KR101477824B1 - 암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

인간 DLL4의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하고 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 성장에 영향을 미치는 단리된 항체가 기술된다. 치료적 유효량의 항-DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 기술된다.
암, DLL4, 항-DLL4 항체, 노치(Notch) 수용체, 암 줄기 세포, 암 줄기 세포 마커

Description

암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING CANCER}
본 발명은 종양학 분야에 관한 것이고, 암의 진단 및 치료를 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 고형 종양의 진단 및 치료를 위한 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 제공한다.
암은 선진국에서 주요 사망 원인 중의 하나이고, 미국에서만 1년에 100만명을 초과하는 사람들이 암으로 진단되고, 500,000명이 사망한다. 전체적으로, 3명 중 1명을 초과하는 사람에게서 일생 동안 어떤 형태든 암이 발달될 것으로 추정된다. 암에는 200가지를 초과하는 상이한 유형이 있고, 이중 4가지 (유방암, 폐암, 결장직장암 및 전립선암)가 모든 신규 사례의 절반 이상을 차지한다 ([Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26]).
유방암은 여성에서 가장 통상적인 암이고, 약 12％의 여성이 일생 동안 이러한 질환이 발달될 위험에 있는 것으로 추정된다. 조기 검출 및 개선된 치료법으로 인해 사망률이 감소되었지만, 유방암은 여전히 중년 여성에서의 주요 사망 원인이고, 전이성 유방암은 아직도 불치병이다. 제시 시에는, 전이성 유방암에 걸린 대부분의 환자에서 1개 또는 2개의 기관계만이 감염되어 있지만, 질환이 진행됨에 따 라, 일반적으로 여러 부위들이 병발되게 된다. 전이성 병발의 가장 통상적인 부위는 흉벽의 피부 및 연질 조직, 뿐만 아니라 겨드랑위 및 빗장위 영역에서의 국소영역성 재발이다. 원격 전이에 대한 가장 통상적인 부위는 뼈 (원격 전이의 30-40％)이고, 폐 및 간이 그 뒤를 잇는다. 그리고, 새롭게 유방암으로 진단된 여성의 약 1-5％에만 진단 시점에 원격 전이가 있지만, 국소 질환이 있는 환자의 약 50％가 결국 5년 이내에 전이와 함께 재발되었다. 현재, 원격 전이의 소견으로부터의 생존 중앙값은 약 3년이다.
현재의 유방암 진단 및 병기결정 방법에는 종양 크기, 림프절 내의 종양 존재, 및 원격 전이의 존재에 의존하는 종양-결절-전이 (TNM) 시스템이 포함된다 ([American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171-180]; [Harris, J R: "Staging of breast carcinoma" in Harris, J. R., Hellman, S.; Henderson, I. C, Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991]). 이러한 파라메터들을 사용하여, 진단을 제공하고 적합한 치료법을 선택한다. 종양의 형태학적 외양을 또한 평가할 수 있지만, 조직병리학적 외양이 유사한 종양들이 현저한 임상 변이성을 나낼 수 있기 때문에, 이러한 접근법에는 심각한 한계가 있다. 마지막으로, 세포 표면 마커에 대한 분석법을 사용하여, 특정 종양 유형을 하위 클래스로 분류할 수 있다. 예를 들어, 유방암의 진단 및 치료에서 고려되는 한가지 인자는 에스트로겐 수용체 (ER)의 존재인데, 이는 전형적으로 ER-양성 유방암이 ER-음성 종양보다 호르몬 치료법 예컨대 타목시펜 또는 아로마타제 억제제에 더욱 쉽게 응답하기 때문이다. 그러나, 유용하긴 하지만, 이러한 분석법들은 유방 종양의 임상 거동을 부분적으로만 예보하고, 현재의 진단 도구로 검출하지 못하고 현재의 치료법으로 치료하지 못하는 많은 표현형 다양성이 유방암에 존재한다.
전립선암은 선진국에서 남성에서 가장 통상적인 암이고, 미국에서의 모든 새로운 암 사례의 약 33％로 추정되며, 두번째로 빈번한 사망 원인이다 ([Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53:5-26]). 전립선 특이적 항원 (PSA) 혈액 테스트의 도입 이래로, 전립선 암의 조기 검출로 생존률이 극적으로 개선되었다; 진단 시점에 국소적이고 지역적인 병기의 전립선암이 있는 환자의 5년 생존률은 100％에 접근하고 있다. 그러나, 50％를 초과하는 환자에서 국소적으로 진행된 질환 또는 전이성 질환이 결국 발달될 것이다 ([Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16]).
현재, 근치적 전립선적출술 및 방사선 요법이 대다수의 국소화된 전립선 종양에 치유적 치료를 제공한다. 그러나, 진행된 사례들에 대해 치료 선택권이 매우 제한된다. 전이성 질환에 대해, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작동제를 단독으로 또는 항-안드로겐과 조합하여 사용하여 안드로겐을 제거하는 것이 표준 치료이다. 그러나, 최대 안드로겐 차단에도 불구하고, 질환이 거의 항상 진행되고, 대다수에서 안드로겐-비의존적 질환이 발달된다. 현재, 호르몬 불응성 전립선 암에 대한 균일하게 허용되는 치료가 없고, 화학요법이 통상적으로 사용된다 ([Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16]; [Trojan et al., 2005, Anticancer Res. 25:551-61]).
결장직장암은 세계적으로 세번째로 통상적인 암이고, 네번째로 빈번한 암 사망 원인이다 ([Weitz et al., 2005, Lancet 365:153-65]). 모든 결장직장암의 약 5-10％는 유전성이고, 주요 형태 중 하나는 가족성 선종성 폴립증 (FAP)이며, 이는 감염된 개체의 약 80％가 선종성 결장 폴립증 (APC) 유전자 내에 배선 돌연변이를 함유하는 보통염색체 우성 질환이다. 결장직암 암종은 국소적으로 주변 성장에 의해, 그리고 다른 곳으로 림프성, 혈행성, 경복막성 및 신경주위성 확산에 의해 침범한다. 가장 통상적인 림프절외(extralymphatic) 병발 부위는 간이고, 폐는 가장 빈번하게 영향을 받는 복강외(extra-abdominal) 기관이다. 기타 혈행성 확산부위에는 뼈, 신장, 부신, 및 뇌가 포함된다.
결장직장암에 대한 현재의 병기결정 시스템은 장벽을 통과한 종양 투과 정도 및 결절 병발의 존재 또는 부재를 기초로 한다. 이러한 병기결정 시스템은 3가지 주요 듀크(Duke) 분류로 정의된다: 듀크 A 질환은 결장 또는 직장의 점막하층으로 한정되고, 듀크 B 질환에는 고유근층을 통과하여 침범하고 결장 또는 직장의 벽을 투과할 수 있는 종양이 있으며, 듀크 C 질환은 지역적인 림프절 전이가 있는 모든 정도의 장벽 침범을 포함한다. 듀크 A 환자에서의 치유률이 95％로 초기 결장직장암에 대해 수술에 의한 절제가 고도로 효과적이지만, 듀크 B 환자에서는 치유률이 75％로 감소하고, 듀크 C 환자에서의 양성 림프절의 존재는 5년 이내의 재발 가능성 60％를 예보한다. 듀크 C 환자를 수술후 화학요법 과정으로 치료하는 것은 재발률을 40％-50％로 감소시키고, 현재 이러한 환자들에 대한 진료 표준이다.
폐암은 세계적으로 가장 통상적인 암이고, 미국에서 세번째로 통상적으로 진단되는 암이며, 단연 가장 빈번한 암 사망 원인이다 ([Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96]; [Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 53:5-26]). 담배 흡연이 모든 폐암의 87％ 추정치의 원인인 것으로 여겨져서, 폐암이 가장 치명적인 예방가능한 질환이 되도록 한다. 폐암은 모든 폐암의 90％ 이상을 차지하는 2가지 주요 유형으로 분류된다: 소세포 폐암 (SCLC) 및 비-소세포 폐암 (NSCLC). SCLC는 사례들의 15-20％를 차지하고, 커다란 중심성 기도 내의 기원 및 세포질이 거의 없는 소세포들의 시트의 조직학적 조성을 특징으로 한다. SCLC는 NSCLC보다 더욱 공격적이어서, 급속하게 성장하고 초기에 전이된다. NSCLC는 모든 사례들의 80-85％를 차지하고, 조직학을 기초로 3가지 주요 아유형으로 추가로 분류된다: 선암종, 편평세포 암종 (표피양 암종), 및 대세포 미분화 암종.
전형적으로 폐암은 이의 진행 과정에서 늦게 제시되고, 따라서 생존 중앙값이 진단 후 오직 6-12개월이고, 전체 5년 생존율은 오직 5-10％이다. 수술이 최상의 치유 기회를 제공하지만, 작은 비율의 폐암 환자만이 적격이어서, 대다수는 화학요법 및 방사선요법에 의존한다. 이러한 치료법들의 시기조정 및 용량 강도를 조작하려는 시도에도 불구하고, 지난 15년 동안 생존율이 거의 증가되지 않았다 ([Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:1166-96]).
이러한 4가지 암, 뿐만 아니라 다수의 기타 암은 이질성 세포 집단으로 구성된 고형 종양으로 제시된다. 예를 들어, 유방암은 중간엽 (기질) 세포, 염증성 세 포 및 내피 세포를 포함하는, 정상 세포 및 암 세포의 혼합물이다. 암의 여러 가지 모델이 이러한 이질성의 존재에 대한 상이한 설명을 제공한다. 암의 전통적인 모델인 한가지 모델은 표현형적으로 별개인 암세포 집단들 모두에 증식하여 새로운 종양을 발생시키는 능력이 있다고 생각한다. 전통적인 모델에서, 종양 세포 이질성은 환경적인 요인, 뿐만 아니라 다양한 종양발생성 세포 집단을 초래하는 암세포 내에서의 진행 중인 돌연변이로부터 초래된다. 이러한 모델은 종양 세포의 모든 집단에 어느 정도의 종양발생성 잠재력이 있다는 견해를 기초로 한다. ([Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12:122-129]; [Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597-1604]; [Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391]; [Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 173-183]; [Beerman H et al., 1991, Cytometry 12:147-54]; [Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53]; [Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884]).
관찰된 고형 종양 세포 이질성에 대한 별법적인 모델은 종양 발달에 대한 줄기 세포의 영향으로부터 유래된다. 이러한 모델에 따르면, 암은 정상적인 조직 발달 및 유지를 제어하는 메커니즘의 조절곤란으로부터 발생한다. ([Beachy et al., 2004, Nature 432:324]). 정상적인 동물 발달 동안, 대부분의 조직 또는 모든 조직의 세포는 줄기 세포로 칭해지는 정상적인 전구체로부터 유래된다 ([Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98]; [Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21]; [Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71]). 줄기 세포는 (1) 광범위한 증식능이 있고, 2) 증식 및/또는 발달 잠재력이 감소된 하나 이상의 종류의 자손을 생성시키는 비대칭 세포 분할을 할 수 있으며, (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위한 대칭 세포 분할을 할 수 있는 세포이다. 줄기 세포의 분화에 의한 성체 세포 재생이 가장 잘 연구된 예는 발달적으로 미성숙한 전구체 (조혈 줄기 및 기원 세포)가 분자 신호에 응답하여 다양한 혈액 및 림프계 세포 유형을 형성하는 조혈계이다. 소화관, 유방 관상 시스템 및 피부의 세포를 포함하는 기타 세포가 각각의 조직 내의 줄기 세포 소집단으로부터 지속적으로 보충되고, 최근의 연구는 뇌를 포함하는 대부분의 기타 성체 조직에 또한 줄기 세포가 서식한다는 것을 시사한다. 이어서, "고형 종양 줄기 세포" (또는 고형 종양으로부터의 "암 줄기 세포")로부터 유래된 종양에 대칭 및 비대칭 라운드 양쪽 모두의 세포 분할을 통해 무질서한 발달이 진행된다. 이러한 줄기 세포 모델에서, 고형 종양은 광범위하게 증식하고, 추가적인 고형 종양 줄기 세포 (자가-재생) 및 종양발생성 잠재력이 결여된, 고형 종양의 대다수의 종양 세포 양쪽 모두를 효율적으로 발생시킨다는 점에서 정상적인 "줄기 세포"와 공통적인 성질이 있는 세포들의 독특하고 한정된 (가능하게는 심지어 드문) 부분집합을 함유한다. 실제로, 종양의 성장 및 유지의 기초가 되고 이의 존재가 현재의 치료적 접근법의 실패에 기여하는 암 줄기 세포의 형성을 장수 줄기 세포 집단에서의 돌연변이가 개시시킬 수 있다.
암의 줄기 세포 성질은 혈액암인 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 최초로 드러났다 ([Lapidot et al., 1994, Nature 17:645-8]). 더욱 최근에는, 악성 인간 유방 및 결장 종양에 면역결핍 마우스에서 종양을 형성시키는 능력이 강화된 암 줄기 세포의 작고 독특한 집단이 유사하게 서식하는 것으로 나타났다. 유방 종양 내의 ESA+, CD44+, CD24-/로우(low), Lin- 세포 집단이 분획화되지 않은 종양 세포와 비교하여 종양발생성 세포에 대해 50배 강화된 것으로 발견되었다 ([Al-Hajj et al., 2003, Proc. Nat'l Acad. Sci. 100:3983-8]). 유사하게, 결장직장 종양 내의 ESA+, CD44+ 하위집단이 유일하게 종양발생성 세포를 포함하는 것으로 발견되었고, 이러한 프로파일에 CD166을 첨가하면 결장암 줄기 세포 (CoCSC)를 추가로 강화시킬 수 있었다 ([Dalerba et al. 2007 Proc Nat'l Acad Sci 104: 10158-63]). 종양발생성 암 세포를 예측적으로 단리하는 능력은 이러한 세포에서 종양발생성의 기초를 이루는 결정적인 생물학적 경로의 연구를 허용하였고, 따라서 암 환자에 대한 더욱 양호한 진단 분석법 및 치료제를 약속한다. 본 발명은 이러한 목적을 향한 것이다.
발명의 개요
인간 델타-유사 리간드 4 (DLL4) N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL 도메인 (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이때 항체가 종양 성장에 영향을 미치는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체 및 제약상 허용가능한 비히클을 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 치료적 유효량의 본 발명의 DLL4 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 추가로 제공된다.
본 발명의 추가적인 목표 및 장점이 부분적으로 하기의 상세한 설명에 기재될 것이고, 부분적으로 상세한 설명으로부터 명백할 것이거나, 또는 본 발명의 실행에 의해 이를 알 수 있다. 본 발명의 목표 및 장점은 첨부된 청구항에서 특히 지적된 요소들 및 조합에 의해 인지 및 달성될 것이다. 상기의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명 양쪽 모두 단지 대표적이고 설명적이며, 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 혼입되어 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명의 여러 실시양태들을 도해하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 작용을 한다. 명세서 및 청구항에서, 부정관사 및 정관사가 붙은 단수 형태는, 문맥적으로 명백히 다르게 지시되지 않는 한, 복수의 대상물을 포함한다.
도 1: 천연 세포-표면 DLL4 단백질에 대한 항-DLL4 21M18 항체의 특이적 결합. 전장 DLL4 및 GFP로 공동-형질감염된 HEK 293 세포를 항-DLL4 항체와 함께 인큐베이션하고, FACS에 의해 분류하였다. DLL4 항체 결합과 GFP 발현 간의 선형 관계에 의해 나타나는 바와 같이 항-DLL4 항체 21M14 및 21M18은 DLL4를 발현하는 세포에 대한 특이적 결합을 나타낸다.
도 2: DLL4 항체가 인간 DLL4와 노치(Notch) 수용체의 상호작용을 차단한다. A) DLL4를 발현하는 HEK 293 세포를 DLL4 또는 대조군 항체의 존재 하에 노치-Fc 또는 대조군 Fc 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 높은 형광 강도는 대조군 항체 (라인 2) 및 21M12 항-DLL4 항체 (라인 5)의 존재 하의 노치와 DLL4의 결합의 존재를 가리킨다. 낮은 형광 강도는 노치의 부재 하의 노치와 DLL4의 상호작용의 부재 (라인 1), 및 항-DLL4 항체 21M18 (라인 3) 및 21M14 (라인 4)의 존재 하의 노치와 DLL4의 상호작용의 파괴를 가리킨다. B) 노치 1을 발현하는 HEK 293 세포를 인간 또는 뮤린 DLL4-Fc와 함께 인큐베이션하였다. 형광 표지된 항-Fc에 의해 결합이 검출되었고, 이를 FACS에 의해 분석하였으며, 이때 높은 형광 강도는 DLL4와 노치1 발현 세포 간의 결합을 가리킨다. 21M18은 노치 수용체에 대한 인간 DLL4 (회색 사각형)의 결합을 차단하지만, 뮤린 DLL4 (흑색 원)의 결합은 차단하지 않는다.
도 3: 항-DLL4 항체의 에피토프 지도작성. A) 인간 DLL4의 세포외 도메인의 네스티드(nested) 결실이 있는 융합 단백질을 ELISA 분석법에서 21M14 및 21M18 항-DLL4 항체와 함께 인큐베이션하였다. 아미노산 1 내지 154를 함유하는 융합 단백질 (aa 1-96, 흑색점이 있는 백색 막대; aa 1-154, 백색점이 있는 흑색 막대)의 존재 하에 배경값을 초과하는 결합이 검출되지 않았다. 반면에, DSL 도메인이 포함되는, DLL4의 아미노산 1 내지 217을 함유하는 모든 융합 단백질 (aa 1-217, 가로선이 그어진 막대; aa 1-251, 대각선이 그어진 막대; aa 1-283, 선영(hatched) 막대; aa 1-323, 백색점이 있는 회색 막대)과 항-DLL4 항체 간의 결합이 검출되었다. B) 웨스턴 블롯이 인간 DLL4 (h-DLL4) C-말단 결실 단백질 및 뮤린-인간 DLL4 키메라 융합 단백질의 발현을 나타낸다 (항-hFc; 상부). DLL4 융합 단백질은 도메인 1 내지 6 중 하나 이상을 포함하고, 이때 C에 도해된 바와 같이 도메인 1 및 2는 N-말단 아미노산 1 내지 154이고; 도메인 3은 아미노산 155 내지 217로부터의 DSL 도메인이며; 도메인 4, 5, 및 6은 각각 EGF 도메인이다. 21M18 항체는 아미노산 1-217 (hDLL4dom1-3)의 존재 하에서만 h-DLL4 단백질을 인식한다. 인간 단백질에 대조적으로, 뮤린 DLL4 (m-DLL4) 아미노산 1-217 (dom1-3)을 포함하는 융합 단백질은 21M18에 의해 인식되지 않는다 (m-DLL4 dom1-3:h-DLL4dom4-6). 그러나, 뮤린 dom3 의 존재 하에 h-DLL4 아미노산 1-154 (dom1-2)를 포함하는 융합 단백질은 21M18에 의해 인식된다 (h-DLL4dom1-2:mDLL4dom3-6). C) B의 결합 데이터의 개략적인 요약이 제시된다. DLL4의 도메인 구조가 상부에 제시되고, DLL4 융합 단백질들이 좌측에 개략적으로 열거 및 제시되며, 인간 단백질은 밝은 회색으로 표시되고, 마우스 단백질은 진한 회색으로 표시된다. 각각의 DLL4 단편에 대한 21M18 결합은 "+" 대 "-"로 지시된다. D) 선택된 위치에서 인간 잔기에 대한 상응하는 뮤린 잔기의 치환을 함유하는 DLL4 단백질 단편들에 대한 21M18 결합의 ELISA 분석. 21M18은 아미노산 68, 69, 및 71 (발린, 발린, 및 프롤린의 교체) 또는 아미노산 142 및 144 (라이신 및 알라닌의 교체)에서의 치환이 있는 DLL4 단백질 단편에 대해 손상된 결합을 나타낸다. E) DSL 도메인 내의 선택된 위치에서 인간 잔기에 대한 상응하는 뮤린 잔기의 치환을 함유하는 DLL4 단백질 단편들에 대한 항체 21M18 및 21M21의 결합의 ELISA 분석. 항체 21M21은 아미노산 161 및 162 (트레오닌 및 세린의 교체)에서의 아미노산 치환을 함유하는 인간 DLL4 단백질 단편에 대해 손상된 결합을 나타낸다. 21M21은 신호전달 분석법에서 DLL4 기능을 손상시키지 않기 때문에 (도 6 참조), 이는 DSL 영역에 결합하는 모든 항체가 DLL4 기능에 영향을 미치지는 않는다는 것을 설명한다.
도 4: 중쇄 가변 영역의 서열 정렬. A) 어버이 뮤린 21M18 항체 서열 (m-21M18-Vh, 상부), 인간-발현 프레임워크 서열 (h-EST-프레임워크, 중간) 및 인간화 21M18 중쇄 가변 영역 서열 (21M18-H7, 하부)이 제시되고, 이때 보존된 아미노산 잔기는 흑색 음영으로 표시된다. 3개의 CDR이 표시되고, 어버이 뮤린 서열이 인간 화 21M18 항체에서 유지된다는 것을 나타낸다. CDR2 내의 카밧(Kabat) 위치 52a에서의 시스테인 잔기가 21M18 H7 및 21M18 H9에서 Dll4에 대한 특이적 결합을 상실하지 않으면서 각각 세린 및 발린 잔기로 변화되었다. 4A에 제시된 프레임워크 영역 내에서의 치환은 1-6으로 번호가 매겨지고, 이때 Vh 사슬에서의 상응하는 카밧 위치는 16, 20, 27, 28, 38, 48이다. B) 어버이 뮤린 21M18 항체 서열 (m-21M18-Vh, 상부), 인간 배선 Vh 서열 (h-배선-Vh, 중간), 및 인간화 21M18 중쇄 가변 영역 서열 (21M18-H2, 하부)이 제시되고, 이때 보존된 아미노산 잔기는 흑색 음영으로 표시된다. 3개의 CDR이 표시되고, 어버이 뮤린 서열이 인간화 21M18 항체에서 유지된다는 것을 나타낸다. CDR2 내의 카밧 위치 52a에서의 시스테인 잔기가 21M18 H7 및 21M18 H9에서 Dll4에 대한 특이적 결합을 상실하지 않으면서 각각 세린 및 발린 잔기로 변화되었다. 모든 중쇄 변이체의 가변 프레임워크 영역 내의 5개의 유지된 뮤린 잔기가 이들의 상응하는 카밧 위치 20, 28, 38, 48, 및 69에서 1-5로 번호가 매겨진다.
도 5: 경쇄 가변 영역의 서열 정렬. 어버이 뮤린 21M18 항체 서열 (m-21M18-Vk, 상부), 인간 배선 서열 (h-배선 Vk, 하부), 및 인간화 21M18 경쇄 가변 영역 서열 (21M18-L2, 중간)이 제시되고, 이때 보존된 아미노산 잔기는 흑색 음영으로 표시된다. 3개의 CDR이 표시되고, 어버이 뮤린 서열이 인간화 21M18 항체에서 유지된다는 것을 나타낸다. 가변 프레임워크 영역 내의 2개의 유지된 뮤린 잔기가 이들의 상응하는 카밧 위치 22 및 36에서 1-2로 번호가 매겨진다.
