JP6449537B2

JP6449537B2 - 抗腫瘍剤、及び、抗腫瘍用キット

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Publication number: JP6449537B2
Application number: JP2013250743A
Authority: JP
Inventors: 幸恵吉井; 高子古川; 恒夫佐賀; 博樹松本; 光喜吉本
Original assignee: NATIONAL INSTITUTES FOR QUANTUM AND RADIOLOGICALSCIENCE AND TECHNOLOGY; Nihon Medi Physics Co Ltd; National Cancer Center Japan
Current assignee: NATIONAL INSTITUTES FOR QUANTUM AND RADIOLOGICALSCIENCE AND TECHNOLOGY; Nihon Medi Physics Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2033-12-04
Also published as: US20140186261A1; JP2014141457A; EP2749294A1

Description

本発明は、抗腫瘍剤、及び、抗腫瘍用キットに関する。

放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、低酸素部位やミトコンドリア機能障害の診断剤として知られている（例えば、特許文献１）。また、非特許文献１には、放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（以下、「放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭ」ともいう。）は、低酸素領域を標的とした腫瘍の放射線治療剤として有用であることが記載されている。

また、近年、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、ＣＤ１３３陽性細胞に集積することが明らかとなった（非特許文献２）。非特許文献３には、腫瘍中のＣＤ１３３陽性細胞の量を低減し、腫瘍が縮小できたことが報告されている。このため、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、がん幹細胞の検出剤、及び、がん幹細胞を標的化したがんの予防・治療剤としての有用性も期待されている（特許文献２）。

特開平８−２４５４２５号公報特開２０１０−１３３８０号公報

ＪａｓｏｎＳ．Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ（２００１），Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．９８，１２０６−１２１１ＹｕｋｉｅＹｏｓｈｉｉｅｔａｌ（２０１０），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３７，３９５−４０４ＹｕｋｉｅＹｏｓｈｉｉｅｔａｌ（２０１１），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３８，１５１−１５７

しかしながら、特許文献２の開示によれば、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、腫瘍内で^１８ＦＤＧと異なる部位に集積することが明らかにされている。そのため、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与では、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭが集積しない腫瘍領域を効果的に殺傷できない、という問題がある。

放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭの投与量を高めれば、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭの発する放射線により、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭが集積しない腫瘍領域も殺傷できるかもしれない。しかしながら、正常組織に対する被曝量の増加が懸念される。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭによる抗腫瘍効果を高める技術を提供することにある。

本発明者らは、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを代謝阻害剤と併用することにより、腫瘍細胞に対する相乗的な殺傷効果が得られることを新たに知見した。また、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭと代謝阻害剤との併用投与により、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与に比べてがん幹細胞（ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌ）の殺傷効果が高まることも見出した。

本発明の一態様は、放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭ）を含有し、代謝阻害剤と併用投与するために用いられる抗腫瘍剤を提供するものである。

また、本発明の他の態様は、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭと併用投与するために用いられる、代謝阻害剤を提供するものである。

さらに、本発明の他の態様は、代謝阻害剤と、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭと、を有する抗腫瘍用キットを提供するものである。

本発明によれば、がん幹細胞及び腫瘍細胞に対する高い殺傷効果を得ることができ、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭによる抗腫瘍効果を高めることが可能になる。

実施例及び比較例の腫瘍体積の経時変化を示す図である。実施例及び比較例の腫瘍におけるアポトーシス細胞の割合を示す図である。実施例及び比較例の腫瘍におけるＣＤ１３３陽性細胞の割合を示す図である。実施例及び比較例の腫瘍体積の経時変化を示す図である。実施例及び比較例の腫瘍体積の経時変化を示す図である。

［抗腫瘍剤］
本発明の抗腫瘍剤は、下記式（１）で表される放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有するものである。

