CN117795093A - 具有增加的灵敏度的用于进行温度多重pcr的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了具有增加的灵敏度的用于检测和定量靶核酸的温度多重PCR的方法。所述方法是通过将样品与经设计用于温度多重PCR的探针接触、在多个温度测量荧光、减去信号以获得针对每个感兴趣靶标的基线信号来进行的。此外,所述方法包括:获得第一荧光信号的基线,以及使用所述第一荧光信号的经获得的基线调整经计算的信号以获得基线偏移的经计算的信号。
Description
技术领域
本发明涉及用于聚合酶链式反应(PCR)的方法,特别地涉及具有增加的灵敏度的用于执行温度多重PCR的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)已成为生物医学研究、疾病监测和诊断中普遍存在的工具。通过PCR进行的核酸序列的扩增描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中。现在,PCR在本领域中是众所周知的,并且已经在科学文献中进行了广泛的描述。参见PCRApplications,((1999)Innis等人编辑,Academic Press,San Diego)、PCR Strategies,((1995)Innis等人编辑,Academic Press,San Diego);PCR Protocols,((1990)Innis等人编辑,Academic Press,San Diego)以及PCR Technology,((1989)Erlich编,StocktonPress,New York)。“实时”PCR测定能够同时对靶序列的起始量进行扩增和检测以及定量。利用DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性的基本TaqMan实时PCR测定描述于Holland等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:7276-7280和美国专利号5,210,015中。在2008年12月9日提交的美国申请序列号12/330,694中已描述了不具有核酸酶活性的实时PCR(无核酸酶测定法)。荧光探针在实时PCR中的使用描述于美国专利号5,538,848中。
带有荧光探针的典型的实时PCR方案包括使用对每个靶序列具有特异性的带标记的探针。优选地,探针标记有一个或多个荧光部分,该一个或多个荧光部分在特定波长下吸收和发射光。在与靶序列或其扩增子杂交后,由于探针杂交或水解,探针表现出可检测的荧光发射变化。
然而,实时测定的主要挑战仍然是在单管中分析许多靶标的能力。在医学和诊断学的几乎每个领域,目标基因座的数量都在迅速增加。例如,在法医DNA鉴定、病原微生物检测、多基因座遗传病筛查和多基因表达研究等中,必须对多个基因座进行分析。
在大多数的当前方法中,多重测定的能力受到检测仪器的限制。具体而言,在同一反应中多个探针的使用需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多个探针,仪器必须能够区分每个探针发出的光信号。市场上大多数的当前技术都不允许在同一反应容器中检测到四至七个以上的不同波长。因此,每个靶标使用一个独特地带标记的探针,在同一容器中最多只能检测到四至七个不同的靶标。实际上,至少一个靶标通常是对照核酸。因此,实际上,在同一管中最多只能检测到三至六个实验靶标。由于光谱宽度的限制,荧光染料的使用也受到限制,其中在可见光谱内没有明显的重叠干扰的只有约六种或七种染料可以适用。因此,除非在扩增和检测策略上进行了根本性改变,否则多重测定的能力将无法跟上临床需求。
为了解决上述需求,美国专利申请序列号15/705,821(公布为US2018-073064A1)已公开了使用温度多重PCR技术检测多个靶核酸的方法,该专利申请的全部内容作为参考特此并入以用于所有目的。虽然这些方法极大地提高了多重检测的范围,但为了具有临床价值,仍然需要提高此类方法的灵敏度。
发明内容
本发明提供了具有提高的灵敏度的用于核酸序列检测的新方法,特别是使用温度多重PCR技术检测多个靶核酸。这些方法是通过以下来进行的:将样品与设计成用于温度多重PCR的探针接触,在多个温度测量荧光,减去信号以获得每个感兴趣靶标的经计算的信号,调整经计算的信号的基线,并评估所得信号以识别并量化靶标。
