JP2016513069A - 安定な二重可変ドメイン免疫グロブリンタンパク質製剤 - Google Patents

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Abstract

本開示は、水性の安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を含む、安定な水性製剤を提供する。本開示はまた、凍結乾燥した安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を含む、安定な凍結乾燥製剤も提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１２年１１月１日に出願された米国仮出願第６１／７２１３６４号の優先権の利益を主張する。本出願はまた、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９４２３１号の優先権の利益も主張する。両優先出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
医薬タンパク質製剤の基本的原則は、ある特定の不安定性、例えば、化学的不安定性および物理的不安定性が克服されなければならないということである。化学的不安定性はしばしば、結合形成または切断を通じたタンパク質の修飾につながる。化学的不安定性に関連する問題の例としては、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離、およびジスルフィド交換が挙げられる。物理的不安定性は、タンパク質の共有結合的変化にはつながらないが、それらも同程度に問題があり、克服困難である。物理的不安定性は、タンパク質の高次構造（二次以上）の変化を伴い、この変化が変性、表面への吸着、凝集、および／または沈殿をもたらし得る（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３）。治療用タンパク質について、化学的および物理的不安定性は、タンパク質を患者への送達用に製剤化することにおいて大きな課題を生み出し得る。凝集はしばしば、最も一般的な種類の物理的不安定性と見なされる。例えば、疎水性界面への曝露は、その界面でのタンパク質分子の整列の物理的不安定性を助長して、そのタンパク質のアンフォールディングを引き起こして空気への疎水性残基の曝露を最大化し、凝集を開始させる。
高濃縮されたタンパク質製剤、特に液体形態の製剤はしばしば、それらがより少量での投薬を可能にし、皮下送達の可能性を提供することから、治療目的に望ましい。高タンパク質濃度製剤の開発は、しかしながら、多くの課題を提示する。例えば、高タンパク質濃度はしばしば、増加したタンパク質凝集、不溶性、および分解をもたらす（考察については、Ｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：１３９０を参照されたい）。
今日まで、認可された治療用タンパク質の大部分は、抗体である。商業的に実現可能な抗体医薬製剤の開発は、しかしながら、抗体が概して同じ構造を有するという事実にもかかわらず、単純明快とはなっていなかった（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：１を参照されたい）。濃度依存的凝集は、抗体を製剤化する際の最も大きな課題のうちの１つと見なされる（Ｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：１３９０）。
二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ））タンパク質は、２つのモノクローナル抗体の機能および特異性を１つの分子実体へと組み合わせるように操作される、多価結合タンパク質である（Ｗｕら、米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の多価性質を考慮すると、これらの分子は、治療薬として多大な有望性を保有する。しかしながら、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、抗体と比較したそれらのはるかにより大きいサイズ（およそ２００ｋＤａ）および複雑性を考慮すると、新たな製剤課題を提示する。
米国特許第７，６１２，１８１号明細書
Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．６：９０３ Ｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９３：１３９０ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６：１
二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ））タンパク質の大部分は、水性製剤中で不安定化（例えば、凝集）を起こしやすいが、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合は、安定に製剤化することができる。水性状態でのいくつかのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体の凝集および／または断片化等の、ある特定の問題を被る。予想外に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合は、高濃度であっても、水性状態で安定に製剤化することができる。かかる安定ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、本明細書で、水性の安定な二重可変ドメイン免疫グロブリンタンパク質または「ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ」タンパク質と称される。
ある特定の実施形態において、本開示は、高濃度ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ製剤を含む、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む安定な水性製剤を提供する。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、貯蔵中に安定したままである（例えば、（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定して）少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度の水性製剤中での加速貯蔵（４０℃）後に、３％未満の凝集増加を示す）、それらの能力によって特徴付けられる、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集団である。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０℃で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０℃で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１０％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０℃で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、クエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、４０℃で１４日間の貯蔵後に、１０％未満の凝集を有するものとして特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、６％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、５％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、４％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、３％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、２％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、１％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度のこのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中で貯蔵される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約５．５〜約６．５ｐＨの水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。他の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５．５〜約６．５ｐＨで、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。本開示の製剤中に含まれ得るＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例としては、ＩＬ４およびＩＬ１３、ＩＬ１αおよびＩＬ１β、ＴＮＦαおよびＩＬ１７、ならびにＤＬＬ４およびＶＥＧＦに対する結合特異性を有する、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本製剤は、約１０％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約９％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約８％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約７％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約６％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約５％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、約４％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。さらなる実施形態において、本製剤は、約３％未満の凝集ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。凝集は、ＳＥＣ分析によって決定されてもよい。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０の水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および緩衝液を含む、水性製剤を提供する。例えば、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液を含む、水性製剤を提供し、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１０％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、本製剤は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約６％以下の凝集を含む。他の実施形態において、本製剤は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約５％以下の凝集を含む。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約５．５〜約６．５ｐＨの水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。他の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５．５〜約６．５ｐＨで、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、本製剤は、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、または約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、製剤中で使用される緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、クエン酸塩、またはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液である。ある特定の実施形態において、緩衝液のモル濃度は、５〜５０ｍＭ、例えば、１０〜２０ｍＭの範囲である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、緩衝液、および界面活性剤を含む、水性製剤を提供する。例えば、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、および界面活性剤を含む、水性製剤を提供し、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、または約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。ある特定の実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜約１％、約０．００５％〜約０．０５％、約０．０１％〜約０．０５％、または約０．１％である。ある特定の実施形態において、製剤中のポリソルベート８０またはポリソルベート２０の濃度は、約０．００５％〜約０．０２％である。ある特定の実施形態において、製剤中で使用される緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、クエン酸塩、またはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液である。ある特定の実施形態において、緩衝液のモル濃度は、５〜５０ｍＭ、例えば、１０〜２０ｍＭの範囲である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、緩衝液、およびポリオールを含む、水性製剤を含む。例えば、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、およびポリオールを含む、水性製剤を提供し、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、または約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、ポリオールは、ソルビトールである。ある特定の実施形態において、製剤中のソルビトールの濃度は、約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約５５ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬソルビトールである。ある特定の実施形態において、ポリオールは、スクロースである。ある特定の実施形態において、製剤中のスクロースの濃度は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約６５〜約９５ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、または約７５〜約８５ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、ポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、製剤中のマンニトールの濃度は、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約２０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０、もしくは約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、製剤中で使用される緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、クエン酸塩、またはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液である。ある特定の実施形態において、緩衝液のモル濃度は、５〜５０ｍＭ、例えば、１０〜２０ｍＭの範囲である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、緩衝液、ポリオール、および界面活性剤を含む、水性製剤を提供する。例えば、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含む、水性製剤を提供し、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、または約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇを含む。ある特定の実施形態において、ポリオールは、ソルビトールである。ある特定の実施形態において、製剤中のソルビトール濃度は、約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約５５ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、ポリオールは、スクロースである。ある特定の実施形態において、製剤中のスクロースの濃度は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約６５〜約９５ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、または約７５〜約８５ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、ポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、製剤中のマンニトールの濃度は、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約２０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０、もしくは約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。ある特定の実施形態において、製剤中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜約１％、約０．００５％〜約０．０５％、約０．０１％〜約０．０５％、または約０．１％である。ある特定の実施形態において、製剤中のポリソルベート８０またはポリソルベート２０の濃度は、約０．００５％〜約０．０２％である。ある特定の実施形態において、製剤中で使用される緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、クエン酸塩、またはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液である。ある特定の実施形態において、緩衝液のモル濃度は、５〜５０ｍＭ、例えば、１０〜２０ｍＭの範囲である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、またはスクロース）、緩衝液（例えば、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、クエン酸塩、またはクエン酸塩／リン酸塩）、および界面活性剤（例えば、ポリソルベート）を含む、製剤を提供し、該製剤は、約５〜約７のｐＨを有し、このＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。ある特定の実施形態において、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０の濃度は、約０．００５％〜約０．０２％である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ポリオール、ヒスチジン緩衝液、およびポリソルベートを含む、製剤を提供し、該製剤は、約５〜約７のｐＨを有し、このＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、６％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、少なくとも６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液を含む、製剤を提供し、このＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１０％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられ、この製剤は、４．５〜７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、界面活性剤、ポリオール、またはこれらの組み合わせをさらに含む。
本開示はまた、部分的に、ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ）タンパク質の大部分が、凍結乾燥状態で不安定化を起こしやすいが、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合が、凍結乾燥形態で安定に製剤化可能であるという驚くべき発見にも基づく。かかる安定ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、本明細書で、凍結乾燥した安定な二重可変ドメイン免疫グロブリンタンパク質または「ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ」タンパク質と称される。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が凍結乾燥状態にあった製剤は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体の凝集および／または断片化等の、ある特定の問題を被る。予想外に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合は、高濃度であっても、凍結乾燥状態で安定に製剤化することができる。
ある特定の実施形態において、本開示は、凍結乾燥した安定なＤＶＤ免疫グロブリン（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を含む、凍結乾燥製剤であり、該製剤が再構成されるとき、該製剤は、約１〜約１００ｍｇ／ｍＬのＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約１０〜約５０ｍＭの緩衝液、ポリオール、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベートを含み、約５〜約７、例えば、約５．５〜約６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で製剤化されるときに、水性製剤中、約５．５〜約６．５のｐＨで、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％超の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化が観察される。
ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化されるときに、水性製剤中、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％超の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化が観察される。
ある特定の実施形態において、本開示は、約５〜約５０ｍＭのモル濃度（例えば、ヒスチジン、コハク酸塩、またはクエン酸塩および／もしくはリン酸塩）を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトール、スクロース、またはトレハロース）を含む、水性製剤を凍結乾燥させることによって調製される、凍結乾燥製剤を提供し、この製剤は、約４．５〜約７．５、例えば、約５．５〜約６．５のｐＨを有する。
ある特定の実施形態において、本開示は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する製剤中で安定しているＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、本製剤は、５〜６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、約５．７〜約６．３のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、約５．５〜約６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、５．８〜約６．２のｐＨ、または６のｐＨを有する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ポリオール、ヒスチジン緩衝液、およびポリソルベートを含む、製剤を提供し、該製剤は、約５〜約７のｐＨを有し、このＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、１５％以下の凝集を有するものとして特徴付けられ、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、少なくとも６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。かかる製剤は、ＳＥＣによって決定するとき、４０℃で１４日間の貯蔵後に、１５％以下の凝集を有するものとして特定される、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として、凍結乾燥状態または水性状態のいずれにあってもよく、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、少なくとも６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
本開示の組成物の１つの利点は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、高濃度の液体形態で安定に製剤化され得るということである。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約２０〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、または約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇである。
本開示の製剤中で使用され得る緩衝液の例としては、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、およびクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、製剤中の緩衝液のモル濃度は、約５〜約５０ｍＭである。ある特定の実施形態において、緩衝液モル濃度は、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭである。
本開示の製剤中で使用され得るポリオールの例としては、ソルビトール、マンニトール、およびスクロースが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ポリオールは、ソルビトールである。ある特定の実施形態において、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬのソルビトールが製剤中で使用される。ある特定の実施形態において、ポリオールは、スクロースである。ある特定の実施形態において、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬのスクロースが製剤中で使用される。さらなる実施形態において、ポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトールが製剤中で使用される。
本開示の製剤中で使用され得る界面活性剤の例としては、ポリソルベートおよびポロキサマーが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベートであり、この例は、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０である。他の例としては、ポロキサマーＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、アルブミン、レシチン、およびシクロデキストリンが挙げられる。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。さらなる実施形態において、ポリソルベートは、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。ある特定の実施形態において、結合タンパク質が４つの機能的な標的結合部位を含む、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖。ある特定の実施形態において、Ｘ１は、ＣＬでない。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含むポリペプチド鎖を含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、Ｘ２は、Ｆｃ領域を表し、ｎは、０または１である。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物および方法において使用されるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含み、このうち２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でなく、かつＸ２がＦｃ領域を含まないことを条件とし、ｎは、０または１であり、該結合タンパク質の該４つのポリペプチド鎖は、４つの機能的抗原結合部位を形成する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１である。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でもＣＬでもないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１である。さらなる実施形態において、重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０であり、かつ／または重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０である。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、このうち第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、第１のリンカーであるが、但し、それがＣＨ２でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、第２のリンカーであるが、但し、それがＣＨ１でもＣＬでもないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１である。
ある特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および第２のポリペプチド鎖のＶＤ１は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの結合部分に由来する。ある特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および第２のポリペプチド鎖のＶＤ２は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの結合部分に由来する。ある特定の実施形態において、第１および第２の親抗体は、同じ標的または異なる標的上の異なるエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、第１の親抗体またはその結合部分は、第２の親抗体またはその結合部分が第２の標的に結合する効力とは異なる効力で、第１の標的に結合する。ある特定の実施形態において、第１の親抗体またはその結合部分は、第２の親抗体またはその結合部分が第２の標的に結合する親和性とは異なる親和性で、第１の標的に結合する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、表５８または６５に記載される重鎖または軽鎖アミノ酸配列を含む、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、表５８または６５（配列番号２８〜７５）に記載される重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。代替として、本開示の製剤は、表５８または６５（配列番号２８〜７５）に記載される重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸配列に記載されるＣＤＲを含む、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それぞれ配列番号６２および６３に記載されるアミノ酸配列を有する、重鎖および軽鎖配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇを含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それぞれ配列番号６６および６７に記載されるアミノ酸配列を有する、重鎖および軽鎖配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤中で使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、次の標的の組み合わせのうちの１つに（いずれの標的順序でも）結合する：ＣＤ２０／ＣＤ８０、ＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２、ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ／ＤＫＫ、ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬ、ＤＬＬ４／ＰＬＧＦ、ＴＮＦ／ＳＯＳＴ（Ｓ２）、ＩＬ−９（Ｓ２）／ＩｇＥ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＴＮＦ／ＩＬ−１７、ＴＮＦ／ＰＧＥ２、ＩＬ１α／ＩＬ１β、またはＤＬＬ４／ＶＥＧＦ。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、医薬水性製剤または医薬凍結乾燥製剤を含む、医薬製剤である。
また、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤を作製および使用する方法も本開示に含まれる。
ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、対象において障害を治療するために使用される。
本開示のさらなる実施形態は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のいずれかを特定する方法である。かかる方法は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、クエン酸塩／リン酸塩緩衝液、および高濃度のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ以上）を含む液体製剤の、加速貯蔵（例えば、約４０摂氏度で１４日間）後の、凝集試験（例えば、ＳＥＣ分析による）を含む。
それぞれ、３つ対４つのドメインアンフォールディングの差異を示す、ＩｇＧ１抗体（ブリアキヌマブ）のＤＳＣプロファイルの、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＴＮＦ／ＰＧＥ２；ＤＶＤ−Ｂ）のＤＳＣプロファイルに対する比較のグラフ図を示す。使用されたＤＶＤ−Ｉｇ溶液の試料組成は、１ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、１ｍＭのイオン強度ヒスチジン（ｐＨ６）、１℃／分の走査速度であった。 種々のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の血清中安定性のグラフ図を示す。 異なる可変ドメイン組み合わせについてのドメイン配向概念を示す。 異なるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と高分子量（ＨＭＷ）凝集体形成との薬物動態パラメータ間の相関のグラフ図を示す。 は、各温度の分子の数に対する（ｙ軸）分子の融解温度を示す、１４個のモノクローナル抗体と１６個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質との熱力学的比較のグラフ図を提供する。抗体の平均開始融解温度は、５９．２℃±３．４℃であった。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の平均開始融解温度は、５３．６℃±３．６℃であった。 ２５０〜３２０ｎｍの波長の近紫外線−ＣＤ走査を使用して測定した、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質におけるモル楕円率をグラフで描写する。
Ｉ．定義
「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の標的結合部位を含む結合タンパク質を表すように使用される。多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作されてもよく、概して、天然に生じる抗体ではない。
「多重特異性結合タンパク質」という用語は、２つ以上の関連のまたは無関連の標的に結合可能な結合タンパク質を指す。多価結合タンパク質の例は、ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ）等の、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質である。ある特定の実施形態において、ＤＶＤ結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含み、四価または多価結合タンパク質である。ＤＶＤは、単一特異性、すなわち、１つの標的に結合可能であっても、または多重特異性、すなわち、２つ以上の標的結合可能であってもよい。
「二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＤＶＤ−Ｉｇ（ＴＭ）」または「ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」という用語は、２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含む、ＤＶＤ結合タンパク質を指す。ＤＶＤ−Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチド、ならびに２つの標的結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、総計６個のＣＤＲが標的結合に関与する。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質における各可変ドメイン（ＶＤ）は、１つ以上の所望の抗原またはエピトープに結合する、１つ以上の「親」モノクローナル抗体（ｍＡｂ）から得られてもよい。ある特定の実施形態において、結果として生じるＤＶＤ−Ｉｇ分子は、両方の親ｍＡｂの活性を保持する。「ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」という用語は、下に記載されるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質という用語を包括する。
「水性の安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ」または「ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」という用語は、約１〜約１００ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１〜１０ｍｇ／ｍＬまたは約５０〜１００ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で、かつｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、所与の温度および時間枠、例えば、５℃または４０℃で１４〜２１日間の安定性試験後に、物理的分解に起因する単量体含量の凝集が低いまたは変化が低い、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合を指す。異なる安定性試験を使用して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇを定義してもよい。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、緩衝化水性製剤中、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、かつｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、緩衝化水性製剤中、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についての安定性試験は、５．０〜６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨのクエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、５０〜１００ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度を有する溶液の安定性、例えば、その溶液の単量体の損失を試験することによって、行われてもよい。
「水性製剤」という用語は、溶媒が水である液状の溶液を指す。ある特定の実施形態において、「水性製剤」という用語は、溶媒が水であり、この製剤が事前に凍結乾燥されていなかった（すなわち、凍結乾燥製剤の再構成からもたらされたものでない）、液体製剤を指す。
「凍結乾燥した安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ」または「ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」という用語は、液体状態で単量体の凝集が低いまたは変化（すなわち、単量体の損失）のレベルが高い、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合を指す。異なる安定性試験を使用して、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇを定義してもよい。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で製剤化されるときに、加速貯蔵、例えば、約４０℃で２１日間の後に、１０％超の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化が観察される。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を含有する、水性製剤中で試験されてもよい。単量体の変化は、ＳＥＣを含むが、これに限定されない、当該技術分野で既知の方法に従って決定することができる。ある特定の実施形態において、加速貯蔵条件は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、光の不在下で約４０℃で貯蔵することを含む。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、５０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有し、ここでＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についての安定性試験は、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨのクエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、約５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ）のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度を有する溶液の安定性、例えば、その溶液の単量体の損失を試験することによって、行われてもよい。
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態にあり、したがって、治療的使用のために対象に投与され得る、調製物を指す。ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇを含む、水性医薬製剤を提供する。他の実施形態において、本開示は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇを含む、凍結乾燥医薬製剤を提供する。
