JP2014147390A - 改善された哺乳動物発現ベクター及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】哺乳動物細胞培養における組み換えタンパク質発現のための核酸の提供。
【解決手段】(a)エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点と;(b)SV40複製起点と;(c)関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と;(d)挿入部位に操作可能に連結されるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとを含む、発現ベクターであって、前記OriP複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用EBNA1複製開始因子が結合するか、又は前記SV40複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用SV40 T抗原が結合する、発現ベクター。該エピソームベクターは、SV40T Ag又はエプスタイン−バーウイルス核抗原を発現する哺乳動物細胞(例えば、COS7又はHEK293−6E細胞)における高タンパク質産生を促進する。
【選択図】図1
【解決手段】(a)エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点と;(b)SV40複製起点と;(c)関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と;(d)挿入部位に操作可能に連結されるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとを含む、発現ベクターであって、前記OriP複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用EBNA1複製開始因子が結合するか、又は前記SV40複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用SV40 T抗原が結合する、発現ベクター。該エピソームベクターは、SV40T Ag又はエプスタイン−バーウイルス核抗原を発現する哺乳動物細胞(例えば、COS7又はHEK293−6E細胞)における高タンパク質産生を促進する。
【選択図】図1
Description
関連出願に対する相互参照
本願は、2008年1月15日提出の米国特許仮出願第61/021282号及び2008年10月10日提出の米国特許仮出願第61/104546号(これらのそれぞれの内容は、それらの全体において本明細書により組み込まれる。)に対する優先権を主張する。
本願は、2008年1月15日提出の米国特許仮出願第61/021282号及び2008年10月10日提出の米国特許仮出願第61/104546号(これらのそれぞれの内容は、それらの全体において本明細書により組み込まれる。)に対する優先権を主張する。
生物製剤を含むタンパク質の安定した産生は、タンパク質をコードするDNAを含有するベクターを宿主細胞に遺伝子移入することによって遂行し得る。エピソーム性複製起点を通じた染色体外複製を含む様々な手段を通じて、細胞株中のベクターの維持を行うことができる。エピソームベクターは、配列が複製開始因子により結合されている場合、ベクターの複製を促進する複製起点を含有する。エピソームベクターは、宿主ゲノムへの挿入を必要とするベクターを上回るいくつかの長所がある。例えば、エピソームベクターは細胞における表現型の変化を減少させるが、これは、宿主ゲノムへのベクターの統合に起因し得る。エピソームベクターはまた、標準的DNA抽出プロトコールを用いて遺伝子移入細胞からも単離され得る。
治療用タンパク質、即ち生物製剤の重要性の高まりに伴い、全体的な産生プロセスの効率を向上させると同時に、タンパク質産生の最適化に取り組まなければならない。従って、効率の向上は、ベクターのタンパク質産生能を踏まえて検討しなければならない。効率的なクローニングの選択肢ならびに高レベルの所望タンパク質産物をもたらす、より優れた発現系が必要とされている。時間的制約を改善し、費用を最小限に抑えるために、生物製剤、特に抗体の産生に関与するクローニング段階の数を減少させることは好都合である。小規模及び大規模細胞培養の両方に対して適正なタンパク質産生をもたらすベクターを提供することも好都合である。本発明は、下記の詳細な説明から明らかになるであろうさらなる長所をもたらすことによって、従来のベクターの限界を克服する。
組み換えタンパク質は、特に医薬探索プロセス中、哺乳動物細胞の一時的遺伝子移入により産生され得る。COS及びヒト胚腎臓(HEK)細胞などの哺乳動物細胞を含め、タンパク質を発現させるために、様々な宿主細胞を使用し得る。エピソームベクターは、複製起点及び、起点に結合するトランス作用複製開始因子の両方に依存する。エプスタイン−バーウイルスのOriPに結合するエプスタイン−バーウイルス核抗原(EBNA)などの複製開始因子は、エピソームベクターにクローニングされ得るか、又は、あるいは、ベクターが遺伝子移入される宿主細胞により発現され得る。従って、エピソームベクターは、複製起点を通じて複製を活性化するために必要とされるトランス作用因子を発現するある種の細胞株に特異的であり得る。
本発明により、組み換えタンパク質発現のための様々なエピソームベクター骨格が不要となる。本発明は、少なくとも2つの異なるエピソーム複製起点を含むエピソームベクターを提供し、これにより、タンパク質発現のために様々な細胞型において同じベクターを使用することができるようになる。様々な複製起点により、必要なトランス作用複製因子を提供し、ベクターを複製可能とする様々な哺乳動物細胞タイプで、ベクターを使用できるようになる。タンパク質産生のための関心のある遺伝子の再クローニングを不要にすることにより、本発明は、効率を向上させ、複数ベクターに伴う費用を削減し、同時にタンパク質産生レベルを維持する。本発明の驚くべき態様は、ベクターに対するヌクレオチド、即ち、第二の複製起点の付加が、ベクターの所望レベルでのタンパク質産生能に悪影響を与えないことである。
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、抗体重又は軽鎖定常領域を含む。従って、抗体軽又は重鎖可変領域は、それぞれ軽又は重鎖定常領域のベクター上流にクローニングされ得、発現系の効率をさらに改善する。エピソームベクターは、SV40 T Ag又はエプスタイン−バーウイルス核抗原を発現する哺乳動物細胞(例えばCOS7又はHEK−293−6E細胞)における高タンパク質産生を促進する。
本発明は、タンパク質収率、産生効率及び費用削減のための要素の最適な組み合わせを提供するが、これらは、全て、特に製薬産業におけるタンパク質産生及び抗体などの生体タンパク質の産生に対する重要な要素である。本発明のその他の特性及び長所は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲で述べる。
ある態様において、本発明は、(a)エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点と;(b)SV40複製起点と;(c)関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と;(d)挿入部位に操作可能に連結される、抗体重又は軽鎖定常領域をコードする核酸配列と、を含む、発現ベクターを提供する。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、抗体重又は軽鎖可変領域、例えば、マウス、ヒト化、キメラ又はヒト抗体重もしくは軽鎖可変領域である。特定の実施形態において、抗体重鎖可変領域は、アダリムマブ、ABT−325及びABT−874からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域である。別の特定の実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、アダリムマブ、ABT−325及びABT−874からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域である。抗体重鎖定常領域は、例えば、マウス、ヒト化、キメラ又はヒトであり、γ1,z,a;γ1,z,non−a;γ2,n+;γ2,n−;及びγ4からなる群から選択される抗体重鎖定常領域であり得る。γ1,z,non−a抗体重鎖定常領域は、重鎖定常領域の位置234にアラニン突然変異をさらに含み得る。別の実施形態において、γ1,z,non−a抗体重鎖定常領域は、抗体重鎖定常領域の位置235又は237のいずれかにアラニン突然変異をさらに含み得る。
ある実施形態において、抗体軽鎖定常領域は、ヒトκアイソタイプ又はヒトλアイソタイプである。ある実施形態において、抗体重鎖定常領域は、マウスγ1アイソタイプ又はマウスγ2aアイソタイプである。別の実施形態において、抗体軽鎖定常領域はマウスκアイソタイプである。ある実施形態において、抗体重鎖定常領域はFcドメインである。ある実施形態において、重又は軽鎖抗体可変領域は、挿入部位に対して5’である。
ある実施形態において、発現ベクターは、挿入部位に操作可能に連結されるプロモーターをさらに含み、プロモーターは、EF−1αプロモーター又はサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのいずれかである。
ある実施形態において、発現ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子などの選択可能マーカーをさらに含む。
ある実施形態において、CMVプロモーターは、配列番号1のヌクレオチド1から608と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、CMVプロモーターは、配列番号1のヌクレオチド1から608を含む。
ある実施形態において、EF−1αプロモーターはヒトである。ある実施形態において、EF−1αプロモーターは、配列番号2のヌクレオチド76から1267と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、EF−1αプロモーターは、配列番号2のヌクレオチド76から1267を含む。
ある実施形態において、OriP複製起点は、配列番号1のヌクレオチド1795から3545と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。
ある実施形態において、SV40複製起点は、配列番号1のヌクレオチド5834から6140と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、SV40複製起点は、配列番号1のヌクレオチド5834から6140を含む。
本発明の典型的発現ベクターは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31及び32からなる群から選択される配列と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、本発現ベクターは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31及び32からなる群から選択される核酸配列を含む。
本発明の発現ベクターはまた、図1、2及び14から25でも提供する。本発明のさらなるベクターは図8から13で記載する。
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む哺乳動物宿主細胞を提供する。哺乳動物宿主は、COS細胞、例えばCOS7細胞など、又はヒト胚腎臓(HEK)細胞、例えばHEK−293細胞などであり得る。
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含むキットを提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳動物宿主細胞に本発明の発現ベクターを導入することと、タンパク質を発現させるために適切な条件下で哺乳動物宿主細胞を培養することと、タンパク質を回収することと、を含む、組み換えタンパク質を産生する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、シグナルペプチドをコードする核酸に操作可能に連結される。
添付の図面とともに読む場合、好ましい実施形態の次の記述から、本発明の前述及びその他の目的、特性及び長所ならびに本発明そのものがより詳細に理解されよう。
I.定義
本発明がより容易に理解され得るように、本明細書中である一定の用語を最初に定義する。
本発明がより容易に理解され得るように、本明細書中である一定の用語を最初に定義する。
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書中で使用される場合、DNA、RNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA及びそれらの類似体を含むものとする。核酸分子は、1本鎖又は2本鎖であり得るが、好ましくは2本鎖DNAである。核酸は、単離し得るか又は別の核酸分子、例えば発現ベクター、又は真核宿主細胞の染色体に組み込み得る。
「単離」核酸分子は、その核酸の天然源に存在するその他の核酸分子から分離されるものである。例えば、ゲノムDNAに関して、「単離される」という用語は、例えばゲノムDNAが天然に会合される染色体から分離される核酸分子を含む。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて、その核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の5’及び3’末端に位置する配列)不含である。さらに、cDNA分子などの「単離」核酸分子は、実質的に、その他の細胞性物質不含もしくは、組み換え技術により産生される場合、培地不含であり得るか、又は実質的に、化学合成される場合、化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含である。
本明細書中で交換可能に使用される「組み換えベクター」又は「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターのあるタイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントが結合され得る環状の2本鎖DNAループを指す。あるいは、ベクターは線状であり得る。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、この場合、さらなるDNAセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。ある一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的に複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、エピソーム哺乳動物ベクターである。「コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、ベクターも指す。
ある一定のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を支配することができる。「発現ベクター」又は「組み換え発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子であり、さらに、遺伝子の発現を調節するための必要なエレメントを含有する。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、関心のある遺伝子及び転写終結因子を含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの調節下に置かれ、このような遺伝子は、プロモーターに「操作可能に連結される」と言われる。同様に、制御エレメント及びコアプロモーターは、制御エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、操作可能に連結される。ある実施形態において、本発明の発現ベクターは、1以上の複製起点を含み、従ってベクターは1つの細胞型に限定されない。
本明細書中で使用される場合、「エピソームとして複製するベクター」又は「エピソームベクター」は、通常、及び非常に好ましくは、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、平行して存在するベクターを指す。エピソームとして複製するベクターは、本明細書中で使用される場合、細胞周期中に複製され、一連のこの複製において、ベクターコピーは、細胞分裂前後に存在するコピー数に依存して、結果として得られる細胞中で統計的に分布する。好ましくは、エピソームとして複製するベクターは、宿主細胞の核中で生じ得、好ましくは、細胞周期のS期中に複製する。さらに、エピソームとして複製するベクターは、細胞周期のS期中に、宿主細胞の核において、少なくとも1回、即ち、1又は複数回複製される。非常に好ましい実施形態において、エピソームとして複製するベクターは、細胞周期のS期中に宿主細胞の核において1回複製される。
本明細書中で使用される場合、本明細書中で交換可能に使用される「複製起点配列」又は「複製起点」という用語は、ベクター中に存在する場合、複製を開始する配列を指す。複製起点は、複製開始因子により又は、あるいはDNAヘリカーゼにより認識され得る。
本明細書中で使用される場合、「組み換え」とは、例えば微生物中で、核酸物質、例えばDNAが、2つの核酸分子間で交換されるプロセスを指す。本明細書中で使用される場合、「相同組み換え」とは、配列相同性又は好ましくは配列同一性のセグメント又は領域を通じて2つの核酸分子間で核酸物質が交換されるプロセスを指す(例えば高度の配列同一性)。典型的な実施形態において、核酸物質は、微生物の染色体又はエピソーム上に位置する。別の典型的な実施形態において、核酸物質は、染色体外に、例えばプラスミド上に位置する。組み換えは、線状及び/又は環状DNA分子の間で起こり得る。