在一方面,提供了用于检测样品中的两种或更多种靶核酸序列的方法。该方法包括将疑似含有所述两种或更多种靶核酸序列的样品在单个反应容器中与各自包含普通荧光染料的一对探针接触,其中该一对探针中的第一探针包含与第一靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列,并且该一对探针中的第二探针包含与第二靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列。第一探针和第二探针可以被设计成用于温度多重PCR。
该方法进一步包括:通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一靶核酸序列和第二靶核酸序列,在第一温度测量普通荧光染料的第一荧光信号,将温度升高至高于第一温度的第二温度以及在第二温度测量该普通荧光染料的第二荧光信号。该方法进一步包括:从第二荧光信号减去第一荧光信号以获得经计算的信号,获得第一荧光信号的基线,以及使用第一荧光信号的经获得的基线调整经计算的信号以获得基线偏移的经计算的信号。
该方法进一步包括:在多个PCR循环中重复上述步骤以从第一靶核酸序列和第二靶核酸序列产生期望数量的扩增产物,并从来自多个PCR循环的第一荧光信号确定第一靶核酸序列的存在,以及从来自多个PCR循环的基线偏移的经计算的信号确定第二靶核酸序列的存在。
在一些实施例中,获得第一荧光信号的基线可包括:在第一温度对第一荧光信号进行非线性回归分析以识别近似信号曲线,以及从该近似信号曲线获得基线。在一些实施例中,获得第一荧光信号的基线可包括确定近似信号曲线的y截距,并且调整经计算的信号可包括将该经计算的信号的y截距与该近似信号曲线的y截距匹配。在其他实施例中,获得第一荧光信号的基线可包括确定近似信号曲线的y截距和基线斜率,并且调整经计算的信号可包括:将该经计算的信号的y截距与该近似信号曲线的y截距匹配,以及将该经计算的信号的基线斜率与该近似信号曲线的基线斜率匹配。
在一些实施例中,确定第一靶核酸和第二靶核酸的存在情况可包括:确定第一荧光信号的一系列相对荧光强度值和基线偏移的经计算的信号的一系列相对荧光强度值。例如,确定第一靶核酸序列的存在情况可包括将第一荧光信号的一系列相对荧光强度值与阈值进行比较,并且确定第二靶核酸序列的存在情况可包括将基线偏移的经计算的信号的一系列相对荧光强度值与第二阈值进行比较。例如,确定第一靶核酸和第二靶核酸的存在情况可包括确定基于下式计算的相对荧光强度终点(RFIe):
在一些实施例中,该方法检测样品中的至少三种靶核酸序列。例如,还可以将样品与第三探针接触,该第三探针包含普通荧光染料和与第三靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列,并且还通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第三核酸。此类方法可进一步包括:将温度升高至高于第二温度的第三温度,在第三温度测量普通荧光染料的第三荧光信号,从第三荧光信号减去第二荧光信号以获得第二经计算的信号,以及使用第一荧光信号的经获得的基线调整第二经计算的信号以获得第二基线偏移的经计算的信号。该方法可进一步包括:在多个PCR循环中重复上述步骤以从第一靶核酸序列、第二靶核酸序列和第三靶核酸序列产生期望数量的扩增产物,以及从来自多个PCR循环的第二基线偏移的经计算的信号确定第三靶核酸序列的存在。
附图说明
图1是根据本发明的方法的一个实施例的在两个温度下使用荧光探针进行温度复用(temperature multiplexing)的图示。
图2是根据本发明的方法的实施例的在三个温度下进行温度复用的图示。
图3示出了在两个温度下的荧光信号和没有基线匹配的相减信号。
图4示出了图3所示的在两个温度下的荧光信号以及根据本发明的方法的实施例的基线匹配的相减信号。
图5示出了没有基线匹配的所得RFIe值的图。
图6示出了根据本公开的方法的实施例使用基线匹配信号的所得RFIe值的图。
图7示出了根据本公开的方法的实施例用于使用基线匹配以增加的灵敏度进行温度多重PCR的方法。
具体实施方式
定义