도 6: DLL4 항체가 노치 신호전달을 차단한다. Hes1-Luc 리포터 및 레닐 라(Renilla) 루시페라제 리포터 벡터로 공동-형질감염된 HeLa 세포를 항-DLL4 항체의 존재 또는 부재 하에 DLL4-Fc 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 감소된 루시페라제 수준은 21M14 및 21M18 항체에 의한 DLL4 노치 경로 활성화의 손실을 나타낸다.
도 7: DLL4 항체가 결장 종양에서 노치 표적 유전자의 발현을 조정한다. A) 항-DLL4 21M18 항체 또는 PBS (대조군)으로 처리된 C8 결장 종양을 단리하고, HES1 및 ATOH-1의 발현을 정량적 RT-PCR에 의해 결정하였다. 대조군으로 처리된 세포와 비교된 상대적인 유전자 발현 (y축)은 항-DLL4 항체로의 처리가 HES1의 발현은 감소시켰고 ATOH-1의 발현은 증가시켰음을 나타낸다. B) 마우스 계통-결핍 OMP-C11 결장 종양 세포 콜로니에서의 HES1 대 ATOH1의 상대적인 발현 비율 (y축)이 제시된다. DLL4를 과발현하는 3T3 세포 (3T3+DLL4)가 오버레이된 C11 콜로니는 3T3 세포가 오버레이된 결장 세포 (3T3) 또는 세포 오버레이에 노출되지 않은 결장 세포 (대조군)와 비교하여 HES1/AT0H1 발현 비율에서의 증가를 나타냈다. HES1/ATOH1 발현 비율에서의 이러한 증가는 10 ug/㎖ 21M18 항체 (21M18) 또는 5 uM-시크리타제 억제제 DBZ (5 uM GSI)와의 인큐베이션에 의해 제거되었다.
도 8: DLL4 항체가 종양 성장을 감소시킨다. NOD/SCID 마우스에 해리된 UM-C4 세포를 주사하고, 항-DLL4 21M18 항체 (n=5) 또는 PBS (n=10)로 처리하였다. 21M18 항체 (다이아몬드)로의 처리는 제23일에 시작된 종양 성장을 감소시켰고, PBS가 주사된 대조군 (흑색 사각형)과 비교하여 제48일에 54％까지의 감소가 관찰되었다.
도 9: DLL4 항체로의 처리가 생체 내에서 증식성 종양 세포의 수를 감소시킨다. 항-DLL4 21M18 항체 또는 대조군 Ab로 처리된 C8 결장 종양을 단리하였다. Ki67에 대한 항체로의 면역세포화학은 대조군과 비교하여 21M18로 처리된 종양에서 증식성 세포의 수의 감소를 나타냈다.
도 10: 플루오로우라실 (5-FU)과 조합된 DLL4 항체로의 처리가 종양 성장을 감소시킨다. NOD/SCID 마우스에게 해리된 UM-C4 세포를 주사하고, 5-FU의 존재 또는 부재 하에 항-DLL4 항체 또는 PBS로 처리하였다. A) 5-FU와 조합된 21M18 항체로의 처리 (원, 파선)는 5-FU (삼각형, 실선) 또는 21M18 항체 (다이아몬드, 점선) 단독으로의 처리에 비해 더 큰 정도로, 그리고 PBS가 주사된 대조군 (사각형, 실선)으로의 처리에 비해 더 큰 정도로, 종양 세포 주입 후 제46일에 종양 성장을 감소시켰다. ㎣ 단위의 종양 부피가 y축 상에 지시된다. B) 개별적인 동물들로부터의 제46일의 종양 측정치의 플롯. 각각의 점은 1마리의 동물을 나타낸다. 21M18 항체 또는 5-FU 각각으로의 처리는 대조군과 비교하여 종양 크기 (㎣)를 감소시켰다. 또한, 21M18 항체 및 5-FU로의 조합 처리는 부가적인 효과가 있었고, 종양 크기를 대조군의 1/5 크기로 감소시켰다.
도 11: 항-EGFR 항체와 조합된 DLL4 항체로의 처리가 종양 성장을 감소시킨다. NOD/SCDD 마우스에 해리된 UM-C4 세포를 주사하고, 항-EGFR 항체의 존재 또는 부재 하에 항-DLL4 항체 또는 PBS로 처리하였다. 개별적인 동물들로부터의 제46일의 종양 측정치의 플롯이 제시된다. 각각의 점은 1마리의 동물을 나타낸다. 21M18 항체 또는 항-EGFR 항체 각각으로의 처리는 대조군과 비교하여 종양 크기 (㎣)를 감소시켰다. 또한, 21M18 및 항-EGFR 항체로의 조합 처리는 부가적인 효과가 있었고, 종양 크기를 대조군의 1/5 크기로 감소시켰다.
도 12: 항-DLL4 mAb 21M18 및 이리노테칸이 결장 종양 성장을 억제하는데 상승적으로 작용한다. NOD/SCID 마우스에 해리된 C8 세포를 주사하고, 이리노테칸의 존재 또는 부재 하에 항-DLL4 항체 또는 대조군 항체로 처리하였다. A) 뮤린 21M18 항체 (원) 또는 이리노테칸 (삼각형) 단독으로의 처리가 대조군으로 처리된 동물 (흑색 사각형)과 비교하여 각각 종양 부피 (y축 ㎣)를 감소시켰다. 그러나, 21M18 및 이리노테칸으로의 조합 처리 (역삼삭형)는 상승성 효과가 있어, 세포 주사 후 55일까지 종양 성장을 완전하게 제거하였다. B) 이리노테칸 (irtcn)과 조합된 인간화 21M18 (h21M18)로의 처리 (원)는 대조군 항체 (흑색 사각형) 또는 대조군 항체 + 이리노테칸 (삼각형)과 비교하여 뮤린 21M18 (m21M18) (삼각형)와 효능이 유사하다.
도 13: 항-DLL4 21M18과 이리노테칸 처리의 조합이 결장 종양 재성장을 방지한다. NOD/SCID 마우스에 해리된 C8 세포를 주사하고, 이리노테칸 또는 항-DLL4 21M18 항체와 조합된 이리노테칸으로 처리하였다 (n = 10마리/군). A) 이리노테칸 단독으로의 처리가 결장 종양 성장을 느리게 하였지만, 2마리의 처리 동물을 제외한 모든 동물에서 제56일 (* 화살표)에 치료를 중단한 후 성장이 계속되었다. B) 반면에, 이리노테칸과 항-DLL4 21M18 항체의 조합물로의 처리는 10마리의 처리 동물 모두에서 치료 동안, 그리고 제56일에 처리를 중단한 후 5주까지 결장 종양 성장을 제거하였다. 각각의 선은 개별적인 동물에 대한 성장 곡선을 나타낸다.
도 14: 항-DLL4 21M18과 이리노테칸 처리의 조합이 확립된 결장 종양의 성장을 단일 치료법 처리보다 더욱 효과적으로 억제한다. NOD/SCID 마우스에 해리된 C8 세포를 주사하고, 이리노테칸의 존재 또는 부재 하에 항-DLL4 항체 또는 대조군 항체로 처리하였다. 21M18 항체 (다이아몬드) 또는 이리노테칸 (삼각형) 단독으로의 처리가 대조군으로 처리된 동물 (흑색 사각형)과 비교하여 각각 종양 부피 (y축 ㎣)를 감소시켰다. 그러나, 21M18 + 이리노테칸으로의 조합 처리 (역삼삭형)는 21M18 또는 이리노테칸 처리 단독보다 더욱 효과적으로 종양 성장을 억제하였다.
도 15: 항-DLL4 항체로 처리된 종양이 종양발생성 세포의 수 감소를 나타낸다. 대조군 항체, 이리노테칸 + 대조군 항체, DLL4 21M18 항체 단독, 또는 DLL4 21M18 항체와 이리노테칸의 조합물 (조합물)로 처리된 도 14에 제시된 실험으로부터의 종양 세포를 감소되는 투여량으로 면역손상 마우스 (n = 10마리/군)에 주사하였다. A) 제81일의 종양 포획률 결과. 종양 부피 (㎣)가 주사된 인간 종양 세포의 개수 (각각의 처리 군에 대해 900, 300, 100 및 50)에 대해 그래프로 표시된다. 각각의 종양 세포 용량에 대해 주사 동물 10마리에서의 검출가능한 종양이 있는 동물의 수가 각각의 세포 용량에 대한 종양 부피의 그래프 아래에 기록되고, 이때 대조군으로 처리된 종양 세포는 왼쪽에 (흑색 원), 항-DLL4 21M18 항체로 처리된 종양 세포는 왼쪽에서 두번째에 (백색 원), 이리노테칸으로 처리된 종양 세포는 오른쪽에서 두번째에 (흑색 삼각형), 조합물로 처리된 종양 세포는 오른쪽에 (백색 원) 나타난다. B) 제81일의 줄기 세포 빈도를 계산하였다. 항-DLL4로 처리된 종양 세포 (왼쪽에서 두번째), 이리노테칸 단독으로 처리된 종양 세포 (오른쪽에서 두번 째), 및 조합물로 처리된 종양 세포 (오른쪽)와 비교된 대조군으로 처리된 종양 세포 (왼쪽)로부터의 암 줄기 세포의 비 (y축)가 95％ 신뢰 구간으로 플롯팅된다. 항-DLL4로 처리된 군은 대조군 (*)에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있고, 조합물 군은 대조군 (*) 및 이리노테칸 단독 군 (**) 모두에 대해 유의하게 상이하다.
도 16: 항-DLL4 21M18과 이리노테칸의 조합 처리가 종양 재발을 지연시킨다. 면역손상 마우스에 해리된 C8 세포를 주사하고, 약 150 ㎣의 확립된 종양을 이리노테칸 (45 mg/kg, 1주일에 2번 투약)과 항-DLL4 21M18 항체 또는 대조군 항체의 조합물로 32일 동안 처리한 후, 이리노테칸 처리를 정지하였다. 대조군 항체 또는 21M18로의 처리는 계속하였다. 종양 부피 (y축)에 의한 종양의 재발이 대조군 (원)과 비교하여 21M18로 처리된 동물 (삼각형)에서 지연되었다.
도 17: 항-DLL4 21M18과 이리노테칸의 조합 처리가 종양 재발을 지연시킨다. 도 16에 제시된 실험으로부터의 개별적인 동물들이 제시된다. 이리노테칸 처리를 종결하고 나서 47일 후의 각각의 동물의 전체 종양 부피 (y축)가 제시된다.
도 18. 항-DLL4 21M18과 항-VEGF 조합물이 종양 성장을 감소시킨다. C17 종양 세포를 이식하고, 2일 후에 대조군 항체 (흑색 사각형, 실선), 21M18 (삼각형, 파선), 항-VEGF (다이아몬드, 실선), 또는 양쪽 항체의 조합물 (원, 점선)로 처리를 시작하였다. 각각의 항체를 10 mg/kg으로 1주일에 2회 투약하였고, n = 10마리/군이었다. 21M18 및 항-VEGF 모두 종양 성장을 감소시켰고, 조합물은 단일 항체보다 더욱 효과적이었다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기 물질들의 조합물을 인식하여 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미하도록 사용된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 리간드 결합, 수용체 이량체화, 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현, 및/또는 암 줄기 세포 마커 단백질의 하류 신호전달을 예를 들어 방해하는 길항제 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체에는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 리간드 결합, 수용체 이량체화, 및/또는 암 줄기 세포 마커 단백질에 의한 신호전달을 예를 들어 촉진하는 작동제 항체가 포함된다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질의 생물학적 활성을 방해하거나 촉진하지 않지만, 예를 들어, 면역계에 의한 항체 내재화 및/또는 인식에 의해, 종양 성장을 억제한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"에는 무손상 폴리클로날(polyclonal) 항체, 무손상 모노클로날(monoclonal) 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 생성된 이중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자 (단, 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타냄)가 포함된다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 칭해지는 중쇄 불변 도메인의 신원을 기초로 하는 면역글로불린의 5개의 주요 클래스인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위클래스 (이소타입) (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린은 상이하고 주지된 서브유닛 구조 및 3차원 형상을 갖는다. 항체는 네이키드(naked) 항체이거나, 또는 다른 분자 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일쇄 항체, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"Fv 항체"는 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 비-공유결합 이량체를 형성한 2-사슬로서, 또는 2개의 사슬이 유사한 이량체성 구조로 회합되도록 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 유연성 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결된 단일쇄 (scFv)로서, 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 지칭한다. 이러한 형상에서, 각각의 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)이 상호작용하여, Fv 이량체의 항원-결합 특이성을 규정한다. 별법적으로, 단일 가변 도메인 (또는 Fv의 절반)이, 비록 일반적으로 친화력이 더 낮긴 하지만, 항원을 인식하여 결합하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 수반되는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 이는 여러 항원 결정기들에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 양쪽 모두, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합체 발현, 및 트랜스제닉(transgenic) 동물에 의한 방식을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 방식에 의해 제조된 이같은 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 최소한도의 비-인간 서열을 함유하는 특정 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 이의 단편인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 항체 사슬 또는 사슬들의 가변 영역의 항원 결정 영역 (또는 초가변 영역) 내의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력이 있는 비-인간 종 (예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린을 지칭한다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 가변 사슬 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력이 있는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 교체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성 및/또는 능력을 정련하고 최적화하기 위해 가변 프레임워크 영역에서 및/또는 교체된 비-인간 잔기 내에서 추가적인 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 가변 도메인들 중 하나 이상, 전형적으로는 2개 또는 3개 또는 4개의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 이때 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성시키는데 사용된 방법의 예가 미국 특허 5,225,539에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의에는 무손상 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체가 포함된다.
"하이브리드 항체"는 상이한 항원 결정기 영역이 있는 항체들로부터의 중쇄 및 경쇄의 쌍들이 함께 어셈블리되어, 생성된 사량체가 2개의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원을 인식하여 이에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화성 및 능력이 있는 포유동물들 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하고, 불변 영역은 또다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체 내의 서열과 상동성이어서, 이러한 종에서의 면역 응답을 유도하는 것이 방지된다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정 항체가 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 인접 아미노산, 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비-인접 아미노산 양쪽 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 단백질 변성 시 전형적으로 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성 시 전형적으로 손실된다. 전형적으로, 에피토프는 독특한 구조적 형상의 적어도 3개, 더욱 일반적으로는 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
항체들 간의 경쟁은 테스트되는 면역글로불린이 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석법에 의해 결정된다. 수많은 유형의 경쟁 결합 분석법, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석법 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석법 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석법 ([Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA ([Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지 분석법, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석법 ([Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA ([Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA ([Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)]); 및 직접 표지 RIA ([Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)])이 공지되어 있다. 전형적으로, 이같은 분석법은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 이들 중 하나를 지니는 세포, 표지되지 않은 테스트 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린을 사용하는 것을 수반한다. 경쟁적 억제는 테스트 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로, 테스트 면역글로불린이 과량으로 존재한다. 경쟁 분석법에 의해 확인된 항체 (경쟁 항체)에는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 기준 항체에 결합되는 에피토프에 입체 장애가 일어나기에 충분히 가까운 이웃 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 50 또는 75％만큼 억제할 것이다.
항체가 "선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 관련되지 않은 단백질이 포함되는 별법적인 물질에 비해 더욱 빈번하게, 더욱 신속하게, 더 오랜 기간 동안, 더 큰 친화력으로, 또는 이의 일부의 조합으로 항체가 에피토프와 반응하거나 회합한다는 것을 의미한다. "선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는, 예를 들어, 항체가 단백질에 적어도 약 0.1 mM, 더욱 일반적으로는 적어도 약 1 μM의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 때로는, "선택적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체가 단백질에 때로는 적어도 약 0.1 μM 또는 이보다 양호한 KD로, 그리고 다른 때에는 적어도 약 0.01 μM 또는 이보다 양호한 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서의 상동성 단백질들 간의 서열 동일성으로 인해, 특이적 결합은 하나를 초과하는 종에서의 암 줄기 세포 마커 단백질을 인식하는 항체를 포함할 수 있다.
항체와 단백질 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 사용되는 경우 본원에서 사용된 용어 "비-특이적 결합" 및 "배경 결합"은 특정 구조의 존재에 의존적이지 않은 상호작용을 지칭한다 (즉, 항체가 에피토프와 같은 특정 구조보다는 일반적인 단백질에 결합한다).
용어 "단리된" 또는 "정제된"은 천연 상태에서 정상적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 순도 및 균질성은 분석 화학 기술 예컨대 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 전형적으로 결정된다. 제제 내에 존재하는 우세한 종인 본 발명의 단백질 (예를 들어 항체) 또는 핵산은 실질적으로 정제된 것이다. 특히, 단리된 핵산은 천연적으로 유전자에 플랭킹(flanking)되고 유전자에 의해 코딩되는 단백질 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리된다. 단리된 항체는 기타 비-면역글로불린 단백질 및 상이한 항원 결합 특이성이 있는 기타 면역글로불린 단백질로부터 분리된다. 이는 핵산 또는 단백질이 일부 실시양태에서 적어도 80％ 순수하고, 일부 실시양태에서 적어도 85％ 순수하고, 일부 실시양태에서 적어도 90％ 순수하고, 일부 실시양태에서 적어도 95％ 순수하고, 일부 실시양태에서 적어도 99％ 순수하다는 것을 또한 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포들의 집단이 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 생리학적 컨디션을 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성 암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
용어 "증식성 장애" 및 "증식성 질환"은 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애 예컨대 암을 지칭한다.
본원에서 사용된 "종양" 및 "신생물"은 전-암성 병변을 포함하여 양성 (비-암성) 또는 악성 (암성) 여부와 상관 없이 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 초래된 임의의 조직 덩어리를 지칭한다.
본원에서 사용된 "전이"는 암이 원래의 부위로부터 신체의 다른 영역으로 확산 또는 이동하면서 새로운 위치에서 유사한 암성 병변이 발달되는 프로세스를 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃 세포와의 부착성 접촉을 잃고 혈류 또는 림프를 통해 1차 질환 부위로부터 이동하여 이웃 신체 구조물을 침범하는 세포이다.
용어 "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포", 또는 "고형 종양 줄기 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, (1) 광범위한 증식 능력이 있고, 2) 비대칭 세포 분할을 하여, 증식성 또는 발달 잠재력이 감소된 하나 이상의 종류의 분화된 후손을 생성할 수 있으며, (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위해 대칭 세포 분할을 할 수 있는 고형 종양으로부터의 세포들의 집단을 지칭한다. "암 줄기 세포", "종양 줄기 세포" 또는 "고형 종양 줄기 세포"의 이러한 성질은 면역손상 마우스 내로의 연속적인 이식 시, 종양을 형성하는데 실패하는 대다수의 종양 세포와 비교하여, 촉지성 종양을 형성하는 능력을 암 줄기 세포에 부여한다. 암 줄기 세포에 무질서한 방식으로 자가-재생 대 분할이 진행되어, 돌연변이가 발생하면서 경시적으로 변할 수 있는 비정상적인 세포 유형의 종양이 형성된다. 고형 종양 줄기 세포는 미국 특허 번호 6,004,528에서 제공된 "암 줄기 세포주"와 상이하다. 상기 특허에서, "암 줄기 세포주"는 자체적으로는 돌연변이가 거의 없지만 세포의 환경에서 발생하는 종양발생성 변화의 결과로 비대칭보다는 대칭적 세포 분할이 진행되는, 느리게 성장하는 기원 세포 유형으로 정의된다. 따라서 이러한 "암 줄기 세포주" 가설은 고도로 돌연변이되고 급속하게 증식하는 종양 세포는 비정상적인 환경의 결과로 주로 발생하고, 이러한 환경은 비교적 정상인 줄기 세포들이 축적된 후, 여기에 이들이 종양 세포가 되도록 야기하는 돌연변이가 진행되도록 하는 것으로 제안한다. 미국 특허 번호 6,004,528은 이같은 모델이 암의 진단을 강화하는데 사용될 수 있음을 제안한다. 고형 종양 줄기 세포 모델은 "암 줄기 세포주" 모델과 기본적으로 상이하고, 그 결과 "암 줄기 세포주" 모델이 제공하지 않는 유용성을 나타낸다. 첫번째로, 고형 종양 줄기 세포는 "돌연변이에 의해 회피"되지 않는다. 미국 특허 번호 6,004,528에 기술된 "돌연변이에 의해 회피되는 암 줄기 세포주"는 전-암성 병변으로 간주될 수 있는 반면, 고형 종양 줄기 세포는 전-암성 단계에서 시작하여 후기 단계의 암까지 종양발생을 담당하는 돌연변이를 자체적으로 함유할 수 있는 암 세포이다. 즉, 고형 종양 줄기 세포 ("암 줄기 세포")는 미국 특허 번호 6,004,528에서의 "암 줄기 세포주"로부터 구별되는 고도로 돌연변이된 세포에 포함될 것이다. 두번째로, 암에 이르는 유전적 돌연변이는 환경적일 뿐만 아니라 고형 종양 줄기 세포 내에서 대부분 내인성일 수 있다. 고형 종양 줄기 세포 모델에서는 단리된 고형 종양 줄기 세포가 이식 시 추가적인 종양을 발생시킬 수 있을 것으로 예상되지만 (따라서, 전이가 설명됨), "암 줄기 세포주" 모델에서는 비정상적인 환경이 종양발생성이었기 때문에 이식된 "암 줄기 세포주" 세포는 새로운 종양을 발생시킬 수 없을 것으로 예상된다. 실제로, 해리되고 표현형적으로 단리된 인간 고형 종양 줄기 세포를 마우스에 (정상적인 종양 환경과 매우 상이한 환경 내로) 전달하고, 여기서 세포가 여전히 새로운 종양을 형성하는 능력에 의해 본 발명이 "암 줄기 세포주" 모델과 구별된다. 세번째로, 고형 종양 줄기 세포는 대칭적 세포 분할이 의무적인 성질이 아니도록 대칭적 및 비대칭적 양쪽 모두의 방식으로 분할할 것이다. 네번째로, 고형 종양 줄기 세포는 느린 증식 속도가 한정적인 특징이 아니도록 다수의 변수에 따라 신속하게 또는 천천히 분할할 수 있다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가물은 종양 세포 집단의 대부분을 이루는 비-종양발생성 세포 및 종양발생성 줄기 세포 (암 줄기 세포) 양쪽 모두를 포함하는 종양 또는 전-암성 병변으로부터 유래된 세포들의 전체 집단을 지칭한다.
본원에서 사용된 "종양발생성"은 자가-재생 (추가적인 종양발생성 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 모든 다른 종양 세포를 생성시키는 증식 (분화되고, 따라서 비-종양발생성인 종양 세포를 발생시킴)의 성질을 포함하는 고형 종양 줄기 세포의 기능적인 양상을 지칭하고, 이는 고형 종양 줄기 세포가 종양을 형성하도록 한다.
본원에서 사용된 용어 "줄기 세포 암 마커(들)", "암 줄기 세포 마커(들)", "종양 줄기 세포 마커(들)", 또는 "고형 종양 줄기 세포 마커(들)"은 발현 수준이 단독으로 또는 다른 유전자와 조합되어 비-종양발생성 세포와 비교하여 종양발생성 암 세포의 존재와 상관되는, 유전자 또는 유전자들 또는 이러한 유전자 또는 유전자들에 의해 발현되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭한다. 상관관계는 유전자의 증가된 발현 또는 감소된 발현과 관련될 수 있다 (예를 들어, mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 펩티드의 증가된 수준 또는 감소된 수준).
