CN101970655B - 改良哺乳动物表达载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的特征在于用于在哺乳动物细胞培养中的重组蛋白质表达的核酸。本发明的附加型载体促进表达SV40T Ag或EB病毒核抗原的哺乳动物细胞(例如COS7或HEK293-6E细胞)中的高蛋白质生产。该方法和系统例如用于药学药物开发和克隆中，特别是用于抗体生产。
Description
相关申请
本申请要求于2008年1月15日提交的美国临时申请序列号61/021282和于2008年10月10日提交的美国临时申请序列号61/104546的优先权，所述专利各自的内容在此整体引入。
发明背景
蛋白质包括生物制品的稳定生产可以通过用载体转染宿主细胞来完成，所述载体包括编码蛋白质的DNA。载体在细胞系中的维持可以通过各种方法来达到，包括通过附加型复制起点的染色体外复制。附加型载体包含当序列由复制起始因子结合时促进载体复制的复制起点。附加型载体具有超过需要插入宿主基因组内的载体的几个优点。例如，附加型载体减少细胞中可能起因于载体整合到宿主基因组内的表型改变。附加型载体还可以使用标准DNA提取方案从转染细胞中分离出。
由于治疗蛋白质即生物制品的发展重要性，必须采取努力以最佳化蛋白质生产，同时改善总体生产过程的效率。因此，效率中的改善必须针对载体的蛋白质生产能力加重。需要更佳的表达系统，其提供有效的克隆选择，以及高水平的所需蛋白质产物。减少生物制品特别是抗体产生中涉及的克隆步骤数目是有利的，以改善时间需要且使成本降到最低。提供供应足够蛋白质生产用于小和大规模细胞培养也是有利的。本发明通过提供根据下文详述将是显而易见的另外优点克服了常规载体的局限性。
发明概述
重组蛋白质可以通过哺乳动物细胞瞬时转染而产生，特别是在药学药物开发过程期间。各种宿主细胞可以用于表达蛋白质，包括哺乳动物细胞例如COS和人胚肾(HEK)细胞。附加型载体依赖于复制起点和结合起点的反式作用的复制起始因子。复制起始因子例如结合EB病毒的OriP的EB病毒核抗原(EBNA)，可以克隆到附加型载体内，或可替代地，可以通过载体转染到其内的宿主细胞表达。因此，附加型载体 可以对特定细胞系特异，所述特定细胞系表达激活通过复制起点的复制所需的反式作用因子。
本发明消除了关于用于重组蛋白质表达的不同附加型载体主链的需要。本发明提供了包括至少2个不同的附加型复制起点的附加型载体，这允许相同载体在不同细胞类型中用于蛋白质表达。不同复制起点允许载体在不同类型的哺乳动物细胞中用于蛋白质表达，所述哺乳动物细胞提供必需的反式作用复制因子且允许载体复制。通过消除再克隆目的基因用于蛋白质生产的需要，本发明改善了效率且减少了与多重载体相关的成本，同时维持蛋白质生产水平。本发明的一个令人惊讶的方面是给载体添加核苷酸即第二个复制起点，不会负面影响载体在所需水平上生产蛋白质的能力。
在一个优选实施方案中，本发明的载体包括抗体重或轻链恒定区。因此，抗体轻或重链可变区可以分别克隆到载体内轻或重链恒定区的上游，进一步改善表达系统的效率。附加型载体促进表达SV40T Ag或EB病毒核抗原的哺乳动物细胞(例如COS7或HEK293-6E细胞)中的高蛋白质生产。
本发明提供了关于蛋白质得率、生产效率和减少成本的最佳元件组合，和生物制品蛋白质例如抗体的生产，所述元件是用于特别是在医药工业中的蛋白质生产的所有重要元件。本发明的其他特征和优点在下文详述和权利要求中描述。
在一个方面，本发明提供了包括下述的表达载体：a)衍生自EB病毒(EBV)的OriP复制起点；(b)SV40复制起点；(c)用于插入目的基因的插入位点；和(d)编码抗体重或轻链恒定区的核酸序列，与插入位点可操作地连接。在一个实施方案中，目的基因是抗体重或轻链可变区，例如鼠类、人源化、嵌合或人抗体重或轻链可变区。在一个具体实施方案中，抗体重链可变区是选自阿达木单抗(adalimumab)、ABT-325和ABT-874的抗体的重链可变区。在另一个具体实施方案中，抗体轻链可变区是选自阿达木单抗、ABT-325和ABT-874的抗体的轻链可变区。抗体重链恒定区是例如鼠类、人源化、嵌合或人的，并且可以是选自γ1，z，a；γ1，z，non-a；γ2，n+；γ2，n-；和γ4的抗体重链恒定区。γ1，z，non-a抗体重链恒定区可以进一步包括在重链恒定区的位置234处的丙氨酸突变。在另一个实施方案中，γ1，z，non-a抗体重链恒定区可以进一步包括 在重链恒定区的位置235或237处的丙氨酸突变。
在一个实施方案中，抗体轻链恒定区是人κ同种型或人λ同种型。在一个实施方案中，抗体重链恒定区是鼠类γ1同种型或鼠类γ2a同种型。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区是鼠类κ同种型。在一个实施方案中，抗体重链恒定区是Fc结构域。在一个实施方案中，重或轻链抗体可变区对于插入位点是5′。
在一个实施方案中，表达载体进一步包括与插入位点可操作地连接的启动子，其中启动子是EF-1α启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一个实施方案中，表达载体进一步包括可选标记，例如氨苄青霉素抗性基因。
在一个实施方案中，CMV启动子包括与SEQ ID NO：1的核苷酸1-608至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同的核酸序列。在一个具体实施方案中，CMV启动子包括SEQ ID NO：1的核苷酸1-608。
在一个实施方案中，EF-1α启动子是人的。在一个实施方案中，EF-1α启动子包括与SEQ ID NO：2的核苷酸76-1267至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同的核酸序列。在一个具体实施方案中，EF-1α启动子包括SEQ IDNO：2的核苷酸76-1267。
在一个实施方案中，OriP复制起点包括与SEQ ID NO：1的核苷酸1795-3545至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同的核酸序列。
在一个实施方案中，SV40复制起点包括与SEQ ID NO：1的核苷酸5834-6140至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同的核酸序列。在一个具体实施方案中，SV40复制起点包括SEQ ID NO：1的核苷酸5834-6140。
本发明的示例性表达载体包括与选自下述的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同的核酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32。在一个具体实施方案中，表达载体包括选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32的核酸序列。
本发明的表达载体还在图1、2和14-15中提供。本发明的另外载体在图8-13中描述。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的载体的哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主可以是COS细胞，例如COS 7细胞，或人胚肾(HEK)细胞，例如HEK-293细胞。
在另一个方面，本发明提供了包括本发明的载体的试剂盒。
在另一个方面，本发明提供了产生重组蛋白质的方法，其包括将本发明的表达载体引入哺乳动物宿主细胞内，在合适条件下培养哺乳动物宿主细胞，以便表达蛋白质，并且回收蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了包括编码信号肽的核酸序列的表达载体。在一个实施方案中，目的基因与编码信号肽的核酸可操作地连接。
附图简述
当连同附图一起阅读时，本发明的下述和其他目的、特征和优点以及本发明自身，根据优选实施方案的下述描述将得到更全面理解，其中：
图1显示空pHyb-C载体的图。特征包括SV40真核生物复制起点、巨细胞病毒真核生物表达启动子(pCMV)、三联前导序列(TPL)、剪接供体位点(SD)、腺病毒主要晚期增强子元件(enh MLP)、剪接受体位点(SA)、关于目的基因的开放读码框(ORF)区随后为多腺苷酸信号(pA)、二重对称元件(DS)、EB病毒衍生的真核生物复制起点(OriP)、复制区(FR)、氨苄青霉素抗性标记(AmpR)和细菌复制起点(pMB1ori)。
图2显示空pHyb-E载体的图。特征包括SV-40真核生物复制起点、EF-1a真核生物启动子、关于目的基因的开放读码框(ORF)区随后为多腺苷酸信号(pA)、二重对称元件(DS)、EB病毒衍生的真核生物复制起点(OriP)、复制区(FR)、氨苄青霉素抗性标记(AmpR)和细菌复制起点(pMB1ori)。
图3显示通过COS细胞产生的重组Fc融合蛋白滴度，所述COS细胞经由电穿孔用pBOS、pTT3、pHybC和pHybE载体转染。
图4显示通过HEK-293-6E细胞产生的重组Fc融合蛋白滴度，所述 HEK-293-6E细胞使用PEI用pBOS、pTT3、pHybC和pHybE载体转染。
图5显示通过HEK-293-6E产生的抗体滴度，所述HEK-293-6E使用PEI用构建为表达IgG抗体的pBOS、pTT3、pHybC和pHybE载体转染。
图6显示通过COS产生的抗体滴度，所述COS经由电穿孔用构建为表达IgG抗体的pBOS、pTT3、pHybC和pHybE载体转染。
图7显示通过COS产生的抗体滴度，所述COS经由电穿孔用表达IgG抗体的pHyb-E-Swa I(v1)或pHyb-E(v2)载体构建体转染。
图8显示pHybC-mBR3-mCg2a载体(也称为“pHybC-mBR3-Fc”)的图。
图9显示pHybE-mBR3-mCg2a载体(也称为“pHybE-mBR3-Fc”)的图。
图10显示pHybC-E7-hCk载体(也称为“pHybC-E7”)的图。
图11显示pHybC-D2-hCg1，z，a载体(也称为“pHybC-D2”)的图。
图12显示pHybE-D2-hCg1，z，a载体(也称为“pHybE-D2”)的图。
图13显示pHybE-E7-hCk载体(也称为“pHybE-E7”)的图。
图14显示pHybE-hCg1，z，aV2(也称为“pJP 182”)的图。
图15显示pHybE-hCg1，z，non-aV2(也称为“pJP183”)的图。
图16显示pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V2(也称为“pJP184”)的图。
图17显示pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V2(也称为“pJP185”)的图。
图18显示pHybE-hCg2，n+V2(也称为“pJP186”)的图。
图19显示pHybE-hCg2，n-V2(也称为“pJP187”)的图。
图20显示pHybE-hCg4 V2(也称为“pJP188”)的图。
图21显示pHybE-mCg1 V2(也称为“pJP189”)的图。
图22显示pHybE-mCg2a V2(也称为“pJP190”)的图。
图23显示pHybE-hCk V2(也称为“pJP191”)的图。
图24显示pHybE-hC1 V2(也称为“pJP192”)的图。
图25显示pHybE-mCk V2(也称为“pJP193”)的图。
发明详述
I.定义
为了本发明可以更容易理解，首先在本文中定义了特定术语。
如本文所使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意欲包括DNA、RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA及其类似物。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。核酸可以进行分离，或整合到另一个核酸分子例如表达载体或真核生物宿主细胞的染色体内。
“分离的”核酸分子是与核酸的天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子。例如，就基因组DNA而言，术语“分离的”包括与基因组DNA与之天然结合的染色体分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸分子不含在核酸由之衍生的生物体的基因组DNA中天然侧接核酸的序列(即，位于核酸的5′和3′末端处的序列)。此外，“分离的”核酸分子例如cDNA分子可以基本上不含其他细胞材料，或当通过重组技术产生时不含培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制品。
