CN101688841B - 用于确定pcr和其他数据集中的串扰系数的系统和方法 - Google Patents

Abstract

用于确定曲线(诸如S形或生长曲线以及尤其是PCR曲线和核酸解链曲线)中的串扰系数、以及用于使用线性减法模型应用串扰系数来产生串扰修正的数据集的系统和方法。使用在整个信号采集范围上采集的串扰数据来确定串扰信号系数。在所有信号曲线数据上的分析提供在整个数据采集范围上的更鲁棒的串扰修正。线性减法模型被用来修正具有串扰分量的数据集。

Description

用于确定PCR和其他数据集中的串扰系数的系统和方法

技术领域

本发明大体上涉及用于处理表示S形或生长曲线(诸如聚合酶链反应(PCR)曲线)的数据的系统和方法，而且更具体地涉及用于确定PCR检测系统的串扰特性的系统和方法。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是用于酶合成或扩增定义的核酸序列的体外方法。该反应一般使用两个寡核甘酸引物，所述两个寡核甘酸引物杂交成相反链并且位于要扩增的模板或目标DNA序列的两侧。引物的延长(elongation)由热稳定的DNA聚合酶进行催化。包含模板变性、引物退火以及退火后的引物经聚合酶的延伸(extension)的一系列重复循环导致特定DNA片段的指数累积。在该过程中一般使用荧光探针以促进扩增过程的检测和量化。

一组典型的实时PCR曲线示于图1a中，其中荧光强度值是相对于典型PCR过程的循环数绘制的。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监视PCR产物的形成。通常在温度循环器中测量该扩增，该温度循环器包括用于在扩增反应期间测量荧光信号的部件和器件。这种温度循环器的示例是Roche Diagnostics LightCycler(目录号20110468)。扩增产物例如借助于荧光标记的杂交探针或者在某些情况下还借助于荧光染料来检测，所述荧光标记的杂交探针当它们结合到目标核酸时发射荧光信号，所述荧光染料结合到双链DNA。如图1a可见，PCR曲线包括基线区5和平稳(plateau)区6。基线区5和平稳区6之间的区域一般称为生长区。

用于分析来自PCR实验的辐射发射的典型PCR检测系统包括两个或更多滤波器，每一个所述滤波器在操作中用于隔离波长范围以用于进一步分析。例如，每个光学滤波器一般允许处于定义的波长范围中的基本所有辐射通过。然而，探针或标记物一般以部分重叠的波长带发射，并且滤波器的带通一般包括这个重叠的区域使得每个检测信道一般会接收从其他探针发射的信号。这种串扰信号倾向于影响所感兴趣的真实信号。因而，期望的是对每个检测信道中的这种串扰信号加以修正。这样做的一种传统方式是确定能够用来修正每个检测信道中的串扰信号的定量串扰系数。

在当前的串扰方法中，一般使用基本和串扰信号的平均平稳值之比来计算串扰系数；常规方法仅仅依赖于含有少于10％数据的平稳区。而且在PCR期间，平稳区信号是在化学性质处于不稳定状态时生成的。由于这个原因，基线信号阈值一般被用于目标识别。因此，常规方法使用有噪声的信号来确定具有有限信息的串扰系数，其中所述有限信息不包括来自曲线上的真实信号采集区的数据。而且，还发现在常规串扰模型中使用的不正确假设会引起作为数据采集曲线的函数的误差。因而，假如(1)存在平稳期、(2)该平稳期是平坦的以及(3)在平稳期中有最小噪声，则计算串扰系数的常规方法可能令人满意。然而，有很多数据集的情况并非如此。

因此，期望的是提供用于确定曲线(诸如S形或生长曲线以及尤其是PCR曲线)中的串扰系数的系统和方法，其克服了上述和其他问题。

发明内容

本发明提供用于确定诸如S形或生长曲线以及尤其是PCR曲线之类的曲线中的串扰系数的系统和方法。本发明还提供用于使用线性减法模型来应用串扰系数以产生串扰修正的数据集的系统和方法。

根据各个实施例，通过最小化基本信号(乘上增益以及任选地加上线性项)和串扰信号之间的差的平方和来确定串扰信号系数。已经表明这个技术优于使用基本和串扰信号的平均平稳值之比的常规技术。另外，这个技术分析整个信号采集范围上的数据以确定串扰系数。例如，可使用采集范围上的所有数据，或者可以使用整个采集范围上的部分数据。在所有信号曲线数据上进行分析提供在整个数据采集范围上更鲁棒的串扰修正。另外，常规方法假设从所有源测量的信号是线性加法模型并且所有信号在检测器之间进行解析；这是不准确的，并导致所得到信号的过修正和欠修正。本发明的技术改为使用线性减法模型，该线性减法模型克服了这个问题且更好地建模实际检测系统。这些新技术将发现其在串扰系数处于2％或更大的范围内的示例中有最大用处。

根据本发明的一个方面，提供一种确定具有至少两个光学元件的聚合酶链反应(PCR)光学检测系统的串扰系数的方法，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围。所述方法一般包括：对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集；以及同时对于每个其他光学元件在该采集范围上采集串扰数据集。所述方法一般还包括使用PCR和串扰数据集来确定串扰系数。在某些方面，采集范围包括基线区、生长区和平稳区。在某些方面，确定串扰系数包括最小化在采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和。在某些方面，对PCR数据集应用串扰系数以产生串扰修正的PCR数据集。在某些方面，线性减法模型被用来应用串扰系数。