本明細書中で使用される場合、「関心のある遺伝子」という用語は、本発明のベクターに付加される外来DNA配列を指す。関心のある遺伝子は、例えば、イントロンが置かれ得るか又はオープン・リーディング・フレームをコードするcDNAであるかいずれかの、コード配列を含み得る。「関心のある遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、最終的タンパク質発現のために本発明のベクターに付加されるDNA配列を指す。関心のある遺伝子がクローニングされるベクターの領域は、本明細書中で「挿入部位」と呼ばれる。好ましくは、関心のある遺伝子は、本発明のベクターを用いて発現される抗体又は融合タンパク質の一部を含む。例えば、重鎖定常領域を含む本発明のベクターに、抗体アダリムマブの重鎖可変領域、即ち、関心のある遺伝子をクローニングする。
本発明のある実施形態において、本ベクターは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に対して3’であり、それに操作可能に連結される抗体軽又は重鎖定常領域を含む。従って、ある実施形態において、関心のある遺伝子は、本発明のベクターでコードされる抗体軽又は重鎖定常領域に操作可能に連結される抗体の軽又は重鎖の可変領域である。
ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的に関連するように置かれる場合、「操作可能に連結される」。例えば、シグナルペプチドをコードするDNAは、発現される際、その配列が、あるタンパク質又はポリペプチドとインフレームとなるようにシグナルペプチドをコードする場合、そのタンパク質又はポリペプチドをコードするDNAに操作可能に連結される。同様に、プロモーター又はエンハンサーは、あるタンパク質又はポリペプチドの発現が促進又は増進される場合、そのタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。ある実施形態において、操作可能に連結されるヌクレオチド配列は隣接する(例えばシグナル配列の場合)。あるいは、操作可能に連結されるヌクレオチド配列は非隣接であり得る(例えばエンハンサーの場合)。ある実施形態において、抗体軽又は重鎖定常領域コードする核酸配列は、関心のある遺伝子、例えば重又は軽鎖可変領域に操作可能に連結される。
「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター及び構成的プロモーターを含む、真核細胞において転写を支配するのに十分な何らかの核酸配列を含む。一般に、プロモーターは、細胞型特異的、組織特異的もしくは時間特異的方式でプロモーター依存性の遺伝子発現を調節可能にするのに十分であるか又は外部シグナルもしくは物質により誘導可能なエレメントを含む。このようなエレメントは、特定の遺伝子の5’又は3’又はイントロン配列領域に位置し得る。普通、遺伝子発現は構成的であるが、必要に応じて、本発明で、制御可能なプロモーターを使用することができる。遺伝子発現は、例えばメタロチオニン遺伝子又は熱ショック遺伝子の使用によるなど、熱、光又は金属を用いて、転写制御により調節することもできる。
「上流」及び「下流」は、ヌクレオチド配列又はベクターに存在する2つのエレメント間の相対的方向を示すために使用される用語である。一方の「上流」であるエレメントは、他方のエレメントよりもその配列の5’末端に近い位置にある(即ち、分子が線状である場合、リボース又はデオキシリボース骨格の5’炭素に連結されるリン酸基を有する分子の末端に近い。)。エレメントは、他のエレメントと比較した場合、それがその配列の3’末端(即ち、線状分子において、リボース又はデオキシリボース骨格の3’炭素に連結されるヒドロキシル基を有する分子の末端)により近い位置に位置する場合、「下流」と呼ばれる。
本明細書中で使用される場合、「スタッファー(stuffer)配列」という用語は、好ましくはベクターにおける、5’及び3’両末端の制限酵素部位に隣接する核酸配列を指す。スタッファー配列は、ベクターにおいて、関心のある遺伝子をコードする核酸に対する挿入部位に位置する。クローニングプロセス中、スタッファー配列は、適切な制限酵素を用いて消化されてベクターから除去され、関心のある遺伝子をコードする核酸が結合されるか又はスタッファー配列の元の位置でベクターへと相同的に組み換えられる。好ましくは、スタッファー配列は、制限酵素が効率的にベクターを切断できるように5’及び3’制限酵素部位間で十分な距離を与えられるよう十分に大きい。さらに、スタッファー配列の長さは、関心のある遺伝子をコードする核酸の大きさとは異なることが好ましく、例えば、約300塩基対以下又は約400塩基対以上のスタッファー配列は、約350塩基対である関心のある遺伝子をコードする核酸に対して使用され得る。別の実施形態において、スタッファー配列は約1kbの大きさである。
「組み換え宿主細胞」(又は単純に「宿主細胞」)という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指すのものとする。このような用語は、特定の目的細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることを理解されたい。突然変異又は環境の影響のいずれかにより、ある種の修飾が続く世代で起こり得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、これらも本明細書中で使用される場合の「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「抗体」という用語は、本明細書中で示される場合、全抗体及び何らかの抗原結合断片(即ち「抗原−結合部分」)又はその1本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書注でVHと略)及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中でVLと略)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存性の高い領域が散在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRから構成され、次の順番、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に並んでいる。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。VH及びVLの組み合わせの6個のCDRは、抗原結合部位を形成する。2本のH鎖及び2本のL鎖から構成される抗体の場合、抗体は、2個の同一の抗原結合部位、同じ抗原に結合する2個の異なる抗原結合部位又は異なる抗原に結合する2個の抗原結合部位を含有し得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)及び古典的な補体系の補体第1成分(C1q)を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
抗体の「抗原結合部分」(又は単純に「抗体部分」)という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原(例えばIL−1α、IL−1β)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされ得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される2個のFab断片を含む2価断片;(iii)VH及びVLドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)VH及びVLドメインからなる、dAb断片(Wardら、(1989)Nature 341:544−546)及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片、VL及びVHの2つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、これらをVL及びVH領域が対となって一価分子を形成する単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより、組み換え法を用いて、これらが連結され得る(1本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Birdら(1988)Science 242:423−426;及びHustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照)。このような1本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者にとって公知の従来技術を用いて得られ、インタクトな抗体であるものと同様にして有用性についてこの断片をスクリーニングする。本発明のある実施形態において、抗体断片は、Fab、Fd、Fd’、1本鎖Fv(scFv)、scFva及びドメイン抗体(dAb)からなる群から選択される。
またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、1以上のその他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される、より大きい免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanovら(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93−101)及び、2価及びビオチン化scFv分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanovら(1994)Mol.Immunol.31:1047−1058)が含まれる。Fc、Fab及びF(ab’)2断片などの抗体部分は、全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化など、従来技術を用いて全抗体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準的組み換えDNA技術を用いて得ることができる。
「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分と独立にその三次元構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の個々の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質及び/又はドメインの残りの部分の機能を喪失することなく、その他のタンパク質に対して付加、除去又は転移され得る。1つの抗体可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、これは、完全抗体可変ドメイン及び修飾された可変ドメイン、例えば、1以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換されているもの、又は短縮されているか又はNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも部分的に全長ドメインの結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
ドメインの群を形成するために、本発明の可変ドメインを組み合わせ得、例えば、相補性ドメインが組み合わせられ得る(VLドメインがVHドメインと組み合わせられるなど)。非相補性ドメインもまた、例えばVHドメイン及び第二のVHドメインと組み合わせられ得る。共有又は非共有手段によるドメインの連結を含む多くの方法でドメインを組み合わせ得る。
「dAb」又は「ドメイン抗体」は、抗原に特異的に結合する1つの抗体可変ドメイン(VH又はVL)ポリペプチドを指す。ある実施形態において、本発明のベクターは、dAbを発現させるために使用される。
「組み換え抗体」という句は、宿主細胞に遺伝子移入された組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組み換え体から単離された抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリ、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物(例えばマウス)から単離された抗体(例えば、Taylorら(1992)Nucl.Acids.Res.20:6287−6295)など、組み換え手段により調製され、発現され、作製されるか又は単離された抗体又は、その他のDNA配列に対する、特定の免疫グロブリン遺伝子配列(ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など)のスプライシングを含む何らかのその他の手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される抗体など、を指す。組み換え抗体の例には、キメラ、CDRグラフト及びヒト化抗体が含まれる。
「ヒト抗体」という用語は、例えば、Kabatら(Kabatら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91−3242)により記載されるように、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するか又はそれに由来する、可変及び定常領域を有する抗体を指す。しかし、本発明のヒト抗体は、例えばCDRにおいて及び特にCDR3において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)。
本発明の組み換えヒト抗体は可変領域を有し、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の定常領域も含み得る(Kabatら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91−3242参照)。しかし、ある一定の実施形態において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発に供され(又はヒトIg配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発)、従って、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH及びVL配列由来であり、それに関連する一方で、ヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで天然に存在し得ない配列である。しかし、ある一定の実施形態において、このような組み換え抗体は、選択的突然変異誘発又は復帰突然変異又はその両方の結果である。
「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異したアミノ酸の一部又は全てが、相同な生殖細胞系列抗体配列からの対応する生殖細胞系列残基で置き換えられるプロセスを指す。本発明のヒト抗体の重及び軽鎖配列は、最大相同性のある配列を同定するために、VBASEデータベース中の生殖細胞系列配列と個々に整列化(アライン)される。本発明のヒト抗体における相違は、このような異なるアミノ酸をコードする規定されるヌクレオチド位置を突然変異させることによって、生殖細胞系列配列に戻される。従って復帰突然変異に対する候補として同定される各アミノ酸の役割は、抗原結合における直接又は間接的役割について調べられるべきであり、突然変異後にヒト抗体の何らかの所望の特徴に影響を与えることが分かった何らかのアミノ酸は、最終的ヒト抗体に含めるべきではない。復帰突然変異を行うアミノ酸の数を最小限に抑えるために、第二の生殖細胞系列配列が、問題となっているアミノ酸の両側で少なくとも10、好ましくは12アミノ酸にわたり本発明のヒト抗体の配列と同一であり、同一直線上にある場合、最も近い生殖細胞系列配列と異なるが、第二の生殖細胞系列配列の対応するアミノ酸と同一であることが分かったそれらのアミノ酸の位置はそのままにし得る。復帰突然変異は抗体最適化のいずれかの段階で起こり得る。
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されるマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種からの重及び軽鎖可変領域配列及び別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
「CDRグラフト抗体」という用語は、マウスCDRの1以上(例えばCDR3)がヒトCDR配列で置換されているマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種からの重及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/又はVLのCDR領域の1以上の配列が、別の種のCDR配列で置換されている抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種(例えばマウス)からの重及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/又はVL配列の少なくとも一部が、より「ヒトに似ている」、即ちヒト生殖細胞系列可変配列により類似するように改変されている、抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、CDRグラフト抗体であり、ここで、対応する非ヒトCDR配列を置換するために、ヒトCDR配列が非ヒトVH及びVL配列に導入されている。