在本文中可互换使用的术语“重组载体”或“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，这指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。可替代地，载体可以是线性的。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。特定载体能够在它们引入其内的宿主细胞内自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因组一起复制。在一个优选实施方案中，本发明的载体是附加型哺乳动物载体。如本文所使用的，术语“构建体”也指载体。
特定载体能够指导它们与之可操作地连接的基因的表达。“表达载体”或“重组表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子，并且此外，包含必需元件以控制基因的表达。一般地，表达载体包括转录启动子、目的基因和转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，并且此种基因被说成与启动子“可操作地连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，那么调节元件和核心启动子是可操作地连接的。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括超过一个复制起点，从而使载体不限制于一种细胞类型。
如本文所使用的，术语“附加型复制载体”或“附加型载体”指一般且非常优选不整合到宿主细胞的基因组内而是平行存在的载体。如本文所使用的，附加型复制载体在细胞周期过程中复制，并且在这个复制过程中，依赖于在细胞分裂前和后存在的拷贝数，载体拷贝在统计上分布于所得到的细胞中。优选地，附加型复制载体可以在宿主细胞的核中发生，并且优选在细胞周期的S期过程中复制。此外，附加型复制载体在细胞周期的S期过程中在宿主细胞的核中复制至少一次，即一次或多次。在一个非常优选的实施方案中，附加型复制载体在细胞周期的S期过程中在宿主细胞的核中复制一次。
如本文所使用的，术语“复制序列的起点”或“复制起点”在本文中可互换使用，指当存在于载体中时起始复制的序列。复制起点可以由复制起始因子或可替代地DNA解旋酶识别。
如本文所使用的，“重组”指通过其核酸材料例如DNA例如在微生物中在2个核酸分子之间交换的过程。如本文所使用的，“同源重组”指通过其核酸材料经由序列同源性或优选地序列同一性(例如高度序列同一性)的区域或区段在2个核酸分子之间交换的过程。在示例性实施方案中，核酸材料位于生物体的染色体或附加体上。在另一个示例性实施方案中，核酸材料染色体外定位于例如质粒上。重组可以在线性和/或环状DNA分子之间发生。
如本文所使用的，术语“目的基因”指加入本发明的载体中的外源DNA序列。目的基因例如可以包括编码序列，其可以由内含子分隔或是编码开放读码框的cDNA。如本文所使用的，“目的基因”指加入本发明的载体中用于最终蛋白质表达的DNA序列。目的基因克隆至其的载体区域在本文中称为“插入位点”。优选地，目的基因包括使用本发明的载体表达的抗体或融合蛋白的部分。例如，将抗体阿达木单抗的重链可变区即目的基因克隆到包括重链恒定区的本发明的载体中。
在本发明的一个实施方案中，载体包括抗体轻或重链恒定区，其对于用于目的基因的插入位点是3′，并且与之可操作地连接。因此，在一个实施方案中，目的基因是抗体轻或重链的可变区，其与本发明的载体中编码的抗体轻或重链恒定区可操作地连接。
当核苷酸序列置于与另一个核苷酸序列的功能关系内时是“可操作地连接的”。例如，如果当表达时，序列在具有蛋白质或多肽的框内编 码信号肽，那么编码信号肽的DNA与编码蛋白质或多肽的DNA可操作地连接。同样地，如果蛋白质或多肽的表达得到促进或增强，那么启动子或增强子与编码蛋白质或多肽的核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方案中，可操作地连接的核苷酸序列是邻接的(例如，在信号序列的情况下)。可替代地，可操作地连接的核苷酸序列可以是非邻接的(例如，在增强子的情况下)。在一个实施方案中，编码抗体轻或重链恒定区的核酸序列与目的基因例如重或轻链可变区可操作地连接。
术语“启动子”包括足以指导在真核生物细胞中的转录的任何核酸序列，包括诱导型启动子、阻遏型启动子和组成型启动子。一般地，启动子包括这样的元件，其足以致使以细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性方式，或通过外部信号或试剂诱导的可控制的启动子依赖性基因表达。此种元件可以位于特定基因的5′或3′或内含子序列区中。通常，基因表达将是组成性的，尽管需要时可以在本发明中采用可调节启动子。基因表达还可以通过转录调节加以控制，使用热、光或金属，例如通过使用金属硫蛋白(metallothionine)基因或热休克基因。
“上游”和“下游”是用于描述核苷酸序列或载体中存在的2个元件之间的相对定向的术语。与其他元件比较，其为另一个元件的“上游”的元件位于与序列的5′末端更接近的位置中(即如果分子是线性的，那么更接近于具有与核糖或脱氧核糖主链的5′碳附着的磷酸基的分子末端)。当与其他元件比较时，元件位于与序列的3′末端更接近的位置中时(即在线性分子中具有与核糖或脱氧核糖主链的3′碳附着的羟基的分子末端)，它被说成是“下游的”。
如本文所使用的，术语“填充序列”指优选在载体中的核酸序列，其侧面为在5′和3′末端处的限制酶位点。填充序列位于载体中在用于编码目的基因的核酸的插入位点处。在克隆过程期间，使用合适的限制酶从载体中消化掉填充序列，并且将编码目的基因的核酸连接或同源重组到载体内在填充序列的先前位置处。优选地，填充序列足够大以提供在5′和3′限制酶位点之间的足够距离，从而使得限制酶可以有效地切割载体。此外，优选填充序列的长度不同于编码目的基因的核酸大小，例如约300个碱基对或更小或约400个碱基对或更大的填充序列长度可以用于编码其为约350个碱基对的目的基因的核酸。在另一个实施方案中，填充序列大小为约1kb。
如本文所使用的，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指重组表达载体已引入其内的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定的实验对象细胞还指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响，特定修饰可以在后代中发生，所以此种后裔事实上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所提及的，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指包括通过二硫键互联的至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域——CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变性区域，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL组合的6个CDRs构成抗原结合位点。在由2条H链和2条L链组成的抗体的情况下，抗体可以包含2个等同的抗原结合位点，结合相同抗原的2个不同抗原结合位点，或结合不同抗原的2个抗原结合位点。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一种组分(C1q)。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如，IL-1α、IL-1β)特异性结合的能力。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区处由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH或VL结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域，VL和VH，由分离的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们 能够制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单条蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且片段以与完整抗体相同的方式就效用进行筛选。在本发明的一个实施方案中，抗体片段选自Fab、Fd、Fd′、单链Fv(scFv)、scFva和结构域抗体(dAb)。
再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是更大免疫粘附分子的部分，由抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。此种免疫粘附分子的例子包括链霉亲和素核心区的使用，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)，以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标记的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。使用常规技术例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以由完整抗体制备抗体部分例如Fc、Fab和F(ab′)2片段。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得。
术语“结构域”指不依赖于蛋白质的其余保留其三级结构的折叠蛋白质结构。一般地，结构域负责蛋白质的不连续功能性质，并且在许多情况下可以加入、去除或转移给其他蛋白质，而无蛋白质和/或结构域的其余部分的功能丧失。单个抗体可变结构域意指包括抗体可变结构域特征性序列的折叠多肽结构域。它因此包括完整抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已由并非抗体可变结构域特异性的序列替换，或抗体可变结构域已截短或包括N或C末端延伸，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
本发明的可变结构域可以进行组合以形成结构域组；例如，互补结构域可以进行组合，例如VL结构域与VH结构域组合。非互补结构域也可以进行组合，例如VH结构域和第二个VH结构域。结构域可以以许多方式进行组合，涉及通过共价或非共价方式的结构域连接。
“dAb”或“结构域抗体”指特异性结合抗原的单个抗体可变结构域(VH或VL)多肽。在一个实施方案中，本发明的载体用于表达dAb。
短语“重组抗体”指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体， 例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列的剪接。此种重组抗体的例子包括嵌合、CDR移植和人源化抗体。
如本文所使用的，术语“人抗体”指具有相应于或衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体，如例如由Kabat等人描述的(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。然而，本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)，例如，在CDRs且特别是CDR3中。
本发明的重组人抗体可以具有可变区，并且还可以包括衍生自人种系免疫球蛋白序列的恒定区(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。然而，在特定实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列且与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系储库内。然而，在特定实施方案中，此种重组抗体是选择性诱变或回复突变或两者的结果。
