JP2012214523A - タンパク質精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ポリペプチドおよび夾雑物を含む組成物から該ポリペプチドを精製するための方法であって、該方法は、以下の一連の工程:(a)該組成物を、第1塩濃度を有する平衡化緩衝液とともにイオン交換樹脂にローディングする工程;(b)該イオン交換樹脂を、素通り画分中に所定のタンパク質濃度が測定されるまで、洗浄緩衝液で洗浄する工程であって、該洗浄緩衝液の塩濃度は、該平衡化緩衝液の塩濃度よりも高い最初の第2塩濃度から、最終的な第3塩濃度へと上昇する、工程;(c)該最終的な第3塩濃度において、一定体積の洗浄緩衝液を、陽イオン交換樹脂に通過させる工程;および(d)該ポリペプチドを、該洗浄緩衝液の最終塩濃度よりも高い塩濃度を有する溶出緩衝液を用いて、該イオン交換樹脂から溶出させる工程を包含する、方法。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、一般に、タンパク質精製に関する。特に、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ポリペプチドおよび少なくとも1種類の夾雑物を含む組成物から、ポリペプチド(例えば、抗体)を精製する方法に関する。
タンパク質の大規模な、経済的精製は、バイオテクノロジー産業にとって、ますます重要な問題になりつつある。一般的に、タンパク質は、真核生物細胞系および原核生物細胞系のいずれかを用いて、細胞培養物によって生成される。この真核生物細胞系および原核細胞系は、組み換えプラスミドの挿入によって、目的のタンパク質を生成するように操作され、この組み換えプラスミドは、そのタンパク質の遺伝子を含む。代表的に使用される細胞は、生きた組織であり、これらは、複合増殖培地(動物血清の調製物から供給される糖、アミノ酸、および成長因子を含む)を与えられなければならない。細胞に与えられた化合物の混合物からおよび細胞自身の副産物から、ヒト用治療剤として使用するために十分な純度への所望のタンパク質の分離は、大変な課題をもたらす。
1つの局面において、本発明は、ポリペプチドおよび夾雑物を含む組成物からポリペプチドを精製するための方法を提供する。この組成物は、第1塩濃度を有する平衡化緩衝液とともにイオン交換樹脂にローディングされる。このイオン交換樹脂は、素通り画分中に所定のタンパク質濃度が測定されるまで、洗浄緩衝液で洗浄される。洗浄中、洗浄緩衝液の塩濃度は、平衡化緩衝液の塩濃度よりも高い最初の第2塩濃度から、最終的な第3塩濃度へと上昇する。次いで、最終的な第3塩濃度において、一定の体積の洗浄緩衝液を、樹脂に通過させる。最後に、ポリペプチドが、洗浄緩衝液の最終塩濃度よりも高い塩濃度を有する溶出緩衝液を用いて、イオン交換樹脂から溶出される。
好ましい実施形態では、本発明は例えば以下の方法などを提供する:
(項目1)
ポリペプチドおよび夾雑物を含む組成物から該ポリペプチドを精製するための方法であって、該方法は、以下の一連の工程:
(a)該組成物を、第1塩濃度を有する平衡化緩衝液とともにイオン交換樹脂にローディングする工程;
(b)該イオン交換樹脂を、素通り画分中に所定のタンパク質濃度が測定されるまで、洗浄緩衝液で洗浄する工程であって、該洗浄緩衝液の塩濃度は、該平衡化緩衝液の塩濃度よりも高い最初の第2塩濃度から、最終的な第3塩濃度へと上昇する、工程;
(c)該最終的な第3塩濃度において、一定体積の洗浄緩衝液を、陽イオン交換樹脂に通過させる工程;および
(d)該ポリペプチドを、該洗浄緩衝液の最終塩濃度よりも高い塩濃度を有する溶出緩衝液を用いて、該イオン交換樹脂から溶出させる工程
を包含する、方法。
(項目2)
前記イオン交換樹脂が、陰イオン交換樹脂である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記イオン交換樹脂が、陽イオン交換樹脂である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記陽イオン交換樹脂が、アガロースに固定されたスルホプロピルを含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記溶出緩衝液が、前記平衡化緩衝液よりも高い伝導率を有する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記溶出緩衝液が、約145mMのNa/HOAcを含み、前記平衡化緩衝液が、約70mMのNa/HOAcを含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記溶出緩衝液が、約100mMのNaClを含み、前記平衡化緩衝液が、約45mMのNaClを含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記洗浄緩衝液が、平衡化緩衝液と溶出緩衝液との混合物を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