式（１）中、Ｃｕは放射性同位体を示すが、より効果的に腫瘍細胞を殺傷できるという観点から、^６４Ｃｕ又は^６７Ｃｕは、β線を放出するため、好ましい。

放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、例えば、Ｊａｌｉｌｉａｎらの方法（ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，５９（１），２００９，ｐｐ．４５−５５）、「ＰＥＴ用放射性薬剤の製造および品質管理―合成と臨床使用へのてびき」（ＰＥＴ化学ワークショップ編）第４版（平成２３年改定版）記載の方法、Ｔａｎａｋａらの方法（ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３‐５０）、Ｌｅｗｉｓらの方法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１，４２，６５５‐６６１）等により製造することができる。

放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭは、各種の腫瘍に集積することができる。放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭが集積する腫瘍としては、例えば、乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、小腸癌、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌、唾液腺癌、神経鞘腫、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌、肉腫、白血病などが挙げられる。これらの腫瘍は、原発性であっても転移性であってもよい。

本発明において、「抗腫瘍」とは、腫瘍の増加を抑制すること、更には、腫瘍を減少若しくは消滅することをいい、本発明の「抗腫瘍剤」は、腫瘍細胞をがん幹細胞とともに殺傷し、これらの腫瘍の増殖を抑制し、更には、腫瘍を減少若しくは消滅できるものを有効成分として含有する剤をいう。

本発明の抗腫瘍剤は、上記の放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを有効成分としてそのまま含んでいてもよいし、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、若しくは賦形剤とともに製剤化されていてもよい。剤形は、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよいが、例えば注射剤などの非経口投与の剤形が好ましい。

本発明の抗腫瘍剤は、後述する代謝阻害剤と併用投与するために用いられる。本発明において「併用投与」とは、同一の投与レジメンで用いられることをいい、同一の腫瘍領域に対し、同一の治療効果（腫瘍の増殖抑制、更には、縮小又は消滅の効果）を発揮できるようにそれぞれの剤が投与されればよい。抗腫瘍剤の投与前に代謝阻害剤が投与されてもよいし、抗腫瘍剤の投与後に代謝阻害剤が投与されてもよいし、抗腫瘍剤と代謝阻害剤とが同時に投与されてもよい。

好ましくは、代謝阻害剤の投与後に本発明の抗腫瘍剤を投与することができ、代謝阻害剤を単回投与（好ましくは持続投与）又は反復投与した後に、本発明の抗腫瘍剤が投与されることがより好ましい。本発明において「反復投与」とは、一定の時間を空けて複数回投与することであり、例えば、１日１回又は複数回ずつ、２日〜１ヶ月間投与することができる。また、「持続投与」とは、一定の時間連続して投与することであり、例えば、数時間〜１週間、連続して投与することができる。

代謝阻害剤の投与後に本発明の抗腫瘍剤を投与する場合、代謝阻害剤と抗腫瘍剤との投与間隔は、特に限定されないが、例えば、生体内における代謝阻害剤の有効成分（例えば、５‐フルオロウラシル、６−チオグアニン又はペメトレキセド）の血中濃度が最高血中濃度に到達した後に、本発明の抗腫瘍剤を投与することができる。

本発明の抗腫瘍剤の投与対象は、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒトである。本発明の抗腫瘍剤の投与量は、投与対象となる患者の種別、年齢、性別、体重、症状、投与法などによって異なり特に限定されないが、一般の放射性医薬品において通常採用されている範囲を採用することができる。また、本発明の抗腫瘍剤は、単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。

また、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有する抗腫瘍剤は、代謝阻害剤を併用することで、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭのがん幹細胞の殺傷効果を高めることができる。したがって、本発明の抗腫瘍剤は、がん幹細胞を殺傷する殺がん幹細胞剤として用いることもできる。がん幹細胞が殺傷されたか否かは、例えば、そのがん幹細胞が発現している細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーを用いて測定すること、あるいは、腫瘍の切片を調製し、がん幹細胞に特定に結合する抗体を用いて免疫組織染色を行うことにより、確認することができる。がん幹細胞が発現している細胞表面マーカーは、腫瘍の種類によって異なることが知られており、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）でＣＤ３４＋など；脳腫瘍、髄芽腫、神経膠芽腫、上衣腫、大腸癌、乳癌、悪性黒色腫でＣＤ１３３＋など；膵臓癌、乳癌、前立腺癌でＣＤ４４＋など；黒色腫でＣＤ２０＋などがある。