术语“回复突变”指其中人抗体的体细胞突变的氨基酸中的一些或全部替换为来自同源种系抗体序列的相应种系残基的过程。本发明的人抗体的重和轻链序列与VBASE数据库中的种系序列分开比对，以鉴定具有最高同源性的序列。通过使编码此种不同氨基酸的限定核苷酸位置突变，使本发明的人抗体中的差异返回到种系序列。因此鉴定为用于回复突变的候选物的每个氨基酸的作用应就在抗原结合中的直接或间接作用进行研究，并且发现在突变后影响人抗体的任何所需特征的任何氨基酸都不应包括在最终人抗体中。为了使实施回复突变的氨基酸数目降到最低，可以保留发现与最紧密的种系序列不同但与第二个种系序列中 的相应氨基酸等同的氨基酸位置，条件是第二个种系序列与本发明的人抗体序列等同且同线共所讨论的氨基酸两侧上的至少10个、优选12个氨基酸。回复突变可以在抗体最佳化的任何阶段时发生。
术语“嵌合抗体”指包括来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠类重和轻链可变区的抗体。
术语“CDR移植抗体”指这样的抗体，其包括来自一个物种的重和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列替换为另一个物种的CDR序列，例如具有鼠类重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠类CDRs(例如，CDR3)已替换为人CDR序列。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其包括来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列，但其中已改变VH和/或VL序列的至少部分以更“象人”，即与人种系可变序列更相似。一种类型的人源化抗体是CDR移植抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列内，以替换相应的非人CDR序列。
如本文所使用的，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指2种更多种元件或组分通过无论何种方式连接在一起，包括化学缀合或重组方法。“框内融合”或“可操作地连接”指2个或更多个开放读码框(ORFs)的连接，以形成邻接的更长ORF，以维持原始ORFs的正确读码框的方式。因此，所得到的重组融合蛋白是包含2个或更多个区段的单一蛋白质，其与由原始ORFs编码的多肽对应(所述区段通常在自然界中不如此连接)。尽管因此制备的读码框在融合区段自始至终是邻接的，但区段可以在物理上或空间上由例如框内连接序列分离。
如本文所使用的，术语“Fc区”包括衍生自抗体重链的恒定区的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc区包括包含抗体的恒定区的多肽，除去第一个恒定区免疫球蛋白结构域。
Fc区可以是Fc区的功能等价类似物。Fc区的功能等价类似物可以是变体Fc区，包括对于野生型或天然存在的Fc区的一种或多种氨基酸修饰。在某些实施方案中，变体Fc区与天然存在的Fc区具有至少50％同源性，其中约80％至90％是优选的，包括至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性、至少约96％同源性、至少约97％同源性、至少98％同源性、或至少约99％同源性。Fc区的功能等价 类似物可以包括加入蛋白质的N或C末端中或从蛋白质的N或C末端中缺失的一个或多个氨基酸残基，优选不超过30个、最优选不超过10个。Fc区的功能等价类似物包括与融合物配偶体可操作地连接的Fc区。
如本文所使用的，术语“Fc融合物”或“Fc融合蛋白”包括其中一种或多种蛋白质、多肽或小分子与Fc区或其衍生物可操作地连接的蛋白质。如本文所使用的，术语“Fc融合物”意欲与术语例如“Ig融合物”、“Ig嵌合体”和“受体球蛋白”(有时具有虚线)同义，如现有技术中使用的(Chamow等人，1996，Trends Biotechnol 14：52-60；Ashkenazi等人，1997，Curr Opin Immunol 9：195-200)。Fc融合物使免疫球蛋白的一个或多个Fc区或其一种或多种变体与融合物配偶体组合，所述融合物配偶体一般可以是任何蛋白质、多肽、肽或小分子。在某些实施方案中，Fc融合物的非Fc部分即融合物配偶体的作用可以是介导靶结合，并且因此它可以在功能上类似于抗体的可变区。
各种接头可以在本发明中用于使Fc多肽与融合物或缀合物配偶体共价连接，或以产生Fc融合物。如本文所使用的，术语“接头”、“连接序列”、“间隔物”、“栓系序列”或其等价物指分子或分子组(例如单体或聚合物)，其使2个分子连接并且可以用于使2个分子置于优选构型中。许多策略可以用于使分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N和C末端之间的多肽连接、经由二硫键的连接、和经由化学交联剂的连接。
II.本发明的载体
本发明提供了用于在哺乳动物宿主细胞中表达蛋白质的附加型载体。本发明的载体基于2个附加型复制起点的包括，这允许载体在包含关于任一复制起点的反式作用复制起始因子的任何细胞系中使用。尽管载体还可以包含结合复制起点的复制起始因子，但在一个优选实施方案中，反式作用复制因子由宿主细胞提供。此外，在一个实施方案中，本发明的载体提供了用于生产抗体和Fc融合蛋白的高效和有效方法，因为载体包含与目的基因可操作地连接的重或轻链恒定区。本发明的载体的例子在图1、2和8-25中描述。此外，示例性载体的序列在SEQ ID NOs：1-32中提供。图1和2(以及相应的SEQ ID NOs：1和2)描述“开放”载体，即不包含抗体重或轻链恒定区和目的基因的本发明的载体。图 8-25提供了本发明的载体的图，所述本发明的载体还包括各种鼠类或人恒定区，具有用于克隆目的基因的位点。
本发明的载体包括至少2种不同的复制起点，例如衍生自EB病毒(EBV)的OriP复制起点和SV40复制起点。复制起点可以衍生自DNA病毒，更优选衍生自允许附加型复制的DNA病毒，包括衍生自例如EB病毒、单纯疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、鼠γ疱疹病毒68、人巨细胞病毒、小鼠巨细胞病毒、假性狂犬病病毒、猴病毒40、多瘤病毒、人BK病毒、牛乳头状瘤病毒和腺伴随病毒。
在一个实施方案中，复制起点来自EB病毒，例如oriP或其功能部分(EB功能起点的例子在Aiyar等人，(1998)EMBO Journal，17：6394中描述)。EB病毒复制起点(OriP)由2个主要元件和促进经由细胞的DNA合成的多重顺式作用元件以及病毒维持元件组成。2个主要元件中的第一个包含重复家族(FR)，其包括EBNA结合位点(在图1和2中显示)。EBNA是经由OriP起始载体复制的复制起始因子(关于EBNA序列，参见Genbank登记号V01555(gi：94734074))。OriP中包含的第二个元件包含所谓的二重对称(DS)，并且它的功能是充当起点识别元件。一般地，DS和FR元件由一般1000bp的几个碱基对分隔。可以改变OriP特别是DS和FR的相对定向，而不影响OriP功能。可以改变OriP且特别是DS和FR相对于位于本发明的表达载体上的其他元件的定向，而不影响OriP功能。在本发明的一个优选实施方案中，其中复制起点是EB病毒复制起点(OriP)，并且其中OriP包括重复家族(FR)和二重对称(DS)，连接顺序是这样的，使得DS元件在目的基因和FR元件之间。在一个实施方案中，本发明的载体包括OriP(EB病毒)复制起点，其包括SEQ ID NO：1的核苷酸1795-3545，或与之80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同的序列。
在另一个实施方案中，载体包括SV40复制起点。SV40(猴病毒40)复制起点(例如在图1和2中描述为“SV40Ori”)需要单个病毒蛋白质大T抗原，用于起始经由这个起点的载体复制。SV40复制起点可以在附加型载体中用于复制且维持所述载体(参见Cabs(1996)Trends Genetics 12：462；Harrison等人(1994)J Virol 68：1913；Cooper等人(1997)PNAS 94：6450；和Ascenziono等人(1997)Cancer Lett 118：135)。在一个实施方案中，本发明的载体包括SV40复制起点，其包括SEQ ID NO：1的核苷酸5834-6140，或与之80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同的序列。
本文描述的复制起点的功能变体也包括在根据本申请的复制起点的含义中。
除附加型复制起点外，本发明的载体还可以具有用于使载体在细菌中复制的复制起点。如图1和2中所示并且不意欲是限制性的例子是在大肠杆菌中起作用的pMB1ori。
本发明的载体还可以包括可选标记。选择标记可以促进载体序列在原核生物和真核生物中的克隆和扩增。在特定实施方案中，选择标记将赋予针对化合物或一类化合物例如抗生素的抗性。可以与本发明的核酸分子和哺乳动物细胞一起使用的示例性选择标记是赋予针对嘌呤霉素的抗性的那种。可替代地，可以使用赋予针对下述的抗性的选择标记：潮霉素、gpt、新霉素、博来霉素、乌本甘、杀稻瘟菌素、卡那霉素、遗传霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、四环素、链霉素、壮观霉素、萘啶酸、利福平、氯霉素、博来霉素或争光霉素，或标记例如DHRF、hisD、trpB或谷氨酰胺合成酶。
在本发明的载体中还包括的是目的基因(以及可选标记)转录和翻译成蛋白质必需的调节元件。转录调节元件通常包括待表达的基因序列5′的启动子、转录起始和终止位点、和多腺苷酸化信号序列。术语“转录起始位点”指在构建体中与掺入原始转录物即mRNA前体内的第一个核酸对应的核酸；转录起始位点可以与启动子序列重叠。术语“转录终止位点”指通常在目的基因或待转录的序列段的3′末端处代表的核苷酸序列，这促使RNA聚合酶终止转录。多腺苷酸化信号序列或多腺苷酸添加信号提供用于在真核生物mRNA的3′末端处在特定位点处切割的信号和在约100-200个腺嘌呤核苷酸(多腺苷酸尾)序列的核心中对切割的3′末端的转录后添加。多腺苷酸化信号序列包括位于距离切割位点上游约10-30个核苷酸处的序列AATAAA，加上下游序列。
可以在本发明的载体中包括的调节元件是启动子。启动子可以是组成型或诱导型的。增强子(即作用于启动子以增加转录的顺式作用DNA元件)可以是必需的，以与启动子结合作用于增加用单独的启动子获得的表达水平，并且可以包括作为转录调节元件。通常，包含启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如，CMV IE P/E；SV40P/E；MPSV P/E)。需要时可以包括剪接信号，以获得剪接转录物。为了产生分泌多肽，所选择的序列一般将包括编码前导肽的信号序列，其指导新合成的多肽到ER膜且通过ER膜，在所述ER膜中多肽可以发送用于分泌。前导肽通常但不是普遍在分泌蛋白质的氨基末端处，并且在蛋白质经过ER膜后通过信号肽酶切割掉。选择序列一般但不一定包括其自身信号序列。当不存在天然信号序列时，可以使异源信号序列与所选择的序列融合。众多信号序列是本领域已知的且可从序列数据库例如GenBank和EMBL获得。翻译调节元件包括翻译起始位点(AUG)、终止密码子和多腺苷酸信号用于待表达的每种个别多肽。内部核糖体进入位点(IRES)包括在某些构建体中。
用于在本发明中使用的启动子包括病毒、哺乳动物和酵母启动子，例如鼠类β珠蛋白启动子、遍在蛋白启动子、多瘤启动子、哺乳动物巨细胞病毒(CMV)启动子、酵母醇氧化酶、磷酸甘油激酶启动子、乳糖诱导型启动子、半乳糖苷酶启动子、腺伴随病毒启动子、痘病毒启动子、逆转录病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、腺病毒启动子、SV40启动子、羟甲基戊二醛辅酶A启动子、胸苷激酶启动子、H5R痘病毒启动子、腺病毒2MPC型晚期启动子、α-抗胰蛋白酶启动子、fox IX启动子、免疫球蛋白启动子、CFTR表面活性剂启动子、白蛋白启动子和转铁蛋白启动子。选择用于与本发明的核酸和表达载体一起使用的启动子可以提供(1)高水平的表达，例如在驱动目的基因的表达中，或(2)减少的表达水平(在通过修饰减弱后)，例如在驱动可选标记基因的表达中。优选地，驱动目的基因的启动子是强启动子，例如遍在蛋白、CMV、EF-1α和SRα启动子，以增加表达且促进目的产物的正确剪接。
在一个实施方案中，本发明的载体包括CMV启动子以驱动目的基因表达。CMV启动子的使用在引入本文作为参考的美国专利号5,385,839和5,849,522中描述。在一个实施方案中，在本发明的载体中使用的CMV启动子与目的基因和SEQ ID NO：1的核苷酸1-608可操作地连接。在本发明的范围中还包括的是与SEQ ID NO：1的核苷酸1-60880％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同的CMV启动子。