「安定」製剤は、製剤中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が貯蔵時にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持する、製剤である。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｐｐ．２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０において概説される。ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性は、溶液中の単量体タンパク質のパーセンテージに従って、分解（例えば、断片化）および／または凝集したタンパク質のパーセンテージの低さにより決定される。例えば、安定ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む水性製剤は、少なくとも９５％の単量体ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、例えば、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含み得る。代替として、本開示の水性製剤は、５％以下の凝集および／または分解したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、例えば、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含み得る。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それが、色および／もしくは清澄度の外観検査時に、または紫外線光散乱によってもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって測定するときに、凝集、沈殿、および／または変性の徴候を実質的に何ら示さない場合、医薬製剤中で「その物理的安定性を保持する」。本開示のある特定の実施形態において、安定な水性製剤は、製剤中で約１０％未満の凝集、および約５％未満のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質凝集を有する製剤である。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、所与の時点での化学的安定性が、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が下に定義されるその生物活性を依然として保持すると見なされるようなものである場合、医薬製剤中で「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、ＤＶＤ−Ｉｇの化学的に変化した形態を検出および定量することによって、評定することができる。化学的変化は、サイズ変更（例えば、切り詰め）を伴い得、これは例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を使用して、評価することができる。他の種類の化学的変化には、電荷変化（例えば、脱アミド化の結果として生じる）が含まれ、これは、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによって評価することができる。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、医薬製剤中のタンパク質がその意図される目的に対して生物学的に活性である場合、医薬製剤中で「その生物活性を保持する」。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の生物活性は、医薬製剤中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の生物活性が、（例えば、抗原結合アッセイにおいて決定するとき）その医薬製剤が調製された時点で示される生物活性の約３０％、約２０％、または約１０％以内（アッセイの誤差以内）である場合、保持されている。
本明細書で使用される「界面活性剤」という用語は、両親媒性構造を有する有機物質を指し、つまり、それらは、相反する溶解性傾向を持つ基、典型的には油溶性の炭化水素鎖および水溶性のイオン基からなる。界面活性剤は、界面活性部分の電荷に応じて、陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性界面活性剤に分類することができる。界面活性剤はしばしば、生物材料の種々の医薬組成物および調製物のための湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、および分散化剤として使用される。好適な界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、モノラウレート、モノパルミテート、モノステアレート、またはポリオキシエチレンソルビタンの別のエステル等のポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）２０およびＴｗｅｅｎ（ＴＭ）８０等の市販のＴｗｅｅｎｓ（ＴＭ）（ＩＣＩ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（ＤＯＳＳ）、レシチン、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、コレステロール、ポリオキシエチレンリシン油、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ６８（ＴＭ）およびＦ１０８（ＴＭ）、これらはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロック共重合体である）；これらのポリオキシエチレンヒマシ油誘導体または混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、またはポリソルベート８０を含む。
「張度調整剤」または「等張化剤」という用語は、液体製剤の張度を調整するために使用することができる化合物を指す。張度調整剤の例としては、グリセリン、ラクトース、マンニトール、デキストロース、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、マルトース、および当業者に既知の他のものが挙げられる。
「ポリオール」という用語は、複数のヒドロキシル基を有する物質を指し、糖（還元および非還元糖）、糖アルコール、および糖酸を含む。ある特定の実施形態において、ポリオールは、約６００ｋＤ未満である（例えば、約１２０〜約４００ｋＤの範囲の）分子量を有する。「還元糖」は、遊離アルデヒドまたはケトン基を含有し、金属イオンを還元するまたはタンパク質中のリジンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応することができる、糖である。「非還元糖」は、遊離アルデヒドまたはケトン基を欠いており、フェーリング溶液またはベネディクト溶液等の穏やかな酸化剤によって酸化されない、糖である。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、およびグルコースである。非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、およびラフィノースが含まれる。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、およびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸に関しては、これらには、Ｌ−グルコン酸塩およびその金属塩が含まれる。ポリオールもまた、等張化剤として作用し得る。本開示のある特定の実施形態において、製剤のうちの一成分は、約１０〜約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のソルビトールである。本開示の特定の実施形態において、ソルビトールの濃度は、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。ある特定の実施形態において、スクロースの濃度は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬである。本開示の特定の実施形態において、スクロースの濃度は、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬである。
「緩衝液」という用語は、その酸−塩基共役構成成分の作用によってｐＨの変化に耐える、緩衝化溶液を指す。本開示で使用される緩衝液は、約４．５〜約７．５の範囲のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲に制御するであろう緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、メチオニン、イミダゾール、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、クエン酸塩、リン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩、トリス、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。ある特定の実施形態において、本開示の製剤中で使用される緩衝液は、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、酢酸塩、クエン酸塩、および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
「再構成された」製剤は、再構成された製剤中にタンパク質が分散させられるように、凍結乾燥タンパク質製剤を希釈剤中に溶解させることによって調製された製剤である。再構成された製剤は、目的とするタンパク質（例えば、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）での治療対象となる患者への投与（例えば、非経口投与）に好適である。
本明細書で目的とする「希釈剤」は、薬学的に許容され（ヒトへの投与のために安全で非毒性で）、凍結乾燥後に再構成される製剤等の液体製剤の調製に有用である、希釈剤である。例となる希釈剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液が含まれる。代替的なある特定の実施形態において、希釈剤は、塩および／または緩衝液の水溶液を含むことができる。
結合タンパク質の「治療上有効量」または「有効量」は、抗体が有効である障害の予防または治療において有効な量を指す。
「障害」という用語は、本開示の製剤での治療から便益を得るであろう任意の病態を指す。これには、対象を問題の障害にかかりやすくする病的状態を含む、慢性および急性障害または疾患が含まれる。
「治療」という用語は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要とする患者には、すでに障害を有する患者、ならびに障害が予防されるべき患者が含まれる。
「非経口投与」および「非経口投与される」という用語は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による、投与様式を意味し、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射および注入を含む。「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」、および「末梢投与される」という語句は、化合物、薬物、または他の材料を、それが患者の系に進入し、代謝および他の同様のプロセスの対象となるように、中枢神経系への直接投与以外で投与すること、例えば、皮下投与を意味する。
「抗体」という用語は広義に、概して４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の必須の標的結合特長を保持するその任意の機能的断片、突然変異体、変異形、もしくは誘導体を指す。
完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと略称される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと略称される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域へとさらに細分することができ、これにはフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域が間置される。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配列される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）およびクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味し、これは無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域であっても変異形配列Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、概して２つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、任意選択でＣＨ４ドメインを含む。
「抗原結合部分」という用語は、標的または抗原に特異的に結合する、結合タンパク質の１つ以上の断片を指す。かかる実施形態は、単一特異性であってもよく、または二特異性、二重特異性、もしくは多重特異性であってもよい（２つ以上の異なる抗原に特異的に結合し得る）。
結合タンパク質の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合可能である部位である。機能的抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも、抗原結合部位が由来する親抗体と同程度に強力であるとは限らないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体結合を評価するための既知の方法を使用して測定可能でなければならない。その上、多価結合タンパク質の機能的抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、定量的に同じである必要はない。
「リンカー」という用語は、１つ以上の抗原結合部分を連結するために使用される、ペプチド結合によってつながれた２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを表す。かかるリンカーポリペプチドは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
「免疫グロブリン定常ドメイン」は、重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒト重鎖および軽鎖（例えば、ＩｇＧ）定常ドメインアミノ酸配列は、当該技術分野で知られている。
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る潜在的な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原に対して向けられる。さらに、異なるエピトープに対して向けられる異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム突然変異生成もしくは部位特異的突然変異生成によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされた、抗体を含むことを意図されない。
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体等の、１つの種由来の重鎖および軽鎖可変領域配列、ならびに別の種由来の定常領域配列を含む、抗体を意味する。
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、マウスＣＤＲのうちの１つ以上（例えば、ＣＤＲ３）がマウスＣＤＲ配列と置き換えられた、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体等の、１つの種由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、それらのＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つ以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列と置き換えられている、抗体を意味する。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの少なくとも一部分が、より「ヒト様」となる、すなわちヒト生殖系列可変配列により類似するように変化させられた、抗体を意味する。ヒト化抗体の１つの種類は、非ヒトＣＤＲ配列およびヒトフレームワーク配列を含む。
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の可変領域の各々において３つのＣＤＲが存在し、これらは、可変領域の各々につきＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と指定される。本明細書で使用される「ＣＤＲ組」という用語は、標的に結合可能な単一の可変領域において生じる３つのＣＤＲからなる群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、様々な体系により様々に定義される。
「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義および「Ｋａｂａｔラベル付け」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。これらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基よりも可変（すなわち、超可変）である、アミノ酸残基を付番する体系を指す（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域に関して、超可変領域は概して、ＣＤＲ１についてアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２についてアミノ酸５０〜６５位、およびＣＤＲ３についてアミノ酸９５〜１０２位の範囲である。軽鎖可変領域に関して、超可変領域は概して、ＣＤＲ１についてアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２についてアミノ酸５０〜５６位、およびＣＤＲ３についてアミノ酸８９〜９７位の範囲である。
Ｃｈｏｔｈｉａおよび同僚（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内のある特定の小部分が、アミノ酸配列のレベルでより大きい多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格立体配座をとることを見出した。これらの小部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３（「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖および重鎖領域を指定する）として指定された。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称されてもよく、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記の体系のうちの１つに厳密に従っていない場合があるが、それにもかかわらずＫａｂａｔ ＣＤＲと重複し、しかしそれらは、特定の残基もしくは残基の群またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合に大きく影響しないという予測または実験的知見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書で使用される方法は、これらの体系のいずれに従って定義されるＣＤＲを利用してもよいが、実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを使用する。
「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からＣＤＲを差し引いた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、様々な体系によって決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、それに対応して様々な解釈の対象となる。６つのＣＤＲ（重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３、ならびに軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３）はまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４つの小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）へと分割し、ここでＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間、ＣＤＲ２は、ＦＲ２とＦＲ３との間、ＣＤＲ３は、ＦＲ３とＦＲ４との間に位置付けられる。「活性」という用語は、２つ以上の抗原に対するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の結合特異性および結合親和性等の活性を含む。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル等の分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態においては、特定の３次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有してもよい。ある特定の実施形態において、エピトープは、抗体または多重特異性結合タンパク質によって結合される抗原の領域である。
「表面プラスモン共鳴」または「ＳＰＲ」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用した、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの生体分子特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１、およびＪｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７を参照されたい。
「Ｋｏｎ」という用語は、当該技術分野で既知であるように、結合タンパク質が抗原と会合して結合タンパク質／抗原複合体を形成する、オン速度定数を指す。
「Ｋｏｆｆ」という用語は、当該技術分野で既知であるように、結合タンパク質が結合タンパク質／抗原複合体から解離する、オフ速度定数を指す。
「Ｋｄ」という用語は、当該技術分野で既知であるように、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。
結合タンパク質の、第２の化学種との相互作用を参照して本明細書で使用される、「特異的結合」、「特異的に結合すること」、または「特異的に結合する」という用語は、この相互作用がその化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、タンパク質全般よりもむしろ特有のタンパク質構造を認識し、それに結合する。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」およびＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する反応物における、エピトープＡ（または遊離の未標識のＡ）を含有する分子の存在により、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に結合した標識されたＡの量は低減されるであろう。
ＩＩ．本開示の製剤において使用するための二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質
本開示は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の、特にＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特定されるものの、製剤、およびその使用に関する（下により詳細に記載される）。
Ａ．一般のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質構造
ある特定の実施形態において、本開示の製剤および方法において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、Ｘ２は、Ｆｃ領域を表し、ｎは、０または１である。
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、このうち１つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、第２のポリペプチドは、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でなく、かつＸ２がＦｃ領域を含まないことを条件とし、ｎは、０または１であり、該結合タンパク質の該２つのポリペプチド鎖は、２つの機能的抗原結合部位を形成する。
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含有し、このうち２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、２つのポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でなく、かつＸ２がＦｃ領域を含まないことを条件とし、ｎは、０または１であり、該結合タンパク質の該４つのポリペプチド鎖は、４つの機能的抗原結合部位を形成する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１である。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ポリペプチド鎖を含み、このポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でもＣＬでもないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１である。さらなる実施形態において、重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ１）ｎは、（Ｘ１）０であり、かつ／または重鎖および／もしくは軽鎖上の（Ｘ２）ｎは、（Ｘ２）０である。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、このうち第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、第１のリンカーであるが、但し、それがＣＨ２でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、第２のリンカーであるが、但し、それがＣＨ１でもＣＬでもないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１である。
ある特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ１および第２のポリペプチド鎖のＶＤ１は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの結合部分に由来する。ある特定の実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＶＤ２および第２のポリペプチド鎖のＶＤ２は、それぞれ、異なる第１および第２の親抗体、またはそれらの結合部分に由来する。ある特定の実施形態において、第１および第２の親抗体は、同じ標的または異なる標的上の異なるエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、第１の親抗体またはその結合部分は、第２の親抗体またはその結合部分が第２の標的に結合する効力とは異なる効力で、第１の標的に結合する。ある特定の実施形態において、第１の親抗体またはその結合部分は、第２の親抗体またはその結合部分が第２の標的に結合する親和性とは異なる親和性で、第１の標的に結合する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｃは、定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。さらなる実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、ｎは、０または１であり、第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、ｎは、０または１であり、この第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、第１および第２のポリペプチド鎖上のＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、米国特許第７，６１２，１８１号に記載され、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の方法および組成物において使用され得るＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、表５８および６５を含めて、下に記載される。本開示の方法および組成物において使用され得るＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のさらなる例は、配列番号２８〜７５に記載される。
Ｂ．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の生成
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の可変ドメインは、目的とする標的に結合可能なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む、親抗体から得ることができる。これらの抗体は、天然に生じることもあれば、組換え技術によって生成されることもある。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を作成するのに使用され得る抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の多種多様な技法、例えば、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、調製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生が不全である、操作されたマウス株であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（TM）トランスジェニックマウス等、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のうちのいくつかまたは全てを含む非ヒト動物を、目的とする抗原で免疫することによって、産生されてもよい。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を生成する方法は、米国特許第７，６１２，１８１号に記載され、この特許の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の組成物および方法において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、特定の標的に結合可能であり、当該技術分野で周知の抗体から作製されてもよい。これらには、抗ＴＮＦ抗体（米国特許第６，２５８，５６２号）、抗ＩＬ−１２およびまたは抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（米国特許第６，９１４，１２８号）；抗ＩＬ−１８抗体（米国特許公開第２００５０１４７６１０号）、ならびに抗Ｃ５、抗ＣＢＬ、抗ＣＤ１４７、抗ｇｐ１２０、抗ＶＬＡ４、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０Ｌ、抗Ｉｄ、抗ＩＣＡＭ−１、抗ＣＸＣＬ１３、抗ＣＤ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＴＧＦ−β２、抗Ｅ−セレクチン、抗Ｆａｃｔ ＶＩＩ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗Ｆ ｇｐ、抗ＣＤ１１／１８、抗ＣＤ１４、抗ＩＣＡＭ−３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２３、抗β２−インテグリン、抗α４β７、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ ＤＲ、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２０、抗ＭＩＦ、抗ＣＤ６４（ＦｃＲ）、抗ＴＣＲ αβ、抗ＣＤ２、抗Ｈｅｐ Ｂ、抗ＣＡ １２５、抗ＥｐＣＡＭ、抗ｇｐ１２０、抗ＣＭＶ、抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３３、抗ＨＬＡ、抗ＶＮＲインテグリン、抗ＩＬ−１α、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−１受容体、抗ＩＬ−２受容体、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ４受容体、抗ＩＬ５、抗ＩＬ−５受容体、抗ＩＬ−６、抗ＩＬ−８、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−１３、抗ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１７、および抗ＩＬ−２３抗体が含まれるが、これらに限定されない（Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１−６およびＣｌａｒｋ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ（２０００）（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイトにてＭ．Ｃｌａｒｋのホームページでオンライン公開）を参照されたい。
親モノクローナル抗体はまた、臨床治験において使用が認可された、または臨床使用のために開発中の、種々の治療用抗体から選択されてもよい。かかる治療用抗体には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：リツジマブ（ｒｉｔｕｚｉｍａｂ）（ＲＩＴＵＸＡＮ（ＴＭ）Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）すなわち非ホジキンリンパ腫を治療するために認可されたキメラ抗ＣＤ２０抗体；オファツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０（ＴＭ）Ｇｅｎｍａｂ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｅｉｎ）（米国特許第５，５００，３６２号に記載される）すなわちフルダラビンおよびアレムツズマブに不応性である慢性リンパ性白血病を治療するために認可された抗ＣＤ２０抗体；ＡＭＥ−１３３ｖ（Ｍｅｎｔｒｉｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわち抗ＣＤ２０抗体；ベルツズマブ（ｈＡ２０）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）すなわち抗ＣＤ２０抗体；ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）；ＰＲＯ７０７６９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（ＰＣＴ／米国特許公開第２００３／０４０４２６号）すなわち抗ＣＤ２０抗体；トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，６７７，１７１号に記載される）すなわち乳癌を治療するために認可されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；ペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第４，７５３，８９４号に記載される）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（ＴＭ）Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／４０２１０号に記載される）すなわち結腸直腸癌および頭頚部癌を治療するために認可されたキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ ＶＥＣＴＩＢＩＸ（Ｒ）Ａｍｇｅｎ）（米国特許第６，２３５，８８３号に記載される）すなわち結腸直腸癌を治療するために認可された抗ＥＧＦＲ抗体；ザルツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＥＧＦＲ（ＴＭ）Ｇｅｎｍａｂ）（米国特許出願第１０／１７２，３１７号に記載される）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体；ＥＭＤ５５９００（Ｍａｂ ４２５ Ｍｅｒｃｋ）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体；ＥＭＤ６２０００およびＥＭＤ７２０００（Ｍａｂ ４２５ Ｍｅｒｃｋ）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体（米国特許第５，５５８，８６４、Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５２（２）：５４９−６０、Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５−２０、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３号に記載される；ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体（ＰＣＴ公開第ＷＯ ９５／２００４５号、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２（１−３）：１２９−４６、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６７（２）：２４７−５３、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（２）：２２８−３５、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０５（２）：２７３−８０に記載される）；ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（Ｒ）ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＧ）（米国特許第５，８９１，９９６号、米国特許第６，５０６，８８３号、Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（１）：７１−８１に記載される）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体；ＡＢＴ−８０６（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２）：６３９−４４）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体；ＫＳＢ−１０２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲ１−１（ＩＶＡＸ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１６２９３１Ａ２号）すなわち抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体；ＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ公開第ＷＯ ０１／８８１３８号）すなわち抗ＥＧＦＲ抗体；アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（ＴＭ）Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｓａｎｏｆｉ）すなわちＢ細胞慢性リンパ性白血病を治療するために認可された抗ＣＤ５２抗体；ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（ＴＭ）Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）すなわち臓器移植拒絶反応を治療するために認可された抗ＣＤ３抗体；イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（ＴＭ）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）すなわち非ホジキンリンパ腫を治療するために認可された抗ＣＤ２０抗体；ゲムツズマブオゾガマイシン（ｈＰ６７．６ ＭＹＬＯＴＡＲＧ（ＴＭ）Ｐｆｉｚｅｒ）すなわちカリケアマイシンに複合体化された抗ＣＤ３３抗体；アレファセプト（ＡＭＥＶＩＶＥ（ＴＭ）Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ）すなわち抗ＣＤ２ ＬＦＡ−３ Ｆｃ融合体；アブシキマブ（ＲＥＯＰＲＯ（ＴＭ）Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌｉｌｌｙ）すなわち心虚血（ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｈｅｍｉａ）を予防するための経皮的冠動脈形成術の補助物質として認可されたキメラヒト−マウス糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体および抗ビトロネクチンαｖβ３受容体抗体；バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（ＴＭ）Ｎｏｖａｒｔｉｓ）すなわち臓器移植拒絶反応を治療するために認可された抗ＣＦ２５抗体；パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（ＴＭ）Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）すなわちＲＳＶ感染を治療するために認可されたＲＳＶのＦタンパク質のＡ抗原部位に対する抗体；インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（ＴＭ）Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわちクローン病、潰瘍性大腸炎、関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および尋常性乾癬を治療するために認可された抗ＴＮＦαα抗体；アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（ＴＭ）ＡｂｂＶｉｅ）すなわち関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、尋常性乾癬を治療するために認可された抗ＴＮＦα抗体；ＣＤＰ５７１（ＨＵＭＩＣＡＤＥ（ＴＭ）Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ）抗ＴＮＦα抗体；エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（ＴＭ）Ａｍｇｅｎ、Ｐｆｉｚｅｒ）すなわち関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋常性乾癬を治療するために認可された抗ＴＮＦαＦｃ融合抗体；セルトリズマブペゴール（ＣＩＭＺＩＡ）ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ）すなわち関節リウマチおよびクローン病を治療するために認可された抗ＴＮＦα抗体；ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわち尋常性乾癬を治療するために認可されたＩＬ−１２およびＩＬ−２３抗体のヒト抗ｐ４０サブユニット；ガリリモマブ（ｇａｌｉｌｉｍｏｍａｂ）（ＡＢＸ−ＣＢＬ Ａｂｇｅｎｉｘ）すなわちマウス抗ＣＤ１４７抗体；ＡＢＸ−ＩＬ８（Ａｂｇｅｎｉｘ）すなわち抗ＩＬ８抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１（Ａｂｇｅｎｉｘ）すなわち抗ＭＵＣ１８抗体；ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｔｈｅｒａｇｙｎ、Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１Ａｎｔｉｓｏｍａ）すなわちマウス抗ＭＵＣ１−イットリウム９０抗体複合体；Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０ Ａｎｔｉｓｏｍａ）すなわち抗ＭＵＣ１抗体；ＡｎｇｉｏＭａｂ（ｍｕＢＣ−１、ＡＳ１４０５ Ａｎｔｉｓｏｍａ）；ＨｕＢＣ−１（Ａｎｔｉｓｏｍａ）；Ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７ Ａｎｔｉｓｏｍａ）；ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（Ｒ）Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、Ｅｌａｎ）すなわち多発性硬化症およびクローン病を治療するために認可された抗α４インテグリン抗体；ＶＬＡ−１（Ｓａｎｔａｒｕｓ）すなわちヒト化抗ＶＬＡ−１抗体；ＬＴＢＲ ｍＡｂ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗リンホトキシンβ受容体抗体；レルデリムマブ（ＣＡＴ−１５２ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ａｂｂｏｔｔ）すなわち抗ＴＧＦ−β２抗体；ブリアキヌマブ（ＡｂｂＶｉｅ）すなわち抗ＩＬ−１２および２３抗体；メテリムマブ（ＣＡＴ−１９２ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）すなわち抗ＴＧＦβ１抗体；ベルチリムマブ（ＣＡＴ−２１３、ｉＣＯ−００８ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｉＣｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）すなわち抗エオタキシン１抗体；ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（Ｒ）ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）すなわち全身性エリテマトーデスを治療するために認可された抗Ｂリンパ球刺激因子タンパク質抗体；マプツムマブ（ｍａｐｕｔｕｍｕｍａｂ）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ヒトＧｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）すなわち抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体；ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）すなわち転移性結腸直腸癌、非扁平上皮非小細胞肺癌、膠芽腫、転移性腎細胞癌を治療するために認可された抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）；抗組織因子抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）；オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）すなわち重度アレルギー性喘息を治療するために認可された抗ＩｇＥ抗体；エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）すなわち抗ＣＤ１１ａ抗体；ＭＬＮ−０２（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）すなわち抗α４β７インテグリン抗体；ザノリムマブ（ＨＵＭＡＸ ＣＤ４（ＴＭ）Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）すなわち抗ＣＤ４抗体；ＨＵＭＡＸ−ＩＬ１５（ＴＭ）（ＡＭＧ−７１４ Ｇｅｎｍａｂ、Ａｍｇｅｎ）すなわち抗ＩＬ１５抗体；ＨｕＭａｘ−ＩＬ８（ＨＵＭＡＸ−Ｉｎｆｌａｍ（ＴＭ）、ＭＤＸ−０１８ Ｇｅｎｍａｂ、Ｃｏｒｍｏｒａｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）すなわち抗ＩＬ８抗体；ＨＵＭＡＸ（ＴＭ）−Ｃａｎｃｅｒ、（Ｇｅｎｍａｂ、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｏｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）すなわち抗ヘパラナーゼＩ抗体；ＨＵＭＡＸ（ＴＭ）−Ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ｇｅｎｍａｂ）すなわち抗ＩＬ８抗体；ＨＵＭＡＸ（ＴＭ）−ＴＡＣ（Ｇｅｎｍａｂ）すなわち抗ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５抗体；ダラツムマブ（ＨｕＭａｘ（Ｒ）−ＣＤ３８、Ｇｅｎｍａｂ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわち抗ＣＤ３８抗体；トラリズマブ（ＩＤＥＣ−１３１ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗ＣＤ４０Ｌ抗体；クレノリミマブ（ｃｌｅｎｏｌｉｍｉｍａｂ）（ＩＤＥＣ−１５１ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗ＣＤ４抗体；ガリキシマブ（ｇｌａｉｘｉｍａｂ）（ＩＤＥＣ−１１４ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗ＣＤ８０抗体；ルミリキシマブ（ｌｕｍｉｌｉｘｍａｂ）（ＩＤＥＣ−１５２ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗ＣＤ２３；抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、Ｔａｉｓｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ミツモマブ（ＢＥＣ２ Ｉｍｃｌｏｎｅ）すなわちマウス抗イディオタイプ抗体；ＩＭＣ−１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）すなわちキメラ抗ＶＥＧＦＲ２抗体；ＤＣ１０１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）すなわちマウス抗ＶＥＧＦＲ２抗体；；抗ＶＥカドヘリン抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（ＴＭ）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）すなわち抗癌胎児性抗原抗体；エプラツズマブ（ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（ＴＭ）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）すなわち抗