［代謝阻害剤］
本発明において代謝阻害剤とは、がん細胞が分裂・増殖する際に、核酸の材料となる物質と化学構造が類似する化合物、又はそれを有効成分とする薬剤であって、核酸の生合成あるいは核酸の生合成経路を妨げ、増殖を抑制する抗がん剤である。好ましくは、代謝阻害剤として、ピリミジン系代謝拮抗剤、プリン系代謝拮抗剤及び葉酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１又は２以上の薬剤を用いることができる。

ピリミジン系代謝拮抗剤としては、チミジル酸合成酵素阻害剤が好ましい。チミジル酸合成酵素阻害剤とは、チミジル酸合成酵素を阻害してＤＮＡ合成障害を引き起こす薬剤であり、例えば、フッ化ピリミジン系薬剤が挙げられる。フッ化ピリミジン系薬剤は、投与により生体内で５‐フルオロウラシルを存在させるものであればよく、５‐フルオロウラシル又はそのプロドラッグを有効成分として含有するものであればよい。フッ化ピリミジン系薬剤として、好ましくは、有効成分として、５‐フルオロウラシル、テガフール、カペシタビン及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含有するものを採用することができる。５‐フルオロウラシル、テガフール又はカペシタビンがそれぞれ塩を形成するときは、塩は薬理学的に許容される塩であればよい。

フッ化ピリミジン系薬剤としては、種々の市販品を用いることができる。５‐フルオロウラシルとしては、例えば、５‐ＦＵ（商品名）が挙げられる。また、テガフールとしては、フトラフール（登録商標）が挙げられる。また、本発明においては、フッ化ピリミジン系薬剤として、例えば、テガフール・ウラシル（ユーエフティ（登録商標））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（ＴＳ−１（登録商標））等の混合剤を使用してもよい。

また、プリン代謝拮抗剤としては、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を有効成分として含有するものが挙げられる。６−メルカプトプリン、アザチオプリン又は６−チオグアニンが塩を形成するときは、塩は薬理学的に許容される塩であればよい。種々の市販品を用いることもでき、６−メルカプトプリンの市販品としては、プリネトール、ロイケリンが挙げられる。また、アザチオプリンの市販品としては、アザニン、イムランが挙げられる。

葉酸代謝拮抗剤としては、メトトレキサート、ペメトレキセド及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を有効成分として含有するものが挙げられる。メトトレキサート又はペメトレキセドがそれぞれ塩を形成するときは、塩は薬理学的に許容される塩であればよい。種々の市販品を用いることもでき、メトトレキサートの市販品としては、メソトレキセートが挙げられる。また、ペメトレキセドの市販品としては、アリムタ（登録商標）が挙げられる。

本発明において代謝阻害剤は、有効成分をそのまま、あるいは、有効成分とともに、薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、徐放剤、バッファ、コーティング剤及び着色剤等を適宜含ませて製剤化されていればよく、経口投与又は非経口投与のいずれに適する剤形であってもよい。例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤、注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、点滴剤、徐放性製剤等の非経口剤が挙げられる。また、２種以上の剤形を組み合わせてもよい。

この代謝阻害剤は、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭと併用投与して用いられればよく、本発明の抗腫瘍剤の投与前若しくは投与後に単回投与（好ましくは持続投与）されてもよいし、反復投与されてもよい。また、本発明の抗腫瘍剤の投与前後の両方において投与されてもよいし、抗腫瘍剤と同時に投与されてもよいが、本発明の抗腫瘍剤の投与前に投与されることが好ましい。