本明細書中で使用される場合、「連結される」、「融合される」又は「融合」という用語は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的結合又は組み換え手段を含むどのような手段を用いるものであれ、2以上のエレメント又は成分を一緒に連結することを指す。「インフレーム融合」又は「操作可能に連結」という用語は、元のORFの正しい読み枠を維持する形で、連続したより長いORFを形成するための2以上のオープン・リーディング・フレーム(ORF)の連結を指す。従って、得られる組み換え融合タンパク質は、元のORFによりコードされるポリペプチドに対応する2以上のセグメントを含有する単一タンパク質である(セグメントは通常、天然ではそのように連結されない。)。従って、読み枠が融合セグメントを通して連続的にされるにもかかわらず、セグメントは、例えばインフレームリンカー配列により、物理学的又は空間的に分離され得る。
本明細書中で使用される場合、「Fc領域」という用語は、抗体重鎖の定常領域由来のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、Fc領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。
Fc領域は、Fc領域の機能的に同等な類似体であり得る。Fc領域の機能的に同等な類似体は、野生型又は天然に存在するFc領域に対する1以上のアミノ酸修飾を含む可変Fc領域であり得る。ある実施形態において、可変Fc領域は、天然に存在するFc領域と少なくとも50%の相同性を保持し、約80%から99%が好ましい(少なくとも約85%相同性、少なくとも約90%相同性、少なくとも約95%相同性、少なくとも約96%相同性、少なくとも約97%相同性、少なくとも98%相同性又は少なくとも約99%相同性を含む。)。Fc領域の機能的に同等な類似体は、タンパク質のN又はC末端への1以上のアミノ酸残基の付加又はタンパク質のN又はC末端からの1以上のアミノ酸残基の欠失を含み得る(好ましくは30以下、最も好ましくは10以下)。Fc領域の機能的に同等な類似体には、融合パートナーに操作可能に連結されるFc領域が含まれる。
「Fc融合」又は「Fc融合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、1以上のタンパク質、ポリペプチド又は小分子がFc領域又はその誘導体に操作可能に連結されるタンパク質を含む。「Fc融合」という用語は、本明細書中で使用される場合、先行技術(Chamowら、1996、Trends Biotechnol 14:52−60;Ashkenaziら、1997、Curr Opin Immunol 9:195−200)で使用されるように、「Ig融合」、「Igキメラ」及び「受容体グロブリン」(ダッシュ付きの場合もある。)などの用語と同義であるものとする。Fc融合は、融合パートナー(一般に、何らかのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は小分子であり得る。)と、免疫グロブリンの1以上のFc領域又はその変異体を組み合わせる。ある実施形態において、Fc融合物の非−Fc部分、即ち融合パートナーの役割は、標的結合を媒介することであり得、従ってそれは抗体の可変領域に対して機能的に類似し得る。
本発明において、融合もしくは結合パートナーにFcポリペプチドを共有結合させるために、又はFC融合物を作製するために、様々なリンカーを使用し得る。本明細書中で使用される場合、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「連結配列」という用語又はその同等物は、2つの分子を連結し、好ましい構造でこの2つの分子を配置するのに役立ち得る分子又は分子の群(単量体又はポリマーなど)を指す。分子を一緒に共有結合させるために多くのストラテジーを使用し得る。これらには、以下に限定されないが、タンパク質又はタンパク質ドメインのN及びC末端間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結及び化学的架橋試薬を介した連結が含まれる。
II.本発明のベクター
本発明は、哺乳動物宿主細胞でタンパク質を発現させるためのエピソームベクターを提供する。本発明のベクターは、複製起点のいずれかに対するトランス作用複製開始因子を含有する何らかの細胞株においてベクターを使用できるようにする、2つのエピソーム複製起点の含有に基づく。本ベクターが、複製起点に結合する複製開始因子も含有し得る一方、好ましい実施形態において、トランス作用複製因子は宿主細胞により提供される。さらに、ある実施形態において、本発明のベクターは、本ベクターが関心のある遺伝子に操作可能に連結される重又は軽鎖定常領域を含有するので、抗体及びFc融合タンパク質の産生のための効率的で有効な手段を提供する。本発明のベクターの例は図1、2及び8から25に記載する。さらに、典型的ベクターの配列は配列番号1から32で提供する。図1及び2(及び対応する配列番号1及び2)は、「オープン」ベクター、即ち、抗体重又は軽鎖定常領域及び関心のある遺伝子を含有しない本発明のベクターを記載する。図8−25は、関心のある遺伝子をクローニングするための部位とともに様々なマウス又はヒト定常領域も含む本発明のベクターのマップを提供する。
本発明は、哺乳動物宿主細胞でタンパク質を発現させるためのエピソームベクターを提供する。本発明のベクターは、複製起点のいずれかに対するトランス作用複製開始因子を含有する何らかの細胞株においてベクターを使用できるようにする、2つのエピソーム複製起点の含有に基づく。本ベクターが、複製起点に結合する複製開始因子も含有し得る一方、好ましい実施形態において、トランス作用複製因子は宿主細胞により提供される。さらに、ある実施形態において、本発明のベクターは、本ベクターが関心のある遺伝子に操作可能に連結される重又は軽鎖定常領域を含有するので、抗体及びFc融合タンパク質の産生のための効率的で有効な手段を提供する。本発明のベクターの例は図1、2及び8から25に記載する。さらに、典型的ベクターの配列は配列番号1から32で提供する。図1及び2(及び対応する配列番号1及び2)は、「オープン」ベクター、即ち、抗体重又は軽鎖定常領域及び関心のある遺伝子を含有しない本発明のベクターを記載する。図8−25は、関心のある遺伝子をクローニングするための部位とともに様々なマウス又はヒト定常領域も含む本発明のベクターのマップを提供する。
本発明のベクターは、少なくとも2つの別個の複製起点、例えばエプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点及びSV40複製起点を含む。複製起点は、DNAウイルス由来、より好ましくは、例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、リスザルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス68、ヒトサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、サルウイルス40、ポリオーマウイルス、ヒトBKウイルス、ウシパピローマウイルス及びアデノ関連ウイルス由来の複製起点を含む、エピソーム性複製を可能にするDNAウイルス由来であり得る。
ある実施形態において、複製起点は、エプスタイン−バーウイルス、例えば、OriP又はその機能的部分由来である(Aiyarら(1998)EMBO Journal、17:6394にエプスタイン−バー機能的起点の例が記載されている。)。エプスタイン−バーウイルス複製起点(OriP)は、細胞によるDNA合成を促進する2つの主要なエレメント及び複数のシス作用エレメント及びウイルス維持エレメントからなる。2つの主要エレメントのうち第一のものは、反復ファミリー(FR)を含有し、これは、EBNA結合部位を含む(図1及び2で示される。)。EBNAは、OriPを介してベクターの複製を開始させる複製開始因子である(EBNA配列に対するGenebank受入番号V01555(gi:94734074)参照)。OriPに含有される第二のエレメントは、いわゆる二重対称(dyad symmetry)(DS)を含有し、その機能は、起点認識エレメントとして作用することである。一般に、DS及びFRエレメントは、いくつかの塩基対、通常は1000bpによって間隔があけられる。OriPの相対配向及び特にDS及びFRの相対配向は、OriP機能に影響を与えることなく変化させることができる。本発明の発現ベクター上に位置するその他のエレメントに対するOriPの配向及び特にDS及びFRの配向は、OriP機能に影響を与えることなく変化させることができる。複製起点がエプスタイン−バーウイルス複製起点(OriP)であり、OriPが反復ファミリー(FR)及び二重対称(DS)を含む、本発明の好ましい実施形態においては、順序は、DSエレメントが関心のある遺伝子とFRエレメントとの間にあるようになる。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号1のヌクレオチドの1795から3545又はそれと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含むOriP(エプスタイン−バーウイルス)複製起点を含む。
別の実施形態において、本ベクターはSV40複製起点を含む。SV40(サルウイルス40)複製起点(例えば図1及び2で「SV40 Ori」と記載される。)は、この起点を介したベクターの複製の開始のために、1つのウイルスタンパク質、ラージT抗原を必要とする。SV40複製起点は、エピソームベクターを複製及び維持するために、エピソームベクターにおいて使用され得る(Calos(1996)Trends Genetics 12:462;Harrisonら(1994)J.Virol 68:1913;Cooperら(1997)PNAS 94:6450;及びAscenzionoら(1997)Cancer Lett 118:135)。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号1のヌクレオチド5834から6140又はこれと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含むSV40複製起点を含む。
本明細書中に記載の複製起点の機能的変異もまた、本発明による複製起点の意味に包含される。
複製のエピソーム複製起点に加えて、本発明のベクターはまた、細菌中でベクターを複製するための複製起点も有し得る。図1及び2で示されるような、これに限定されるわけではない例は、E.コリで機能するpMB1 oriである。
本発明のベクターはまた選択可能マーカーも含み得る。選択マーカーは、原核及び真核生物でのベクター配列のクローニング及び増幅を促進し得る。ある一定の実施形態において、選択マーカーは、抗生物質などの化合物又は化合物のクラスに対する耐性を与える。本発明の核酸分子及び発現系とともに使用することができる典型的選択マーカーは、ピューロマイシンに対する耐性を与えるものである。あるいは、ハイグロマイシン、gpt、ネオマイシン、ゼオシン、ウアバイン、ブラストシジン、カナマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ナリジクス酸、リファンピシン、クロラムフェニコール、ゼオシン又はブレオマイシンに対する耐性を与える選択マーカー又はDHRF、hisD、trpBもしくはグルタミンシンテターゼなどのマーカーを使用し得る。
本発明のベクターには、タンパク質への関心のある遺伝子(ならびに選択可能マーカー)の転写及び翻訳に必要な制御エレメントも含まれる。転写制御エレメントは、通常、発現されるべき遺伝子配列のプロモーター5’、転写開始及び終結部位及びポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写物、即ちmRNA前駆体に組み込まれる最初の核酸に対応するコンストラクト中の核酸を指し;この転写開始部位はプロモーター配列と重複し得る。「転写終結部位」という用語は、通常、RNAポリメラーゼを転写終結させる、関心のある遺伝子又は一続きの転写されるべき配列の3’末端に相当するヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナル配列又はポリA付加シグナルは、真核mRNAの3’末端での特異的部位での切断及び切断される3’末端への約100−200アデニンヌクレオチド(ポリAテール)の配列の核における転写後付加のためのシグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列には、切断部位から約10−30ヌクレオチド上流に位置する配列AATAA、さらに、下流配列が含まれる。
本発明のベクターに含まれ得る制御エレメントはプロモーターである。このプロモーターは、構成的又は誘導可能であり得る。エンハンサー(即ち、転写を増加させるためにプロモーターにおいて作用するシス作用DNAエレメント)は、プロモーターのみで得られる発現レベルを向上させるためにプロモーターと連結して機能するために必要であり得、転写制御エレメントとして含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントはエンハンサー配列も含む(例えばCMV IE P/E;SV40 P/E;MPSV P/E)。スプライシングされた転写物を得るために必要な場合、スプライスシグナルが含まれ得る。分泌ポリペプチドを産生させるために、選択された配列は通常、分泌のためにポリペプチドが送られ得るER膜に及びER膜を通じ、新たに合成されたポリペプチドを移動させる、リーダーペプチドをコードするシグナル配列を含む。リーダーペプチドは、分泌タンパク質のアミノ末端にあり、タンパク質がER膜を横断した後、シグナルペプチダーゼにより切断除去されることが多い(しかし全てがそうではない。)。分泌される配列には、一般に、それ自身のシグナル配列が含まれる(しかし必ずしもそうではない。)。ネイティブシグナル配列がない場合、異種シグナル配列を選択された配列に融合させることができる。多くのシグナル配列は当技術分野で公知であり、GenBank及びEMBLなどの配列データベースから入手可能である。翻訳制御エレメントには、発現されるべき各個別のポリペプチドに対する、翻訳開始部位(AUG)、停止コドン及びポリAシグナルが含まれる。配列内リボソーム侵入部位(IRES)はいくつかのコンストラクト中に含まれる。
本発明での使用のためのプロモーターには、ウイルス、哺乳動物及び酵母プロモーター、例えば、マウスβグロブリンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ポリオーマプロモーター、哺乳動物サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、酵母アルコールオキシダーゼ、ホスホグリセロキナーゼプロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アデノ関連ウイルスプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、SV40プロモーター、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムAプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、H5Rポックスウイルスプロモーター、アデノウイルス2型MPC後期プロモーター、α−アントリプシンプロモーター、フォックスIXプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、CFTRサーファクタントプロモーター、アルブミンプロモーター及びトランスフェリンプロモーターが含まれる。本発明の核酸及び発現ベクターとの使用のために選択されたプロモーターは、(1)例えば関心のある遺伝子の発現を推進することにおける高レベル発現又は(2)例えば選択可能マーカー遺伝子の発現を推進することにおける、発現レベル低下(修飾による減弱後)をもたらし得る。好ましくは、関心のある遺伝子を推進するプロモーターは、発現を向上させ、関心のある産物の適正なスプライシングを促進するための、強力なプロモーター、例えば、ユビキチン、CMV、EF−1α及びSRαプロモーターである。
ある実施形態において、本発明のベクターには、関心のある遺伝子の発現を推進するためのCMVプロモーターが含まれる。CMVプロモーターの使用は、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第5,385,839号及び同第5,849,522号に記載されている。ある実施形態において、本発明のベクターにおいて使用されるCMVプロモーターは、関心のある遺伝子及び配列番号1の1から608のヌクレオチドに操作可能に連結される。配列番号1のヌクレオチド1から608と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるCMVプロモーター配列も本発明の範囲に含まれる。
本発明のベクターで使用され得る別のプロモーターは、伸長因子−1α(EF−1α)、例えばヒトEF−1αからのプロモーターである。GenBank受入番号NM_001402(gi:83367078)でヒトEF−1αプロモーターに対する配列を見出すことができる。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号2のヌクレオチド76から1267を含む。配列番号1のヌクレオチド1から608と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるEF−1αプロモーター配列も本発明の範囲に含まれる。
ある実施形態において、本ベクターは、クローニングのためのSwaI制限部位を含む。
通常、遺伝子(例えば選択可能マーカー及びGOI)は、プロモーターとポリアデニル化部位との間に挟まれる。使用されるポリA配列は、関心のある遺伝子由来であり得るか(即ちネイティブポリA配列が使用され得る。)又は異種ポリA配列(即ちGOIとは異なる遺伝子由来)、例えば、BGHポリA及びSV40ポリAが使用され得る。mRNAは、プロモーターから転写され、コード領域に対して3’に位置するポリアデニル化シグナルにより安定化される。ポリAシグナルは当技術分野で周知であり、本発明で使用されるベクター及び宿主細胞との使用のために安定性に基づき選択され得る。使用することができるポリAシグナルの例には、ヒトBGHポリA、SV40ポリA、ヒトβアクチンポリA、ウサギβグロブリンポリA及び免疫グロブリンκポリAが含まれる。