根据本发明的另一个方面，提供一种计算机可读媒介，该计算机可读媒介包括或存储用于控制处理器来确定具有至少两个光学元件的聚合酶链反应(PCR)光学检测系统的串扰系数的代码，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围。所述代码一般包括用于执行如下操作的指令：对于每个光学元件接收在PCR生长过程的采集范围上采集的PCR数据集；以及同时对于每个其他光学元件接收在该采集范围上采集的每个滤波器的串扰数据集。该代码一般还包括用于使用PCR和串扰数据集来确定串扰系数的指令。在某些方面，所述采集范围包括基线区、生长区和平稳区。在某些方面，用于确定串扰系数的代码包括用于通过最小化在采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和来确定串扰系数的代码。

根据本发明的又一个方面，提供一种动力学聚合酶链反应(PCR)系统，其一般包括具有至少两个光学元件的光学检测模块，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，其中所述光学检测模块通常适于：对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集；以及同时对于每个其他光学元件在该采集范围上采集串扰数据集。该系统一般还包括智能模块，该智能模块适于处理所采集的PCR数据集和串扰数据集以确定串扰系数。在某些方面，所述采集范围包括基线区、生长区和平稳区。在某些方面，智能模块通过最小化在采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和来确定串扰系数。

根据本发明的再一个方面，提供一种核酸解链分析系统，其一般包括具有至少两个光学元件的光学检测模块，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围。所述光学检测模块一般适于对于每个光学元件在温度采集范围上采集解链数据集以及同时对于每个其他光学元件在该温度采集范围上采集串扰数据集。光学检测模块一般还适于通过最小化在该采集范围上的每个解链数据集和串扰数据集之间的平方和来确定串扰系数。

根据本发明的再一个方面，提供一种确定具有至少两个光学元件的光学检测系统的串扰系数的方法，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围。该方法通常包括：对于每个光学元件在生长过程的采集范围上采集第一数据集；同时对于每个其他光学元件在该采集范围上采集串扰数据集；以及使用在该采集范围上的第一数据集和串扰数据集来确定串扰系数。在某些方面，所述生长过程是PCR过程、细菌过程(bacterial process)、酶过程以及结合(binding)过程之一。

参考说明书(包括附图和权利要求书)的其余部分将意识到本发明的其他特征和优点。本发明的进一步特征和优点以及本发明各个实施例的结构和操作在下面参照附图进行详细描述。在附图中，相似的参考数字指示相同或功能类似的元件。

附图说明

图1a示出了一组典型的实时PCR曲线，其中荧光强度值是相对于典型PCR过程的循环数绘制的。

图1b示出了用于确定检测系统的串扰系数的过程，该检测系统使用两个或更多检测信道来分析PCR扩增过程。

图2示出了特定双信道情况：FAM信号以及其到双信道检测系统的HEX信道的串扰。

图3示出了两个滤波器范围中两个染料谱的重叠。

图4示出当使用常规方法测试FAM和HEX信道时24个单独的残差图，其中目标在FAM信道中而在HEX信道中没有目标。

图5示出了首尾相连(end-to-end)的图4的二十四个图。

图6示出了图4的所有二十四个图的叠加。

图7-9示出了根据本发明实施例处理的数据集的首尾相连的残差图。

图10-12示出了分别对应于图7-9所示图的叠加残差图。

图13示出了HIV化验的PCR实验的数据集，其中目标在FAM滤波器中而在HEX滤波器中没有目标。

图14示出了与图13的HIV化验对应的HEX信道的串扰数据集。

图15、16和17示出了分别使用常规方法和本发明的两个实施例的HEX信道中的串扰修正信号。

图18示出了描绘软件和硬件资源之间的关系的一般框图。

具体实施方式

本发明提供用于尤其为PCR检测系统和PCR数据集以及核酸解链数据集确定串扰系数以及用于使用该串扰系数产生串扰修正的数据集的系统和方法。本发明还提供用于使用线性减法模型应用串扰系数以产生串扰修正的数据集的系统和方法。

尽管本文档的其余部分将就本发明对PCR数据集的适用性来讨论本发明的实施例和各方面，但是应当明白本发明可应用于与其他过程有关的数据集。其他可提供类似S形或生长曲线或者可根据本发明的技术以其他方式进行处理的过程的示例包括细菌过程、解链过程、微生物生长过程、酶过程(例如酶动力学反应)以及结合过程。例如，本发明的技术还可应用于分析来自核酸解链过程和类似过程的数据。

如图1a所示，典型PCR生长曲线的数据能够例如以二维坐标系进行表示，其中PCR循环数定义x轴而所累积的多核苷酸生长的指示符定义y轴。典型地，如图1a所示，累积生长的指示符是荧光强度值，因为荧光标记物的使用也许是最广泛使用的标记方案。然而，应当理解，根据所用的特定标记和/或检测方案，可使用其他指示符。累积信号生长的其他有用指示符的示例包括发光强度、化学发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷转移、电压、电流、功率、能量、温度、粘度、光散射、放射性强度、反射率、透射率以及吸收率。循环的定义也能够包括时间、过程循环、单位工作循环以及再生循环。