可以在本发明的载体中使用的另一种启动子是来自延伸因子1α(EF-1α)例如人EF-1α的启动子。人EF-1α启动子的序列可以在GenBank 登记号NM_001402(gi：83367078)处找到。在一个实施方案中，本发明的载体包括SEQ ID NO：2的76-1267。在本发明的范围中还包括的是与SEQ ID NO：1的核苷酸1-60880％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同的EF-1α启动子。
在一个实施方案中，载体包括SwaI限制位点用于克隆目的。
一般地，基因(例如，可选标记和GOIs)夹在启动子和多腺苷酸化位点之间。所使用的多腺苷酸序列可以来自目的基因(即可以使用天然多腺苷酸序列)，或可以使用异源多腺苷酸序列(即来自与GOI不同的基因)，例如BGH多腺苷酸和SV40多腺苷酸。mRNA由启动子转录且通过位于编码区3′的多腺苷酸化信号稳定。多腺苷酸信号是本领域众所周知的，并且可以基于用于与本发明中采用的载体和宿主细胞一起使用的合适性进行选择。可以使用的多腺苷酸信号的例子包括人BGH多腺苷酸、SV40多腺苷酸、人β肌动蛋白多腺苷酸、兔β珠蛋白多腺苷酸和免疫球蛋白κ多腺苷酸。
本发明的载体包括目的基因，其中载体作为用于在细胞培养中表达的手段。目的基因可以编码功能核酸分子(例如，RNA，例如反义RNA分子)，或更一般地，编码对于其希望增加生产的肽、多肽或蛋白质。本发明的载体可以具有在插入位点处插入的目的基因，从而使得目的基因与允许目的基因表达的调节核酸序列可操作地连接。在一个实施方案中，本发明的载体可以用于表达基本上任何目的基因，特别是编码具有治疗上有用的活性或其他商业相关应用的重组蛋白质的基因。
目的基因的非限制性例子包括激素、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子和酶。所需产物的非详尽列表包括例如人生长激素，牛生长激素，甲状旁腺激素，促甲状腺激素，滤泡刺激激素生长，促黄体激素；激素释放因子；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；降钙素；胰高血糖素；分子例如肾素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子例如蛋白质C，心钠素，肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受激活调节的正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白质(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；副中肾管抑制物质；松弛素A或B链； 松弛素原；小鼠促性腺素关连肽；DNA酶；抑制素；活化素；关于激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)，神经生长因子例如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5、FGF-6；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGFα和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质例如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(ILs)，例如IL-1至IL-23；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白质，例如HER2；衰变加速因子；病毒抗原例如AIDS包膜的部分；转运蛋白质；归巢受体；地址素；关于生长因子、细胞因子、趋化因子和淋巴因子的受体；调节蛋白质；抗体；嵌合蛋白质例如免疫粘附素和任何上述多肽的片段。细菌多肽或蛋白质的例子包括例如碱性磷酸酶和β-内酰胺酶。
在本发明的一个方面，载体包括与插入位点可操作地连接的抗体重或轻链区。包括2个附加型复制起点和抗体的轻或重链恒定区的载体的例子可以在SEQ ID NOs：3-32中找到。
本发明的一个实施方案包括可以用于表达完整抗体的载体，即对于重或轻链与恒定区连接的可变区。因此，目的基因可以编码抗体重链或轻链可变区，其可以具有任何抗体类型，例如鼠类、嵌合、人源化和人的。编码重链或轻链可变区的目的基因可以包括全长可变区，或可替代地，可以仅编码重链或轻链的片段，例如抗原结合部分区。在一个实施方案中，目的基因编码鼠类或人抗体可变区。在此种情况下，恒定区可以与可变区的物种匹配(SEQ ID NOs：3-8、27和28编码鼠类恒定区，而SEQ ID NOs：9-26和29-32编码人恒定区)。
在一个实施方案中，本发明的载体包括具有特定同种型和/或同种异型特征的编码抗体重恒定区的核酸序列。重链恒定区可以例如是γ同种型(IgG)，例如γ1、γ2、γ3或γ4。在一个实施方案中，重链γ1恒定 区是特定同种异型，包括但不限于，同种异型z，a和z，non-a。z，a同种异型也称为G1m17和G1m1同种异型，并且与具有在位置214处的Lys(在CH1内)、在356处的Asp(CH3)和在358处的Leu(CH3)(编号根据EU编号系统)的IGHG1对应。z，non-a同种异型也称为G1m17和nG1m1同种异型，与具有在位置214处的Lys(在CH1内)、在356处的Glu(CH3)和在358处的Met(CH3)(编号根据EU编号系统)的IGHG1对应。
在另一个实施方案中，重链γ2恒定区(hcG2)是特定同种异型，包括但不限于，n-或n+。hcG2的n+同种异型也称为G2m(n)或G2m(23)，与具有在CH1中的位置189处的Thr和在位置282处的Met(编号根据EU编号系统)的IGHG2对应。hcG2的n-同种异型也称为G2m(n-)或G2m(n-)，与具有在CH1中的位置189处的Pro和在位置282处的Val(编号根据EU编号系统)的IGHG2对应。n+和n-同种异型的另外细节在Hougs等人(2001)Jmmunogenetics 52：242和Brusco等人(1995)Immunogenetics 42：414中描述。
在其他实施方案中，重链恒定区可以是IgM、IgA(IgA1或IgA2)、IgD或IgE同种型。
在一个实施方案中，重链恒定区可以具有下述人同种型和同种异型特征：γ1，z，a；γ1，z，非-a；γ2，n+；γ2，n-；或γ4。在一个实施方案中，同种型/同种异型γ1，z，non-a可以包括在重链恒定区的位置234处的突变。在一个进一步的实施方案中，同种型/同种异型γ1，z，non-a可以包括在重链恒定区的位置234和235或234和237处的突变。此种载体的例子在图8-25中提供。
在另一个例子中，在本发明的载体中编码的轻链恒定区可以包括κ同种型或λ同种型。
由本发明的载体编码的恒定区并不限于人，而是相反可以包括鼠类或其他物种的恒定区。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码重链恒定区的核酸，其不是鼠类γ1同种型也不是鼠类γ2a同种型，或轻链恒定区是鼠类κ同种型。
本发明的2种载体pHybC和pHybE是空载体，因为这些载体不包含恒定区域，并且可以用于克隆目的基因。pHybC和pHybE的描述在下文提供，并且这些载体的图可以在图1和2中找到。
pHfybC pHybC载体(空)包含2个病毒复制起点，从而使得载体可以在不同细胞系中复制。pHybC包含下述元件：SV40复制起点(“SV40Ori”)，其允许在表达SV40的大T抗原蛋白质的细胞(例如，COS7细胞)中的载体质粒复制；与用于目的基因的插入位点可操作地连接的CMV启动子(“pCMV”)；三联前导序列(TPL)；剪接供体位点(SD)；和腺病毒主要晚期增强子元件(enh MLP)；剪接受体位点(SA)；关于目的基因的开放读码框(ORF)区随后为多腺苷酸信号(pA)；二重对称元件(DS)；EB病毒衍生的真核生物复制起点(OriP)，其允许在表达病毒EBNA-1蛋白质的细胞(例如，HEK-293-6E细胞)中的载体质粒复制；复制区(FR)；氨苄青霉素抗性标记(AmpR)；和细菌复制起点(pMB1ori)。pHybC载体利用pCMV启动子，可用的最强启动子元件之一。pHybC(空)的载体图在图1中描述。pCMV载体的核酸序列在SEQ ID NO：1中阐述。
pHybE pHybE载体(空)包含2个复制起点，从而使得载体可以在不同细胞系中复制。pHybE包含下述元件：SV40复制起点(“SV40Ori”)，其允许在表达SV40的大T抗原蛋白质的细胞(例如，COS7细胞)中的载体质粒复制；与用于目的基因的插入位点可操作地连接的EF-1a真核生物启动子；关于目的基因的开放读码框(ORF)区随后为多腺苷酸信号(pA)；二重对称元件(DS)；EB病毒衍生的真核生物复制起点(OriP)；复制区(FR)；氨苄青霉素抗性标记(AmpR)；和细菌复制起点(pMB1ori)。pHybE(空)的载体图在图2中描述。pHybE与pHybC不同之处在于，pHybE包含与用于目的基因的插入位点可操作地连接的EF-1a启动子，而pHybC包含CMV启动子。pHybE载体的核酸序列在SEQ ID NO：2中阐述。
下文提及的载体基于pHybE或pHybC，并且另外包含免疫球蛋白重或轻链恒定区。与pHybE和pHybC一样，下述载体具有可以用于插入目的基因的克隆位点，所述目的基因例如免疫球蛋白可变区的编码序列、或其抗原结合部分。在每种情况下，关于目的基因的克隆位点与载体内包含的恒定区的编码序列相邻。因此，下文载体可以用于表达包含特定恒定区和特定可变区的抗体轻或重链。与pHybC和pHybE一样，下文提及的本发明的载体各自包含多个复制起点，从而使得抗体轻或重链可以使用相同载体在不同细胞系中表达。本发明的另外载体的描述在 下文描述(还参见图8-25中提供的载体图)。应当指出描述为形式1(V1)的pHyb载体具有SrfI限制位点上游的另外Swa I位点，而描述为形式2(V2)的pHyb载体不具有另外Swa I位点。
包括鼠类恒定区的本发明的载体
pHvbC-mCg2a 载体pHybC-mCg2a基于pHybC载体(因此包含上文对于pHybC描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ2a重链恒定区的鼠类免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybC-mCg2a载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区(或其部分)和鼠类γ2重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybC-mCg2a可以用于表达与γ2重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。图8显示了pHybC-mBR3-mCg2a的图，其包括关于鼠类BR3蛋白质的细胞外结构域(ECD)的编码序列作为目的基因。pHybC-mBR3-mCg2a的核酸序列在SEQ ID NO：27中阐述。
pHybE-mCk 载体pHybE-mCk基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。pHybE-mCk还包括关于κ轻链恒定区的鼠类免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-mCk载体可以用于表达包括免疫球蛋白轻链可变区和鼠类κ轻链恒定区的抗体轻链。可替代地，pHybE-mCk可以用于表达与κ轻链恒定区融合的目的基因。pHybE-mCk V2的载体图在图25中提供。pHybE-mCk V1的核酸序列在SEQ ID NO：3中阐述，并且pHybE-mCk V2的核酸序列在SEQID NO：4中阐述。
pHybE-mCg1 pHybE-mCg1基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1重链恒定区的鼠类免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-mCg1载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和鼠类γ1重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-mCg1可以用于表达与鼠类γ1重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-mCg1 V2的载体图在图21中提供。pHybE-mCg1 V1的核酸序列在SEQ ID NO：5中阐述，并且pHybE-mCg1 V2的核酸序列在SEQ ID NO：6中阐述。
