JP2015225032A - 核酸増幅分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、測定対象とする試料について、2次元グラフの第1の軸を核酸増幅産物についての測定値、第2の軸を核酸増幅反応の進捗を示す値とする核酸増幅反応曲線を取得する測定部と、正常な核酸増幅反応曲線と測定した核酸増幅反応曲線を比較する比較部と、比較結果に基づいて、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常か否か判定する判定部とを有する核酸増幅分析装置を提供する。
【選択図】図6A
Description
法は、標的とする核酸を含む反応液に対して温度変化(温度サイクル)を繰り返し、特定の塩基配列を選択的に増幅させる方法である。一般的なPCR法は、(1)熱変性、(2)アニー
リング、(3)伸長の3ステップを1サイクルとし、各ステップを試薬指定の温度で制御する
ことにより、鋳型となるDNAを2倍に増幅させる。サイクルを繰り返すことで、鋳型となるDNAが指数関数的に増幅することができる。
して、リアルタイムPCRがある。従来のリアルタイムPCR装置は、複数の反応液に対して、同時に同じ温度サイクルを開始して鋳型となるDNAを増幅する。
、一定時間毎に行う。このため、X軸にサイクル数、Y軸に蛍光強度をプロットすると、不連続な散布図が得られる。
近似させる方法が提案されている(特許文献1)。
どがあった時、核酸増幅反応曲線の変化量は、正常な反応と比べ小さくなる。このような異常な核酸増幅反応曲線であっても、特許文献1に記載のダブルシグモイド式に近似する
ことができればCt値を求めることができる。ただし、求められたCt値は正確でない可能性が残る。また、従来手法では、核酸増幅反応曲線のプラトー値やCt値から増幅の有無を判定することができたとしても、正常な核酸増幅反応曲線か否かを判定することはできなかった。
、後述する形態例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
図1に、核酸増幅分析装置100の概略構成を示す。サンプル容器101には、核酸を含む検体が収容される。サンプル容器ラック102には、複数のサンプル容器101が収容される。試薬容器103には、検体に加える試薬が収納される。試薬容器ラック104には、複数の試薬容器103が収容される。反応容器105は、検体と試薬の混合に使用される。反応容器ラック106には、複数の反応容器105が収容される。反応液調整部107は、サンプル容器101から吸引した検体と試薬容器103から吸引した試薬を反応容器105に吐出して混合し、反応液を調整する。密閉ユニット108は、反応容器105の密閉に使用される。攪拌ユニット109は、密閉された反応容器105に収納された反応液の攪拌に使用される。
置される。ロボットアームY軸111は、ロボットアームX軸110の駆動によりX軸方向
に移動される。ロボットアームY軸111上には、ロボットアームY軸の駆動によりY軸方
向に移動されるグリッパユニット112が配置される。グリッパユニット112は、反応容器105を掴み、装置内の各部に搬送する。また、ロボットアームY軸111上には、
ロボットアームY軸の駆動によりY軸方向へ移動することができる分注ユニット113が配置される。分注ユニット113は、サンプル容器101に収納された検体や試薬容器103に収納された試薬を吸引し、反応液調整部107に架設された反応容器105に吐出する。
図2に、異常な核酸増幅反応曲線の検出処理手順の概要を示す。制御部121は、まずキャリブレータやポジティブコントロール等を含む試料をPCR測定し、核酸増幅反応曲線
を取得する(ステップ201)。次に、制御部121は、測定により得た核酸増幅反応曲線をシグモイド式に近似する処理を行い、近似(フィッティング)の可否を判定する(ステップ202)。制御部121は、近似可の場合にはステップ203に進み、近似不可の場合にはステップ209に進む。
る。もっとも、核酸増幅法は、PCR法に限定されない。例えばLAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法などの恒温核酸増幅方法も適用することができる。
を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達するサイクル数をCt値と定義する。恒温核酸増幅法では、増幅産物に基づく規定の測定値を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達する反応時間をCt値に対応する概念として定義する。従って、本明細書においては、「核酸増幅反応の進捗を示す値」を、増幅産物の一定量を閾値として用いるときに、当該閾値に測定値が達するサイクル数または反応時間を意味する。
反応によって合成された二本鎖DNAを結合させ、励起光の照射により生じる蛍光強度を測
定することにより、増幅産物の生成量に基づく蛍光量をモニタする方法である。一方、蛍光標識プローブ法の一例として、5’末端を蛍光物質で、3’末端をクエンチャー物質で修飾したTaqManプローブと核酸増幅反応によって合成された二本鎖DNAを結合させ、励起光
の照射により生じる蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量に基づく蛍光量をモニタする方法がある。
