segmento do que em qualquer segmento adicional. 27. 0 método, de acordo com a reivindicação 25, em que o tampão de lavagem compreende uma mistura de tampão de equilíbrio e tampão de eluição. 28. 0 método, de acordo com a reivindicação 27, em que a condutividade do tampão de lavagem é aumentada ao aumentar a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem. 29. 0 método, de acordo com a reivindicação 28, em que a proporção de tampão de eluição no tampão de lavagem aumenta a uma taxa constante de 6% durante o primeiro segmento, a uma taxa constante de 3,5% durante o segundo segmento e a uma taxa constante de 2% durante o terceiro segmento.
4. 30. O método, de acordo com a reivindicação 28, em que o material de permuta de catiões é lavado com 5 volumes de coluna de tampão de lavagem no primeiro segmento, 2 volumes de coluna de tampão de lavagem no segundo segmento e 6 volumes de coluna de tampão de lavagem no terceiro segmento.
5. 31. O método, de acordo com a reivindicação 21, em que a condutividade do tampão de lavagem é aumentada ao aumentar a percentagem de tampão de eluição no tampão de lavagem.
6. 32. O método, de acordo com a reivindicação 21, em que a condutividade do tampão de lavagem é aumentada ao aumentar a concentração de sal no mesmo. 33. 0 método, de acordo com a reivindicação 21, que compreende adicionalmente lavar o material de permuta de iões com um tampão de regeneração depois da etapa (d).
7. 34. Um método para purificar um anticorpo a partir de uma composição que compreende o anticorpo e um contaminante, sendo que o método compreende as seguintes etapas realizadas sequencialmente: (a) carregar a composição num material de permuta de catiões; (b) lavar o material de permuta de catiões com um tampão de lavagem que utiliza uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo, em que a condutividade do tampão de lavagem aumenta numa primeira taxa a partir de uma primeira condutividade até uma segunda condutividade, a uma segunda taxa a partir da segunda condutividade até uma terceira condutividade e a uma terceira taxa a partir da terceira condutividade até uma quarta condutividade, e em que o aumento na condutividade do tampão de lavagem é maior no primeiro segmento da lavagem de gradiente de inclinação múltipla do que em segmentos subsequentes, e em que a concentração de proteína predeterminada corresponde a uma DO de 0,6 medida a 280 nm; e (c) eluir o anticorpo a partir do material de permuta de iões, em que a quantidade de anticorpo na composição carregada no material de permuta de catiões é a partir de 15 mg a 45 mg do anticorpo por mL de material de permuta de catiões.
8. 35. Um método para purificar um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e um contaminante, sendo que o método compreende as seguintes etapas realizadas sequencialmente: (a) carregar a composição num material de permuta de iões; (b) lavar o material de permuta de iões com tampão de lavagem que utiliza uma lavagem de gradiente de inclinação múltipla até uma concentração de proteína predeterminada ser medida no fluxo, em que o gradiente de inclinação múltipla compreende dois ou mais segmentos e o aumento na concentração de sal do tampão de lavagem é maior no primeiro segmento do gradiente de inclinação múltipla do que em segmentos subsequentes, e em que a concentração de proteína predeterminada corresponde a uma DO de 0,6 medida a 280 nm; e (c) eluir o polipéptido a partir do material de permuta de iões. 36. 0 método, de acordo com a reivindicação 35, que compreende adicionalmente a etapa entre as etapas (b) e (c) de lavagem da coluna com a partir de 0,4 a 1 volume de coluna de tampão de lavagem. 37. 0 método, de acordo com a reivindicação 36, em que o tampão de lavagem tem a composição do tampão de lavagem no final da etapa (b). 38. 0 método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende adicionalmente submeter a composição que compreende o polipéptido a uma ou mais etapas de purificação adicionais de modo a obter uma preparação homogénea do polipéptido. 39. 0 método, de acordo com a reivindicação 38, que compreende adicionalmente preparar uma composição farmacêutica ao combinar a preparação homogénea do polipéptido com um veículo farmaceuticamente aceitável. 40. 0 método, de acordo com a reivindicação 38, que compreende adicionalmente conjugar o polipéptido purificado com uma molécula heteróloga. 41. 0 método, de acordo com a reivindicação 40, em que a molécula heteróloga é polietileno glicol, um marcador ou um agente citotóxico.