pHybE-mCg2a pHybE-mCg2a基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ2a重链恒定区的 鼠类免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-mCg2a载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和鼠类γ2重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-mCg2a可以用于表达与γ2重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-mCg2a V2的载体图在图22中提供。pHybE-mCg2a V1的核酸序列阐述为SEQ ID NO：7，并且pHybE-mCg2a V2的核酸序列在SEQ ID NO：8中阐述。作为可以如何使用pHybE-mCg2a的一个实施方案的例子，图9显示了pHybE-mBR3-mCg2a的图。图9中描述的载体包含关于鼠类BR3蛋白质的细胞外结构域(ECD)的编码序列。pHybE-mBR3-mCg2a的核酸序列在SEQ ID NO：28中阐述。
包括人恒定区的本发明的载体
pHybC-E7-hCk pHybC-E7-hCk基于pHybC载体(因此包含上文对于pHybC描述的所有元件)。这种载体还包括关于κ轻链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。另外，pHybC-E7-hCk包含阿达木单抗的轻链可变区的编码序列(也称为“E7”)。pHybC-E7-hCk的载体图在图10中提供，并且pHybC-E7-hCk的核酸序列在SEQ ID NO：29中阐述。
pHybC-D2-hCg1，z，a pHybC-D2-hCg1，z，a基于pHybC载体(因此包含上文对于pHybC描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1，z，a重链恒定区的编码序列。另外，pHybC-D2-hCg1，z，a包含阿达木单抗的重链可变区的编码序列(也称为“D2”)。pHybC-D2-hCg1，z，a的载体图在图11中提供。pHybC-D2-hCg1，z，a的核酸序列在SEQ ID NO：30中阐述。
pHybE-hCk pHybE-hCk基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于κ轻链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，例如，pHybE-hCk载体可以用于表达包括免疫球蛋白轻链可变区和人κ轻链恒定区的抗体轻链。可替代地，pHybE-hCk可以用于表达与κ轻链恒定区融合的目的基因。pHybE-hCk V2的载体图在图23中提供。pHybE-hCk V1的核酸序列在SEQ ID NO：9中阐述，并且pHybE-hCk V2的核酸序列在SEQ ID NO：10中阐述。pHybE-E7-hCk的载体图也在图13中提供。除上文描述的pHybE-hCk载体的所有元件外，pHybE-E7-hCk还包含阿达木单抗的轻链可变区的编码序列(也称为“E7”)。pHybE-E7-hCk的核酸序列在SEQ ID NO：32中阐述。
pHybE-hCl pHybE-hCl基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于λ轻链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCl载体可以用于表达包括免疫球蛋白轻链可变区和人λ轻链恒定区的抗体轻链。可替代地，pHybE-hCl可以用于表达与λ轻链恒定区融合的目的基因。pHybE-hCl V2的载体图在图24中提供。pHybE-hCl V1的核酸序列在SEQ ID NO：11中阐述，并且pHybE-hCl V2的核酸序列在SEQ ID NO：12中阐述。
pHybE-hCg1，z，a pHybE-hCg1，z，a基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1，z，a重链恒定区的编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg1，z，a载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和人γ1，z，a重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg1，z，a可以用于表达与γ1，z，a重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1，z，a的载体图在图14中提供。pHybE-hCg1，z，a V1的核酸序列在SEQ ID NO：13中阐述，并且pHybE-hCg1，z，a V2的核酸序列在SEQ ID NO：14中阐述。关于pHybE-D2-hCg1，z，a的载体图在图12中提供。除上文描述的pHybE-hCg1，z，a的元件外，pHybE-D2-hCg1，z，a包含阿达木单抗的重链可变区的编码序列(也称为“D2”)。pHybE-D2-hCg1，z，a的核酸序列在SEQID NO：31中阐述。
pHybE-hCg1，z，non-a pHybE-hCg1，z，non-a基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1，z，non-a重链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg1，z，non-a载体可以用于表达包括免疫球蛋白可变重链区和人γ1，z，non-a重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg1，z，non-a可以用于表达与γ1，z，non-a重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1，z，non-a V2的载体图在图15中提供。pHybE-hCg1，z，non-a V1的核酸序列在SEQ ID NO：15中阐述，并且pHybE-hCg1，z，non-a V2的核酸序列在SEQ ID NO：16中阐述。
pHybE-hCg1，z，non-a mut(234，235) pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1，z，non-a，mut(234，235)重链恒定区的人 免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)载体可以用于表达包括免疫球蛋白可变重链区和人γ1，z，non-a，mut(234，235)重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg 1，z，non-a，mut(234，235)可以用于表达与γ1，z，non-a，mut(234，235)重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V2的载体图在图16中提供。pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V1的核酸序列在SEQ ID NO：17中阐述，并且pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V2的核酸序列在SEQ IDNO：18中阐述。
pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237) pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ1，z，non-a，mut(234，237)重链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)载体可以用于表达包括免疫球蛋白可变重链区和人γ1，z，non-a，mut(234，237)重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)可以用于表达与γ1，z，non-a，mut(234，237)重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V2的载体图在图17中提供。pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V1的核酸序列在SEQ ID NO：19中阐述，并且pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V2的核酸序列在SEQ IDNO：20中阐述。
pHybE-hCg2，n- pHybE-hCg2，n-基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ2，n-重链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg2，n-载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和人γ2，n-重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg2，n-可以用于表达与γ2，n-重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg2，n-的载体图在图19中提供。pHybE-hCg2，n-V1的核酸序列在SEQ ID NO：21中阐述，并且pHybE-hCg2，n-V2的核酸序列在SEQ ID NO：22中阐述。
pHybE-hCg2，n+ pHybE-hCg2，n+基于pHyhE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ2，n+重链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg2，n+ 载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和人γ2，n+重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg2，n+可以用于表达与γ2，n+重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg2，n+的载体图在图18中提供。pHybE-hCg2，n+V1的核酸序列在SEQ ID NO：23中阐述，并且pHybE-hCg2，n+V2的核酸序列在SEQ ID NO：24中阐述。
pHybE-hCg4 pHybE-hCg4基于pHybE载体(因此包含上文对于pHybE描述的所有元件)。这种载体还包括关于γ4重链恒定区的人免疫球蛋白编码序列。因此，在一个实施方案中，pHybE-hCg4载体可以用于表达包括免疫球蛋白重链可变区和人γ4重链恒定区的抗体重链。可替代地，pHybE-hCg4可以用于表达与γ4重链恒定区融合的目的基因，例如Fc融合蛋白。pHybE-hCg4的载体图在图20中提供。pHybE-hCg4V1的核酸序列在SEQ ID NO：25中阐述，并且pHybE-hCg4V2的核酸序列在SEQ ID NO：26中阐述。
本发明的载体的序列在SEQ ID NOs：1-32中提供。在一个实施方案中，本发明的载体包括SEQ ID NOs：1-32任何一个中所示的序列，或与之至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98或至少99％等同的序列。
本发明可以用于生产人和/或人源化抗体，其免疫特异性识别特定细胞靶例如，上述蛋白质中的任何一种，人EGF受体、her-2/neu抗原、CEA抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep-cam、其他癌细胞表面分子、TNF-α、TNF-b1、VEGF、其他细胞因子、α4β7整联蛋白、IgEs、病毒蛋白质(例如，巨细胞病毒)。可以使用本发明的组合物和方法产生的抗体的例子包括但不限于，抗TNFα抗体、抗IL-12抗体、抗IL-18抗体、抗EPO受体(EPO-R)抗体。在一个实施方案中，抗TNFα抗体是全人抗TNFα抗体，例如阿达木单抗/D2E7(参见引入本文作为参考的美国专利号6,090,382； 