本発明の抗腫瘍剤と併用投与される代謝阻害剤の投与量は、特に限定されないが、好ましくは、代謝阻害剤が単独で抗腫瘍薬として用いられる際の投与量を超えない範囲で使用することができ、代謝阻害剤を単独投与したとき体重減少が認められない量を投与することがより好ましい。具体的には、代謝阻害剤を単独で投与したとき代謝阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下、好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、更に好ましくは７％以下となるように投与量を設定することができる。これにより、代謝阻害剤の副作用を低減しつつ放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭの抗腫瘍効果を高めることができる。ここでいう単独投与とは、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含む他の医薬を併用しない投与レジメンをいう。体重減少率は、「体重減少率（％）＝｛（代謝阻害剤の投与開始前の体重−代謝阻害剤の投与開始後の体重）／代謝阻害剤の投与開始前の体重｝×１００」で表すことができ、「代謝阻害剤の投与開始後の体重」は、好ましくは、代謝阻害剤の投与開始から１〜２週間後の体重にすることができる。

また、代謝阻害剤は、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有する抗腫瘍剤と併用して用いることにより、がん幹細胞を殺傷することができる。したがって、本発明の抗腫瘍剤と併用投与して用いられる代謝阻害剤は、殺がん幹細胞剤となり得る。

［抗腫瘍用キット］
本発明の抗腫瘍用キットは、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有する上記の抗腫瘍剤と、上記の代謝阻害剤とを有するものである。

また、本発明の抗腫瘍用キットは、上記の代謝阻害剤を投与した後に上記の抗腫瘍剤を投与することを記載した添付文書を含むことが好ましい。この添付文書には、後述する本発明の抗腫瘍用キットの使用方法を記載することができる。

本発明の抗腫瘍用キットは、好ましくは、上記の抗腫瘍剤、及び、上記の代謝阻害剤を哺乳動物に投与して用いられる。投与対象となる哺乳動物としては、ヒトがより好ましい。

[抗腫瘍剤、代謝阻害剤、及び、抗腫瘍用キットの使用方法]
本発明の抗腫瘍剤、代謝阻害剤、抗腫瘍用キットの使用方法の一例について以下に説明する。

まず、腫瘍を発現した被検体又は患者に代謝阻害剤を投与する。このとき、代謝阻害剤を単独投与したとき該代謝阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下、好ましくは９％以下、より好ましくは８％以下、更に好ましくは７％以下となるように、代謝阻害剤の投与量を設定することができる。

その後、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有する抗腫瘍剤を投与する。この抗腫瘍剤は、代謝阻害剤の投与後、生体内における、代謝阻害剤の有効成分（例えば、５‐フルオロウラシル、６−チオグアニン又はペメトレキセド）の血中濃度が最高血中濃度に到達した後に、投与することが好ましい。

また、代謝阻害剤の反復投与と、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有する抗腫瘍剤の単回投与とからなる投与計画を複数回繰り返してもよい。この繰り返しは、連続して行ってもよいし、当該抗腫瘍剤の投与後１〜３０日間、好ましくは、１０〜２５日間の間隔をおいて行ってもよい。

これにより、放射性Ｃｕ‐ＡＴＳＭと代謝阻害剤とが相乗的に作用して、がん幹細胞を含む腫瘍細胞を殺傷する。したがって、本発明の抗腫瘍キットは、がん幹細胞を殺傷する殺がん幹細胞剤として用いることもできる。そして、本発明の抗腫瘍用キットによれば、腫瘍細胞の殺傷効果と放射線増感効果とを併せ持つため、高い腫瘍増殖抑制効果を得ることができる。また、投与する放射能量に対する抗腫瘍効果が高いため、正常組織に対する被曝を抑えることができる。また、代謝阻害剤の投与量は体重減少させない程度に少ないため、代謝阻害剤の副作用も低減することができる。