本発明のベクターには、関心のある遺伝子が含まれ、このベクターは細胞培養で発現させるための手段である。関心のある遺伝子は、機能的な核酸分子(例えば、アンチセンスRNA分子などのRNA)をコードし得るか又は、より一般的には、産生増加が所望される、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする。本発明のベクターは、関心のある遺伝子を有し得、これは、関心のある遺伝子の発現を可能にする制御核酸配列に関心のある遺伝子が操作可能に連結されるように、挿入部位に挿入される。ある実施形態において、基本的に何らかの関心のある遺伝子、特に治療的に有用な活性又はその他の商業的に適切な適用を有する組み換えタンパク質をコードする遺伝子を発現させるために、本発明のベクターを使用することができる。
関心のある遺伝子の非限定例には、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子及び酵素が含まれる。所望の産物の限定的な一覧には、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン成長、黄体形成ホルモン;ホルモン放出因子;リポタンパク質;α−1−アンチトリプシン;インスリンA−鎖;インスリンB−鎖;プロインスリン;カルシトニン;グルカゴン;レニンなどの分子;第VIIIC因子、第IX因子、組織因子及びフォン・ウィルブラント因子などの凝固因子;タンパク質C、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタントなどの抗凝固因子;ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)などのプラスミノーゲン活性化因子;ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子−α及び−β;エンケファリナーゼ;RANTES(regulated on activation normally T−cell expressed and secreted);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−I−α);ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン;ミュラー管退縮因子;リラキシンA−又はB−鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン−関連ペプチド;DNase;インヒビン;アクチビン;ホルモン又は成長因子に対する受容体;インテグリン;タンパク質A又はD;リウマチ因子;骨由来栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5又は−6(NT−3、NT−4、NT−5又はNT−6)などの栄養因子、血管内皮増殖因子(VEGF)、NGF−βなどの神経成長因子を含む成長(増殖)因子;血小板由来増殖因子(PDGF);aFGF、bFGF、FGF−4、FGF−5、FGF−6などの線維芽細胞増殖因子;上皮細胞増殖因子(EGF);TGF−α及びTGF−β(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4又はTGF−β5を含む。)などの形質転換成長因子(TGF);インスリン様成長因子−I及び-II(IGF−I及びIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−1)、インスリン様成長因子結合タンパク質;CD−3、CD−4、CD−8及びCD−19などのCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン−α、−β及び−γなどのインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M−CSF、GM−CSF及びG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1からIL−33;スーパーオキシドジスムターゼ;T−細胞受容体;表面膜タンパク質、例えば、HER2;分解促進因子;例えばAIDSエンベロープの一部などのウイルス抗原;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;成長(増殖)因子、サイトカイン、ケモカイン及びリンホカインに対する受容体;調節タンパク質;抗体;イムノアドへシンなどのキメラタンパク質及び上記で列挙したポリペプチドのいずれかの断片が含まれる。細菌ポリペプチド又はタンパク質の例には、例えばアルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼが含まれる。
本発明のある態様において、本ベクターは、挿入部位に操作可能に連結される抗体重又は軽鎖領域を含む。2個のエピソーム複製起点及び抗体の軽又は重鎖定常領域を含むベクターの例は、配列番号3−32で見出され得る。
本発明のある実施形態は、完全な抗体、即ち重又は軽鎖のいずれかに対する定常領域に連結される可変領域を発現させるために使用することができるベクターを含む。従って、関心のある遺伝子は、いずれかの抗体タイプ、例えば、マウス、キメラ、ヒト化及びヒトであり得る、抗体重鎖又は軽鎖可変領域をコードし得る。重鎖又は軽鎖可変領域をコードする関心のある遺伝子は、全長可変領域を含み得るか又はあるいは、重鎖又は軽鎖の断片のみ、例えば抗原結合部分領域をコードし得る。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、マウス又はヒト抗体可変領域をコードする。このような例において、定常領域は、可変領域の種と一致し得る(配列番号3−8、27及び28はマウス定常領域をコードし、一方、配列番号9−26及び29−32はヒト定常領域をコードする。)。
ある実施形態において、本発明のベクターには、ある一定のアイソタイプ及び/又はアロタイプ特性を有する抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列が含まれる。重鎖定常領域は、例えば、γ1、γ2、γ3又はγ4などのγアイソタイプ(IgG)であり得る。ある実施形態において、重鎖γ1定常領域は、以下に限定されないが、アロタイプ z,a及びz,non−aを含む、ある一定のアロタイプである。z,a、アロタイプはまた、G1m17及びG1m1アロタイプとしても知られており、位置214(CH1内)にLys、356(CH3)にAsp及び358(CH3)にLeu(EU付番システムに従い付番)があるIGHG1に対応する。z,non−aアロタイプはまた、G1m17及びnG1m1アロタイプとしても知られており、位置214(CH1内)にLys、356(CH3)にGlu及び358(CH3)にMetがあるIGHG1に対応する(EU付番システムに従い付番)。
別の実施形態において、重鎖γ2定常領域(hcG2)は、以下に限定されないが、n−又はn+を含む、ある一定のアロタイプである。G2m(n)又はG2m(23)としても知られるhcG2のn+アロタイプは、CH1の位置189にThr及び位置282にMetがあるIGHG2に対応する(EU付番システムに従い付番)。G2m(n−)としても知られるhcG2のn−アロタイプは、CH1の位置189にPro及び位置282にValがあるIGHG2に対応する(EU付番システムに従い付番)。n+及びn−アロタイプのさらなる詳細は、Hougsら(2001)Immunogenetics 52:242及びBruscoら(1995)Immunogenetics 42:414に記載されている。
その他の実施形態において、重鎖定常領域は、IgM、IgA(IgA1又はIgA2)、IgD又はIgEアイソタイプであり得る。
ある実施形態において、重鎖定常領域は、次のヒトアイソタイプ及びアロタイプ特性:γ1,z,a;γ1,z,non−a;γ2,n+;γ2,n−;又はγ4を有し得る。ある実施形態において、アイソタイプ/アロタイプγ1,z,non−aは、重鎖定常領域の位置234に突然変異を含み得る。さらなる実施形態にいおて、アイソタイプ/アロタイプγ1,z,non−aは、重鎖定常領域の位置234及び235又は234及び237に突然変異を含み得る。このようなベクターの例は、図8から25で提供される。
別の例において、本発明のベクター中でコードされる軽鎖定常領域は、κアイソタイプ又はλアイソタイプを含み得る。
本発明のベクターによりコードされる定常領域は、ヒトに限定されないが、しかし、かわりに定常領域のマウス又はその他の種を含み得る。ある実施形態において、本発明の発現ベクターは、マウスγ1アイソタイプ又はマウスγ2aアイソタイプのいずれかである重鎖定常領域又はマウスκアイソタイプである軽鎖定常領域をコードする核酸を含む。
2つの本発明のベクター、pHybC及びpHybEは、これらのベクターが定常領域を含有しない空のベクターであり、関心のある遺伝子をクローニングするために使用され得る。pHybC及びpHybEの説明を下記で与え、これらのベクターのマップは図1及び2で見出すことができる。
pHybC
pHybCベクター(空)は、様々な細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2個のウイルス複製起点を含有する。pHybCは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、CMVプロモーター(「pCMV」);3成分(tripartite)リーダー配列(TPL);スプライスドナー部位(SD);アデノウイルス主要後期エンハンサーエレメント(enhMLP);スプライス受容部位(SA);関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域とそれに続くポリAシグナル(pA);二重対称エレメント(DS);ウイルスEBNA−1タンパク質を発現する細胞(例えばHEK−293−6E細胞)でのベクタープラスミドの複製を可能にする、エプスタインバーウイルス由来真核性複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybCベクターは、入手可能な最強プロモーターエレメントの1つであるpCMVプロモーターを使用する。pHybC(空)のベクターマップは図1に記載する。pHybCベクターの核酸配列は配列番号1で示す。
pHybCベクター(空)は、様々な細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2個のウイルス複製起点を含有する。pHybCは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、CMVプロモーター(「pCMV」);3成分(tripartite)リーダー配列(TPL);スプライスドナー部位(SD);アデノウイルス主要後期エンハンサーエレメント(enhMLP);スプライス受容部位(SA);関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域とそれに続くポリAシグナル(pA);二重対称エレメント(DS);ウイルスEBNA−1タンパク質を発現する細胞(例えばHEK−293−6E細胞)でのベクタープラスミドの複製を可能にする、エプスタインバーウイルス由来真核性複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybCベクターは、入手可能な最強プロモーターエレメントの1つであるpCMVプロモーターを使用する。pHybC(空)のベクターマップは図1に記載する。pHybCベクターの核酸配列は配列番号1で示す。
pHybE
pHybEベクター(空)は、異なる細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2つの複製起点を含有する。pHybEは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でのベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、EF−1α真核性プロモーター;関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域と、それに続くポリAシグナル(pA);二重対称(dyad symmetry)エレメント(DS);エプスタインバーウイルス由来真核複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybE(空)のベクターマップは図2に記載する。pHybEは、pHybEが関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるEF−1αプロモーターを含有し、一方pHybCがCMVプロモーターを含有するという点で、pHybCとは区別される。pHybEベクターの核酸配列は配列番号2で示す。
pHybEベクター(空)は、異なる細胞株中でこのベクターが複製され得るように、2つの複製起点を含有する。pHybEは、次のエレメントを含有する:SV40のラージT抗原タンパク質を発現する細胞(例えばCOS7細胞)でのベクタープラスミド複製を可能にする、SV40複製起点(「SV40 Ori」);関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、EF−1α真核性プロモーター;関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム(ORF)領域と、それに続くポリAシグナル(pA);二重対称(dyad symmetry)エレメント(DS);エプスタインバーウイルス由来真核複製起点(OriP);反復領域(FR);アンピシリン耐性マーカー(AmpR);及び細菌複製起点(pMB1ori)。pHybE(空)のベクターマップは図2に記載する。pHybEは、pHybEが関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるEF−1αプロモーターを含有し、一方pHybCがCMVプロモーターを含有するという点で、pHybCとは区別される。pHybEベクターの核酸配列は配列番号2で示す。
下記ベクターは、pHybE又はpHybCのいずれかに基づき、免疫グロブリン重又は軽鎖定常領域をさらに含有する。pHybE及びpHybCのように、次のベクターは、関心のある遺伝子、例えば免疫グロブリン可変領域又はその抗原結合部分のコード配列の挿入のために使用され得るクローニング部位を有する。各例において、関心のある遺伝子に対するクローニング部位は、ベクター内に含有される定常領域のコード配列に隣接する。従って、下記のベクターは、特定の定常領域及び特定の可変領域を含有する抗体軽又は重鎖を発現させるために使用され得る。pHybC及びpHybEのように、下記の本発明のベクターのそれぞれは、同じベクターを用いて抗体軽又は重鎖が様々な細胞株で発現され得るように、複数の複製起点を含有する。本発明のさらなるベクターの説明は以下に記載する(図8から25で与えられるベクターマップも参照)。注目すべきことに、バージョン1(V1)として記載されるpHybベクターは、SrfI制限部位の上流にさらなるSwaI部位を有し、一方、バージョン2(V2)として記載されるpHybベクターにはさらなるSwaI部位がない。
マウス定常領域を含む本発明のベクター
pHybC−mCg2a
ベクターpHybC−mCg2aは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybC−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域(又はその一部)及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybC−mCg2は、γ2重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。図8は、関心のある遺伝子としてマウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含むpHybC−mBR3−mCg2のマップを示す。pHybC−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号27で示す。
pHybC−mCg2a
ベクターpHybC−mCg2aは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybC−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域(又はその一部)及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybC−mCg2は、γ2重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。図8は、関心のある遺伝子としてマウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含むpHybC−mBR3−mCg2のマップを示す。pHybC−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号27で示す。
pHybE−mCk
ベクターpHybE−mCkは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。pHybE−mCkは、κ軽鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCkベクターは、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びマウスκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCkは、マウスκ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−mCk V2のベクターマップは図25で与える。pHybE−mCk V1の核酸配列ば配列番号3で示し、pHybE−mCk V2の核酸配列は配列番号4で示す。
