JP5956587B2 - 定量的な光学的測定のための方法及び実験機器 - Google Patents

Description

本発明は、定量的な光学的測定のための方法、及び前記方法を利用する実験機器（laboratory apparatus）に関する。

当該方法は、試料溶液中の化学的、生化学的、生物学的又は生物医学的検体の濃度を測定するために、特に化学、生化学、生物学又は生物医学の研究室の環境において使用される。当該光学的測定の典型的な原理は蛍光の計測に基づいている。検体は蛍光標識によって標識されるが、それは光源の励起光によって励起できる。蛍光標識は、光を受け、典型的に異なった波長（蛍光）にて試料光を放つ。検出された試料光の強度は、溶液中の検体濃度を導き出すために使用される。理想的には、検体濃度は検出された強度に比例しており、且つ、キャリブレーション係数を使用することで決定できる。当該キャリブレーション係数はあらかじめ決定され得、例えば、実験機器のメモリ内のデータセットに含まれ得、又は従来のキャリブレーション法によって決定できる。蛍光の計測を使用する実験機器は、例えば、蛍光光度計（蛍光試料光の強度を測定するもの）、蛍光分光計（励起光の波長に依存する蛍光試料光の強度を測定するもの）、又はリアルタイムＰＣＲ装置（PCR instrument）（経時的にＰＣＲ試料からの蛍光を観察することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の経過を観察する装置）である。

複数の検体を計測することが望まれ、そしてそれらの検体が実質的に異なった濃度を有する場合には、光学的測定をおこなうための追加的な技術的試みが必要である。光学的測定をおこなうための検出器デバイスとして実験機器で典型的に使用される電気的光検出器は、実験機器、特に検出器デバイスの操作パラメータの既定のセットに対して特定の範囲の検出可能な光度に制限されている。前記範囲内の強度は、検出器デバイスの操作パラメータセットを変更することなく検出できる。前記範囲外の強度を計測するためには、検出器デバイスの操作パラメータセットを変更する必要がある。典型的には、検出器デバイスの感度を変更するために、電気利得 (electric gain) が使用される。あるいは、励起光の強度は、実験機器の感度パラメータの変化量をシミュレートするために変更される。多くの市販の検出器デバイスが、入射試料光の強度を計測するために好適である感度パラメータを自動的に提供するか又は使用するように設計されている。検出器デバイスは、計測中に適用された感度パラメータに関して−ほぼ正しい−強度を自動的に測定する。理想的な場合では、ノイズやシグナルの飽和又は過負荷は別として、強度Ｉは、少なくとも関数Ｉ（Ｓ）の実質的に直線の領域内において感度パラメータＳの値に比例する。原則として、Ｉ（Ｓ）はまた、試料光が検出器デバイスによって検出される波長にも依存する。

いずれにせよ、検出器デバイスは、強度と感度との正しい関係を利用するために内部修正を使用できる。前記修正は、検出器デバイス単体に当てはめることができるが、検出器デバイスが実験機器の一部であるときには、更なる変更が必要なこともある。実験デバイスにおいて、光源、フィルター、光路を誘導する手段を含む実験デバイスの測定機構と検出器デバイスの組み合わせは、異なった感度パラメータの使用がその検出器デバイスによって計測された強度の精度低下を導く状況につながる。実験機器全体の正確なキャリブレーションを欠いているので、特に、異なった感度パラメータにて検出された強度の比較精度は低下する。

異なった検体に関して計測される強度の比較精度を高める１つの可能性は、検出器デバイスの運転に単一の感度パラメータ値を使用することである。この場合、検出器デバイスによって検出できる強度範囲は、計測に狭い範囲しか利用できないようなノイズ効果とシグナル飽和効果によって制限される。そのうえ、最適の感度パラメータを、例えば使用者が手作業によって、前もって見つけておかなければならないのは不都合である。

本発明の目的は、十分な精度に匹敵し得る広い発光強度測定範囲を備えた定量的な光学的測定方法を提供することである。本発明の更なる目的は、本発明による方法を利用する実験機器を提供することである。

前記目的は、請求項１に記載の方法、及び請求項１３に記載の実験機器によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項の対象である。