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず種々の変更を行うことができる。たとえば、本発明は以下の技術思想を包含する。
［１］フッ化ピリミジン系薬剤と併用投与するために用いられる、放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体を含有する抗腫瘍剤。
［２］前記フッ化ピリミジン系薬剤が、有効成分として、５‐フルオロウラシル、テガフール、カペシタビン及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含有する、［１］に記載の抗腫瘍剤。
［３］前記放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体が、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ、又は、^６７Ｃｕ‐ＡＴＳＭである、［１］又は［２］に記載の抗腫瘍剤。
［４］殺がん幹細胞剤として用いられる、［１］〜［３］のいずれか一に記載の抗腫瘍剤。
［５］前記フッ化ピリミジン系薬剤を投与した後に用いられる、［１］〜［４］いずれか一に記載の抗腫瘍剤。
［６］前記フッ化ピリミジン系薬剤の投与量が、前記フッ化ピリミジン系薬剤を単独投与したとき該フッ化ピリミジン系薬剤の投与後の体重減少率が１０％以下となるように設定されている、［１］〜［５］いずれか一に記載の抗腫瘍剤。
［７］放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体と併用投与するために用いられる、フッ化ピリミジン系薬剤。
［８］殺がん幹細胞剤として用いられる、［７］に記載のフッ化ピリミジン系薬剤。
［９］フッ化ピリミジン系薬剤と、放射性ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）銅錯体と、を有する抗腫瘍用キット。
［１０］がん幹細胞を殺傷するために用いられる、［９］に記載の抗腫瘍用キット。

以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。

（製造例１）⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭ、及び、代謝阻害剤の調製
（ＡＴＳＭの合成）
ジアセチル‐ビス（Ｎ４‐メチルチオセミカルバゾン）（ＡＴＳＭ）の合成は、Ｔａｎａｋａらの方法（ＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３−５０）に準じた。

（⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの合成）
⁶⁴ＣｕはＭｃＣａｒｔｈｙらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，１９９７，ｐｐ．３５−４３）及びＯｂａｔａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，２００３，ｐｐ．５３５−５３９）に準じて製造・精製した。ＡＴＳＭと⁶⁴Ｃｕを用い、Ｔａｎａｋａらの方法（上掲）に準じて⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭを合成した。また、製造後の薬剤は、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）を用いて検定し、放射化学的純度９５％以上のものを以下の実験に使用した。なお、ＴＬＣを用いた⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの分析条件は下記のとおりである。
ＴＬＣプレート：シリカゲルプレート（製品名：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、メルク株式会社製）
展開相：酢酸エチル
検出：フルオロイメージアナライザー（形式：ＦＬＡ−７０００，富士フイルム株式会社製）

（５‐フルオロウラシル溶液の調製）
５‐フルオロウラシル（５‐Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，Ｗａｋｏ社製）を生理食塩液に溶解し、マウス１匹あたり１００μＬになるように調製して、以下の実験に使用した。なお、以下本実施例及び対応する図面では、この５‐フルオロウラシル溶液を「５‐ＦＵ」と省略する。
（６−チオグアニン溶液の調製）
６−チオグアニン（６−Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ，Ｗａｋｏ社製）を生理食塩液に溶解し、マウス１匹あたり１００μＬになるように調製して、以下の実験に使用した。なお、以下本実施例及び対応する図面では、この６‐チオグアニン溶液を「６ＴＧ」と省略する。
（ペメトレキセド溶液の調製）
ペメトレキセド（アリムタ（登録商標）注射用，日本イーライリリー株式会社社製）を生理食塩液に溶解し、マウス１匹あたり１００μＬになるように調製して、以下の実験に使用した。なお、以下本実施例及び対応する図面では、このペメトレキセド溶液を「ＰＴ」と省略する。

（実施例１）ヌードマウスを用いた５‐ＦＵの投与量の検討
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，７週齢，体重約２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）に、５‐ＦＵを１日１回２５ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。最初の投与開始日から５日目以降の体重を測定して、体重減少率を求めた。体重減少率は下記式に基づき算出した。
体重減少率（％）＝［｛（最初の５‐ＦＵ投与前日の体重）−（５‐ＦＵ投与開始後に測定した体重）｝／（最初の５‐ＦＵ投与前日の体重）］×１００
対照群には、５‐ＦＵに代えて生理食塩液を投与した。結果を表１に示す。表１には、マウス４匹の平均及び標準偏差で示した。なお、５‐ＦＵを５０ｍｇ／ｋｇ投与したマウスは投与から１０又は１１日目に、５‐ＦＵを１００ｍｇ／ｋｇ投与したマウスは投与から７又は８日目に死亡したため、死亡後の体重の測定データはない。