ベクターpHybE−mCkは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。pHybE−mCkは、κ軽鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCkベクターは、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びマウスκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCkは、マウスκ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−mCk V2のベクターマップは図25で与える。pHybE−mCk V1の核酸配列ば配列番号3で示し、pHybE−mCk V2の核酸配列は配列番号4で示す。
pHybE−mCg1
pHybE−mCg1は、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg1ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ1重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg1は、マウスγ1重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg1 V2のベクターマップは図21で与える。pHybE−mCg1 V1の核酸配列は配列番号5で示し、pHybE−mCg1 V2の核酸配列は配列番号6で示す。
pHybE−mCg1は、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg1ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ1重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg1は、マウスγ1重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg1 V2のベクターマップは図21で与える。pHybE−mCg1 V1の核酸配列は配列番号5で示し、pHybE−mCg1 V2の核酸配列は配列番号6で示す。
pHybE−mCg2a
pHybE−mCg2aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg2aは、γ2重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg2a V2のベクターマップは図22で与える。pHybE−mCg2a V1の核酸配列は配列番号7として示し、pHybE−mCg2a V2の核酸配列は配列番号8で示す。pHybE−mCg2がどのように使用され得るかというある実施形態の例として、図9は、pHybE−mBR3−mCg2aのマップを示す。図9に記載のベクターは、マウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含有する。pHybE−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号28で示す。
pHybE−mCg2aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2a重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−mCg2aベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ2重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−mCg2aは、γ2重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−mCg2a V2のベクターマップは図22で与える。pHybE−mCg2a V1の核酸配列は配列番号7として示し、pHybE−mCg2a V2の核酸配列は配列番号8で示す。pHybE−mCg2がどのように使用され得るかというある実施形態の例として、図9は、pHybE−mBR3−mCg2aのマップを示す。図9に記載のベクターは、マウスBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)に対するコード配列を含有する。pHybE−mBR3−mCg2aの核酸配列は配列番号28で示す。
ヒト定常領域を含む本発明のベクター
pHybC−E7−hCk
pHybC−E7−hCkは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。さらに、pHybC−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybC−E7−hCkのベクターマップは図10で与え、pHybC−E7−hCkの核酸配列は配列番号29で示す。
pHybC−E7−hCk
pHybC−E7−hCkは、pHybCベクターに基づく(従ってpHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。さらに、pHybC−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybC−E7−hCkのベクターマップは図10で与え、pHybC−E7−hCkの核酸配列は配列番号29で示す。
pHybC−D2−hCg1,z,a
pHybC−D2−hCg1,z,aは、pHybCベクターに基づく(従って、pHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するコード配列も含む。さらに、pHybC−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域のコード配列を含有する(「D2」とも呼ばれる。)。pHybC−D2−hCg1,z,aのベクターマップは図11で与える。pHybC−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号30で示す。
pHybC−D2−hCg1,z,aは、pHybCベクターに基づく(従って、pHybCに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するコード配列も含む。さらに、pHybC−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域のコード配列を含有する(「D2」とも呼ばれる。)。pHybC−D2−hCg1,z,aのベクターマップは図11で与える。pHybC−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号30で示す。
pHybE−hCk
pHybE−hCkはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、例えば、pHybE−hCkベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCkは、κ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCk V2のベクターマップは図23で与える。pHybE−hCk V1の核酸配列は配列番号9で示し、pHybE−hCk V2の核酸配列は配列番号10で示す。pHybE−E7−hCkのベクターマップもまた図13で与える。上述のpHybE−hCkベクターのエレメント全てに加えて、pHybE−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybE−E7−hCkの核酸配列は配列番号32で示す。
pHybE−hCkはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、例えば、pHybE−hCkベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCkは、κ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCk V2のベクターマップは図23で与える。pHybE−hCk V1の核酸配列は配列番号9で示し、pHybE−hCk V2の核酸配列は配列番号10で示す。pHybE−E7−hCkのベクターマップもまた図13で与える。上述のpHybE−hCkベクターのエレメント全てに加えて、pHybE−E7−hCkは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する(「E7」とも呼ばれる。)。pHybE−E7−hCkの核酸配列は配列番号32で示す。
pHybE−hCl
pHybE−hClはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、λ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hClベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトλ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hClは、λ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCl V2のベクターマップは図24で与える。pHybE−hCl V1の核酸配列は配列番号11で示し、pHybE−hCl V2の核酸配列は配列番号12で示す。
pHybE−hClはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、λ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hClベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトλ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hClは、λ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。pHybE−hCl V2のベクターマップは図24で与える。pHybE−hCl V1の核酸配列は配列番号11で示し、pHybE−hCl V2の核酸配列は配列番号12で示す。
pHybE−hCg1,z,a
pHybE−hCg1,z,aは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,aは、γ1,z,a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,aのベクターマップは図14で与える。pHybE−hCg1,z,a V1の核酸配列は配列番号13で示し、pHybE−hCg1,z,a V2の核酸配列は配列番号14で示す。pHybE−D2−hCg1,z,aに対するベクターマップは図12で与える。上述のpHybE−hCg1,z,aのエレメントに加えて、pHybE−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域(「D2」とも呼ばれる。)のコード配列を含有する。pHybE−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号31で示す。
pHybE−hCg1,z,aは、pHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,aは、γ1,z,a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,aのベクターマップは図14で与える。pHybE−hCg1,z,a V1の核酸配列は配列番号13で示し、pHybE−hCg1,z,a V2の核酸配列は配列番号14で示す。pHybE−D2−hCg1,z,aに対するベクターマップは図12で与える。上述のpHybE−hCg1,z,aのエレメントに加えて、pHybE−D2−hCg1,z,aは、アダリムマブの重鎖可変領域(「D2」とも呼ばれる。)のコード配列を含有する。pHybE−D2−hCg1,z,aの核酸配列は配列番号31で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a
pHybE−hCg1,z,non−aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−aは、γ1,z,non−a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a V2のベクターマップは図15で与える。pHybE−hCg1,z,non−a V1の核酸配列は配列番号15で示し、pHybE−hCg1,z,non−a V2の核酸配列は配列番号16で示す。
pHybE−hCg1,z,non−aはpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−aベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−aは、γ1,z,non−a重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a V2のベクターマップは図15で与える。pHybE−hCg1,z,non−a V1の核酸配列は配列番号15で示し、pHybE−hCg1,z,non−a V2の核酸配列は配列番号16で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)は、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2のベクターマップは図16で与える。pHybE−hcG1,z,non−a,mut(234,235)V1の核酸配列は配列番号17で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2の核酸配列は配列番号18で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)は、γ1,z,non−a,mut(234,235)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2のベクターマップは図16で与える。pHybE−hcG1,z,non−a,mut(234,235)V1の核酸配列は配列番号17で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,235)V2の核酸配列は配列番号18で示す。
pHvbE−hCg1、z,non−a,mut(234,237)
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)はpHybEベクターに基づく。(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)は、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2のベクターマップは図17で与える。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V1の核酸配列は配列番号19で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2の核酸配列は配列番号20で示す。
pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)はpHybEベクターに基づく。(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)は、γ1,z,non−a,mut(234,237)重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2のベクターマップは図17で与える。pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V1の核酸配列は配列番号19で示し、pHybE−hCg1,z,non−a,mut(234,237)V2の核酸配列は配列番号20で示す。
pHybE−hCg2,n−
pHybE−hCg2,n−はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまたγ2,n−重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n−ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n−重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n−は、γ2,n−重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n−V2のベクターマップは図19で与える。pHybE−hCg2,n−V1の核酸配列は配列番号21で示し、pHybE−hCg2,n−V2の核酸配列は配列番号22で示す。
pHybE−hCg2,n−はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまたγ2,n−重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n−ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n−重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n−は、γ2,n−重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n−V2のベクターマップは図19で与える。pHybE−hCg2,n−V1の核酸配列は配列番号21で示し、pHybE−hCg2,n−V2の核酸配列は配列番号22で示す。
pHybE−hCg2,n+