ＣＤ２２抗体；タカツズマブテトラキセタンイットリウム（９０Ｙ）（ＡＦＰ−Ｃｉｄｅ（Ｒ）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）すなわち抗α胎児型タンパク質抗体；ミラツズマブ（ＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ（Ｒ）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）すなわち抗ＣＦ７４抗体；ＬｅｕｋｏＣｉｄｅ（Ｒ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ（Ｒ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（ＴＭ）、ＭＤＸ−０１０ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）すなわち黒色腫を治療するために認可された抗ＣＴＬＡ４抗体；イラツムマブ（ＭＤＸ−０６０ Ｍｅｄａｒｅｘ）すなわち抗ＣＤ３０抗体；ＭＤＸ−０７０（Ｍｅｄａｒｅｘ）すなわち抗前立腺特異的膜抗原；ＯＳＩＤＥＭ（ＴＭ）（ＩＤＭ−１ Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）すなわち抗Ｈｅｒ２抗体；ＨＵＭＡＸ（ＴＭ）−ＣＤ４、すなわちＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＣＤ４抗体；ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、すなわちＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＩＬ１５抗体；ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（ＴＭ）Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわち関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎を治療するために認可された抗ＴＮＦα抗体；ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（Ｒ）、ＣＮＴＯ １２７５ Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）すなわち尋常性乾癬を治療するために認可された抗ＩＬ−１２抗体；ＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）すなわち抗細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体；ＭＯＲ２０１（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）すなわち抗線維芽細胞成長因子受容体３抗体；ビジリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（ＴＭ）ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）すなわち抗ＣＤ３抗体；フォントリズマブ（ＨＵＺＡＦ（ＴＭ）ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）すなわち抗ＩＮＦγ抗体；ボロシキシマブ（Ｍ２００ ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）すなわち抗α５β１インテグリン抗体；ＳＭＡＲＴ（Ｒ）ＩＬ−１２（ＰＤＬ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）すなわち抗ＩＬ−１２；ＩＮＧ−１（Ｘｏｍａ）すなわち抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体；オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）すなわちアレルギー性喘息を治療するために認可された抗ＩｇＥ抗体；ＭＬＮ０１（Ｘｏｍａ）すなわち抗βインテグリン抗体；ならびにトシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（ＴＭ）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）すなわち関節リウマチおよび全身若年性特発性関節炎を治療するために認可された抗ＩＬ６抗体。
Ｃ．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の構築
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを組み合わせることによって形成される。二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）重鎖は、直接またはリンカーによって直列に連結された２つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、続いて定常ドメインＣＨ１およびＦｃ領域を含む。二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）軽鎖は、２つの親ｍＡｂからの２つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が直接またはリンカーを介して直列に連結され、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）があるように、設計される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１２，１８１号の図１Ａを参照されたい）。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を作製する方法はまた、米国特許第７，６１２，１８１号にも記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の可変ドメインは、上述の方法のいずれか１つによって生成される、親抗体からの組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。ある特定の実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲグラフトまたはヒト化可変重鎖または軽鎖ドメインである。ある特定の実施形態において、可変ドメインは、ヒト重鎖または軽鎖可変ドメインである。
リンカー配列は、単一アミノ酸配列またはポリペプチド配列であってもよい。可変ドメインを連結するために使用され得るリンカー配列の例としては、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号３）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号５）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号７）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号８）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）．４（配列番号９）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１０）、ＡＤＡＡＰ（配列番号１１）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１２）、ＴＶＡＡＰ（配列番号１３）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１４）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１５）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１６）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１７）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１８）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１９）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２０）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２１）、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２４）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号２５）、ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号２６）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７）が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーの他の例は、米国特許公開第２０１００２２６９２３号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。リンカー配列の選定は、いくつかの抗体Ｆａｂ分子の結晶構造分析に基づいて決定されてもよい。Ｆａｂまたは抗体分子構造において可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインとの間に天然の可動性連鎖が存在する。この天然連鎖は、ＶドメインのＣ末端からの４〜６個の残基およびＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端からの４〜６個の残基によって提供される、およそ１０〜１２個のアミノ酸残基を含む。本開示のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それぞれＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の軽鎖および重鎖におけるリンカーとして、ＣＬまたはＣＨ１のＮ末端の５〜６個のアミノ酸残基または１１〜１２個のアミノ酸残基を使用して生成された。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に最初の５〜６個のアミノ酸残基は、強力な二次構造を用いることなくループ立体配座を採用し、したがって２つの可変ドメイン間の可動性リンカーとして作用することができる。ＣＬまたはＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部であるため、可変ドメインの天然の延長部であり、したがってそのリンカーまたは接合部から生じる可能性のある免疫原性は、最小化される。リンカーのさらなる例は、表６５に記載される（下線を引かれたアミノ酸を参照されたい）。
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン全ての残基ではないが、ＣＬまたはＣＨ１ドメインの任意の長さの配列、例えばＣＬまたはＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基を含み得、すなわち、軽鎖リンカーは、ＣκまたはＣλからのものであり得、重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む、任意のアイソタイプのＣＨ１に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、Ｇ／Ｓに基づく配列（例えば、Ｇ４Ｓ反復）；ヒンジ領域由来配列、およびタンパク質由来の他の天然配列等の、他のタンパク質に由来してもよい。
ある特定の実施形態において、定常ドメインは、組換えＤＮＡ技法を使用して２つの連結された可変ドメインに連結される。例えば、連結された重鎖可変ドメインを含む配列は、重鎖定常ドメインに連結され、連結された軽鎖可変ドメインを含む配列は、軽鎖定常ドメインに連結される。ある特定の実施形態において、定常ドメインは、それぞれ、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである。ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖は、Ｆｃ領域にさらに連結される。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ領域配列または変異形Ｆｃ領域配列を含んでもよい。ある特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。例えば、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤからのＦｃ領域を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、二重特異的な四価結合タンパク質である。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０およびＣＤ８０に結合し、ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２に結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＲＡＮＫＬに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＤＫＫに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０およびＲＡＮＫＬに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＬＬ４およびＰＬＧＦに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＬＬ４およびＶＥＧＦに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＳＯＳＴに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−９およびＩｇＥに結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８に結合する。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、米国特許第７，６１２，１８１号に記載される。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＩＬ−１７に結合する。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＰＧＥ２に結合する。ＰＧＥ２ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、米国特許公開第２０１０００７４９００号に提供される。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに結合する。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、米国特許第７，６１２，１８１号に記載される。ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−４およびＩＬ−１に結合する。ＩＬ−４およびＩＬ−１３ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例は、米国公開第２０１００２２６９２３号に記載される。上述の特許および特許出願に記載されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のアミノ酸および核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の方法および組成物において使用され得るＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２８〜７５に記載される。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０／ＣＤ８０に特異的に結合し、配列番号３０および３１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ２０／ＣＤ８０ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３０および３１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ２０／ＣＤ８０ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３０および３１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ８０／ＣＤ２０に特異的に結合し、配列番号３２および３３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ８０／ＣＤ２０ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３２および３３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ８０／ＣＤ２０ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３２および３３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２に特異的に結合し、配列番号３４および３５に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２−Ｉｇタンパク質は、配列番号３４および３５に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３４および３５に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＨＥＲ２／ＶＥＧＦに特異的に結合し、配列番号３６および３７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３６および３７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３６および３７に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬに特異的に結合し、配列番号３８および３９に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３８および３９に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号３８および３９に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦに特異的に結合し、配列番号４０および４１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４０および４１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４０および４１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＤＫＫに特異的に結合し、配列番号４２および４３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＤＫＫ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４２および４３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＤＫＫ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４２および４３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＫＫ／ＴＮＦに特異的に結合し、配列番号４４および４５に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＫＫ／ＴＮＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４４および４５に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＫＫ／ＴＮＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４４および４５に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬに特異的に結合し、配列番号４６および４７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４６および４７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬ−Ｉｇタンパク質は、配列番号４６および４７に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＲＡＮＫＬ／ＣＤ２０に特異的に結合し、配列番号４８および４９に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ／ＣＤ２０−Ｉｇタンパク質は、配列番号４８および４９に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＲＡＮＫＬ／ＣＤ２０−Ｉｇタンパク質は、配列番号４８および４９に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＬＬ４／ＰＬＧＦに特異的に結合し、配列番号５０および５１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＰＬＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５０および５１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＰＬＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５０および５１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＰＬＧＦ／ＤＬＬ４に特異的に結合し、配列番号５２および５３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＰＬＧＦ／ＤＬＬ４−Ｉｇタンパク質は、配列番号５２および５３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＰＬＧＦ／ＤＬＬ４−Ｉｇタンパク質は、配列番号５２および５３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＳＯＳＴ（Ｓ２）に特異的に結合し、配列番号５４および５５に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＳＯＳＴ（Ｓ２）−Ｉｇタンパク質は、配列番号５４および５５に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＳＯＳＴ（Ｓ２）−Ｉｇタンパク質は、配列番号５４および５５に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＯＳＴ（Ｓ２）／ＴＮＦに特異的に結合し、配列番号５６および５７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＳＯＳＴ（Ｓ２）／ＴＮＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５６および５７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＳＯＳＴ（Ｓ２）／ＴＮＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５６および５７に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−９（Ｓ２）／ＩｇＥに特異的に結合し、配列番号５８および５９に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−９（Ｓ２）／ＩｇＥ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５８および５９に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−９（Ｓ２）／ＩｇＥ−Ｉｇタンパク質は、配列番号５８および５９に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩｇＥ／ＩＬ−９（Ｓ２）に特異的に結合し、配列番号６０および６１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩｇＥ／ＩＬ−９（Ｓ２）−Ｉｇタンパク質は、配列番号６０および６１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩｇＥ／ＩＬ−９（Ｓ２）−Ｉｇタンパク質は、配列番号６０および６１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＩＬ−１７に特異的に結合し、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７−Ｉｇタンパク質は、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７−Ｉｇタンパク質は、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＰＧＥ２に特異的に結合し、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＰＧＥ２−Ｉｇタンパク質は、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＰＧＥ２−Ｉｇタンパク質は、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１α／ＩＬ−１βに特異的に結合し、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−１α／ＩＬ−１β−Ｉｇタンパク質は、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−１α／ＩＬ−１β−Ｉｇタンパク質は、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＬＬ４／ＶＥＧＦに特異的に結合し、配列番号２８および２９に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８および２９に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８および２９に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＬＬ４／ＶＥＧＦに特異的に結合し、配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の方法および組成物において使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ１２／ＩＬ１８に特異的に結合し、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ１２／ＩＬ１８−Ｉｇタンパク質は、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ１２／ＩＬ１８−Ｉｇタンパク質は、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
Ｄ．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の発現
本開示のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、当該技術分野で既知のいくつかの技法のうちのいずれによって産生されてもよい。例えば、ＤＶＤ重鎖およびＤＶＤ軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）が標準技法によって宿主細胞中にトランスフェクトされる、宿主細胞からの発現。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等の、外来性ＤＮＡを原核性または真核性宿主細胞中に導入するために一般的に使用される、多種多様な技法を包含することが意図される。
本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用）およびＤＧ４４またはＤＵＸＢ１１細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５、Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５）、ＮＳ０骨髄腫細胞、サル腎臓株（例えば、ＣＯＳ ７細胞等のＣＶＩおよびＣＯＳ）、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３細胞等のヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、チャイニーズハムスター線維芽細胞（例えば、Ｒ１６１０）、ヒト子宮頚癌（例えば、ＨＥＬＡ）、マウス線維芽細胞（例えば、ＢＡＬＢｃ／３Ｔ３）、マウス骨髄腫（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３、ＮＳ０、ＳＰ２／Ｏ）、ハムスター腎臓株（例えば、ＨＡＫ）、マウスＬ細胞（例えば、Ｌ−９２９）、ヒトリンパ球（例えば、ＲＡＪＩ）、ヒト腎臓（例えば、２９３および２９３Ｔ）が含まれる。宿主細胞株は、典型的には（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｙ．、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．から）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から、市販されている。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入されるとき、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、宿主細胞を、宿主細胞中でのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の発現または宿主細胞が成長させられる培養培地中へのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の分泌を可能にするのに十分な一定期間、培養することによって産生される。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収される。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の組換え発現のための例となる体系において、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖およびＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖および軽鎖ｃＤＮＡｓは各々、ｃＤＮＡの高レベルの転写を主導するために、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素に作動可能に連結される。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲをコードするｃＤＮＡも保有し、これにより、メトトレキサート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能となる。選択された形質転換体宿主細胞は、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、無傷のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がその培養培地から回収される。標準分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体について選択し、宿主細胞を培養し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を培養培地から回収する。依然としてさらに、本開示は、本開示のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が合成されるまで本開示の宿主細胞を好適な培養培地中で培養することによって本開示のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を合成する方法を提供する。方法は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を培養培地から単離することをさらに含むことができる。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の重要な特長は、それが従来の抗体の場合と同様の方式で産生および精製することができるということである。
Ｅ．水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質および凍結乾燥した安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を特定するための方法
多数のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が不安定で、凝集を起こしやすい一方で、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のある特定の部分集合（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と称される）が、高濃度であっても、水性製剤中で安定しているということは、予想外かつ驚くべき知見である。加えて、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の大部分が凍結乾燥状態で安定していないことが見出された一方で、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のある特定の部分集合（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と称される）は、安定しており、本開示の製剤を使用して首尾よく凍結乾燥することができる。顕著なことに、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特定されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質もまた、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が概してＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質よりも安定していることを考慮すると、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質でもある。加えて、非ＡＳ−ＤＶＤ Ｉｇタンパク質がＬＳ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である可能性もある。２つの部分集団間の識別は、下のアッセイに記載されるように、凝集のレベル、凍結／融解特性、または貯蔵後の単量体含量に基づいてもよい。概して、凝集の増加は、単量体含量の減少を示す。
故に、ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質とを識別するための方法を含む。本開示はまた、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と非ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質とを識別するための方法も含む。別の代替形態において、本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質をＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質から識別するための方法を提供する。特定後、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、本開示の組成物中に首尾よく製剤化され得る一方で、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および非ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、かかる製剤中で安定に留まることができず、単量体含量凝集および／または損失を起こしやすい。概して、凝集の増加は、単量体含量の減少を示す。
ある特定の実施形態において、凍結／融解（Ｆ／Ｔ）（例えば、−８０℃／３０℃）試験を使用して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を特定してもよい。かかる方法は、高濃度のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、１００ｍｇ／ｍＬ）を有する溶液中の高分子量（ＨＭＷ）種のパーセンテージの決定に依存する。一実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、Ｆ／Ｔ周期後にＳＥＣによって決定するとき、高分子量（ＨＭＷ）種の１％以下の増加（凝集体）（例えば、０．５％以下の凝集体）、または単量体相対％の変化の１％未満の増加（例えば、０．５％）を示す、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。Ｆ／Ｔ周期は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液を凍結すること、この溶液を融解させること、任意選択で反復すること、および融解した溶液を凝集レベルについて、例えば、ＳＥＣ分析を使用して試験すること、を含む。凍結／融解試験は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む溶液に対して行われてもよい。ある特定の実施形態において、Ｆ／Ｔ試験は、約３０℃〜−８０℃での４回の凍結／融解周期後に、ＳＥＣによって、凝集あるいは単量体含量の変化を測定することを含む。試験が、４周期後に、凝集体相対パーセントまたは単量体相対％の変化の、約１％を超える増加をもたらす場合、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、非ＬＳ ＤＶＤ Ｉｇと見なされるであろう。
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のアンフォールディング温度を使用して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるかどうかを決定してもよい。図４に記載されるように、約４５℃未満のアンフォールディングの温度を示すＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、概して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられない（図４に記載される「Ａ」）。ある特定の他の実施形態において、約４５〜５０℃のアンフォールディングの温度を示すＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である可能性が低いが、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であり得る（図４に記載される「Ｂ」）。ある特定の他の実施形態において、５０℃よりも高いアンフォールディングの温度を示すＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は概して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる（図４に記載される「Ｃ」）。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質アンフォールディング温度を決定するための試験は、当該技術分野で知られており（熱力学的試験を記載する実施例１もまたを参照されたい）、概して、約５および約７、例えば、約５．５〜約６．５のｐＨで行われる。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇであるかどうかを決定するために、溶液の貯蔵試験を行うことができる。例えば、貯蔵試験は、１〜１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質で、５℃または４０℃で１４〜２１日間行われてもよい。