Abbott Laboratories)。在一个实施方案中，抗IL-12抗体是全人的抗IL-12抗体，例如ABT-874(Abbott Laboratories；参见引入本文作为参考的美国专利号6,914,128)。在一个实施方案中，抗IL-18抗体是全人IL-18抗体(例如，ABT-325)，例如还参见引入本文作为参考的US20050147610 A1中描述的抗体。在一个实施方案中，抗EPO/R(也称为ABT-007)抗体是全人抗体，如在此引入作为参考的美国专利申请 号US 20060018902 A1中描述的那种。
此外，在载体中编码的恒定区还可以用于使恒定区例如Fc结构域与蛋白质可操作地连接，以形成融合蛋白，例如Fc-融合蛋白。因此，可以使用本发明的方法和组合物产生的蛋白质类型的另一个例子包括融合蛋白。此种融合蛋白的例子包括作为具有免疫球蛋白分子部分的融合物表达的蛋白质，作为具有拉链部分的融合蛋白表达的蛋白质，和新多功能蛋白质例如细胞因子和生长因子(即GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)的融合蛋白。WO 93/08207和WO 96/40918描述了称为CD40L的分子的各种可溶寡聚形式的制备，分别包括免疫球蛋白融合蛋白和拉链融合蛋白；其中讨论的技术可应用于其他蛋白质。另一种融合蛋白是重组TNFR：Fc，也称为entanercept(疑为etanercept，依那西普)。Entanercept(疑为Etanercept，依那西普)(或 Amgen/Wyeth)是p75TNFα受体细胞外部分的2个分子的二聚体，每个分子由与人IgG1的232氨基酸Fc部分融合的235氨基酸TNFR衍生的多肽组成。事实上，任何分子都可以作为融合蛋白表达，包括但不限于，细胞受体分子的细胞外结构域、酶、激素、细胞因子、免疫球蛋白分子的部分、拉链结构域和表位。
用于测定核酸和氨基酸“序列同一性”的技术也是本领域已知的。一般地，此种技术包括就基因测定mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，并且使这些序列与第二个苷酸或氨基酸序列比较。一般而言，“同一性”指分别地2个多核苷酸或多肽序列的确切核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应性。2个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过测定其“同一性百分比”进行比较。2个序列无论是核酸还是氨基酸序列的同一性百分比，是2个比对序列之间的确切匹配数目除以较短序列的长度并且乘以100。用于核酸序列的近似比对由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法提供。通过使用评分矩阵，这种算法可以应用于氨基酸序列，所述评分矩阵由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff第5版suppl.3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.，USA研发，并且由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化。这种算法测定序列的同一性百分比的示例性实现由Genetics Computer Group(Madison，Wis.)在 “BestFit”实用应用中提供。关于这种方法的缺省参数在Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，Version 8(1995)中描述(可从Genetics Computer Group，Madison，Wis.获得)。在本发明的背景中确定同一性百分比的优选方法是使用由University of Edinburgh取得版权的MPSRCH程序包，其由John F.Collins和Shane S.Sturrok研发，并且由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，Calif.)经销。根据这个套件包，可以采用Smith-Waternan算法，其中缺省参数用于评分表(例如，缺口开放罚分12、缺口延伸罚分1和缺口6)。根据产生的数据，“匹配”值反映“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适程序是本领域一般已知的。
2个核酸片段如本文所描述的被视为“选择性杂交”。2个核酸分子之间的序列同一性程度影响此种分子之间的杂交事件的效率和强度。部分等同的核酸序列将至少部分抑制完全等同的序列与靶分子的杂交。完全等同序列的杂交抑制可以使用本领域众所周知的杂交测定进行评估(例如，DNA印迹、RNA印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratones，New York；或Ausubel等人(编辑)，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997))。此种测定可以使用不同程度的选择性来进行，例如，使用从低到高严格性不等的条件。如果采用低严格性的条件，那么使用甚至缺乏部分序列同一性程度的辅探针(例如，与靶分子具有小于约30％序列同一性的探针)也可以评估非特异性结合的不存在，从而使得在不存在非特异性结合事件的情况下，辅探针将不与靶杂交。
当利用基于杂交的检测系统时，选择这样的核酸探针，其与靶核酸序列互补，并且随后通过选择合适条件，探针和靶序列彼此“选择性杂交”或结合，以形成杂交分子。在“中等严格性”下能够与靶序列选择性杂交的核酸分子一般在这样的条件下杂交，所述条件允许检测与所选择的核酸探针序列具有至少约70％序列同一性、长度至少约10-14个核苷酸的靶核酸序列。严格杂交条件一般允许检测与所选择的核酸探针序列具有超过约90-95％序列同一性、长度至少约10-14个核苷酸的靶核酸序列。用于其中探针和靶具有特定序列同一性程度的探针/靶杂交的杂交条件，可以如本领域已知的进行测定(参见例如，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，编辑B.D.Hames和S.J.Higgins，(1985)20Oxford；Washington，D.C.；IRL Press)。
就用于杂交的严格性条件而言，本领域众所周知的是，通过改变例如下述因素众多等价条件可以用于确定特定严格性：探针和靶序列的长度和性质、各种序列的碱基组成、盐和其他杂交溶液组分的浓度、杂交溶液中阻断剂或洗涤剂(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇以及十二烷基硫酸钠)的存在或不存在、杂交反应温度和时间参数，以及改变洗涤条件。特定杂交条件组的选择根据本领域的标准方法进行选择(参见例如，参见Sambrook.等人，同上或Ausubel等人，同上)。第一种多核苷酸“衍生自”第二种多核苷酸，如果它与第二种多核苷酸的区域、其cDNA、其互补体具有相同或基本上相同的碱基对序列，或如果它显示出如上所述的序列同一性。第一种多核苷酸“衍生自”第二种多核苷酸，如果它(i)由衍生自第二种多核苷酸的第一种多核苷酸编码，或(ii)显示如上所述的与第二种多肽的序列同一性。
本发明还提供了包含在合适容器例如小瓶中的本发明的一种或多种载体的试剂盒。表达载体可以包含用于插入所选择的目的序列的至少一个克隆位点，或可以具有已存在于载体中的特定目的基因。载体可以以脱水或冻干形式或在水溶液中提供。试剂盒可以包括用于重构脱水多核苷酸的缓冲液。其他试剂可以包括在试剂盒中，例如反应缓冲液、用于比较的阳性和阴性对照载体。一般地，试剂盒还将包括关于其中试剂使用的说明书。
III.本发明的载体的用途
本发明包括使用本文描述的载体表达蛋白质的方法。因此，本发明包括产生重组蛋白质的方法，其包括将本发明的表达载体引入哺乳动物宿主细胞内，在合适条件下培养哺乳动物宿主细胞，以便表达蛋白质，并且回收蛋白质。本发明的载体的优点是它提供使用哺乳动物细胞培养系统的高蛋白质生产。
经由本发明的核酸或表达载体能够基因表达的任何细胞类型都可以在本发明中用作宿主细胞。术语“宿主细胞”指已使用重组DNA技术用构建的载体转化的细胞。
本领域普通技术人员可以选择具体宿主细胞系，其最适合于经由本发明的载体表达GOI和可选标记基因。可以在本发明中采用的细胞包括 哺乳动物细胞和细胞系以及由其衍生的细胞培养物。哺乳动物细胞例如生殖细胞或体细胞可以衍生自哺乳动物，例如小鼠、大鼠或其他啮齿类动物，或来自灵长类动物例如人或猴。应当理解原代细胞培养或永生化细胞可以用于执行本发明的技术。
在具体实施方案中，细胞类型在起源中是哺乳动物，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)(例如，DG44和DUXB11；Urlaub等人，Som.CellMolec.Genet.12：555，1986；Haynes等人，Nuc.Acid.Res.11：687-706，1983；Lau等人，Mol.Cell.Biol.4：1469-1475，1984；Methods in Enzymology.1991，第185卷，第537-566卷。Academic Press，Inc.，San Diego，Calif)、中国仓鼠成纤维细胞(例如，R1610)、人宫颈癌(例如，HELA)、猴肾系(例如，CVI和COS)、鼠类成纤维细胞(例如，BALBc/3T3)、鼠类骨髓瘤(P3.times.63-Ag3.653；NS0；SP2/O)、仓鼠肾系(例如，HAK)、鼠类L细胞(例如，L-929)、人淋巴细胞(例如，RAJI)、人肾(例如，293和293T)。宿主细胞系一般是商购可得的(例如，来自BD Biosciences，Lexington，Ky.；Promega，Madison，Wis.；Life Technologies，Gaithersburg，Md.)或来自美国典型培养物中心(ATCC，Manassas，Va.)。
在一个优选实施方案中，在本发明中使用的宿主细胞反向提供与本发明的载体中包括的至少一个复制起点对应的复制起始因子。例如，如果载体包括对应SV40起源和OriP起源的2个复制起点，那么可以使用表达大T抗原或EBNA蛋白质的任何细胞系，优选哺乳动物。在一个实施方案中，将载体转化到COS细胞或人胚肾(HEK)细胞内。例如，COS7细胞衍生自通过SV40的起点缺陷突变体转化的CV-1猿猴细胞(Sigma-Aldrich)。通过使用HEK-293-6E细胞可以提供EBNA。
在基因组内已稳定整合复制起始因子的细胞系具有下述优点：复制起始因子的稳定长期表达，以及复制和维持包含复制起点的质粒的双重支持。表达EBNA-1的商购可得的细胞系的例子是ATCC：293HEK-EBNA1和CV1-EBNA1。通过稳定细胞克隆的转染和选择，可以产生超表达至少一种复制起始因子优选EBNA1蛋白质或SV40大T抗原的特定细胞系。
核酸和表达载体可以通过本领域已知的各种技术引入或转化到合适的宿主细胞内(参见例如，Ridgway，1973，Vectors：Mammalian Expression Vectors，第24.2章，第470-472页，Rodriguez和Denhardt编辑，Butterworths，Boston，Mass.；Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；和Chu等人，1981，Gene 13：197)。术语“转化”和“转染”及其语法变化在本文中可互换使用，并且指通过可实践的任何方法由细胞摄取外源DNA。当外源核酸已引入细胞膜内时，细胞已进行“转化”。核酸的摄取导致稳定转染子，与通过其完成摄取的方法无关，所述方法可以包括转染(包括电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、用有包膜DNA的细胞融合、显微注射和用完整病毒感染。甚至以高于正常水平的瞬时表达也对于功能研究或目的蛋白质的生产和回收有用。转化细胞在适合于产生目的蛋白质(例如在一个实施方案中，抗体重和/或轻链)的条件下生长，并且执行测定以鉴定所编码的目的多肽。用于鉴定且定量基因产物的示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分类器分析(FACS)、免疫组织化学等。
在本发明中使用的细胞可以根据标准细胞培养技术进行培养，例如它们可以与固体表面固定或在合适的营养培养基中悬浮生长。
本发明还包含的是包括本文描述的载体的哺乳动物宿主细胞。