以上のように、如何なる核酸増幅法であっても、所定の間隔で核酸増幅産物から発せられる蛍光量や濁度変化、散乱光量等を検出することにより、X軸を増幅反応の進捗を示す
値(サイクル数又は反応時間)、Y軸を増幅産物の検出値(蛍光強度、濁度変化、散乱強
度等)とする核酸増幅反応曲線を作成することができる。
より行い、式(1)から得られる計算値F(Xi)と実測値Yi(i:サイクル数又は反応時間)と
の差の二乗和Zi 2(式(2))が所定値以下になるまで非線形最小二乗法(準ニュートン)
処理を繰り返し、上記パラメータの最適値を決定する。
行列J(5行i列)を、次の式(3)により定義する。iは増幅反応の進捗を示す値(サイクル数又は反応時間)である。(δZ/δB)1,(δZ/δa)1,(δZ/δb)1,(δZ/δc)1,(δZ/δK)1は、Ziにi=1を代入し、変数B, a, b, c ,Kで偏微分する意味である。
式(4)を変形し、ΔB,Δa,Δb,Δc,ΔKを計算する。
ここで、Jtは行列Jの配置行列であり、(Jt *J)-1は(Jt *J)の逆行列である。制御部121は、以上のステップIIとステップIIIを、式(2)の残差二乗和Zi 2が設定値以下にな
るまで反復する。
イド式を利用することも可能である。
であり、各パラメータの値は表2の通りである。
を2階微分(式(7))して核酸増幅反応曲線301の変曲点を求める。式(7)中の変数B,K,a,b,cは表2に従う。
。2分法より、F’’(26)>0, F’’(27)<0である。このため、F’’(X) = 0となるXは、26 < X <27の範囲にある。よって、本実施例では、F’’(26) ≒ 0とし、X=26を変曲点とする。本実施例とは別に、ニュートン近似を適用し、F’’(X) ≒ 0を算出すること
も可能である。
121は、この値を、正常な核酸増幅反応曲線301の変曲点における傾きとする。図5に、式(8)により表される核酸増幅反応曲線301を1階微分したグラフ501を示す。
ティブコントロール核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きの基準値(S)とし、他の試薬
情報と共に試薬ボトルに貼り付けられるバーコードに登録する。なお、登録先はバーコードに限らず、試薬ボトルに張り付けられるICタグ等のメモリに登録しても良い。因みに、傾きの基準値は、同じメーカの同一検査項目の試薬でも、試薬ロット(Lot)により変
わる可能性がある。このバーコード等に判定式の基準値が登録されているので、いずれの核酸増幅分析装置においても、測定された核酸増幅反応曲線が正常か否かの判定を行うことが可能となる。
されたプラトー値302は、基準とする核酸増幅反応曲線のプラトー値(P)として試薬バ
ーコード等に登録することができる。本実施例では、次の式(9)からプラトー値(P) = 1.0とした。
コードに登録することができる。
次に、対象試料について測定された核酸増幅反応曲線が異常か否かを検出する動作について説明する。前述したように、図2に示すフローチャートには、(1)試薬バーコードに
登録されたキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールなどの核酸試料に対する核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きの基準値(S)を利用する処理と、(2)試薬バーコードに登録されたキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールなどの核酸試料に対する核酸増幅反応曲線のプラトー値の基準値(P)を利用す
る処理の2パターンが用意されている。その理由は、ユーザがキャリブレータやポジティブコントロール、インターナルコントロールを含む患者検体を測定した場合に、核酸増幅反応曲線が式(1)に近似できる場合と、増幅産物に基づく検出値が低い又は核酸増幅反応
曲線のベースライン305のバラつき等により近似不可となる場合とがあるためである。
(1)反応液に増幅反応を阻害する物質が含まれていた、(2)試薬の消費期限が切れていた、(3)温調ブロック異常に伴う温度サイクル不良等の装置トラブルなどがあった時、核酸増
幅反応曲線303の変化量は、正常(理想的)な核酸増幅反応曲線301と比べて強度が小さくなる。図3に示す異常な核酸増幅反応曲線303は、測定された核酸増幅反応曲線を式(1)に近似した後のグラフであり、各パラメータの値は表3の通りである。
次の式(10)に近似される。
を異常と判定してステップ208に進み、想定される不具合の内容をモニタに表示する。
なお、想定される不具合の内容は、過去の測定結果よりデータベース化されているものとする。一方、Ds ≧ 0.7であれば、制御部121は、測定により得られた核酸増幅反応曲
線を正常であると判定し、アラームを表示させることなく判定処理を終了する(ステップ210)。
ティブコントロール核酸増幅反応曲線のプラトー値(P)とP = 1.0(式(9)より)とを利用
し、得られた核酸増幅反応曲線が正常か否かを次の式(14)を用いて判定する(ステップ209)。
かった場合、核酸増幅反応曲線303のプラトー値(P’)304は、P’ = 0.6となる。ここで、Pは式(9)より、P’は式(15)より導かれる。
を異常と判定してステップ208に進み、想定される不具合の内容をモニタに表示する。
やはり、想定される不具合の内容は、過去の測定結果よりデータベース化されているものとする。一方、Dp ≧ 0.7の場合、制御部121は、測定により得られた核酸増幅反応曲
