BR112013005890B1 - Método para purificar eritropoietina peguilada - Google Patents

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Abstract

método para purificar eritropoietina peguilada. aqui é reportado um método para a purificação de uma proteína compreendendo eritropoietina e um único resíduo de poli (etileno glicol) de subprodutos de reação ou material de partida não reagido por um método de cromatografia de permuta de cátion. descobriu-se que empregando-se um material de cromatografia sp sephacryl s 500 hr de permuta de cátion condicionado a uma condutividade de 21 ms/cm e uma eluição de gradiente linear a proteína de fusão de eritropoietina e um único resíduo de poli (etileno glicol) podem ser obtidos em uma única etapa com produção e pureza elevada.

Description

Aqui é reportado um método para purificar eritropoietina PEGuilada com um método de eluição de gradiente linear em uma coluna SP Sephacryl S 500 HR.
Antecedentes da Invenção
As proteinas desempenham uma importante função no portfolio médico atual. Para aplicação em humanos cada proteina terapêutica tem que atender a critérios distintos. Para garantir a segurança de agentes biofarmacêuticos para humanos, o acúmulo de subprodutos durante o processo de produção tem que ser removido especialmente. Para preencher as especificações reguladoras uma ou mais etapas de purificação têm que seguir o processo de fabricação. Entre outras coisas, a pureza, produtividade, e produto desempenham um papel importante na determinação de um processo de purificação apropriado.
Os conjugados de proteinas terapêuticas foram reportados, por exemplo, para polietileno glicol (PEG) e Interleucina-6 (EP 0 442 724), para PEG e eritropoietina (WO 01/02017), para moléculas quiméricas compreendendo Endostatina e imunoglobulinas (US 2005/008649), para proteinas de fusão com base em anticorpo secretado (US 2002/147311), para polipeptideos de fusão compreendendo albumina (US 2005/0100991; albumina de soro humano US 5.876.969), para polipeptideos PEGilados (US 2005/0114037), e para fusões de eritropoietina.
Necina, R., e outros (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) reportaram a captura de anticorpos monoclonais humanos diretamente de sobrenadantes de cultura de célula por meio de permuta de ion exibindo densidade de carga elevada. Em WO 89/05157 um método é reportado para a purificação de imunoglobulinas do produto diretamente submetendo-se o meio de cultura de célula a um tratamento de permuta de cátion. Uma purificação de uma etapa de anticorpos de IgG monoclonais de ascites de camundongo é descrita por Danielsson, A., e outros, J. Immun. Meth. 115 (1988) 79-88. Um método para purificar um polipeptideo por cromatograf ia de permuta de ion é reportado em WO 2004/024866 no qual uma lavagem de gradiente é usada para separar um polipeptideo de interesse de um ou mais contaminantes. Em EP 0 530 447 um processo para purificar anticorpos monoclonais de IgG por uma combinação cromatográfica de três etapas é reportada. Uma purificação fácil de receptor antagonista de interleucina-1 mono- PEGilado é reportada por Yu, G., e outros, Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. Wang, H., e outros, Peptides 26 (2005) 1213-1218; reporta a purificação de hTFF3 expresso em E.coli por uma cromatografia de permuta de cátion de duas etapas. Yun, Q., e outros (Yun, Q., e outros, J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) reporta a purificação de rhG-CSF PEGilado por duas etapas de cromatografia de permuta de ion consecutivas.
Sumário da Invenção
Aqui é reportado um método para a purificação de um conjugado de proteina compreendendo eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol) de subprodutos de reação ou material de partida não reagido por um método de cromatografia de permuta de cátion. Descobriu-se que empregando o material de cromatografia de permuta de cátion SP Sephacryl S 500 HR e uma eluição de gradiente linear através da qual na coluna uma solução tamponada de uma condutividade definida foi aplicada, a proteina conjugada compreendendo eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol) pôde ser obtida em uma única etapa com produção e pureza elevada.
Desse modo, aqui é reportado como um aspecto um método para obter uma proteína de fusão compreendendo eritropoietina e um único resíduo de poli (etileno glicol) compreendendo as seguintes etapas:a) aplicar uma solução com uma condutivídade de cerca de 21 mS/cm a uma coluna de cromatograf ia compreendendo material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR,b) aplicar uma solução compreendendo uma mistura de eritropoietina livre bem como proteínas de fusão de eritropoietina e poli (etileno glicol) com um ou mais resíduos de poli (etileno glicol) por molécula de eritropoietina à coluna de a),c) aplicar uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm à coluna e desse modo recuperar as proteínas de fusão compreendendo dois ou mais resíduos de poli (etileno glicol),d) aplicar uma solução com condutividade continuamente e linearmente crescente até um valor final de pelo menos 60 mS/cm à coluna e desse modo recuper separadamente a proteína de fusão compreendendo eritropoietina e um único resíduo de poli (etileno glicol) e eritropoietina livre, por meio do qual a proteína de fusão compreendendo eritropoietina e um único resíduo de poli (etileno glicol) é obtida primeiro.
Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução com um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5. Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução tamponada de fosfato com um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5.
Em uma modalidade a solução aplicada na etapa d) tem um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5. Em uma modalidade a aplicação de uma solução com condutividade continuamente e linearmente crescente é até um valor de condutividade final de cerca de 70,0 mS/cm.
Em uma modalidade a solução com condutividade continuamente e linearmente crescente é uma solução com uma concentração de cloreto de sódio continuamente e linearmente crescente.
Em uma modalidade a eritropoietina é eritropoietina humana. Em uma modalidade a eritropoietina humana tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01 ou SEQ ID NO: 02.
Em uma modalidade o único residue de poli (etileno glicol) tem um peso molecular de 20 kDa a 40 kDa.
Em uma modalidade a solução compreendendo uma mistura de eritropoietina livre e proteinas de fusão de eritropoietina e poli (etileno glicol) com um ou mais residues de poli (etileno glicol) por molécula de eritropoietina é aplicada ao material de cromatografia de um modo que de 1 mg até 4 mg de proteina de fusão sejam aplicados a 1 ml de material de cromatografia.
Descrição da Invenção
Aqui é reportado um método para purificar uma proteina, que compreende uma molécula de eritropoietina e um resíduo de poli (etileno glicol), com um método de eluição de gradiente, sendo que o gradiente é um gradiente de condutividade linear em uma coluna SP Sephacryl S 500 HR, por meio do qual uma solução com uma condutividade definida foi aplicada à coluna de cromatografia antes da aplicação da solução compreendendo a proteína.
Os métodos cromatográficos gerais e seu uso são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Veja, por exemplo, Heftmann, E., (ed.), Chromatography, 5a edição, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, Nova Iorque (1992); Deyl, Z. , (ed.),
Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, Nova Iorque (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J., e outros, (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); ou Ausubel, F.M., e outros, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1987-1994).
O termo "aplicar a" significa uma etapa parcial de um método de purificação no qual uma solução é levada em contato com um material de cromatografia. Isto significa que ou a) a solução é adicionada a um dispositivo cromatográfico no qual o material de cromatografia está contido, ou b) que o material de cromatografia é adicionado à solução. No caso a) a solução passa através do dispositivo permitindo uma interação entre o material de cromatografia e as substâncias contidas na solução. Dependendo das condições, tais como, por exemplo, pH, condutividade, concentração de sal, temperatura, e/ou taxa de fluxo, algumas substâncias da solução se ligam ao material de cromatografia e, desse modo, podem ser recuperadas do material de cromatografia em uma etapa adicional. As substâncias restantes na solução podem ser encontradas no fluxo total. O "fluxo total" significa a solução obtida após a passagem do dispositivo, que pode ou ser a solução aplicada ou uma solução tamponada, que é usada para lavar a coluna ou para causar a eluição das substâncias ligadas ao material de cromatografia. Em uma modalidade o dispositivo é uma coluna ou um cassete. No caso b) o material de cromatografia pode ser adicionado, por exemplo, como um sólido, à solução, por exemplo, contendo a substância de interesse a ser purificada, permitindo uma interação entre o material de cromatografia e as substâncias na solução. Após a interação, o material de cromatografia é removido, por exemplo, por filtração, e substância ligada ao material de cromatografia são também removidos da solução, ao passo que as substâncias não ligadas ao material de cromatografia permanecem na solução.
O termo "modo ligado e eluido" significa um modo de operação de uma etapa de cromatograf ia, na qual uma solução contendo uma substância de interesse a ser purificada é aplicada a um material de cromatografia, por meio do qual a substância de interesse se liga ao material de cromatografia. Desse modo, a substância de interesse é retida no material de cromatografia, ao passo que as substâncias sem interesse são removidas com o fluxo total ou com o sobrenadante. A substância de interesse é, por conseguinte, recuperada do material de cromatografia em uma segunda etapa com uma solução de eluição. Em uma modalidade o método como reportado aqui é operado de um modo ligado e eluido.
As soluções empregadas no método como reportado aqui são soluções brutas ou tamponadas. O termo "solução tamponada" significa uma solução na qual as mudanças do pH devido à adição ou liberação de substâncias ácidas ou alcalinas são niveladas pela substância de tampão dissolvida. Qualquer substância de tampão com tais propriedades pode ser usada. Geralmente as substâncias de tampão farmaceuticamente aceitáveis são usadas. Em uma modalidade a solução tamponada é selecionada de uma solução tamponada de fosfato consistindo em ácido fosfórico e/ou sais dos mesmos, ou uma solução tamponada de acetato consistindo em ácido acético e sais dos mesmos, ou uma solução tamponada de citrato consistindo em ácido citrico e/ou sais dos mesmos, ou uma solução tamponada de morfolina, ou uma solução tamponada 2-(N-morfolino) etanossulfônica, ou uma solução tamponada de histidina, ou uma solução tamponada de glicina, ou uma solução tamponada de tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) . Em uma modalidade a solução tamponada é selecionada de uma solução tamponada de fosfato, ou uma solução tamponada de acetato, ou uma solução tamponada de citrato, ou uma solução tamponada de histidina. Opcionalmente a solução tamponada pode compreender um sal adicional, tal como, por exemplo, cloreto de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, citrato de sódio, ou citrato de potássio.