pHybE−hCg2,n+はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2,n+重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n+ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n+重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n+は、γ2,n+重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n+のベクターマップは図18で与える。pHybE−hCg2,n+V1の核酸配列は配列番号23で示し、pHybE−hCg2,n+V2の核酸配列は配列番号24で示す。
pHybE−hCg2,n+はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ2,n+重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg2,n+ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ2,n+重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg2,n+は、γ2,n+重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg2,n+のベクターマップは図18で与える。pHybE−hCg2,n+V1の核酸配列は配列番号23で示し、pHybE−hCg2,n+V2の核酸配列は配列番号24で示す。
pHybE−hCg4
pHybE−hCg4はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ4重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg4ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ4重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg4は、γ4重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg4のベクターマップは図20で与える。pHybE−hCg4 V1の核酸配列は配列番号25で示し、pHybE−hCg4 V2の核酸配列は列番号26で示す。
pHybE−hCg4はpHybEベクターに基づく(従ってpHybEに対する上述のエレメント全てを含有する。)。このベクターはまた、γ4重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、pHybE−hCg4ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ4重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、pHybE−hCg4は、γ4重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る(例えばFc融合タンパク質)。pHybE−hCg4のベクターマップは図20で与える。pHybE−hCg4 V1の核酸配列は配列番号25で示し、pHybE−hCg4 V2の核酸配列は列番号26で示す。
本発明のベクターの配列は配列番号1−32で与える。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号1−32のいずれか1つで示される配列又はそれらと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一である配列を含む。
本発明は、特異的細胞標的、例えば上述のタンパク質のいずれか、ヒトEGF受容体、her−2/neu抗原、CEA抗原、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep−cam、その他の癌細胞表面分子、TNF−α、TGF−b1、VEGF、その他のサイトカイン、α4β7インテグリン、IgE、ウイルス性タンパク質(例えばサイトメガロウイルス)を免疫特異的に認識するヒト及び/又はヒト化抗体の産生において使用され得る。本発明の組成物及び方法を用いて作製され得る抗体の例には、以下に限定されないが、抗TNFα抗体、抗IL−12抗体、抗IL−18抗体及び抗EPO受容体(EPO−R)抗体が含まれる。ある実施形態において、抗TNFα抗体は、完全ヒト抗TNFα抗体、例えば、アダリムマブ/D2E7である(本明細書中に参照により組み込まれる、米国特許第6,090,382号参照;Humira(R);Abbott Laboratories)。ある実施形態において、抗IL−12抗体は、完全ヒト抗IL−12抗体、例えば、ABT−874である(Abbott Laboratories;本明細書中に参照により組み込まれる、米国特許第6,914,128号参照)。ある実施形態において、抗IL−18抗体は、完全ヒトIL−18抗体(例えばABT−325)であり、例えば本明細書中に参照により組み込まれる、US20050147610A1に記載の抗体も参照のこと。ある実施形態において、抗EPO/R(ABT−007とも呼ばれる。)抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願US20060018902A1に記載のような、完全ヒト抗体である。
さらに、本ベクターにおいてコードされる定常領域はまた、融合タンパク質(例えばFc−融合タンパク質)を形成させるためにタンパク質に定常領域、例えばFcドメインを操作可能に連結するためにも使用され得る。従って、本発明の方法及び組成物を用いて作製され得るタンパク質のこのタイプの別の例には、融合タンパク質が含まれる。このような融合タンパク質の例には、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されるタンパク質及び新規多機能性タンパク質、例えばサイトカイン及び成長(増殖)因子(即ち、GM−CSF及びIL−3、MGF及びIL−3)の融合タンパク質など、が含まれる。WO93/08207及びWO96/40918は、それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質及びジッパー融合タンパク質を含む、CD40Lと呼ばれる分子の様々な可溶性オリゴマー形態の調製を記載し;そこで考察される技術は、その他のタンパク質に適用可能である。別の融合タンパク質は、エンタネルセプト(entanercept)としても知られる、組み換えTNFR:Fcである。エンタネルセプト(entanercept)(又はEnbrel(R);Amgen/Wyeth)は、p75TNFα受容体の細胞外部分の2つの分子(各分子は、ヒトIgG1の232個のアミノ酸Fc部分に融合される235個のアミノ酸TNFR−由来ポリペプチドからなる。)の二量体である。実際、以下に限定されないが、細胞性受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメイン及びエピトープを含め、融合タンパク質として、あらゆる分子を発現させることができる。
核酸及びアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術もまた当技術分野で公知である。通常、このような技術には、遺伝子に対するmRNAのヌクレオチド配列を決定すること及び/又はそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること及び第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列とこれらの配列を比較することが含まれる。一般に、「同一性」とは、それぞれ2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。2以上の配列(ポリヌクレオチド又はアミノ酸)の「%同一性」を決定することによって、それらを比較することができる。核酸であれ又はアミノ酸配列であれ、2つの配列の%同一性は、2つの整列化された配列間の完全な一致の数をより短い配列の長さで除して、100を掛けたものである。核酸配列に対するおおよそのアラインメントはSmith及びWaterman、Advances in Applied Mathematics 2:482−489(1981)の局所的な相同性アルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、Dayhoff、Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、5 suppl.3:353−358、National Biomedical Research Foundation、Washington、D.C.USAにより開発されたスコアリングマトリクスを使用することによって、アミノ酸配列に対して適用することができ、Gribskov、Nucl.Acids.Res.14(6):6745−6763(1986)により正規化される。配列の%同一性を決定するためのこのアルゴリズムの典型的な実施は、「BestFit」ユーティリティーアプリケーションのGenetics Computer Group(Madison、Wis.)により与えられる。この方法に対する初期設定パラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual、Version 8(1995)(Genetics Computer Group、Madison、Wis.から入手可能)に記載されている。本発明と関連して%同一性を定める好ましい方法は、John F.Collins及びShane S.Sturrokにより開発され、IntelliGenetics、Inc.(Mountain View、Calif.)により配布されるプログラムのMPSRCHパッケージ(University of Edinburghが著作権を有する。)を使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表に対して初期設定パラメータ(例えば、ギャップオープンペナルティーが12、ギャップ伸長ペナルティーが1及びギャップが6)が使用される場合、Smith−Waternanアルゴリズムを利用することができる。生成されるデータから、「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の%同一性又は類似性を計算するためのその他の適切なプログラムは、一般に当技術分野で公知である。
2つの核酸断片は、本明細書中で記載されるように、「選択的にハイブリッド形成する」と考えられる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリッド形成事象の効率及び強度に影響する。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一である配列が標的分子とハイブリッド形成することを少なくとも部分的に阻害する。当技術分野で周知のハイブリッド形成アッセイを用いて、完全に同一である配列のハイブリッド形成の阻害を評価することができる(例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリッド形成など、Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring HarborLaboratories、New York;又はAusbelら(編)、Current Protocols In Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc.、New York(1997)参照)。様々な選択性の程度を使用して、例えば、低から高ストリンジェンシーまで変化する条件を使用して、このようなアッセイを行うことができる。低ストリンジェンシー条件が使用される場合、非特異的結合事象がないときに二次プローブが標的とハイブリッド形成しないように、部分的にすら配列同一性がない二次プローブ(例えば、標的分子との配列同一性が約30%未満であるプローブ)を用いて、非特異的結合がないことを評価することができる。
ハイブリッド形成に基づく検出系を利用する場合、標的核酸配列と相補的であり、適切な条件の選択により、プローブ及び標的配列が、ハイブリッド分子を形成するために「選択的にハイブリッド形成する」か又は互いに結合する、核酸プローブが選択される。「中程度にストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリッド形成することができる核酸分子は、通常、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ70%配列同一性を有する少なくとも約10−14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリッド形成する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、通常、選択された核酸プローブの配列と約90−95%を超える配列同一性を有する少なくとも約10−14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ及び標的が具体的な程度の配列同一性を有する場合のプローブ/標的ハイブリッド形成に有用なハイブリッド形成条件は、当技術分野で知られるように決定することができる(例えば、Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach、B.D.Hames及びS.J.Higgins編、(1985)Oxford;Washington、D.C.;IRL Press参照)。
ハイブリッド形成に対するストリンジェンシー条件に関して、例えば次の因子:プローブ及び標的配列の長さ及び性質、様々な配列の基本組成、塩及びその他のハイブリッド形成溶液成分の濃度、ハイブリッド形成溶液中のブロッキング剤又は界面活性剤(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン及びポリエチレングリコール及びドデシル硫酸ナトリウム)の有無、ハイブリッド形成反応温度及び時間パラメータを変化させ、ならびに洗浄条件を変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために、多くの同等の条件を使用することができることは当技術分野で周知である。特定の一連のハイブリッド形成条件の選択は、当技術分野における標準的方法に従い選択される(例えば、Sambrookら、前出又はAusbelら、前出参照)。第一のポリヌクレオチドは、それが第二のポリヌクレオチドの領域、そのcDNA、その相補体と、同じ又は実質的に同じ塩基対配列を有する場合、又はそれが、上述のような配列同一性を示す場合、第二のポリヌクレオチド「由来」である。第一のポリペプチドは、それが(i)第二のポリヌクレオチド由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされるか又は(ii)上述のように第二のポリペプチドと配列同一性を示す場合、第二のポリペプチド「由来」である。
本発明はまた、バイアルなどの適切な容器中に1以上の本発明のベクターを含有するキットも提供する。発現ベクターは、選択された関心のある配列の挿入のための少なくとも1つのクローニング部位を含有し得るか又は特異的な関心のある遺伝子が既にそのベクターに存在し得る。このベクターは、乾燥又は凍結乾燥形態で又は水溶液中で提供され得る。本キットは、乾燥ポリヌクレオチドを再構成するための緩衝液を含み得る。本キットには、その他の試薬、例えば、反応緩衝液、比較用の陽性及び陰性対照ベクターが含まれ得る。通常、本キットはまた、その中の試薬の使用に関する説明書も含み得る。
III.本発明のベクターの使用
本発明は、本明細書中に記載のベクターを用いてタンパク質を発現させる方法を含む。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、タンパク質を発現させるために適切な条件下でその哺乳動物宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法を含む。本発明のベクターの長所は、それが、哺乳動物細胞培養系を用いて高いタンパク質産生をもたらすことである。
本発明は、本明細書中に記載のベクターを用いてタンパク質を発現させる方法を含む。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、タンパク質を発現させるために適切な条件下でその哺乳動物宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法を含む。本発明のベクターの長所は、それが、哺乳動物細胞培養系を用いて高いタンパク質産生をもたらすことである。
本発明において、本発明の核酸又は発現ベクターを介して遺伝子発現可能なあらゆる細胞型を宿主細胞として使用することができる。「宿主細胞」という用語は、組み換えDNA技術を用いて構築されたベクターにより形質転換されている細胞を指す。
当業者は、本発明のベクターを介してGOI及び選択可能マーカー遺伝子を発現させるために最適である特定の宿主細胞株を選択することができる。本発明で使用することができる細胞には、哺乳動物細胞及び細胞株及びそれら由来の細胞培養物が含まれる。哺乳動物細胞、例えば生殖細胞又は体細胞、は、マウス、ラットもしくはその他のげっ歯類などの哺乳動物又はヒトもしくはサルなどの霊長類由来であり得る。本発明の技術を遂行する際に初代細胞培養又は不死化細胞を使用することができることを理解されたい。