本文所用的术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物(例如微生物学培养物)。术语“样品”还旨在包括生物学样品和环境样品两者。样品可包括合成来源的样本。生物学样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如,支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳朵、关节镜)、活检样品、尿液、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳房液、胚胎细胞和胎儿细胞。在优选实施例中,生物学样品是血液,且更优选是血浆。如本文所用,术语“血液”涵盖全血或血液的任何级分,诸如常规定义的血清和血浆。血浆是指对用抗凝血剂处理过的血液进行离心产生的全血级分。血清是指血液样品凝结后残留的流体的水状部分。环境样品包括环境材料,诸如表面物质、土壤、水和工业样品,以及从食品和奶制品加工仪器、设备、装备、器皿、一次性和非一次性物品中获得的样品。这些实例不应解释为限制适用于本发明的同一样品类型。
本文所用的术语“靶标”或“靶核酸”是指待检测或测量其存在或待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此,靶标实质上包括任何存在可检测的探针(例如寡核苷酸探针)或测定的分子,或者可以由本领域技术人员生产。例如,靶标可以是生物分子,诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物,其能够与可检测的探针(例如抗体)结合或以其他方式接触,其中可检测的探针还包含能够被本发明的方法检测的核酸。如本文所用,“可检测探针”是指能够与目标靶生物分子杂交或退火并允许靶生物分子进行特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面,靶标是核酸,并且可检测的探针是寡核苷酸。在整个本公开中,术语“核酸”和“核酸分子”可以互换使用。该术语是指寡核苷酸、oligo、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物和其他类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA),所有这些都可以是单链或双链形式,并且除非另有限制,否则将涵盖可以以相似方式起作用的天然核苷酸的已知类似物作为天然存在的核苷酸及它们的组合和/或混合物。因此,术语“核苷酸”是指天然存在的和经修饰的/非天然存在的核苷酸,包括存在于多核酸或寡核苷酸内的核苷三磷酸、核苷二磷酸和核苷单磷酸以及单磷酸单体。核苷酸也可以是核糖;2'-脱氧;2',3'-脱氧以及本领域众所周知的大量的其他核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸,诸如3'-O-甲基、卤代碱基或糖取代;替代性糖结构,包括非糖、烷基环结构;替代性碱基,包括肌苷;脱氮杂修饰的;chi和psi,经接头修饰;经大量标记修饰的;磷酸二酯修饰或替代,包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、酰胺、酯、醚;以及基本或完全的核苷酸间替代,包括诸如可光解的硝基苯基部分的切割键。
可以定量或定性地测出靶标的存在与否。靶标可以以多种不同形式出现,包括例如简单或复杂的混合物,或以基本上纯化的形式出现。例如,靶标可以是含有其他成分的样品的一部分,也可以是样品的唯一或主要成分。因此,靶标可以是整个细胞或组织、细胞或组织提取物、其分馏的裂解物或基本上纯化的分子的成分。靶标也可以具有已知或未知的序列或结构。
术语“扩增反应”是指用于扩增核酸靶序列的拷贝的任何体外方式。
“扩增”是指将溶液提交至足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的成分可包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常是指靶核酸中的“指数”增加。然而,本文所用的“扩增”还可以指核酸的选择性靶序列数目的线性增加,但是不同于一次性、单一引物延伸步骤。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指以几何级数由此扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR对于本领域技术人员是众所周知的;参见,例如美国专利号4,683,195和4,683,202;以及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人编,1990。