一般过程概述

根据本发明，用于确定检测系统的串扰系数的过程100的一个实施例能够简单参照图1b进行描述，该检测系统使用两个或更多检测信道分析PCR扩增过程。在某些方面，PCR检测系统包括用于分析来自PCR实验的辐射发射的检测器。该检测系统包括两个或更多光学元件，每个所述光学元件在操作中用于隔离波长范围以进行进一步分析。这些光学元件通常被选择成匹配PCR扩增过程中所用的荧光探针或标记物的发射特性，例如隔离在特定染料的发射带内的辐射。例如，在某些方面，所述光学元件包括一个或多个允许处于定义的波长范围内的基本所有辐射都通过的光学滤波器。其他光学元件可能包括衍射光栅。每个光学元件定义检测信道，例如由检测器元件接收的波长范围。

在本发明的示例性实施例中，可通过使用常规的个人计算机系统来实施该方法，该个人计算机系统包括但不限于：用于输入数据集的输入装置，诸如键盘、鼠标等；用于表示曲线区域中感兴趣的特定点的显示装置，诸如监视器；执行该方法中的每个步骤所需的处理装置，诸如CPU；诸如调制解调器的网络接口、用于存储数据集的数据存储装置、运行在处理器上的计算机代码等等。而且，该方法还可被实施于PCR装置中。

在步骤110中，对于每个检测信道，接收或以其他方式采集代表一个或多个PCR曲线的实验数据集。在某些方面，在检测系统的整个采集范围上例如在基线区、过渡区和平稳区上采集数据。绘制的PCR数据集(一个或多个PCR数据曲线集)的示例示于图2A中，其中y轴和x轴分别代表PCR曲线的荧光强度和循环数。在某些方面，数据集应当包括沿轴等距隔开的数据。然而，可能存在一个或多个缺失的数据点。在步骤120中，对于每个其他信道，在采集范围上与步骤110同时地采集串扰数据集。串扰数据集的示例示于图2B中。在步骤130中，处理数据集以确定串扰系数，这将在下面进行更详细的描述。在某些方面，每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和被最小化，这将在下面进行描述。在其他方面，最小化PCR数据集和串扰数据集之间的差的绝对值之和。

在过程100被实施在驻留于PCR数据采集装置(诸如温度循环器)中的智能模块(例如执行指令的处理器)中的情况下，可在数据被收集时将数据集实时地提供给智能模块，或者数据集可被存储在存储器单元或缓冲器中并且在完成了实验之后将其提供到智能模块。类似地，数据集可经由到采集装置的直接连接(例如，USB或其他直接有线或无线连接)或网络连接(例如，LAN、VPN、内联网、因特网等)而被提供给分离的系统(诸如桌上型计算机系统或其他计算机系统)，或者可以在便携式媒介(诸如CD、DVD、软盘等)上提供数据集。

图18示出了解释软件和硬件资源之间的关系的一般框图。该系统包括动力学PCR分析模块和作为计算机系统的一部分的智能模块，该动力学PCR分析模块可位于温度循环器装置中。数据集(PCR数据集)经由网络连接或直接连接而从分析模块传送到智能模块，反之亦然。数据集由运行在处理器上且存储在智能模块的存储装置上的计算机代码根据图1b所显示的方法进行处理并且在处理之后被传送回到分析模块的存储装置，其中修改后的数据可显示在显示装置上。

在某些方面，数据集包括具有一对坐标值(或二维向量)的数据点。对于PCR数据，这对坐标值一般代表循环数和荧光强度值。

在步骤130中确定了串扰系数之后，在步骤140中所确定的串扰系数可被应用于原始或新的PCR数据集以产生串扰修正的数据集。在步骤150中，串扰系数和/或串扰修正的PCR数据集或其他数据可被存储到存储器单元、例如通过网络连接或经由便携式存储媒介而提供到不同系统，或者显示在显示装置(诸如监视器或打印机)上。

串扰系数确定

在常规串扰模型中，一般如下所述地计算串扰系数：

假设单个样本含有两种具有独特但重叠光谱的可见染料。检测系统由两个独特的光谱滤波器组成，每个滤波器让大约95％的一个染料光谱和大约5％的另一个染料光谱通过。每个滤波器一般被优化成使来自仅仅一种染料的光通过。由每个滤波器通过的光分别视为信道一和信道二。

(1)取信道1和2的平稳信号区中的五个数据点的平均：

PLAvg1＝平均(五个点平稳信道1)

PLAvg2＝平均(五个点平稳信道2)

(2)计算样本的串扰系数：

XT-染料2-信道1＝PLAvg2/PLAvg1

(3)现在将样本大小增加到96微井板(microwell plate)并对信道1-＞信道2计算XT：

XT(1-＞2)＝平均(XT1，XT2，...，XT96)

假如(1)存在平稳期、(2)该平稳期是平坦的以及(3)在平稳期中有最小噪声，则这个计算串扰的常规方法是令人满意的。然而，有很多数据集的情况并非如此。

根据本发明的各个实施例，提供用于提高串扰系数的计算精度的方法。根据某些方面，通过使用类似于线性回归的优化技术来确定串扰系数。将“Signal”定义为基本信号以及把“XTSignal”定义为串扰信号、下标i定义为循环数、q定义为乘性增益、r和s定义为偏移和斜率，能够通过以下方程描述三个示例性实施例：

(1)使用简单增益“q”来最小化每个荧光信号和串扰信号之间的平方和，如下面方程(1)所示。

min[∑_i(XTSignal_i-q*Signal_i)²]                            (1)