본원에서 사용된 용어 "생검" 또는 "생검 조직"은 샘플이 암성 조직을 함유하는지를 결정하기 위한 목적으로 대상으로부터 제거된 조직 또는 체액 샘플을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상이 암에 걸린 것으로 추측되기 때문에 생검 조직 또는 체액을 수득한 후, 생검 조직 또는 체액을 암의 존재 또는 부재에 대해 시험한다.
본원에서 사용된 용어 "대상"은 특정 치료의 수용자가 될 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭하고, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 용어 "대상" 및 "환자"는 인간 대상과 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"제약상 허용가능한"은 인간이 포함되는 동물에서의 사용에 대해, 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 허가되었거나 또는 허가가능하거나, 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거되었음을 지칭한다.
"제약상 허용가능한 염"은 제약상 허용가능하고 어버이 화합물의 원하는 약리학적 활성을 보유하는 화합물의 염을 지칭한다.
"제약상 허용가능한 부형제, 담체 또는 보조제"는 하나 이상의 본 발명의 항체와 함께 대상에게 투여될 수 있고, 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료량의 화합물을 전달하는데 충분한 용량으로 투여될 때 비-독성인 부형제, 담체 또는 보조제를 지칭한다.
"제약상 허용가능한 비히클"은 하나 이상의 본 발명의 항체가 이와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
"전구약물"은 치료적으로 효과적인 화합물이 생산되기 위해 신체 내에서의 전환을 필요로 하는 치료적으로 효과적인 화합물의 유도체를 지칭한다. 전구약물은 치료적으로 효과적인 어버이 화합물로 전환될 때까지 약리학적으로 불활성일 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소형 유기 분자 또는 기타 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나, 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 연질 조직 및 뼈 내로의 암의 확산이 예를 들어 포함되는 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제 또는 정지시킬 수 있거나, 종양 전이를 억제 및 정지시킬 수 있거나, 종양 성장을 억제 및 정지시킬 수 있거나, 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나, 이환율 및 사망률을 완화시킬 수 있거나, 삶의 질을 개선시킬 수 있거나, 또는 이같은 효과들의 조합이 가능하다. 기존의 암 세포의 성장을 방지할 수 있고/있거나 이를 사망시킬 수 있다는 점에서, 약물은 세포정지성(cytostatic) 및/또는 세포독성으로 칭해질 수 있다.
본원에서 사용된 "진단 제공" 또는 "진단성 정보"는 환자에게 질환 또는 컨디션이 있는지 여부를 결정하는데 및/또는 표현형 카테고리 또는 질환 또는 컨디션의 예후 또는 이의 치료 (일반적인 치료 또는 임의의 특정한 치료)에 대한 가능한 응답과 관련하여 유의성이 있는 임의의 카테고리로 질환 또는 컨디션을 분류하는데 유용한, 암 줄기 세포의 존재가 예를 들어 포함되는 임의의 정보를 지칭한다. 유사하게, 진단은 대상이 질환 (예컨대 종양)에 걸릴 것 같은지 여부, 대상의 종양이 암 줄기 세포를 포함하는지 여부, 종양의 성질 또는 분류, 예를 들어 고위험 종양 또는 저위험 종양에 관련된 정보, 예후에 관련된 정보 및/또는 적합한 치료를 선별하는데 유용한 정보가 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의 유형의 진단 정보를 제공하는 것을 지칭한다. 치료의 선별은 특정 화학요법제 또는 기타 치료 양식 예컨대 수술 또는 방사선의 선택 또는 치료법을 보류할지 또는 제공할지 여부에 관한 선택을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "예후 제공", "예후성 정보", 또는 "예측성 정보"는 대상의 미래의 건강 (예를 들어, 예상 이환율 또는 사망률, 암에 걸릴 가능성, 및 전이 위험)에 대한 암의 존재 (예를 들어, 본 발명의 진단 방법에 의해 결정됨)의 영향에 관한, 대상의 종양 내의 암 줄기 세포의 존재가 예를 들어 포함되는 정보를 제공하는 것을 지칭한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기"와 같은 용어는 1) 진단된 병리학적 컨디션 또는 장애를 치유하고/하거나, 느리게 하고/하거나, 이의 증상을 줄이고/줄이거나 이의 진행을 정지시키는 치료용 수단 및 2) 표적화된 병리학적 컨디션 또는 장애를 방지하고/하거나 이의 발달을 느리게 하는 예방용 또는 방지용 수단 양쪽 모두를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애가 있는 이들, 장애에 걸릴 경향이 있는 이들, 및 장애를 방지하려는 이들이 포함된다. 암세포의 수에서의 감소 또는 암 세포의 완전한 부재; 종양 크기에서의 감소; 말초 장기 내로의 암 세포 침윤, 예를 들어, 연질 조직 또는 뼈 내로의 암의 확산의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질에서의 개선; 또는 효과들의 일부 조합 중 하나 이상을 환자가 나타낸다면 대상은 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된 것이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 다수의 뉴클레오티드 단위 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 관련된 구조적 변이체)로 구성된 중합체를 지칭하고, DNA 또는 RNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 임의의 것을 포함하고, 여기에는 4 아세틸사이토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐사이토신, 슈도이소사이토신, 5 (카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5 브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 2 티오우라실, 5 카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6 이소펜테닐아데닌, 1 메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1 메틸구아닌, 1 메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2 메틸아데닌, 2 메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5 메틸사이토신, N6 메틸아데닌, 7 메틸구아닌, 5 메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸 2 티오우라실, 베타 D 만노실큐에오신, 5' 메톡시카르보닐메틸우라실, 5 메톡시우라실, 2 메틸티오 N6 이소펜테닐아데닌, 우라실 5 옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실 5 옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2 티오사이토신, 5-메틸-2 티오우라실, 2-티오우라실, 4 티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실 5 옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실 5 옥시아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오사이토신, 및 2,6 디아미노퓨린이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"엄격한 혼성화 조건"이라는 구절은 프로브가 이의 표적 하위서열 (전형적으로 핵산들의 복합적인 혼합물 내)에 혼성화하지만 다른 서열에는 혼성화하지 않을 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 상황에 따라 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침이 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서의 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5-10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 평형 상태에서 표적에 상보적인 프로브의 50％가 표적 서열에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에서의 온도)이다 (서열이 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 평형 상태에서 프로브의 50％가 차지된다). 불안정화제 예컨대 포름아미드의 첨가로 엄격한 조건이 또한 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 대해, 양성 신호는 배경값의 적어도 2배이고, 바람직하게는 배경 혼성화의 10배이다. 대표적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50％ 포름아미드, 5×SSC, 및 1％ SDS, 42℃에서의 인큐베이션, 또는 5×SSC, 1％ SDS, 65℃에서의 인큐베이션 + 65℃에서의 0.2×SSC 및 0.1％ SDS 세정.
용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA (예를 들어, rRNA, tRNA)의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA) 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 전장 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 성질 (예를 들어, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 유지되는 한 코딩 서열의 임의의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 이 용어는 구조 유전자의 코딩 영역, 및 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 5' 및 3' 말단 양쪽 모두 상에서 어느 한쪽 말단 상에서 약 1 kb 이상의 거리에 대해 코딩 영역에 인접하여 위치하는 서열을 또한 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열로 지칭된다. 코딩 영역의 3'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열로 지칭된다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 게놈 형태의 유전자 양쪽 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 명명되는 비-코딩 서열로 중단된 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA) 내로 전사되는 유전자의 절편이다; 인트론은 인핸서(enhancer)와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사물로부터 제거되거나 "스플라이싱 아웃(splicing out)"된다; 따라서, 인트론은 전령 RNA (mRNA) 전사물 내에 존재하지 않는다. mRNA는 신생 폴리펩티드 내의 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하도록 번역 중에 기능한다. 인트론을 함유하는 것에 더하여, 게놈 형태의 유전자는 RNA 전사물 상에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 양쪽 상에 위치하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 이러한 서열들은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 지칭된다 (이러한 플랭킹 서열은 mRNA 전사물 상에 존재하는 비-번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치한다). 5' 플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 이에 영향을 미치는 조절 서열 예컨대 프로모터 및 인핸서를 함유할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대한 언급과 함께 사용되는 경우의 용어 "재조합"은 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 변형되었음 또는 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래됨을 가리킨다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 과발현되거나 비정상적으로 발현되는, 예컨대 비-천연 발생 단편 또는 스플라이스(splice) 변이체로서 발현되는 천연 유전자를 발현한다. 본원에서의 용어 "재조합 핵산"은 정상적으로는 천연에서 발견되지 않는 형태의, 일반적으로, 핵산의 조작, 예를 들어 중합효소 및 엔도뉴클레아제를 사용한 조작에 의해 본래 시험관 내에서 형성된 핵산을 의미한다. 이러한 방식으로, 상이한 서열들이 작동적으로 연결된다. 따라서, 선형 형태의 단리된 핵산, 또는 정상적으로는 연결되지 않는 DNA 분자들을 결찰시킴으로써 시험관 내에서 형성된 발현 벡터 모두 본 발명의 목적을 위해 재조합물로서 간주된다. 일단 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 생물 내로 도입되면, 이는 비-재조합적으로, 즉 시험관내 조작보다는 숙주 세포의 생체내 세포 장치를 사용하여 복제될 것으로 이해된다; 그러나, 일단 재조합적으로 생산된 이같은 핵산은, 비록 나중에 비-재조합적으로 복제되더라도, 본 발명의 목적을 위해 여전히 재조합물인 것으로 간주된다. 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 즉, 상기 묘사된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.
본원에서 사용된 용어 "이종 유전자"는 이의 천연 환경에 있지 않은 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자는 또다른 종 내로 도입된 한 종으로부터의 유전자를 포함한다. 이종 유전자는 어떤 방식으로든 변경된 (예를 들어, 돌연변이, 다중 카피로의 부가, 비-천연 조절 서열에의 연결 등), 생물에 천연인 유전자를 또한 포함한다. 이종 유전자 서열은 염색체에서 유전자 서열과 천연적으로 회합하는 것으로 발견되지 않는 DNA 서열에 전형적으로 연결되거나, 또는 천연에서 발견되지 않는 염색체의 일부분 (예를 들어, 정상적으로는 유전자가 발현되지 않는 좌위에서 발현되는 유전자)과 회합된다는 점에서 이종 유전자는 내인성 유전자와 구별된다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 DNA 절편(들)을 한 세포에서 또다른 세포로 전달하는 핵산 분자와 관련되어 사용된다. 용어 "비히클"은 종종 "벡터"와 상호교환가능하게 사용된다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 종종 유래된다.
"결찰"은 2개의 이중 가닥 핵산 단편들 간에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 프로세스를 지칭한다. 달리 제공되지 않는 한, 대략 등몰량의 결찰될 DNA 단편 0.5 ㎍ 당 10 유닛의 T4 DNA 결찰효소 ("결찰효소")와 함께 공지된 완충제 및 조건을 사용하여 결찰이 달성될 수 있다. 핵산의 결찰은 2개의 단백질을 인-프레임(in-frame)으로 함께 연결시켜 단일 단백질 또는 융합 단백질을 생성시키는 작용을 할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "유전자 발현"은 유전자 내에 코딩된 유전자 정보가 유전자의 "전사"를 통해 (예를 들어, RNA 중합효소의 효소 작용을 통해) RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로, 그리고 단백질을 코딩하는 유전자에 대해서는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환되는 프로세스를 지칭한다. 유전자 발현은 프로세스 내의 다수의 단계에서 조절될 수 있다. "상향 조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 지칭하고, "하향 조절" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 지칭한다. 상향 조절 또는 하향 조절에 수반되는 분자 (예를 들어, 전사 인자)는 각각 "활성화제" 및 "억제제"로 종종 칭해진다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," "단백질," 및 "단백질 단편"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들, 뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조의 화합물, 예를 들어, 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 알파 탄소가 있는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이같은 유사체에는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격이 있을 수 있지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조가 유지된다. 아미노산 모방체는 구조가 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이하지만 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 화학 화합물을 지칭한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 양쪽 모두에 적용된다. "아미노산 변이체"는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일하거나 회합된 (예를 들어, 천연적으로 인접성인) 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 동의성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산들이 대부분의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈이 알라닌을 지정하는 모든 위치에서, 코딩되는 폴리펩티드가 변경되지 않으면서 코돈이 상응하는 코돈들 중 또다른 것으로 변경될 수 있다. 이같은 핵산 변동은 보존적으로 변형된 변동의 한 종류인 "침묵 변동"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 핵산의 침묵 변동을 또한 기술한다. 특정 상황에서 핵산 내의 각각의 코돈 (메티오닌에 대한 일반적으로 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 일반적으로 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자가 산출되도록 변형될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 침묵 변동은 기술된 서열에서 발현 산물에 관하여 내재적이지만, 실제 프로브 서열에 관해서는 그렇지 않다. 아미노산 서열에 관하여, 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경시키거나, 부가하거나 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체" (변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 초래하는 경우 포함)라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다. 이같은 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 본 발명의 대립유전자에 부가적이고, 이를 배제하지 않는다. 전형적으로, 보존적 치환에는 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)이 포함된다 (예를 들어, [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
본원에서 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "에피토프 태그"에 융합된, 암 줄기 세포 마커 단백질 또는 이의 도메인 서열 또는 일부분을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 에피토프 태그 폴리펩티드는 항체에 의한 인식을 위한 에피토프를 제공하는데 충분한 아미노산 잔기를 포함하지만, 암 줄기 세포 마커 단백질의 활성을 방해하지 않도록 충분히 짧다. 적절한 에피토프 태그에는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 일반적으로 약 8개 내지 약 50개 사이의 아미노산 잔기, 때때로 약 10개 내지 약 20개 사이의 잔기가 있다. 통상적으로 사용되는 에피토프 태그에는 Fc, HA, His, 및 FLAG 태그가 포함된다.
본 발명은 암의 연구, 진단, 특성화 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 고형 종양 줄기 세포 마커에 대한 항체 및 이러한 항체를 사용하여 환자에서 종양 성장을 억제하고 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 리간드 결합, 수용체 이량체화, 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현, 및/또는 암 줄기 세포 마커 단백질의 하류 신호전달을 예를 들어 방해하는 길항제 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체에는 암 줄기 세포 마커 단백질에 특이적으로 결합하고, 리간드 결합, 수용체 이량체화, 및/또는 암 줄기 세포 마커 단백질에 의한 신호전달을 예를 들어 촉진하는 작동제 항체가 포함된다. 특정 실시양태에서, 개시된 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질의 생물학적 활성을 방해하거나 촉진하지 않지만, 예를 들어, 면역계에 의한 내재화 및/또는 인식에 의해, 종양 성장을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나를 초과하는 고형 종양 줄기 세포 마커 단백질을 특이적으로 인식한다.
인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이때 항체가 종양 성장에 영향을 미치는 단리된 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 본 발명의 항체 및 제약상 허용가능한 비히클을 포함하는 제약 조성물이 추가로 제공된다.
치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 항체가 세포독성 모이어티(moiety)에 접합된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 조합 요법을 달성하는데 적합한 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 세포는 유방 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 전립선 종양, 췌장 종양, 및 두경부 종양으로부터 선택된다.
자신이 유래된 조직과 같이, 고형 종양은 세포들의 비균질한 집단으로 구성된다. 대다수의 이러한 세포들에 종양발생성이 없다는 것은 고형 종양의 발달 및 유지가 증식하고 추가적인 종양 줄기 세포 (자가-재생) 및 종양 발생성 잠재력이 없는 대다수의 더욱 분화된 종양 세포 (즉, 비-종양발생성 암 세포) 양쪽 모두를 효율적으로 발생시키는 능력이 있는 줄기 세포의 작은 집단 (즉, 종양발생성 암 세포)에 또한 의존적이라는 것을 시사한다. 암 줄기 세포의 개념은 조혈 줄기 세포 (HSC)의 발견 직후에 최초로 도입되었고, 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 실험적으로 확립되었다 ([Park et al., 1971, J. Natl. Cancer Inst. 46:411-22]; [Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8]; [Bonnet & Dick, 1997, Nat. Med. 3:730-7]; [Hope et al., 2004, Nat. Immunol. 5:738-43]). 독특한 패턴의 세포-표면 수용체의 발현 및 배양물 및 이종이식편 동물 모델에서의 자가-재생 및 증식 성질의 평가를 기초로 고형 종양으로부터의 줄기 세포가 더욱 최근에 단리되었다. 분획화되지 않은 종양 세포에 비해 종양을 형성하는 능력이 50배를 초과하여 강화된 ESA+ CD44+ CD24-/로우 계통 집단이 발견되었다 ([Al-Hajj et al., 2003, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 100:3983-8]). 비-종양발생성 종양 세포의 덩어리로부터 종양발생성 암 줄기 세포를 단리하는 능력으로, 마이크로어레이 분석을 사용하여 비-종양발생성 종양 세포 또는 정상 유방 상피와 비교하여 암 줄기 세포에서의 차별적인 발현이 있는 유전자인 암 줄기 세포 마커를 확인하게 되었다. 본 발명은 이러한 확인된 암 줄기 세포 마커의 지식을 사용하여 암을 진단하고 치료한다.
본 발명의 암 줄기 세포 마커는 노치 수용체 리간드인 인간 DLL4와 관련된다. 노치 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 배아-후(post-embryonic) 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 결정적인 조절인자들 중 하나이다. 더욱 구체적으로, 노치 신호전달은 인접한 세포 운명들 간의 측면 억제의 프로세스에서 수반되고, 비대칭 세포 분할 동안 세포 운명 결정에서 중요한 역할을 한다. 조절되지 않은 노치 신호전달은 수많은 인간 암과 관련되고, 이러한 암에서 종양 세포의 발달 운명을 변경시켜 이를 미분화 및 증식 상태에서 유지시킬 수 있다 ([Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]). 따라서, 줄기 세포 집단에 의한 정상적인 발달 및 조직 복구를 제어하는 항상성 메커니즘을 침해함으로써 발암이 진행될 수 있다 ([Beachy et al., 2004, Nature 432:324]).
노치 수용체는 초파리 돌연변이체에서 최초로 확인되었다. 초파리 노치의 반수체기능부전(haploinsufficiency)으로는 날개 가장자리에서의 노치가 초래되는 반면, 기능손실(loss-of-function)로는 표피의 세포가 신경 조직으로 운명이 전환되는 배아 치사 "신경원성" 표현형이 생산된다 ([Moohr, 1919, Genet. 4:252]; [Poulson, 1937, PNAS 23:133]; [Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271]). 노치 수용체는 커다란 세포외 도메인 내에 수많은 일렬의 표피 성장 인자 (EGF)-유사 반복부 및 시스테인-풍부 노치/LIN-12 반복부를 함유하는 단일-통과 막횡단 수용체이다 ([Wharton et al., 1985, Cell 43:567]; [Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094]; [Artavanis et al., 1999, Science 284:770]에서 재검토됨). 4가지 포유류 노치 단백질이 확인되었고 (노치1, 노치2, 노치3, 및 노치4), 이러한 수용체들에서의 돌연변이는 변함없이 발달 이상 및 인간 병리학 (하기 기술되는 바와 같은 여러 암 포함)을 초래한다 ([Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103]; [Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25]).
노치 수용체는 델타, 세레이티드(Serrated), Lag-2 (DSL) 패밀리의 단일-통과 막횡단 리간드에 의해 활성화된다. 포유동물에서의 공지된 노치 리간드인 델타-유사 1 (Dll1), 델타-유사 3 (Dll3), 델타-유사 4 (Dll4), 재기드(Jagged) 1 및 재기드 2는 DSL 도메인, 및 세포외 도메인 내의 일렬의 EGF-유사 반복부를 특징으로 한다. 노치 수용체의 세포외 도메인이 이의 리간드의 세포외 도메인 (전형적으로 인접한 세포 상에 있음)과 상호작용하여, 노치의 2가지 단백질분해성 절단이 초래되고, 이는 ADAM 프로테아제에 의해 매개되는 세포외 절단 및 감마 시크리타제에 의해 매개되는 막횡단 도메인 내에서의 절단이다. 이러한 후자의 절단으로 노치 세포내 도메인 (NICD)이 초래된다. 그후, NICD가 핵에 진입하고, 여기서 주요 하류 이펙터로서 CBF1, 서프레서 오브 헤어리스(Suppressor of Hairless) [Su(H)], Lag-2 (CSL) 패밀리의 전사 인자를 활성화시켜, 핵의 헤어리(Hairy) 및 인핸서 오브 스플릿(Enhancer of Split) [E(spl)] 패밀리의 염기성 나선-고리-나선 전사 인자의 전사를 증가시킨다 ([Artavanis et al., 1999, Science 284:770]; [Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:543]). 초파리에서 확인된 세포질 단백질 델텍스(Deltex)가 수반되는 별법적인 세포내 경로가 포유동물에 또한 존재할 수 있고 ([Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33]), 이러한 델텍스-의존적 경로가 Wnt 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용을 할 수 있다 ([Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710]; [Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375- 85]).
조혈 줄기 세포 (HSC)는 신체 내의 최상으로 이해된 줄기 세포이고, 노치 신호전달은 이의 정상적인 유지, 뿐만 아니라 백혈병성 변환 양쪽 모두에 연루된다 ([Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]). HSC는 성체 골수 내의 기질 니치(niche)에 존재하는 드문 세포 집단이다. 이러한 세포들은 독특한 유전자 발현 프로파일, 뿐만 아니라 더욱 분화된 기원 세포를 지속적으로 발생시켜 전체 조혈 시스템을 재구성시키는 능력 양쪽 모두를 특징으로 한다. HSC 및 기원 세포에서의 노치1 신호전달의 구성적 활성화는 시험관 내에서 및 장기 재구성 분석법에서 림프계 세포 및 골수 세포 양쪽 모두를 생성시키는 무한증식 세포주를 확립시키고 ([Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81]), 재그드 1의 존재는 HSC에 대해 강화된 인간 골수 세포 집단의 생착을 증가시킨다 ([Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72]). 더욱 최근에는, 노치 신호전달이 생체 내에서 HSC에서 증명되었고, HSC 분화를 억제하는데 수반되는 것으로 나타났다. 또한, 노치 신호전달은 Wnt-매개 HSC 자가-재생에 필요한 것으로 보인다 ([Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314]).
노치 신호전달 경로는 신경 줄기 세포의 유지에서 또한 중심적인 역할을 하고, 이의 정상적인 유지, 뿐만 아니라 뇌 암 양쪽 모두에 연루된다 ([Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]; [Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63]; [Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800]). 신경 줄기 세포는 발달 동안 포유류 신경계에서 모든 뉴런성 및 아교 세포를 발생시키고, 더욱 최근에는 성인 뇌에서 확인되었다 ([Gage, 2000, Science 287:1433-8]). 노치1; 노치 표적 유전자 Hes1, 3, 및 5; 및 노치 신호전달 프레세닐린1 (PS1)의 조절인자가 결핍된 마우스는 감소된 개수의 배아 신경 줄기 세포를 나타낸다. 또한, PS1 이형접합체 마우스의 뇌에서 성체 신경 줄기 세포가 감소된다 ([Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93]; [Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58]). 신경 줄기 세포에서의 감소는 뉴런으로의 조기 분화로부터 기인하는 것으로 보이고 ([Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50]), 이는 노치 신호전달이 신경 줄기 세포 분화 및 자가-재생을 조절한다는 것을 시사한다.