如本文所用,“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性寡聚物。寡核苷酸包括能够与靶核酸特异性结合的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构体形式、肽核酸(PNA)等。通常,单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成寡核苷酸,其大小范围从几个单体单元,例如3-4个,到几十个单体单元,例如40-60个。每当寡核苷酸由字母序列表示时,诸如“ATGCCTG”,应理解的是核苷酸从左至右为5'-3'顺序,并且除非另有说明,否则“A”表示脱氧腺苷,“C”表示脱氧胞苷,“G”表示脱氧鸟苷,“T”表示脱氧胸苷,以及“U”表示核糖核苷尿苷。通常,寡核苷酸包含四个天然的脱氧核苷酸;然而,它们也可以包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。当酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求时,例如单链DNA、RNA/DNA双链体等,那么为该寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组合物是本领域普通技术人员所熟知的。
如本文所用,“寡核苷酸引物”或简称为“引物”是指与靶核酸模板上的序列杂交并促进检测寡核苷酸探针的多核苷酸序列。在本发明的扩增实施例中,寡核苷酸引物用作核酸合成的起始点。在非扩增实施例中,寡核苷酸引物可用于产生能够被切割剂切割的结构。引物可以具有各种长度,并且通常长度小于50个核苷酸,例如长度为12-25个核苷酸。可以基于本领域技术人员已知的原理来设计用于PCR的引物的长度和序列。
如本文所用,术语“寡核苷酸探针”是指能够与目标靶核酸杂交或退火并允许靶核酸进行特异性检测的多核苷酸序列。
“报告部分”或“报告分子”是赋予可检测信号的分子。例如,可检测的表型可以是比色、荧光或发光的。“猝灭剂部分”或“猝灭剂分子”是能够猝灭来自报告部分的可检测信号的分子。
“错配的核苷酸”或“错配”是指在一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以具有至少一个错配,但是也可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配的核苷酸。
如本文所用,术语“多态性”是指等位基团变体。多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)以及简单的序列长度多态性。多态性可以归因于一个等位基因与另一个等位基因相比的一个或多个核苷酸取代,或者可以归因于本领域已知的插入或缺失、重复、倒位和其他改变。
关于一个分子与另一分子诸如靶多核苷酸的探针的结合的术语“特异性的”或“特异性”是指两个分子之间的识别、接触和稳定的复合物的形成,以及该分子与其他分子的实质上较少的识别、接触或复合物的形成。如本文所用,术语“退火”是指两个分子之间稳定的复合物的形成。
如果探针的至少一个区域与核酸序列的互补序列的至少一个区域具有基本的序列同一性,则该探针对核酸序列“能够退火”。“基本的序列同一性”是至少约80%,优选至少约85%,更优选至少约90%、95%或99%,以及最优选100%的序列同一性。为了确定DNA序列和RNA序列的序列同一性,通常将U和T视为相同的核苷酸。例如,包含序列ATCAGC的探针能够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。
如本文所用,术语“切割剂”是指能够切割寡核苷酸探针以产生片段的任何方式,包括但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法,切割剂可仅用于切割、降解或以其他方式分离寡核苷酸探针的第二部分或其片段。切割剂可以是酶。切割剂可以是天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。