Os termos "eluição continua" e "método de eluição continua", que são usados alternadamente neste pedido, significam um método em que a condutividade de uma solução causando a eluição, isto é, a recuperação de um composto de ligação de um material de cromatografia, é mudada, isto é, aumentada ou reduzida, continuamente, isto é, a concentração é mudada por uma sequência de pequenas etapas cada não maior do que uma mudança de 2%, ou de 1% da concentração da substância causando a eluição. Nesta "eluição continua" uma ou mais condições, por exemplo, o pH, a força iônica, concentração de um sal, e/ou o fluxo de uma cromatografia, podem ser mudados linearmente ou exponencialmente ou assintoticamente. Em uma modalidade a mudança é linear.
O termo "material de cromatografia de permuta de ion " significa uma matriz de peso molecular elevado imóvel que carrega substituintes carregados covalentemente ligados usados como fase estacionária na cromatografia de permuta de ion. Para neutralidade de carga total, os ions não covalentemente ligados são ligados a isto. O "material de cromatografia de permuta de ion" tem a capacidade de permutar seus contra-ions não covalentemente ligados para ions similarmente carregados da solução circundante. Dependendo da carga de seus contra-ions permutáveis a "resina de permuta de ion" é referida como resina de permuta de cátion ou como resina de permuta de ânion. Dependendo da natureza do grupo carregado (substituinte) a "resina de permuta de ion" é referida como, por exemplo, no caso de resina de permuta de cátion, resina de ácido sulfônico (S), ou resina de sulfopropila (SP), ou resina de carboximetila (CM).
A uma pessoa versada na técnica os procedimentos e métodos são bem conhecidos por converter uma sequência de aminoácido, por exemplo, de um polipeptideo, em uma sequência de ácido nucléico correspondente codificando esta sequência de aminoácido. Portanto, um ácido nucléico é caracterizado por sua sequência de ácido nucléico consistindo em nucleotideos individuais e também pela sequência de aminoácido de um polipeptideo codificado do mesmo modo.
O termo "poli (etileno glicol)" ou "residue de poli (etileno glicol)" significa um resíduo não proteináceo contendo poli (etileno glicol) como parte essencial. Tal resíduo de poli (etileno glicol) pode conter também grupos químicos que são necessários para reações de ligação, que resultam da síntese química da molécula, ou que é um espaçador para a distância ideal de partes da molécula. Esses grupos químicos adicionais não são usados para o cálculo do peso molecular do resíduo de poli (etileno glicol). Além disso, tal resíduo de poli (etileno glicol) pode consistir em uma ou mais cadeias de poli (etileno glicol) que são covalentemente ligadas juntas. Os resíduos de poli (etileno glicol) com mais do que uma cadeia de PEG são chamados residues de poll (etileno glicol) ramificados ou multi-ramificados. Os residues de poll (etileno glicol) ramificados podem ser preparados, por exemplo, pela adição de óxido de polietileno à vários polióis, incluindo glicerol, pentaeritriol, e sorbitol. Os residues de poli (etileno glicol) são reportados em, por exemplo, EP 0 473 084, US 5,932,462. Em uma modalidade o residue de poli (etileno glicol) tem um peso molecular de 20 kDa a 35 kDa e é um residue de poli (etileno glicol) linear. Em outra modalidade o residue de poli (etileno glicol) é um residue de poli (etileno glicol) ramificado com um peso molecular de 35 kDa a 40 kDa.
O termo "fusão da eritropoietina com um residue de poli (etileno glicol)" significa uma ligação quimicamente introduzida covalente de um residue de poli (etileno glicol) no terminal N ou um residuo de lisina interno de eritropoietina. A fusão resulta em um conjugado de proteina, que compreende uma molécula de eritropoietina e um ou mais residuo/residuos de poli (etileno glicol). O processo de fusão é também significado como PEGilação e o produto da mesma como eritropoietina PEGuilada. A fusão/conjugação de polipeptideos com os residues de poli (etileno glicol) é amplamente conhecida no estado da técnica e revisada por, por exemplo, Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. O residuo de poli (etileno glicol) pode ser ligado usando diferentes grupos funcionais. Poli (etileno glicóis) com diferente peso molecular, diferente forma, bem como diferentes grupos de ligação pode ser usado (veja, também Francis, G.E., e outros, Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C, e outros, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249- 304) . A fusão de eritropoietina e um residuo de poli(etileno glicol) pode ser realizada em solução aquosa com reagentes de residue de poli (etileno glicol) como descrito, por exemplo, em WO 00/44785. A fusão pode também ser realizada na fase sólida de acordo com Lu, Y., e outros, Reactive Polimers 22 (1994) 221-229. Não aleatoriamente, a fusão de terminal N também pode ser produzida por WO 94/01451.