(2)使用共同的偏移“r”和斜率“s”但单独的简单增益“q”来最小化每个荧光信号和串扰信号之间的平方和，如下面方程(2)所示。这将产生每个信道的串扰系数和所有信道的共同线性项。

$\min \left[{\mathrm{\Σ}}_i\left[\begin{array}{c}{({\mathrm{XTSignal}1}_i-(r+s*i+q1*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+{({\mathrm{XTSignal}2}_i-(r+s*i+q2*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+\\ {({\mathrm{XTSignal}3}_i-(r+s*i+q3*{\mathrm{Signal}}_i))}^2\end{array}\right]\right]---\left(2\right)$

(3)使用偏移“r”、斜率“s”和简单增益“q”来最小化每个荧光信号和串扰信号之间的平方和，如下面方程(3)所示。这将产生每个信道的串扰系数和线性项。

min[∑_i(XTSignal_i-(r+s*i+q*Signal_i))²]                    (3)

在其他方面，最小化PCR数据集和串扰数据集之间的差的绝对值之和。可使用其他最小化方法，诸如例如Levenberg-Marquardt方法、线性规划方法、Nelder-Mead方法、梯度下降法、次梯度法、单纯形法、椭圆法、捆集法、牛顿法、拟牛顿法、内点方法以及其他对本领域技术人员显而易见的方法。

这些各个实施例的一个优点在于整个信号采集范围上的数据被用来确定串扰系数。例如，可使用采集范围上的所有数据，或者可使用整个采集范围上的部分数据。这提供平均掉(average out)系统数据采集误差的串扰系数。相比而言，常规方法仅仅依赖于含有少于10％数据的平稳区。本发明的实施例还为诸如PCR的化验提供额外的优点。在PCR期间，平稳区信号是在消耗了大多数探针时生成的。由于这个原因，基线信号阈值一般被用于目标识别。因此，常规方法使用有噪声的信号来确定具有有限信息的串扰系数，所述有限信息不包括来自曲线上的真实信号采集点的数据。而且，还发现在常规串扰模型中使用的不正确假设会引起作为数据采集曲线的函数的误差。将整个曲线用于串扰计算去除了这些错误假设中的一些。正确模型的进一步使用实际上还消除了串扰修正误差。

根据某些方面，在确定串扰系数之前对代表所有信号(基本信号和串扰信号)的数据集执行背景和/或基线相减。背景相减一般是通过减去每个信道特有的缓冲信号而完成的。基线相减一般是通过定义基线(例如，斜率和截距)并从所有信号值(基本信号和串扰信号)中减去这个基线而完成的。能够通过指定基线开始和终止值并在这些端点之间执行线性回归或者通过对函数(诸如双S形函数)进行曲线拟合并将来自这个函数的斜率和截距参数用作基线来定义该基线。

在某些方面，确定基线包括对定义的基线开始位置和基线终止位置之间的数据集执行线性回归。在其他方面，确定基线包括曲线拟合双S形函数以识别斜率和截距值。

在特定方面，该方法可包括在确定串扰系数之前从PCR数据集(信号)和串扰数据集中的一个或多个中去除异常点或“尖峰”。题为“Levernberg Margquardt Outlier Spike Removal Method”的美国专利申请序列号11/316,315和题为“PCR Elbow Determination By Use ofa Double Sigmoid Function Curve Fit With the Levenberg-MarquardtAlgorithm and Normalization”的美国专利申请序列号11/349,550公开了用于拟合双S形函数以确定PCR曲线的斜率和截距参数(以及其他参数)以及还用于识别和去除PCR数据集中的异常点或“尖峰”的这种技术。

在该方法的某些方面，光学元件包括一个或多个滤波器，每个滤波器允许不同特定波长范围的光通过。在特定的实施例中，该系统包括至少四个滤波器。

在其他方面，该方法包括显示或输出所确定的串扰系数和/或将所确定的串扰系数存储到存储器模块以便稍后用于产生串扰修正的数据集。

本发明还涉及计算机可读媒介，所述计算机可读媒介包括用于控制处理器以确定具有至少两个光学元件的聚合酶链反应(PCR)光学检测系统的串扰系数的代码，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，所述代码包括用于执行如下操作的指令：对于每个光学元件接收在PCR生长过程的采集范围上采集的PCR数据集，所述采集范围包括基线区、生长区和平稳区；同时对于每个其他光学元件接收在所述采集范围上采集的每个滤波器的串扰数据集；以及使用所述采集范围上的PCR和串扰数据集来确定串扰系数。在某些方面，所述光学元件包括一个或多个光学滤波器，每个所述滤波器允许不同特定波长范围的光通过。

在计算机可读媒介的另一方面，所述数据采集范围代表多个PCR循环，其中确定串扰系数包括最小化在该采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和。

在特定的实施例中，最小化平方和包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-q*Signal_i)²]，

其中i是PCR循环数，其中Signali是光学元件的PCR数据集，其中XTSignali是光学元件的串扰数据集，且其中q是乘性增益因子。

在其他实施例中，最小化平方和包括使用以下形式的方程：

$\min \left[{\mathrm{\Σ}}_i\left[\begin{array}{c}{({\mathrm{XTSignal}1}_i-(r+s*i+q1*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+{({\mathrm{XTSignal}2}_i-(r+s*i+q2*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+\\ {({\mathrm{XTSignal}3}_i-(r+s*i+q3*{\mathrm{Signal}}_i))}^2\end{array}\right]\right]$