表１で示すように、１日５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇずつ投与した群は、５日目で体重減少率が１０％を超えたが、１日２５ｍｇ／ｋｇずつ投与したものは、１８日目においても体重減少率が１０％以内であった。そこで、以後の実施例では、５‐ＦＵは、１日１回２５ｍｇ／ｋｇずつ４日間反復投与することにした。

（実施例２）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭ及び５‐ＦＵの投与による抗腫瘍効果
ヒト大腸がん由来のＨＴ２９細胞は、ＡＴＣＣより購入したものを増殖させて利用した。ＨＴ２９担がんモデルは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，７週齢，体重約２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）の大腿部皮下にＨＴ２９細胞１×１０⁷個を移植して作製し、移植後１週後に、５‐ＦＵを１日１回２５ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。５‐ＦＵ最終投与日に、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を尾静脈より投与した。なお、対照群には５‐ＦＵ及び^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。５‐ＦＵの投与開始後、２、４、８、１２又は１５日後に、マウスの腫瘍径を計測した。また、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ投与から２日後に摘出した腫瘍から得られた細胞について、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａｆｌｏｗ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ミリポア社製）を用い、アポトーシス細胞、及び、ＣＤ１３３陽性（ＣＤ１３３＋）細胞の検出を行った。アポトーシス細胞の検出は、アネキシンＶ（ＭｏｕｓｅＡｎｔｉＨｕｍａｎＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣ，ＡｂＤＭＣＡ２７１２Ｆ、ｓｅｒｏｔｅｃ社製）により行った。また、ＣＤ１３３＋細胞の検出は抗ＣＤ１３３抗体（ＣＤ１３３／１（Ａ１３３）−ＰＥ，ミルテニーバイオテク社製）を用いた。

（比較例１）ＨＴ２９担がんマウスへの５‐ＦＵの単独投与による抗腫瘍効果
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例２と同様にした。

（比較例２）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
５‐ＦＵを投与する代わりに生理食塩液を投与した以外は、実施例２と同様に行った。

（比較例３）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
５‐ＦＵを投与する代わりに生理食塩液を投与した。また、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭの投与量は、７４ＭＢｑ（２ｍＣｉ）とした。それ以外は、実施例２と同様に行った。

［評価１］
実施例２、及び、比較例１〜３において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を図１に示す。図１では、５‐ＦＵの投与を開始した日の前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を示した。また、図１は、マウス６匹の平均及び標準偏差で示した。図１で示すように、５‐ＦＵの単独投与では、腫瘍の増殖を抑制できなかった。また、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与では、投与量に応じて腫瘍の増殖を抑制できたが、３７ＭＢｑの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと５‐ＦＵとの併用投与により、７４ＭＢｑの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭを単独投与したとき（比較例３）よりも高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。

実施例２、及び、比較例１〜３のアポトーシス細胞の検出結果を図２に示す。図２は、摘出した腫瘍中のアポトーシス細胞の割合について、マウス６匹の平均及び標準偏差で示した。図２で示すように、５‐ＦＵ、及び、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与でも腫瘍細胞のアポトーシスは確認できたが、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと５‐ＦＵとを併用することで、それぞれの単独投与によるアポトーシス細胞を合わせた量を上回る量のアポトーシス細胞が検出された。

実施例２、及び、比較例１〜３のＣＤ１３３＋細胞の検出結果を図３に示す。図３は、摘出した腫瘍中のＣＤ１３３＋細胞の割合について、マウス６匹の平均及び標準偏差で示した。図３で示すように、５‐ＦＵ、及び、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与でもＣＤ１３３＋細胞を殺傷できたが、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと５‐ＦＵとの併用投与により、更にＣＤ１３３＋細胞を殺傷できることが示された。