本発明による方法は、少なくとも１つの実験用試料中の少なくとも１つの検体の特徴的性質の定量的な光学的測定の方法、特に少なくとも１つの生化学的又は生物学的試料の蛍光測定の方法であって、ここで前記方法は、少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの検出器デバイスを備えた実験機器を使用し、ここで前記実験機器は、少なくとも１つの検出器デバイスによってシグナルを検出する実験機器の能力を制御する感度パラメータＳを少なくとも利用し、前記方法は、少なくとも１つの試料に試料光の放出を引き起こすための光源光、及び試料光を検出するための少なくとも１つの検出器デバイスを使用し、並びにその方法は、対応する試料光の少なくとも１つの強度Ｉを検出するために少なくとも１つの感度パラメータＳを利用し、好ましくは少なくとも２つの異なった感度パラメータＳを利用し、そして、対応する試料光の少なくとも２つの強度Ｉを検出し、その方法は、以下のステップ：
−少なくとも１つの基準点（reference point）（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を測定し；
−第一の検体に割り当てられた試料光の少なくとも１つの第一の強度Ｉ＿ｍ１を計測するために、Ｓ＿ｒｅｆと異なる少なくとも１つの第一の感度パラメータＳ＿ｍ１を使用し；
−少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）と少なくとも１つの測定点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）を利用することによって決定される線の傾きの尺度である量Ｑ１を決定し；
−Ｑ１に依存し、且つ、第一の検体の特性に特徴的である、特に少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度に特徴的である、第一の検体値Ｃ＿ｍ１を計算するために量Ｑ１を使用すること、
を含む。

前記方法の好ましい実施形態において、量Ｑ１は、少なくとも２つの点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）と（Ｓ＿ｍ１、Ｉ＿ｍ１）によって規定される線、好ましくは直線の傾きであり、そして、Ｑ１は、式
Ｑ１＝（Ｉ＿ｍ１−Ｉ＿ｒｅｆ）／（Ｓ＿ｍ１−Ｓ＿ｒｅｆ）、
或いは（Ｓ＿ｒｅｆ、Ｉ＿ｒｅｆ）と複数の異なった測定点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）を通る補間関数 (interpolation function) 若しくは補間線 (interpolation function) 、又は回帰関数 (regression function) 若しくは回帰線 (regression line) に従って好ましくは計算され、
ここで、特に、Ｃ＿ｍ１がＱ１に対して比例している、好ましくはＣ＿ｍ１＝Ｑ１である。本明細書において好ましくは、基準点は、特に少なくとも２つの別々の感度パラメータＳを利用して計測される、好ましくは少なくとも１つの検体（又は少なくとも２つの検体）と同じである標準化点 (standardization point) である。更に、好ましくは、基準点が、少なくとも１つの既定の固有検出波長と同じである。好ましくは、１つの標準化点が、各固有検出波長に使用される。

前記方法の別の好ましい実施形態において、量Ｑ１は、（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）、および、同じ第一の検体を使用して測定された複数の基準点（Ｓ＿ｎ１、Ｉ＿ｎ１）に適用される、直線の補間線又は回帰線の傾きである。

好ましくは、関係Ｉ（Ｓ）は、検出器デバイスによって検出される試料光の固有波長にも依存していると考えられる。典型的には、少なくとも１つの試料は、光源光強度Ｉ（ω＿ｓ）が最大値を有する波長である少なくとも１つの固有波長ω＿ｓを有する光源光を用いて照らされる。光源光は単色であり得、そしてそれは、光源光が実質的に固有波長でのみ発光することを意味する。検出器デバイスは、好ましくは試料光のスペクトルが最大値を有する固有発光波長に相当する、固有検出波長ω付近の１若しくは複数の既定のスペクトル領域だけを検出するための光学フィルターを備えている。この発光波長は、検体の蛍光によって規定され得る。好ましくは、前記方法は、少なくとも１つの既定の固有検出波長に依存する試料光の強度を検出器デバイスに検出させるステップを含み、ここで、少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）が固有検出波長に依存してそれぞれ測定され、これにより、少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を各固有検出波長に割り当てる。

前記方法は、少なくとも１つの試料中の少なくとも１つの検体の特徴的性質を測定するために、化学、生化学、生物学又は生物医学の実験室において好ましくは利用される。好ましくは、前記特徴的性質は、試料中の、好ましくは試料中の化学的、生化学的、生物学的又は生物医学的試料中の、検体濃度、好ましくは化学的、生化学的、生物学的又は生物医学的検体の濃度である。

典型的には、多くの異なった試料は別々に提供され、そして、各試料には少なくとも１つの検体が存在するか、又は光学的に、好ましくは蛍光測定によって計測されるべき丁度１種類の検体が存在する。計測されるべき２つ以上の検体が存在している１つの試料が計測されることが可能であって、且つ、好ましい。本発明の方法をおこなうための実験機器は、例えば、使用者によって計測されるべき別の試料に交換できる、１つの試料を保持するように構成されるか、又は平行に若しくは連続して実験機器内に配置された複数の試料を測定するために、複数の試料を保持するように構成され得る。