비정상적인 노치 신호전달이 다수의 인간 암에서 연루된다. 인간에서의 노치1 유전자는 노치 경로의 활성화를 초래하는 전위된 좌위로서 T-세포 급성 림프모구성 백혈병의 아집단에서 최초로 확인되었다 ([Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61]). 마우스 모델에서의 T-세포에서의 노치1 신호전달의 구성적 활성화로 T-세포 림프종이 유사하게 생성되고, 이는 원인성 역할을 시사한다 ([Robey et al., 1996, Cell 87:483-92]; [Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91]; [Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9]; [Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48]). 최근에, 비정상적인 노치1 신호전달을 일으키는 노치1 점 돌연변이, 삽입 및 결실이 아동 및 성인 T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종 양쪽 모두에 빈번하게 존재하는 것으로 발견되었다 ([Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33]).
유방 종양 내의 노치1 및 노치4 좌위 양쪽 모두 내로의 마우스 유방 종양 바이러스의 빈번한 삽입 및 결과적인 활성화된 노치 단백질 단편으로 노치 신호전달이 유방암에 최초로 연루되었다 ([Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol 61:66-74]; [Brennan & Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 트랜스제닉 마우스에서의 추가적인 연구로 정상적인 유선 발달 동안 관 분지에서의 노치의 역할이 입증되었고, 유방 상피 세포 내의 구성적으로 활성인 형태의 노치4는 상피 분화를 억제하고, 종양발생을 초래한다 ([Jhappan et al., 1992, Genes & Dev. 6:345-5]; [Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85]; [Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77]; [Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9]; [Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol 196:204-17]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 현재, 인간 유방암에서의 노치에 대한 증거는 유방 암종에서의 노치 수용체의 발현 및 임상 결과와의 상관관계에 한정된다 ([Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86]; [Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86]). 또한, 노치 경로의 과발현이 자궁경부암 ([Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8]), 신세포 암종 ([Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32]), 두경부 편평세포 암종 ([Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4]), 자궁내막암 ([Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9]), 및 신경모세포종 ([van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8])에서 관찰되었고, 이는 다수의 신생물의 발달에서의 노치의 잠재력인 역할을 가리킨다. 흥미롭게도, 노치 신호전달은 결장의 Apc-돌연변이체 신생물성 세포의 미분화 상태의 유지에서 역할을 할 수 있다 ([van Es & Clevers, 2005, Trends Mol. Med. 11:496-502]).
노치 경로는 증식, 이동, 평활근 분화, 혈관형성 및 동맥-정맥 분화가 포함되는 혈관 발달의 여러 양상에서 또한 수반된다 ([Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543]). 예를 들어, 노치-1/4 및 재그드-1에서의 동종접합성 무효(null) 돌연변이, 뿐만 아니라 Dll4의 이종접합성 손실로 동맥 발달 및 난황낭 혈관화에서 여러가지의, 그러나 가변성인 결함이 초래된다. 또한, Dll1-결핍 및 노치-2-저차형(hypomorphic) 마우스 배아는 혈관 구조의 불량한 발달로부터 초래되었을 것 같은 출혈을 나타낸다 ([Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54]; [Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52]; [Xue et al., 1999, Hum. Mel Genet. 8:723-30]; [Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21]; [McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502]). 인간에서, 재그드1에서의 돌연변이는 혈관 결함을 포함하는 발달 장애인 알라질(Alagille) 증후군과 관련되고, 노치3에서의 돌연변이는 혈관 항상성이 불완전한 유전형 혈관 치매 (CADASIL)를 초래한다 ([Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10]).
정상적인 유방 상피와 비교하여 암 줄기 세포에서 발현되는 것으로 DLL4가 확인되어, 대다수의 비-종양발생성 암 세포뿐만 아니라 고형 종양의 형성 및 재발을 초래하는 종양발생성 세포를 제거하기 위해 노치 경로를 표적화하는 것이 제안되었다. 또한, 종양 형성 및 유지에서의 혈관형성의 두드러진 역할로 인해, DLL4에 대한 항체를 통한 노치 경로 표적화는 혈관혈성을 또한 효율적으로 억제하여, 암에서 영양분을 고갈시키고 암의 제거에 기여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 암과 관련된 질환을 진단 또는 모니터링하기 위해 발현을 분석할 수 있는 암 줄기 세포 마커를 제공한다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커의 발현은 폴리뉴클레오티드 발현, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커를 코딩하는 mRNA에 의해 결정된다. 당업자에게 주지된 다수의 수단들 중 임의의 수단에 의해 폴리뉴클레오티드를 검출 및 정량할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 절편, 예를 들어, 환자 생검으로부터의 절편의 원위치 혼성화에 의해 암 줄기 세포 마커를 코딩하는 mRNA가 검출된다. 일부 실시양태에서, RNA를 조직으로부터 단리하고, 예를 들어, 노던 블롯, 정량적 RT-PCR, 또는 마이크로어레이에 의해, 검출한다. 예를 들어, 전체 RNA를 조직 샘플로부터 추출할 수 있고, 암 줄기 세포 마커에 특이적으로 혼성화하고 이를 증폭시키는 프라이머를 사용하여, RT-PCR을 사용하여 암 줄기 세포 마커 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커의 발현을 상응하는 폴리펩티드의 검출에 의해 결정할 수 있다. 당업자에게 주지된 다수의 수단들 중 임의의 수단에 의해 폴리펩티드를 검출 및 정량할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 박층 크로마토그래피 (TLC)와 같은 분석 생화학 방법을 사용하여 암 줄기 세포 마커 폴리펩티드가 검출된다. 또한, 단리된 폴리펩티드를 표준 기술에 따라 서열분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커 단백질이 조직 절편 상에서 면역형광 또는 면역조직화학을 예를 들어 사용하여 단백질에 대해 상승된 항체로 검출된다. 별법적으로, ELISA, FACS, 웨스턴 블롯, 면역침전 또는 단백질 마이크로어레이를 예를 들어 사용하여 암 줄기 세포 마커에 대한 항체로 발현을 검출할 수 있다. 예를 들어, 암 줄기 세포를 환자 생검으로부터 단리하고, 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현을 FACS를 사용하여 형광 표지된 항체로 검출할 수 있다. 또다른 방법에서, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 세포를 전형적인 영상화 시스템에서 표지된 항체를 사용하여 생체내에서 검출할 수 있다. 예를 들어, 상자성 동위원소로 표지된 항체를 자기 공명 영상화 (MRI)에 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 진단 분석법은 면역조직화학, 원위치 혼성화, 또는 RT-PCR을 예를 들어 사용하여 종양 세포에서 암 줄기 세포 마커가 발현되는지 또는 발현되지 않는지를 결정하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 진단 분석법은 정량적 RT-PCR을 예를 들어 사용하여 암 줄기 세포 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 진단 분석법은 대조군 조직 예컨대 정상적인 상피와 비교하여 암 줄기 세포 마커의 발현 수준을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
그후, 암 줄기 세포 마커 발현의 검출을 사용하여, 예후를 제공하고 치료법을 선택할 수 있다. 예후는 암 줄기 세포 마커의 발현이 가리키는 임의의 공지된 위험을 기초로 할 수 있다. 또한, 암 줄기 세포 마커의 검출을 사용하여, 검출된 암 줄기 세포 마커 단백질에 대한 항체로의 치료가 예를 들어 포함되는 적합한 치료법을 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질 예컨대 노치 수용체 리간드인 DLL4의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 문맥에서, 적절한 항체는 암 줄기 세포 마커의 발현을 방해함; 암 줄기 세포 신호 전달 경로의 활성화를 방해함, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커와 이의 리간드, 수용체 또는 공동-수용체 간의 상호작용을 입체적으로 억제함으로써 방해함; 암 줄기 세포 신호 전달 경로를 활성화시킴, 예를 들어, 리간드로서 작용하거나 내인성 리간드의 결합을 촉진함으로써 활성화시킴; 또는 암 줄기 세포 마커에 결합하고 종양 세포 증식을 억제함 중 하나 이상의 효과가 있을 수 있는 작용제이다.
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 세포외적으로 작용하여 암 줄기 세포 마커 단백질의 기능을 조정한다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 세포외 결합은, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커의 내재성 활성화 (예를 들어 키나제 활성)을 억제함으로써 및/또는 상호작용, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커와 이의 리간드, 이의 수용체, 공동-수용체 또는 세포외 매트릭스의 상호작용을 입체적으로 억제함으로써, 암 줄기 세포 마커 단백질의 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 세포외 결합은, 예를 들어, 암 줄기 세포 마커 단백질의 내재화에 의해 또는 암 줄기 세포 마커의 세포 표면 왕래를 감소시킴으로써, 암 줄기 세포 마커의 세포 표면 발현을 하향조절시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 세포외 결합은, 예를 들어, 유인 리간드로 작용함으로써 또는 리간드 결합을 증가시킴으로써, 암 줄기 세포 마커 단백질의 신호전달을 촉진할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 암 줄기 세포 마커 단백질에 결합하고, 종양 세포 증식 억제, 종양 세포의 세포 사멸 촉발, 종양 세포의 덜 종양발생성인 세포 유형으로의 분화 촉진, 또는 종양 세포의 전이 방지 중 하나 이상의 효과가 있다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 접합된 독소, 화학요법제, 방사성동위원소 또는 기타 이같은 작용제를 통해 세포 사멸을 촉발한다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 단백질 내재화에 의해 암 줄기 세포 마커를 발현하는 종양 세포에서 활성화되는 독소에 접합된다.
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)을 통해 암 줄기 세포 마커 단백질을 발현하는 세포의 세포 사멸을 매개한다. ADCC는 항체의 Fc 부분을 인식하는 이펙터 세포에 의한 세포 용해를 수반한다. 예를 들어, 다수의 림프구, 단핵구, 조직 대식세포, 과립구 및 호산구에, Fc 수용체가 있고, 이들이 세포용해를 매개할 수 있다 ([Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]).
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 활성화시킴으로써 암 줄기 세포 마커 단백질을 발현하는 세포의 세포 사멸을 촉발한다. CDC에는 항체의 Fc 부분에 혈청 보체가 결합하고, 이어서 보체 단백질 케스케이드가 활성화되어, 세포막 손상 및 결국 세포 사멸이 초래되는 것이 수반된다. 항체의 생물학적 활성은 항체 분자의 불변 도메인 또는 Fc 영역에 의해 대부분 결정되는 것으로 공지되어 있다 ([Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)]). 동일한 서브클래스의 항체는 그러하지만 상이한 종으로부터의 항체는 아닌 것과 같이, 상이한 클래스 및 서브클래스의 항체는 이러한 점에서 상이하다. 인간 항체 중에서, IgM이 보체에 결합하는데 가장 효율적인 클래스의 항체이고, IgG1, IgG3, 및 IgG2가 그 뒤를 잇는 반면, IgG4는 보체 케스케이드를 활성화시키는데 있어서 꽤 부족한 것으로 보인다 ([Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]; [Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76]). 본 발명에 따라, 원하는 생물학적 활성이 있는 클래스의 항체가 제조된다.
보체 활성화 및/또는 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 암 줄기 세포에 대한 임의의 특정 항체의 능력을 분석할 수 있다. 당해 세포가 시험관내에서 성장 및 표지되고, 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 면역 세포 또는 혈청 보체와 조합되어 항체가 세포 배양물에 첨가된다. 예를 들어, 용해된 세포로부터의 표지의 방출에 의해, 표적 세포의 세포용해가 검출된다. 실제로, 환자 자신의 혈청을 보체 및/또는 면역 세포의 공급원으로 사용하여 항체가 스크리닝될 수 있다. 시험관내 테스트에서 보체를 활성화시키거나 ADCC를 매개할 수 있는 항체를 이러한 특정 환자에서 치료용으로 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 세포 사멸을 촉발하여 혈관형성을 억제할 수 있다. 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 프로세스이고, 정상적인 성장 (예를 들어, 배아 발달, 상처 치유 동안에, 그리고 배란에 응답하여)에 필요한 기초적인 프로세스이다. 1-2 ㎟보다 큰 고형 종양 성장 또한 영양분 및 산소 (이것들이 없으면 종양 세포가 사멸함)를 공급하기 위해 혈관형성을 필요로 한다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 내피 세포, 평활근 세포, 또는 혈관 어셈블리에 필요한 세포외 매트릭스의 성분이 예를 들어 포함되는, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 혈관 세포를 표적으로 한다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 혈관 세포 동원, 어셈블리, 유지 또는 생존에 필요한 성장 인자 신호전달을 억제한다.
암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생물학적 샘플, 예를 들어, 환자 조직 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플 내의 암 줄기 세포 마커 단백질의 발현을 검출하는데 사용된다. 조직 생검을 절편화하고, 예를 들어, 면역형광 또는 면역조직화학을 사용하여 단백질을 검출할 수 있다. 또한, 샘플로부터 개별적인 세포들을 단리할 수 있고, FACS 분석에 의해 고정된 세포 또는 살아 있는 세포 상에서 단백질 발현을 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커의 발현, 예를 들어, 종양 세포 상에서의 발현, 세포 용해물 내에서의 발현 또는 기타 단백질 샘플 내에서의 발현을 검출하기 위한 단백질 어레이에서 항체를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 시험관내 세포 기반 분석법, 생체내 동물 모델 등에서 항체를 종양 세포와 접촉시킴으로써 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 치료적 유효량의 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 투여함으로써 환자에서 암을 치료하는데 항체가 사용된다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민 등에 임의로 접합된 관련된 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)이 무균 염수에 용해되고 애쥬번트 (예를 들어 완전 또는 불완전 프로인트 애쥬번트)와 조합되어 형성된 안정적인 에멀션의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 당나귀 등)을 면역화시킴으로써 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 그후, 폴리클로날 항체를 이렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 회수한다. 수집된 혈액을 응고시키고, 혈청을 따라내어, 원심분리에 의해 정화하고, 항체 역가에 대해 분석한다. 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 등이 포함되는 당업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 폴리클로날 항체를 정제할 수 있다.
하이브리도마 방법, 예컨대 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기술된 것들을 사용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터, 또는 기타 적합한 숙주 동물을 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생산을 이끌어낸다. 시험관 내에서 림프구가 또한 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 폴리에틸렌 글리콜을 예를 들어 사용하여 적절한 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨 후, 이를 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선별해낼 수 있다. 면역침전, 면역블롯팅 또는 시험관내 결합 분석법 (예를 들어, 방사면역분석법 (RIA); 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA))에 의해 결정되는 바와 같이 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 표준 방법 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 사용하여 시험관내 배양에서 또는 동물 내에서 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 그후, 모노클로날 항체를 상기 폴리클로날 항체에 대해 기술된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제할 수 있다.
별법적으로, 미국 특허 4,816,567에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 모노클로날 항체를 또한 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 RT-PCR에 의해, 성숙형 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 이의 서열을 통상적인 절차를 사용하여 결정한다. 그후, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 형질감염되지 않은 경우 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 이러한 발현 벡터가 형질감염되었을 때, 숙주 세포에 의해 모노클로날 항체가 생성된다. 또한, 원하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 기술된 바와 같은 원하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리할 수 있다 ([McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; [Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581-597).
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)을 재조합 DNA 기술을 사용하여 다수의 상이한 방식으로 추가로 변형시켜, 별법적인 항체를 생성시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체의 것으로 1) 예를 들어 인간 항체의 영역을 치환하여 키메라 항체를 생성시키거나, 또는 2) 비-면역글로불린 폴리펩티드를 치환하여 융합 항체를 생성시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체의 원하는 항체 단편이 생성되도록 불변 영역이 말단절단되거나 제거된다. 가변 영역의 부위-지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 사용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화력 등을 최적화할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 가변 영역 내에 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 최소 서열을 함유하는 항체이다. 이같은 항체는 인간 대상에게 투여되는 경우 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 응답을 감소시키기 위해 치료적으로 사용된다. 실제로, 인간화 항체는 최소한도의 비-인간 서열이 있으면서 전형적으로는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생산된 항체 또는 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화 항체를 생산할 수 있다. [Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536])의 방법에 따라 인간 항체의 CDR을 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 비-인간 항체 (예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR로 치환함으로써 항체가 인간화될 수 있다. 인간 가변 프레임워크 영역에서 및/또는 교체된 비-인간 잔기 내에서 추가적인 잔기를 치환함으로써 인간화 항체를 추가로 변형시켜, 항체 특이성, 친화력 및/또는 능력을 정련하고 최적화할 수 있다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될 인간 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 선택이 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 아미노산 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 따라서, 특정 실시양태에서, CDR이 취해진 설치류 항체의 서열과 가장 상동성인 인간 아미노산 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로 사용된다 ([Sims et al., 1993, J. Immunol, 151:2296]; [Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196:901]). 또다른 방법에서는, 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 FR이 사용되고, 이는 여러 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al., 1992, PNAS, 89;4285]; [Presta et al., 1993, J. Immunol, 151:2623]). 특정 실시양태에서, 인간화 항체의 생성에서 사용하기 위한 인간 가변 FR을 고르기 위해 방법들의 조합이 사용된다.
인간화될 항체 (예를 들어, 설치류 항체)는 항원에 대한 높은 친화력, 뿐만 아니라 다른 유리한 생물학적 성질을 유지하여야 하는 것으로 또한 이해된다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 인간화될 설치류 항체로부터의 어버이 서열 및 다양한 후보 인간화 서열의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 당업자가 입수가능하고 이들에게 친숙하다. 선택된 후보 항체 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 설명하고 디스플레이하기 위해 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이같은 모델을 사용하여, 인간화될 항체의 기능에서의 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있고, 즉, 항원에 결합하는 후보 항체의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성이 달성되도록 어버이 항체로부터 수용자 인간화 항체로 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 항원 결정 영역 (또는 초가변 영역)의 CDR 내의 잔기는 항원 결합을 위해 인간화 항체에서 어버이 항체 (예를 들어, 원하는 항원 결합 성질이 있는 설치류 항체)로부터 유지된다. 특정 실시양태에서, 가변 FR 내의 하나 이상의 추가적인 잔기가 인간화 항체에서 어버이 항체로부터 유지된다. 특정 실시양태에서, 가변 FR 내의 6개까지의 추가적인 잔기가 인간화 항체에서 어버이 항체로부터 유지된다.
면역글로불린의 성숙형 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터의 아미노산은 각각 Hx 및 Lx로 명시되고, 이때 x는 [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, 1991]의 방식에 따른 아미노산의 위치를 지정하는 숫자이다. 카밧은 각각의 하위군의 항체에 대한 다수의 아미노산 서열을 목록화하고, 이러한 하위군 내의 각각의 잔기 위치에 대해 가장 통상적으로 발생하는 아미노산을 목록화하여, 컨센서스 서열을 생성시켰다. 카밧은 목록화된 서열 내의 각각의 아미노산에 잔기 번호를 할당하는 방법을 사용하였고, 잔기 번호를 할당하는 이러한 방법이 업계에서 표준이 되었다. 당해 항체를 보존된 아미노산을 참조로 카밧 내의 컨센서스 서열들 중 하나와 정렬시킴으로써 카밧의 개론에 포함되지 않는 다른 항체에 대해 카밧의 방식이 확장될 수 있다. 카밧 번호매김 시스템을 사용하면 상이한 항체들 내에서 등가의 위치에 있는 아미노산들이 쉽게 확인된다. 예를 들어, 인간 항체의 L50 위치에 있는 아미노산은 마우스 항체의 아미노산 위치 L50에 대해 등가의 위치를 차지한다. 게다가, 한 항체 서열 내의 각각의 아미노산이 또다른 서열 내의 카밧 번호가 동일한 아미노산과 정렬되도록 카밧 번호매김 시스템을 사용함으로써, 예를 들어 동일성 백분율을 결정하기 위해, 임의의 2개의 항체 서열이 독특하게 정렬될 수 있다. 정렬 후, 대상 항체 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙형 가변 영역)을 기준 항체의 동일한 영역과 비교하려는 경우, 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 간의 서열 동일성 백분율은 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 모두 내의 동일한 아미노산으로 차지된 위치의 개수를 2개의 영역의 정렬된 위치의 전체 개수로 나누고 (갭은 계수하지 않음), 100을 곱하여 백분율로 전환한 값이다.
하기의 실시예 1은 본 발명의 암 줄기 세포 마커인 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 대표적인 인간화 항-DLL4 항체 (21M18 H9L2, ATCC 기탁 번호 PTA-8427 및 21M18 H7L2, ATCC 기탁 번호 PTA-8425; 2007년 5월 10일에 기탁됨; (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA))의 생산을 기술한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 뮤린 모노클로날 항체 21M18로부터 유래된 비-인간 항원 결정 영역을 포함한다. 구체적으로, 특정 실시양태에서, 어버이 설치류 항체로부터의 중쇄 CDR인 CDR1 (서열 1), CDR2 (카밧 위치 52a에서 차이가 있는 서열 2; 서열 3; 또는 서열 4), 및 CDR3 (서열 5) 중 하나 이상이 인간화 21M18 항체에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 어버이 설치류 항체로부터의 경쇄 CDR인 CDR1 (서열 9), CDR2 (서열 10), 및 CDR3 (서열 11) 중 하나 이상이 인간화 21M18 항체에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 중쇄 또는 경쇄 인간 가변 영역 내에서 하나 이상의 FR 치환을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하고, 항체가 종양의 성장에 영향을 미치는 인간화 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 무손상 IgG 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 무손상 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 Fab 단편이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 비-인간 항원 결정 영역 및 인간 가변 프레임워크 영역을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 항원 결정 영역은 설치류 기원의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 항원 결정 영역은 마우스 항체로부터의 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 설치류 CDR은 모노클로날 항체 21M18로부터 유래되고, 이때 21M18은 서열 6으로 지정된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 (a) CDR1 (서열 1), CDR2 (서열 2; 서열 3; 또는 서열 4), 및 CDR3 (서열 5) 또는 (b) 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 프레임워크 영역은 발현된 인간 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기가 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기는 카밧 번호매김 시스템을 기초로 16, 20, 27, 28, 38, 및 48로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 있다. 특정 실시양태에서, 카밧 번호매김 시스템을 기초로 위치 16, 20, 27, 28, 38, 및 48이 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기가 비-인간 항원 결정 영역을 포함하는 항체 내의 상응하는 위치를 차지하는 잔기로 치환된다.