其中i是PCR循环数，其中Signali是光学元件的PCR数据集，其中XTSignali是光学元件的串扰数据集，其中r是共同偏移，其中s是共同斜率，且其中q1、q2和q3是乘性增益因子。

在又一个实施例中，最小化平方和包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-(r+s*i+q*Signal_i))²]，

其中i是PCR循环数，其中Signali是光学元件的PCR数据集，其中XTSignali是光学元件的串扰数据集，其中r是偏移，其中s是斜率，且其中q是乘性增益因子。

在某些方面，所述代码还包括执行如下操作的指令：确定每个PCR数据集和每个串扰数据集的基线；以及在确定串扰系数之前从每个数据集中减去相应的基线。在这里，用于确定基线的指令可包括用于对定义的基线开始位置和基线终止位置之间的数据集执行线性回归的指令。在另一方面，用于确定基线的指令可包括用于曲线拟合双S形函数以识别斜率和截距值的指令。

在其他方面，所述代码还包括用于在确定串扰系数之前从PCR数据集和串扰数据集中的一个或多个中去除异常点的指令。所述代码还可包括用于显示或输出所确定的串扰系数的指令。在其他实施例中，所述代码还可以包括用于将所确定的串扰系数存储到存储器模块以便稍后用于产生串扰修正的数据集的指令。

所述代码还可包括用于使用线性减法模型对PCR数据集应用所确定的串扰系数以产生串扰修正的数据集的指令。在这里，线性减法模型可包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，且其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数。

在另一方面，线性减法模型可包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r+s*i)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数，且其中r和s分别是为所有信道(i)共有的增益和线性项。

在又一方面，线性减法模型可包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r_i+s_i*i)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数，且其中r_i和s_i分别是对每个信道(i)均不同的增益和线性项。

本发明还涉及动力学聚合酶链反应(PCR)系统，其包括：具有至少两个光学元件的光学检测模块，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，其中所述光学检测模块适于：对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集，所述采集范围包括基线区、生长区和平稳区；和同时对于每个其他光学元件在所述采集范围上采集串扰数据集；以及智能模块，适于处理所采集的PCR数据集和串扰数据集以使用在采集范围上的每个PCR和串扰数据集来确定串扰系数。在该系统的某些方面，数据采集范围代表多个PCR循环并且智能模块通过最小化在采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的平方和来确定串扰系数。最小化平方和可包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-q*Signal_i)²]，

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，且其中q是乘性增益因子。

在其他实施例中，最小化平方和可包括使用以下形式的方程：

$\min \left[{\mathrm{\Σ}}_i\left[\begin{array}{c}{({\mathrm{XTSignal}1}_i-(r+s*i+q1*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+{({\mathrm{XTSignal}2}_i-(r+s*i+q2*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+\\ {({\mathrm{XTSignal}3}_i-(r+s*i+q3*{\mathrm{Signal}}_i))}^2\end{array}\right]\right]$

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，其中r是共同偏移，其中s是共同斜率，且其中q1、q2和q3是乘性增益因子。

在又其他实施例中，最小化平方和包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-(r+s*i+q*Signal_i))²]，

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，其中r是偏移，其中s是斜率，且其中q是乘性增益因子。

在该系统内，智能模块还可适于确定每个PCR数据集和每个串扰数据集的基线并且在确定串扰系数之前从每个数据集中减去相应的基线。在特定的实施例中，智能模块通过对定义的基线开始位置和基线终止位置之间的数据集执行线性回归来确定基线。在另一特定的实施例中，智能模块通过曲线拟合双S形函数以识别斜率和截距值来确定基线。

在该系统的某些实施例中，智能模块还适于在确定串扰系数之前从PCR数据集和串扰数据集中的一个或多个中去除异常点。在该系统的其他实施例中，所述光学元件包括一个或多个滤波器，每个滤波器允许不同特定波长范围的光通过。

在该系统内，智能模块还可适于使用线性减法模型对PCR数据集应用所确定的串扰系数以产生串扰修正的数据集。在某些实施例中，线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，且其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数。在另一实施例中，线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r+s*i)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数，且其中r和s分别是为所有信道(i)共有的增益和线性项。在又一实施例中，线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r_i+s_i*i)$

其中f_i是信道(i)中所测量的信号以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道(j)到信道(i)的串扰系数，且其中r_i和s_i分别是对每个信道(i)均不同的增益和线性项。

该系统在某些方面还可包括显示模块，其中智能模块还适于向显示模块提供数据以显示所确定的串扰系数或串扰修正的PCR数据集中的一个。在特定实施例中，该系统还可包括存储器模块，其中智能模块还适于将所确定的串扰系数存储到存储器模块以便稍后用于产生串扰修正的数据集。

使用HPV校准化验(calibration assay)的示例

考虑具体双信道情形：如图2A和2B所示的HPV校准化验中的FAM信号及其到HEX信道中的串扰。FAM和HEX是具有不同激发和发射特性的众所周知的荧光染料。图2A和2B中的信号几乎是理想的，因为存在清晰的带有很少噪声的平坦平稳期。因而，可预期串扰系数几乎等于用常规方法和方程(1)-(3)的方法所计算的串扰系数。