对于其中发生扩增的方法,切割剂优选是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的酶。此类酶通常是核酸扩增酶。核酸扩增酶的实例是核酸聚合酶,诸如水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶或大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I。该酶可以是天然存在的、未经修饰的或经修饰的。
“核酸聚合酶”是指催化核苷酸并入核酸的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶等。
“耐热DNA聚合酶”是指当经受升高的温度达到选择的时间段时,是稳定的(即,抵抗分解或变性)并保留足够的催化活性的DNA聚合酶。例如,当经受升高的温度达到使双链核酸变性所需的时间时,耐热DNA聚合酶保留足够的活性以进行后续的引物延伸反应。核酸变性所需的加热条件是本领域中众所周知的,并且在美国专利号4,683,202和4,683,195中举例说明。如本文所用,耐热聚合酶通常适用于温度循环反应,诸如聚合酶链式反应(“PCR”)。耐热的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)物种Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶,诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
如前述美国专利申请序列号15/705,821(通过引用并入本文)中所述,温度多重PCR技术允许使用每个不同的荧光探针通过监测不同温度下的荧光来识别多个靶标。可以从后续(较高)温度信号减去较低温度下的监测信号以获得感兴趣的信号值。(参见图1)。更具体地,如前述申请中所述,可以通过以下来执行温度复用:设计探针以使其标签部分在不同的Tm温度与其相应的猝灭寡核苷酸分子杂交,在处于或高于Tm温度的多个温度测量荧光,以及处理所得信号以识别和量化靶标。
例如,可以通过使用全部用相同荧光团标记的三种寡核苷酸探针来实现在一次反应中扩增和检测三种靶核酸。标准寡核苷酸探针可用于通过测量第一温度(通常是PCR循环的退火温度)下的荧光信号来检测第一靶标。可以使用具有低Tm标签猝灭的寡核苷酸双链体的第一“带标签”探针通过测量在处于或高于其Tm温度并且高于第一温度的第二温度下的计算荧光值来检测第二靶标。可以使用具有高Tm标签猝灭的寡核苷酸双链体的第二“带标签”探针通过测量在处于或高于其Tm温度并且高于第二温度的第三温度下的计算荧光值来检测第三靶标。(参见图2)虽然这种方法理论上能够使用一种/>探针和两种带有四至七个不同报告部分(例如荧光染料)的不同带标签探针在一次反应中检测介于12与21种之间的不同靶核酸,或者使用一种/>探针和3种不同的带标签探针在一次反应中检测介于16与28种之间的不同靶核酸,但如将根据本公开的实施例所证明,仍需要提高的灵敏度。
在单个荧光通道在三个温度T1、T2和T3下读取的通常情况下(在本实例中按升序排列),其中T1与靶标“A”相关联,T2与靶标“B”相关联,T3与靶标“C”相关联,靶标“A”的感兴趣信号仅仅是T1下产生的信号,靶标“B”的感兴趣信号是信号(T2)–信号(T1),并且靶标“C”的信号是信号(T3)–信号(T2)。应当理解,该信号相减可能导致靶标“B”和“C”的感兴趣信号具有与靶标“A”的感兴趣信号不同的基线截距。实际上,已经发现,以这种方式使用这些信号而不进一步处理信号的靶标灵敏度低于能够可靠且准确地识别相关靶标的存在和/或量化相关靶标的期望。
本发明通过校正通过减去其他信号而计算出的感兴趣信号来提供提高的灵敏度。在使用单一荧光染料(例如FAM)的情况下,探针设计成在不同温度下与其相应的猝灭寡核苷酸分子杂交,使得可以通过监测三个温度(T1<T2<T3)下的荧光信号来评估三个不同的靶标,这三个温度的信号将计算如下(其中FAM(T)是在给定温度T下测量的FAM的相对荧光):
等式1:信号(T1)=FAM(T1)
等式2:信号(T2)=FAM(T2)–(FAM_m1)xFAM(T1)
等式3:信号(T3)=FAM(T3)–(FAM_m2)xFAM(T2)