특정 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 프레임워크 영역은 IGH(V)1-18을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기가 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 중쇄 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기는 카밧 번호매김 시스템을 기초로 20H, 28H, 38H, 48H, 및 69H로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 있다. 특정 실시양태에서, 카밧 번호매김 시스템을 기초로 위치 20H, 28H, 38H, 48H, 및 69H가 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기가 비-인간 항원 결정 영역을 포함하는 항체 내의 상응하는 위치를 차지하는 잔기로 치환된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 비-인간 항원 결정 영역 및 인간 가변 프레임워크 영역을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 항원 결정 영역은 설치류 기원의 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 항원 결정 영역은 마우스 항체로부터의 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, CDR은 모노클로날 항체 21M18로부터 유래되고, 이때 21M18은 서열 12로 지정된 VL 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL 영역은 (a) CDR1 (서열 9), CDR2 (서열 10), 및 CDR3 (서열 11) 또는 (b) 서열 12의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인간 경쇄 가변 프레임워크 영역은 IGK(V)4-1을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 경쇄 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기가 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기는 카밧 번호매김 시스템을 기초로 22L 및 36L로 구성된 군으로부터 선택된 위치에 있다. 특정 실시양태에서, 카밧 번호매김 시스템을 기초로 위치 22L 및 36L이 치환된다. 특정 실시양태에서, 인간 가변 프레임워크 영역으로부터의 하나 이상의 잔기가 비-인간 항원 결정 영역을 포함하는 항체 내의 상응하는 위치를 차지하는 잔기로 치환된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 DLL4에의 특이적 결합에 대해 항체 21M18과 경쟁하는 항체이고, 이때 21M18 항체는 (a) 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8로 지정된 가변 영역이 있는 중쇄 및 (b) 서열 12로 지정된 가변 영역이 있는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
특정 실시양태에서, 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL 도메인 (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이때 항체가 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8과의 서열 동일성이 90％ 이상인 중쇄 가변 영역 및 서열 12와의 서열 동일성이 90％ 이상인 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8에 대한 서열 동일성이 95％ 이상이고, 경쇄 가변 영역은 서열 12에 대한 서열 동일성이 95％ 이상이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8에 대한 서열 동일성이 99％ 이상이고, 경쇄 가변 영역은 서열 12에 대한 서열 동일성이 99％ 이상이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 항체가 CDR1 (서열 1); CDR2 (서열 2, 서열 3, 또는 서열 4); 및 CDR3 (서열 5)을 코딩하는 비-인간 항원 결정 영역 및 IGH(V)1-18을 코딩하는 인간 가변 프레임워크 영역을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 폴리뉴클레오티드 분자가 (a) 서열 6, 서열 7, 또는 서열 8의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 (b) 엄격한 혼성화 조건 하에 (a)에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 폴리뉴클레오티드 분자가 (a) 서열 13, 서열 14, 또는 서열 15 및 (b) 엄격한 혼성화 조건 하에 (a)에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 항체가 CDR1 (서열 9); CDR2 (서열 10); 및 CDR3 (서열 11)을 코딩하는 비-인간 항원 결정 영역 및 IGK(V)4-1을 포함하는 인간 가변 프레임워크 영역을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 폴리뉴클레오티드 분자가 (a) 서열 12의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 (b) 엄격한 혼성화 조건 하에 (a)에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4 N-말단 영역 (서열 27) 및 인간 DSL (서열 26)의 조합물에 의해 형성된 인간 DLL4 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 코딩하고, 이때 폴리뉴클레오티드 분자가 (a) 서열 16 및 (b) 엄격한 혼성화 조건 하에 (a)에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 상보물에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 인간화 항체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 또는 두경부암을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 컨테이너, 및 컨테이너 내에 함유된, 본 발명의 인간화 항체를 포함하는 조성물을 포함하고, 조성물이 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 가리키는 포장 삽입물을 추가로 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 완전히 인간성인 항체를 직접 제조할 수 있다. 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리되거나 시험관 내에서 면역화된 무한증식 인간 B 림프구가 생성될 수 있다 (예를 들어, [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 5,750,373 참조). 또한, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 인간 항체를 선별할 수 있다 ([Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381]; [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581]). 면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 좌위를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체가 또한 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기술되어 있다.
본 발명은 암 줄기 세포 마커를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 또한 포함한다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프들은 동일한 분자 (예를 들어 동일한 암 줄기 세포 마커 폴리펩티드) 내에 있을 수 있거나, 또는, 예를 들어, 항체가 암 줄기 세포 마커뿐만 아니라, 예를 들어, 1) 백혈구 상의 이펙터 분자 예컨대 T-세포 수용체 (예를 들어 CD3) 또는 Fc 수용체 (예를 들어 CD64, CD32, 또는 CD16) 또는 2) 하기에 상세하게 기술되는 바와 같은 세포독성제를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있도록, 상이한 분자 상에 있을 수 있다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
대표적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이러한 에피토프들 중 하나 이상은 본 발명의 폴리펩티드에서 유래된다. 별법적으로,세포 방어 메커니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시키도록 면역글로불린 분자의 항-항원성 팔이 백혈구 상의 촉발 분자 예컨대 T 세포 수용체 분자 (예를 들어 CD2, CD3, CD28, 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체에 결합하는 팔과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포에 지시하는데 또한 사용될 수 있다. 이러한 항체는 항원-결합 팔 및 세포독성제 또는 방사선핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 팔을 소유한다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 당업계에서 통상적이다 ([Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science 229:81]; [Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120]; [Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368]; 및 미국 특허 5,731,168). 2가를 초과하는 항체가 또한 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 ([Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)])
특정 실시양태에서, 예를 들어 종양 투과를 증가시키기 위한 항체 단편이 제공된다. 항체 단편의 생산에 대해 다양한 기술이 공지되어 있다: 전통적으로, 이러한 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117]; [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv, 및 scFv 항체 단편 모두 대장균 또는 기타 숙주 세포에서 발현되어 이로부터 분비될 수 있어, 다량의 이러한 단편이 생산되도록 한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 이같은 항체 단편을 또한 단리할 수 있다. 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기술된 바와 같이 또한 선형 항체일 수 있고, 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술들이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 단일쇄 항체의 생산을 위해 기술들을 개조할 수 있다 (미국 특허 번호 4,946,778 참조). 또한, Fab 발현 라이브러리 ([Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)])의 구축을 위해 방법들을 개조하여, 노치 수용체 리간드 DLL4, 또는 이의 유도체, 단편, 또는 유사체에 대한 원하는 특이성이 있는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인할 수 있다. (a) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산되는 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술피드 다리를 환원시킴으로써 생성되는 Fab 단편, (c) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생성되는 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이디오타입을 함유하는 항체 단편이 당업계의 기술에 의해 생산될 수 있다.
특히 항체 단편의 경우에, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체를 변형시키는 것이 추가로 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 항체 단편 내의 적합한 영역의 돌연변이에 의해 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 단편 내로 혼입시킴으로써 또는 에피토프를 펩티드 태그 내로 혼입시킨 후 이를 항체 단편에 말단에서 또는 중간에서 융합시킴 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해)으로써 달성될 수 있다.
이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이종접합체 항체는 공유결합으로 연결된 2개의 항체로 구성된다. 이같은 항체는, 예를 들어, 면역 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해 제안되었다 (미국 특허 번호 4,676,980). 가교결합제가 수반되는 것들을 포함하여 합성 단백질 화학에서의 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 항체를 제조할 수 있는 것으로 구현된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적을 위한 적절한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트가 포함된다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체가 항체와 인간 DLL4의 폴리펩티드의 회합을 제공하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은 체액성 응답을 개시하고 원하는 종양-관련 항원에 대한 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 임의 유형의 포유동물의 영역을 포함하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 따라서, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어, 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이, 짧은꼬리원숭이(macaque) 등) 또는 이리 기원의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 면역글로불린의 가변 영역 및 불변 영역 양쪽 모두가 인간성이다. 또다른 실시양태에서, 결합 성질을 개선시키거나 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 혼화성 항체 (일반적으로 비-인간 공급원으로부터 유래됨)의 가변 영역이 조작되거나 특이적으로 맞춤제작될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에서 유용한 가변 영역은 수입된 아미노산 서열의 포함을 통해 인간화될 수 있거나 또는 다른 방식으로 변경될 수 있다.
하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 교체에 의해, 그리고 필요하다면 부분적인 프레임워크 영역 교체 및 서열 교환에 의해 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두 내의 가변 도메인이 변경된다. 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 동일한 서브클래스의 항체로부터 CDR이 유래될 수 있지만, 상이한 클래스의 항체, 바람직하게는 상이한 종으로부터의 항체로부터 CDR이 유래될 것으로 파악된다. 한 가변 도메인의 항원 결합능을 또다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 전체 CDR들을 도너 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 교체할 필요는 없을 수 있다. 그보다는, 항원 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기들을 전달하는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 번호 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에 기재된 설명 하에, 일상적인 실험을 수행함으로써 또는 시행착오 테스트에 의해 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 충분히 당업자의 능력 내일 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 천연의 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교하여 원하는 생화학적 특성 예컨대 증가된 종양 국소화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하도록 불변 영역 도메인들 중 하나 이상의 분획이 결실될거나 변경된 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 본 발명의 변형된 항체가 포함할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 호환성인 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실된 변형된 불변 영역이 구현된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체를 포함할 것이다 (ΔCH2 구축물). 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어 10개의 잔기)로 교체될 것이고, 이는 결여된 불변 영역이 전형적으로 제공하는 분자 유연성의 일부를 제공한다.
이의 형상외에도, 불변 영역이 여러 이펙터 기능을 매개하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분이 항체에 결합하는 것은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에서 중요하다. 보체의 활성화는 염증성 응답을 또한 자극하고, 자가면역 과민증에서 또한 수반될 수 있다. 또한, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)에 결합하면서, 항체가 Fc 영역을 통해 세포에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (이타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 포함하여, 항체의 여러 클래스들에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 소거, 킬러 세포에 의한 항체로 코팅된 표적 세포의 용해 (소위 항체-의존적 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC), 염증 매개인자의 방출, 태반 이동 및 면역글로불린 생산 제어가 포함되는 다수의 중요하고 다양한 생물학적 응답을 촉발한다. 다양한 Fc 수용체 및 수용체 부위가 어느 정도 연구되었지만, 이들의 위치, 구조 및 기능화에 대해 알려지지 않은 것이 여전히 많다.
본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니지만, 본원에 기술된 바와 같이 변형된 불변 영역을 포함하는 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하고, 차례로 이는 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (점 돌연변이 또는 기타 수단을 통해 이루어짐)는 순환되고 있는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 또다른 경우에, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형이 보체 결합을 완화시키고, 따라서 접합된 세포독소의 혈청 반감기 및 비-특이적 회합을 감소시키는 것일 수 있다. 불변 영역의 또다른 변형은 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인한 강화된 국소화를 허용하는 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 모이어티를 제거하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 충분히 당업자의 권한 내인 주지된 생화학적 또는 분자 조작 기술을 사용하여 쉽게 이루어질 수 있다.
변형된 항체가 각각의 변형된 항체의 힌지(hinge) 영역에 CH3 도메인을 직접적으로 융합시키도록 변형될 수 있다는 것이 주지될 것이다. 또다른 구축물에서,힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (변형되거나 또는 변형되지 않음)은 아미노산 5-20개의 스페이서로 힌지 영역에 연결된 호환성 구축물이 발현될 수 있다. 이같은 스페이서는, 예를 들어, 불변 도메인의 조절 요소들이 자유롭고 접근가능하게 유지되거나 또는 힌지 영역이 유연성으로 유지되는 것을 확실히 하기 위해 부가될 수 있다. 그러나, 일부 경우에는, 아미노산 스페이서들이 면역원성이고 구축물에 대한 원치 않는 면역 응답을 이끌어내는 것으로 판명될 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 구축물에 부가되는 임의의 스페이서는 비교적 비-면역원성이거나, 변형된 항체의 원하는 생화학적 품질이 유지될 수 있다면 전적으로 생략될 수도 있다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에도, 몇몇개, 심지어는 단일 아미노산의 부분적인 결실 또는 치환에 의해 본 발명의 항체가 제공될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역 내의 단일 아미노산의 돌연변이가 실질적으로 Fc 결합을 감소시킴으로써 종양 국소화를 증가시키는데 충분할 수 있다. 유사하게, 조정될 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 CLQ 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 이같은 부분적인 결실은 손상되지 않은 대상 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능은 남기면서 항체의 선택된 특성 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기에 암시된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역이 생성된 구축물의 프로파일을 강화시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 형상 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서 보존된 결합 부위가 제공하는 활성 (예를 들어 Fc 결합)을 파괴시키는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태는 원하는 특성 예컨대 이펙터 기능을 강화시키거나 또는 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 부가하는 것을 포함할 수 있다. 이같은 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입하거나 복제시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어, 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산이 동일한 일반적인 클래스 내의 또다른 아미노산으로 치환되는 것, 예를 들어, 한 산성 아미노산이 또다른 산성 아미노산으로, 한 염기성 아미노산이 또다른 염기성 아미노산으로, 또는 한 중성 아미노산이 또다른 중성 아미노산으로 치환되는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환이 의도하는 바는 당업계에 주지되어 있다.
본 발명은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 또한 관련된다. 세포독성제에는 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 등이 포함된다. 이같은 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제에는, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제(intercalating agent)가 포함된다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 일부 실시양태에서, 다수의 주지된 킬레이터들 중 임의의 것 또는 직접적인 표지화를 사용하여 항체가 방사성 동위원소, 예컨대 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re에 접합될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 개시된 조성물은 약물, 전구약물 또는 림포카인 예컨대 인터페론에 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 하나 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리키아마이신, 메이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065 및 독소 활성이 있는 이러한 독소들의 유도체와 항체의 접합체 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체가 다른 면역학적으로 활성인 리간드 (예를 들어, 항체 또는 이의 단편)와 복합체를 형성할 수 있고, 이때 생성된 분자는 신생물성 세포 및 이펙터 세포 예컨대 T 세포 양쪽 모두에 결합한다.
얼마나 유용한 품질이 수득되는지와 상관 없이, 본 발명의 항체는 다수의 접합된 형태 (즉, 면역접합체) 또는 접합되지 않은 형태 중 임의의 형태로 사용될 수 있다. 별법적으로, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체 의존적 세포형 세포독성 (ADCC)이 포함되는 대상의 천연적인 방어 메커니즘을 악성 세포를 제거하는데 이용하기 위해 본 발명의 항체는 접합되지 않은 또는 "네이키드(naked)" 형태로 사용될 수 있다. 어떤 접합된 변형된 항체 또는 접합되지 않은 변형된 항체를 사용할지의 선택은 암의 유형 및 단계, 부가적인 치료 (예를 들어, 화학요법 또는 외부의 방사선조사)의 사용 및 환자 컨디션에 좌우될 것이다. 본원의 교시에 비추어서 당업자가 쉽게 이같은 선택을 할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본 발명의 항체를 면역특이적 결합에 대해 분석할 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석법에는 BIAcore 분석법, FACS 분석법, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 방사면역분석법, ELISA, "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 침전소 반응, 젤 확산 침전소 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석 분석법, 면역방사측정 분석법, 형광 면역분석법, 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 이같은 분석법들은 당업계에 일상적이고 주지되어 있다 (예를 들어, 거명에 의해 본원에 전문이 포함된 [Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조).
일부 실시양태에서, ELISA를 사용하여 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 면역특이성이 결정된다. ELISA 분석법은 항원을 제조하는 단계, 96웰 미량역가 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하는 단계, 검출가능한 화합물 예컨대 효소 기질 (예를 들어 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합된 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 웰에 첨가하는 단계, 일정 기간 동안 인큐베이션하는 단계 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 검출가능한 화합물에 접합되지 않고, 대신 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 인식하는 제2의 접합된 항체가 웰에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 웰을 항원으로 코팅하는 것 대신, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 웰에 코팅될 수 있고, 코팅된 웰에 항원을 첨가한 후 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체가 첨가될 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키도록 변형될 수 있는 파라메터들, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 ELISA의 기타 변형에 관하여 박식할 것이다 (예를 들어, [Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]의 11.2.1 참조).
암 줄기 세포 마커 항원에 대한 항체의 결합 친화력 및 항체-항원 상호작용의 오프(off) 속도를 경쟁적 결합 분석법에 의해 결정할 수 있다. 경쟁적 결합 분석법의 한 예는 표지된 항원 (예를 들어 3H 또는 125I), 또는 이의 단편 또는 변이체를 증가되는 양의 표지되지 않은 항원의 존재 하에 당해 항체와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사면역분석법이다. 스캐차드 플롯 분석에 의해 데이터로부터 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 친화력 및 결합 오프-속도를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 결합 온(on) 및 오프 속도를 결정하기 위해 BIAcore 키네틱 분석이 사용된다. BIAcore 키네틱 분석은 표면 상에 암 줄기 세포 마커 항원이 고정된 칩으로부터의 항체의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 추가적인 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA가 포함되고, DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다.
추가로 본 발명은 단편, 유사체 및 유도체를 예를 들어 코딩하는 상기 기술된 폴리뉴클레오티의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 대립유전자 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 발생 변이체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리펩티드의 코딩 서열의 천연 발생 대립유전자 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가가 예를 들어 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 별법적인 형태이고, 이는 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현 및 숙주 세포로부터의 분비를 예를 들어 돕는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포로부터의 폴리펩티드의 운송을 제어하는 분비성 서열로 기능하는 리더(leader) 서열)에 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙형 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열이 있는 폴리펩티드는 프리(pre)-단백질이고, 여기서 리더 서열이 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드가 형성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 성숙형 단백질 + 추가적인 5' 아미노산 잔기인 프로(pro)-단백질을 또한 코딩할 수 있다. 프로(pro)-서열이 있는 성숙형 단백질이 프로-단백질이고, 이는 불활성 형태의 단백질이다. 프로-서열이 절단되면, 활성인 성숙형 단백질이 남는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 코딩된 폴리펩티드의 정제를 예를 들어 허용하는 마커 서열에 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙형 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙형 폴리펩티드의 정제를 제공하도록 pQE-9 벡터가 공급하는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 포유류 숙주 (예를 들어 COS-7 세포)가 사용되는 경우에는 마커 서열이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 DLL4에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％. 적어도 95％, 일부 실시양태에서는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들어 적어도 95％ "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 바꿔 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 뉴클레오티드의 5％까지가 결실되거나 또다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내의 전체 뉴클레오티드의 5％까지의 약간의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서, 또는 이러한 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 기준 서열 내의 뉴클레오티드들 사이에 개별적으로 또는 기준 서열 내에 하나 이상의 인접한 군으로 산재된다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정한 핵산 분자가 기준 서열과 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 일부 실시양태에서는, 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 동일한지 여부를 공지된 컴퓨터 프로그램 예컨대 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 베스트핏은 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)]의 국소적인 상동성 알고리즘을 사용하여, 2개의 서열들 간의 최적의 상동성 절편을 발견한다. 베스트핏 또는 임의의 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들어 95％ 동일한지 여부를 결정하는 경우, 동일성 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되도록, 그리고 기준 서열 내의 뉴클레오티드의 전체 개수의 5％까지의 상동성에서의 갭이 허용되도록 파라메터들이 설정된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 양쪽 모두에서의 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 일으키는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 성질 또는 활성을 변경시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 유전자 코드의 동의성으로 인해 침묵 치환에 의해 뉴클레오티드 변이체가 생산된다. 다양한 이유로, 예를 들어, 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (인간 mRNA에서의 코돈을 대장균과 같은 박테리아 숙주가 선호하는 것으로 변화시키기 위해), 폴리뉴클레오티드 변이체가 생산될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간 DLL4에 대한 항체 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 단백질의 구조 또는 기능에 대한 현저한 효과 없이 본 발명의 일부 아미노산 서열이 변할 수 있는 것으로 당업계에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적인 활성을 나타내거나 인간 DLL4 단백질에 대한 항체 또는 이의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변형물을 추가로 포함한다. 이같은 돌연변이체는 결실, 삽입, 역전, 반복 및 유형 치환을 포함한다.
정상적으로는 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학 모이어티를 함유하도록 폴리펩티드 및 유사체가 추가로 변형될 수 있다. 이러한 유도체화 모이어티는 단백질의 가용성, 생물학적 반감기 또는 흡수를 개선시킬 수 있다. 모이어티는 단백질의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 또한 감소시키거나 제거할 수 있다. 이러한 모이어티들에 대한 개관은 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES5 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 발견할 수 있다.
본원에 기술된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 적절한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이러한 서열을 적절한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 것까지에 이른다. 일부 실시양태에서, 당해 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성함으로써 재조합 기술을 사용하여 DNA 서열이 구축된다. 임의로, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 서열이 돌연변이되어, 이의 기능적 유사체가 제공될 수 있다. 예를 들어 [Zoeller et al., Proc. Nat 7. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)] 및 미국 특허 번호 4,588,585 참조.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 당해 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 구축될 것이다. 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하고 당해 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포가 선호하는 코돈을 선별하여 이같은 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 표준 방법을 적용하여 당해 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 역-번역된 유전자를 구축할 수 있다. 추가로, 특정한 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 여러개의 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 결찰시킬 수 있다. 개별적인 올리고뉴클레오티드들은 상보적인 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 전형적으로 함유한다.
일단 어셈블리되면 (합성, 부위-지정 돌연변이유발 또는 또다른 방법에 의해), 특정한 단리된 당해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 벡터 내로 삽입될 것이고, 원하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 적절한 어셈블리를 뉴클레오티드 서열분석, 제한효소 지도작성, 및 적절한 숙주에서의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현에 의해 확인할 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 내의 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 유전자가 작동가능하게 연결되어야 한다.
재조합 발현 벡터를 사용하여 암 줄기 세포 마커 폴리펩티드 융합물을 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시킨다. 재조합 발현 벡터는 암 줄기 세포 마커 폴리펩티드 융합물 또는 생체등가적인(bioequivalent) 유사체를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편이 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 복제가능한 DNA 구축물이다. 전사 단위는, 하기에 상세하게 기술되는 바와 같이, (1) 유전자 발현에서의 조절 역할이 있는 유전자 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적합한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 일반적으로 포함한다. 이같은 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함한다. 숙주 내에서 복제되는 능력 (일반적으로 복제 기원에 의해 부여됨), 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선별 유전자가 추가적으로 혼입될 수 있다. DNA 영역들은 서로 기능적으로 관련되는 경우에 작동적으로 연결된 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현된다면 신호 펩티드 (분리 리더)에 대한 DNA가 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결된 것이거나, 서열의 전사를 제어한다면 프로모터가 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이거나, 또는 번역을 허용하도록 놓인다면 리보솜 결합 부위가 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로, 작동적으로 연결됨은 인접함을 의미하고, 분비성 리더의 경우에는, 인접하고 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다. 효모 발현 시스템에서 사용하기 위한 구조적 요소에는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 별법적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 임의로, 발현된 재조합 단백질로부터 추후에 이러한 잔기가 절단되어, 최종 생성물이 제공될 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 좌우될 것이다. 광범위한 발현 숙주/벡터 조합을 사용할 수 있다. 진핵생물 숙주에 대한 유용한 발현 벡터에는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 박테리아 숙주에 대한 유용한 발현 벡터에는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 대장균으로부터의 플라스미드 (pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체 포함), 더욱 광범위한 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 사상 단일 가닥 DNA 파지가 포함된다.
암 줄기 세포 마커 단백질의 발현에 대한 적절한 숙주 세포에는 적합한 프로모터의 제어 하의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고급 진핵생물 세포가 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 대장균 또는 바실루스(Bacillus)가 포함된다. 고급 진핵생물 세포에는 하기 기술되는 바와 같은 포유류 기원의 확립 세포주가 포함된다. 무세포 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균류, 효모 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 클로닝 및 발현 벡터가 관련된 개시내용이 거명에 의해 본원에 포함되는 [Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., 1985]에 기술되어 있다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현시키는데 또한 유리하게 사용될 수 있다. 포유류 세포에서의 재조합 단백질의 발현을 수행할 수 있는데, 이같은 단백질은 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적합하게 변형되며, 완전하게 기능성이기 때문이다. 적절한 포유류 숙주 세포주의 예로는 [Gluzman, Cell 23:175, 1981]에 기술된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주. 및 L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주가 예를 들어 포함되는, 적합한 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주가 포함된다. 포유류 발현 벡터는 비-전사 요소들 예컨대 복제 기원, 발현될 유전자에 연결된 적절한 프로모터 및 인핸서, 및 5' 또는 3'에 플랭킹된 기타 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종성 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템이 [Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에 검토되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질을 임의의 적절한 방법에 따라 정제할 수 있다. 이같은 표준 방법에는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술이 포함된다. 적합한 친화력 컬럼에 통과시킴으로써 정제를 용이하게 하도록 친화력 태그 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스페라제가 단백질에 부착될 수 있다. 단리된 단백질을 단백질용해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 사용하여 또한 물리적으로 특성화할 수 있다.