使用确定串扰系数的常规方法的分析

取来自串扰数据的平稳区中的五个点的平均并除以来自纯信号的平稳区中的五个点的平均。串扰系数于是被定义为热循环器中的所有井(well)的串扰系数的平均值。该结果为(经由

码示出)：

TableMean＝0*Range[24]；

For[j＝1，j≤24，j++，

 TableMean[[j]]＝Mean[Table[FC1[[60+i，j]]，{i，50，55}]]/

    Mean[Table[FC1[[i，j]]，{i，50，55}]]；

]

TableMean

{0.0173338，0.0171016，0.016073，0.015443，0.0165934，0.0181777，0.0170146，0.0155421，0.0166653，0.0145379，0.0150514，0.014366，0.0160809，0.0152727，0.0147269，0.0134197，0.0135746，0.0133044，0.0158858，0.0163226，0.0159318，0.0148446，0.0139202，0.0146015}

MTM＝Mean[TableMean]

0.0154911

因而，在这个示例中，FAM到HEX串扰系数被确定为0.01549。对于方程(1)-(3)的方法，FAM到HEX串扰系数的总结示于下面表1中：

表1

计算方法	串扰系数	偏移	线性项
				现有的	0.01549	--	--
方程1	0.01572	--	--
				方程2	0.01470	0.03947	-0.00011043
方程3	0.01433	0.03132	0.00040327

方程1也许与常规方法最类似，它产生几乎相同的串扰系数，而方程2和3则不同，因为它们包括线性项。

串扰矩阵的比较：常规方法和方程(1)

考虑具体四信道情形：比较HPV校准化验中的FAM、HEX、JA270和CY5.5的所有串扰系数是有益的。下面表2示出了使用常规方法计算的串扰系数，而在表3中示出了使用方程(1)-(3)计算的系数。方程(1)不使用对角线元素(a₁₁，a₂₂，a₃₃，a₄₄)，所以这些单元被标为“-”。如上面针对这个包含带有很少噪声的清晰的平坦平稳期的HPV校准集所讨论的，预期这两个串扰系数集几乎相同。

表2：现有串扰矩阵：

表3：使用方程1计算的串扰矩阵：

因而，在这个特定示例中，应用常规方法与方程(1)-(3)的方法的任何差别是由于串扰系数的数学应用而不是系数本身。然而，应当注意，存在其中当将当前方法与方程(1)-(3)相比较时串扰系数大不相同的许多示例。

应用串扰系数来产生串扰修正的数据

应用串扰系数的常规方法假设下面方程(4)所示的加法线性模型：

f₁＝a₁₁c₁+a₁₂c₂+a₁₃c₃+a₁₄c₄

f₂＝a₂₁c₁+a₂₂c₂+a₂₃c₃+a₂₄c₄

f₃＝a₃₁c₁+a₃₂c₂+a₃₃c₃+a₃₄c₄

f₄＝a₄₁c₁+a₄₂c₂+a₄₃c₃+a₄₄c₄

                                    (4)

其中f_i是所测量的信号，c_i是荧光染料信号，以及a_IJ是从信道J到信道I的串扰。

这些串扰系数还具有如下属性：

$\underset{I}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{IJ}}=1---\left(5\right)$

方程组(4)能够通过矩阵求逆来求解以得到染料信号c_i，染料信号c_i被定义为串扰修正的信号。这个方法的一个问题在于它假设来自信道J的所有信号在信道(1，2，3，4)之间解析(parse)。一般而言这不正确。

根据一个实施例，使用减法线性模型来应用串扰系数以产生串扰修正的数据集。方程(1)的线性减法模型示于下面方程(6)中：

f_1C＝f₁-(a₁₂f₂+a₁₃f₃+a₁₄f₄)

f_2C＝f₂-(a₂₁f₁+a₂₃f₃+a₂₄f₄)

                                        (6)

f_3C＝f₃-(a₃₁f₁+a₃₂f₂+a₃₄f₄)

f_4C＝f₄-(a₄₁f₁+a₄₂f₂+a₄₃f₃)

其中f_i是信道(i)中所测量的荧光以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号。系数a_IJ表示从信道(J)到信道(I)的串扰系数。这个模型不对基本信号在不同信道之间解析做出假设。

方程(2)的线性减法模型示于下面方程(7)中：

f_1C＝f₁-(a₁₂f₂+a₁₃f₃+a₁₄f₄)-(r+s*i)

f_2C＝f₂-(a₂₁f₁+a₂₃f₃+a₂₄f₄)-(r+s*i)

                                        (7)

f_3C＝f₃-(a₃₁f₁+a₃₂f₂+a₃₄f₄)-(r+s*i)

f_4C＝f₄-(a₄₁f₁+a₄₂f₂+a₄₃f₃)-(r+s*i)

其中f_i是信道(i)中所测量的荧光以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号。系数a_IJ表示从信道(J)到信道(I)的串扰系数。方程(7)使用为所有信道共有的增益和线性项r和s。

方程(3)的线性减法模型示于下面方程(8)中：

f_1C＝f₁-(a₁₂f₂+a₁₃f₃+a₁₄f₄)-(r₁+s₁*i)

f_2C＝f₂-(a₂₁f₁+a₂₃f₃+a₂₄f₄)-(r₂+s₂*i)

                                        (8)

f_3C＝f₃-(a₃₁f₁+a₃₂f₂+a₃₄f₄)-(r₃+s₃*i)

f_4C＝f₄-(a₄₁f₁+a₄₂f₂+a₄₃f₃)-(r₄+s₄*i)