線を正常であると判定し、アラームを表示させることなく判定処理を終了する(ステップ210)。ただし、近似エラーのアラームは、別途モニタに表示される。
図6Aに、ステップ207における判定結果の表示画面例を示す。当該画面には、基準となる核酸増幅反応曲線と測定試料の増幅曲線に関する一次微分曲線601(式(8)参照
)と、変曲点における傾き比(S’/S)と変曲点の結果602とが表示される。同画面に
は、一次微分曲線601についてX軸スクロール604が用意される。X軸スクロール604を軸方向に沿って移動すると、制御部121は、指定のX軸位置(本実施例ではサイク
ル数)に対する基準核酸増幅反応曲線又は測定試料の核酸増幅反応曲線における傾き603も画面内に表示される。
制御部121には、キャリブレータの核酸増幅反応曲線が異常であると判定された場合に、自動的に再キャリブレーションを実行する機能が搭載されている。ここで、再キャリブレーションとは、核酸試料が収納されたサンプル容器101や試薬容器103をユーザが新たに架設することなく(すなわち、最初に載置したサンプル容器101や試薬容器103を使用し)、再度実行されるキャリブレーションのことである。
’/S)は式(12)で算出される値であり、プラトー比(P’/P)は式(14)で算出される値で
ある。測定結果に基づいて計算された傾き比(S’/S)やプラトー比(P’/P)がユーザの設定した値より小さく、かつ「再キャリブレーションをする」ボタンにチェックが入っている場合、制御部121は、異常と判定された濃度が得られたキャリブレータについてのみ再測定を自動実行する機能を有する。
前述の通り、核酸増幅分析装置100によれば、キャリブレータ、ポジティブコントロール、インターナルコントロール等の核酸を含む試料について、核酸増幅反応が正常か否かを検出することが可能となり、Ct値といった核酸増幅反応の進捗を示す値の測定結果の信頼性を向上させることができる。
本発明は、上述した実施例の構成に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでい
る。例えば上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために、一部の実施例について詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要は無い。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成に他の構成を追加し、又は、各実施例の一部構成を他の構成で置換し、又は各実施例の一部構成を削除することも可能である。
えば集積回路その他のハードウェアとして実現しても良い。また、上記の各構成、機能等は、それぞれの機能を実現するプログラムをプロセッサが解釈して実行することにより実現しても良い。すなわち、各構成等をソフトウェアにより実現しても良い。この場合、各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリやハードディスク、SSD(Solid State Drive)等の記憶装置、ICカード、SDカード、DVD等の記憶媒体に格納
することができる。
要な全ての制御線や情報線を表すものでない。実際にはほとんど全ての構成が相互に接続されていると考えて良い。
101…サンプル容器
102…サンプル容器ラック
103…試薬容器
104…試薬容器ラック
105…反応容器
106…反応容器ラック
107…反応液調整部
108…密閉ユニット
109…攪拌ユニット
110…ロボットアームX軸
111…ロボットアームY軸
112…グリッパユニット
113…分注ユニット
114…チップ
115…チップラック
116…核酸増幅部
117…検出器
118…廃棄ボックス
119…入力部
120…表示部
121…制御部
802…カローセル
803…温調ブロック
804…保持具
805…中心軸
Claims (20)
- 測定対象とする試料について、2次元グラフの第1の軸を核酸増幅産物についての測定値、第2の軸を核酸増幅反応の進捗を示す値とする核酸増幅反応曲線を取得する測定部と、
正常な核酸増幅反応曲線と測定した核酸増幅反応曲線を比較する比較部と、
比較結果に基づいて、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常か否か判定する判定部と
を有する核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記比較部は、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾き又はプラトー値と、測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾き又はプラトー値を比較する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項2に記載の核酸増幅分析装置において、
前記核酸増幅反応曲線の不連続な測定値に対してシグモイド関数を適用する第1の処理、シグモイド関数へ準ニュートン法を用いた近似処理を繰り返し適用する第2の処理、シグモイド関数のパラメータを決定する第3の処理を実行して、前記核酸増幅反応曲線の近似式を算出する演算機能部
を更に有する核酸増幅分析装置。 - 請求項3に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