예를 들어, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초원심분리 유닛을 사용하여 우선 농축할 수 있다. 농축 단계에 이어서, 농축물을 적절한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 별법적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기가 매달려있는 매트릭스 또는 기판을 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에서 통상적으로 사용되는 기타 유형의 매트릭스일 수 있다. 별법적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적절한 양이온 교환체에는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 포함된다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 메틸 또는 기타 지방족 기가 매달려 있는 실리카 젤을 사용하는 1회 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 사용하여 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기 정제 단계들 중 일부 또는 전체가 다양하게 조합되어 또한 사용될 수 있다.
박테리아 배양에서 생산된 재조합 단백질은, 예를 들어, 세포 펠렛으로부터의 초기 추출에 이은 1회 이상의 원심분리, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 사용된 미생물 세포를 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용이 포함되는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 사용하여 암 줄기 세포 마커를 발현하는 종양발생성 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 종양발생성 세포의 성장을 억제하는 방법은 시험관 내에서 세포를 암 줄기 세포 마커에 대한 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 무한증식 세포주 또는 암 세포주를 발현된 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 첨가된 배지에서 배양하여, 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 종양 줄기 세포를 포함하는 종양 세포를 샘플, 예를 들어, 종양 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 첨가된 배지에서 배양하여, 세포 성장을 억제한다.
일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 종양발생성 세포의 성장을 억제하는 방법은 생체 내에서 세포를 암 줄기 세포 마커에 대한 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양발생성 세포와 암 줄기 세포 마커에 대한 항체의 접촉이 동물 모델 내에서 착수된다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 이종이식편을 면역손상 마우스 (예를 들어 NOD/SCID 마우스)에서 성장시키고, 여기에 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 투여하여, 종양 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커를 발현하는 암 줄기 세포를 환자 샘플, 예를 들어, 종양 생검, 흉막 삼출액 또는 혈액 샘플로부터 단리하여, 면역손상 마우스 내로 주사한 후, 마우스에게 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 투여하여 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 동물 내로 종양발생성 세포를 도입하는 것과 동시에 또는 도입 직후에 투여하여, 종양 성장을 방지한다. 일부 실시양태에서, 종양발생성 세포가 지정된 크기로 성장된 후 치료제로서 암 줄기 세포 마커에 대한 항체가 투여된다.
본 발명은 암 줄기 세포 마커를 표적으로 하는 항체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 제약 조성물은 인간 환자에서 종양 세포 성장을 억제하고 암을 치료하는데 사용된다.
정제된 본 발명의 항체를 제약상 허용가능한 비히클 (예를 들어, 담체, 부형제)와 조합함으로써 보관 및 사용을 위해 제형이 제조된다 ([Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000]). 적절한 제약상 허용가능한 비히클에는 비-독성 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 염 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 탄수화물 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위한 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 투여 (예컨대 질 및 직장 전달이 포함되는 점막 투여) 예컨대 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적물, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말; 폐 투여 (예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 투여 (분무기에 의한 것 포함); 기관내, 비내, 표피 및 경피); 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입이 포함되는 비경구 투여; 또는 두개내 투여 (예를 들어, 수막강내 또는 뇌실내)일 수 있다.
치료 제형은 단위 투약형일 수 있다. 이같은 제형에는 경구, 비경구 또는 직장 투여 또는 흡입에 의한 투여를 위한 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 내의 용액 또는 현탁액, 또는 좌약이 포함된다. 정제와 같은 고체 조성물에서, 주요 활성 성분이 제약 담체와 혼합된다. 통상적인 정제제조용 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 본 발명의 화합물 또는 이의 비-독성인 제약상 허용가능한 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성하기 위한 기타 희석제 (예를 들어, 물)를 포함한다. 그후, 고체 예비제형 조성물을 상기 기술된 유형의 단위 투약형으로 세분한다. 장기 작용의 장점을 제공하는 투약형을 제공하기 위해 신규 조성물의 정제, 알약 등이 코팅되거나 또는 다른 방식으로 조제될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약이 외부 성분으로 덮인 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 붕해를 저지하는 작용을 하고, 내부 성분이 손상되지 않고 위를 통과하도록 하거나 이의 방출이 지연되도록 하는 장용성 층에 의해 2개의 성분이 분리될 수 있다. 다양한 물질들이 이같은 장용성 층 또는 코팅물용으로 사용될 수 있고, 이같은 물질에는 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물이 포함된다.
제약 제형은 리포솜 ([Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545)과 복합체를 형성한 본 발명의 항체를 포함한다. 순환 시간이 강화된 리포솜이 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다. 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발 방법에 의해 일부 리포솜이 생성될 수 있다. 규정된 세공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경의 리포솜이 산출된다.
[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기술된 바와 같이, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 항체가 또한 포획될 수 있다.
또한, 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
일부 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체 및 화학요법제 또는 여러 상이한 화학요법제들의 칵테일의 조합 투여를 수반한다. 항체로의 치료는 화학요법의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 이에 이어서 일어날 수 있다. 본 발명에서 구현되는 화학요법에는 당업계에 공지되어 있고 시판되는 화학 물질 또는 약물, 예컨대 독소루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴 및 카르보플라틴이 포함된다. 조합 투여는 단일 제약 제형으로의 투여 또는 별도의 제형들을 사용하는 공동-투여, 또는 임의의 순서이지만 모든 활성 작용제들이 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘할 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이같은 화학요법제들의 제조 및 투약 스케쥴은 제조업자의 지침서에 따라 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정되는 바와 같이 사용될 수 있다. 이같은 화학요법의 제조 및 투약 스케쥴은 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)]에 또한 기술되어 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체 및 제2 치료제의 조합 투여를 수반한다. 본원에서 사용된 "제2 치료제"에는 화학요법제, 방사선 요법, 사이토카인 및 또다른 종양 관련 항원에 대한 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
또다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체 및 방사선 요법의 조합 투여를 수반한다. 항체로의 치료는 방사선 요법의 투여 전에, 이와 동시에, 또는 이에 이어서 일어날 수 있다. 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 이같은 방사선 요법에 대한 임의의 투약 스케쥴을 사용할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체와 추가적인 종양 관련 항원에 대한 또다른 항체의 조합 투여를 수반할 수 있고, 상기 항체에는 EGF 수용체 (EGFR) (Erbitux®), erbB2 수용체 (HER2) (Herceptin®), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (Avastin®)에 결합하는 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 치료는 하나 이상의 사이토카인의 투여를 포함할 수 있고, 암세포의 수술적 제거 또는 치료 의사가 필요한 것으로 생각하는 임의의 기타 치료법을 동반할 수 있다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적합한 투여량은 치료 의사의 재량으로 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 응답성, 환자에게 치료 목적 또는 예방 목적으로 투여되는지 여부, 기존의 치료법, 환자의 임상 병력 등에 좌우된다. 항체는 한번에 또는 수일에서 수개월까지 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 질환 상태의 축소 (예를 들어 종양 크기에서의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투약 스케쥴은 환자의 신체 내에서의 약물 축적의 측정치로부터 계산될 수 있고, 개별적인 항체의 상대적인 효능에 따라 변할 것이다. 투여 의사는 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복율을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 0.01 ㎍ 내지 100 ㎎일 수 있고, 하루에, 매주, 매달 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 치료 의사는 체액 또는 조직 내의 약물의 측정된 체류 시간 및 농도를 기초로 투약을 위한 반복율을 추정할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 항체를 포함하고 본원에 기술된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 컨테이너 내에 하나 이상의 정제된 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 모든 대조군, 분석법을 수행하기 위한 지침서, 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어가 포함되는, 검출 분석법을 수행하는데 필요하고/하거나 충분한 성분들을 모두 함유한다. 개시된 본 발명의 항체가 당업계에 주지된 확립된 키트 포맷들 중 하나 내로 쉽게 혼입될 수 있다는 것을 당업자는 쉽게 인식할 것이다.
본 발명의 실시양태들은 본 발명의 항체의 제조 및 본 발명의 항체의 사용 방법이 상세하게 기술된 하기의 실시예를 참조로 추가로 정의될 수 있다. 물질 및 방법 양쪽 모두에 대한 다수의 변형이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 가능한 경우에는 언제나, 동일하거나 유사한 부분을 지칭하도록 동일한 참조 번호가 도면 전반에 걸쳐 사용될 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형태의 정관사 및 부정관사는 문맥적으로 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 복수의 이같은 항체 또는 당업자에게 공지된 하나 이상의 항체 또는 이의 등가물을 포함한다. 또한, 명세서에서 사용된, 성분들의 양, 반응 조건, 순도, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 길이 등을 나타내는 모든 숫자들은 달리 지시되지 않는 한 용어 "약"으로 수식된다. 따라서, 명세서 및 청구항에 기재된 수적 파라메터들은 본 발명의 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사값이다.
실시예 1: 모노클로날 및 인간화 DLL4 항체의 생산
항원 생산
인간 DLL4의 세포외 도메인의 재조합 폴리펩티드 단편이 항체 생산을 위한 항원으로서 생성되었다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 DLL4 (서열 25)의 아미노산 1-522를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리하였다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 인-프레임 N-말단에서 인간 Fc-태그 또는 히스티딘-태그에 결찰시키고, 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 매개 발현을 위한 전달 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 표준 형질감염, 감염, 및 세포 배양 프로토콜을 사용하여, 상응하는 DLL4 폴리펩티드를 발현하는 재조합 곤충 세포를 생산하였다 ([O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]).
절단 예측 소프트웨어 SignalP 3.0을 사용하여 인간 DLL4의 내인성 신호 서 열의 절단을 추정하였지만, 실제 생체내 절단점은 어느 한쪽 방향으로든 두서너개의 아미노산만큼 다를 수 있다. DLL4의 예측된 절단은 아미노산 1 내지 26 사이이고, 따라서 DLL4 항원 단백질은 대략 아미노산 27 내지 아미노산 522을 포함한다. 항원 단백질을 곤충 세포 컨디셔닝 배지로부터 단백질 A 및 Ni++-킬레이트 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 항원 단백질을 PBS (pH=7)에 대해 투석하고, 약 1 mg/㎖로 농축하고, 면역화용 제제로 멸균 여과하였다.
면역화
표준 기술을 사용하여 마우스 (n=3)를 정제된 DLL4 항원 단백질 (Antibody Solutions; Mountain View, CA)로 면역화시켰다. 개별적인 마우스로부터의 혈액을 ELISA 및 FACS 분석 (하기에 상세하기 기술됨)을 사용하여 항원 인식에 대해 초기 면역화 약 70일 후에 스크리닝하였다. 항체 역가가 가장 높은 2마리의 동물을 최종 항원 부스트(boost)용으로 선별한 후, 지라 세포를 하이브리도마 생산을 위해 단리하였다. 하이브리도마 세포를 1개의 세포/웰로 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 각각의 웰로부터의 상등액을 ELISA 및 FACS 분석에 의해 항원 단백질에 대해 스크리닝하였다. 항체 역가가 높은 여러 하이브리도마들을 선별하여, 정치 플라스크 배양으로 규모를 증진시켰다. 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 상등액으로부터 항체를 정제하였다. 정제된 모노클로날 항체를 FACS로 다시 테스트하고, 이소타입을 결정하여 IgG 및 IgM 항체를 선별하였다.
FACS 분석
천연 세포-표면 DLL4 단백질을 인식하는 하이브리도마 클론에 의해 생산된 모노클로날 항체를 선별하기 위해, FACS 분석을 사용하였다. HEK293 세포를 DLL4의 전장 cDNA 클론 및 형질감염 마커 GFP를 코딩하는 발현 벡터들로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 24시간 내지 48시간 후, 세포를 현탁액으로 수집하고, 얼음 상에서 항-DLL4 항체 또는 배경 항체 결합을 검출하기 위한 대조군 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세정하고, 1차 항체를 형광 발색단에 접합된 항-마우스 2차 항체로 검출하였다. 그후, 표지된 세포를 FACS에 의해 분류하여, 천연 세포-표면 DLL4 단백질의 세포 표면 발현을 특이적으로 인식하는 항-DLL4 항체를 확인하였다. 모노클로날 항체 21M14 및 21M18가 형질감염된 세포 상의 DLL4를 인식하였다 (도 1). 뮤린 항체 21M18는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) (번호 X)에 기탁되었다.
이어서, DLL4와 노치 간의 상호작용을 방해하는 DLL4에 대해 지시된 항체의 능력을 흐름 세포측정을 사용하여 결정하였다. DLL4 cDNA가 안정적으로 형질도입된 HEK 293 세포를 항-DLL4 또는 대조군 항체의 존재 하에 노치1-EGF10-15-Fc 또는 대조군 단백질-Fc와 함께 인큐베이션하였다. DLL4를 발현하는 세포에 대한 Fc 융합 단백질의 결합을 PE-접합 염소 항-Fc 항체 및 흐름 세포측정에 의해 검출하였다. 이렇게 하여, 노치가 DLL4에 결합하는 것을 억제하는 항-DLL4 항체의 능력을 형광 강도에서의 감소에 의해 결정하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이, 노치 결합의 억제가 뮤린 항체 21M14 및 21M18에서는 관찰되었지만, 21M12에서는 관찰되지 않았다. 또한, 뮤린 21M18은 인간 DLL4에 특이적으로 결합하였지만 뮤린 DLL4에는 그렇지 않았고, 노치1을 발현하는 세포에 대한 인간 DLL4의 결합을 차단하였지만, 뮤린 DLL4 결합은 그렇지 않았다 (도 2B). 이러한 데이터는 이종이식편 실험에서의 21M18이 종양 세포 상에서 발현된 인간 DLL4를 표적으로 하고 혈관 상에서 발현된 뮤린 DLL4는 표적으로 하지 않는다는 것을 가리킨다.
에피토프 지도작성
DLL4 세포외 도메인의 특정 영역을 인식하는 항체를 확인하기 위해, 에피토프 지도작성을 수행하였다. Fc 단백질에 융합된 DLL4의 세포외 도메인의 네스티드(nested) 시리즈의 결실 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 CMV 프로모터를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 벡터가 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되었다. Fc 단백질에 융합된 인간 및 마우스 DLL4의 키메라인 DLL4의 단편을 코딩하는 추가적인 구축물이 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 또한 생성되었다. 특정 아미노산 치환을 포함하는 추가적인 시리즈의 DLL4-fc 융합 단백질들을 디자인하였다. 이러한 재조합 융합 단백질들을 일시적으로 형질감염된 HEK 293 세포에서 발현시켰고, 이로부터 ELISA를 위해 형질감염 24시간 내지 48시간 후에 컨디셔닝 배지를 수집하였다. DLL4 융합 단백질 단편을 항-인간 Fc 항체로 코팅된 플레이트 상에 포획하였다. 그후, 결합된 DLL4 단편과 항-DLL4 항체가 상호작용하도록 하고, HRP 접합 항-마우스 항체와의 후속 인큐베이션 및 HRP 활성의 검출에 의해 결합을 측정하였다 (도 3A). 도 3에 나타난 바와 같이, 모노클로날 뮤린 항체 21M14 및 21M18는 DLL4의 아미노산 1-217 내에 함유된 에피토프를 인식하였다. 이 러한 영역은 여러 노치 리간드에 존재하는 "DSL (델타/세레이트(Serrate)/lag-2)" 도메인으로 칭해지는 모티프를 함유한다 ([Tax et al., 1994, Nature 368:150-4]). 추가적으로, 항-DLL4 mAb를 웨스턴 블롯 분석에 의해 DLL4 융합 단백질 단편에의 결합에 대해 시험하였다 (도 3B). 이러한 작업은 아미노산 155-217 내에 존재하는 DSL 도메인의 존재 하에 아미노산 1-154 내의 DLL4에 대한 21M18의 인간 특이적 결합을 증명하였다. 이는 DLL4 기능에 대한 이러한 N-말단 서열의 기존에 인정되지 않은 중요성을 증명하였다. 이러한 작업이 개략적인 형태로 요약되고 (도 3C), 이때 21M18 결합 또는 결합 결여는 각각 "+" 또는 "-"로 표시된다. 인간 DLL4 아미노산을 상응하는 뮤린 아미노산으로 바꾸는 특정 아미노산 치환을 함유하는 일련의 DLL4 단백질 단편 (DLL4dom1-6)에 대한 21M18의 결합을 시험함으로써 21M18의 결합을 추가로 특성화였다. 이러한 융합 단백질들을 21M18에의 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 제시된 바와 같이 여러 위치들이 21M18 결합에 중요한 것으로 확인되었다 (도 3D). 21M18은 아미노산 68, 69, 및 71 (발린, 발린, 및 프롤린의 교체) 또는 아미노산 142 및 144 (라이신 및 알라닌의 교체)에서의 치환이 있는 DLL4 단백질 단편에 대한 손상된 결합을 나타냈다. 반면에, 별개의 항체 21M21은 DSL 영역 내에 함유된 에피토프에 결합하였지만 (도 3E), 이러한 항체는 도 6에 나타난 바와 같이 DLL4 기능에 영향을 미치지 않았고, 이는 DSL에 대한 결합이 기능성 항체를 예보하지 않음을 나타낸다.
키메라 항체
DLL4를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체가 확인된 후, 설치류 항체가 치료제로서 사용될 때의 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 면역 응답을 극복하기 위해 이러한 항체를 변형시켰다. 특정 실시양태에서, 선별된 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 RT-PCR에 의해 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 포유류 발현 벡터 내의 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 인-프레임으로 각각 결찰시켰다. 별법적으로, 동일한 플라스미드 상에 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 함유하는 인간 Ig 발현 벡터 예컨대 TCAE 5.3가 사용되었다 ([Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66:4137-42]). 그후, 키메라 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터들을 키메라 항체 생산을 위해 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 공동-형질감염시켰다. 키메라 항체의 면역반응성 및 친화력을 ELISA 및 FACS에 의해 어버이 뮤린 항체와 비교하였다.
인간화 항체
특정 실시양태에서, DLL4에 대한 인간화 항체가 생성되었다. 본질적으로 [Larrick, J.M., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250] 및 [Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9: 88]에 기술된 바와 같이 축퇴성 PCR을 사용하여 뮤린 모노클로날 항체 21M18의 가변 도메인을 하이브리도마 세포주로부터 단리하여 서열 분석하였다. 그후, 어버이 21M18 항체 아미노산 서열과 구조적으로 유사할 것 같은 인간 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역을 인간화를 위한 인간 프레임워크 영역으로 선택하였다. 후보 인간 프레임워크 영역을 확인하기 위해, 진뱅크(Genbank)에 기탁된 인간 서열에 대한 BLAST 검색을 사용하여 21M18의 VH 및 VL 뮤린 가변 도메인에 의해 코딩되는 예상 단백질 서열을 발현된 인간 cDNA에 의해 코딩되는 인간 항체 서열과 비교하였다. 이러한 방법을 사용하여, 발현된 인간 cDNA 서열 (예를 들어 진뱅크 AY393019, DC295533)을 중쇄 프레임워크의 디자인에서 추가적인 분석을 위해 선별하였다.
후보 인간화 프레임워크 중쇄와 어버이 뮤린 모노클로날 항체 21M18 중쇄 간의 아미노산 차이를 가능한 중요성에 대해 평가하였고, 위치에서의 각각의 차이가 21M18 항체의 정확한 폴딩에 기여하는지 여부에 관하여 판단하였다. 또다른 항체 단편의 해석된 결정 구조 (예를 들어, [Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55:122-28]에 기술된 바와 같은 fab 2E8의 구조)의 조사가 이러한 분석의 지표가 되었다. Jmol, 퀵(quick) PDB3 및 Pymol이 포함되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 구조를 모델링하였다. β-시트 프레임워크의 포장, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들 간의 상호작용, 아미노산 측쇄의 용매 노출 정도, 및 아미노산이 CDR 루프의 위치결정에 영향을 미칠 가능성에 대한 소정의 위치에서의 아미노산의 잠재적인 영향이 고려되었다. 이러한 분석으로부터, 인간 IgG2 불변 영역에 인-프레임으로 융합된 5개의 후보 VH 사슬이 화학적으로 합성되었다. 후보 중쇄는 i) 21M18 결합 기능에 대한 가능한 영향의 분석을 기초로 합성 프레임워크 내에 선별된 치환을 함유하는 기능성 인간 프레임워크 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 1, 2, 및 5)를 포함하였다.
유사하게, 선별된 인간 프레임워크 IGK(V)4-1 경쇄와 어버이 뮤린 모노클로 날 항체 21M18 경쇄 간의 아미노산 차이를 확인한 후, 위치에서의 각각의 차이가 21M18 항체의 정확한 폴딩에 기여하는지 여부에 관하여 판단하였다. 이러한 분석으로부터, 5개의 후보 VL 사슬이 화학적으로 합성되었다. 첫번째 후보 경쇄는 i) 완전한 IGK(V)4-1 인간 프레임워크 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 9, 10, 및 11)을 포함하였다. 4개의 추가적인 후보 경쇄는 i) 프레임워크 영역 내에 유지된 21M18 뮤린 잔기의 개수가 증가성인 IGK(V)4-1 인간 프레임워크 영역 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 9, 10, 및 11)을 포함하였다.
각각의 후보 변이체 인간화 중쇄 및 경쇄의 기능성을 포유류 세포 내로의 공동-형질감염에 의해 테스트하였다. 상기 기술된 5개의 후보 인간화 21M18 중쇄 각각을 뮤린 21M18 경쇄 cDNA와 함께 HEK 293 세포 내로 공동-형질감염시키고, 컨디셔닝 배지를 DLL4 항원 결합 활성에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 가장 강건한 결합을 나타내는 21M18 중쇄 변이체를 선별하였다. 이러한 변이체 ("21M18 H2")는, 뮤린 CDR에 더하여, Vh 프레임워크 내의 6개의 프레임워크 위치인 카밧 위치 16, 20, 27, 28, 38, 및 48에서의 치환을 함유하였다 (도 4A). 그후, 21M18 H2 인간화 중쇄를 5개의 후보 인간화 경쇄 각각과 함께 HEK293 세포 내로 공동-형질감염시키고, 다시 컨디셔닝 배지를 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 단일 경쇄 변이체가 다른 후보들보다 양호한 결합을 나타내는 것으로 발견되었다 - 카밧 위치 22 및 36에서 뮤린 잔기가 유지된 "21M18 L2" (도 5).
이어서, CDR2 H2 (서열 2) 내의 단리된 시스테인 잔기를 변경시켰다. 구체 적으로, 카밧 위치 52a에서의 시스테인 잔기가 세린 잔기 (변이체 H7; 서열 3) 또는 발린 잔기 (변이체 H9; 서열 4)로 변형된 H2의 2개의 중쇄 변이체를 합성하였다. 이러한 중쇄들을 HEK293 세포 내로 L2와 함께 공동-형질감염시키고, 컨디셔닝 배지를 다시 분석하였다. 변이체 양쪽 모두 (21M18 H7L2 및 21M18 H9L2)가 ELISA에 의해 특이적 항원 결합을 나타냈다. 따라서, 21M18 중쇄 CDR2는 카밧 위치 52a에서의 잔기가 시스테인, 세린, 또는 발린 잔기를 포함하는 서열 2, 3, 또는 4를 포함하였다.