Os termos "fusão de eritropoietina e poli (etileno glicol)" e "PEGilação" significa a formação de uma ligação covalente entre um residuo de poli (etileno glicol) no terminal N da eritropoietina e/ou um residuo de lisina interno para obter um conjugado de proteina, que compreende uma molécula de eritropoietina e um residuo de poli (etileno glicol). Em uma modalidade a PEGilação de eritropoietina é realizada em solução aquosa usando moléculas de PEG ramificadas ou lineares ativadas por NHS de um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa.
O termo "sob condições adequadas para ligar" e equivalentes gramaticais do mesmo como usado neste pedido significa que uma substância de interesse, por exemplo, eritropoietina PEGuilada, se liga a uma fase estacionária quando levada em contato com, por exemplo, um material de permuta de ion. Isto não necessariamente significa que 100% da substância de interesse é ligada, porém, essencialmente 100% da substância de interesse é ligada, isto é pelo menos 50% da substância de interesse é ligada, pelo menos 75% da substância de interesse é ligada, pelo menos 85% da substância de interesse é ligada, ou mais do que 95% da substância de interesse é ligada à fase estacionária.
A conjugação ou fusão quimica de eritropoietina e poli (etileno glicol) geralmente resulta em uma mistura de diferentes compostos, tais como eritropoietina poli-
PEGuilada, mono-eritropoietina PEGuilada, eritropoietina não PEGuilada, produtos de hidrólise do éster de PEG ativado, bem como produtos de hidrólise da eritropoietina propriamente dita. Para obter uma eritropoietina mono- PEGuilada na forma substancialmente homogênea essas substâncias devem ser separadas.
Portanto, é um aspecto como reportado aqui fornecer um método para a produção de um conjugado de proteina, que compreende uma molécula de eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol), na forma substancialmente homogênea sendo que o método compreende as seguintes etapas:a) conjugar eritropoietina e poli (etileno glicol) usando um éster de poli (etileno glicol) ativado de um peso molecular de 20 kDa a 40 kDa,b) aplicar os conjugados obtidos na etapa a) a um material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR ao qual uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm foi aplicada,c) recuperar a proteina, que compreende uma molécula de eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol) (mono-eritropoietina PEGuilada), em uma forma substancialmente homogênea por uma eluição de gradiente de condutividade linear e desse modo produzindo o conjugado de proteina, que compreende eritropoietina e um único residuo de poli(etileno glicol).
Em uma modalidade o material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR está em uma coluna de cromatograf ia. Este método é especialmente útil para a purificação de eritropoietina recombinante PEGuilada, que é glicosilada, isto é, que foi produzido por uma célula de mamifero, em uma modalidade por uma célula CHO, ou uma célula HEK293, ou uma célula BHK, ou uma célula Per.Cβ®, ou uma célula HeLa e é por conseguinte quimicamente PEGilado.
Na primeira etapa do método a eritropoietina é PEGuilada. As moléculas de polimero de poli (etileno glicol) (PEG) usadas na reação de PEGilação têm um peso molecular de cerca de 20 kDa a 40 kDa (o termo "peso molecular" como usado aqui deve ser entendido como o peso molecular médio da PEG por que a PEG como composto polimérico não é obtida com um peso molecular definido, porém, na realidade tem uma distribuição de peso molecular; o termo "cerca de" indica que nas preparações de PEG, algumas moléculas pesarão mais e menos do que o peso molecular indicado, isto é, o termo cerca de refere-se a uma distribuição de peso molecular na qual 95% das moléculas de PEG tem um peso molecular dentro de + /- 10% do peso molecular indicado. Por exemplo, um peso molecular de 30 kDa significa uma faixa de 27 kDa a 33 kDa).