特定の実施形態において、細胞型は、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)(例えばDG44及びDUXB11;Urlaubら、Som.Cell.Molec.Genet.12:555、1986;Haynesら、Nuc.Acid.Res.11:687−706、1983;Lauら、Mol.Cell.Biol.4:1469−1475、1984;Methods in Enzymology、1991、vol.185、pp537−566。Academic Press、Inc.、San Diego、Calif.)、チャイニーズハムスター繊維芽細胞(例えばR1610)、ヒト子宮頸癌(例えばHELA)、サル腎臓株(例えばCVI及びCOS)、マウス繊維芽細胞(例えばBALBc/3T3)、マウス骨髄腫(P3.times.63−Ag3.653;NS0;SP2/O)、ハムスター腎臓株(例えばHAK)、マウスL細胞(例えばL−929)、ヒトリンパ球(例えばRAJI)、ヒト腎臓(例えば293及び293T)を含む、哺乳動物由来である。宿主細胞株は、通常、市販されているか(例えば、BD Biosciences、Lexington、Ky.;Promega、Madison、Wis.;Life Technologies、Gaithersburg、Md.)又はAmerican Type Culture Collection(ATCC、Manassas、Va)から入手可能である。
好ましい実施形態において、本発明で使用される宿主細胞は、本発明のベクターに含まれる少なくとも1つの複製起点に対応する複製開始因子をトランスで提供する。例えば、ベクターが、SV40起点及びOriP起点に対応する2つの複製起点を含む場合、ラージT抗原又はEBNAタンパク質のいずれかを発現する何らかの細胞株、好ましくは哺乳動物細胞株、を使用することができる。ある実施形態において、COS細胞又はヒト胚腎臓(HEK)細胞を本ベクターで形質転換する。例えば、COS7細胞は、SV40の起点欠失突然変異体により形質転換されたCV−1サル細胞由来である(Sigma−Aldrich)。EBNAは、例えばHEK−293−6E細胞を使用することにより提供され得る。
ゲノム内に複製開始因子を安定的に組み込んだ細胞株は、複製開始因子の安定な長期発現及び複製の長期的支持及び複製起点含有プラスミドの維持の長所を有する。EBNA−1を発現する市販の細胞株の例は、ATCC:293HEK−EBNA1及びCV1−EBNA1である。少なくとも1つの複製開始因子、好ましくは、EBNA1タンパク質又はSV40ラージT抗原を過剰発現する特異的な細胞株は、安定した細胞クローンの遺伝子移入及び選択により作製することができる。
当技術分野で周知の様々な技術によって、適切な宿主細胞に核酸及び発現ベクターを導入するか又は形質転換することができる(例えば、Ridgway、1973、Vectors:Mammalian Expression Vectors、Chapter 24.2、pp.470−472、Rodriguez及びDenhardt編、Butterworths、Boston、Mass.;Grahamら、1973、Virology 52:456;Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York;Davisら、1986、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier;及びChuら、1981、Gene 13:197参照)。「形質転換」及び「遺伝子移入」という用語及びそれらの文法的変異は、本明細書中で交換可能に使用され、実用的な何らかの手段による、細胞による外来DNAの取り込みを指す。外来核酸が細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「形質転換」されている。取り込みが完遂される手段(遺伝子移入(電気穿孔法を含む。)、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ付きDNAとの細胞融合、マイクロインジェクション及びインタクトなウイルスでの感染を含み得る。)にかかわらず、核酸の取り込みの結果、安定した形質転換体が得られる。正常レベルより高い一時的発現さえも、機能試験又は関心のあるタンパク質の産生及び回収に有用である。関心のあるタンパク質の産生に適切な条件下で、形質転換された細胞を増殖させ(例えば、ある実施形態において、抗体重及び/又は軽鎖)、コードされる関心のあるポリペプチドを同定するためにアッセイを行う。遺伝子産物を同定し、定量するための典型的アッセイ技術には、酵素免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は蛍光活性化細胞分類分析(FACS)、免疫組織化学などが含まれる。
標準的細胞培養技術に従い、本発明で使用される細胞を培養することができ、例えば、固体表面にそれらを固定し、適切な栄養培地中の縣濁液中で増殖させることができる。
本明細書中に記載のベクターを含む哺乳動物宿主細胞も本発明により包含される。
本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は、文献で詳細に説明される。例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、(J.Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989);Current Protocols in Molecular Biology(F.Ausbelら編、1987 改訂);Essential Molecular Biology(T.Brown編、IRL Press 1991);Gene Expression Technology(Goeddel編、Academic Press 1991);Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A.Bothwellら編、Bartlett Publ.1990);Gene Transfer and Expression(M.Kriegler、Stockton Press 1990);Recombinant DNA Methodology(R.Wuら編、Academic Press 1989);PCR:A Practical Approach(M.McPhersonら、IRL Press at Oxford University Press 1991);Oligonucleotide Synthesis(M.Gait編、1984);Cell Culture for Biochemists(R.Adams編、Elsevier Science Publishers 1990);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.Miller & M.Calos編、1987);Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler編、1991);Animal Cell Culture(J.Pollardら編、Humana Press 1990);Culture of Animal Cells、2.sup.nd.Ed.(R.Freshneyら編、Alan R.Liss 1987);Flow Cytometry and Sorting(M.Melamedら編、Wiley−Liss 1990);Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press、Inc.);及びAnimal Cell Culture(R.Freshney編、IRL Press 1987);及びWirth M.及びHauser H.(1993)Genetic Engineering of Animal Cells、In:Biotechnology Vol.2 Puhler A(編)VCH、Weinhcim 663−744参照。)。
(実施例)
次の実施例は、様々な哺乳動物宿主細胞、例えば、COS7及びHEK−293−6E細胞に対して個別のベクター構築を不要にするための革新的な解決法を説明する。次の実施例はまた、抗体の完全な軽又は重鎖の発現における又はFc融合タンパク質の発現における使用のための、抗体の定常領域をコードする核酸を含有するベクターも提供する。
次の実施例は、様々な哺乳動物宿主細胞、例えば、COS7及びHEK−293−6E細胞に対して個別のベクター構築を不要にするための革新的な解決法を説明する。次の実施例はまた、抗体の完全な軽又は重鎖の発現における又はFc融合タンパク質の発現における使用のための、抗体の定常領域をコードする核酸を含有するベクターも提供する。
様々なその他のベクター、即ちpBOS及びpTT3ベクターから選択される特性を組み合わせることによって、pHyb−C及びpHyb−Eと呼ばれる2つの新しいベクター骨格を構築した(2007年12月28日提出の「DUAL−SPECIFIC IL−1A/IL−1b ANTIBODIES」という題名の、米国仮出願第60/878,165、国際出願PCT/US2007/26482、及びUSSN12/006,068(これら全ては本明細書中に参照により組み込まれる。)参照)。対照ベクターpBOSは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるEF−1αプロモーターを含有し、SV40複製起点を持つ。対照ベクターpTT3は、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるCMVプロモーター及びEBNA複製起点(OriP)を含有する。
COS7及びHEK−293−6E細胞の両方における、マウスBR3−Fc融合物及びヒト抗体(アダリムマブ)の両方のタンパク質発現を評価するために、本発明のベクターを試験した。COS7及びHEK−293−6E細胞における良好なタンパク質発現から、両細胞型における組み換え発現に対する一体化ベクター系が示される。
ベクターpHybC及びpHybEの構築
図1及び2は、それぞれが2つの複製起点を含有する新しいベクターのマップを与える。図1及び2は、ベクターの「空」のものに相当し、即ち、関心のある遺伝子又は抗体定常領域の核酸を含有しない(下記実施例4で詳述)。pHybCは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるCMVプロモーターを含有し、一方、pHybEはEF−1αプロモーターを含有する。
図1及び2は、それぞれが2つの複製起点を含有する新しいベクターのマップを与える。図1及び2は、ベクターの「空」のものに相当し、即ち、関心のある遺伝子又は抗体定常領域の核酸を含有しない(下記実施例4で詳述)。pHybCは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるCMVプロモーターを含有し、一方、pHybEはEF−1αプロモーターを含有する。
pHybC−mBR3−Fc構築のために(「mBR3」は、第三のBLys受容体のマウス型を指し、本明細書中で使用される場合、具体的に、mBR3タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)部分に対するコード配列を指す。)、増幅DNA断片の5’及び3’両末端にPspXI制限部位を導入するプライマーを用いて、pEF−BOSベクターからのSV40複製起点領域をPCR増幅した。次に、PspXIによりこの挿入断片を消化した。CMVプロモーターの上流にSalI制限部位を有するpTT3−mBR3−FcコンストラクトをSalIで消化した。次に、pHybC−mBR3−Fcベクターを作製するために、pTT3−mBR3−FcのSalI部位に、PspXI消化した挿入断片を結合させた。
mBR3細胞外ドメインを通じ、SV40複製起点領域を含有する、5’末端PspXI修飾された断片化DNAをPCRにより最初に増幅することによって、pHybE−mBR3−Fcコンストラクトを作製した。次に、5’でPspXIにより、3’でBsp68Iにより(これは、mBR3細胞外ドメイン配列の上流のリーダー配列において部位を有する。)この産物を消化し、続いて、pHybE−mBR3−Fcコンストラクトを作製するために、SalI及びBsp68I消化したpTT3−mBR3−Fcコンストラクトに、この消化断片をサブクローニングした。
それぞれ受容体−Fc融合タンパク質mBR3−Fcを発現する、pHybC−mBR3−Fc及びpHybE−mBR3−Fcのマップは図8及び9で見出され得る。
pHybC−mBR3−Fcとして、即ち、既に構築された、SalIにより予め消化されたpTT3−E7ベクターに、pHybC−mBR3−Fc(上述)の作製中に単離され消化された同じPspXI消化SV40 Ori領域を結合することにより、D2E7抗体(アダリムマブ)の軽鎖タンパク質を発現するpHybC−E7ベクターを同様に構築した。
pHybE−E7ベクター構築のために、HindIII及びBsiWI制限酵素での既存のpBOS−E7ベクターの消化によって、挿入断片を作製した。次に、D2E7軽鎖タンパク質の発現のため、pHybE−E7を作製するために、同じ酵素で予め消化されたpHybC−E7ベクターにこの挿入断片を結合させた。
pHybC−D2及びpHybE−D2ベクター構築のために、既存のpTT3−D2ベクターをBsp68I及びNotI制限酵素で消化することにより、D2E7抗体(アダリムマブ)の重鎖可変及び定常コード領域からなる挿入断片(即ち、D2重鎖コード配列)を作製した。D2E7抗体(アダリムマブ)の重鎖タンパク質の発現のための、それぞれpHybC−D2及びpHybE−D2作製するために、同じ酵素で予め消化したpHybC−mBR3−Fc及びpHybE−mBR3−Fcベクターに、この挿入断片を結合させた。
タンパク質収率の比較
2つの複製起点の付加によるベクターサイズの上昇がそのベクターによるタンパク質産生に影響を与えたか否か判定するために、それぞれが1つの複製起点のみを含有した対照ベクターpBOS及びpTT3と、上記のpHyb−E及びpHyb−Cベクターを比較した。pBOS、pTT3、pHyb−C及びpHyb−Eからの発現を比較するために、マウスBAFF受容体−ヒトFc融合タンパク質コンストラクト(mBR3−Fc)を4つのベクター骨格にサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
2つの複製起点の付加によるベクターサイズの上昇がそのベクターによるタンパク質産生に影響を与えたか否か判定するために、それぞれが1つの複製起点のみを含有した対照ベクターpBOS及びpTT3と、上記のpHyb−E及びpHyb−Cベクターを比較した。pBOS、pTT3、pHyb−C及びpHyb−Eからの発現を比較するために、マウスBAFF受容体−ヒトFc融合タンパク質コンストラクト(mBR3−Fc)を4つのベクター骨格にサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
mBR3−Fc配列を含有するこの4つのベクターをCOS細胞へと電気穿孔法で移入するか又はHEK−293−6E細胞へと遺伝子移入した(プロトコールは下記)。この細胞を5又は7日間温置した。培地試料を採取し、培地中のmBR3−Fc分泌タンパク質の濃度を測定した。IgG ELISAによりタイターを調べ、COS7細胞の場合は5日後及びHEK−293−6E細胞の場合は7日後の調整済み培地からのmBR3−Fcタンパク質とIgGタンパク質標準との間の分子量の差を調整した。ELISAにおいて標準物質としてより大きなヒトIgGタンパク質を使用することによる、mBR3−Fcタンパク質タイターの過大評価を回避するために、タイター調整が必要である。
293遺伝子移入
本実験で使用される293の一時的遺伝子移入手順は、Durocherら(2002);Nucleic Acids Research 30(2):E9及びPhamら(2005);Biotechnology Bioengineering 90(3):332−44で公開されている方法の変法であった。遺伝子移入において使用された試薬には次のものが含まれる。
本実験で使用される293の一時的遺伝子移入手順は、Durocherら(2002);Nucleic Acids Research 30(2):E9及びPhamら(2005);Biotechnology Bioengineering 90(3):332−44で公開されている方法の変法であった。遺伝子移入において使用された試薬には次のものが含まれる。
・130rpm、37℃及び5%CO2に設定された加湿恒温槽中で使い捨てエルレンマイヤーフラスコ中で培養したHEK−293−6E細胞(EBNA1を安定して発現するヒト胚腎臓細胞株;National Research Council Canadaから得られる。)。
・培養液:FreeStyle293発現用培地(Invitrogen 12338−018)+25μg/mLジェネティシン(G418)(Invitrogen 10131−027)及び0.1%プルロニックF−68(Invitrogen 24040−032)。
・遺伝子移入用培地:FreeStyle293発現用培地+10mM HEPES(Invitrogen 15630−080)。
・ポリエチレンイミン(PEI)保存液:1mg/mL滅菌保存溶液、pH7.0、直線状25kDa PEI(Polysciences)で調製し、−15℃未満で保存。
・トリプトン供給培地:FreeStyle293発現用培地中のトリプトンN1の5%w/v滅菌保存液(Organotechnie、19554)。
遺伝子移入のための細胞調製:遺伝子移入のおよそ2−4時間前に、HEK−293−6E細胞を遠心により回収し、およそ100万個の細胞/mLの細胞密度で培養液中で再懸濁した。各遺伝子移入に対して、細胞縣濁液40mLを使い捨て250mLエルレンマイヤーフラスコに移し、2から4時間温置した。
遺伝子移入:遺伝子移入液及びPEI保存液を予め室温(RT)に温めた。各遺伝子移入に対して、遺伝子移入液5mL中でプラスミドDNA25μg及びポリエチレンイミン(PEI)50μgを組み合わせ、DNA:PEI複合体を形成させるためにRTで15−20分間温置した。BR3−Ig遺伝子移入に対して、1回の遺伝子移入あたり、BR3−Igプラスミド25μgを使用した。予め調製した40mL培養物に各5mL DNA:PEI複合体混合物を添加し、130rpm、37℃及び5%CO2に設定した加湿恒温槽に戻した。20から28時間後、トリプトン供給培地5mLを各遺伝子移入に対して添加し、6日間培養を継続した。
COS7細胞遺伝子移入
次のような標準的電気穿孔条件を用いて、1コンストラクトあたり2枚のCOS7 150mmプレートを遺伝子移入した。COS7遺伝子移入実験に対して、DMEM+10%FBS+1xグルタミン中でCOS細胞を培養した。電気穿孔法に対して、1本のコンフルエントのT−150フラスコからの細胞を使用した。この細胞をトリプシン処理し、血清を不活性化するために、培地+血清中で沈降させた。次に細胞を1xPBS中で洗浄した。