其中f_i是信道(i)中所测量的荧光以及f_iC是信道(i)中串扰修正的信号。系数a_IJ表示从信道(J)到信道(I)的串扰系数。方程(8)使用在每个信道中都不同的增益和线性项r和s。

还要注意，这些串扰修正信号的计算有利地不要求矩阵求逆。而且，在某些方面，方程(6)-方程(8)可通过首先从基本信号和串扰信号中减去背景或基线来修改。

双染料情况下的串扰应用的比较

考虑图3所示的染料光谱，其中光谱10代表染料1(FAM)而光谱20代表染料2(HEX)。期望的是去除由FAM和HEX染料中的重叠区所代表的串扰。

在常规方法中，对于如滤波器1内所观测的FAM和如滤波器2内所观测的HEX的串扰修正信号，求解上面的方程(4)和(5)分别给出了下面方程(9)和(10)所示的结果。

$c_1=\frac{f_1(1-a_{12})-a_{12}{f}_2}{1-a_{12}-a_{21}}---\left(9\right)$

$c_2=\frac{f_2(1-a_{21})-a_{21}{f}_1}{1-a_{12}-a_{21}}---\left(10\right)$

使用方程(1)针对这个系统的串扰修正信号被给出为下面的方程(11)和(12)：

f_1C＝f₁-a₁₂f₂                        (11)

f_2C＝f₂-a₂₁f₁                        (12)

方程(11)克服了与方程(9)相关联的两个问题，即对f₁的乘数(1-a₁₂)(其造成串扰过补偿)不再存在，且不正确的分母不再存在。

常规方法与新方法针对HPV数据集的比较

使用现有方法和方程(1)-(3)来测试只有FAM和HEX信道的HPV数据集。这个数据在FAM信道中含有目标而在HEX信道中不含有目标。这些方法被应用于HEX信道中的串扰信号并且所得到的残差图被检查。理想地，这些残差将以零截距为中心，其中斜率为零。

a)使用常规方法的残差图

图4示出了24个单独的残差图，而图5示出了首尾相连的这二十四个图。图6示出了所有二十四个图的叠加。在最优的修正中，将预期这些残差以x轴为中心，其中斜率和截距为零。然而在图4中，大多数图表明这些残差从循环1到循环60显著降低，指示非最优的串扰实施。

在观测图6(图4的所有二十四个图的叠加)时，显然可见当使用常规串扰方法时存在从循环1到循环60的明显下降趋势。

b)使用方程(1)-(3)的残差图

图7-9分别示出了方程(1)-(3)的首尾相连的残差图。类似地，图10-12示出了方程(1)-(3)的叠加的残差图。比较图6和图10-12，显而易见，使用本发明技术的残差范围有利地小于常规方法。另外，使用本发明的技术，叠加图的趋势线具有更接近零目标的斜率和截距。在这个示例中，FAM和HEX串扰大约为2％。因而，这些图示出了更优的修正，指示本发明技术的鲁棒性。在存在更多染料并且串扰处于2-20％的范围内的示例中本发明技术的优越性将更加明显。

常规方法与新方法针对HIV数据集的比较

图13和14分别对于FAM和HEX滤波器示出了其中目标在FAM滤波器中且在HEX滤波器中没有目标的HIV化验的PCR实验。使用图13和14中的数据，对于常规方法和方程(1)，FAM-＞HEX串扰的串扰系数(a₂₁)被计算为a₂₁＝0.051。

图15、16和17分别示出了使用常规方法、方程(1)和方程(3)的HEX信道中的串扰修正信号。可以看出，使用后两种方法中的任一种大大地减少了信号的过修正。

应当明白，本文描述的包括串扰修正过程的串扰系数确定过程可以以运行在计算机系统的处理器上的计算机代码来实施。该代码包括用于控制处理器以实施该过程的各个方面和步骤的指令。所述代码一般被存储在硬盘、RAM或诸如CD、DVD等的便携式媒介上。类似地，这些过程可以在诸如温度循环器的PCR装置中实施，所述PCR装置包括执行存储在耦合到处理器的存储器单元中的指令的处理器。包括这种指令的代码可通过到代码源的网络连接或直接连接或者使用众所周知的便携式媒介而被下载到PCR装置存储器单元。

本领域技术人员应当明白，本发明的串扰系数确定和串扰修正过程能够使用各种编程语言(诸如C、C++、C#、Fortran、VisualBasic等以及诸如

的应用程序(其提供对数据可视化和分析有用的预封装例程、功能和过程))来编码。后者的另一示例是。

虽然经由示例以及就特定实施例描述了本发明，但是要理解，本发明不限于所公开的实施例。相反，旨在覆盖对本领域技术人员显而易见的各种修改和类似布置。因此，所附权利要求书的范围应当被给予最宽泛的解释以便涵盖所有这样的修改和类似布置。

Claims (15)

1.一种确定具有至少两个光学元件的聚合酶链反应(PCR)光学检测系统的串扰系数的方法，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，所述方法包括：

-对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集；

-同时对于每个其他光学元件采集由在至少两个滤波器范围中的至少两个染料光谱的重叠所产生的串扰数据集，所述串扰数据集是在所述采集范围上采集的；以及

-使用所述采集范围上的PCR数据集和串扰数据集来确定串扰系数，

其中确定串扰系数包括最小化在所述采集范围上的所述PCR数据集和串扰数据集之间的差的平方和。

2.权利要求1的方法，其中数据采集范围代表多个PCR循环，且其中确定串扰系数包括最小化在所述采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的差的平方和。