O termo "eritropoietina" e sua abreviação "EPO" referem-se a uma proteina tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou de SEQ ID NO: 2, ou uma proteina ou polipeptideo substancialmente homóloga a isto, cujas propriedades biológicas referem-se ao estimulo de produção de hemácia e ao estimulo da divisão e diferenciação de progenitores eritróide comprometidos na medula óssea. A eritropoietina recombinante pode ser preparada através da expressão em células eucarióticas, por exemplo, em células CHO, ou células BHK, ou células HeLa por tecnologia de DNA recombinante ou por ativação de gene endógena, isto é a glicoproteina de eritropoietina é expressa por ativação de gene endógeno, veja, por exemplo US 5.733.761, US 5.641.670, US 5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667, e WO 91/09955. Em uma modalidade a eritropoietina é EPO humano. Em uma modalidade a eritropoietina humana tem a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade a eritropoietina humana tem a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1. O termo "eritropoietina" também significa variantes da proteina de SEQ ID NO: 1 ou de SEQ ID NO: 2, na qual um ou mais residues de aminoácido foram alterados, deletados, ou inseridos, a qual tem atividade biológica comparável como a proteina não modificada, tal como, por exemplo, reportado em EP 1 064 951 ou US 6.583.272. Um variante pode ter a sequência de aminoácido de eritropoietina humana tendo de 1 a 6 sitios adicionais para glicosilação. A atividade especifica de eritropoietina PEGuilada pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica da eritropoietina PEGuilada purificada é tal que a administração da proteina por injeção aos pacientes humanos resulta em células da medula óssea aumentando a produção de reticulócitos e hemácias comparado com os grupos de controle ou não injetados dos indivíduos. A atividade biológica da eritropoietina PEGuilada obtida e purificada de acordo com o método reportado aqui pode ser testada pelo métodos de acordo com Bristow, A., Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Eritropoietina Bio 97-2 (1997) 31-48.
Os variantes de sequência de aminoácido de eritropoietina podem ser preparados introduzindo-se as modificações apropriadas na sequência de nucleotídeo codificando a eritropoietina, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleção de, e/ou inserções em, e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácido da eritropoietina. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua atividade biológica comparável com a eritropoietina humana.
As substituições de aminoácido conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o titulo de "substituições 5 preferidas". Mais alterações substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o titulo de "substituições exemplares", e como descrito abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácido. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas em eritropoietina humana e os produtos 10 avaliados quanto à retenção da atividade biológica de eritropoietina humana.
Figure img0001
Figure img0002
Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo comas propriedades de cadeia lateral comuns:(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, He;(2) hidrofilica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;(3) ácido: Asp, Glu;(4) básico: His, Lys, Arg;(5) residues que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro;(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
As substituições não conservadoras implicarão na troca de um membro de uma dessas classes para outra classe.
A PEGilação quimica de eritropoietina geralmente resulta em uma preparação de proteina compreendendo eritropoietina que é PEGuilada em um ou mais grupos ε-amino de residues de lisina e/ou no grupo de amino de terminal N. A PEGilação seletiva no aminoácido de terminal N pode ser realizada de acordo com Felix, A.M., e outros, ACS Symp. Ser. 680 (Polyetileno glycol)) (1997) 218-238. A PEGilação de terminal N seletiva pode ser obtida durante a sintese de fase sólida acoplando-se um derivado de aminoácido Na- PEGilado ao aminoácido de terminal N-l da cadeia de peptideo. PEGilação da cadeia lateral pode ser realizada durante a sintese de fase sólida por acoplamento de derivados de lisina Nε-PEGilados à cadeia em desenvolvimento. A Combinação de PEGilação de cadeia lateral e de terminal N é praticável como descrito acima em sintese de fase sólida ou por sintese de fase de solução aplicando-se reagentes PEG ativados a um peptideo desprotegido de amino.
Os derivados de PEG adequados são moléculas de PEG ativadas com, como em uma modalidade, um peso molecular médio de cerca de 5 kDa a cerca de 40 kDa, em outra modalidade de cerca de 20 kDa a cerca de 40 kDa, e em uma outra modalidade de cerca de 30 kDa a cerca de 35 kDa. Os derivados de PEG podem ser PEGs lineares ou ramificados. Uma ampla variedade de derivados de PEG adequados para uso na preparação de conjugados de PEG-proteina e PEG-peptideo está disponível.
Os derivados de PEG ativado são conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Morpurgo, M., e outros, J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, para PEG- vinilsulfona. As espécies de PEG de cadeia ramificada e cadeia linear são adequadas para a preparação dos fragmentos PEGilados. Os exemplos de reagentes de PEG reativos são iodo-acetil-metóxi-PEG, ou metóxi-PEG- vinilsulfona (m é em uma modalidade é um inteiro de cerca de 450 a cerca de 900 e R é alquila inferior, linear ou ramificada, tendo um a seis átomos de carbono tais como metila, etila, isopropila, etc. por meio das quais metila é preferida):
Figure img0003
O uso dessas substâncias ativadas por iodo é conhecido na técnica e descrito, por exemplo, por Hermanson, G. T., em Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp. 147-148.
Em uma modalidade as espécies de PEG são um éster de PEG ativado, por exemplo, propionato de N- hidroxissucinimidila, ou butanoato de N- hidroxissucinimidila, ou N-hidroxissucinimida tal como PEG- HS (Monfardini, C, e outros, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69) . Em uma modalidade PEG é ativado por éster de N- hidroxissucinimida.