在这种情况下,FAM_m1和FAM_m2可以是经确定以均衡信号温度之间的增益的染料特定乘数。例如,可以通过针对每个温度信号评估等式4,并且然后使用等式5和6求解变量来计算乘数。
等式4 mT=中位数[最后5个荧光值]–中位数[前5个荧光值]。
等式5 xFAM(T1)=mT2/mT1
等式6 xFAM(T2)=mT3/mT1
在进行上述计算时(包括如等式2和3中所述的信号值的简单相减)以获得用于识别和/或量化三个靶标的三个相关信号时,应当理解,这些信号中的每一者将必然具有不同的基线截距。在许多情况下,对此类基线截距的任何处理都是不合适的,因为这不会维持正确评估信号所需的尺度不变性。然而,对于单个孔中的给定荧光染料,光路在所有温度下都是相同的。因此,匹配基线截距实际上维持了尺度不变性,因为仅仅将给定信号与不同温度下相同荧光团的信号进行匹配。因此,根据本发明,可以通过将T2和T3下的信号的基线与T1下的信号的基线匹配来获得随后较高温度下的荧光信号的更准确表示。在本发明的一些实施例中,该基线对齐或匹配可以通过将信号T2和T3的y截距与信号T1的y截距匹配来实现。在其他实施例中,基线对齐或匹配可以通过将信号T2和T3的y截距和基线斜率两者与信号T1的这两者匹配来实现。应当理解,虽然将信号的y截距和基线斜率两者与信号T1的这两者相匹配可能是期望的并且是最准确的,但是它也可能是计算密集型的。因此,仅仅匹配y截距可能是合适的,因为这可以充分提高后续计算的灵敏度。
根据本发明,这可以通过识别在初始温度下拟合信号的PCR数据集的曲线的近似值,并且然后用该近似值的相关基线参数替换随后的较高温度信号来完成。如共同拥有的美国专利号7,680,868中所述(该专利特此通过引用整体并入以用于所有目的),在许多情况下,使用等式7或包括基线截距加斜率的类似函数来将PCR数据集拟合为近似值,其中x是指循环次数,并且z1至z7是可调参数。
等式7
在本实例中,y截距指定为z1,并且基线斜率指定为z2。因此,信号(T2)和信号(T3)与信号(T1)的基线匹配可以通过用从信号(T1)的近似值确定的值替换信号(T2)和信号(T3)的z1或z1+z2 x来完成。如下文将进一步详细描述的,此类基线匹配极大地提高了靶标灵敏度,这提高了使用本发明的方法进行的确定和量化的可靠性和准确性。
图7示出了根据本公开的方法的实施例用于使用基线匹配以增加的灵敏度进行温度多重PCR的方法。在第一步骤702中,将疑似含有靶核酸的样品在单个反应容器(例如单个试管或多孔微板中的单个孔)内与设计成用于温度多重PCR的探针接触。例如,该样品可以是疑似含有至少两种不同的靶核酸。可以将探针设计成通过使用在多个温度下监测的单一荧光染料而用于温度多重PCR。例如,可以将探针设计成通过使标签部分在不同的Tm温度下与其相应的猝灭寡核苷酸分子杂交而用于温度复用。在与探针接触之后,在步骤704,通过PCR扩增靶核酸。
接下来,在步骤706,在第一温度测量荧光信号。例如,第一温度可以是PCR循环的退火和/或延伸温度。在第一温度下测量的信号可以指示第一靶核酸的存在。
接下来,在步骤708,温度逐渐升高至第二温度。第二温度可以处于或高于与第二探针的标签猝灭寡核苷酸双链体相关联的解链温度。在步骤710,在第二温度测量荧光信号。然后,为了获得指示第二靶核酸的存在的信号,在步骤712,通过从在第二温度下检测到的信号减去在第一温度下检测到的信号来确定经计算的信号值。经计算的信号值可以任选地被归一化以校正可能受温度影响的信号。例如,已知荧光信号在较高温度下会降低,因此,可以使用标准来归一化在不同温度下获得的信号值。
任选地,如果正在评估多于两个靶标,则可以提供进一步的步骤(图7中未示出),其中温度可以升高至第三温度,该第三温度处于或高于与第三探针的标签猝灭寡核苷酸双链体相关联的解链温度。可以在第三温度测量荧光信号,并且可以通过从第三温度下的荧光信号减去第二温度下的荧光信号来获得第二经计算的信号。
在步骤714,获得第一温度下的荧光信号的基线。该基线可包括第一温度下的荧光信号的y截距和/或基线斜率。可以通过用于获得评估信号的此类参数的任何合适的方法来获得该基线。在一些实施例中,可以通过对测量信号进行非线性回归分析来获得该基线。例如,可以使用等式7来近似估计测量信号,并且可以通过确定从该测量信号确定的近似信号的y截距和/或基线斜率值来获得基线。