算出された前記近似式に従い算出された増幅産物に基づく測定値に対し、閾値に達する核酸増幅反応の進捗を示す値を算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項3に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
算出された前記近似式を前記核酸増幅反応曲線にフィッティング可能な場合、前記近似式を1階微分した関数に、前記近似式を2階微分して算出した変曲点の値を代入して、前記変曲点における前記近似式の傾きを算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項3に記載の核酸増幅分析装置において、
前記演算機能部は、
前記核酸増幅反応曲線が算出された前記近似式にフィッティング不可の場合、前記核酸増幅反応曲線のプラトー値を算出する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線の前記変曲点と当該変曲点における前記傾き、又は、前記プラトー値を試薬容器の情報記憶手段から読み取る読み取り部
を更に有することを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと、前記測定した核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きを表示画面上に対比的に表示する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と、前記測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値を表示画面上に対比的に表示する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、想定される不具合内容及び/又は増幅不良を報知する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、再キャリブレーション条件設定画面を通じて事前に設定された条件に従い、再キャリブレーションを実行させる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項11に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再キャリブレーション条件が、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きとの比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項11に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再キャリブレーション条件が、正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値との比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記判定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合、再検査条件設定画面を通じて事前に設定された再検査条件に従い、再検査を実行させる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項14に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再検査条件が、正常な核酸増幅反応曲線の変曲点における傾きと測定した核酸増幅反応曲線の変曲点での傾きとの比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項14に記載の核酸増幅分析装置において、
前記再検査条件が、正常な核酸増幅反応曲線のプラトー値と測定した核酸増幅反応曲線のプラトー値との比である
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項1に記載の核酸増幅分析装置において、
前記測定部は、
それぞれ独立に温度制御可能な複数の温調ブロックと、
反応液を収容する複数の反応容器がそれぞれの前記温調ブロックで温度制御される保持具と
を更に有することを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項17に記載の核酸増幅分析装置において、
前記測定部は、測定した前記核酸増幅反応曲線が正常でないと判定された場合の不具合内容に前記温調ブロックの異常が含まれたとき、異常が疑われる温調ブロックで温度制御される前記保持具の使用を禁止する
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項18に記載の核酸増幅分析装置において、
再キャリブレーション条件設定画面を通じ、ユーザは、異常が疑われる温調ブロックの使用を禁止するか否かを事前に選択できる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。 - 請求項18に記載の核酸増幅分析装置において、
再検査条件設定画面を通じ、ユーザは、異常が疑われる温調ブロックの使用を禁止するか否かを事前に選択できる
ことを特徴とする核酸増幅分析装置。
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