Figure img0004
usando alcóxi-PEG-N-hidroxissucinimida, tal como metóxi-PEG-N-hidroxissucinimida (MW 30000), sendo que R e m são como definidos acima. Em uma modalidade a espécie de PEG é o éster de N-hidroxissucinimidila de ácido poli (etileno glicol)-butirico de metóxi. O termo "alcóxi" refere-se a um grupo éter de alquila no qual o termo 'alquila' significa um grupo alquila de cadeia reta ou ramificada contendo um máximo de quatro átomos de carbono, tais como metóxi, etóxi, n-propóxi e similar, preferivelmente metóxi.
O termo "forma substancialmente homogênea" significa que o conjugado ou fusão de proteina de eritropoietina obtido, contido, ou usado é um tendo um número definido de residues de PEG presos. Em uma modalidade a eritropoietina PEGuilada é uma eritropoietina mono-PEGuilada. A preparação pode conter eritropoietina não reagida (isto é, ausência de grupo PEG), eritropoietina poli-PEGuilada, bem como fragmentos do polipeptideo gerado durante a reação de PEGilação. O termo "forma substancialmente homogênea" significa que uma preparação de uma eritropoietina mono-PEGuilada contém pelo menos 50% (peso/peso) da eritropoietina mono-PEGuilada, ou pelo menos 75% da eritropoietina mono-PEGuilada, ou pelo menos 90% da eritropoietina mono-PEGuilada, ou mais do que 95% da eritropoietina mono-PEGuilada. O percentual de valores é com base no % de área do cromatograma que corresponde ao método de cromatografia com o qual a eritropoietina mono- PEGuilada é obtida.
Aqui é reportado um método para a purificação de uma eritropoietina PEGuilada para obter uma forma substancialmente homogênea de uma eritropoietina mono- PEGuilada. Descobriu-se que o material de cromatografia tem que ser condicionado previamente a aplicação da preparação de eritropoietina PEGuilada por uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm. Se o material de cromatografia é condicionado com uma condutividade inferior a separação das espécies diferentes da preparação de eritropoietina PEGuilada é menos eficiente. Também não é vantajoso ajustar a condutividade da solução da preparação de eritropoietina PEGuilada antes da aplicação ao material de cromatografia. Além disso, o uso adicional de um método de gradiente em etapa é menos eficaz uma vez que a eritropoietina não PEGuilada não pode ser recuperada quantitativamente do material de cromatografia. A recuperação de material de partida não reagido é vantajosa uma vez que este pode ser reutilizado na reação de PEGilação.Portanto, a invenção corrente fornece um método para a obtenção de uma eritropoietina mono-PEGuilada usando um material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR em uma única etapa primeiro aplicando-se uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm ao material de cromatografia e por conseguinte aplicando-se a solução compreendendo a preparação de eritropoietina PEGuilada ao material de cromatografia. Descobriu-se que a condutividade da primeira solução tem que ser precisamente controlada para garantir uma separação dos componentes individuais da preparação de proteina bruta.
Portanto, o método para obter um conjugado de proteina, que compreende eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol), como reportado aqui compreende as seguintes etapas:a) aplicar uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm a uma coluna de cromatograf ia compreendendo material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR,b) aplicar uma solução compreendendo uma mistura de eritropoietina livre bem como conjugados de proteina de eritropoietina e poli (etileno glicol) com um ou mais residues de poli (etileno glicol) por molécula de eritropoietina à coluna de a),c) aplicar uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm à coluna e desse modo recuperar poli (etileno glicol) livre e proteinas compreendendo dois ou mais residues de poli (etileno glicol),d) aplicar uma solução com condutividade continuamente e linearmente crescente até um valor final de cerca de 62,5 mS/cm à coluna e desse modo recuperar separadamente a proteina compreendendo eritropoietina e um único residue de poli (etileno glicol) e eritropoietina livre, por meio do qual a proteina compreendendo eritropoietina e um único residue de poli(etileno glicol) é obtida primeiro.
Descobriu-se que para garantir uma separação dos componentes individuais da preparação a principio uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm tem que ser aplicada ao material de cromatografia.Em uma modalidade o método é um método de cromatografia de coluna.
Em uma modalidade antes da aplicação de uma solução compreendendo a preparação de eritropoietina PEGuilada uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é aplicada para até 8 volumes de coluna ao material de cromatografia. Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução com um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5. Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução tamponada de fosfato com um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5.
Após a aplicação da solução compreendendo a preparação de eritropoietina PEGuilada uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é aplicada à coluna e por meio da qual poli (etileno glicol) livre e proteinas de fusão (isto é conjugados de proteina) compreendendo dois ou mais residues de poli (etileno glicol) são recuperados do material de cromatografia. Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é aplicada para até 8 volumes de coluna ao material de cromatografia.