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学等的常规技术，这在本领域的技术内。此种技术在文献中充分加以说明。参见例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(J.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)；Current Protocols in Molecular Biology(F.Ausubel等人，编辑，1987年更新)；Essential Molecular Biology(T.Brown编辑，IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel编辑，Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A.Bothwell等人编辑，Bartlett Publ.1990)；Gene Transfer and Expression(M.Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology(R.Wu等人编辑，Academic Press 1989)；PCR：A Practical Approach(M.McPherson等人，IRL Press at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis(M.Gait编辑，1984)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams编辑，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.Miller & M.Cabs编辑，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler编辑，1991)；Animal Cell Culture(J.Pollard等人编辑，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells，2.sup.nd Ed.(R.Freshney等人编辑，Alan R.Liss 1987)；Flow Cytometry and Sorting(M.Melamed等人编辑，Wiley-Liss 1990)；丛书Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；和Animal Cell Culture(R.Freshney编辑，IRL Press 1987)；以及Wirth M.和Hauser H.(1993)Genetic Engineering of Animal Cells，In：Biotechnology第2版Puhler A(编辑)VCH，Weinhcim 663-744。
例证
下述实施例举例说明了消除构建分开载体用于不同哺乳动物宿主细胞例如COS7和HEK-293-6E细胞的需要的创新解决方案。下述实施例还提供包含编码抗体恒定区的核酸的载体，用于在抗体的完整轻或重链的表达中或在Fc融合蛋白的表达中使用。
通过使来自各种其他载体即pBOS和pTT3载体的选择特征组合，构建命名为pHyb-C和pHyb-E的2种新载体主链(参见美国临时申请号60/878,165，于2007年12月28日提交、名称为“DUAL-SPECIFICIL-1A/IL-1b ANTIBODIES”的国际申请号PCTJUS2007/26482，和USSN12/006,068，所有所述专利在此引入本文作为参考)。对照载体pBOS包含与用于目的基因的插入位点可操作地连接的EF-1a启动子，且携带SV40复制起点。对照载体pBOS包含与用于目的基因的插入位点可操作地连接的CMV启动子，和EBNA复制起点(OriP)。
通过评估小鼠BR3-Fc融合物和人抗体(阿达木单抗)在COS7和HEK293-6E细胞中的蛋白质表达来测试本发明的载体。在COS7和HEK293-6E细胞中的成功蛋白质表达证实用于在2种细胞类型中的重组表达的统一载体系统。
实施例1：载体pHybC和pHybE的构建
图1和2提供了各自包含2个复制起点的新载体的图。图1和2代表“空”形式的载体，即不包含目的基因或抗体恒定区的核酸(在下文实施例4中更详细地描述)。pHybC包含与用于目的基因的插入位点可操 作地连接的CMV启动子，而pHybE包含EF-1a启动子。
对于pHybC-mBR3-Fc构建体(“mBR3”指鼠类形式的第三种BLyS受体，并且如本文所使用的特别指关于mBR3蛋白质的细胞外结构域(ECD)部分的编码序列)，来自pEF-BOS载体的SV40复制起点区用引物进行PCR扩增，所述引物在扩增DNA片段的5′和3′末端处引入PspXI限制位点。这个插入片段随后通过PspX I进行消化。具有CMV启动子上游的Sal I限制位点的pTT3-mBR3-Fc构建体用Sal I进行消化。随后将PspX I消化的插入片段连接到pTT3-mBR3-Fc的Sal I位点内，以制备pHybC-mBR3-Fc载体。
通过首先通过PCR扩增5′末端PspX I修饰的断裂的DNA制备pHybE-mBR3-Fc构建体，所述DNA包含经过mBR3细胞外结构域的SV40复制起点区。这种产物随后在5′处通过PspX I和3′处通过Bsp68I进行消化，这具有在mBR3细胞外结构域序列上游的前导序列中的位点。随后将这个消化片段亚克隆到Sal I和Bsp68I消化的pTT3-mBR3-Fc构建体内，以产生pHybE-mBR3-Fc构建体。
各自表达受体-Fc融合蛋白mBR3-Fc的pHybC-mBR3-Fc和pHybE-mBR3-Fc的图可以在图8和9中找到。
表达D2E7抗体(阿达木单抗)的轻链蛋白质的pHybE-E7蛋白质与pHybC-mBR3-Fc类似地构建，即通过将相同的PspX I消化的SV40Oir区连接到通过SalI预消化的先前构建的pTT3-E7载体内，所述PspX I消化的SV40Oir区在pHybC-mBR3-Fc的制备过程中(上文描述)进行分离且消化。
对于pHybE-E7载体构建，通过用Hind III和BsiW I限制酶消化预先存在的pBOS-E7载体产生插入片段。随后将这个插入片段连接到用相同酶预消化的pHybC-E7载体内，以产生pHybE-E7用于表达D2E7轻链蛋白质。
对于pHybC-D2和pHybE-D2载体构建，通过用Bsp68I和Not I限制酶消化预先存在的pTT3-D2载体，产生由D2E7抗体(阿达木单抗)的重链可变和恒定编码区(即，D2重链编码序列)组成的插入片段。将这个插入片段连接到用相同酶预消化的pHybC-mBR3-Fc和pHybE-mBR3-Fc载体内，以分别产生pHybC-D2和pHybE-D2用于表达D2E7抗体(阿达木单抗)的重链蛋白质。
实施例2：蛋白质得率的比较
为了测定伴随2个复制起点的添加在载体大小中的增加是否影响通过载体的蛋白质生产，使上文描述的pHyb-E和pHyb-C载体与对照载体pBOS和pTT3比较，所述对照载体pBOS和pTT3各自仅包含1个复制起点。为了比较来自pBOS、pTT3、pHyb-C和pHyb-E的表达，将小鼠BAFF受体-人Fc融合蛋白构建体(mBR3-Fc)亚克隆到4种载体主链内，并且通过endo-free DNA prep试剂盒平行制备。
将包含mBR3-Fc序列的4种载体电穿孔到COS细胞内或转染到HEK-293-6E细胞内(方案在下文描述)。使细胞温育5或7天的时间段。获得培养基样品并且测量在培养基中的mBR3-Fc分泌蛋白质浓度。通过IgG ELISA测定滴度，并且对于COS7细胞在5天后并且对于HEK-293-6E细胞在7天后，通过来自条件培养基的IgG蛋白质标准和mBR3-Fc蛋白质之间的分子量中的差异进行调整。由于在ELISA中使用大得多的人IgG蛋白质作为标准，需要滴度调整以阻止mBR3-Fc蛋白质滴度的过度估计。
293转染
在实验中使用的293瞬时转染操作是Durocher等人(2002)；Nucleic Acids Research 30(2)：E9和Pham等人(2005)；Biotechnology Bioengineering 90(3)：332-44中公开的方法的修饰。在转染中使用的试剂包括：
●HEK 293-6E细胞(稳定表达EBNA1的人胚肾细胞系；得自National Research Council Canada)在一次性锥形瓶中在设为130rpm、37℃和5％CO2的增湿温箱中进行培养。
●培养基：FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen 12338-018)加上25μg/mL遗传霉素(G418)(Invitrogen 10131-027)和0.1％普朗尼克F-68(Invitrogen 24040-032)。
●转染培养基：FreeStyle 293表达培养基加上10mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。
●聚乙烯亚胺(PEI)原液：1mg/mL无菌母液，pH 7.0，用线性25kDa PEI(Polysciences)制备并且贮藏于低于-15℃下。
●胰蛋白胨补料培养基：在FreeStyle 293表达培养基中的胰蛋白胨N1(Organotechnie，19554)5％w/v无菌原液。
用于转染的细胞制剂：在转染前约2-4小时，通过离心收获HEK293-6E细胞，并且以约1百万活细胞/mL的细胞密度重悬浮于培养基中。对于每次转染，将40mL细胞悬浮液转移到一次性250-mL锥形瓶内并且温育2-4小时。
转染：使转染培养基和PEI原液预温至室温(RT)。对于每次转染，使25μg质粒DNA和50μg聚乙烯亚胺(PEI)在5mL转染培养基中组合，并且在RT下温育15-20分钟，以允许形成DNA:PEI复合物。对于BR3-Ig转染，使用25μg BR3-Ig质粒/转染。将各5-mL DNA:PEI复合物混合物加入先前制备的40-mL培养物中，并且送回设为130rpm、37℃和5％CO2的增湿温箱中。在20-28小时后，将5mL胰蛋白胨补料培养基加入每种转染中，并且培养继续6天。
COS7细胞转染
使用标准电穿孔条件如下转染2块COS7 150mm板/构建体。对于COS7转染实验，使COS7细胞在DMEM+10％FBS+1x谷氨酰胺中培养。来自1个汇合T-150烧瓶的细胞用于电穿孔。使细胞进行胰蛋白酶处理，并且在培养基加上血清中向下旋转以灭活血清。随后在1XPBS中洗涤细胞。
对于每个T-150，使团块重悬浮于0.8mls电穿孔缓冲液中。COS电穿孔缓冲液包括20mM Hepes(或P3缓冲液)、137mM NaCl、5mMKCl、0.7mM Na2HPO4和6mM右旋糖。使电穿孔缓冲液调整至pH 7.0，并且进行过滤灭菌。60微克DNA(30μg每种重和轻链质粒DNA或在Fc融合蛋白的情况下60μg DNA)用于每次电穿孔。使0.8mls细胞/缓冲液/DNA混合至每个比色杯(0.4cm比色杯-Biorad)。此外，一个比色杯仅装有缓冲液以用作空白对照。将比色杯置于冰上。细胞在250V和950μF下电穿孔15-25毫秒。随后将比色杯送回冰上。将2个比色杯的内容物转移到包含20mls杂交瘤SFM的1个50ml圆锥体内。10ml移液管用于打碎凝块并且转移给2个150mm组织培养皿，各自包含另外20ml培养基。每个皿中的培养基总体积随后为30ml。皿随后在37℃、5％CO2下温育3天。
将COS细胞条件培养基(上清液)收集到50ml锥形管内并且向下旋转。在旋转后，使用2微米(um)滤器过滤上清液。取出样品用于ELISA分析。在5天后收集上清液，并且在标准IgG ELISA中进行分析，以测定其分别的蛋白质得率。
pBOS、pTT3、pHybC和pHybE形式的载体在mBR3和阿达木单抗(D2E7)实验中分开进行测试。
蛋白质测试
使用ELISA和/或Poros A在转染后5天(对于COS7细胞)或7天(对于293-6E细胞)测试培养上清液中的mBR3-Fc融合蛋白浓度。
结果
显示来自对照和实验转染的蛋白质表达水平的数据显示于图3(COS7细胞)和图4(HEK-293细胞)中。图3中的数据显示pHybC和pHybE在COS细胞中产生融合蛋白方面都是有效的，其中2种载体表达比对照载体pTT3更高的水平。图4中呈现的数据显示来自用pHyb-E转染的HEK细胞的表达水平超过用其他3种载体可见的表达，而pHyb-C蛋白质生产水平与对照可比较。因此，pHyb-C和pHyb-E都能够与对照载体pTT3和pBOS一样好，如果不是更好地表达融合蛋白。
实施例3：需要2种DNA构建体共转染的蛋白质得率的比较
将针对TNFα的人IgG1/κ单克隆抗体(阿达木单抗)/D2E7亚克隆到4种载体主链内，并且通过endo-free DNA prep试剂盒平行制备。
将包含用于表达阿达木单抗的序列的4种载体电穿孔到COS细胞内；HEK-293-6E使用聚(乙烯亚胺)(PEI)进行转染。
使用的293瞬时转染操作与实施例3中描述的那种相同，除对于阿达木单抗转染，其中使用10μg D2E7重链(称为“D2”)质粒和15μg D2E7轻链(称为“E7”)质粒/转染。