在步骤716,调整来自步骤712的经计算的信号的基线以匹配在步骤714中获得的基线。在一些实施例中,仅使用y截距来匹配基线。在一些实施例中,y截距和基线斜率两者都用于匹配基线。如果获得第二经计算的信号(例如,如果正在评估三个靶标),则还可以调整第二经计算的信号的基线以匹配在步骤714中获得的基线。
如由箭头718所示,这些信号测量和计算可以在多个PCR循环中重复和进行。然后,在步骤720,一旦重复了所需次数的循环,所确定的累积信号值不仅可以用于确定靶核酸的存在或不存在,还可以用于确定靶核酸的数量。这可以通过从PCR生长曲线确定阈值(Ct值)来完成,该PCR生长曲线是根据相对于PCR循环次数绘制的计算信号值生成的。例如,RFIe可以使用下文所述的等式8来确定,并且可以基于RFIe值来设定阈值。
本发明的实施例将进一步在以下实例中描述,这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
实例1
进行实时PCR研究以评估根据本发明的实施例的基线匹配的效果。该研究使用含有不同浓度的人乳头瘤病毒(HPV)的样品进行。使用的荧光探针包括香豆素、FAM、HEX、JA270和DKR。在三个温度下评估荧光:58℃(T1)、80℃(T2)和96℃(T3)。为了理解根据本发明的实施例的基线匹配的效果,评估与FAM相关联的信号并且在有和没有基线匹配的情况下执行计算。具体来说,RFIe值是可以通过下面的等式8确定的PCR曲线的尺度不变增长的度量,在有和没有基线匹配的情况下确定该值。
等式8
图3示出了T1和T3下的荧光信号,以及在没有任何基线匹配的情况下使用等式3的经计算的信号(CT3),其中FAM_m2=0.91。从图3中可以看出,CT3的基线与T1的基线不对齐。图3中描绘的曲线的RFIe值提供于下表:
信号 | RFIe |
FAM(T1) | 31.6211 |
FAM(T2) | 6.8158 |
FAM(T3) | 3.1355 |
图4示出了T1和T3下的荧光信号以及基线偏移的经计算的信号(BCT3)。在该情况下,通过用T1的y截距替换CT3的y截距来偏移基线。从图4中可以看出,BCT3的基线与T1的基线对齐。图4中描绘的曲线的RFIe值提供于下表:
可以看出,当采用基线匹配时,与T3相关的曲线的RFIe值显着增加。因此,很明显,基线匹配可以对靶标的识别和量化产生重要影响。
实例2
进行类似于实例1但具有更大数据集的实时PCR研究以评估基线匹配的灵敏度提高。
图5示出了没有基线匹配的数据集的所得RFIe值的图,并且图6示出了使用基线匹配信号的所得RFIe值的图。在每种情况下,水平线描绘了正曲线调用与负曲线调用的分离,即确定靶标的存在。然而,可以看出,在图6(其具有在使用根据本发明的实施例的基线匹配之后计算的值)中,正曲线调用与负曲线调用之间存在更清晰的分离。相比之下,从图5中可以看出,在未使用基线匹配的情况下,正曲线调用与负曲线调用之间根本没有明确的界限。这些结果说明了使用根据本发明的实施例的基线匹配可以获得提高的灵敏度。
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发明,但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚,在不脱离本发明的真实范围的情况下,可在形式和细节上进行各种改变。例如,上述方法可以以各种组合使用。
Claims (16)
1.一种用于检测样品中两种或更多种靶核酸序列的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)将疑似含有所述两种或更多种靶核酸序列的所述样品在单个反应容器中与各自包含普通荧光染料的一对探针接触,其中所述一对探针中的第一探针包含与第一靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列,并且所述一对探针中的第二探针包含与第二靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列,其中所述第一探针和所述第二探针经设计用于温度多重PCR;
(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述第一靶核酸序列和所述第二靶核酸序列;
(c)在第一温度测量所述普通荧光染料的第一荧光信号;
(d)将温度升高至高于所述第一温度的第二温度;
(e)在所述第二温度测量所述普通荧光染料的第二荧光信号;