Após a eritropoietina poli-PEGuilada ter sido recuperada do material de cromatografia a eluição continua com um gradiente de condutividade linear é iniciada. A condutividade da fase móvel passando pelo material de cromatografia é continuamente e linearmente aumentada para pelo menos uma condutividade de cerca de 62,5 mS/cm. No gradiente linear a principio a eritropoietina mono- PEGuilada é recuperada da coluna e por conseguinte a eritropoietina substancialmente não PEGuilada homogênea é recuperada. O aumento na condutividade é em uma modalidade aplicando-se uma solução com uma concentração de cloreto de sódio crescente. Em uma modalidade a solução aplicada para aumentar a condutividade tem um valor de pH de pH 2,5 a pH 3,5. Em uma modalidade o aumento da condutividade de um valor de cerca de 21 mS/cm para o valor final de pelo menos 62,5 mS/cm está dentro de um volume aplicado da fase móvel de 10 volumes de coluna.
Em uma modalidade a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução tamponada de fosfato de sódio ou potássio de cerca de 100 mM com um valor de pH de cerca de pH 3,0 com (isto é, contendo) cerca de 120 mM de cloreto de sódio.
Em uma modalidade o gradiente linear é um gradiente de concentração de cloreto de sódio de cerca de 120 mM a cerca de 1000 mM de cloreto de sódio em uma solução tamponada de fosfato de sódio ou potássio de cerca de 100 mM com um valor de pH de cerca de pH 3,0.
Em uma modalidade a solução compreendendo uma mistura de eritropoietina livre e poli (etileno glicol) livre bem como proteinas de fusão (isto é, conjugados de proteina) de eritropoietina e poli (etileno glicol) com um ou mais residues de poli (etileno glicol) por molécula de eritropoietina é aplicada ao material de cromatografia que de 1 mg/ml até 4 mg/ml de proteina é aplicado a 1 ml do material de cromatografia.
O termo "material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR" significa um material de cromatografia de permuta de cátion também significa MacroCap SP (também disponível por GE Healthcare). O material de cromatografia SP Sephacryl S 500 HR é em uma modalidade um copolimero reticulado de dextrana de alila e bisacrilamida de N,N- metileno com ácido sulfônico como grupo funcional cromatográfico e é, desse modo, um forte material de cromatografia de permuta de cátion.
Os seguintes exemplos, listagem de sequência efiguras são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, o escopo verdadeiro da qual é apresentado nas reivindicações anexas. É entendido que as modificações possam ser feitas nos procedimentos apresentados sem afastar-se do espirito da invenção.Descrição da Listagem de SequênciaSEQ ID NO: 01 Sequência de aminoácido deeritropoietina humana.SEQ ID NO: 02 Sequência de aminoácido deeritropoietina
Descrição das humana. Figuras
Figura 1 Cromatograma de eluição de uma purificação de uma preparação de eritropoietinaPEGuilada com um método como reportado aqui.Figura 2 Cromatogramas analíticos SEC das frações de pico 1, 2 e 3 da Figura 1.
Figura 3 Cromatogramas analíticos SEC das frações de pico 1, 2 e 3 de uma separação sendo que a coluna de cromatografia foi condicionada com uma solução com condutividade mais elevada.
Figura 4 Cromatograma de eluição de uma purificação de uma preparação de eritropoietinaPEGuilada com um método de eluição em etapa.
Figura 5 Cromatogramas analíticos SEC das frações de pico 1, 2 e 3 (pico de regeneração da Figura 4.Figura 6 Cromatograma de eluição de uma purificação
Figura 7 de uma preparação de eritropoietinaPEGuiladacom um método como reportado aqui com o anterior ajustando a condutividade da solução de amostra para 20 mS/cm, Cromatogramas analíticos SEC das frações de
Exemplos
Materiais pico 1, 2 e 3 da Figura 6.& Métodos Cromatografia de Exclusão de Tamanho Analítica: resina: TSK 3000 (Tosohaas) coluna: 300 x 7,8 mmtaxa de fluxo: 0,5 ml/min15 solução de eluição: fosfato de potássio a 200 mM contendo cloreto de potássio a 250 mM, ajustado para pH 7,0comprimento de onda:220 nmCromatografia de Eritropoietina PEGuilada:20 resina: SP Sephacryl S 500 HRvolume do leito: 2,5 ml carga da amostra: mg/ml de resina-variável (veja osexemplos abaixo)taxa de fluxo: 0,5 ml/min25 soluções: A: fosfato de potássio a 100 mM,ajustado para pH 3,0 B: fosfato de potássio a 100 mM, cloreto de sódio a 1000 mM, ajustado para pH 3,030 solução de aplicação: 88% de A e 12% de BSolução de lavagem: 88% de A e 12% de B Volume da lavagem: 20 ml (8 volumes de coluna (CV)) Solução de eluição de gradiente linear: 100% de Bgradiente linear: em 25 ml (10 volumes de coluna)para 100% de B comprimento de onda: 254 nm, 280 nm
Exemplo 1
Cromatografia de uma preparação de eritropoietina PEGuilada com um material de cromatografia de SP-Sephacryl com condicionamento com uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm
A Cromatografia de Eritropoietina PEGuilada foi realizada como descrito na seção de Materiais e Métodos.