COS7转染实验如上所述执行，除使用30μg每种重和轻链载体/板转染外。
转染后7天使用ELISA和/或Poros A测试培养上清液中的阿达木单抗抗体浓度。对于COS7细胞在5天后并且对于HEK-293-6E细胞在7 天后，通过IgG ELISA测定来自条件培养基的滴度。
显示来自对照和实验转染的蛋白质表达水平的数据显示于图5(HEK-293细胞)和图6(COS细胞)中。图5中的数据显示pHybC和pHybE主链载体都能够产生比对照载体pBOS更多的阿达木单抗，以及与对照载体pTT3比较，可比较(pHybC)或更多(pHybE)的量(Durocher，Y.等人Nucleic Acids Res.30：E9(2002))。类似地，图6中的数据显示pHybC和pHybE主链载体都能够产生比对照载体pTT3更多的蛋白质，以及与对照载体pBOS可比较的水平。
实施例4：pHyb-E抗体恒定区载体的构建
为了促进使用新pHyb-E载体主链可以用于抗体生产的载体制备，产生12种不同重和轻链载体的实验对象组(概括在表2和3中提供)。构建了允许人和小鼠IgG表达的12种主模板pHybE载体。
为了制备图14-25中描述的载体，从pHybE-填充片段-hCgl，z，a(pJP167)中分离出6123bp Srf I/Not I片段，并且与来自pBOS载体的Srf I/Not I限制片段连接，所述pBOS载体由信号肽编码区、λ填充片段和恒定区编码区组成。为了制备SrfI/NotI限制片段，执行SrfI/NotI消化，以便产生由信号肽编码区、λ填充片段和恒定区编码区(关于恒定区序列，参见表1)组成的插入片段。这些片段衍生自已构建到pEF-BOS质粒DNA内的pBOS主模板(参见Mizushima，S.和Nagata，S.Nucleic Acids Res.18：5322(1990)；也在美国临时申请号60/878,165，于2007年12月28日提交、名称为“DUAL-SPECIFIC IL-1A/IL-1b ANTIBODIES”)的国际申请号PCTJUS2007/26482，和USSN 12/006,068中描述，所述专利引入本文作为参考)。首先通过重叠PCR修饰关于pHybE-hCl构建体的插入片段，以产生在J区3′末端处的AfeI限制位点，以促进克隆到这种载体内。将所有插入物连接到先前序列验证的用SrfI和NotI预消化的pHyBE构建体内，以产生下述载体。
包含新恒定区的载体随后就小鼠和人抗体恒定区进行序列验证(参见SEQ ID NOs：3-32)。
表2和3中描述的载体都具有～1-kb‘填充’序列(λ噬菌体DNA的)，其可以通过可变区序列交换出来。这些新主载体也包含直接在SrfI位点上游的新Swa I限制位点。这个新SwaI位点用于将来自pHyb-E的抗体 开放读码框转移给其他表达载体，所述其他表达载体也利用SwaI位点用于克隆目的，例如CHO表达载体。除可替代克隆位点的弹性外，这些载体也与现有pBOS、pTT3和CHO载体反向相容。
如图7中可见，COS7细胞中的初步转染数据显示，当与不含另外Swa I位点的构建体(v2载体)比较时，这个另外Swa I位点(v1载体)对阿达木单抗表达水平没有显著影响。
表1：恒定区序列
| 恒定区 | 序列的定位 |
| mCκ | SEQ ID NO：3的2285-2605 |
| mCγ1 | SEQ ID NO：5的2277-3251 |
| mCγ2a | SEQ ID NO：7的2277-3269 |
| hCκ | SEQ ID NO：9的2287-2610 |
| hCλ | SEQ ID NO：11的2269-2588 |
| hCγ1，z，a | SEQ ID NO：13的2277-3269 |
| hCγ1，z，non-a | SEQ ID NO：15的2277-3269 |
| hCγ1，z，non-a，mut(234，235) | SEQ ID NO：17的2277-3269 |
| hCγ1，z，non-a，mut(234，237) | SEQ ID NO：19的2277-3269 |
| hCγ2(n-) | SEQ ID NO：21的2277-3257 |
| hCγ2(n+) | SEQ ID NO：23的2277-3257 |
| hCγ4 | SEQ ID NO：25的2277-3260 |
表2：制备用于人和小鼠IgG表达的示例性主pHybE载体组
| 重链载体 | 轻链载体 | |
| 人 | pHybE-，hCg1，z，a | pHybE-hCk |
| pHybE-，hCg1，z，non-a | pHybE-hCl | |
| pHybE-，hCg1，z，non-a，(mut 234，235) | ||
| pHybE-，hCg1，z，non-a，(mut 234，237) | ||
| pHybE-，hCg2，n+ | ||
| pHybE-，hCg2，n- | ||
| pHybE-，hCg4 | ||
| 小鼠 | pHybE-mCg1 | pHybE-mCk |
| pHybE-mCg2a |
概括：
实施例1-4中描述的先前实验显示pHyb-C和pHyb-E载体在超过一种细胞系中起作用，同时提供丰富的蛋白质表达，这通常超过用原始pBOS和pER载体可见的表达水平。当pHybE载体用于在HEK-293-6E细胞中表达低得率mBR3-Fc融合蛋白时，这种增强表达特别明显。如由这个数据显示的，pHyb-C和pHyb-E载体代表载体技术中超过先前使用载体的显著进展。
表3：本发明的载体的概括
描述为形式1的pHyb载体具有Srf I限制位点上游的另外Swa I位点。
描述为形式2的pHyb载体不具有另外Swa I位点。
| SEQ ID NO | 核酸的描述 |
| 1 | pHybC-empty |
| 2 | pHybE-empty |
| 3 | pJP180；pHybE-mCk V1 |
| 4 | pJP193；pHybE-mCk V2 |
| 5 | pJP176；pHybE-mCg1 V1 |
| 6 | pJP189；pHybE-mCg1 V2 |
| 7 | pJP177；pHybE-mCg2a V1 |
| 8 | pJP190；pHybE-mCg2a V2 |
| 9 | pJP178；pHybE-hCk V1 |
| 10 | pJP191；pHybE-hCk V2 |
| 11 | pJP179；pHybE-hC1 V1 |
| 12 | pJP192；pHybE-hC1 V2 |
| 13 | pJP170；pHybE-hCg1，z，a V1 |
| 14 | pJP182；pHybE-hCg1，z，a V2 |
| 15 | pJP171；pHybE-hCg1，z，non-a V1 |
| 16 | pJP183；pHybE-hCg1，z，non-a V2 |
| 17 | pJP172；pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V1 |
| 18 | pJP184；pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，235)V2 |
| 19 | pJP173；pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V1 |
| 20 | pJP185；pHybE-hCg1，z，non-a，mut(234，237)V2 |
| 21 | pJP174；pHybE-hCg2，n-V1 |
| 22 | pJP187；pHybE-hCg2，n-V2 |
| 23 | pJP181；pHybE-hCg2，n+V1 |
| 24 | pJP186；pHybE-hCg2，n+V2 |
| 25 | pJP175；pHybE-hCg4 V1 |
| 26 | pJP188；pHybE-hCg4 V2 |
| 27 | pHybC-mBR3-mCg2a |
| 28 | pHybE-mBR3-mCg2a |
| 29 | pHybC-E7-hCk |
| 30 | pHybC-D2-hCg1，z，a |
| 31 | pHybE-D2-hCg1，z，a |
| 32 | pHybE-E7-hCk |
等价方案
本领域技术人员应认识到或使用不超过例行试验能够确定与本文描述的本发明具体实施方案的许多等价方案。此种等价方案预期由下述权利要求包括。
引入作为参考
本申请自始至终可以引用的所有引用参考文献(包括文献来源、专利、专利申请和网站)的内容为了所有目的在此特别整体引入作为参考，如其中引用的参考文献一样。除非另有说明，否则本发明的实践将采用免疫学、分子生物学、细胞生物学以及药物制造和递送的常规技术，这是本领域众所周知的。这些技术包括但不限于下述出版物中描述的技术。
Claims (27)
1.一种表达载体，其包括：
(a)衍生自EB病毒(EBV)的OriP复制起点；
(b)SV40复制起点；
(c)用于插入目的基因的插入位点；
(d)与插入位点可操作地连接的EF-1α启动子；和，任选地包含
(e)编码抗体重或轻链恒定区的核酸序列，其与所述插入位点可操作地连接，
其中OriP复制起点由反式作用EBNA1复制起始因子结合，所述反式作用EBNA1复制起始因子不是由表达载体编码的。
2.权利要求1的表达载体，其中所述目的基因是抗体重或轻链可变区。
3.权利要求2的表达载体，其中所述抗体重或轻链可变区选自鼠类、人源化、嵌合和人的。
4.权利要求2的表达载体，其中所述抗体重链可变区是选自抗-TNFα抗体、抗-IL-18抗体和抗-IL-12抗体的抗体的重链可变区。
5.权利要求2的表达载体，其中所述抗体轻链可变区是选自抗-TNFα抗体、抗-IL-.8抗体和抗-IL-12抗体的抗体的轻链可变区。
6.权利要求1-5中任一项的表达载体，其中所述抗体重链恒定区是鼠类或人的。
7.权利要求1-5中任一项的表达载体，其中所述抗体重链恒定区选自γ1，z，a；γ1,z,non-a；γ2，n+；γ2,n-；和γ4。
8.权利要求7的表达载体，其中所述γ1,z,non-a抗体重链恒定区进一步包括在所述重链恒定区的根据EU编号系统的位置234处的丙氨酸取代。
9.权利要求8的表达载体，其进一步包括在所述重链恒定区的根据EU编号系统的位置235或237处的丙氨酸取代。
10.权利要求1-5中任一项的表达载体，其中所述抗体轻链恒定区是人κ同种型或人λ同种型。
11.权利要求1-5中任一项的表达载体，其中所述抗体重链恒定区是鼠类γ1同种型或鼠类γ2a同种型。
12.权利要求1-5中任一项的表达载体，其中所述抗体轻链恒定区是鼠类κ同种型。
13.权利要求1的表达载体，其中所述抗体重链恒定区是Fc结构域。
14.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其进一步包括可选标记。
15.权利要求14的表达载体，其中所述可选标记是氨苄青霉素抗性基因。
16.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其中所述EF-1α启动子是人的。
17.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其中所述EF-1α启动子包括SEQ ID NO：2的核苷酸76-1267。
18.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其中所述OriP复制起点包含SEQ ID NO：1的核苷酸1795-3545。
19.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其中所述SV40复制起点包括SEQ ID NO：1的核苷酸5834-6140。
20.权利要求1-5和13中任一项的表达载体，其中所述表达载体包括选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、31和32的核酸序列。
21.权利要求1的表达载体，其中所述表达载体包括SEQ ID NO：2的核酸序列。
22.权利要求1-5、13和20-21中任一项的表达载体，其进一步包括编码信号肽的核酸序列。
23.一种试剂盒，其包括权利要求1-5、13和20-21中任一项的表达载体。
24.一种分离的哺乳动物宿主细胞，其包括权利要求1-5、13和20-21中任一项的表达载体。
25.权利要求24的分离的哺乳动物宿主细胞，其为COS细胞或人胚肾(HEK)细胞。
26.权利要求25的分离的哺乳动物宿主细胞，其为COS7细胞或HEK-293-6E细胞。
27.一种产生重组蛋白质的方法，其包括将权利要求1-5、13和20-21中任一项的表达载体引入分离的哺乳动物宿主细胞内，在合适条件下培养所述哺乳动物宿主细胞，以便表达所述蛋白质，并且回收所述蛋白质。
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