특정 실시양태에서, DLL4에 대한 인간화 항체가 생성되었다. 본질적으로 [Larrick, J.M., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250] 및 [Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9: 88]에 기술된 바와 같이 축퇴성 PCR을 사용하여 뮤린 모노클로날 항체 21M18의 가변 도메인을 하이브리도마 세포주로부터 단리하여 서열 분석하였다. 그후, 어버이 21M18 항체 아미노산 서열과 가장 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역을 인간화를 위한 인간 프레임워크 영역으로 선택하였다. 가장 유사한 인간 프레임워크 영역을 확인하기 위해, 진뱅크에 기탁된 인간 게놈 서열에 대한 BLAST 검색을 사용하여 21M18의 VH 및 VL 뮤린 가변 도메인에 의해 코딩되는 예상 단백질 서열을 인간 게놈에 의해 코딩되는 Ig 가변 도메인과 비교하였다. 이러한 방법을 사용하여, IGH(V)1-18을 인간 중쇄 프레임워크 영역으로 선택하였고, IGK(V)4-1을 인간 경쇄 프레임워크 영역으로 선택하였다.
선택된 인간 프레임워크 IGH(V)1-18 중쇄와 어버이 뮤린 모노클로날 항체 21M18 중쇄 간의 아미노산 차이를 확인한 후, 위치에서의 각각의 차이가 21M18 항체의 정확한 폴딩에 기여하는지 여부에 관하여 판단하였다. 또다른 항체 단편의 해석된 결정 구조 (예를 들어, [Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55:122-28]에 기술된 바와 같은 fab 2E8의 구조)의 조사가 이러한 분석의 지표가 되었다. Jmol, 퀵 PDB3 및 Pymol이 포함되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 구조를 모델링하였다. β-시트 프레임워크의 포장, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들 간의 상호작용, 아미노산 측쇄의 용매 노출 정도, 및 아미노산이 CDR 루프의 위치결정에 영향을 미칠 가능성에 대한 소정의 위치에서의 아미노산의 잠재적인 영향이 고려되었다. 이러한 분석으로부터, 인간 IgG2 불변 영역에 인-프레임으로 융합된 5개의 후보 VH 사슬이 화학적으로 합성되었다. 첫번째 후보 중쇄는 i) 완전한 IGH(V)1-18 인간 프레임워크 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 1, 2, 및 5)을 포함하였다. 4개의 추가적인 후보 중쇄는 i) 프레임워크 영역 내에 유지된 21M18 뮤린 잔기의 개수가 증가성인 IGH(V)1-18 인간 프레임워크 영역 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 1, 2, 및 5)을 포함하였다.
유사하게, 선별된 인간 프레임워크 IGK(V)4-1 경쇄와 어버이 뮤린 모노클로날 항체 21M18 경쇄 간의 아미노산 차이를 확인한 후, 위치에서의 각각의 차이가 21M18 항체의 정확한 폴딩에 기여하는지 여부에 관하여 판단하였다. 이러한 분석으로부터, 5개의 후보 VL 사슬이 화학적으로 합성되었다. 첫번째 후보 경쇄는 i) 완전한 IGK(V)4-1 인간 프레임워크 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 9, 10, 및 11)을 포함하였다. 4개의 추가적인 후보 경쇄는 i) 프레임워크 영역 내에 유지된 21M18 뮤린 잔기의 개수가 증가성인 IGK(V)4-1 인간 프레임워크 영역 및 ii) 어버이 21M18 뮤린 항체 CDR (서열 번호 9, 10, 및 11)을 포함하였다.
각각의 후보 변이체 인간화 중쇄 및 경쇄의 기능성을 포유류 세포 내로의 공동-형질감염에 의해 테스트하였다. 상기 기술된 5개의 후보 인간화 21M18 중쇄 각각을 뮤린 21M18 경쇄 cDNA와 함께 HEK 293 세포 내로 공동-형질감염시킨 후, 컨디셔닝 배지를 DLL4 항원 결합 활성에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 가장 강건한 결합을 나타내는 21M18 중쇄 변이체를 선별하였다. 이러한 변이체 ("21M18 H2")는, 뮤린 CDR에 더하여, 카밧 위치 20, 28, 38, 48 및 69의 5개의 프레임워크 위치에서 뮤린 잔기를 함유하였다 (도 4). 그후, 21M18 H2 인간화 중쇄를 5개의 후보 인간화 경쇄 각각과 함께 HEK293 세포 내로 공동-형질감염시키고, 다시 컨디셔닝 배지를 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 단일 경쇄 변이체가 다른 후보들보다 양호한 결합을 나타내는 것으로 발견되었다 - 카밧 위치 22 및 36에서 뮤린 잔기가 유지된 "21M18 L2" (도 5).
이어서, CDR2 H2 (서열 2) 내의 단리된 시스테인 잔기를 변경시켰다. 구체적으로, 카밧 위치 52a에서의 시스테인 잔기가 세린 잔기 (변이체 H7; 서열 3) 또는 발린 잔기 (변이체 H9; 서열 4)로 변형된 H2의 2개의 중쇄 변이체를 합성하였다. 이러한 중쇄들을 HEK293 세포 내로 L2와 함께 공동-형질감염시키고, 컨디셔닝 배지를 다시 분석하였다. 변이체 양쪽 모두 (21M18 H7L2 및 21M18 H9L2)가 ELISA 에 의해 특이적 항원 결합을 나타냈다. 따라서, 21M18 중쇄 CDR2는 카밧 위치 52a에서의 잔기가 시스테인, 세린, 또는 발린 잔기를 포함하는 서열 2, 3, 또는 4를 포함하였다.
그후, 인간화 21M18 항체를 추가로 특성화하였다. 구체적으로, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 인간화 21M18 항체의 결합 친화력을 Biacore를 사용하여 결정하였다. 친화력은 21M18 변이체 H2L2에 대해 약 0.33 nM인 것으로 결정되었다.
인간화 21M18 항체가 ATCC에 기탁되었다 (21M18 H9L2, ATCC 기탁 번호 PTA-8427 및 21M18 H7L2, ATCC 기탁 번호 PTA-8425; 2007년 5월 10일 기탁됨).
인간 항체
일부 실시양태에서, DLL4의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 인간 항체가 파지 디스플레이 기술을 사용하여 단리되었다. 인간 항체 가변 도메인들을 함유하는 합성 항체 라이브러리를 상기 기술된 DLL4 항원의 특이적 및 고-친화력 인식에 대해 스크리닝하였다. 라이브러리 내의 CDR 카셋트를 항체 최적화를 위해 독특한 플랭킹 제한 부위를 통해 특이적으로 교환하였다. 그후, 최적화된 인간 가변 영역들을 포유류 CHO 세포에서의 인간 항체의 발현을 위해 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 함유하는 Ig 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
실시예 2: DLL4에 대한 항체를 평가하기 위한 시험관내 분석법
본 실시예는 세포 증식, 노치 경로 활성화, 및 세포독성에 대한 DLL4에 대해 생성된 항체의 활성을 테스트하기 위한 대표적인 시험관내 분석법을 기술한다.
증식 분석법
여러 암 세포주에 의한 DLL4의 발현을 Taqman 분석을 사용하여 정량하였다. DLL4를 발현하는 것으로 확인된 세포주를 104개의 세포/웰로 96웰 조직 배양 마이크로플레이트에 플레이팅하고, 24시간 동안 확산시켰다. 이어서, 세포들을 추가로 12시간 동안 2％ FCS가 있는 신선한 DMEM에서 배양한 후, 항-DLL4 항체 대 대조군 항체를 10 μM/ℓ BrdU의 존재 하에 배양 배지에 첨가하였다. BrdU 표지화에 이어서, 배양 배지를 제거하고, 세포를 실온에서 30분 동안 에탄올 내에 고정시키고, 90분 동안 과산화효소가 접합된 모노클로날 항-BrdU 항체 (클론 BMG 6H8, Fab 단편)와 반응시켰다. 테트라메틸벤지딘을 함유하는 용액에서 기질을 발색시키고, 15분 후 25 ㎕의 1 M/ℓ H2SO4로 정지시켰다. 발색 반응을 450 nm 필터를 사용하는 자동 ELISA 플레이트 판독기로 측정하였다 (UV Microplate Reader; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). 모든 실험을 삼중으로 수행하였다. 대조군 항체와 비교하여 세포 증식을 억제하는 항-DLL4 항체의 능력이 결정되었다.
경로 활성화 분석법
특정 실시양태에서, 노치 신호전달 경로의 활성화를 차단하는 DLL4에 대한 항체의 능력을 시험관 내에서 결정하였다. 항생제 및 10％ FCS가 보충된 DMEM에서 배양된 HeLa 세포를 1) DLL4 리간드에 응답한 노치 신호전달 수준을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 상류의 Hes1 프로모터를 함유하는 Hes1-Luc 리포터 벡터 ([Jarriault et al., 1995, Nature 377:355-8]) 및 2) 형질감염 효율에 대한 내부 대조군으로서의 레닐라 루시페라제 리포터 (Promega; Madison, WI)로 공동-형질감염시켰다. 그후, 형질감염된 세포를 10 ㎍/㎖ DLL4-Fc 단백질로 하룻밤 동안 코팅된 배양 플레이트에 첨가하였다. 그후, DLL4에 대한 항체를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 형질감염 48시간 후, 루시페라제 수준을 이중 루시페라제 분석 키트 (Promega; Madison, WI)를 사용하여 측정하였고, 이때 반딧불이 루시페라제 활성이 레닐라 루시페라제 활성에 대해 표준화되었다. 이렇게 하여 DLL4에 의해 유도된 노치 경로 활성화를 억제하는 항체의 능력이 결정되었다. 노치 경로 활성화의 DLL4 활성화의 억제가 항-DLL4 뮤린 항체 21M14 및 21M18로 관찰되었다 (도 6). 반면에, DLL4의 DSL 도메인에 결합하였음에도 불구하고 (도 3E), 항-DLL4 항체 21M21은 노치 결합을 억제하지 않았다 (도 6) .
특정 실시양태에서, 하류 유전자 활성화를 조정하는 항-DLL4 항체의 능력을 결정하였다. 뮤린 21M18 항체로 처리된 동물로부터의 C8 결장 종양 세포 (하기에 상세하게 기술됨)를 단리하고, 노치 경로 유전자 HES1 및 ATOH-1의 발현을 RT-PCR에 의해 결정하였다. 종양 조직으로부터의 전체 RNA를 제조업자의 지침서에 따라 <RNeasy Fibrous Tissue> 키트 (Qiagen, Valencia, CA)로 단리하였다. RNA 샘플의 품질을 260 nm/280 nm 비율에 의해 결정하였다. RNA 샘플의 분취량을 브롬화에티듐 (EtBr)로 염색된 변성 아가로스 젤 상에 러닝시킴으로써 RNA의 완전성을 결정하였다. 젤 상의 28s rRNA 대 18s rRNA의 비율을 FC 소프트웨어와 함께 배달되는 FluorChem 카메라로 가시화시켰다. RNA 샘플을 RNase가 없는 물에서 용출시키고, -80℃에서 보관하였다. 3'-TAMRA FAM (6-카르복시플루오레세인) 리포터 염료 및 3'-TAMRA (6-카르복시-테트라메틸로다민)을 함유하는 이중-형광 비-확장성 프로브로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 역전사효소, 1× Tagman 완충제 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 프라이머/프로브 혼합물을 함유하는 25 ㎕의 최종 부피로 100 ㎍의 전체 RNA를 실시간 PCR용으로 사용하였다. <ABI 7900 HT Fast Real Time PCR System> (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 반응을 수행하였다: 48℃에서 30분, 95℃에서 10분, 및 40 사이클의 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분. SDS2.3 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 결과를 분석하였다. 모든 프라이머 및 프로브 셋트는 Applied Biosystems (Foster City, CA)에서 수득하였다. 표적 유전자의 발현 수준이 살림 유전자 Gus B의 발현 수준에 대해 표준화되었고, 상대적인 양으로 표현되었다. 항-DLL4 뮤린 21M18 항체로의 처리는 대조군으로 처리된 종양과 비교하여 HES1의 발현을 감소시켰고 ATOH-1의 발현을 증가시켰다 (도 7A).
일부 실시양태에서, 시험관 내에서 종양발생성 세포를 유지시키는 것으로 공지된 배양 조건을 사용하여 마우스 계통-결핍 OMP-C11 종양 세포 콜로니가 확립되었다. 이러한 종양 세포 콜로니에 10 ㎍/㎖ 뮤린 21M18 또는 5 μM 감마-시크리타제 억제제 (GSI; 즉 DBZ)의 존재 또는 부재 하에 인간 DLL4가 없는 3T3 세포 (3T3) 또는 세포 표면 상에 과발현된 인간 DLL4를 포함하는 3T3 세포 (DLL4)를 오버레이시켰다. 오버레이 대조군이 또한 포함되었다. 3T3-DLL4 세포는 HES1을 유도하고 ATOH1 유전자 발현을 억제한 반면 (HES1:ATOH1의 비율로 나타남), 21M18 또는 GSI 단독은 DLL4-유도 노치 표적 유전자 변화를 억제하였다.
보체-의존적 세포독성 분석법
특정 실시양태에서, 단리된 DLL4를 발현하는 암 세포주 또는 면역손상 마우스 (하기에 상세하게 기술됨)에서 이종이식편으로 계대된 환자 샘플로부터 암 줄기 세포를 사용하여, DLL4에 대한 항체에 의해 매개되는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 측정하였다. 세포를 항생제 및 5％ FBS가 보충된 RPMI 1640 배양 배지 200 ㎕에 106개의 세포/㎖로 현탁시켰다. 그후, 현탁된 세포를 DLL4에 대한 항체 또는 대조군 항체와 함께 200 ㎕ 혈청 또는 열-불활성화 혈청과 삼중으로 혼합하였다. 세포 혼합물을 1 내지 4시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 그후, 처리된 세포를 수집하고, 배양 배지에 희석된 100 ㎕ FITC-표지 아넥신 V에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. HBSS에 희석된 요오드화프로피듐 용액 (25 ㎍/㎖) 100 ㎕를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 배양 배지에 재현탁시키고, 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. FITC 염색 세포의 흐름 세포측정은 전체 세포 카운트를 제공하였고, 전체 세포 개수의 백분율로서의 죽은 세포에 의한 요오드화프로피듐 흡수를 사용하여, 열-불활성화 혈청 및 대조군 항체와 비교하여 혈청 및 DLL4에 대한 항체의 존재 하에서의 세포 사망을 측정하였다. 이렇게 하여 보체-의존적 세포독성을 매개하는 항-DLL4 항체의 능력이 결정되었다.
항체-의존적 세포형 세포독성 분석법
특정 실시양태에서, 단리된 DLL4를 발현하는 암 세포주 또는 면역손상 마우스 (하기에 상세하게 기술됨)에서 이종이식편으로 계대된 환자 샘플로부터 암 줄기 세포를 사용하여, DLL4에 대한 항체에 의해 매개되는 항체 의존적 세포형 세포독성 (ADCC)을 측정하였다. 세포를 항생제 및 5％ FBS가 보충된, 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배양 배지 200 ㎕에 106개의 세포/㎖로 현탁시켰다. 이펙터 세포로 사용하기 위해 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 헤파린처리된 말초혈로부터 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 그후, 하나 이상의 DLL4 항체 또는 대조군 항체의 존재 하에 96웰 플레이트에서 표적 세포 (T)를 PBMC 이펙터 세포 (E)와 25:1, 10:1, 및 5:1의 E/T 비율로 혼합하였다. 대조군은 항체의 존재 하에서의 표적 세포 단독 배양 및 이펙터 세포 단독 배양을 포함하였다. 세포 혼합물들을 1 내지 6시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 그후, 비색 분석법 (CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay; Promega; Madison, WI)에 의해, 세포 용해시 방출되는 안정적인 세포질 효소인 방출된 락테이트 탈수소효소 (LDH)를 측정하였다. 490 nm에서의 흡광도 데이터를 표준 96웰 플레이트 판독기로 수집하고, 배경값을 수정하였다. 특이적 세포독성의 백분율을 ％ 세포독성 = 100 × (실험의 LDH 방출 - 이펙터 자발적 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출) / (표적 최대 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출)의 식에 따라 계산하였다. 이렇게 하여 항체 의존적 세포형 세포독성을 매개하는 DLL4에 대한 항체의 능력이 결정되었다.
실시예 3: 항-DLL4 항체를 사용한 종양 성장의 생체내 방지
본 실시예는 이종이식편 모델에서 종양 성장을 방지하기 위한 항-DLL4 항체의 용도를 기술한다. 특정 실시양태에서, 마우스 내의 이종이식편으로 계대된 환자 샘플 (고형 종양 생검 또는 흉막 삼출액)로부터의 종양 세포를 실험 동물 내로의 재-계대를 위해 제조하였다. 종양 조직을 멸균 조건 하에 제거하고, 작은 조각으로 절단하고, 멸균 칼날을 사용하여 완전히 잘게 다지고, 효소에 의한 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 구체적으로, 흉막 삼출액 세포 또는 생성된 종양 조각을 배양 배지 내의 초순수 콜라게나제 III (200-250 유닛의 콜라게나제/㎖)과 혼합하고, 15-20분마다 10 ㎖ 피펫으로 아래위로 피펫팅하면서 37℃에서 1-4시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 세포를 40 μM 나일론 메쉬로 여과하고, 2％ 열-불활성화 송아지 혈청 (HICS) 및 25 mM HEPES (pH 7.4)를 함유하는 행크(Hank) 완충 염수 용액 (HBSS)으로 세정하였다. 그후, 해리된 종양 세포를 NOD/SCED 마우스의 유방 지방 패드 내로 피하 주사하여, 종양 성장을 유도하였다.
특정 실시양태에서, 먼저, 해리된 종양 세포를 실험 동물 내로 주사하기 전에 세포 표면 마커를 기초로 종양발생성 및 비-종양발생성 세포로 분류하였다. 구체적으로, 상기 기술된 바와 같이 해리된 종양 세포를 2％ 열-불활성화 송아지 혈청 (HICS)을 함유하는 헤페스(Hepes) 완충 염수 용액 (HBSS)으로 2회 세정하고, 106개의 세포/100 ㎕로 재현탁시켰다. 항체를 첨가하고, 세포를 20분 동안 얼음 상에 서 인큐베이션한 후, HBSS/2％ HICS로 2회 세정하였다. 항체에는 항-ESA (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), 항-CD44, 항-CD24, 및 계통 마커인 항-CD2, -CD3, -CD10, -CD16, -CD18, -CD31, -CD64, 및 -CD140b (총괄적으로 Lin으로 지칭됨; BD Biosciences, San Jose, CA)가 포함되었다. 이러한 마커들을 발현하는 세포를 양성적으로 또는 음성적으로 선별하기 위해 항체가 플루오로크롬에 직접 접합되었다. H2Kd+ 및 뮤린 CD45+ 세포에 대해 선별함으로써 마우스 세포를 제거하고, 생육력 염료 DAPI를 사용함으로써 죽은 세포를 제거하였다. 흐름 세포측정을 FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 수행하였다. 측면 산란 및 전방향 산란 프로파일을 사용하여 세포 응괴를 제거하였다. 그후, 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/로우(low), Lin- 종양발생성 세포를 NOD/SCID 마우스 내로 피하 주사하여, 종양 성장을 유도하였다.
특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체를 UM-C4 결장 종양 세포의 성장을 감소시키는 능력에 대해 분석하였다. 해리된 UM-C4 세포 (10,000개/동물)을 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 다음날, 10 mg/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 항체 (n=5) 또는 PBS (n=10)를 동물에게 실험 기간 동안 일주일에 2번씩 복강내 주사 (i.p.)하였다. 성장이 검출될 때까지 종양 성장을 매주 모니터링하고, 검출된 후에는 종양 성장을 총 8주 동안 일주일에 2번씩 측정하였다. 21M18 항체로의 처리는 PBS가 주사된 대조군에 비해 종양 성장을 54％만큼 감소시켰다 (도 8).
그후, 생체내에서 증식에 영향을 미치는 항-DLL4 항체의 능력을 결정하였다. 뮤린 21M18 항체 또는 대조군 항체로 처리된 동물로부터의 C8 결장 종양을 단리하고, 세포 증식의 마커인 Ki67의 발현을 면역세포화학에 의해 결정하였다. 구체적으로, 포르말린에 고정되고 파라핀에 매립된 종양을 4-um 두께의 절편으로 절단하였다. 자일렌에서 절편의 파라핀을 제거하고, 절편을 증류수에서 재수화시켰다. 표준 방법에 따라 면역조직화학을 수행하였다. 간략하게, 절편을 탄소제거 챔버에서 수조 내의 시트레이트 완충제 (pH 6)에 20분 동안 함침시켜, 항원을 부활시켰다. 슬라이드를 약 45분 동안 냉각시키고, PBS에서 헹궜다. 절편을 과산화수소 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)와 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 1차 항체의 첨가 전에 내인성 과산화효소를 제거하였다. 홀스 희석 완충제 (PBS 내의 1％ NHS, 1％ BSA, 0.1％ Tx-100, 0.05％ NaN3)에 1:50으로 희석된 토끼 항-인간 Ki67 (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)을 각각의 절편에 첨가하고, 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세정 완충제 (PBS 내의 젤라틴 10％, Tx-100 10％)로 3회 세정하였다 (각각 5분). HRP 용액과 접합된 항-토끼 2차 항체 (Immpress anti-Rabbit pre-diluted, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)를 슬라이드에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 세정 완충제로의 광범위한 세정 후, 벡터 노바 레드(Vector Nova Red) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)를 첨가하였다. 슬라이드를 물로 헹구고, 헤마톡실린으로 대비염색하고, 영구적인 마운팅 매질 (Vectamount, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA)로 마운팅하였다. 항-DLL4 뮤린 21M18 항체로의 처리는 대조군으로 처리된 종양과 비교하여 Ki67을 발현하는 세포의 개수를 감 소시켰다 (도 9).
실시예 4: 조합 치료법에서의 항-DLL4 항체를 사용한 종양 성장의 생체내 방지 및 치료
플루오로우라실과 조합된 DLL-4 항체
특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체를 생체내에서 UM-C4 결장 종양 세포의 성장을 감소시키는 능력에 대해 화학요법과 조합하여 분석하였다. 해리된 UM-C4 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 다음날, 주당 1회 투여되는 항-대사물질 화학요법제 플루오로우라실 (5-FU)로의 동시 치료와 함께 또는 동시 치료 없이 동물에게 실험 기간 동안 주당 2회씩 10 ㎎/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 항체 또는 PBS를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 성장이 검출될 때까지 종양 성장을 매주 모니터링하고, 검출된 후에는 종양 성장을 총 8주 동안 일주일에 2번씩 측정하였다. 5-FU와 조합된 DLL4 뮤린 21M18 항체로의 처리는 어느 한쪽 단독으로의 처리보다 더 큰 정도로 종양 성장을 감소시켰다 (도 10).