周囲温度を超える温度、例えば、４０℃での試験は、しばしば、加速条件と称される。ある特定の実施形態において、加速貯蔵条件は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、光の不在下で４０℃で貯蔵することを含む。ある特定の実施形態において、試験は、ＳＥＣによって決定した、高温（例えば、４０℃）および高濃度（例えば、５０ｍｇ／ｍＬ）での溶液のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質凝集レベルに基づく。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液を使用した水性製剤中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化され、加速条件下で貯蔵されてもよい。加速条件は、室温よりも高い温度、例えば、約３５〜約４５摂氏度（Ｃ）の貯蔵温度で、長期間、例えば、約１０〜約２１日間にわたるものを含み得る。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についてスクリーニングするために使用される加速貯蔵条件は、５０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば、約６０ｍｇ／ｍＬまたは５０〜１００ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度で、４０℃の温度で１４日間の貯蔵である。５０ｍｇ／ｍＬ以上、例えば、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度での加速貯蔵試験後に、溶液は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凝集または単量体含量の変化の徴候について試験されてもよい。
ある特定の実施形態において、５．０〜６．５のｐＨ、例えば、約６のｐＨ、および約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する緩衝化溶液（例えば、ヒスチジンまたはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液）中で、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を試験して、それらがＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるかどうかを決定してもよい。
顕著なことに、より低いレベルのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度（例えば、１ｍｇ／ｍＬ）もまた使用してタンパク質を試験してもよく、この場合、より低いレベルの凝集がＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇについて予想されるであろう。例えば、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中１ｍｇ／ｍＬの濃度で約４０℃で貯蔵されるとき、２１日後に３％以下の凝集を有するＤＶＤ−Ｉｇである。
タンパク質凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の方法に従って決定されてもよい。概して、凝集の増加は、単量体含量の減少を示し、この単量体含量の減少もまたＳＥＣ分析を使用して決定することができる。
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、溶液が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によって決定するとき、１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度での加速貯蔵後に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の１０％以下の凝集を有する場合、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、溶液が、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度での加速貯蔵後に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の６％以下の凝集を有する場合、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度での加速貯蔵後に、１０％未満、代替として９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の凝集を有する場合、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、８％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇとして定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、６％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇとして定義される。さらなる実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、５％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇとして定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で約４０℃で２１日間の貯蔵後に、１０％以下の凝集を有する、または水性製剤中５０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化されるときに、約４０℃で１４日後の加速貯蔵後に、１０％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇとして定義される。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で約４０℃で２１日間の貯蔵後に、１０％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、あるいは、水性製剤中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で約５℃で２１日間の貯蔵後に、１％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。代替として、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中１ｍｇ／ｍＬの濃度で約５℃で２１日間の貯蔵後に、１．５％以下の凝集、または水性製剤中１ｍｇ／ｍＬの濃度で約４０℃で２１日間の貯蔵後に、３％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中５０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で製剤化されるときに、約４０℃で１４日後の加速貯蔵後に、１０％未満の凝集体が形成される、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、１０％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、８％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、６％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。さらなる実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、５％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の方法に従って決定することができる。ある特定の実施形態において、加速貯蔵条件は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、光の不在下で４０℃で貯蔵することを含む。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を含有する、水性製剤中で試験されてもよい。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％以下の凝集を有し、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、６％未満の凝集を有し、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
凝集パーセントを使用して、凝集が加速貯蔵後に存在するかどうかを決定してもよいが、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液の単量体含量をまた使用してもよい。概して、凝集パーセントの増加は、単量体含量の減少を示す。代替として、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、このタンパク質が、１５ｍＭのヒスチジン中、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で、５０ｍｇ／ｍＬ以上のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の濃度を有する溶液中、４０℃で１４日後に６％以下の単量体損失（ＳＥＣによって決定）、または４０℃で７日後に３％以下の単量体損失（ＳＥＣによって決定）を有する場合、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされてもよい。単量体含量は、４０℃でおよび／または約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨでの貯蔵を含むが、これらに限定されない、任意の試験条件下で使用されてもよい。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、あるいは、水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度でかつ約５．５〜約６．５ｐＨで、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である。代替として、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１．５％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化、または水性製剤中、１ｍｇ／ｍＬの濃度でかつ約５．５〜約６．５ｐＨで、約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約３％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度でかつ約５．５〜約６．５のｐＨで製剤化されるときに、約４０℃で１４日後の加速貯蔵後に、約１０％未満の相対（ｒｅｌ．）ピーク面積の単量体変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、６０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度でかつ５．５〜６．５のｐＨで製剤化されるときに、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、８％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、６％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。さらなる実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、（例えば、約４０℃で）１４日間の加速貯蔵後に、５％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有し、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のクエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、６％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有し、ここでＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸塩リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
別の代替形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、低温（例えば、５℃）かつ高濃度（例えば、５０ｍｇ／ｍＬ）のＤＶＤ−Ｉｇでの、溶液の凝集安定性および／または単量体含量に基づいて特定される。例えば、１５ｍＭのヒスチジン中、約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで、５０ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する溶液は、５℃で７日後に（ＳＥＣによって決定）、１％以下の単量体（ＳＥＣによって決定）損失を有し得る。別の例において、１５ｍＭのヒスチジン中、約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで、５０ｍｇ／ｍＬのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する溶液は、５℃で１４日後に、２％以下の単量体損失を有し得る。代替として、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇは、水性製剤中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で約５℃で２１日間の貯蔵後に、１％以下の凝集、または水性製剤中１ｍｇ／ｍＬの濃度で約５℃で２１日間の貯蔵後に、１．５％以下の凝集を有する。ある特定の実施形態において、単量体損失は、約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで、決定される。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される試験溶液条件はまた、静菌剤として０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムも含有する。
ある特定の実施形態において、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、溶液が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によって決定するとき、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の１５％以下の凝集を有する場合、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、ＳＥＣ分析によって決定するとき、１５％以下、代替として１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満の凝集を有する場合、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。
ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中５０ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で製剤化されるときに、加速貯蔵、例えば、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、１５％未満の凝集体が形成されるものとして定義される。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、４０℃で、１４日間の加速貯蔵後に、１５％以下の凝集を有する。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、約４０℃で、１４日間の加速貯蔵後に、１４％未満の凝集を有する。さらなる実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、約４０℃で、１４日間の加速貯蔵後に、１３％未満の凝集を有する。代替として、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、４回の凍結融解周期後に１％以下の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を含有する、水性製剤中で試験されてもよい。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、１５％以下の凝集を有し、ここでＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。上述のように、凝集は、ＳＥＣを含むが、これに限定されない、当該技術分野で既知の方法に従って決定することができる。
ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０で製剤化されるときに、加速貯蔵、例えば、約４０℃で２１日間の後に、１０％超の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化が観察される。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、５０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有し、ここでＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中のクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、水性製剤中、約５．０〜約６．５、例えば、約５．５〜約６．０のｐＨで、１００ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で製剤化されるときに、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、２０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、約４０℃で、１４日間の加速貯蔵後に、１８％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する。さらなる実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、例えば、約４０℃で、１４日間の加速貯蔵後に、１３％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する。代替として、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、４回の凍結融解周期後に、１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。代替として、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、最も安定なｐＨの水溶液中、１〜１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１〜１０ｍｇ／ｍＬまたは約５０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約２５℃で７日後に、４％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。代替として、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、最も安定な水溶液中、約５℃で７日後に、１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として定義される。
顕著なことに、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるかどうかを決定するために使用される、本明細書に記載されるアッセイは、排他的なものではなく、つまり、例えば、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇは、少なくとも５０℃のアンフォールディング温度を有するものとして特徴付けられてもよく、また、水性緩衝製剤中、約５０〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度でかつ約５．５〜約６．５のｐＨで、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対ピーク面積変化を有してもよい。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有し、少なくとも５０℃のアンフォールディング温度を有する。
一旦、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、上述の試験に従ってＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であると特定されると、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、安定に製剤化することができる。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のさらなる特定が、実施例４で下に記載される。
ＩＩＩ．本開示の水性の安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）製剤
本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む、安定な水性製剤を提供する。本開示は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が高濃度であっても安定に製剤化され得るという点で、当該技術分野で認識される製剤と比較して改善された特性を有する、水性製剤を特長とする。
故に、本開示は、少なくとも部分的に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集団が、約４．５〜約７．５のｐＨを有し、かつ緩衝液、界面活性剤、および／またはポリオールを含有する水性製剤中で、安定に製剤化され得るという発見にも基づく。これらの「水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と称され、加速貯蔵アッセイを使用して特定することができ、ここでＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ超の濃度で、液体形態で製剤化される（上の第ＩＩ．Ｅ節もまた参照されたい）。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。実際の実施例に記載されるように、ｐＨは、緩衝製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に対して影響を有することが見出された。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する製剤のｐＨは、約４．５〜約７．５の範囲であり、代替として、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤のｐＨは、約５．０〜約７．０の範囲であり、代替としてそのｐＨは、約５〜約６．５の範囲であってもよく、代替として製剤のｐＨは、約５．５〜約６．５の範囲であってもよい。さらなる実施形態において、ｐＨは、約５．８〜約６．２の範囲である。上述のｐＨ値の中間の範囲、例えば、約５．６〜約６．４もまた、本開示の一部であることが意図される。上述の値のうちのいずれかの組み合わせを上限／下限として使用した値の範囲、例えば、約５．５〜約６．２のｐＨ範囲もまた、含まれることが意図される。ある特定の実施形態において、本開示の製剤のｐＨは、約６．０である。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および緩衝液を含む。本開示の製剤中で使用され得る緩衝液の例としては、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、トリス、およびクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の製剤中で使用される緩衝液のモル濃度は、約１〜約５０ｍＭの範囲であってもよい。ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、約５〜約５０ｍＭのモル濃度での緩衝液を有する。代替として、緩衝液のモル濃度は、約１０〜約２０ｍＭである。
本開示のある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約２００ｍＭのヒスチジン（例えば、約２〜約１００ｍＭ、約５〜約７０ｍＭ、約５〜約６０ｍＭ、約５〜約５０ｍＭ、約１０〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭ、または約１０〜約２０ｍＭ）を含む。ある特定の実施形態において、本開示の緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１５ｍＭのヒスチジンを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約４０ｍＭ）のグリシンを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２０ｍＭの濃度のグリシンを含む。さらに特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、約５．５〜約６．５のｐＨで、約２０ｍＭの濃度のグリシン、および約２０〜約３０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約２６ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭの酢酸塩（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約２〜約４０ｍＭ、約５〜約３０ｍＭ、または約２〜約１５ｍＭ）を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２〜約１５ｍＭの濃度で酢酸塩を含む。
本開示のある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約２〜約４０ｍＭ、約５〜約３０ｍＭ、または約２〜約１５ｍＭ）のアルギニンを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１５ｍＭの濃度でアルギニンを含む。
本開示のさらに別の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のクエン酸塩を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１５ｍＭの濃度でクエン酸塩を含む。
本開示のさらに別の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のリン酸塩を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩を含む。一実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩、および約１２５ｍＭの濃度で塩化ナトリウムを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のトリスを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２〜約１０ｍＭの濃度でトリスを含む。
なおも別の実施形態において、緩衝液系は、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約５〜約１０ｍＭ）の濃度でリン酸塩およびクエン酸塩、例えば、リン酸塩（例えば、リン酸水素ナトリウム）、ならびに約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約１０ｍＭ）の濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約５ｍＭの濃度でリン酸塩および約５ｍＭの濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩および約１０ｍＭの濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。
緩衝液に加えて、ポリオールが水性製剤に、例えば、さらなる安定性のために、添加されてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して異なり得る量で製剤に添加されてもよい。ある特定の実施形態において、水性製剤は、等張性である。
本開示の水性製剤において使用され得るポリオールの例としては、ソルビトール、マンニトール、およびスクロース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、およびグルコースが挙げられるが、これらに限定されない。非還元糖には、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、およびグリセロールが含まれる。添加されるポリオールの量もまた、ポリオールの分子量に関して異なり得る。例えば、二糖類（例えば、トレハロース）と比較して、より低い量の単糖類（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。
ある特定の実施形態において、ソルビトール等のポリオールの濃度は、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、本組成物は、約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬのソルビトール、約２５〜約５５ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬを含み、例えば、約３３〜約４８ｍｇ／ｍＬのソルビトールの範囲である。
ある特定の実施形態において、スクロースは、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。ある特定の実施形態において、本組成物は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約６５〜約９５ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約７５〜約８５ｍｇ／ｍＬを含み、例えば、約７２〜約８４ｍｇ／ｍＬのスクロースの範囲である。
ある特定の実施形態において、ポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、本組成物は、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約２０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ｍｇ／ｍＬを含む。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、およびポリオールを含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。
緩衝液に加えて、界面活性剤が水性製剤に、例えば、さらなる安定性のために添加されてもよい。例となる界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン性洗剤が挙げられる。ある特定の実施形態において、添加される界面活性剤の量は、製剤化されたＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凝集を低減する、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、かつ／または吸着を低減するような量である。
ある特定の実施形態において、水性製剤は、洗剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有する。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である。ある特定の実施形態において、本製剤は、約０．００１〜約１％のポリソルベート８０、または約０．００５および約０．０５％のポリソルベート８０、例えば、約０．００１％、約０．００５、約０．０１％、約０．０５％、または約０．１％のポリソルベート８０を含有する。ある特定の実施形態において、約０．０１％のポリソルベート８０が本開示の製剤中に見出される。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、および界面活性剤を含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、約０．００５％〜約０．０２％の濃度を有する。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、緩衝液（例えば、ヒスチジン）、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０、および糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールを含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、緩衝液（例えば、ヒスチジン）、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０、および非還元糖、例えば、スクロースを含む。
本開示の水性製剤の１つの利点は、高濃度のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が水溶液中に安定に維持され得るということである。故に、ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ超、約２０ｍｇ／ｍＬ超、約３０ｍｇ／ｍＬ超、約４０ｍｇ／ｍＬ超、約５０ｍｇ／ｍＬ超、約１００ｍｇ／ｍＬ超、約１１０ｍｇ／ｍＬ超、約１２０ｍｇ／ｍＬ超、約１３０ｍｇ／ｍＬ超、約１４０ｍｇ／ｍＬ超、約１５０ｍｇ／ｍＬ超、約１６０ｍｇ／ｍＬ超、約１７０ｍｇ／ｍＬ超、約１８０ｍｇ／ｍＬ超、約１９０ｍｇ／ｍＬ超、または約２００ｍｇ／ｍＬ超のタンパク質濃度を含む、高タンパク質濃度を含む。
本開示の種々の実施形態において、水性製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の濃度は、約０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５〜２２０ｍｇ／ｍＬ、約１〜２１０ｍｇ／ｍＬ、約５〜２００ｍｇ／ｍＬ、約１０〜１９５ｍｇ／ｍＬ、約１５〜１９０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜１８５ｍｇ／ｍＬ、約２５〜１８０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜１７５ｍｇ／ｍＬ、約３５〜１７０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜１６５ｍｇ／ｍＬ、約４５〜１６０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜１５５ｍｇ／ｍＬ、約５５〜１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜１４５ｍｇ／ｍＬ、約６５〜１４０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜１３５ｍｇ／ｍＬ、約７５〜１３０ｍｇ／ｍＬ、約８０〜１２５ｍｇ／ｍＬ、約８５〜１２０ｍｇ／ｍＬ、約９０−Ｈ５ｍｇ／ｍＬ、約９５〜１１０ｍｇ／ｍＬ、約９５〜１０５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬである。上に列挙される濃度の中間の範囲、例えば、約３１〜１７４ｍｇ／ｍＬもまた、本開示の一部であることが意図される。例えば、上に列挙される値のうちのいずれかの組み合わせを上限／下限として使用した値の範囲もまた、含まれることが意図される。
本開示は、当該技術分野で認識される製剤と比較して改善された特性を有する、水性製剤を特長とする。例えば、本開示の製剤は、７％未満の凝集体、６％未満の凝集体、または５％未満の凝集体のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質凝集レベルを有する。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤中で使用されるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それぞれ配列番号６２および６３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖配列を有する、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質である。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、または配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、またはＤＶＤ−Ａ）、ヒスチジンまたは酢酸緩衝液、およびスクロースまたはソルビトールを含み、この製剤は、約５〜約６のｐＨを有し、このタンパク質濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ以上である。さらなる実施形態において、水性製剤は、約５〜約５．５の範囲、例えば、約５．２のｐＨを有する。さらなる実施形態において、水性製剤は、界面活性剤、例えば、ポリソルベートを含む。列挙される緩衝液、賦形剤、およびｐＨについての範囲は上述される。
ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それぞれ配列番号６６および６７に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖配列を有する抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む、抗ＩＬ１α／ＩＬ−１β ＤＶＤ−Ｉｇである。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、または配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、またはＤＶＤ−Ｃ）、ヒスチジン緩衝液、およびスクロースまたはソルビトールを含み、この製剤は、約５〜約６のｐＨを有し、このタンパク質濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ以上である。さらなる実施形態において、水性製剤は、約５〜約５．５の範囲、例えば、約５．４のｐＨを有する。さらなる実施形態において、水性製剤は、界面活性剤、例えば、ポリソルベートを含む。列挙される緩衝液、賦形剤、およびｐＨについての範囲は上述される。
ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、配列番号２８および２９もしくは配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、または配列番号２８および２９もしくは配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質）、ヒスチジン緩衝液、およびスクロースまたはアルギニンを含み、この製剤は、約５〜約６のｐＨを有し、このタンパク質濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。さらなる実施形態において、水性製剤は、約５．５〜約６の範囲のｐＨを有し、さらなる実施形態において、水性製剤は、界面活性剤、例えば、ポリソルベートである。列挙される緩衝液、賦形剤、およびｐＨについての範囲は上述される。
ＩＶ．本開示の凍結乾燥した安定な二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質製剤
本開示はさらに、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含む、安定な凍結乾燥製剤を提供する。故に、本開示は、少なくとも部分的に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集団が、約４．５〜約７．５のｐＨを有し、かつ緩衝液、界面活性剤、および／またはポリオールを含有する凍結乾燥製剤中で、安定に製剤化され得るという発見にも基づく。これらの「凍結乾燥した安定なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」または「ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質」は、（上述の）加速貯蔵アッセイを使用して特定することができ、ここでＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、５０ｍｇ／ｍＬ超の濃度で、液体形態で製剤化される。
本開示の凍結乾燥製剤の下で言及される特長は、凍結乾燥前の溶液を指しても、あるいは、例えば、液体濃度（ｍｇ／ｍＬ）に言及する、再構成された製剤を指してもよい。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する製剤のｐＨは、約４．５〜約７．５の範囲であり、代替として、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤のｐＨは、約５．０〜約７．０の範囲であり、代替としてそのｐＨは、約５〜約６．５の範囲であってもよく、代替として製剤のｐＨは、約５．５〜約６．５の範囲であってもよい。さらなる実施形態において、ｐＨは、約５．８〜約６．２の範囲である。上述のｐＨ値の中間の範囲、例えば、約５．６〜約６．４もまた、本開示の一部であることが意図される。上述の値のうちのいずれかの組み合わせを上限／下限として使用した値の範囲、例えば、約５．５〜約６．２のｐＨ範囲もまた、含まれることが意図される。ある特定の実施形態において、本開示の製剤のｐＨは、約６．０である。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および緩衝液を含む。本開示の製剤中で使用され得る緩衝液の例としては、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、トリス、およびクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の製剤中で使用される緩衝液のモル濃度は、約１〜約５０ｍＭの範囲であってもよい。ある特定の実施形態において、本開示の水性製剤は、約５〜約５０ｍＭのモル濃度での緩衝液を有する。代替として、緩衝液のモル濃度は、約１０〜約２０ｍＭである。
本開示のある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約２００ｍＭのヒスチジン（例えば、約２〜約１００ｍＭ、約５〜約７０ｍＭ、約５〜約６０ｍＭ、約５〜約５０ｍＭ、約１０〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭ、または約１０〜約２０ｍＭ）を含む。ある特定の実施形態において、本開示の緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１５ｍＭのヒスチジンを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約４０ｍＭ）のグリシンを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２０ｍＭの濃度のグリシンを含む。さらに特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、約５．５〜約６．５のｐＨで、約２０ｍＭの濃度のグリシン、および約２０〜約３０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約２６ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭの酢酸塩（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約２〜約４０ｍＭ、約５〜約３０ｍＭ、または約２〜約１５ｍＭ）を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２〜約１５ｍＭの濃度で酢酸塩を含む。
本開示のある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約２〜約４０ｍＭ、約５〜約３０ｍＭ、または約２〜約１５ｍＭ）のアルギニンを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１５ｍＭの濃度でアルギニンを含む。
本開示のさらに別の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のクエン酸塩を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１５ｍＭの濃度でクエン酸塩を含む。
本開示のさらに別の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のリン酸塩を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩を含む。一実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩、および約１２５ｍＭの濃度で塩化ナトリウムを含む。
ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約４．５〜約７．５のｐＨ、例えば、約５〜約７のｐＨ、または約５．５〜約６．５のｐＨで、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ）のトリスを含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約２〜約１０ｍＭの濃度でトリスを含む。
なおも別の実施形態において、緩衝液系は、約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約５０ｍＭ、約５〜約１０ｍＭ）の濃度でリン酸塩およびクエン酸塩、例えば、リン酸塩（例えば、リン酸水素ナトリウム）、ならびに約１〜約５０ｍＭ（例えば、約５〜約１０ｍＭ）の濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。特定の実施形態において、緩衝液系は、約５ｍＭの濃度でリン酸塩および約５ｍＭの濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約１０ｍＭの濃度でリン酸塩および約１０ｍＭの濃度でクエン酸塩（クエン酸）を含む。
緩衝液に加えて、ポリオールが水性製剤に、例えば、さらなる安定性のために、添加されてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して異なり得る量で製剤に添加されてもよい。ある特定の実施形態において、凍結乾燥製剤は、再構成されると等張性である。
本開示の凍結乾燥製剤において使用され得るポリオールの例としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、およびラフィノースが挙げられるが、これらに限定されない。添加されるポリオールの量もまた、ポリオールの分子量に関して異なり得る。例えば、二糖類（例えば、トレハロース）と比較して、より低い量の単糖類（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。
ある特定の実施形態において、ソルビトール等のポリオールの濃度は、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、本組成物は、約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬのソルビトール、約２５〜約５５ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬを含み、例えば、約３３〜約４８ｍｇ／ｍＬのソルビトールの範囲である。
ある特定の実施形態において、スクロースは、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。ある特定の実施形態において、本組成物は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬのスクロース、約６５〜約９５ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約７５〜約８５ｍｇ／ｍＬを含み、例えば、約７２〜約８４ｍｇ／ｍＬのスクロースの範囲である。
ある特定の実施形態において、ポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、本組成物は、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、または約２０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ｍｇ／ｍＬを含む。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、およびポリオールを含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。
緩衝液に加えて、界面活性剤が凍結乾燥製剤に、例えば、さらなる安定性のために添加されてもよい。例となる界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、６０、８０）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン性洗剤が挙げられる。ある特定の実施形態において、添加される界面活性剤の量は、製剤化されたＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凝集を低減する、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、かつ／または吸着を低減するような量である。
ある特定の実施形態において、凍結乾燥製剤は、洗剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有する。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを説明するために使用される用語である。ある特定の実施形態において、本製剤は、約０．００１〜約０．１％のポリソルベート８０、または約０．００５および約０．０５％、２０ポリソルベート８０、例えば、約０．００１、約０．００５、約０．０１、約０．０５、または約０．１％のポリソルベート８０を含有する。ある特定の実施形態において、約０．０１％のポリソルベート８０が本開示の製剤中に見出される。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、および界面活性剤を含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。ある特定の実施形態において、ポリソルベートは、約０．００５％〜約０．０２％の濃度を有する。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含み、この製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態において、本製剤は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、緩衝液（例えば、ヒスチジン）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）を含む。ある特定の実施形態において、本製剤は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ、緩衝液（例えば、ヒスチジン）、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０、および非還元糖、例えば、スクロースを含む。
本明細書に記載される凍結乾燥製剤は、最初に「前乾燥製剤（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」として作製され、この前乾燥製剤は、凍結乾燥プロセス前の製剤である。前乾燥製剤中に存在するタンパク質の量は、所望の用量体積、投与様式（複数可）等を考慮して決定される。例えば、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の開始濃度は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬであり得る。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤中で使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＩＬ−１７に特異的に結合し、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７−Ｉｇタンパク質は、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７−Ｉｇタンパク質は、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（（例えば、配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、または配列番号６２および６３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、またはＤＶＤ−Ａ）、ヒスチジンまたは酢酸緩衝液、およびスクロースまたはソルビトールを含み、この製剤は、約５〜約６のｐＨを有し、このタンパク質濃度は、再構成されると約５０ｍｇ／ｍＬ超である。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤中で使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ１α／ＩＬ−１βに特異的に結合し、それぞれ配列番号６６および６７に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖配列を含む。ある特定の実施形態において、凍結乾燥製剤中で使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１α／ＩＬ−１βに特異的に結合し、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−１α／ＩＬ−１β−Ｉｇタンパク質は、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ−１α／ＩＬ−１β−Ｉｇタンパク質は、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＩＬ１α／ＩＬ１β ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、または配列番号６６および６７に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、抗ＴＮＦ／ＩＬ−１７ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、またはＤＶＤ−Ｃ）、ヒスチジン緩衝液、およびスクロースまたはソルビトールを含み、この製剤は、約５〜約６のｐＨを有し、このタンパク質濃度は、再構成されると約５０ｍｇ／ｍＬ超である。ある特定の実施形態において、水性製剤は、約５〜約５．５の範囲、例えば、約５．４のｐＨを有する。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤中で使用されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦ／ＰＧＥ２に特異的に結合し、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＰＧＥ２−Ｉｇタンパク質は、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＴＮＦ／ＰＧＥ２−Ｉｇタンパク質は、配列番号６４および６５に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＤＬＬ４／ＶＥＧＦに特異的に結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含み、配列番号２８および２９または配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８および２９または配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８および２９または配列番号７２および７３に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、ＩＬ１２／ＩＬ１８に特異的に結合するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含み、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖ＣＤＲに対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ１２／ＩＬ１８−Ｉｇタンパク質は、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖可変領域に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＩＬ１２／ＩＬ１８−Ｉｇタンパク質は、配列番号７０および７１に記載される重鎖および軽鎖に対応するアミノ酸配列を含む。
凍結乾燥は、当該技術分野で既知の方法に従って行なわれてもよい。Ｈｕｌｌ５０（ＴＭ）（Ｈｕｌｌ，ＵＳＡ）またはＧＴ２０．ＴＭ．（Ｌｅｙｂｏｌｄ−Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）凍結乾燥機等の、多くの異なる凍結乾燥機が、この目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結させ、その後、氷を、一次乾燥のために好適な温度で凍結内容物から昇華させることによって遂行される。この条件下で、生成物温度は、製剤の共融点または崩壊温度を下回る。典型的には、一次乾燥のための棚段温度は、典型的には約５０〜２５０ｍＴｏｒｒの範囲の、好適な圧力で、約−３０〜２５℃の範囲であろう（但し、生成物が一次乾燥中に凍結したままであることを条件とする）。製剤、試料を保持する容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズおよび種類、ならびに液体の体積が、乾燥に必要とされる時間を主に規定することになり、この時間は、数時間から数日間の範囲であり得る（例えば、４０〜６０時間）。任意選択で、二次乾燥段階がまた、生成物中の所望の残渣の水分レベルに応じて行われてもよい。二次乾燥が行われる温度は、主に、用いられる容器の種類およびサイズならびにタンパク質の種類に応じて、約０〜４０℃の範囲である。例えば、凍結乾燥の水完全除去段階全体にわたる棚段温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０℃）であってもよい。二次乾燥に必要とされる時間および圧力は、例えば、温度および他のパラメータに応じて、好適な凍結乾燥ケーキを生産するものであろう。二次乾燥時間は、生成物中の所望の残渣水分レベルによって規定され、典型的には少なくとも約５時間（例えば、１０〜１５時間）かかる。圧力は、乾燥工程中に用いられる圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、製剤およびバイアルサイズに応じて変えることができる。
患者への投与前に、凍結乾燥製剤は、薬学的に許容される希釈剤により再構成され、その結果、再構成された製剤中のタンパク質濃度は、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、例えば、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、代替として約１０ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、代替として約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬとなる。再構成された製剤中のこのような高タンパク質濃度は、再構成された製剤の皮下送達が意図される場合に特に有用であると見なされる。しかしながら、静脈内投与等の他の投与経路については、再構成された製剤中のより低い濃度のタンパク質が所望され得る（例えば、再構成された製剤中、約２〜５０ｍｇ／ｍＬ、または約３〜４０ｍｇ／ｍＬのタンパク質）。ある特定の実施形態において、再構成された製剤中のタンパク質濃度は、前乾燥製剤中のタンパク質濃度よりもかなり高い。再構成は概して、完全な水和を確保するために約２５摂氏度の温度で起こるが、他の温度が所望に応じて用いられてもよい。再構成に必要とされる時間は、例えば、希釈剤の種類、賦形剤（複数可）およびタンパク質の量に依存するであろう。例となる希釈剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。希釈剤は任意選択で、防腐剤を含有する。例となる防腐剤は上述されており、このうちベンジルまたはフェノールアルコール等の芳香族アルコールが好ましい防腐剤である。用いられる防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度を、タンパク質との適合性について評定すること、および防腐剤有効性試験によって、決定される。例えば、防腐剤が芳香族アルコール（ベンジルアルコール等）である場合、それは、約０．１〜２．０％および好ましくは約０．５〜１．５％の量で存在し得るが、最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在し得る。
Ｖ．本開示の使用
本開示の製剤は、治療的に、すなわち、インビボで、またはインビトロもしくはインサイツ目的のための試薬としての両方で、使用されてもよい。本開示の方法をまた使用して、治療的使用に有利である特性を有する水系製剤を作製してもよい。水性製剤を医薬製剤として使用して、対象において障害を治療してもよい。
本開示の製剤を使用して、この治療用タンパク質が治療に適切である、任意の障害を治療してもよい。「障害」は、このタンパク質での治療から便益を得るであろう任意の病態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病的状態を含む、慢性および急性障害または疾患が含まれる。抗ＴＮＦ ＤＶＤ−Ｉｇの場合、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の治療上有効量が、関節リウマチ等の自己免疫疾患、クローン病等の腸障害、強直性脊椎炎等の脊椎関節症、または乾癬等の皮膚障害を治療するために投与されてもよい。抗ＩＬ−１２ ＤＶＤ−Ｉｇの場合、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の治療上有効量が、多発性硬化症等の神経障害、または乾癬等の皮膚障害を治療するために投与されてもよい。本開示の製剤を使用して治療してもよい障害の他の例としては、乳癌、白血病、リンパ腫、および大腸癌を含む、癌が挙げられる。
「対象」という用語は、生存生物、例えば、原核生物および真核生物を含むことが意図される。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。本開示の具体的な実施形態において、対象は、ヒトである。
「治療」という用語は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置の両方を指す。治療を必要とするものは、障害をすでに持つもの、ならびに障害が予防されるべきものが含まれる。
水性製剤は、ヒトを含む、治療を必要とする哺乳動物に、既知の投与方法に従って投与されてもよい。投与方法の例としては、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、および経皮が挙げられる。
タンパク質の適切な投薬量（「治療上有効量」）は、例えば、治療対象の病態、病態の重症度および過程、タンパク質が予防目的それとも治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴およびタンパク質への反応、使用されるタンパク質の種類、ならびに担当医師の裁量に依存するであろう。タンパク質は、患者に一度にまたは一連の治療にわたって投与され、患者に診断以降のいずれの時点で投与されてもよい。タンパク質は、唯一の治療として、または問題の病態を治療するのに有用な他の薬物もしくは治療法と併せて、投与されてもよい。
本開示の医薬製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質すなわち活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変えられてもよい。
選択される投薬量レベルは、製剤中で見出されるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄速度、治療の継続期間、用いられる特定の化合物と併用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、病態、全身の健康状態、および以前の診療歴、ならびに医療技術分野で周知の同様の要因を含む、多様な要因に依存するであろう。
本開示のある特定の実施形態において、製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の投薬量は、約１〜約２５０ｍｇである。ある特定の実施形態において、製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の投薬量は、約３０〜約１４０ｍｇ、約４０〜約１２０ｍｇ、約５０〜約１１０ｍｇ、約６０〜約１００ｍｇ、または約７０〜約９０ｍｇである。さらなる実施形態において、本組成物は、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｇのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質投薬量を含む。
本開示のある特定の実施形態において、（再構成時の）製剤中のＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の投薬量は、約１〜約２５０ｍｇである。さらなる実施形態において、製剤中のＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇの投薬量は、約３０〜約１４０ｍｇ、約４０〜約１２０ｍｇ、約５０〜約１１０ｍｇ、約６０〜約１００ｍｇ、または約７０〜約９０ｍｇである。さらなる実施形態において、本組成物は、約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０ｍｇのＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ投薬量を含む。
本開示の製剤は、しばしば高濃度のタンパク質、特にＤＶＤ−Ｉｇタンパク質等の複合体タンパク質に関連する、タンパク質凝集の問題を含む、製剤開発において既知の一般的な問題を克服する。故に、ある特定の実施形態において、本開示の製剤は、高レベルのこの新たな治療用タンパク質形式が患者に投与され得る、新たな手段を提供する。
本明細書に提示される実施例は、予想外の安定性特性を有する、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を含有する製剤を記載する。実験は、水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質または凍結乾燥した安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質と称される、ある特定のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、それぞれ水性製剤または凍結乾燥製剤中で安定していたが、一方で他のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、同様に製剤化されたときに凝集および不安定性を示したという点で、驚くべきものであった。実験は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を特定するための方法、ならびにその安定製剤を例として示す。
材料および方法
本明細書に記載される方法を、水性および凍結乾燥製剤中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を評定および監視するために行われた実験において使用した。
一般的方法
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤を、一般の品質パラメータ（例えば、ｐＨ）、物理的安定性のパラメータ（例えば、清澄度、色、粒子汚染、および純度）、および化学的安定性のパラメータ（例えば、脱アミド化、酸化、および一般の化学的安定性）について試験した。例となる試験には、可視的な微粒子汚染についての試験、不可視的な粒子のための光遮断粒子数についての試験、およびサイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（本明細書でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とも称される）およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）等の純度についての試験が含まれた。
微粒子汚染（例えば、可視的粒子）を目視検査によって決定した。不可視的な粒子を、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）に従った光遮断アッセイによって監視した。製剤の物理化学的安定性を、断片および凝集体の検出を可能にするＳＥＣによって評定した。化学的安定性を監視するために、ＳＥＣ（断片および加水分解の検出のため）およびＩＥＣを行った。
試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質
本明細書に提供される実施例において試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、表１に列挙される。表１に記載されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の配列が、表６５に提供される。
Figure 2016513069
出発材料としてのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を精製後に得、それは９５％超が単量体型であった。
陽イオン交換ＨＰＬＣ法
ＩＥＣの一形態である陽イオン交換ＨＰＬＣを使用して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の素性および純度を決定した。アッセイを、下に詳述されるパラメータにより行った。
Ｄｉｏｎｅｘ ＷＣＸ−１０Ｇガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）と組み合わせた、Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ（Ｒ）ＷＣＸ−１０分析カラム（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を、上限カラム圧力を２１０バールに制限しながら実行した。移動相Ａは、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）からなった。この緩衝液は、４．９７ｇの無水リン酸水素二ナトリウムをおよそ３３００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解させ、ｐＨを、１Ｍのリン酸を使用して７．０に調整し、緩衝液体積をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で３５００ｍＬまで増加させ、溶液を膜フィルターに通して濾過することによって、作製した。移動相Ｂは、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）からなった。この緩衝液は、２．５６ｇの無水リン酸水素二ナトリウムをおよそ１５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解させ、ｐＨを、１Ｍのリン酸を使用して６．０に調整し、緩衝液体積をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１８００ｍＬまで増加させ、溶液を膜フィルターに通して濾過することによって、作製した。陽イオン交換ＨＰＬＣ法の要約が表２に記載される。
Figure 2016513069
ＩＬ１２ＩＬ１８およびＤＶＤ ６６ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質については、使用する移動相を次のように変更した：
移動相Ａ：１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、および
移動相Ｂ：１０ｍＭ ＭＥＳ＋５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．６）。
ＩＬ１αＩＬβについては、使用する移動相を次のように変更した：
移動相Ａ：２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）、および
移動相Ｂ：２０ｍＭリン酸塩＋５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）。
Figure 2016513069
ＩＥＣの同様のバージョンを種々の他のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のために使用した。
サイズ排除ＨＰＬＣ法
サイズ排除ＨＰＬＣを使用して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液の純度を決定した。アッセイを下に概説されるように行った。
ＴＳＫゲルガード（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ、カタログ番号０８５４３、６．０ｍｍ×４．０ｃｍ、７μｍ）を、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ、カタログ番号０８５４１、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ）と組み合わせて、７０バールの上限カラム圧力を用いて実行した。移動相は、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／２００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４（ｐＨ７．０）からなった。この緩衝液は、４９．６８ｇの無水リン酸水素二ナトリウムおよび９９．４４ｇの無水硫酸ナトリウムをおよそ３３００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解させ、ｐＨを、１Ｍのリン酸を使用して７．０に調整し、緩衝液体積をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で３５００ｍＬまで増加させ、溶液を膜フィルターに通して濾過することによって、作製した。
実験用パラメータは次のように列挙された：
流量：０．３ｍＬ／分、
注射体積（２０μｇ試料に匹敵）：２０μＬ、
カラム温度：室温、
オートサンプラ温度：２〜８℃、
実行時間：５０分間、
溶出：均一濃度勾配。
検出を、２１４ｎｍ波長（０．１分超のピーク幅および８ｎｍ帯域幅）および３６０ｎｍ参照波長（１００ｎｍ帯域幅）を使用したダイオードアレイ検出器を使用して行った。
試験試料を２系列で注射した。純度を、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ピークの面積を、緩衝液関連ピークを除いて、試料中の全ての２１４ｎｍ吸収構成成分の総面積と比較することによって決定した。高分子量凝集体および抗体断片を、この方法を使用して無傷のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質から分解した。
凍結／融解アッセイ
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性溶液を、反復した凍結／融解アッセイを使用して測定した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を−８０℃で凍結させ、次いで水浴中３０℃で融解させ、結果として生じる溶液を、凝集についてはＳＥＣによって、かつ／または不可視的な粒子形成については光遮断アッセイによって、分析した。
加速およびリアルタイム貯蔵安定性研究
製剤のｐＨおよび貯蔵温度は、タンパク質液体製剤および凍結乾燥物製剤の長期貯蔵中のタンパク質安定性に影響を及ぼす、２つの重要な要因である。長期貯蔵を模倣してより低い温度（例えば、２〜８℃）での長期貯蔵に対する製剤の成否の洞察を迅速に得るために、タンパク質製剤を昇温、例えば、４０℃での短期貯蔵（加速貯蔵）にさらして、これらの要因の影響を評定した。リアルタイムの貯蔵安定性を評定するために、試料をまた２〜８℃でも維持した。
光遮断アッセイ
光遮断アッセイを、凝集しているＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液の不溶性微粒子含量を測定するために行った。光遮断測定機器（粒子計数器、モデルシリンジ、Ｋｌｏｔｚ Ｂａｄ Ｌｉｅｂｅｎｚｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ、シリーズＳ２００３７）に層流空気フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ、モデル番号ＵＬＴ２５８６−９−Ａ４０）を装着して、測定中の異質粒子汚染を最小限にした。光遮断分析を次のように行った。３．５ｍＬの試料を５ｍＬの丸底管中に、層流空気流条件下で配置した。最初の０．８ｍＬのすすぎ後、測定を、製造業者の仕様書に従って、ｎ＝３モード（１測定当たり０．８ｍＬ）で行った。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣ分析に先立ち、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、好適な緩衝液系の中へ透析した。この緩衝液系（例えば、５ｍＭリン酸塩／５ｍＭクエン酸塩をまた、ＤＳＣ測定のための参照／ブランクとしても使用した。抗体を１〜２ｍｇ／ｍＬで分析した。自動ＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。分子のアンフォールディングを、１℃／分の走査速度を２５℃〜９５℃の温度範囲にわたって適用することによって研究した。他の測定パラメータは次の通りであった：当てはめ期間：１６秒間；プレ走査待ち時間：１０分間；フィードバックモード：なし。
気液界面振動研究
振動研究を、ＨＳ ２６０ ＩＫＡシェーカー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）上の６Ｒガラスバイアル中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、１５０ｒｐｍ（毎分回転数）の速度で行った。試料の光学密度を種々の期間の振動後に評価した。同様に、ＳＥＣもまた種々の時点で取り出した試料に対して行った。
ＰＥＧ溶解度
ＰＥＧ ３０００を溶解度研究のために使用した。ＰＥＧ ３０００の５０ｗ／ｖ％溶液を水中で調製した。この溶液の少量のアリコートを０．５ｍｇ／ｍＬ濃度で緩衝液中のタンパク質の原液に添加した。最初の沈殿の徴候が始まった時点で必要とされた総体積を書き留めた。
真正溶解度
真正溶解度評価のために、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を濃縮し、５℃で一晩貯蔵した。溶液を沈殿、相分離、混濁度等について目視検査した。上清（または両相）を、溶解した濃度について確認した。
近紫外線−ＣＤ
近紫外線−ＣＤ走査を１ｍｇ／ｍＬ濃度で、充填した２ｍＬのバイアルを使用して、Ｊａｓｃｏ分光計（ＪＡＳＣＯ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）により２５０〜３２０ｎｍで取った。走査速度は５０ｎｍ／分であり、平均３つの走査を取った。分光計を、ランプを回すことによって平衡化させた後、データを取得した。
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光測定
ＦＴＩＲ走査を１ｍｇ／ｍＬ濃度で、１０μＬ溶液を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＴＲ−ＦＴＩＲ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により取った。走査を４００〜４０００ｃｍ−１で収集し、面積を正規化し、二次導関数を得た後、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して曲線当てはめを行った。
光散乱
光散乱研究をＭａｌｖｅｒｎゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により、１７３°の後方散乱角度を使用して行った。トルエンを標準物として使用し、緩衝液（例えば、酢酸塩、ヒスチジン、およびトリス）をブランクとして使用した。自動モードを使用した。
動的走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ＤＳＦを用いて、タンパク質のアンフォールディングが生じる傾向を評定した。この技法は、色素Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅをタンパク質試料に添加することを伴った。この蛍光色素は、疎水性表面に感受性があり、かかる環境で増加した蛍光を示す。色素を含む試料を次いで加熱し、温度の関数としての蛍光シグナルを監視した。温度が増加するにつれて、タンパク質は、アンフォールディングが生じ始め、その疎水性内面を曝露した。これは、この領域への色素結合およびより大きい蛍光シグナルにつながった。シグナルが増加し始める温度は、開始温度（Ｔｏｎ）である。内因的な安定性がより低いタンパク質は、内因的な安定性がより高いタンパク質よりも、アンフォールディングが生じやすく、より低いＴｏｎ値を有する。ＤＳＦはまた、９６ウェル形式でのクローンの迅速なスクリーニングのための高処理ツールも提供し、ＤＳＣにおけるより大量の試料およびより長い実行時間の潜在的な制限を排除する。６μＬの０．４Ｘ ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を２７μＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液に添加した。走査速度は１℃／分であり、走査を２５〜７５℃で取った。
凍結乾燥方法
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を標準方法に従って凍結乾燥し、結果として生じる凍結乾燥物の安定性を調査した。
試料調製および凍結乾燥
バイアルに、オートクレーブ処理し乾燥させた溶解栓で栓をした。その後、バイアルを凍結乾燥機で凍結乾燥させた。典型的な周期が表４において下に示される。試料を１００ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液へと再構成した。
Figure 2016513069
Ｉ．ＤＶＤ−ＩＧタンパク質の安定性
実施例１〜３は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性が、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の増加した構造的複雑性に起因して、抗体よりも低い、例えば、より容易に凝集し、より低い融解温度を有することを実証する。
実施例１．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および抗体の熱力学的比較
抗体と比較したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を決定するために実験を行った。ＩｇＧ１分子（モノクローナル抗体、ｍＡｂ）およびＤＶＤ−Ｉｇの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行って、この２つの分子の熱力学的特性における差異を決定した。具体的には、ＤＳＣを行って、例となる抗体（ブリアキヌマブ、抗ＩＬ１２モノクローナル抗体）の熱力学的特性を、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＴＮＦ／ＰＧＥ２、ＤＶＤ−Ｂ）のそれと比較した。製剤情報およびＤＳＣ条件が実施例２において下に提供される。ブリアキヌマブのＤＳＣプロファイルの、ＴＮＦ／ＰＧＥ２（ＤＶＤ−Ｂ）のそれとの比較により、３つのドメインアンフォールディング対４つのドメインアンフォールディングにおける差異が示される（図１）。図１から、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の熱的アンフォールディングが抗体のそれよりも早く開始したこともまた明白であり、このことは、ＤＶＤ−Ｉｇ分子の全体的な熱力学的安定性（または内因的な安定性）が抗体のそれよりも低いことを示す。図１（ＤＶＤ−Ｂ）におけるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、約５０℃で最初のアンフォールディングを示すＤＳＣプロファイルを有した一方で、この同じＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、さらなる安定性試験からの結果を考慮するとＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられたことに留意すべきである。
ｍＡｂの熱力学的安定性（例えば、動的走査熱量測定によって決定したアンフォールディングの開始）は、概して、表１に列挙されるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のパネルと比較しておよそ約５℃より高い。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の群のアンフォールディングの温度と凝集傾向との間には概して何の直接相関もないが、これらの値をスクリーンとして使用して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の所与の群の安定性を評定することができる。したがって、アンフォールディングの開始温度を利用して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質またはＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を特定することができる。図４に記載されるように、全体的な分布は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が概して、抗体と比較してより低いアンフォールディング温度を有することを示す。図４は、１６個の異なるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および１４個の異なる抗体からまとめられた結果を提供する。図４に記載される研究において行われたアッセイは、上述のものおよび図１におけるものと同様である。
実施例２．溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼすｐＨの影響
４、６、または８のｐＨを有する溶液中で製剤化されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の熱力学的安定性（内因的な安定性）を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して評価した。全ての製剤が５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度を有した。加熱を１℃／分の走査速度で行った。複数のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼすｐＨの影響を示す結果が下の表５に提供される。表５に記載されるＴｍ１〜Ｔｍ４は、種々のドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン等の熱的融解／アンフォールディング温度を表す。２つの抗体（アダリムマブおよびブリアキヌマブ）の安定性もまた比較のために記載される。
Figure 2016513069
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表５に示されるように、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は概して、約５０℃超のアンフォールディング開始温度を有し、融解温度はしたがって、抗体および他の安定タンパク質の融解温度よりも若干低い。実施例２は、ブリアキヌマブおよびアダリムマブについての開始温度がｐＨ６で６０℃前後であるが、一方で、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質については、平均が５３℃前後であることを示す。
データはまた、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の融解温度が、ｐＨ４でよりもｐＨ６およびｐＨ８でより高いことを示す。故に、ｐＨは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の物理化学的安定性に影響し、安定性は、およそｐＨ６で最良であるように思われる。
長期貯蔵中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の安定性に及ぼす溶液ｐＨの影響をさらに評定するために、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤を、貯蔵に供する前（Ｔ０）または３ヶ月間の加速貯蔵に供した後（Ｔ３ｍ）に、ＳＥＣを使用して分析した。４、６、または８のｐＨで製剤化された、溶液（８０ｍｇ／ｍＬスクロースの存在下での５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質）中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を評価した。加速貯蔵については、試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）４０℃で貯蔵した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体（Ｍｏｎ）凝集体（Ａｇｇ）、および断片（Ｆｒａｇ）パーセンテージを、ＳＥＣを使用して決定し、その結果が表６に提示される。
Figure 2016513069
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表６における結果は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が最初にｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨ範囲で製剤化され得ること、およびＴ０時点で新たに調製された試料の最初の値が大きな差異を示さないことを示した。しかしながら、加速貯蔵後に、ｐＨ４およびｐＨ８でのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、単量体の有意な損失および凝集体または断片化の対応する増加を示した。