以上の結果から、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと体重減少のない量の５‐ＦＵとの併用により、有意な抗腫瘍効果が認められ、かつ体重減少も観察されないことが示された。

（実施例３）ヌードマウスを用いた６ＴＧの投与量の検討
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，７週齢，体重約２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）に、６ＴＧを１日１回１２．５ｍｇ／ｋｇ，２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。最初の投与開始日から５日目以降の体重を測定して、体重減少率を求めた。体重減少率は下記式に基づき算出した。
体重減少率（％）＝［｛（最初の６ＴＧ投与前日の体重）−（６ＴＧ投与開始後に測定した体重）｝／（最初の６ＴＧ投与前日の体重）］×１００
対照群には、６ＴＧに代えて生理食塩液を投与した。結果を表２に示す。表２には、マウス４匹の平均及び標準偏差で示した。なお、６ＴＧを２５ｍｇ／ｋｇ投与したマウスは投与から１３〜１５日目に、６ＴＧを５０ｍｇ／ｋｇ投与したマウスは投与から６〜８日目に死亡したため、死亡後の体重の測定データはない。

表２で示すように、１日２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇずつ投与した群は、５日目で体重減少率が１０％を超えたが、１日１２．５ｍｇ／ｋｇずつ投与したものは、１８日目においても体重減少率が１０％以内であった。そこで、以後の実施例では、６ＴＧは、１日１回１２．５ｍｇ／ｋｇずつ４日間反復投与することにした。

（実施例４）ヌードマウスを用いたＰＴの投与量の検討
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，７週齢，体重約２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）に、ＰＴを１日１回２５、５０、１００又は２００ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。最初の投与開始日から５日目以降の体重を測定して、体重減少率を求めた。体重減少率は下記式に基づき算出した。
体重減少率（％）＝［｛（最初のＰＴ投与前日の体重）−（ＰＴ投与開始後に測定した体重）｝／（最初のＰＴ投与前日の体重）］×１００
対照群には、ＰＴに代えて生理食塩液を投与した。結果を表３に示す。表３には、マウス４匹の平均及び標準偏差で示した。

表３で示すように、すべての群について、１８日目においても体重減少率が１０％以内であった。そこで、以後の実施例では、ＰＴは、１日１回２００ｍｇ／ｋｇずつ４日間反復投与することにした。

（実施例５）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭ及び６ＴＧの投与による抗腫瘍効果
実施例２と同様な方法でＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後１週後に、６ＴＧを１日１回１２．５ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。６ＴＧ最終投与日に、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を尾静脈より投与した。なお、対照群には６ＴＧ及び^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。６ＴＧの投与開始後、２、４、８、１２又は１５日後に、マウスの腫瘍径を計測した。

（比較例４）ＨＴ２９担がんマウスへの６ＴＧの単独投与による抗腫瘍効果
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例５と同様にした。

（実施例６）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭ及びＰＴの投与による抗腫瘍効果
実施例２と同様な方法でＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後１週後に、ＰＴを１日１回２００ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与した。ＰＴ最終投与日に、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を尾静脈より投与した。なお、対照群にはＰＴ及び^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。ＰＴの投与開始後、２、４、８、１２又は１５日後に、マウスの腫瘍径を計測した。

（比較例５）ＨＴ２９担がんマウスへのＰＴの単独投与による抗腫瘍効果
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例６と同様にした。

［評価２］
実施例５、６、及び、比較例４，５において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を図４に示す。図４では、６ＴＧ又はＰＴの投与を開始した日の前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を示した。また、図４は、マウス６匹の平均及び標準偏差で示した。さらに、図４では、実施例２、比較例１〜３の結果も併せて示した。図４で示すように、６ＴＧ又はＰＴの単独投与では、腫瘍の増殖を抑制できなかった。また、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与では、投与量に応じて腫瘍の増殖を抑制できたが、３７ＭＢｑの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと６ＴＧ又はＰＴとの併用投与により、７４ＭＢｑの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭを単独投与したとき（比較例３）よりも高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。