EGFR 또는 VEGF 항체와 조합된 DLL-4 항체
특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체를 생체내에서 종양 포힉 빈도에 영향을 미치는 능력에 대해 항-EGF 수용체 (EGFR) 항체와 조합하여 분석하였다. 해리된 UM-C4 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 다음날, 동물 (n=10)에게 10 mg/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 항체, 항-EGFR 항체, 항-DLL4 및 항-EGFR 항체의 조합물, 또는 PBS를 복강 내 (i.p.) 주사하였다. 항-DLL4 또는 항-EGFR 항체로 처리된 모든 동물 및 10마리의 대조군 동물 중 9마리에서 종양이 검출되었다. 반면에, 항-DLL4 및 항-EGFR 항체의 조합물로 처리된 10마리의 동물 중 2마리에서만 처리하고 나서 수주 후에 검출가능한 종양이 있었다 (도 11). 또한, 항-EGFR 항체와 조합된 항-DLL4 뮤린 21M18 항체로의 처리는 어느 한쪽 단독으로의 처리에 비해 종양발생 빈도를 감소시켰다 (도 11).
특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체를 생체내에서 종양 포획 빈도에 영향을 미치는 능력에 대해 항-EGF 수용체 (EGFR) 항체와 조합하여 테스트하였다. C17 종양 세포를 마우스 (n=10마리/군)에 이식하고, 2일 후에 대조군 항체, 뮤린 21M18, 항-VEGF 항체, 또는 양쪽 항체의 조합물로의 처리를 시작하였다. 각각의 항체를 10 mg/kg의 용량으로 일주일에 2번 제공하였다. 21M18 및 항-VEGF 모두 종양 성장을 감소시켰고, 조합물은 어느 한쪽 항체 단독보다 더욱 효과적이었다 (도 18).
이리노테칸과 조합된 DLL-4 항체
특정 실시양태에서, 항-DLL4 항체를 화학요법제 이리노테칸과 조합하여 테스트하였다. 일부 실시양태에서, 해리된 OMP-C8 종양 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 다음날, 7.5 mg/kg의 투여량으로 주당 1회 투여되는 화학요법제 이리노테칸으로의 동시 치료와 함께 또는 동시 치료 없이 동물에게 실험 기간 동안 주당 2회씩 10 ㎎/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 항체 또는 대조군 항체를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 성장이 검출될 때까지 종양 성장을 매주 모니터링하고, 검출된 후에는 종양 성장을 일주일에 2번씩 측정하였다. 이리노테칸과 조합된 항-DLL4 21M18 항체로의 처리는 어느 한쪽 단독으로의 처리보다 더 큰 정도로 종양 성장을 감소시켰다 (도 12A). 그리고, 7.5 mg/kg 이리노테칸 단독으로의 매주 처리를 중단한 후 대부분의 동물에서 종양 성장이 지속되거나 가속화된 반면, 일주일에 2번씩의 10 mg/kg 항-DLL4 21M18 및 매주 7.5 mg/kg의 이리노테칸의 조합은 제56일에 처리를 중단한 후 5주를 초과하여 결장 종양 성장을 추가로 방지하였다 (도 13).
특정 실시양태에서, 인간화 H7L2 21M18 항-DLL4 항체를 이리노테칸과 조합하여 테스트하였다. 일부 실시양태에서, 해리된 C8 종양 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사 다음날, 7.5 mg/kg의 투여량으로 주당 1회 투여되는 화학요법제 이리노테칸으로의 동시 치료와 함께 또는 동시 치료 없이 동물에게 실험 기간 동안 주당 2회씩 10 ㎎/kg 인간화 21M18 항-DLL4 항체, 뮤린 21M18 항체, 또는 대조군 항체를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 성장이 검출될 때까지 종양 성장을 매주 모니터링하고, 검출된 후에는 종양 성장을 일주일에 2번씩 측정하였다. 이리노테칸과 조합된 인간화 항-DLL4 21M18 항체로의 처리는 종양 성장에 대해 뮤린 21M18과 유사한 효능을 나타냈다 (도 12B).
일부 실시양태에서, 확립된 결장 종양을 치료하는데 항-DLL4 뮤린 21M18 및 이리노테칸 처리의 조합을 사용하였다. 해리된 C8 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 주사된 세포로 약 60 ㎣의 종양이 생산되었을 때, 처리를 시작하였다. 7.5 mg/kg의 투여량으로 주당 1회 투여되는 화학요법제 이리노테칸으로의 동시 치료와 함께 또는 동시 치료 없이 동물에게 실험 기간 동안 주당 2회씩 10 ㎎/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 항체 또는 대조군을 복강내 (i.p.) 주사하였다. 이리노테칸과 조합된 항-DLL4 뮤린 21M18 항체로의 치료는 확립된 결장 종양의 성장을 어느 한쪽 단독으로의 치료보다 더 큰 정도로 감소시켰다 (도 14).
일부 실시양태에서, 항체 처리에 이은 조합 치료법이 종양 재발을 지연시켰다. 해리된 C8 세포 (10,000개/동물)를 6-8주령 NOD/SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 피하 주사하였다. 주사된 세포로 약 150 ㎣의 종양이 생산되었을 때, 치료를 시작하였다. 총 32일 동안 주당 1회의 7.5 mg/kg의 이리노테칸과 조합하여 주당 2회씩 10 ㎎/kg 뮤린 21M18 항-DLL4 또는 대조군 항체를 동물에게 복강내 (i.p.) 투여하였다. 그후 조합 치료를 중단하고, 나머지 실험 동안 항체를 DLL4 21M18 또는 대조군 항체로 처리하였다. 조합 치료법에 이은 항-DLL4 21M18 항체로의 처리는 대조군으로 처리된 동물에 비해 종양 성장의 재발을 현저하게 지연시켰다 (도 16). 이리노테칸 처리를 종결하고 나서 47일 후의 개별적인 종양 부피가 또한 제시되었다 (도 17).
암 줄기 세포 빈도의 DLL-4 항체 감소가 이리노테칸에 의해 강화된다
특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 항-DLL4 21M18 항체 단독 또는 이리노테칸과 조합된 항체의 능력을 제한 희석 분석을 사용하여 결정하였다. 상기 기술된 바와 같이 대조군 또는 DLL4 뮤린 21M18 항체, 이리노테칸, 또는 이리노테칸과 조합된 DLL4 뮤린 21M18 항체로 처리된 마우스로부터의 C8 결장 종양을 처리 38일 후에 단리하였다. 단리된 종양 (실험군 당 n=3)을 하기 기술된 바와 같이 프로세싱하였다. 종양을 제거하고, 멸균 면도날로 다졌다. 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해, DNAseI (Worthington, Lakewood, NJ)의 1:100 희석물과 함께 MEBM 배지 (Cambrex, East Rutherford, NJ) 내의 콜라게나제/히알루로니다제/디스파제 (10×의 1:1:8)를 함유하는 소화 용액을 종양 현탁액과 혼합하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리하고, 얼음 상에서 2분 동안 1 ㎖의 ACK 배지 (증류수 내의 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA)에 재현탁시켜, 적혈구를 제거하였다. 세포를 원심분리하고, FACS 완충제 내에 1×107 개의 세포/㎖의 농도로 재현탁시킨 후, 비오틴화 마우스 항체 (α-마우스 CD45-비오틴 1:200 희석물 및 래트 α-마우스 H2Kd-비오틴 1:100 희석물; BioLegend, San Diego, CA)와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고 나서, 스트렙타비딘 자기 비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가하여 마우스 세포를 제거하였다. 현탁액 내의 나머지 인간 세포를 수집하고, 카운팅하고, 추후의 사용을 위해 원하는 농도로 희석하였다. 그후, 인간 세포의 단계 희석물을 면역손상 마우스 내로 다시 주사하였다. 구체적으로, 900개, 300개, 100개, 또는 50개의 단리된 인간 종양 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리 영역 내로 주사하였다 (군 당 n=10). 종양 부피를 1주일에 2번 평가하였다.
제81일에 연구를 종결했을 때, 검출가능한 종양이 있는 마우스의 백분율이 DLL4 21M18 항체로 처리된 종양 세포가 주사된 모든 군에서 감소되었고, 대조군 또 는 이리노테칸 단독으로 처리된 것에 비해 DLL4 21M18-이리노테칸으로 처리된 종양 세포에서 더욱 더 감소되었다 (도 15A). 이러한 종양 생성 빈도를 사용하여, 줄기 세포 빈도를 L-Calc™ 소프트웨어 (http://www.stemcell.com/search/default.asp에서 다운로드 가능)에서 제공하는 포아송(Poisson) 통계를 사용하여 계산하였다. 간략하게, 포아송 분포 통계를 기초로, 동물의 37％에서 종양이 발달되지 않으면 기지수의 주사된 세포 중에 정확히 1개의 줄기 세포가 존재한다. 이리노테칸 단독으로의 종양 처리는 암 줄기 세포의 수를 대조군 처리 종양에서의 1:93에서 1:82로 감소시켰다. 반면에, 항-DLL4 항체는 암 줄기 세포 빈도를 대조군 처리된 종양에서의 1:93에서 DLL4 항체 처리된 종양에서는 1:238로, DLL4 21M18-이리노테칸 조합 처리된 종양 세포에서는 1:573로 감소시켰다 (도 15B).
실시예 5: 항-DLL4 항체를 사용한 종양의 생체내 치료
본 실시예는 이종이식편 모델에서 암을 치료하기 위한 인간화 항-DLL4 21M18 항체의 용도를 기술한다. 특정 실시양태에서, 마우스 내의 이종이식편으로 계대된 환자 샘플 (고형 종양 생검 또는 흉막 삼출액)로부터의 종양 세포를 실험 동물 내로의 재-계대를 위해 제조하였다. 종양 조직을 제거하고, 작은 조각으로 절단하고, 멸균 칼날을 사용하여 완전히 잘게 다지고, 효소에 의한 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그후, 해리된 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에게 유방 종양에 대해서는 유방 지방 패드 내로, 또는 비-유방 종양에 대해서는 옆구리 내로 피하 주사하여, 종양 성장을 유도하였다. 별법적으로, ESA+, CD44+, CD24-/로우, Lin- 종양발생성 종양 세포를 상기 기술된 바와 같이 단리하여 주사하였다.
종양 세포 주사에 이어서, 종양 성장에 대해 동물들을 모니터링하였다. 일단 종양이 약 100 ㎣의 평균 크기에 도달하면, 항체 처리를 시작하였다. 각각의 동물에게 100 ㎍ DLL4 21M18 인간화 항체 또는 대조군 항체를 일주일에 5번씩 총 6주 동안 복강내로 제공하였다. 이러한 6주 동안 종양 크기를 일주일에 2번씩 평가하였다. 이렇게 하여 대조군 항체와 비교하여 추가적인 종양 성장을 방지하거나 종양 크기를 감소시키는 DLL4 인간화 항체의 능력이 결정되었다.
항체 처리 종점에, 종양들을 추가적인 분석을 위해 수확하였다. 일부 실시양태에서, 종양의 일부분을 면역형광에 의해 분석하여, 종양 내로의 항체 투과 및 종양 응답을 평가하였다. 항-DLL4 처리 마우스 및 대조군 항체 처리 마우스로부터의 각각의 수확된 종양의 일부분을 액체 질소에서 신선-동결시키고, O.C.T.에 매립하고, 저온유지장치에서 유리 슬라이드 상의 10 ㎛ 절편으로 절단하였다. 일부 실시양태에서, 각각의 종양의 일부분을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 매립하고, 마이크로톰에서 유리 슬라이드 상의 10 ㎛ 절편으로 절단하였다. 절편들을 후-고정시키고, 주사된 항체를 특이적으로 인식하는 발색단-표지 항체와 함께 인큐베이션하여, 종양 생검 내에 존재하는 항-DLL4 수용체 또는 대조군 항체를 검출하였다. 또한, 상이한 종양 및 종양-동원 세포 유형을 인식하는 항체, 예를 들어, 혈관 내피 세포를 검출하기 위한 항-VE 카드헤린 (CD144) 또는 항-PECAM-1 (CD31) 항체, 혈관 평활근 세포를 검출하기 위한 항-평활근 알파-액틴 항체, 증식성 세포를 검출하기 위한 항-Ki67 항체, 죽어가는 세포를 검출하기 위한 TUNEL 분석법, 노치 신호 전달을 검출하기 위한 항-세포내 도메인 (ICD) 노치 단편 항체를 사용하여, 항체 처리의 효과, 예를 들어, 혈관형성, 종양 성장 및 종양 형태학에 대한 효과를 평가할 수 있다.
특정 실시양태에서, 종양 세포 유전자 발현에 대한 항-DLL4 인간화 항체 처리의 효과를 또한 평가하였다. DLL4 항체 및 대조군 항체로 처리된 마우스로부터의 각각의 수확된 종양의 일부분으로부터 전체 RNA를 추출하여, 정량적 RT-PCR에 사용하였다. DLL4, 노치 수용체, 노치 신호전달 경로의 성분, 뿐만 아니라 기존에 확인된 추가적인 암 줄기 세포 마커 (예를 들어, CD44)의 발현 수준을 내부 대조군으로서의 살림 유전자 GAPDH와 비교하여 분석하였다. 이렇게 하여, DLL4 항체 처리 시의 종양 세포 유전자 발현에서의 변화를 결정하였다.
또한, 종양 내의 암 줄기 세포의 존재에 대한 항-DLL4 항체 처리의 효과를 평가하였다. DLL4 대 대조군 항체 처리 마우스로부터의 종양 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 칼날을 사용하여 완전히 다지고, 효소에 의한 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그후, 해리된 종양 세포를 상기에 상세히 기술된 바와 같이 ESA+, CD44+, CD24-/로우, Lin- 표면 세포 마커 발현을 기초로 종양발생성 암 줄기 세포의 존재에 대해 FACS 분석에 의해 분석하였다.
그후, 항-DLL4 항체 처리 후에 ESA+, CD44+, CD24-/로우, Lin- 발현을 기초로 단리된 세포의 종양발생성을 평가하였다. DLL4 항체 처리 대 대조군 항체 처리 마우스로부터 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/로우, Lin- 암 줄기 세포를 NOD/SCID 마우스의 유방 지방 패드 내로 다시 피하 주사하였다. 그후, 일관적인 종양 형성에 필요한 주사된 세포의 수를 기초로 하는 암 줄기 세포의 종양발생성을 결정하였다.
실시예 6: 인간화 항-DLL4 항체를 사용한 인간 암의 치료
본 실시예는 노치 수용체 또는 노치 수용체 리간드 발현이 검출된 암 줄기 세포 및/또는 종양 세포를 포함하는 종양을 표적으로 하는 DLL4에 대한 인간화 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법을 기술한다. 먼저, 암 줄기 세포 마커 발현의 존재를 종양 생검으로부터 결정할 수 있었다. 암으로 진단된 환자로부터의 생검으로부터의 종양 세포를 멸균 조건 하에 제거하였다. 일부 실시양태에서, 조직 생검을 액체 질소에서 신선-동결시키고, O.C.T.에 매립하고, 저온유지장치에서 유리 슬라이드 상의 10 ㎛ 절편으로 절단하였다. 일부 실시양태에서, 조직 생검을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 매립하고, 마이크로톰에서 유리 슬라이드 상의 10 ㎛ 절편으로 절단하였다. 절편들을 DLL4에 대한 항체와 함께 인큐베이션하여, 단백질 발현을 검출하였다.
암 줄기 세포의 존재를 또한 검출할 수 있었다. 조직 생검 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 칼날을 사용하여 완전하게 다지고, 세포에 효소적 소화 및 기계적 파괴를 적용하여, 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그후, 해리된 종양 세포를 항-ESA, -CD44, -CD24, -Lin, 및 -DLL4 항체와 함께 인큐베이션하여 암 줄기 세포를 검출하고, ESA+, CD44+, CD24-/로우, Lin-, DLL4+ 종양 줄기 세포의 존재를 상기에 상세히 기술된 바와 같이 흐름 세포측정에 의해 결정하였다.
종양이 노치 수용체 또는 노치 수용체 리간드를 발현하는 것으로 진단된 암 환자를 인간화 항-DLL4 항체로 처리하였다. 특정 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이 생성된 인간화 항-DLL4 항체를 정제하고, 적절한 제약 비히클과 함께 주사용으로 제제화하였다. 일부 실시양태에서, 적어도 10주 동안 1개월에 한번 이상 DLL4 항체로 환자를 처리하였다. 일부 실시양태에서, 적어도 14주 동안 1주일에 한번 이상 DLL4 항체로 환자를 처리하였다. 각각의 항체 투여는 제약상 유효량이어야 한다. 일부 실시양태에서, 약 2 내지 약 100 mg/㎖ 사이의 항-DLL4 항체가 투여되었다. 일부 실시양태에서, 약 5 내지 약 40 mg/㎖ 사이의 항-DLL4 항체가 투여되었다. 표준 방사선요법 또는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 류코보린, 또는 스트렙토조신을 사용하는 화학요법 전에, 이와 동시에 또는 이후에 항체를 투여할 수 있었다. 환자를 모니터링하여, 예를 들어, 종양 퇴행, 새로운 종양의 발병률의 감소, 더 낮은 종양 항원 발현, 감소된 암 줄기 세포 개수, 또는 질환 예후를 평가하는 기타 수단을 기초로, 이같은 처리로 항-종양 응답이 초래되었는지 여부를 결정하였다.
본 발명의 또다른 실시양태들이 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실행을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예들은 예시적인 것으로만 간주되고, 본 발명의 진정한 범주 및 취지는 하기의 청구항에 의해 지시되는 것으로 의도된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 거명에 의해 전문이 본 명세서에 포함된다.
Figure 112009025837547-pct00001
Figure 112009025837547-pct00002
Figure 112009025837547-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Oncomed Pharmaceuticals, Inc. <120> Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Cancer <130> 2293.025PC03/KWM/PAC <150> 60/942,542 <151> 2007-06-07 <150> 60/886,260 <151> 2007-01-23 <150> 60/847,904 <151> 2006-09-29 <160> 27 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR1 <400> 1 Thr Ala Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2, H2 <400> 2 Tyr Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 H7 <400> 3 Tyr Ile Ser Ser Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 H9 <400> 4 Tyr Ile Ser Val Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 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Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR1 <400> 9 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR2 <400> 10 Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 11 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Lys Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain, H2, variable region <400> 13 atggactgga cctggagcat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggagc tcactcccag 60 gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggctagcgt gaagatcagc 120 tgcaaggcta gcggatactc ctttacagct tactacatcc actgggtgaa gcaggcccct 180 ggacaagggc tggagtggat cggatatatc agctgttaca acggagctac aaactacaac 240 cagaagttca agggcagggt caccttcaca acagacacaa gcacaagcac agcctacatg 300 gagctgagga gcctgagaag cgacgacaca gccgtgtact actgtgctag ggactacgac 360 tacgacgtgg ggatggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtcag ctca 414 <210> 14 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain, H7, variable region <400> 14 atggactgga cctggagcat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggagc tcactcccag 60 gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggctagcgt gaagatcagc 120 tgcaaggcta gcggatactc ctttacagct tactacatcc actgggtgaa gcaggcccct 180 ggacaagggc tggagtggat cggatatatc agctcctaca acggagctac aaactacaac 240 cagaagttca agggcagggt caccttcaca acagacacaa gcacaagcac agcctacatg 300 gagctgagga gcctgagaag cgacgacaca gccgtgtact actgtgctag ggactacgac 360 tacgacgtgg ggatggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtcag ctca 414 <210> 15 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain, H9 <400> 15 atggactgga cctggagcat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggagc tcactcccag 60 gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggctagcgt gaagatcagc 120 tgcaaggcta gcggatactc ctttacagct tactacatcc actgggtgaa gcaggcccct 180 ggacaagggc tggagtggat cggatatatc agcgtctaca acggagctac aaactacaac 240 cagaagttca agggcagggt caccttcaca acagacacaa gcacaagcac agcctacatg 300 gagctgagga gcctgagaag cgacgacaca gccgtgtact actgtgctag ggactacgac 360 tacgacgtgg ggatggacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtcag ctca 414 <210> 16 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 16 atggtgctcc agacccaggt cttcatttcc ctgctgctct ggatcagcgg agcctacggg 60 gacatcgtga tgacccagtc ccctgactcc ctggctgtgt ccctgggcga gagggccacc 120 atctcctgca gagccagcga atccgtcgat aattatggca tttcctttat gaagtggttc 180 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttacg ctgcatccaa ccaagggtcc 240 ggggtccctg acaggttctc cggcagcggg tccggaacag atttcactct caccatcagc 300 agcctgcagg ctgaagatgt ggctgtctat tactgtcagc aaagcaagga ggtgccttgg 360 acattcggag gagggaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcccc ctccgtcttc 420 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaaa agcggcactg ccagcgtggt gtgcctgctg 480 aataacttct atccccggga ggccaaagtg cagtggaagg tggataacgc cctccaaagc 540 ggcaactccc aggagagcgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga ccctgagcaa agccgactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagcag ccccgtcaca aagagcttca acaggggcga gtgttga 717 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR1 <400> 17 acagcttact acatccac 18 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2, H2 <400> 18 atatcagctg ttacaacgga gctacaaact acaaccagaa gttcaagggc 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2, H7 <400> 19 atatcagctc ctacaacgga gctacaaact acaaccagaa gttcaagggc 50 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2, H9 <400> 20 atatcagcgt ctacaacgga gctacaaact acaaccagaa gttcaagggc 50 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 <400> 21 agggactacg actacgacgt ggggatggac tac 33 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR1 <400> 22 agagccagcg aatccgtcga taattatggc atttccttta tgaag 45 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR2 <400> 23 gctgcatcca accaagggtc c 21 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 24 cagcaaagca aggaggtgcc ttggacattc ggagga 36 <210> 25 <211> 522 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly 515 520 <210> 26 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Trp Leu Leu Asp Glu Gln Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Arg Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg 20 25 30 Leu Cys Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro 35 40 45 Asp Gly Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys 50 55 60 <210> 27 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn 145 150

Claims (63)

  1. i. CDR 아미노산 서열 CDR1 (서열 1); CDR2 (서열 2, 서열 3 또는 서열 4); 및 CDR3 (서열 5)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    ii. CDR 아미노산 서열 CDR1 (서열 9); CDR2 (서열 10); 및 CDR3 (서열 11)을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 CDR 아미노산 서열 CDR1 (서열 1), CDR2 (서열 3) 및 CDR3 (서열 5)을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 CDR 아미노산 서열 CDR1 (서열 9); CDR2 (서열 10); 및 CDR3 (서열 11)을 포함하는 것인 항체.
  3. 서열 6, 서열 7 및 서열 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 12의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  4. 서열 7을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 12를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 DLL4에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  5. ATCC에 기탁 번호 PTA-8427 또는 PTA-8425로 기탁된 플라스미드에 의해 코딩되는 항체와 동일한 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  6. ATCC에 기탁 번호 PTA-8670으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 21M18 항체에 함유된 중쇄 가변 영역 CDR 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 CDR 아미노산 서열을 함유하는 모노클로날 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  8. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  10. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgG2 항체인 항체.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 결장암 치료용 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 세포.
  14. ATCC에 기탁 번호 PTA-8670으로 기탁된 하이브리도마.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  16. (i) 서열 13, 서열 14, 또는 서열 15 및 (ii) 서열 16을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  18. 제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 제12항에 있어서, 결장암의 치료가 항체 및 제2 치료제의 투여를 포함하는 것인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 제2 치료제가 화학요법제 또는 제2 항체인 제약 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 제2 치료제가 항-VEGF 항체인 제약 조성물.
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