試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性は、ｐＨ６前後で最も高かった。試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の全て（ＤＶＤ ５、ＤＶＤ ６、ＤＶＤ ３８、ＤＶＤ ５３、ＤＶＤ ５４、ＤＶＤ ６５、ＤＶＤ ６６、ＤＶＤ １６５、ＤＶＤ １６６、ＤＶＤ ２５８、ＤＶＤ ２７７、およびＤＶＤ ２７８を含む）が、Ｈ４でまたはｐＨ８でよりもｐＨ６で、より高い単量体パーセンテージおよびより低い断片パーセンテージを有した。
試験された１２個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの９個が、ｐＨ４でよりもｐＨ６で、より低い凝集体パーセンテージを示し、逆のパターンを示した３個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質について、ｐＨ６およびｐＨ４での凝集体パーセンテージの差異は、非常に小さかった（２．７％未満の差異）。また、試験された１２個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの１１個が、ｐＨ８でよりもｐＨ６で、より低い凝集体パーセンテージを示した。故に、加速貯蔵は、増加した凝集体形成をもたらした。しかしながら、増加は、特にｐＨ６で、予期したよりも低かった。
ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の貯蔵安定性に及ぼす溶液ｐＨの影響
貯蔵中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の安定性に及ぼす溶液ｐＨの影響を評定するために、４、６、または８の溶液ｐＨを有するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤を、貯蔵に供する前（Ｔ０）または５℃、４０℃、もしくは５０℃で４日間（４ｄ）、７日間（７ｄ）、もしくは２１日間（２１ｄ）の貯蔵に供した後に、ＳＥＣおよびＩＥＣを使用して分析した（表６、７、および８を参照されたい）。評価された溶液は、２ｍｇ／ｍＬのＩＬ１２−ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇ濃度を有し、１０ｍＭクエン酸塩および１０ｍＭリン酸塩の緩衝液中にあった。試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）貯蔵した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体、凝集体、および断片のパーセンテージを、ＳＥＣを使用して決定し（表７を参照されたい）、主要種、酸性および塩基性種を、ＩＥＣを使用して評定した（表８を参照されたい）。
Figure 2016513069
ＳＥＣデータは、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤がｐＨ６で最も安定していたことを示す。ｐＨ６で、貯蔵されたＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤は概して、９５％超の単量体および２％未満の凝集体を示した。５０℃で２１日間の加速貯蔵条件下であっても、製剤は、９０％超の単量体および５％未満の凝集体を保持した。ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇ製剤は、特により長い継続期間およびより高い温度の貯蔵条件下で（例えば、２１日間、５０℃の条件下で）、ｐＨ４およびｐＨ８よりもｐＨ６でより安定していた。これらの結果によれば、ＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、５０℃での貯蔵後の安定性結果を考慮すると、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされるであろう。
Figure 2016513069
ｐＨ４、６、および８でのＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤についてＩＥＣデータは、化学分解がｐＨおよび貯蔵温度に依存することを示す。最も高い化学的安定性が、５℃で貯蔵された試料について観察された。２１日後に検出された安定性の小規模な変化は、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、商業用の生物学的治療薬に一般的であると見なされる、この貯蔵温度で安定していることを示した。安定性の差異は小さかったものの、最も高い化学的安定性がｐＨ６での製剤について観察された。化学的安定性の欠如は、４０℃および５０℃の上昇した貯蔵温度でさらにより顕著であった。
実施例３．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質はモノクローナル抗体よりも容易に凝集する
抗体対ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凝集に対する振動の影響を検査した。振動は、分子の凝集につながり得る応力である。振動後の凝集に対するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＴＮＦ／ＰＧＥ２（ＤＶＤ−Ｂ）の感受性を、６Ｒバイアル中、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する溶液を使用して（ｐＨ６の溶液、１０ｍＭクエン酸塩／１０ｍＭリン酸塩）、モノクローナル抗体ブリアキヌマブと比較した。６Ｒバイアルに、５ｍＬのタンパク質溶液の試料を充填し、ＨＳ ２６０ ＩＫＡシェーカー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）上で、１５０毎分回転数（ｒｐｍ）の速度で、種々の時間の長さにわたって（０、５、２４、４８、または９６時間）振動した。試料を、溶液の混濁度の測定を提供する、５００ｎｍでの光学密度について確認した。より高い混濁度は、より大きい凝集およびより低い安定性を示す。結果が表９に示され、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がモノクローナル抗体よりも容易に凝集することを明らかにしている。
Figure 2016513069
溶液の混濁度を示すＯＤ５００測定値によって示されるように、振動は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、モノクローナル抗体よりも、より多くの不可視的なおよび可視的な凝集体を形成する原因となった。故に、４８時間の振動後、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、コロイド不安定をより起こしやすく、したがって、モノクローナル抗体よりも安定性が低かった。モノクローナル抗体と比較した、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のより高い可視的な凝集体形成は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が概して、溶液中の剪断応力に対して、モノクローナル抗体よりも安定性が低いことを示す。また、これらの結果は、全てのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、ｐＨ６でモノクローナル抗体と同程度に安定であるわけではないことを示唆する。
ＩＩ．水性の安定なＤＶＤ−ＩＧタンパク質（ＡＳ−ＤＶＤ−ＩＧ）を特定するためのアッセイ
実施例４．ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、「水性の安定な」または「水性不安定」と特徴付けることができる。
上に考察されるように、発明者らは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が水性状態にある製剤が、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体の凝集および／または断片化等の、ある特定の問題を被ることを見出した。発明者らは、実験を実施し、驚くべきことにかつ予想外に、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合が、高濃度であっても、水性状態で安定に製剤化され得ることを発見した。次の実施例は、ＳＥＣ研究を記載し、これは、驚くべきことに、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が水性の安定なである、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積の低いパーセント変化を有するか、または水性不安定である、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が凝集およびまたは断片化を起こしやすいかのいずれかであると特徴付けられ得ることを示している。顕著なことに、試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の多くは、水性不安定または凍結乾燥不安定であることが見出された。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の構造的複雑性および高濃度での顕著な疎水性相互作用に起因して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が高濃度の製剤中で安定であろうとは予想されなかった。
より低い温度（例えば、２〜８℃）での長期貯蔵に対する製剤の成否の洞察を迅速に得るために、種々のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を昇温での短期貯蔵にさらして、タンパク質液体製剤の加速貯蔵または長期貯蔵中の、タンパク質安定性に及ぼす貯蔵温度の影響を評定した。
高濃度で１４日間の安定性スクリーニング
６０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤を、貯蔵に供する前（Ｔ＝０）または１４日間の加速貯蔵に供した後（Ｔ＝１４日）に、ＳＥＣを使用して分析した（表１０）。溶液（８０ｍｇ／ｍＬスクロースを含む、６０ｍｇ／ｍＬの１０ｍＭクエン酸塩／１０ｍＭリン酸塩緩衝液）中の貯蔵ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を４０℃で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。手短に述べると、試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）４０℃で貯蔵した。所定の時点で、調製した溶液の試料を、試料取り出しスキームに従って分析のために取り出した。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質単量体（Ｍｏｎ）凝集体（Ａｇｇ）、および断片（Ｆｒａｇ）パーセンテージを、ＳＥＣを使用して決定し、その結果が表１０に提示される。
Figure 2016513069
驚くべきことに、表１０に示されるように、発明者らは、試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の部分集合が水性状態で製剤化されたときに安定していたことを発見した。試験された１２個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの１０個（ＤＶＤ ５、ＤＶＤ ６、ＤＶＤ ３７、ＤＶＤ ６５、ＤＶＤ ６６、ＤＶＤ １６６、ＤＶＤ ２５７、ＤＶＤ ２７７、ＤＶＤ ２７８、およびＤＶＤ ２８２）は、１４日間の加速貯蔵後に、２６％未満の凝集体形成を示し、７３％超の単量体を有した。試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの５個（ＤＶＤ ６、ＤＶＤ ６５、ＤＶＤ ６６、ＤＶＤ １６６、およびＤＶＤ ２８２）は、１０％未満の凝集体形成を示し、これらのうちの３つ（ＤＶＤ ６６、ＤＶＤ １６６、およびＤＶＤ ２８２）は、５％未満の凝集体形成を示した。
上述のように、ある特定のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（「水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ」タンパク質または「ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ」タンパク質）は、高濃度（例えば、６０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度）で製剤化されるときでさえも、４０℃で１４日間の加速貯蔵後に、安定したままである（例えば、ＳＥＣによって決定するとき、６％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化または１０％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化）。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の大部分は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の一般構造および実施例１〜３に記載される安定性研究に基づいて予想された通り、加速貯蔵中に凝集する傾向があった（非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質）。故に、ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質から区別するためのカットオフを、５０ｍｇ／ｍＬ超でｐＨ６で、４０℃で１４日間貯蔵したときの、１０％以下の正味凝集体の形成として取ったが、これは試験された１２個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの５個がこのレベルで凝集体形成を示した、上記の非限定的な実施例において見られる通りである。ある特定の実施形態において、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質とを区別するためのカットオフを、５０ｍｇ／ｍＬ超でｐＨ６で、４０℃で１４日間貯蔵したときの、６％以下の正味凝集体の形成として取ったが、これは試験された１２個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のうちの４個がこのレベルで凝集体形成を示した、上記の非限定的な実施例において見られる通りである。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の多くは、低い凝集、例えば、５℃で２１日後に１％以下の凝集または４０℃で２１日間の貯蔵後に１０％以下の凝集を示さない。例えば、４℃または４０℃のいずれかで５０ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ／ＩＬ１３ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度を有する溶液中の７日後の単量体損失を検査したアッセイにおいて、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の多くは、ＳＥＣによって決定したとき、単量体損失の増加を示した。いくつかの場合において、単量体損失の量は、これらの場合において単量体レベルが増加したため、マイナスであった（例えば、凝集体のうちのいくつかは解離して、単量体を再び形成し、よって、損失が外見上減少した）。第３の実験は、５０ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度を有する溶液中のＴＮＦ／ＳＯＳＴ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を４℃で試験した。ＴＮＦ／ＩＬ１３ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に関する実験にあるように、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の多くは、単量体損失の増加を示した（ＳＥＣによって決定）。
顕著なことに、上記のアッセイをまた使用して、凍結乾燥した安定なＤＶＤ−免疫グロブリン（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を識別することもできる。ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と非ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質とを区別するためのカットオフを、５０ｍｇ／ｍＬ超でｐＨ６で、４０℃で１４日間貯蔵したときの、１５％以下の正味凝集体の形成として取った。故に、上記のアッセイにおいて試験された、１０％未満もしくは６％未満の凝集、または１０％未満もしくは６％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化をもたらす、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の両方と見なされ、１５％未満の凝集または１５％未満の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化をもたらすＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされる。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の両方とも、試験された全体的なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のあるパーセンテージのみに相当する。
ＩＩＩ．製剤中の非ＡＳ−ＤＶＤ−ＩＧタンパク質の安定性
次の実施例は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（第ＩＶ〜ＶＩＩＩ節に記載される）と比較した、製剤中の非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（上の実施例４に記載される、凝集試験に不合格である、すなわち、例えば、６％超の凝集を示す）の安定性を示すデータを提供する。
実施例５：例となる非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性に及ぼす濃度の影響
長期貯蔵安定性に及ぼすタンパク質濃度の影響を評定するために、１、２、５、１０、２５、５０、および７５ｍｇ／ｍＬの濃度の例となる非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の製剤を、４０℃で１４日間の貯蔵に供した。製剤は、ｐＨ６であり、１５ｍＭのヒスチジン単独の緩衝液中にあった。試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）貯蔵した。試料をＳＥＣを使用して分析して、貯蔵後の凝集体パーセンテージを決定した。結果として生じたデータが表１１に提供される。
Figure 2016513069
表１１におけるデータは、試験された条件（すなわち、ｐＨ６、１５ｍＭヒスチジン緩衝液）下で、高濃度に達した４０℃で１４日間の貯蔵後に、ＤＶＤ−Ｂが不安定となる、つまり、高比率の凝集体が形成することを示す。形成された凝集体パーセンテージは、２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で１８％を超えた。故に、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるＤＶＤ−Ｂは、貯蔵中の増加した凝集から明らかなように、ヒスチジン緩衝液中で安定しなかった。
実施例６：例となる非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性に及ぼす、ｐＨ、イオン強度、および濃度の影響
溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性に及ぼす、ｐＨ、イオン強度、および濃度の影響を評定するために、ＤＶＤ−Ｂの種々の製剤（５ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬ）を４０℃および５℃で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。次の緩衝液を使用した：ｐＨ４．５に酢酸塩、ｐＨ６にヒスチジン、およびｐＨ８にトリス。１ｍＭのイオン強度溶液には２ｍＭの濃度の緩衝液、２０および１００ｍＭのイオン強度溶液には１０ｍＭの濃度の緩衝液を使用した（塩化ナトリウムを使用してさらにイオン強度を維持した）。試料を、各々およそ５００μＬの滅菌バイアル中に充填し、温度室内および光の不在下にある制御条件下で貯蔵した。５℃で３ヶ月（５Ｃ、３ｍ）または４０℃で２１日間（４０Ｃ、２１ｄ）の後、調製した溶液の試料を、ＳＥＣを使用して分析した。ＳＥＣを使用して測定した正味の凝集体の数が表１２に提示される。表１３および１４は、異なる安定剤／賦形剤（例えば、スクロースおよびＴｗｅｅｎ８０）の添加が、規定の時点後に残留した単量体パーセントに大きな改善をもたらさなかったことをさらに示す（上述の手法を使用して結果を得た）。低濃度試料についての最初の時点での正味凝集体値の負の値はまた、可逆的凝集体の最初の形成を示す。
Figure 2016513069
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製剤へのポリオールの添加は、１ｍｇ／ｍＬにあるＤＶＤ−Ｂの単量体含量の若干の改善および凝縮体レベルの減少をもたらした。
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製剤へのポリオールの添加は、１００ｍｇ／ｍＬにあるＤＶＤ−Ｂの単量体含量の若干の改善および凝縮体レベルの減少をもたらした。
Figure 2016513069
データは、種々の溶液条件を分析したものの、ＤＶＤ−Ｂが、ｐＨ６であってもさほど安定しなかったことを示す（例えば表１３を参照されたい）。また、ｐＨ６で、イオン強度は、正味の凝集体形成との一貫した関係を示さなかった。５℃の貯蔵条件にあってさえも高量の凝集体が形成されたことによって、乏しい安定性が示される。さらに、ポリオールおよび／または界面活性剤の添加も、ＤＶＤ−Ｂの凝集を改善しかった（表１３、１４、および１５を参照されたい）。
実施例１〜３に上述のように、多くのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、内因的に不安定である。しかしながら、驚くべきことに、ある特定のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、実施例４に記載されるように、安定していると特徴付けられ得る。下記の実施例に記載される実験は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、アミノ酸配列の差異にもかかわらず、高濃度であっても予想外に安定して製剤化され得ることを実証する。下記の実施例は、実施例５および６と対照的であり、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤化の不成功を示す。
ＩＶ．ＡＳ−ＤＶＤ−ＩＧタンパク質は、４．５〜７．５のＰＨ範囲にある緩衝液を含有する製剤中で安定している。
実施例７：ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす緩衝液濃度の効果
緩衝液、例えばヒスチジンの濃度は、タンパク質液体製剤の加速／長期貯蔵中にタンパク質安定性に影響し得る重要な要因のうちの１つである。より低い温度（例えば、２〜８℃）での長期貯蔵に対する安定した製剤についての洞察を迅速に得るために、タンパク質を昇温およびリアルタイム温度での短期貯蔵にさらして、この影響を評定した。
溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を、４０℃および５℃で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。評価したヒスチジンの濃度は、０、５、１５、５０、および２００ｍＭを含む。
試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）貯蔵した。７日および２１日後、調製した溶液の試料を、ＳＥＣおよびＩＥＣを使用して分析した。
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＊沈殿は、不溶性である可視的凝集体が観察されるかどうか（有または無）を示す。
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表１６および１７は、異なる時点および不溶性凝集体の形成時に残留している単量体の量により、約５〜約５０ｍＭの範囲にあるヒスチジン濃度が最適な安定性を提供したことが示唆されることを示す。約２００ｍＭのヒスチジンの濃度は、いくつかの場合において、不溶性凝集体の形成をもたらした（表１６における沈殿の指標を参照されたい）。０ｍＭのヒスチジン製剤は、いくつかの場合における不溶性および可溶性凝集体の形成によって示されるように、増大した凝集を示した（いくつかの場合において、可溶性凝集体は、０で、５ｍＭのヒスチジン濃度でのそれよりも高かった）。第２に、ｐＨは、ヒスチジンを含有する製剤において、より長い貯蔵時間にわたってよく維持されることが予想される。
ＩＥＣ測定値の誤差は通常、同じ製剤でのＳＥＣ測定値と比較して、より高い（２〜３％の変動）。よって、それを考慮に入れると、ＩＥＣによってアッセイしたときに製剤内で大きな差異は観察されず、これにより、化学的安定性がヒスチジンのモル濃度にさほど影響されなかったことから化学的安定性が緩衝液濃度から独立している（概して、凝集傾向とは対照的に）ことが示される。
実施例８：溶液中のＡＳ−ＤＶＤ Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ−Ｃ抗ＩＬ１アルファ／ベータＤＶＤ−Ｉｇタンパク質）の安定性の実施例
抗ＩＬ１α／βＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ−Ｃ）を、異なるｐＨおよび異なる温度にある異なる緩衝液中１００ｍｇ／ｍＬと１ｍｇ／ｍＬとの両方で、経時的な安定性に対して評定した。１００ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｃで試験した緩衝液は、１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４）、１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ５．５）、１５ｍＭコハク酸塩（ｐＨ５．５）、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）、水（緩衝液なし）（ｐＨ６．０）、１５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．０）、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．５）、および１５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を含んだ。１ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｃで試験した緩衝液は、ｐＨ３、４、５、６、７、または８にある１０ｍＭクエン酸塩＋１０ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。
試料を、５０℃、４０℃、２５℃、および５℃で貯蔵した。ある特定の時点で、試料を取り出し、安定性について評価した。物理的安定性を、凝集体％、単量体％、断片％を含めて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣまたはＳＥＣ）によって評価し、回収した総計種を定量した。化学的安定性を、定量した酸性種％、主要種％、および塩基性種％を含めて、弱陽イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣまたはＩＥＣ）によって評価した。
表１８および１９は、種々の緩衝液およびｐＨにおける１００ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬそれぞれでのＤＶＤ−Ｃの安定性を記載する。表１７および１８の両方において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）データおよびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）データが示される。製剤および省略形の解は、各表の下に与えられる。
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製剤および省略形の解：
酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩
ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン
ｓｕｃｃ＝１５ｍＭコハク酸塩
水＝透析によって水中で製剤化
クエン酸塩＝１５ｍＭクエン酸塩
トリス＝１５ｍＭトリス
ＨＭＷ％＝ＳＥＣによって定量した高分子量種のパーセンテージ
Ｍ％＝ＳＥＣによって定量した単量体のパーセンテージ
ＬＭＷ％＝ＳＥＣによって定量した低分子量種（断片）のパーセンテージ
ＡＵＣ＝ＳＥＣ曲線の総積分面積
酸性％＝ＩＥＣによって定量した、主要種に対する酸性種のパーセンテージ
主要物質％＝ＩＥＣによって定量した主要種のパーセンテージ
塩基性％＝ＩＥＸによって定量した、主要種に対する塩基性種のパーセンテージ
Ｔ０＝時間ゼロ
Ｔ７ｄ＝７日間の貯蔵
Ｔ１ｍｏ＝１ヶ月間の貯蔵
Ｔ３ｍｏ＝３ヶ月間の貯蔵
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省略形の解：
ＨＭＷ％＝ＳＥＣによって定量した高分子量種のパーセンテージ
Ｍ％＝ＳＥＣによって定量した単量体のパーセンテージ
ＬＭＷ％＝ＳＥＣによって定量した低分子量種（断片）のパーセンテージ
ＡＵＣ＝ＳＥＣ曲線の総積分面積
酸性％＝ＩＥＸによって定量した、主要種に対する酸性種のパーセンテージ
主要物質％＝ＩＥＸによって定量した主要種のパーセンテージ
塩基性％＝ＩＥＸによって定量した、主要種に対する塩基性種のパーセンテージ
ＮＤ＝種を検出せず
ＮＲ＝アッセイを実施せず
０＝時間ゼロ
７ｄ＝７日間の貯蔵
２１ｄ＝１ヶ月間の貯蔵
３ｍｏ＝３ヶ月間の貯蔵
６．５ｍｏ＝６．５ヶ月間の貯蔵
分子は、ｐＨ３での透析の間に完全に分解した。種は、時間ゼロでのこの条件で、透析後、ＳＥＣまたはＩＥＣによって何ら検出されなかった。また、ｐＨ４で５０℃での貯蔵も、同じ結果を生んだ。両結果は、ＮＤによって示される。
加えて、ＤＶＤ−Ｃの熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評定した。熱安定性を、ｐＨ４、５、６、７、または８にある１０ｍＭクエン酸塩＋１０ｍＭリン酸緩衝液中で製剤化された１．０ｍｇ／ｍＬの分子で評価した。より高い開始温度のアンフォールディング、またはより高いドメイン中点温度のアンフォールディングは、より優れた熱安定性を意味する。異なるｐＨでの熱安定性はしばしば、これらのｐＨで製剤化された分子の長期の安定性と相関する。したがって、ＤＳＣデータは、分子が最も安定しているおよび最も安定していないｐＨを特定することに役立ち得る。
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上述のように、３つの異なる温度（４０℃、２５℃、または５℃）で貯蔵したときのＤＶＤ−Ｃの安定性を、多数の異なる緩衝液およびｐＨにおいて試験した。ＤＶＤ−Ｃの濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬにわたった。１００ｍｇ／ｍＬで、緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、クエン酸塩、およびトリスを含んだ。ＤＶＤ−Ｃもまた、淡水中で製剤化した。製剤のｐＨは、４〜８にわたった。１ｍｇ／ｍＬで、タンパク質を、３〜８にわたるｐＨのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液中で製剤化した。製剤化後すぐに、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の試料を、前述の温度で貯蔵した。特定の時点で、アリコートを取り、ＳＥＣによって物理的安定性を、および弱陽イオン交換（ＷＣＸ）によって化学的安定性を、評定した。
全体的に、データは、ＤＶＤ−ＣがｐＨ３およびｐＨ４以外で安定していることを示した。具体的には、データは、ＤＶＤ−Ｃの物理的安定性がｐＨ５．５付近で最良であり、化学的安定性がｐＨ６．０付近で最高であることを示した。ヒスチジンおよびコハク酸塩が、これらのｐＨに対して適切な緩衝液であると決定した。
加えて、ＤＶＤ−Ｃの熱安定性を、表１８に記載されるように、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評定した。熱安定性を、ｐＨ４〜８にあるクエン酸塩−リン酸緩衝液中で製剤化した１．０ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｃで評定した。より高い開始温度のアンフォールディング（Ｔｏｎ）、またはより高いドメイン中点温度のアンフォールディング（Ｔｍ）は、より優れた熱安定性を意味する。熱安定性は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の長期の安定性と相関する可能性が高い。データは、５〜８のｐＨ範囲において同様の熱安定性を示す。
実施例９：ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼすポリオールの効果
動的走査蛍光法（ＤＳＦ）を利用して、タンパク質のアンフォールディングが生じる傾向を評定した。溶液中のタンパク質の安定性に及ぼすこれらのポリオールの効果を評定するために、ポリオール、例えば、スクロースおよびソルビトールの影響を調査した。例となるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として、ＤＶＤ−Ａ、ＤＶＤ−Ｃ、およびＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を使用した。下の表２１に示されるように、概して、種々の濃度（１、１００、１５０ｍｇ／ｍＬ）にあるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、スクロース（例えば、４０〜１６０ｍｇ／ｍＬ）およびソルビトール（例えば、２０〜８０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で安定している。その上、提供されたソルビトールおよびスクロースの濃度の増加は、若干の増加した安定性をもたらした。よって、タンパク質製剤を含有する緩衝液（例えば、１５ｍＭヒスチジン）への糖類の添加は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を若干増大させる。
Figure 2016513069
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表２１における上記のデータから明らかなように、ポリオール（例えば、ソルビトールおよびスクロース）は、広範囲（２０〜１６０ｍｇ／ｍＬのスクロースおよび２０〜８０／ｍｇ／ｍＬのソルビトール）で、溶液中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を改善することができる。さらに、データは、増加するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度によるアンフォールディングの開始の減少、それによる熱力学的安定性の減少を明らかにする。これらのデータは、高濃度の液体製剤で観察された凝集等の、観察された不安定性と相関する。
Ｖ．ＡＳ−ＤＶＤ−ＩＧタンパク質は、４．５〜７．５のＰＨ範囲にある緩衝液およびポリオールを含有する製剤中で安定している
実施例１０：ポリオールを含有する製剤中のＤＶＤ−Ａの貯蔵安定性に及ぼす緩衝液の効果
異なる緩衝液中のＤＶＤ−Ａの貯蔵安定性に及ぼす緩衝液の効果を評定するために、製剤の安定性を、貯蔵前（Ｔ０）、または４０℃での貯蔵（加速貯蔵）の７日後（７ｄ）もしくは２１日後（２１ｄ）に評定した。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるＤＶＤ−Ａ（８５ｍｇ／ｍＬ）を、ｐＨ５．２にある種々の緩衝液（１５ｍＭクエン酸塩、１５ｍＭヒスチジン、１５ｍＭアルギニン、１５ｍＭ酢酸塩、または水）中で製剤化した。試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、温度室内および光の不在下にある制御条件下で貯蔵した。試料をＳＥＣを使用して分析し、結果が表２２および２３に提供される。
Figure 2016513069
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表２２に提供されるＳＥＣ結果は、ｐＨ４のヒスチジン製剤と比較したｐＨ５．２のヒスチジン製剤が最低レベルの凝集体を有したが、クエン酸塩および酢酸塩緩衝液もまた、低レベルの凝集体を示したことを示す。クエン酸塩および酢酸塩は、ＳＥＣによって測定したときにより少量の可溶性凝集体を示したものの、溶液は目に見えて混濁しており、不溶性凝集体の形成を示した。しかしながら、ＳＥＣ測定値を考慮すると、可視的な濁度は顕著ではなかった。全体的に、クエン酸塩および酢酸塩製剤は、ヒスチジン製剤よりも若干安定度が低いのみであった。ＩＥＣ測定値のノイズ／誤差は通常高めであることを考慮すると、化学的安定性における大きな差異は、表２３に提示した製剤内では観察されなかった。ポリオール単独製剤もまた、ヒスチジン製剤と比較して若干安定度が低かった。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特定されるタンパク質の全体的な安定性特性を考慮すると、表２２および２３のＳＥＣおよびＩＥＣ分析において観察された若干の差異は、ｐＨ５．２にある試験した緩衝液の各々が安定していることを示した。故に、ｐＨ５．２にある試験した緩衝液間で観察された差異は、各々を使用して、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対して、高濃度にあるそれらを含めて、安定した製剤を提供し得ることを示した。
ＶＩ．ＡＳ−ＤＶＤ−ＩＧタンパク質は、４．５〜７．５のＰＨ範囲にある、緩衝液、ポリオール、および界面活性剤を含有する製剤中で安定している
実施例１１：ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、界面活性剤および糖類を含有する様々なヒスチジン製剤中で安定している。
次の実施例は、加速／リアルタイム安定性試験の間の低濃度および高濃度製剤でのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の物理化学的安定性に及ぼす、ｐＨ、緩衝液、および賦形剤（界面活性剤およびポリオールを含む）の影響を記載する。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、モノクローナル抗体と比較して際立って異なるタンパク質特性を有することを実証するために、モノクローナル抗体の安定性を維持するために周知であり使用されている５つの異なる製剤条件を試験した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を使用して、低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）およびより高濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の貯蔵安定性を、貯蔵なし（Ｔ０）、５℃の制御温度で１ヶ月（１ｍ、５Ｃ）、および４０℃の制御温度で１ヶ月（１ｍ、４０Ｃ）という３つの貯蔵条件に従って評価した。多様なｐＨ（５．２５〜７．２の範囲を選択）、緩衝液、および賦形剤を用いた製剤を、次の条件に従って試験した。
１）ｐＨ５．２５およびｐＨ６、１５ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０
２）ｐＨ６、１５ｍＭヒスチジン、４０ｍｇ／ｍＬソルビトール、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０
３）ｐＨ６および７．２にあるＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１２５ｍＭ ＮａＣｌ）
４）２０ｍＭグリシン、２６ｍｇ／ｍＬグリセロール、ｐＨ６
５）水、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ５および６
結果が下の表２４〜２７に提示される。データは、全てのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、全ての試験したｐＨおよび製剤条件において安定しているとは限らないことを示す。ＤＶＤ−Ｂは、試験した全ての溶液条件下で高量の凝集体を形成し、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として分類された（実施例４に提示されるアッセイに従う）。全ての他のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるとして事前に選択された）は、正常な反応を示し、安定していた。
スクロース、ソルビトール、グリセロール、およびグリシンを使用して、これらの賦形剤の効果を評価した。振動応力に対して安定化を提供する界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ８０（ポリソルベート８０）もまた使用して、高濃度溶液の安定性に及ぼすその影響を評価した。塩濃度の影響を、塩化ナトリウムを使用してイオン強度を変動させることにより評価した。
概して、ヒスチジン緩衝液中ｐＨ６またはｐＨ５．２での製剤が、全てのＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対して有効であった。ソルビトールおよびスクロースの両方が、各々安定性を改善した。スクロースは、規定の時点後に、若干より少ない単量体の形成をもたらした。塩の存在は、特に表２４の１００ｍｇ／ｍＬでのＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、および表２７に示されるように、より少ない程度に１ｍｇ／ｍＬでの場合に、不安定性の増加（より少ない単量体の残留として定義）をもたらした。グリセロールおよびグリシンの存在は、他の製剤と比較したときに、保管安定性後により少ない単量体の残留をもたらした。例えば、表２４によると、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ソルビトールよりもスクロースの存在下で、ｐＨ６において若干より安定していた。データはまた、イオン強度が無いか非常に少ないかのどちからである製剤が、同等の経時的な安定性を示したことを実証する。
凝集体および／または断片の形成率を評価したＳＥＣデータは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の物理的安定性を示した（表２４および２６を参照されたい）。表２６に示されるように、全ての分子が、低濃度では大きな凝集傾向を示さなかった。ＩＥＣデータは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の化学的安定性の指標である。例えば、脱アミド化は、酸性種の形成（主要種の酸性種への転換）をもたらす。正電荷を持つ変異形の生成は、塩基性種の増加につながるであろう。２つの酸性または塩基性種のうちのいずれかの形成は、これら２つの種の形成が主要種の％の全体的な増加をもたらすため、不安定性を示す（表２５および２７を参照されたい）。
表２４〜２７における結果は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、ｐＨ５〜６の界面活性剤、例えば、０．０１％のＴｗｅｅｎ ８０のみを含む製剤中で安定していることを示す。
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実施例１２．種々の製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ−Ｃ）の安定性に及ぼす貯蔵の影響
タンパク質製剤のｐＨおよび貯蔵温度は、加速／長期貯蔵中にタンパク質安定性に影響する２つの重要な要因である。より低い温度（例えば、２〜８℃）での長期貯蔵の製剤の成否についての洞察を得るために、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を昇温およびリアルタイム温度での短期貯蔵にさらして、これらの要因の影響を評定した。
溶液中のＤＶＤ−Ｃ（１００ｍｇ／ｍＬ）の貯蔵安定性を、４０℃の製剤中で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、温度室内および光の不在下にある制御条件下で貯蔵した。所定の時点で、調製した溶液の試料を、試料取り出しスキームに従って分析のために取り出した。結果として生じたデータが表２８および２９に提供される。
Figure 2016513069
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表２８および２９に提供されるデータは、試験貯蔵条件の間に単量体レベルに最低限の損失しか生じなかったという点において、ＤＶＤ−Ｃが非常に安定していた（いくつかの不安定なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、例えば実施例５中のものと比較して）ために、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として分類されるであろうことを示す。
実施例１３：緩衝液およびポリオールを含有する製剤中のＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす界面活性剤の効果