3.权利要求1或2的方法，其中最小化平方和包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-q*Signal_i)²]，

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，且其中q是乘性增益因子。

4.权利要求1或2的方法，其中最小化平方和包括使用以下形式的方程：

$\min \left[{\mathrm{\Σ}}_i\left[\begin{array}{c}{(\mathrm{CTSignal}{1}_i-(r+s*i+q1*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+{(\mathrm{XTSignal}{2}_i-(r+s*i+q2*{\mathrm{Signal}}_i))}^2+\\ {(\mathrm{XTSignal}{3}_i-(r+s*i+q3*{\mathrm{Signal}}_i))}^2\end{array}\right]\right]$

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，其中r是共同偏移，其中s是共同斜率，且其中q1、q2和q3是乘性增益因子。

5.权利要求1或2的方法，其中最小化平方和包括使用以下形式的方程：

min[∑_i(XTSignal_i-(r+s*i+q*Signal_i))²]，

其中i是PCR循环数，其中Signal_i是光学元件的PCR数据集，其中XTSignal_i是光学元件的串扰数据集，其中r是偏移，其中s是斜率，且其中q是乘性增益因子。

6.权利要求1的方法，还包括：

-确定每个PCR数据集和每个串扰数据集的基线；以及

-在确定串扰系数之前从每个数据集中减去相应的基线。

7.权利要求1的方法，还包括：

-使用线性减法模型对PCR数据集应用所确定的串扰系数以产生串扰修正的数据集。

8.权利要求7的方法，其中线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)$

其中f_i是信道i中所测量的信号以及f_iC是信道i中串扰修正的信号，且其中系数a_ij表示从信道j到信道i的串扰系数。

9.权利要求7的方法，其中线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r+s*i)$

其中f_i是信道i中所测量的信号以及f_iC是信道i中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道j到信道i的串扰系数，且其中r和s分别是为所有信道i共有的增益和线性项。

10.权利要求7的方法，其中线性减法模型包括以下形式的方程：

$f_{\mathrm{iC}}=f_i-\left(\underset{j\≠i}{\mathrm{\Σ}}{a}_{\mathrm{ij}}{f}_j\right)-(r_i+s_i*i)$

其中f_i是信道i中所测量的信号以及f_iC是信道i中串扰修正的信号，其中系数a_ij表示从信道j到信道i的串扰系数，且其中r_i和s_i分别是对每个信道i均不同的增益和线性项。

11.一种用于确定具有至少两个光学元件的聚合酶链反应(PCR)光学检测系统的串扰系数的设备，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，所述设备包括：

-用于对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集的装置；

-用于同时对于每个其他光学元件采集由在至少两个滤波器范围中的至少两个染料光谱的重叠所产生的串扰数据集的装置，所述串扰数据集是在所述采集范围上采集的；以及

-用于使用所述采集范围上的PCR数据集和串扰数据集来确定串扰系数的装置，

其中用于确定串扰系数的装置包括用于最小化在所述采集范围上的所述PCR数据集和串扰数据集之间的差的平方和的装置。

12.一种动力学聚合酶链反应(PCR)系统，包括：

-具有至少两个光学元件的光学检测模块，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，其中所述光学检测模块适于：

-对于每个光学元件在PCR生长过程的采集范围上采集PCR数据集，所述采集范围包括基线区、生长区和平稳区；和

-同时对于每个其他光学元件采集由在至少两个滤波器范围中的至少两个染料光谱的重叠所产生的串扰数据集，所述串扰数据集是在所述采集范围上采集的；以及

-智能模块，适于处理所采集的PCR数据集和串扰数据集以使用在所述采集范围上的PCR数据集和串扰数据集来确定串扰系数，

其中该智能模块通过最小化在所述采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的差的平方和来确定串扰系数。

13.一种核酸解链分析系统，包括：

-具有至少两个光学元件的光学检测模块，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，其中所述光学检测模块适于：

-对于每个光学元件在温度采集范围上采集解链数据集，以及同时对于每个其他光学元件采集由在至少两个滤波器范围中的至少两个染料光谱的重叠所产生的串扰数据集，所述串扰数据集是在所述温度采集范围上采集的；以及

-通过最小化在所述采集范围上的每个解链数据集和串扰数据集之间的差的平方和来确定串扰系数。

14.一种确定具有至少两个光学元件的光学检测系统的串扰系数的方法，每个光学元件在操作中用于隔离不同的特定电磁波长范围，该方法包括：

-对于每个光学元件在生长过程的采集范围上采集第一数据集；

-同时对于每个其他光学元件采集由在至少两个滤波器范围中的至少两个染料光谱的重叠所产生的串扰数据集，所述串扰数据集是在所述采集范围上采集的；以及

-使用在所述采集范围上的所述第一数据集和串扰数据集来确定串扰系数，

其中确定串扰系数包括最小化在所述采集范围上的PCR数据集和串扰数据集之间的差的平方和。

15.权利要求14的方法，其中该数据采集范围代表多个PCR循环，且其中确定串扰系数包括最小化在采集范围上的每个PCR数据集和串扰数据集之间的差的绝对值之和。

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