(f)从所述第二荧光信号减去所述第一荧光信号,以获得经计算的信号;
(g)获得所述第一荧光信号的基线;
(h)使用所述第一荧光信号的经获得的基线调整所述经计算的信号,以获得基线偏移的经计算的信号;
(i)在多个PCR循环中重复步骤(b)至(h),以从所述第一靶核酸序列和所述第二靶核酸序列产生期望数量的扩增产物;
(j)从来自所述多个PCR循环的所述第一荧光信号确定所述第一靶核酸序列的存在,以及从来自所述多个PCR循环的所述基线偏移的经计算的信号确定所述第二靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其中获得所述第一荧光信号的所述基线包括:在所述第一温度进行对所述第一荧光信号的非线性回归分析以识别近似信号曲线,以及从所述近似信号曲线获得所述基线。
3.根据权利要求2所述的方法,其中获得所述第一荧光信号的所述基线包括确定所述近似信号曲线的y截距。
4.根据权利要求3所述的方法,其中调整所述经计算的信号包括将所述经计算的信号的y截距与所述近似信号曲线的所述y截距匹配。
5.根据权利要求2所述的方法,其中获得所述第一荧光信号的所述基线包括确定所述近似信号曲线的y截距和基线斜率。
6.根据权利要求5所述的方法,其中调整所述经计算的信号包括:将所述经计算的信号的y截距与所述近似信号曲线的所述y截距匹配,以及将所述经计算的信号的基线斜率与所述近似信号曲线的所述基线斜率匹配。
7.根据权利要求1所述的方法,其中确定第一靶核酸和第二靶核酸的存在包括:确定所述第一荧光信号的一系列相对荧光强度值和所述基线偏移的经计算的信号的一系列相对荧光强度值。
8.根据权利要求7所述的方法,其中:
(i)确定所述第一靶核酸序列的存在包括将所述第一荧光信号的所述一系列相对荧光强度值与阈值进行比较;并且
(ii)确定所述第二靶核酸序列的存在包括将所述基线偏移的经计算的信号的所述一系列相对荧光强度值与第二阈值进行比较。
9.根据权利要求7所述的方法,其中确定所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的存在包括确定基于下式计算的相对荧光强度终点(RFIe):
10.根据权利要求1所述的方法,其中在所述样品中检测到至少三种靶核酸序列,并且其中在步骤(a)还将所述样品与第三探针接触,所述第三探针包含所述普通荧光染料和与第三靶核酸序列至少部分地互补的核苷酸序列,并且在步骤(b)还通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第三核酸,所述方法进一步包括以下步骤:
(e1)在步骤(e)之后,将温度升高至高于所述第二温度的第三温度;
(f1)在所述第三温度测量所述普通荧光染料的第三荧光信号;
(g1)从所述第三荧光信号减去所述第二荧光信号,以获得第二经计算的信号;
(h1)使用所述第一荧光信号的经获得的基线调整所述第二经计算的信号,以获得第二基线偏移的经计算的信号;
(i1)在多个PCR循环中重复步骤(b)至(h)和(e1)至(h1),以从所述第一靶核酸序列、所述第二靶核酸序列和所述第三靶核酸序列产生期望数量的扩增产物;以及
(j1)从来自所述多个PCR循环的所述第二基线偏移的经计算的信号确定所述第三靶核酸序列的存在。
11.根据权利要求10所述的方法,其中获得所述第一荧光信号的所述基线包括确定所述第一荧光信号的y截距。
12.根据权利要求11所述的方法,其中调整所述经计算的信号各自包括将所述经计算的信号的y截距与所述第一荧光信号的所述y截距匹配。
13.根据权利要求10所述的方法,其中获得所述第一荧光信号的所述基线包括确定所述第一荧光信号的y截距和基线斜率。
14.根据权利要求13所述的方法,其中调整所述经计算的信号各自包括:将所述经计算的信号的各y截距与所述第一荧光信号的所述y截距匹配,以及将所述经计算的信号的各基线斜率与所述第一荧光信号的所述基线斜率匹配。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述探针中的每一者包含在各种解链温度与相应的猝灭寡核苷酸分子杂交的标签部分。
16.根据权利要求10所述的方法,其中所述探针中的每一者包含在各种解链温度与相应的猝灭寡核苷酸分子杂交的标签部分。
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