次のような標準的電気穿孔条件を用いて、1コンストラクトあたり2枚のCOS7 150mmプレートを遺伝子移入した。COS7遺伝子移入実験に対して、DMEM+10%FBS+1xグルタミン中でCOS細胞を培養した。電気穿孔法に対して、1本のコンフルエントのT−150フラスコからの細胞を使用した。この細胞をトリプシン処理し、血清を不活性化するために、培地+血清中で沈降させた。次に細胞を1xPBS中で洗浄した。
各T−150に対して、0.8mls電気穿孔緩衝液中でペレットを再懸濁した。COS電気穿孔緩衝液には、20mM Hepes(又はP3緩衝液)、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4及び6mMデキストロースが含まれていた。電気穿孔緩衝液を7.0のpHに調整し、ろ過滅菌した。DNA60μg(それぞれ重及び軽鎖プラスミドDNA30μg又はFc融合タンパク質の場合、60μg DNA)を各電気穿孔に対して使用した。細胞/緩衝液/DNAの0.8mlsを各キュベットに対して混合した(0.4cmキュベット−Biorad)。さらに、ブランクとして使用するために、1個のキュベットには緩衝液のみを添加した。キュベットを氷上に置いた。15から25ミリ秒間、250V及び950μFで細胞を電気穿孔処理した。次に、キュベットを氷上に戻した。20mlsハイブリドーマSFMを含有する1本の50mLコニカルチューブに2個のキュベットの内容物を移した。塊を破壊し、別の20mL培地をそれぞれ含有する2枚の150mm組織培養皿に移すために、10mLピペットを使用した。各培養皿の総培地体積は30mLであった。次に、この培養皿を37℃、5%CO2で3日間温置した。
COS細胞調整済み培地(上清)を50mLコニカルチューブに回収し、沈降させた。沈降後、2ミクロン(μm)フィルターを用いて上清をろ過した。ELISA分析用に試料を採取した。5日後、上清を回収し、それらの個々のタンパク質収率を調べるために標準的IgG ELISAで分析した。
mBR3及びアダリムマブ(D2E7)実験において、ベクターのpBOS、pTT3、pHybC及びpHybEを個別に試験した。
タンパク質試験
ELISA及び/又はPorosAを用いて、遺伝子移入から5日後(COS7細胞の場合)又は7日後(293−6E細胞の場合)に、培地上清中のmBR3−Fc融合タンパク質濃度を試験した。
ELISA及び/又はPorosAを用いて、遺伝子移入から5日後(COS7細胞の場合)又は7日後(293−6E細胞の場合)に、培地上清中のmBR3−Fc融合タンパク質濃度を試験した。
結果
対照及び実験的遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図3(COS細胞)及び図4(HEK−293細胞)で示す。図3のデータは、pHybC及びpHybEが両者とも、COS細胞中で融合タンパク質を産生することにおいて有効であり、両ベクターとも対照ベクターpTT3よりも高いレベルで発現したことを示す。図4で与えられるデータは、pHyb−Eにより遺伝子移入されたHEK細胞からの発現レベルがその他の3種類のベクターで見られる発現を超え、一方でpHyb−Cタンパク質産生レベルは対照と同等であったことを示す。従って、pHyb−C及びpHyb−Eは両者とも、それ以上とは言わないまでも、対照ベクター、pTT3及びpBOSと同程度に、mBr3−Fc融合タンパク質を発現することができる。
対照及び実験的遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図3(COS細胞)及び図4(HEK−293細胞)で示す。図3のデータは、pHybC及びpHybEが両者とも、COS細胞中で融合タンパク質を産生することにおいて有効であり、両ベクターとも対照ベクターpTT3よりも高いレベルで発現したことを示す。図4で与えられるデータは、pHyb−Eにより遺伝子移入されたHEK細胞からの発現レベルがその他の3種類のベクターで見られる発現を超え、一方でpHyb−Cタンパク質産生レベルは対照と同等であったことを示す。従って、pHyb−C及びpHyb−Eは両者とも、それ以上とは言わないまでも、対照ベクター、pTT3及びpBOSと同程度に、mBr3−Fc融合タンパク質を発現することができる。
2つのDNAコンストラクトの同時遺伝子移入を必要とするタンパク質収率の比較
4つのベクター骨格に、TNFα(アダリムマブ)/D2E7に対するヒトIgG1/κモノクローナル抗体をサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
4つのベクター骨格に、TNFα(アダリムマブ)/D2E7に対するヒトIgG1/κモノクローナル抗体をサブクローニングし、エンドフリーDNA prepキットにより平行して調製した。
アダリムマブの発現のための配列を含有する4つのベクターをCOS細胞に電気穿孔法により移入し、ポリ(エチレンイミン)(PEI)を用いてHEK−293−6E細胞に遺伝子移入した。
使用した293一時的遺伝子移入手順は、アダリムマブ遺伝子移入を除き、実施例3に記載のものと同じであり、1回の遺伝子移入あたり、D2E7重鎖(「D2」と呼ばれる。)プラスミド10μg及びD2E7軽鎖(「E7」と呼ばれる。)プラスミド15μgを使用した。
1プレート遺伝子移入あたり各重及び軽鎖ベクター30μgを使用したことを除き、上述のように、COS7遺伝子移入実験を行った。
ELISA及び/又はPorosAを用いて、遺伝子移入から7日後に、培地上清中のアダリムマブ抗体濃度を試験した。COS7細胞の場合5日後及びHEK−293−6E細胞の場合7日後に、IgG ELISAにより調整済み培地からタイターを調べた。
対照及び実験遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図5(HEK−293細胞)及び図6(COS細胞)で示す。図5のデータは、pHybC及びpHybE骨格ベクターの両方が対照ベクターpBOSよりも多くのアダリムマブを産生することができ、対照ベクターpTT3と同等(pHybC)又はより多い(pHybE)量を産生することができることを示す(Durocher、Y.ら、Nucleic Acids Res.30:E9(2002))。同様に、図6のデータは、pHybC及びpHybE骨格ベクターの両方が対照ベクターpTT3よりも多くのタンパク質を産生することができ、対照ベクターpBOSと同等レベルのタンパク質を産生できることを示す。
pHyb−E抗体定常領域ベクターの構築
新しいpHyb−Eベクター骨格を用いた抗体産生のために使用し得るベクターの作製を促進するために、12種類の様々な重及び軽鎖ベクターのパネルを作製した(表2及び3で概要を与える。)。ヒト及びマウスIgG発現の両方を可能にする12種類のマスター鋳型pHybEベクターを構築した。
新しいpHyb−Eベクター骨格を用いた抗体産生のために使用し得るベクターの作製を促進するために、12種類の様々な重及び軽鎖ベクターのパネルを作製した(表2及び3で概要を与える。)。ヒト及びマウスIgG発現の両方を可能にする12種類のマスター鋳型pHybEベクターを構築した。
図14−25に記載のベクターを作製するために、6123bp SrfI/NotI断片をpHybE−スタッファー−hCg1,z,a(pJP167)から単離し、シグナルペプチドコード領域、λスタッファー及び定常領域コード領域からなるpBOSベクターからのSrfI/NotI制限断片と結合した。シグナルペプチドコード領域、λスタッファー及び定常領域コード領域からなる挿入断片を作製するため、SrfI/NotI制限断片を作製するために、SrfI/NotI制限消化を行った(定常領域配列については表1参照)。これらの断片は、pEF−BOSプラスミドDNAに構築されたpBOSマスター鋳型由来であった(本明細書中に参照により組み込まれる、Mizushima、S.及びNagata、S.Nucleic Acids Res.18:5322(1990)参照;2007年12月28日提出の「DUAL−SPECIFIC IL−1A/IL−1b ANTIBODIES」という題名の、米国仮出願第60/878165号、国際出願PCT/US2007/026482号にも記載)及びUSSN12/006,068参照)。このベクターへのクローニングを促進するため、J領域の3’末端にAfeI制限部位を生じさせるために、オーバーラップPCRにより、pHybE−hClコンストラクトに対する挿入断片を最初に修飾した。次のベクターを作製するために、SrfI及びNotIで予め消化した、既に配列確認済みのpHyBEコンストラクトに全ての挿入物を結合させた。
次に、マウス及びヒト抗体定常領域に対して、新規定常領域含有ベクターの配列確認を行った(配列番号3−32参照)。
表2及び3に記載のベクターは全て、可変領域配列と交換され得る(λファージDNAの)〜1−kb「スタッファー」配列を有する。これらの新しいマスターベクターはまた、SrfI部位のすぐ上流に新しいSwaI制限部位も含有する。この新規SwaI部位は、CHO発現ベクターなど、クローニングのためにSwaI部位も利用するその他の発現ベクターにpHyb−Eから抗体オープン・リーディング・フレームを移すために有用である。代替的クローニング部位の柔軟性に加えて、これらのベクターはまた、既存のpBOS、pTT3及びCHOベクターと下位互換性(backward compatible)でもある。
図7で見られるように、COS7細胞における予備的遺伝子移入データから、さらなるSwaI部位がないコンストラクト(v2ベクター)と比較した場合、このさらなるSwaI部位(v1ベクター)がアダリムマブ発現レベルにおいて顕著な影響がなかったことが示された。
要約:
実施例1−4で述べられる先行する実験は、複数の細胞株でpHyb−C及びpHyb−Eベクターが機能的であり、同時に、元のpBOS及びpTT3ベクターで見られる発現レベルを超えることが多い、十分なタンパク質発現を提供することを示す。HEK−293−6E細胞中で収率の低いmBR3−Fc融合タンパク質を発現させるためにpHyb−Eベクターを使用した場合、この発現増大は特に顕著である。このデータにより示されるように、pHyb−C及びpHyb−Eベクターは、ベクター技術において、以前に使用されたベクターを上回る顕著な長所を示す。
実施例1−4で述べられる先行する実験は、複数の細胞株でpHyb−C及びpHyb−Eベクターが機能的であり、同時に、元のpBOS及びpTT3ベクターで見られる発現レベルを超えることが多い、十分なタンパク質発現を提供することを示す。HEK−293−6E細胞中で収率の低いmBR3−Fc融合タンパク質を発現させるためにpHyb−Eベクターを使用した場合、この発現増大は特に顕著である。このデータにより示されるように、pHyb−C及びpHyb−Eベクターは、ベクター技術において、以前に使用されたベクターを上回る顕著な長所を示す。
同等性
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識し、解明することができる。かかる同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識し、解明することができる。かかる同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。
参照による組み込み
本願を通して引用され得る、引用される参照物全ての内容(参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。)は、参照物がそこで引用されるように、あらゆる目的に対してそれらの全体において、本明細書により、参照により明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野で周知である、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び薬物製造及び送達の従来技術を使用する。これらの技術には、以下に限定されないが、次の刊行物で記載される技術が含まれる。
本願を通して引用され得る、引用される参照物全ての内容(参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。)は、参照物がそこで引用されるように、あらゆる目的に対してそれらの全体において、本明細書により、参照により明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野で周知である、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び薬物製造及び送達の従来技術を使用する。これらの技術には、以下に限定されないが、次の刊行物で記載される技術が含まれる。
Claims (29)
- (a)エプスタイン−バーウイルス(EBV)由来のOriP複製起点と;
(b)SV40複製起点と;
(c)関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と;
(d)挿入部位に操作可能に連結されるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとを含む、発現ベクターであって、
前記OriP複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用EBNA1複製開始因子が結合するか、又は前記SV40複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用SV40 T抗原が結合する、発現ベクター。 - 関心のある遺伝子が抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域である請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域が、マウス、ヒト化、キメラ及びヒトからなる群から選択される請求項2に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖可変領域が、抗TNFα抗体、抗IL−18抗体及び抗IL−12抗体からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域である請求項2に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖可変領域が、抗TNFα抗体、抗IL−18抗体及び抗IL−12抗体からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域である請求項3に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖定常領域がマウス又はヒトである請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖定常領域が、γ1,z,a;γ1,z,non−a;γ2,n+;γ2,n−;及びγ4からなる群から選択される請求項1に記載の発現ベクター。
- γ1,z,non−a抗体重鎖定常領域が、重鎖定常領域の位置234にアラニン変異をさらに含む請求項7に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖定常領域の位置235又は237のいずれかにアラニン変異をさらに含む請求項8に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖定常領域がヒトκアイソタイプ又はヒトλアイソタイプのいずれかである請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖定常領域が、マウスγ1アイソタイプ又はマウスγ2aアイソタイプのいずれかである請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の軽鎖定常領域がマウスκアイソタイプである請求項1に記載の発現ベクター。
- 抗体の重鎖定常領域がFcドメインである請求項1に記載の発現ベクター。
- 重鎖又は軽鎖の抗体可変領域が挿入部位に対して5’である請求項2に記載の発現ベクター。
- 選択可能マーカーをさらに含む請求項1に記載の発現ベクター。
- 選択可能マーカーがアンピシリン耐性遺伝子である請求項15に記載の発現ベクター。
- 配列番号1、27、29及び30からなる群から選択される核酸配列を含む請求項1に記載の発現ベクター。
- 配列番号1の核酸配列を含む請求項1に記載の発現ベクター。
- シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項1に記載の発現ベクター。
- CMVプロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜608を含む請求項1に記載の発現ベクター。
- OriP複製起源が配列番号1のヌクレオチド1795〜3545を含む請求項1に記載の発現ベクター。
- SV40複製起点が配列番号1のヌクレオチド5834〜6140を含む請求項1に記載の発現ベクター。
- ベクターが、挿入部位に操作可能に連結される、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域をコードする核酸配列をさらに含む請求項1に記載の発現ベクター。
- 請求項1に記載のベクターを含むキット。
- 請求項1に記載のベクターを含む哺乳動物宿主細胞。
- COS細胞又はヒト胚腎臓(HEK)細胞である請求項25に記載の哺乳動物宿主細胞。
- COS7細胞である請求項26に記載の哺乳動物宿主細胞。
- HEK−293−6E細胞である請求項26に記載の哺乳動物宿主細胞。
- 請求項1に記載の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することと、タンパク質を発現させるために適切な条件下で哺乳動物宿主細胞を培養することと、タンパク質を回収することとを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法。
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