O cromatograma de eluição para este método é mostrado na Figura 1. Os cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos da fração pico 1 de eritropoietina oligo-PEGuilada e da fração pico 2 mono-PEGuilada e fração pico 3 não PEGuilada são mostrados na Figura 2 A-C.
Figure img0005
Exemplo 2
Cromatografia de uma preparação de eritropoietina PEGuilada com um material de cromatografia SP-Sephacryl com condicionamento com uma solução com uma condutividade de cerca de 29 mS/cm
A Cromatografia de Eritropoietina PEGuilada foi realizada como descrito na seção de Materiais e Métodos com os seguintes parâmetros diferentes: solução da aplicação: 80% de A e 20% de Bsolução de lavagem: 80% de A e 20% de Bvolume de lavagem: 20 ml (8 volumes de coluna (CV) )tampão de eluição de gradiente linear: 100 % Bgradiente linear: em 25 ml (10 volumes de coluna)para 50% de B
Os cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos da fração pico 1 de eritropoietina oligo- PEGuilada e a fração pico 2 mono-PEGuilada e a fração pico 3 não PEGuilada são mostrados na Figura 3 A-C.
Figure img0006
Exemplo 3
Cromatografia de uma preparação de eritropoietina PEGuilada com um material de cromatografia SP-Sephacryl com condicionamento com uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm e etapa de eluição com uma solução com uma condutividade de 37 mS/cm
A Cromatografia de Eritropoietina PEGuilada foi realizada como descrito na seção de Materiais e Métodos.
O cromatograma de eluição para este método é mostrado na Figura 4 . Os cromatogramas de exclusão de tamanho analíticos da fração pico 1 de eritropoietina oligo-PEGuilada e a fração pico 2 mono-PEGuilada e a fração pico 3 não PEGuilada é mostrada na Figura 5 A-C. Tem que ser salientado que a eritropoietina não PEGuilada pode ser somente recuperada durante a regeneração da coluna e não com o método de eluição em etapa.
Figure img0007
Exemplo 4
Cromatografia de uma preparação de eritropoietina
PEGuilada com um material de cromatografia SP-Sephacryl com condicionamento com uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm e amostra ajustada para a condutividade de 20 mS/cm
A Cromatografia de Eritropoietina PEGuilada foirealizada como descrito na seção de Materiais e Métodos.
O cromatograma de eluição para este método é mostrado na Figura 6. Os cromatogramas de exclusão de tamanho analiticos da fração pico 1 de eritropoietina 15 oligo-PEGuilada e da fração pico 2 mono-PEGuilada e fração pico 3 não PEGuilada são mostrados na Figura 7 A-C.
Figure img0008

Claims (8)

1. Método para obter uma proteína que compreende eritropoietina e um único resíduo de polietilenoglicol, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) aplicar uma solução compreendendo uma mistura de eritropoietina e conjugados de eritropoietina e polietilenoglicol com um ou mais resíduos de polietilenoglicol por molécula de eritropoietina a uma coluna, compreendendo material para cromatografia SP Sephacryl S 500 HR, ao qual uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm foi aplicada,b) aplicar uma solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm à coluna e desse modo recuperar polietilenoglicol livre, e proteínas compreendendo dois ou mais resíduos de polietilenoglicol,c) aplicar uma solução com condutividade linearmente crescente até um valor final de cerca de 62,5 mS/cm à coluna e desse modo recuperar separadamente a proteína, que compreende eritropoietina e um único resíduo de polietilenoglicol, e eritropoietina, em que a proteína compreendendo eritropoietina e um único resíduo de polietilenoglicol é recuperada primeiro;em que a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução com um valor de pH de 2,5 a 3,5.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução com uma condutividade de cerca de 21 mS/cm é uma solução tamponada de fosfato com um valor de pH de 2,5 a 3,5.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo uma mistura de eritropoietina e conjugados de eritropoietina e polietilenoglicol com um ou mais resíduos de polietilenoglicol por molécula de eritropoietina não é ajustada para uma condutividade de cerca de 21 mS/cm.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução com condutividade linearmente crescente é uma solução com concentração de cloreto de sódio linearmente crescente.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução com condutividade linearmente crescente tem um valor de pH de 2,3 a 3,5.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a eritropoietina é eritropoietina humana.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a eritropoietina humana tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01 ou SEQ ID NO: 02.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o único resíduo de polietilenoglicol tem um peso molecular de 20 kDa a 40 kDa.
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