工程(b)の間の前記洗浄緩衝液の塩濃度の上昇が、該洗浄緩衝液中の溶出緩衝液の比率を上げることによって達成される、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記洗浄緩衝液中の前記溶出緩衝液の比率が、一定の割合で上昇する、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記溶出緩衝液の比率の前記上昇が、1カラム体積の洗浄緩衝液あたり約1mM〜約3mMの一定の割合で、前記洗浄緩衝液の塩濃度を上昇させる、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記洗浄緩衝液中の溶出緩衝液のパーセンテージが、工程(b)の洗浄過程の間、2以上の異なる割合で上昇する、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記洗浄緩衝液中の溶出緩衝液のパーセンテージが、前記洗浄の第1セグメントについて第1の割合で上昇し、該洗浄の第2のセグメントについて第2の割合で上昇し、そして該洗浄の第3のセグメントについて第3の割合で上昇する、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記ポリペプチドが、抗体である、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記抗体が、HER2を結合する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記夾雑物が、前記抗体の脱アミド化改変体である、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記イオン交換樹脂にローディングされる前記組成物中の抗体の量が、陽イオン交換樹脂1mLあたり、約15mg〜約45mgである、項目14に記載の方法。
(項目18)
工程(b)における前記所定のタンパク質濃度が、280nmにおいて測定された0.6ODに相当する、項目1に記載の方法。
(項目19)
約0.4〜約1カラム体積の洗浄緩衝液が、工程(c)において前記イオン交換樹脂に通される、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記平衡化緩衝液、前記洗浄緩衝液および前記溶出緩衝液のpHが、ほぼ同じである、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記平衡化緩衝液、前記洗浄緩衝液および前記溶出緩衝液のpHが、ほぼ5.5である、項目23に記載の方法。
(項目22)
前記ポリペプチドを含む前記組成物を、工程(a)〜工程(d)の前、間または後のいずれかで1以上のさらなる精製工程に供し、その結果、該ポリペプチドの均質な調製物を得る工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記ポリペプチドの均質な前記調製物と、薬学的に受容可能なキャリアとを合わせることにより薬学的組成物を調製する工程をさらに包含する、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記精製されたポリペプチドを、異種分子と結合させる工程をさらに包含する、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記異種分子が、ポリエチレングリコール、標識または細胞傷害性剤である、項目24に記載の方法。
(項目26)
項目1に記載の方法に従って精製された、ポリペプチド。
(項目27)
ポリペプチドおよび夾雑物を含む組成物から抗体を精製するための方法であって、該方法は、順次実施される以下の工程:
(a)該抗体を、第1伝導率の平衡化緩衝液を用いて陽イオン交換材料に結合させる工程;
(b)該陽イオン交換材料を、洗浄緩衝液を用いて洗浄する工程であって、該洗浄緩衝液の伝導率が、該洗浄の間に、該第1伝導率よりも高い第2伝導率から、第3伝導率へと上昇する、工程;
(c)一定体積の、該第3伝導率の洗浄緩衝液を、該陽イオン交換材料に通す工程;および
(d)該抗体を、該第3伝導率よりも高い第4伝導率の溶出緩衝液を用いて該陽イオン交換材料から溶出させる工程
を包含する、方法。
(項目28)
前記陽イオン交換樹脂が、アガロース上に固定されたスルホプロピルを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記洗浄緩衝液の前記伝導率が、前記第2伝導率から前記第3伝導率へと一定の割合で上昇する、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記洗浄緩衝液の伝導率が、前記第2伝導率から前記第3伝導率へと2以上の異なる割合で上昇する、項目27に記載の方法。
(項目31)
前記洗浄緩衝液の伝導率が、前記洗浄の第1セグメントについては第1の割合で上昇し、該洗浄の第2セグメントについては第2の割合で上昇し、そして該洗浄の第3セグメントについては第3の割合で上昇する、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記洗浄緩衝液が、平衡化緩衝液と溶出緩衝液との混合物を含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記洗浄緩衝液の前記伝導率が、該洗浄緩衝液中の溶出緩衝液の比率が上昇することにより上昇する、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記洗浄緩衝液中の溶出緩衝液の前記比率が、前記第1セグメントの間は約6%の一定の割合で上昇し、前記第2セグメントの間は約3.5%の一定の割合で上昇し、そして前記第3セグメントの間は約2%の一定の割合で上昇する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記洗浄緩衝液中の溶出緩衝液の比率が、前記第1セグメントの間は約26%から約54%へと上昇し、前記第2セグメントの間は約54%から約61%へと上昇し、そして前記第3セグメントの間は約61%から約74%へと上昇する、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記陽イオン交換材料が、前記第1セグメントにおいて約5カラム体積の洗浄緩衝液を用いて洗浄され、前記第2セグメントにおいて約2カラム体積の洗浄緩衝液を用いて洗浄され、そして前記第3セグメントにおいて約6カラム体積の洗浄緩衝液を用いて洗浄される、項目31に記載の方法。