製剤ｐＨをタンパク質の等電点（ｐＩ）から１単位超に設定することは、概して有益である。製剤ｐＨがｐＩに近似するほど、概して、タンパク質の全体的な表面は非荷電と見なされるため、非極性基のタンパク質間引力に寄与し、それ故、非共有結合性の凝集および不安定性を増大させる。振動および撹拌は物理的不安定性を助長し、それが疎水性空気／水界面を生み出すことで、これらの界面でのタンパク質分子の整列をもたらし、かつ最終的には凝集をもたらす。空気は水よりも疎水性であることを考慮すると、空気と液体との間の界面は、特に（部分的に）アンフォールディングが生じたタンパク質の凝集が発生し得る変性表面であると見なされる。有効な空気−水界面は、振動または撹拌によって増加され得る。
次の実施例では、例となるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の不安定性に及ぼす種々の濃度の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）の効果を評価した。研究は、ポリオールスクロースの不在または存在下で行った。表３０および３１に提示されるデータは、スクロース（８０ｍｇ／ｍＬ）ありおよびなしのｐＨ５．２または５．４にあるヒスチジン緩衝液中の種々の界面活性剤濃度（０〜２ｍｇ／ｍＬ）を比較する。濁度測定の結果は、０．０５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にある界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ８０）が、概してＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に剪断／変性応力に対する安定性を提供したことを示す。濁度は、界面活性剤濃度を０．０１ｍｇ／ｍＬに低下させた際に増加した。同様の観察を、スクロースの存在下にあるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対して行った。全ての研究は、１ｍｇ／ｍＬのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質濃度にある１５ｍＭヒスチジンにおいて実施した。対応するＳＥＣ分析が示したところによると、概して、０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ８０を含有した試料についての単量体相対（ｒｅｌ．）％における大きな損失から、最も安定した製剤を産出したＴｗｅｅｎ８０の量が０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬであることが示される。紫外線を使用した５００ｎｍでの濁度測定が表３０に列挙され、試料のＳＥＣ分析が表３１に列挙される。ｐＨの範囲もまた、下に記載する製剤中で試験した。
Figure 2016513069
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 ＊ＳＥＣデータは、表３０の０および９６ｈの振動試料に対応する。
実施例１４：振動研究において測定した、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす界面活性剤濃度の効果
次の実施例は、３５０および５００ｎｍの２つの異なる波長の光学密度を使用して測定した、ｐＨ６にある１ｍｇ／ｍの濃度のＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（１５ｍＭヒスチジン＋８０ｍｇ／ｍＬスクロース）の振動安定性に及ぼす、異なる濃度（濃度の範囲）のポリソルベート８０およびポロキサマーの効果を記載する。試料を、０、２４、４８、１２０、および２４０時間後に採取した。
Figure 2016513069
表３２に記載のように、界面活性剤の添加は、ＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の振動安定性を増加させた。０．０５〜２ｍｇ／ｍＬの範囲にあるポリソルベート濃度が、ＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に対して最も有効であると決定し、ポロキサマーは、０．１〜２ｗ／ｖ％の範囲で最も有効であると決定した。ＤＶＤ−Ｂもまた試験し、この特定の振動アッセイにおいて試験したときに同様の安定性を示した。
実施例１５：ＩＬ１２ＩＬ１８およびＤＶＤ−Ｂ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼすポリオール（スクロースおよびソルビトール）濃度の効果
次の実施例は、方法の節に記載されるように、Ａｖａｃｔａ（Ｙｏｒｋ，ＵＫ）製の自動ハイスループット機器Ｏｐｔｉｍ−１０００を使用して、内因性蛍光によって、ｐＨ６で３ｍｇ／ｍＬで測定した、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼすポリソルベート８０の存在下のポリオールすなわちスクロースおよびソルビトールの効果を示す。９μｌのＭＣＡを研究に使用した。熱走査を、１℃／分の走査速度を使用して得て、走査を２５〜７５℃から取得した。全ての試料を、スクロースおよびソルビトール賦形剤のために原液から新たに調製した。
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表３３におけるデータに基づいて、ＤＶＤ−Ｂ Ｉｇタンパク質の安定性は、いずれのポリオール（スクロースまたはソルビトール）の濃度の増加と共にも増加した。スクロースについては１００ｍｇ／ｍＬおよびソルビトールについては６０ｍｇ／ｍＬが、浸透圧を達成するであろう大体の最大濃度であると決定されたために、それらを調査した。６０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲にあるスクロースが有効であると決定された一方で、２０〜６０ｍｇ／ｍＬの範囲にあるソルビトールが安定性に有効であった。対照的に、ＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質について表３３に示される結果は、ＤＳＦによって測定したときに安定性における改善を示さなかった。
実施例１６：１００ｍｇ／ｍＬでのＤＶＤ−ＢおよびＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の保管安定性に及ぼすｐＨおよびヒスチジン濃度（ｐＨ６での）の影響
次の実施例は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定した、ＤＶＤ−ＢおよびＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の保管安定性に及ぼすヒスチジン濃度（０〜２００ｍＭの範囲）の効果を示す。試料を調製し、１００ｍｇ／ｍＬでの溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を、５℃および４０℃で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。手短に述べると、試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）４０℃で貯蔵した。所定の時点で、調製した溶液の試料を、試料取り出しスキームに従って分析のために取り出した。
Figure 2016513069
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表３４もまた、２つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす、４．５〜７．４のｐＨ範囲（ｐＨ４．５は１５ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６は１５ｍＭヒスチジン、およびｐＨ７．４は１５ｍＭリン酸塩）の効果を示す。データは、非ＡＳ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ−Ｂが、はるかに高いレベルの経時的な凝集体形成によって示されるように、ｐＨ４．５を上回ると不安定である一方で、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるＩＬ１ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性は、約４．５〜約７．４のｐＨの間で維持されることを示す。緩衝剤であるヒスチジンの量は安定性に対してほとんど効果がないように思われ、それは、モノクローナル抗体の場合にもそうであり得たように、非ＡＳ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についての安定性の問題が製剤パラメータによって軽減され得ることを示す。
データは、ＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性が、４．５〜７．４のｐＨ範囲で維持される一方で、ＤＶＤ−Ｂが、溶液中、ｐＨ４．５でもｐＨ７．４でも不安定であることを示す。しかしながら、２つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性は、溶液中の上の条件から、ｐＨ６で０〜２００ｍＭのヒスチジン濃度範囲で同様の安定性プロファイルを示す。
実施例１７：１００ｍｇ／ｍＬでのＤＶＤ−ＢおよびＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の保管安定性に及ぼす、ｐＨ６でのクエン酸塩濃度の効果
次の実施例は、ＤＶＤ−ＢおよびＩＬ１２／ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の保管安定性に及ぼすクエン酸塩緩衝液濃度（０〜１００ｍＭの範囲）の影響を記載する。試料を調製し、１００ｍｇ／ｍＬでの溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を、５℃および４０℃で評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。手短に述べると、試料を滅菌バイアル（各々およそ５００μＬ）中に充填し、制御条件下で（温度室内および光の不在下で）４０℃で貯蔵した。所定の時点で、調製した溶液の試料を、試料取り出しスキームに従って分析のために取り出した。
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表３５における２つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ｐＨ６で０〜１００ｍＭのクエン酸塩濃度間で異なる安定性プロファイルを示した。ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＩＬ１２ＩＬ１８は、特に５℃で、経時的な凝集体の小規模な増加しか伴わずに高い安定性を示したが、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ−Ｂについては逆のことが言えた。これは、高濃度の液体製剤が、これらの条件下でＩＬ１２ＩＬ１８ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対しては実現可能であろうが、ＤＶＤ−Ｂに対してはそうではないことを示す。
ＶＩＩＩ．安定な凍結乾燥ＤＶＤ−ＩＧ（ＬＳ−ＤＶＤ−ＩＧ）タンパク質製剤
実施例１８および１９は、凍結乾燥形態でのＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性を記載する。実施例１８は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凍結／融解（Ｆ／Ｔ）安定性を実証する、驚くべき結果を記載する。実施例１９は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含有する安定な凍結乾燥製剤を示す研究を記載する。凍結は、凍結乾燥の第１工程であり、よって、凍結融解安定性を有しない分子は、凍結乾燥中に不安定性となりやすい。
実施例１８：反復した凍結／融解周期に供されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす溶液ｐＨの影響
５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液中、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の凍結融解挙動を、タンパク質溶液をｐＨ４、ｐＨ６、およびｐＨ８で、凍結状態と液体状態との間を最大２回循環させることによって評価した。凍結を、温度制御した−８０℃の冷凍庫を使用して行い、融解を、３０℃の温度制御した水浴を使用して行った。試料を２回目の凍結／融解（Ｆ／Ｔ）周期後に取り出し、ＳＥＣによって分析した。表３６は、これらのｐＨレベルで製剤化された試料中に残留した単量体（Ｍｏｎ）の量ならびに形成された断片（Ｆｒａｇ）および凝集体（Ａｇｇ）の量に対する、凍結／融解プロセシングの効果を示す。
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ＤＶＤ ５、ＤＶＤ ６、ＤＶＤ ３７、ＤＶＤ ３８、ＤＶＤ ５３、ＤＶＤ ５４、ＤＶＤ ６５、ＤＶＤ ６６、ＤＶＤ １６５、ＤＶＤ １６６、ＤＶＤ ２５７、ＤＶＤ ２５８、ＤＶＤ ２７７、ＤＶＤ ２７８、ＤＶＤ ２８１、およびＤＶＤ ２８２は、反復した凍結融解周期に供された後に安定性を実証した。これらのデータは、約４〜約８のｐＨ範囲で製剤化されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、反復したＦ／Ｔプロセシングの後に安定したままであることを示す。試験されたＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤の高い安定性（全てが９３％超の単量体含量を示し、１１／１６個の製剤が９５％超の単量体含量を示した）は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がＩｇＧよりもはるかにより複雑であるため、予想外であった。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質等の複合分子は、凍結および融解にさらされるとき、容易に凝集および断片化することが予想された。
反復した凍結／融解周期に供されたＤＶＤ−Ｂの安定性に及ぼす溶液ｐＨの影響
１０ｍＭクエン酸塩／１０ｍＭリン酸塩緩衝液中、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でのＤＶＤ−Ｂの凍結融解挙動を、タンパク質溶液をｐＨ４〜９で、凍結状態と液体状態との間を最大４回循環させることによって評価した。凍結を、温度制御した−８０℃の冷凍庫を用いて行い、融解を、３０℃の温度制御した水浴を用いて行った。試料を各凍結／融解（Ｆ／Ｔ）周期後に取り出し、光遮断およびＳＥＣによって分析した。表３７は、種々のｐＨ値での、光遮断測定を使用して決定した、形成された不可視的な粒子の数に対する凍結／融解プロセシングの効果を示す。
Figure 2016513069
光遮断アッセイの結果は、４〜９のｐＨを有するＤＶＤ−Ｂ製剤によって形成された粒子の数が低かったことを示す。形成された粒子の数は、ｐＨの増加と共に増加し、分子のｐＩ（ｐＩ ８．５）前後で最大となった。しかしながら、１つのみを例外として、試験されたタンパク質溶液は、１ｍＬ当たりサイズ２５ミクロン以上の粒子６００個未満を要件とする、日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ）（ＩＣＨ）ガイドラインの要件を満たした。
表３８は、凍結／融解プロセシング後のＤＶＤ−Ｂの安定性のＳＥＣ測定値を示す。これらの測定値は、単量体、凝集体、および断片のパーセンテージ、ならびに曲線下面積（ＡＵＣ）を含む。
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表３８における結果は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、４回のＦ／Ｔ周期の後であっても大幅な量の凝集体を形成しないことを示す。この良好なＦ／Ｔ安定性は、それらのより高い構造的複雑性に起因してＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、複数回の凍結／融解周期時に、液体／氷界面での分解またはさらに低温変性をより受けやすいであろうことが予期されたため、驚くべきものである。これは、タンパク質についての一般的な観察であり、多くの他のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、凍結／融解時にかなりの量の凝集を示す。凍結は、凍結乾燥プロセスの最初のかつ必要不可欠な工程であることから、データは、ＤＶＤ−Ｂが凍結乾燥され、よって、安定な生物学的治療薬の剤形に変換され得ることを示唆する。
表３７における結果は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、４回のＦ／Ｔ周期の後であっても大幅な凝集体を形成しないことを示す。この良好なＦ／Ｔ安定性は、安定性が、内因的な安定性欠如および抗体と比べて増加した構造的複雑性を考慮して、観察されたものと同程度までに良好ではない可能性があることが予期されたため、驚くべきものである。
実施例１９：ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす凍結乾燥の影響
凝集体は、凍結乾燥のプロセス中に、ならびに後の、固体タンパク質の保管安定性中に形成し得る。凍結乾燥中に形成された凝集体は、概して、即時の再構成後に測定される。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を、制御温度条件で長い一定期間にわたって評価した。規定の貯蔵期間後、試料を取り出し、凍結乾燥ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に及ぼす貯蔵時間および貯蔵温度の影響を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によって評価した。次の３つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を研究した：ＤＶＤ−Ｂ（ＴＮＦ−ＰＧＥ２）、ＤＶＤ−Ａ（ＴＮＦ−ＩＬ１７）、およびＤＶＤ−Ｃ（ＩＬ１α−ＩＬ１β）。これらの３つのうち、ＤＶＤ−ＡおよびＤＶＤ−Ｃは、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であった。ＤＶＤ−Ｂは、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であるが、それ（ならびにＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＤＶＤ−ＡおよびＤＶＤ−Ｃ）が凍結乾燥製剤中で安定していることが見出されたため、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特定された。緩衝液、ポリオール、および界面活性剤を含有する製剤中、表３９に示される溶液中で、製剤を凍結乾燥させた。
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表４０は、凍結乾燥製剤の貯蔵前（Ｔ０）または５℃もしくは４０℃のいずれかでの所与の貯蔵期間にわたる貯蔵後にＳＥＣを使用して測定された、単量体、凝集体、および断片のパーセンテージを記載する。
Figure 2016513069
表４０におけるＳＥＣデータは、凍結乾燥ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、それらが高いパーセンテージの単量体および低いパーセンテージの凝集体および断片を示すため、最大３ヶ月間の貯蔵の期間にわたって安定したままであることを示す。４０℃で３ヶ月の加速貯蔵および３時間の再構成時間後、凍結乾燥ＤＶＤ−Ａは、９３％超の単量体、６．４％未満の凝集体、およびわずか約０．４％の断片を有した。４０℃で４週間の加速貯蔵後、凍結乾燥ＤＶＤ−Ｂは、９５％超の単量体ならびにわずか約３．２％の凝集体および約１．４％の断片を有した。４０℃で１ヶ月の加速貯蔵後、凍結乾燥ＤＶＤ−Ｃは、およそ９７％の単量体、２％の凝集体、および１％の断片を有した。故に、ＤＶＤ−Ａ、ＤＶＤ−Ｂ、およびＤＶＤ−Ｃの凍結乾燥製剤は、ＳＥＣによって評定したとき、長期安定性を示した。
下記の表４１は、ＩＥＣを使用して測定された、貯蔵された製剤の安定性に関するデータを提供する。化学的安定性の影響は、経時的な酸性および塩基性種の形成から観察すると大きくはなかった。したがって、全ての試験された分子は、凍結乾燥状態で大きな化学分解を示さない。凍結乾燥ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性を４０℃および５℃で評価した。規定の貯蔵期間後、凍結乾燥試料を取り出し、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性に及ぼす貯蔵時間の影響を評価した。試料を注射用水で再構成し、完全に再構成されると、ＳＥＣおよびＩＥＣを使用して分析した。
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表４０において上で見られた化学的安定性の影響は、経時的な酸性および塩基性種の形成から観察すると大きくはなかった。
下記の表４２は、貯蔵された凍結乾燥製剤の再構成時間を提供する。凍結乾燥剤形の成否を特徴付けるための１つの基本的な基準は、凍結乾燥試料が、溶媒、通常は注射用水での再構成後に、均一で清澄な液体に変換されるのにかかる時間である。理想的には、再構成手順は、１０分未満かかる。表４１に示されるように、全ての試験された試料が最大で５分後に完全な再構成を示した。これは、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＡおよびＣ）が安定な凍結乾燥製剤として製剤化され得ることを示す。その上、上記の実施例は、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（それは液体製剤中で安定でない）が、凍結乾燥を使用して安定化され得ることを示す（例えば、ＤＶＤ−Ｂ）。
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ＩＸ．ＤＶＤ−ＩＧタンパク質の特性評価
実施例２０〜２３は、一般のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のさらなる特性評価を提供する。
実施例２０：ＰＥＧ ３０００を使用したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の溶解度評定
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はしばしば、タンパク質を少量の水中に押し込める「クラウダ（ｃｒｏｗｄｅｒ）」として使用されるが、これは利用可能な溶媒の一部がクラウダ、典型的には重合体によって、結合させられるかまたは占有されるためである。ＰＥＧは、開発早期に利用可能な微量のタンパク質材料を利用することによってタンパク質の真正溶解度を評定するために使用される。概して、沈殿を誘導するために必要とされるＰＥＧの量が高ければ高いほど、溶液中のタンパク質の予期される真正溶解度は高くなる。
次の研究を、ＰＥＧ溶液（５０ｗ／ｖ％）の少量のアリコートの、ｐＨ６の緩衝液（５ｍＭクエン酸塩および５ｍＭリン酸塩）中のタンパク質の原液（０．５ｍｇ／ｍＬ）への添加を使用して行った。表４３は、種々のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についてのデータを示す。
Figure 2016513069
これらのデータは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の沈殿を誘導するために必要とされるＰＥＧ ３０００の量が、溶解度の高いタンパク質（すなわち、約１００ｍｇ／ｍＬを超える真正溶解度を有するタンパク質）に典型的なものであることを示す。ＰＥＧ沈殿アッセイは、抗体製剤評定において、その溶解度についての情報を提供するための標準アッセイであるが、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質がＡＳもしくはＬＳまたはさらに非ＬＳとして分類されるかどうかを予測するには十分でないようであり、モノクローナル抗体と比較したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の複雑性および製剤化への取り組みの困難さを示している。
実施例２１：近紫外線ＣＤ走査を使用したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の三次構造の評定
タンパク質の構造は、タンパク質液体および凍結乾燥物製剤の加速／長期貯蔵中のタンパク質安定性に影響を及ぼす重要な要因のうちの１つである。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の三次構造を評定するために、２５０〜３２０ｎｍの近紫外線ＣＤ走査をＪａｓｃｏ分光計により、５０ｎｍ／分の走査速度で、１ｍｇ／ｍＬの濃度で取った。１ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質当たり平均３回の走査を取った。研究において使用されるｐＨは、５ｍＭクエン酸塩および５ｍＭリン酸塩条件下で６であった。モノクローナル抗体の紫外線ＣＤ走査もまた比較のために取得した。図５に提示されるデータは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、２５０〜３２０ｎｍ領域における特長的な楕円率プロファイルの存在によって示される、折り畳み構造を有することを示す。
図５に提示されるＤＶＤ−Ｉｇ楕円率の値は、既知の安定モノクローナル抗体について観察されるものと同様である。したがって、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質およびｍＡｂの両方が同様の貯蔵安定性を示すことが予想される。しかしながら、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、実際には、ｍＡｂよりも安定性が低い。したがって、紫外線ＣＤデータのみを使用して、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質について観察される安定性の問題を正確に予測することはできない。
実施例２２：ＡＴＲ−ＦＴＩＲを使用したＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の二次構造の評定
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の二次構造を評定するために、Ｂｒｕｋｅｒ（Ｔｅｎｓｏｒ ２７）からのＡＴＲ−ＦＴＩＲ機器により領域１６００〜１７００ｃｍ−１において取った、二次導関数、面積正規化ＦＴＩＲ走査に、曲線当てはめを行い、種々のピークを分析し、加算して、分子におけるβシート構造総％を得た。特に、βシート配列を示す１６３８ ｃｍ−１でのピーク等のピークを考慮した。これは、βシートがｍＡｂの二次構造の大部分を構成することが知られているためである。したがって、ｍＡｂに由来するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質もまた、それらの二次構造組成としてβシートを大部分含有するはずであることが予想される。ここからのいずれの偏差も、分子の全体的な構造統合性が損なわれていることを示し得る。研究を５ｍＭクエン酸塩／５ｍＭリン酸塩緩衝液中、４、６、または８のｐＨで行った。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。β構造の総パーセンテージを１６個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質について評定した（表４４を参照されたい）。
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表４５に提示される結果は、研究された１６個のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の全てが、β要素から主に構成される折り畳まれた二次構造を有することを示す。β要素の割合は、約８５％〜約９７％の範囲であり、これは標準抗体について観察されるものと同様である。これは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、操作された分子であり、ｍＡｂと比較してより低いパーセンテージのβシートを有することが想定される（しかしそれらは依然として、それらの優勢な二次構造としてβシートを含有することが予想される）ことから、予想外であった。これらの知見は、二次構造組成が、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の、抗体と比較してより低い全体的貯蔵安定性に対する要因ではないことを示唆する。β要素の割合は、約８５％〜約９７％の範囲であった。
実施例２３：ＤＶＤ−Ｂ製剤の二次ビリアル係数に及ぼすイオン強度およびｐＨの影響
二次ビリアル係数（Ｂ２２）は、溶液中のタンパク質間の引力または反発相互作用の熱力学的パラメータおよび指標である。正の値は、反発相互作用を示し、負の値は、引力相互作用を示す。反発相互作用は通常、よりよい長期貯蔵につながる。散乱光強度は、次の等式によって分子量およびＢ２２に関連付けられる。
Figure 2016513069
 式中、Ｋは、光学定数であり、下記によって得られる。
Figure 2016513069
Ｒθは、過剰レイリー比、すわなち溶質によって散乱される光の測定であり、ｎは、溶媒屈折率であり、ｄｎ／ｄｃは、溶質の屈折率増分であり、ＮＡは、アボガドロ数であり、lは、入射光の波長である。ほとんどの希釈溶液について、より高次のビリアル係数は負の値を有することから、次の等式（デバイ）を使用して、二次ビリアル係数を取得した。
Figure 2016513069
散乱強度をＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏにより測定した。二次ビリアル係数値は、全て正であり、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、この算出に関して、少なくとも希釈条件下で、典型的なタンパク質分子として振る舞うことを示す。使用された緩衝液は、ｐＨ４．５には酢酸塩、ｐＨ６にはヒスチジン、およびｐＨ８にはトリスであった。１ｍＭのイオン強度溶液には２ｍＭの濃度の緩衝液、２０および１００ｍＭのイオン強度溶液には１０ｍＭを使用した。残りのイオン強度は、塩化ナトリウムによって維持した。結果が表３３および３４に示される。二次ビリアル係数の値は、ｐＨ８．０でよりもｐＨ４．５およびｐＨ６．０で平均してより高かったことから、ＤＶＤ−ＢがｐＨ８．０でよりもｐＨ４．５およびｐＨ６．０でよりよく貯蔵されるであろうことが示唆される。また、二次ビリアル係数の値は、より低いイオン強度でより高かったことから、より低いイオン強度もまた、ＴＮＦ−ＰＧＥ２ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性に関連し得ることが示唆される。
Ｄｓは、無限希釈での分子の自己拡散係数である。ｋｄは、溶液中の分子間の相互作用を説明するパラメータである。ｋｄの正の値は、分子間反発を示し、逆もまた真なりである。
Figure 2016513069
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言及したように、Ｂ２２およびｋＤの符号が正であり、大きさが大きい場合、それは、溶液中のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質間の強力な反発相互作用を示す。これは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が溶液中で互いに遭遇して凝集体を形成する可能性が低下するため、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質液体製剤の長期貯蔵安定性のために理想的な条件である。上記のデータは、製剤の一部として低イオン強度および低ｐＨが、高イオン強度および高ｐＨを有する製剤よりも大きい長期のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質安定性をもたらすことを示唆する。また、イオン強度およびｐＨは、Ｂ２２値に高く寄与することから、それは、静電反発が概してＢ２２値のかなりの部分を構成することを示す。
ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および抗体の比較に関して、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質製剤が抗体製剤の長期安定性プロファイルと同様の長期安定性プロファイルを有するためには、より正のＢ２２値が必要とされる可能性がある。これは、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が抗体よりも大きく、反発（およびＢ２２）への剛体球の寄与がＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に関してより高いためである。したがって、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および抗体の両方が、Ｂ２２に寄与する同じ静電反発を有する場合、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についてのＢ２２項は、溶液中の同程度のタンパク質間反発を反映するように、より正となる。
実施例２４：ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の薬物動態研究
次の実施例は、種々のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の薬物動態研究を記載する。
可変ドメイン組み合わせおよび配向は、血清中安定性に影響を及ぼす
図２に記載されるように、ある特定の可変ドメイン組み合わせは、他の組み合わせよりも安定なＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を提供する。図２Ａは、２つの異なるドメイン配向、すなわち、「外側／内側」および「内側／外側」にある、ある特定のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についての血清中安定性を記載する。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ＴＮＦ／ＳＯＳＴは、約１６％の高分子量（ＨＭＷ）％が「外側／内側」配向にあるが、約７５％のＨＭＷが逆の配向にある。このドメイン配向概念が図２Ｂに記載される。図２におけるＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、短／短リンカー組み合わせを含み、ｈｕＩｇＧ１アイソタイプである。
インビトロ薬物動態研究
種々の生物学的治療薬の薬物動態（ＰＫ）特性を、オスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける４ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後に評定した。血液試料を２８日間の研究全体にわたって収集した。血清試料を、ＭＳＤアッセイを使用して、抗ヒトＩｇキャプチャーおよびスルホ−タグ（Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を化学発光検出のために用いて、分析した。各動物についての薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用して、ノンコンパートメント解析によって算出した。
図３は、ラットを使用した薬物動態研究からの結果を記載する。本研究は、ラット血清中の、クリアランス（ＣＬ）およびＴ1/2とインビトロでの高分子量（ＨＭＷ）凝集体形成との間の相関を検査した。図３に示されるように、インビトロで１０％未満のＨＭＷ凝集を有するＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、低い（０．３ｍＬ未満／時間／ｋｇ）クリアランスおよび長い（１０日間超）半減期を有する可能性がより高い。外れ値には、ＤＶＤ ２５７およびＤＶＤ ２５８が含まれた。ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ラット標的を認識し、そのＰＫは、ＴＭＤによって影響を受けた。ＤＶＤ ０３７（ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２、配列番号３４および３５）は、良好でないインビトロ特性を示したが、良好なインビボのＰＫを示した。ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の重鎖および軽鎖についてのアミノ酸配列が、表６５の配列番号６８および６９に提供される。
実施例２５：ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の粘度研究
次の実施例は、例となるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ＤＶＤ−Ａ）についての粘度研究を記載する。
粘度を、Ｒｈｅｏｓｅｎｓｅ（Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）製のｍ−ＶＲＯＣ低体積粘度計により測定した。ｍ−ＶＲＯＣは、試験液が矩形スリットを通じて流れるときのその圧力降下から粘度を測定する。試験液が流路を通じて流れるようにポンプ送液されるとき、入口からの増加する距離で圧力が測定される。センサーの圧力対位置における直線のプロットが、粘度に比例する。
機器を予め排気して、材料の使用量を最小限にし、その後材料を回収した。空気を使用して機器を清潔にした後、試料測定を行った。４０μｌ／分〜２００μｌ／分の初期流量を使用して、必要とされる圧力差を得た。圧力室の飽和は粘度読み取りを急速に安定化し、２０マイクロリットルの試料により安定化を達成した。一旦、機器が試料でプライミングされると、安定な第２の読み取りを得るには５マイクロリットル未満の追加の試料で十分であった。故に、３系列で読み取りを得るには、総計３０マイクロリットル未満（３５マイクロリットル未満）の試料で十分であった。
全ての試料の粘度をまた、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ（Ｘ，Ｘ）製の回転球粘度計により測定した。１．８ｍｍキャピラリーを粘度範囲２〜７０ｃＰの試料のために使用し、１．６ｍｍキャピラリーを最小粘度（２ｃＰ未満）の試料のために使用した。機器を事前較正し、種々の可能性のある角度（７０°、５０°、および／または４０°）のいずれかで実行した。
ＤＶＤＡの粘度を、種々のＤＶＤ−Ａ濃度中、異なるモル濃度（すなわち、０ｍＭ〜３０ｍＭヒスチジン）およびｐＨ（すなわち、ｐＨ４．８〜ｐＨ８．３）を有するヒスチジン製剤中で決定した。測定からの結果が表４７〜４９において下に提供される。
Figure 2016513069
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表４７〜４９における上述の結果は、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質溶液の粘度に及ぼすイオン強度、ｐＨ、およびタンパク質濃度の影響を示す。ＤＶＤ−Ａ（配列番号６２および６３）は、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質であり、上記の結果は、医薬組成物およびインビボ使用に適切であろう高濃度でのシリンジ通過可能な液体製剤に応じるように、粘度値を製剤手段によって調整することができることを示す。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１５０ｋＤの標準モノクローナル抗体と比較して、約２００ｋＤのはるかにより高い分子量を有するだけでなく、それらの構造もまたより複雑である。したがって、ｍＡｂおよびＤＶＤ−Ｉｇの粘度が比較的類似しており、また約１０ｃＰｓを下回る高濃度であってもそうであることは驚くべきことであった。
実施例２６：ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の熱安定性
次の実施例は、アダリムマブ等のモノクローナル抗体と対比した、例となるＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質および例となるＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質を含むＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の熱安定性を検査する、３つの異なる試験からの結果を記載する。
動的走査蛍光法
Ａｖａｃｔａ（Ｙｏｒｋ，ＵＫ）製の自動ハイスループット機器Ｏｐｔｉｍ−１０００を研究のために使用した。９マイクロリットルのマイクロキュービックアレイ（ＭＣＡ）を研究のために使用した。試料原液の調製のために、３マイクロリットルのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、色素の１倍最終濃度を得るために、２７マイクロリットルの試料溶液に添加した。この色素は、５０００倍の商業用製品として入手可能であるが、任意の色素が好適であろう。熱走査を２６℃〜９５℃で、６０℃／時間の走査速度で取得した。ベースラインを直線性に対して当てはめ、その組み込みがＲ２を０．９５未満に減少させた第１の点（温度）を、開始温度として取った。反復研究により、開始温度の変動が５％未満であることが確認された。
内因性蛍光
トリプトファン蛍光を使用して、アンフォールディング温度を評価した。日立（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製の日立ＦＬ−４５００機器を研究のために使用した。温度を、水浴を使用して維持した。キュベット内の温度を、熱電対およびＯｍｅｇａ Ｉｎｃ．（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）製の温度モニターＣＳｉ３２を使用して監視した。ＶＷＲ（ＭＡ）製の前面三角水晶キュベットは、内部フィルター効果（Ｉｎｎｅｒ ｆｉｌｔｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を最小化し、よって強力な発光シグナルをもたらすため、これを使用した。２９５ｎｍの励起波長を使用した。発光を３２８〜３３８ｎｍで監視した。λ最大値は３３２ｎｍで観察されたが、強度は比較のために３３５ｎｍで観察された。熱走査を３０℃〜７０℃で、７８℃／時間の走査速度で取得した。ベースラインを直線性に対して当てはめ、その組み込みがＲ２を０．９５未満に減少させた第１の点（温度）を、開始温度として取った。反復研究により、開始温度の変動が５％未満であることが確認された。走査速度の増加は、開始温度に大きくは影響しなかった。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＤＳＣを使用して、種々の溶液条件下でのタンパク質の熱力学的安定性を特徴付けた。Ｍｉｃｒｏｃａｌ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）製の自動キャップ（ｃａｐ）を使用した。熱走査を２５℃〜６５℃で、６０℃／時間の走査速度で取得した。高濃度試料中のアンフォールディングに続く凝集および沈殿は、キャップＤＳＣセルの閉塞につながり得、これにより次いで掃除がかなり困難となることから、いずれのかかる事象も阻害するために走査は、開始温度をおよそ５℃超えるまでのみで取得した。１０分間のプレ走査平衡化サーモスタットを各走査前に適用した。対応する緩衝液走査を試料走査の直後に取った。開始の差異は、反復走査の間で２℃未満であった。ベースラインを直線性に対して当てはめ、その組み込みがＲ２を０．９５未満に減少させた第１の点（温度）を、開始温度として取った。反復研究により、開始温度の変動が５％未満であることが確認された。
本研究からの結果が表５０に提供される。
Figure 2016513069
表５０に記載される結果は、タンパク質溶液の熱安定性に及ぼすタンパク質濃度の影響を示す。ＤＶＤ１（ＩＬ１２ＩＬ１８）、ＡＳ ＤＶＤおよびＤＶＤ２（本明細書でＤＶＤ−Ｂとも称される）、ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ならびに他のｍＡｂは全て、タンパク質濃度がタンパク質の熱安定性に対して若干の影響を有するにすぎないことを示す。したがって、液体高濃度製剤の成否は、タンパク質の熱安定性に及ぼすタンパク質濃度の影響から独立し得るが、高濃度液体製剤は、他の周知の種類の不安定性、例えば、保管不安定性を呈する。概して、実施例１〜３に記載されるように、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、抗体よりも低い融解温度を有する。いくつかの実例、例えば、ＤＶＤ１においては、同様の融解温度が観察されるが、概して、これは事実と異なる。
Ｘ．抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−ＩＧ製剤（水性および凍結乾燥）
実施例２７：抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ｈ１Ａ１１．１ＳＬ−Ａｖの前製剤特性評価
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ（ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖ、表４１）の貯蔵安定性（５℃）および加速安定性（４０℃）を、下に列挙される製剤中およびタンパク質濃度で評価した。安定性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価し、回収された凝集体％、単量体％、断片％、および総計種を定量した。全体的に、製剤は、５〜７のｐＨ範囲および１．０〜１１８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲を網羅する。