（実施例７）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭ及び５‐ＦＵの反復投与による抗腫瘍効果
実施例２と同様な方法でＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後１週後に、５‐ＦＵを１日１回２５ｍｇ／ｋｇずつ４日間腹腔内に反復投与し、５‐ＦＵ最終投与日（４日目）に、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を尾静脈より投与した。５−ＦＵ投与開始から２５日目に、再び５‐ＦＵの投与を開始し、１日１回２５ｍｇ／ｋｇずつ４日間反復投与した。そして、５‐ＦＵ最終投与日に、^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）を尾静脈より投与した。なお、対照群には５‐ＦＵ及び^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。。５‐ＦＵの投与開始後、２，４，８，１２，１４，１６，２０，２４，２７，３１，３４日後に、マウスの腫瘍径を計測した。

（比較例６）ＨＴ２９担がんマウスへの５‐ＦＵの単独投与による抗腫瘍効果
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例７と同様にした。

（比較例７）ＨＴ２９担がんマウスへの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
５‐ＦＵを投与する代わりに生理食塩液を投与した以外は、実施例７と同様に行った。

［評価３］
実施例７、及び、比較例６，７において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を図５に示す。図５では、５‐ＦＵの投与を最初に開始した日の前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を示した。また、図５は、マウス６匹の平均及び標準偏差で示した。図５で示すように、５‐ＦＵの単独投与では、腫瘍の増殖をほとんど抑制できなかった。また、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭの単独投与では、投与量に応じて腫瘍の増殖を抑制できたが、３７ＭＢｑの⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと５‐ＦＵとの併用投与により、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭを単独投与したとき（比較例７）よりも高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。なお、何れの投与群においても、体重の減少は認められなかった。

以上の結果から、⁶⁴Ｃｕ‐ＡＴＳＭと体重減少のない量の代謝阻害剤との併用により、有意な抗腫瘍効果が認められ、かつ体重減少も観察されないことが示された。

Claims

^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭを含有し、ピリミジン代謝拮抗剤、プリン代謝拮抗剤、及び、葉酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝阻害剤と併用投与するために用いられる抗腫瘍剤。
前記代謝阻害剤が、フッ化ピリミジン系薬剤である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
前記フッ化ピリミジン系薬剤が、有効成分として、５‐フルオロウラシル、テガフール、カペシタビン及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含有する、請求項２に記載の抗腫瘍剤。
前記代謝阻害剤が、有効成分として、６−チオグアニン、又は、ペメトレキセドを含有する、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
殺がん幹細胞剤として用いられる、請求項１乃至４いずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
前記代謝阻害剤を投与した後に用いられる、請求項１乃至５いずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
前記代謝阻害剤の投与量が、前記代謝阻害剤を単独投与したとき該代謝阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下となるように設定されている、請求項１乃至６いずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭと併用投与するために用いられる、ピリミジン代謝拮抗剤、プリン代謝拮抗剤、及び、葉酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種又は２種以上の抗腫瘍剤。
殺がん幹細胞剤として用いられる、請求項８に記載の抗腫瘍剤。
有効成分として、５‐フルオロウラシル、テガフール、カペシタビン及びこれらの塩からなる群から選択される１又は２以上の化合物を含む、請求項８又は９に記載の抗腫瘍剤。
ピリミジン代謝拮抗剤、プリン代謝拮抗剤、及び、葉酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種又は２種以上の代謝阻害剤と、
^６４Ｃｕ‐ＡＴＳＭと、
を有する抗腫瘍用キット。
がん幹細胞を殺傷するために用いられる、請求項１１に記載の抗腫瘍用キット。
前記代謝阻害剤としてフッ化ピリミジン系薬剤を含む、請求項１１又は１２に記載の抗腫瘍用キット。