(項目37)
前記洗浄緩衝液の伝導率が、該洗浄緩衝液中の溶出緩衝液のパーセンテージを上昇させることにより上昇される、項目27に記載の方法。
(項目38)
前記洗浄緩衝液の伝導率が、該洗浄緩衝液中の塩濃度を上昇させることにより上昇される、項目27に記載の方法。
(項目39)
工程(c)において前記陽イオン交換材料に通される洗浄緩衝液の前記一定体積が、約0.4カラム体積と約1.0カラム体積との間である、項目27に記載の方法。
(項目40)
工程(d)の後に再生緩衝液を用いて前記イオン交換材料を洗浄する工程をさらに包含する、項目27に記載の方法。
(項目41)
抗体および夾雑物を含む組成物から該抗体を精製するための方法であって、該方法は、順次実施される以下の工程:
(a)該組成物を、陽イオン交換材料にローディングする工程;
(b)該陽イオン交換材料を、第1伝導率から第2伝導率へと第1の割合で上昇し、該第2伝導率から第3伝導率へと第2の割合で上昇し、そして該第3伝導率から第4伝導率へと第3の割合で上昇する伝導率を有する洗浄緩衝液で洗浄する工程;および
(c)該抗体を、該イオン交換材料から溶出させる工程であって、該陽イオン交換材料にローディングされる該組成物中の抗体の量が、陽イオン交換材料1mlあたり約15mg〜約45mgの抗体である、工程
を順次実施する工程を包含する、方法。
(項目42)
ポリペプチドおよび夾雑物を含む組成物から該ポリペプチドを精製するための方法であって、該方法が、順次実施される以下の工程:
(a)該組成物をイオン交換材料にローディングする工程;
(b)陽イオン交換材料を、所定のタンパク質濃度が素通り画分中に測定されるまで、複数の傾きの勾配を用いて洗浄緩衝液で洗浄する工程;および
(c)該ポリペプチドを、該イオン交換材料から溶出させる工程
を包含する、方法。
(項目43)
前記複数の傾きの勾配が、2以上のセグメントを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記複数の傾きの勾配の各セグメントが、より浅い傾きを有する、項目43に記載の方法。
(項目45)
工程(b)と工程(c)との間に、0.4カラム体積〜1カラム体積の洗浄緩衝液を用いて前記カラムを洗浄する工程をさらに包含する、項目42に記載の方法。
(項目46)
前記洗浄緩衝液が、工程(b)の終わりに前記洗浄緩衝液の組成を有する、項目45に記載の方法。
(定義:)
本明細書中で精製される「組成物」は、目的のポリペプチドおよび1種類以上の夾雑物を含む。この組成物は、「部分的精製物」であり得る(すなわち、1以上の精製工程(例えば、プロテインAクロマトグラフィー)に供された)か、または宿主細胞もしくはポリペプチドを生成する組織から直接的に得られ得る(例えば、組成物は、収集された細胞培養液を含み得る)。
expressed and secreted);ヒト、マクロファージ炎症タンパク質(MIP−1−α);血清アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン);ミューラー管阻害物質;レラキシンA鎖;レラキシンB鎖;プロレニン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;微生物タンパク質(例えば、β−ラクタマーゼ;DNase;IgE;細胞障害性Tリンパ球関連抗体(CTLA)(例えば、CTLA−4);インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモンもしくは成長因子のレセプター;プロテインAもしくはプロテインD;リウマチ因子;神経栄養因子(例えば、骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ニューロトロフィン−5、もしくはニューロトロフィン−6(NT−3、NT−4、NT−5、もしくはNT−6)、または神経成長因子(例えば、NGF−β);血小板由来成長因子(PDGF);線維芽細胞成長因子(例えば、aFGFおよびbFGF;上皮成長因子(EGF);トランスフォーミング成長因子(TGF)(例えば、TGF−αおよびTGF−β(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、もしくはTGF−β5を含む));インシュリン様成長因子−Iおよび−II(IGF−IおよびIGF−II);デス(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP);CDタンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8、CD19、およびCD20);エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン(例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ);コロニー刺激因子(CSF)(例えば、M−CSF、GM−CSF、およびG−CSF;インターロイキン(IL)(例えば、IL−1〜IL−10);スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス抗原(例えば、AIDSエンベロープの一部など);輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節性タンパク質;インテグリン(例えば、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4、およびVCAM);腫瘍関連抗原(例えば、HER2、HER3、もしくはHER4)レセプター;ならびに、上記に列挙されたポリペプチドのいずれかのフラグメントおよび/もしくは改変体。最も好ましいものは、ヒトHER2に結合する全長抗体である。
of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.(編)Calbiochem Corporation(1975)中に記載される。1つの実施形態において緩衝液は、(例えば、以下の実施例1のように)約5〜約7の範囲のpHを有する。この範囲でpHを制御する緩衝液の例としては、MES、MOPS、MOPSO、ホスフェート、アセテート、シトレート、スクシネート、およびアンモニウム緩衝液、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。開示される方法に使用される緩衝液は、代表的に、塩(例えば、NaCl、KCl、またはNaHOAc)をまた含む。
本明細書中の発明は、ポリペプチドおよび1種類以上の夾雑物を含む組成物(例えば、水溶液)から、ポリペプチドを精製するための方法を提供する。この組成物は、一般的に、ポリペプチドの組み換え産物から得られた組成物であるが、ペプチド合成によるポリペプチド産物から得られた組成物であり得る。もしくはこのポリペプチドは、そのポリペプチドの天然供給源から精製され得る。好ましくは、ポリペプチドは、抗体(例えば、HER2抗原に結合する抗体)である。
16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotolerans、およびK.marxianusなど);yarrowia(EP402,226);Pichia pastoris(EP183,070);Candida;Trichoderma reesia(EP244,234);Neurospora crassa;Schwanniomyces(例えば、Schwanniomyces occidentails);ならびに糸状菌(例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium)、およびAspergillus宿主(例えば、A.nidulansおよびA.niger))。
CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR (CHO、 Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));マウスセルトーリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982));MRC 5細胞;FS4細胞;およびヒトヘパトーム細胞(Hep
G2)。
HER2の吸光係数は、1.45である。結果を求めるために使用された計算は、以下である:
タンパク質濃度(mg/mL)=280nm/1.45×希釈係数;
各画分のタンパク質質量(mg)=タンパク質濃度(mg/mL)×画分体積(mL);
収量(%)=画分質量(mg)/全質量(mg)×100。
ローディングのために、再生緩衝液(0.5N NaOH)、続いて平衡化緩衝液(30mM MES/45mM NaCl、pH5.6)による一連の洗浄によって、SPXLFFカラムを調製した。次いで、このカラムに、pH5.60±0.05および伝導率5.8±0.2mmhosに調整したプロテインAプールをローディングした。このカラムを線形塩勾配を用いて、実質的に図2に示されるように、洗浄した。線形勾配を開始する前に、溶出緩衝液(30mM MES、100mM NaCl、pH5.6)と平衡化緩衝液とを混合して、約26%の溶出緩衝液を含む最初の洗浄緩衝液を作製した。1mM
NaCl/カラム体積(CV)、2mM/CV、および3mM/CVの塩濃度上昇率を用いて、線形勾配の傾きを異なる実験で変動させた。素通り画分において280nmで0.6ODが測定されるまで、線形勾配を継続した。次いで、このカラムを1CVの最終洗浄緩衝液で洗浄した。
ローディングのために、再生緩衝液(0.5N NaOH)、続いて平衡化緩衝液(30mM MES/70mM Na/HOAc、pH5.5)による一連の洗浄によって、上記のようにSPXLFFカラムを調製した。次いで、このカラムに、pH5.60±0.05および伝導率5.8±0.2mmhosに調整したプロテインAプールをローディングした。
Claims (1)
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