５℃および４０℃の温度で、ならびに５０、３０、および１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、製剤は次の通りであった：１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）；１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）；ｐＨ５の３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ８０；ｐＨ６の３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ８０；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。全ての製剤が、貯蔵中の微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有した。５℃および４０℃の温度で、ならびに６０、５０、３０、および１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、製剤は、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）であった（貯蔵中の微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムもまた含有する）。５℃で、および１１８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、製剤は、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）であった（貯蔵中の微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムもまた含有する）。４０℃で、および１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、製剤は、ｐＨ５、６、および７の１０ｍＭクエン酸塩および１０ｍＭリン酸塩であった。タンパク質を含む製剤を濾過して、可能性のある微生物を除去した。
凍結−融解安定性を、製剤中のタンパク質を、４周期の、−８０℃で少なくとも２０時間の凍結および３０℃の水浴中の融解に供することによって行った。凍結−融解安定性について試験した製剤が下に列挙される。安定性をＳＥ−ＨＰＬＣによって評価し、回収された凝集体％、単量体％、断片％、および総計種を定量した。製剤は、６０ｍｇ／ｍＬタンパク質での１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）（微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムもまた含有する）ならびにｐＨ５、６、および７の１０ｍＭクエン酸塩および１０ｍＭリン酸塩、ならびに１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質（可能性のある微生物を除去するために濾過した）であった。
最後に、熱安定性を測定するための示差走査熱量測定を、ｐＨ５、６、および７の１０ｍＭクエン酸塩および１０ｍＭリン酸塩緩衝液中のタンパク質、ならびに１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質に対して行った。各タンパク質ドメインのアンフォールディングの開始温度およびアンフォールディングの中点温度（Ｔｍ）を定量した。
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
緩衝液の解（全ての緩衝液が微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有する）：
酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）、リン酸塩＝１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
酢酸塩−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ヒスチジン−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
解：
ＦＴ＝凍結融解
ＦＴ２＝２周期の凍結および融解、すなわち−８０℃での凍結および３０℃の水浴中での融解後の分析
ＦＴ４＝４周期の凍結および融解、すなわち−８０℃での凍結および３０℃の水浴中での融解後の分析
クエン酸塩−リン酸塩＝１０ｍＭクエン酸塩および１０ｍＭリン酸塩
ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジンおよび０．０２％アジ化ナトリウム（アジ化物は微生物成長を阻害するためのものである）
Figure 2016513069
全体的に、表５１〜５４におけるデータは、ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖが、安定モノクローナル抗体について典型的に観察される分解プロファイルを有することを示唆する。凝集および断片化は、より低い温度（５℃）でよりも、昇温（４０℃）でより高い。
５℃で、２１日間の貯蔵後に凝集または断片化の外見上の増加は何ら存在しない。４０℃で、分解の量は、安定ｍＡｂについて典型的に観察されるそれらの値よりも高かった。しかしながら、それは、それをさらなる開発から除外するほどには大きくなかった。全体的に、このＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、その安定性に基づいてＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として適格であった。
実施例２８：抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質のための製剤選択
材料および方法。抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇ ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖタンパク質の安定性を、表５５に列挙される５つの製剤中で評価した。全ての製剤を１５ｍＭのヒスチジン緩衝液中で調製した。製剤Ｆ１〜Ｆ４を５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で調製した。これらの製剤において、ｐＨは、５．５〜６．０の範囲であり、ポリソルベート８０濃度は、０〜０．０５ｗ／ｖ％の範囲であり、スクロース濃度は、０〜７．５ｗ／ｖ％の範囲であり、アルギニン濃度は、０〜１ｗ／ｖ％の範囲であった。製剤Ｆ４は、１５ｍＭヒスチジン緩衝液中でｐＨ６．０で、いずれの安定剤も用いずに調製し、５０ｍｇ／ｍＬの液体製剤安定性評定に対する研究対照としての役目を果たした。加えて、１つの製剤を２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でｐＨ６．０で調製した（製剤Ｆ５）。この製剤において、ポリソルベート８０濃度は、０．０２５ｗ／ｖ％であり、スクロース濃度は、３．８ｗ／ｖ％であった。
Figure 2016513069
上記の製剤において、１５ｍＭのヒスチジン緩衝液を選択したが、これは、それが標的製剤のｐＨを維持するのに十分な緩衝能を提供するためである。スクロースを、凍結−融解ストレスに対する安定剤（凍結保護剤）および凍結乾燥プロセス誘導性ストレスに対する安定剤（凍結乾燥保護剤）として評価した。ポリソルベート８０（界面活性剤）およびアルギニンを、凝集体および微粒子形成に対して製剤を可能性として安定化するために、添加した。
凍結−融解および液体製剤安定性試験。全ての液体製剤の安定性を３周期の凍結／融解（Ｆ／Ｔ）ストレス後に、ならびに−８０、５、２５、および４０℃で１ヶ月の貯蔵後に、評価した。安定性を、視覚的外観、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による凝集体％、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）による電荷不均一性、還元ＳＤＳ−キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）による断片化、マイクロフロー画像法（ＭＦＩ）による不可視的な粒子、およびＥＬＩＳＡを使用したＤＬＬ４／ＶＥＧＦ結合能を含む、分析アッセイの広範な一団によって試験した。
凍結／融解および液体安定性試験結果が表５６に提供される。
Figure 2016513069
Figure 2016513069
解．ＥＦＶＰ：可視的な粒子が本質的にない、ＴＭＴＣ：数え切れないほど多い、ＮＰ：未実施
上記の表において見られるように、凍結−融解ストレスは、任意の安定剤（例えば、ポリソルベート８０、スクロース、およびアルギニン）を用いずに製剤化された製剤Ｆ４中で、可視的な粒子および相当により高い不可視的な粒子数をもたらした。他の製剤と比べて、この製剤はまた、２５および４０℃で１ヶ月の貯蔵後に、より高い不可視的な粒子数の傾向を示した。２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する製剤Ｆ５は、５、２５、および４０℃で１ヶ月の貯蔵にわたって、５０ｍｇ／ｍＬの製剤と比べて相当により低い凝集を示した。
凍結乾燥製剤安定性試験。選択製剤の安定性もまた、製剤を凍結乾燥した後に評価した。凍結乾燥薬品安定性を、全てのスクロース含有製剤（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ５）について評定した。安定性を５５℃で２週間の貯蔵後に評定した。安定性を、視覚的外観（再構成前および後）、再構成時間、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による凝集体％、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）による電荷不均一性、還元ＳＤＳ−キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）による断片化、マイクロフロー画像法（ＭＦＩ）による不可視的な粒子、およびカール・フィッシャー滴定による含水率を含む、分析アッセイの広範な一団によって試験した。
凍結乾燥製剤安定性試験結果が表５７に提供される。全ての評価された製剤についての再構成時間は、およそ１分間であった。ＳＥＣによる凝集の若干の増加およびＣＥＸによる塩基性領域％を、全ての製剤について、５５℃のストレスを与えた貯蔵条件下で観察した。全ての他の測定された生成物安定性属性において、最小の変化が観察された。
Figure 2016513069
 解．ＥＦＶＰ＝可視的な粒子が本質的にない、ＮＰ＝未実施
抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質Ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖの配列が表５８に記載される（ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は実施例２８および２９に記載）。
Figure 2016513069
表５８は、ＤＶＤ ｈ１Ａ１１．１−ＳＬ−Ａｖについての完全長重鎖および軽鎖配列を提供する。リンカー配列は、下線を引かれる一方で、ＣＤＲおよび定常領域配列は、太字となっている。
実施例２９：第２の抗ＤＬＬ４／抗ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質（ｈ１Ａ１１．１−ＬＳ−Ａｖ）の拡大前製剤特性評価
抗ＤＬＬ４／−ａｎｔｉＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対する拡大前製剤特性評価を、異なる製剤条件がＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の安定性にどのように影響を及ぼすかを探索するために行った。ｈ１Ａ１１．１−ＬＳ−Ａｖについてのデータが表５９および６０に提示される。ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の貯蔵安定性（５℃）および加速安定性（４０℃）を、下に列挙される製剤中およびタンパク質濃度で評価した。安定性をＳＥＣによって評価し、回収された凝集体％、単量体％、断片％、および総計種を定量した。全体的に、製剤は、５〜７のｐＨ範囲および１０〜５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲を網羅する。
５℃および４０℃の温度で、ならびに５０、３０、および１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、次の製剤を評価した：１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）、１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）、ｐＨ５の３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ６の３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。全ての製剤が、貯蔵中の微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有した。
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
緩衝液の解（全ての緩衝液が微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウム０．０２％を含有する）：酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）；ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）；リン酸塩＝１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）；酢酸塩−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ８０；ヒスチジン−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ８０；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
表５９についての緩衝液の解は、表６０におけるものと同じである。
実施例３０：追加のＤＬＬ４−ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質ｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＬＳ−Ａｖおよびｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＳＬ−Ａｖの製剤研究
追加のＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質に対する拡大前製剤特性評価を、異なる製剤条件が安定性にどのように影響を及ぼすかを探索するために行った。ｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＬＳ−Ａｖおよびｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＳＬ−Ａｖ ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についてのデータが下に提示される。これらのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、不安定であることが判明し、ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質と見なされるためのスクリーニング基準に不合格であった。
ｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＬＳ−Ａｖおよびｈ１Ａ１１．１．Ａ６−ＳＬ−Ａｖの貯蔵安定性（５℃）および加速安定性（４０℃）を、下に列挙される製剤中およびタンパク質濃度で評価した。安定性をＳＥＣによって評価し、回収された凝集体％、単量体％、断片％、および総計種を定量した。全体的に、製剤は、５〜７のｐＨ範囲および１０〜５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲を網羅する。
５℃および４０℃の温度で、ならびに５０、３０、および１０ｍｇ／ｍＬで、次の条件を試験した：１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）；１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）；１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）；ｐＨ５の３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０；ｐＨ６の３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０；およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。全ての製剤が、貯蔵中の微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有した。
全体的に、表６１〜６３に提供されるデータは、２つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、安定モノクローナル抗体については観察されない非定型の分解プロファイルを有することを示唆する。凝集速度は、実際、４０℃でよりも５℃でより高かった。
５℃で、２１日間の貯蔵後に凝集の急速な増加が存在する。４０℃で、分解の量もまた増加するが、５℃で観察された速度ではなかった。どちらの場合も、凝集は、濃度依存性であった。
全体的に、これらのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、５℃での不安定性に基づいてスクリーニングに不合格であり、非ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の例である。
Figure 2016513069
Figure 2016513069
緩衝液の解（全ての緩衝液が微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有する）：
酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）、リン酸塩＝１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
酢酸塩−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ヒスチジン−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Figure 2016513069
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Figure 2016513069
Figure 2016513069
緩衝液の解（全ての緩衝液が微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有する）：
酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）、リン酸塩＝１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
酢酸塩−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ヒスチジン−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
Figure 2016513069
Figure 2016513069
Figure 2016513069
緩衝液の解（全ての緩衝液が微生物成長を阻害するために０．０２％アジ化ナトリウムを含有する）：
酢酸塩＝１５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５）、ヒスチジン＝１５ｍＭヒスチジン（ｐＨ６）、リン酸塩＝１５ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）
酢酸塩−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭ酢酸塩、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ヒスチジン−スクロース−Ｔｗ＝３０ｍＭヒスチジン、８０ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０２％ Ｔｗ８０
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
全体的に、表６１〜６４におけるデータは、２つのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質が、安定モノクローナル抗体については観察されない非定型の分解プロファイルを有することを示唆する。凝集速度は、実際、４０℃でよりも５℃でより高い。５℃で、２１日間の貯蔵後に凝集の急速な増加が存在する。４０℃で、分解の量もまた増加するが、５℃で観察された速度ではなかった。どちらの場合も、凝集は、濃度依存性であった。全体的に、これらのＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、それらの５℃での不安定性に基づいてＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として適格でなく、水性非安定と見なされるであろう。
配列
本明細書に記載される他のＤＶＤ−Ｉｇタンパク質についての重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が、表６５において下に提供される。リンカー配列は、下線を引かれる一方で、ＣＤＲ配列は、太字となっている。下の「Ｌ」は、軽鎖を表し、下の「Ｈ」は、重鎖を表す。
Figure 2016513069
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参照による援用
本明細書全体を通じて引用され得る、全ての引用された参考資料（参考文献、特許、特許出願、およびウェブサイトを含む）の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれ、それらの中で引用される参考資料も同様である。本開示の実施は、特に指示されない限り、当該技術分野で周知である、免疫学、分子生物学、細胞生物学の従来の技法を用いる。
均等物
本開示は、他の特定の形態で、本開示の趣旨または必須の特性から逸脱することなく具体化されてもよい。上述の実施形態はしたがって、全ての点において、本明細書に記載される本開示の限定ではなく、むしろ例示説明として見なされるべきである。本開示の範囲は故に、上述の説明によってではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって指定され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に該当する全ての変更がしたがって、本明細書に包含されることが意図される。

Claims (76)

  1. 水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質および約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液を含む、水性製剤であって、前記製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する、水性製剤。
  2. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、請求項１に記載の水性製剤。
  3. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１０％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、請求項１に記載の水性製剤。
  4. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、請求項１に記載の水性製剤。
  5. 前記製剤は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約６％以下の凝集を含む、請求項１に記載の水性製剤。
  6. 前記製剤は、ＳＥＣ分析によって決定するとき、約５％以下の凝集を含む、請求項１に記載の水性製剤。
  7. 前記製剤は、約５〜約６．５のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の水性製剤。
  8. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約５．５〜約６．５ｐＨの水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４０℃で２１日間の貯蔵後に、約１０％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の水性製剤。
  9. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約５．５〜約６．５ｐＨの水性製剤中、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約５℃で２１日間の貯蔵後に、約１％以下の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の水性製剤。
  10. 界面活性剤、ポリオール、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の水性製剤。
  11. 前記ポリオールは、ソルビトール、マンニトール、およびスクロースからなる群から選択される、請求項１０に記載の水性製剤。
  12. 前記ポリオールは、マンニトールであり、マンニトールの濃度は、約１０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０、および約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される、請求項１１に記載の水性製剤。
  13. 前記ポリオールは、ソルビトールである、請求項１１に記載の水性製剤。
  14. ソルビトールの濃度は、約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約２５〜約５５ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬ、および約３５〜約４５ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される、請求項１３に記載の水性製剤。
  15. 前記ポリオールは、スクロースである、請求項１１に記載の水性製剤。
  16. スクロースの濃度は、約６０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約６５〜約９５ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬ、および約７５〜約８５ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される、請求項１５に記載の水性製剤。
  17. 前記界面活性剤は、ポリソルベートである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の水性製剤。
  18. ポリソルベートの濃度は、約０．００１％〜約１％、約０．００５％〜約０．０５％、約０．００５％〜約０．０２％、約０．０１％〜約０．０５％、および約０．１％からなる群から選択される、請求項１７に記載の水性製剤。
  19. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である、請求項１７または請求項１８に記載の水性製剤。
  20. 前記ポリソルベート８０または前記ポリソルベート２０は、約０．００５％〜約０．０２％の濃度を有する、請求項１９に記載の水性製剤。
  21. 前記緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製剤。
  22. 前記緩衝液のモル濃度は、１０〜２０ｍＭの範囲である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の水性製剤。
  23. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の水性製剤。
  24. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約２０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、および約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される、前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の濃度を有する、請求項２３に記載の水性製剤。
  25. 水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含む、水性製剤であって、前記製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する、水性製剤。
  26. 前記ポリオールは、ソルビトール、マンニトール、およびスクロースからなる群から選択される、請求項２５に記載の水性製剤。
  27. 前記ポリオールは、ソルビトールである、請求項２６に記載の水性製剤。
  28. ソルビトールの濃度は、約３０〜約５０ｍｇ／ｍＬである、請求項２７に記載の水性製剤。
  29. 前記ポリオールは、スクロースである、請求項２６に記載の水性製剤。
  30. 前記スクロースは、約７０〜約９０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項２９に記載の水性製剤。
  31. 前記緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の水性製剤。
  32. 前記緩衝液のモル濃度は、約１０〜約２０ｍＭの範囲である、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の水性製剤。
  33. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の水性製剤。
  34. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約２０〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２０〜約２１０ｍｇ／ｍＬ、約３０〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約４０〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約６０〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約７０〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、および約８０〜約１０５ｍｇ／ｍＬからなる群から選択される、前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質の濃度を有する、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の水性製剤。
  35. ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ポリオール、緩衝液、および界面活性剤を含む、製剤であって、前記製剤は、約５〜約７のｐＨを有し、前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１５％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、製剤。
  36. 前記ポリオールは、ソルビトール、マンニトール、およびスクロースからなる群から選択される、請求項３５に記載の製剤。
  37. 前記緩衝液は、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リン酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される、請求項３５または３６に記載の製剤。
  38. 前記界面活性剤は、ポリソルベートである、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の製剤。
  39. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である、請求項３８に記載の製剤。
  40. 前記ポリソルベート８０または前記ポリソルベート２０は、約０．００５％〜約０．０２％の濃度を有する、請求項３９に記載の製剤。
  41. ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、ポリオール、ヒスチジン緩衝液、およびポリソルベートを含む、製剤であって、前記製剤は、約５〜約７のｐＨを有し、前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に約１５％未満の凝集を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられる、製剤。
  42. 水性製剤である、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の製剤。
  43. 凍結乾燥製剤である、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の製剤。
  44. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、
    Ｃは、定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
    ｎは、０または１であり、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の製剤。
  45. 前記第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
    Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
    ｎは、０または１であり、
    前記第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
    Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
    ｎは、０または１であり、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する、請求項４４に記載の製剤。
  46. ２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含み、前記結合タンパク質は、４つの機能的な標的結合部位を含む、請求項４４または４５に記載の製剤。
  47. Ｘ１は、ＣＬでない、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の製剤。
  48. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８〜７５に記載される前記可変軽鎖または重鎖アミノ酸配列からの３つのＣＤＲを含む、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の製剤。
  49. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８〜７５に記載される軽鎖または重鎖アミノ酸配列を含む、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の製剤。
  50. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０／ＣＤ８０、ＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２、ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ／ＤＫＫ、ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬ、ＤＬＬ４／ＰＬＧＦ、ＴＮＦ／ＳＯＳＴ、ＩＬ−９／ＩｇＥ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＴＮＦ／ＩＬ−１７、ＴＮＦ／ＰＧＥ２、ＩＬ１α／ＩＬ１β、およびＤＬＬ４／ＶＥＧＦからなる群から選択される結合特異性を有する、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の製剤。
  51. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ４／ＩＬ１３、ＩＬ１α／ＩＬ１β、およびＴＮＦα／ＩＬ１７からなる群から選択される結合特異性を有する、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の製剤。
  52. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＩＬ−１７に対する結合特異性を有する、請求項５０に記載の製剤。
  53. 前記ＴＮＦα／ＩＬ１７特異的ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＶＤ Ａ（配列番号６２および６３）である、請求項５２に記載の製剤。
  54. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ１α／ＩＬ１βに対する結合特異性を有する、請求項５０に記載の製剤。
  55. 前記ＩＬ１α／ＩＬ１β特異的ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＤＶＤ Ｃ（配列番号６６および６７）である、請求項５４に記載の製剤。
  56. 前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８に対する結合特異性を有する、請求項５０に記載の製剤。
  57. 前記製剤は、医薬製剤である、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の製剤。
  58. 水性の安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質および約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液を含む、医薬組成物であって、前記ＡＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＳＥＣによって決定するとき、ヒスチジンまたはクエン酸塩リン酸塩緩衝液中、約６０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化されるときに、約４０摂氏度で１４日間の貯蔵後に、単量体相対パーセンテージで約１０％未満の損失を有する、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質として特徴付けられ、前記製剤は、４．５〜７．５のｐＨを有する、医薬組成物。
  59. 界面活性剤、ポリオール、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 障害を治療する方法であって、前記障害が治療されるように、請求項５８または５９に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  61. 凍結乾燥した安定なＤＶＤ−Ｉｇ（ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質を含む、凍結乾燥製剤であって、前記製剤が再構成されるとき、それが約１〜約１００ｍｇ／ｍＬの前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約１０〜約５０ｍＭ緩衝液、ポリオール、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベートを含み、約５〜約７のｐＨを有する、凍結乾燥製剤。
  62. 前記製剤は、約５．５〜約６．５のｐＨを有する、請求項６１に記載の凍結乾燥製剤。
  63. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で製剤化されるときに、水性製剤中、約５．５〜約６．５のｐＨで、約４０℃で２１日間の加速貯蔵後に、１０％超の単量体相対（ｒｅｌ．）ピーク面積変化が観察される、請求項６１または６２に記載の凍結乾燥製剤。
  64. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、各々が独立してＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、
    Ｃは、定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
    ｎは、０または１であり、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
  65. 前記第１のポリペプチド鎖は、第１のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、
    Ｃは、重鎖定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域であり、
    ｎは、０または１であり、
    前記第２のポリペプチド鎖は、第２のＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、
    ＶＤ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、
    ＶＤ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、
    Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、
    Ｘ１は、リンカーであるが、但し、それがＣＨ１でないことを条件とし、
    Ｘ２は、Ｆｃ領域を含まず、
    ｎは、０または１であり、
    前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ１ドメインは、第１の機能的な標的結合部位を形成し、前記第１および第２のポリペプチド鎖上の前記ＶＤ２ドメインは、第２の機能的な標的結合部位を形成する、請求項６４に記載の凍結乾燥製剤。
  66. ２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含み、前記結合タンパク質は、４つの機能的な標的結合部位を含む、請求項６４または６５に記載の凍結乾燥製剤。
  67. Ｘ１は、ＣＬでない、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
  68. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８〜７５に記載される前記可変軽鎖または重鎖アミノ酸配列からの３つのＣＤＲを含む、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
  69. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、配列番号２８〜７５に記載される軽鎖または重鎖アミノ酸配列を含む、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
  70. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＣＤ２０／ＣＤ８０、ＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２、ＴＮＦ／ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ／ＤＫＫ、ＣＤ２０／ＲＡＮＫＬ、ＤＬＬ４／ＰＬＧＦ、ＴＮＦ／ＳＯＳＴ、ＩＬ−９／ＩｇＥ、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８、ＴＮＦ／ＩＬ−１７、ＴＮＦ／ＰＧＥ２、ＩＬ１α／ＩＬ１β、またはＤＬＬ４／ＶＥＧＦからなる群から選択される結合特異性を有する、請求項請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤。
  71. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＴＮＦおよびＩＬ−１７に対する結合特異性を有する、請求項７０に記載の凍結乾燥製剤。
  72. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ１α／ＩＬ１βに対する結合特異性を有する、請求項７０に記載の凍結乾燥製剤。
  73. 前記ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１８に対する結合特異性を有する、請求項７０に記載の凍結乾燥製剤。
  74. ＬＳ−ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質、約５〜約５０ｍＭのモル濃度を有する緩衝液、界面活性剤、およびポリオールを含む、水性製剤を凍結乾燥させることによって調製される、凍結乾燥製剤であって、前記製剤は、約４．５〜約７．５のｐＨを有する、凍結乾燥製剤。
  75. 前記緩衝液は、ヒスチジン、コハク酸塩、ならびにクエン酸塩および／またはリン酸塩からなる群から選択される、請求項７４に記載の凍結乾燥製剤。
  76. 前記ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、スクロース、およびトレハロースからなる群から選択される、請求項７４または７５に記載の凍結乾燥製剤。
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