好ましくは、感度パラメータが、計測された強度Ｉが感度パラメータＳに対して実質的に直線である直線領域内で検出器デバイスを操作できるように、試料中の検体の特定の濃度に関して、特定の感度パラメータが、好ましくは自動的に、好ましくは半自動的に、又は好ましくは手動で選ばれる方法を提供する。典型的には、各検体を有する各試料は、特定の感度パラメータを用いて計測される。

Ｃ＿ｍ１、特に試料中の検体濃度を導くための基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）の使用は、濃度の値を比較するときに−又は更に計算するときに−精度を高める。たった１回の計測から、例えば、ＣＯＮ１＝ｂ（ｂはキャリブレーション関数ｂ（Ｉ＿ｍ１）である）又はＣＯＮ１＝ｂ（Ｉ＿ｍ１−Ｉ＿ｍ０）（Ｉ＿ｍ０は、本発明に従って検体を含まないブランク試料を用いた計測値である）に従って濃度、例えば第一の検体の濃度ＣＯＮ１を導き出す代わりに、その濃度は、基準点と測定点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）を通過するか、又は複数の基準点と測定点を通る回帰線である直線の傾きＣ＿ｍ１から導き出される。

好ましくは、基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）は標準化点であり（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）＝（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）、標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定するステップは、以下のステップ：
・少なくとも１つの標準試料に少なくとも１つの標準試料光を放射させるため、且つ、データセット（Ｓ；Ｉ＿１）を使用して測定される、Ｉ＿１（Ｓ）＝ｃ１^*（Ｓ−Ｓ＿１＿０）＋Ｉ＿１＿０（式中、ｃ１は、第一の光学標準に依存する係数であり、且つ、Ｓ＿１＿０及びＩ＿１＿０は、直線を規定するためのパラメータである）に従って、可変感度パラメータＳの第一の関数として第一の標準試料光の第一の強度Ｉ＿１を測定するように少なくとも１つの標準試料光を検出器デバイスに検出させるために、光源光及び少なくとも１つの光学標準試料を使用し；
・少なくとも１つの第二の関数Ｉ＿２（Ｓ）を利用し；
・少なくとも２つの関数Ｉ＿１（Ｓ）とＩ＿２（Ｓ）の間の交点である（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
を含む。

この場合、好ましくは試料の計測前に測定される一つの標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）が、好ましくは検出器デバイスの少なくとも１つの既定の固有検出波長に関する、好ましくは異なった試料中の、異なった検体の計測に使用され、そこでは、好ましくは１つの個々の標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）が、１つの固有検出波長に割り当てられる。Ｉ＿１（Ｓ）は、Ｓの変化量によって決定され、そして、関連強度Ｉ＿１（Ｓ）が検出される。Ｓ＿１＿０及びＩ＿１＿０を決定するために、データセット（Ｓ；Ｉ＿１）は少なくとも２つの点（Ｓ；Ｉ＿１）を含まなければならない。好ましくは、データセット（Ｓ；Ｉ＿１）は、複数の点（Ｓ；Ｉ＿１）を含んでいる。Ｉ＿１（Ｓ）の決定方法は、計測値（Ｓ；Ｉ＿１）の対に関数Ｉ＿１（Ｓ）を当てはめるための従来の回帰法又は補間法を含み得る。標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）は、Ｎ個（Ｎ＞０）の検体の計測値のすべての計算Ｃ＿ｍ１、Ｃ＿ｍ２、Ｃ＿ｍ３、Ｃ＿ｍ４、．．．Ｃ＿ｍＮによって共有され得る。これは、異なった強度の比較の精度全体を更に改善し、そしてそれは、感度パラメータＳ＿ｍ１、Ｓ＿ｍ２、Ｓ＿ｍ３、Ｓ＿ｍ４、．．．Ｓ＿ｍＭ（式中、Ｍは、好ましくはＮ以下の数であり得る）における測定値に関連する。

好ましくは、光学標準試料は光学試料であり、そしてそれは、前もって測定された、特定の濃度の検体の代表、特に特定の濃度の蛍光マーカーの代表である。通常、光学標準試料は、（例えば、蛍光によって）光学的に相互作用している物質が別々の既定の濃度を有する各試料中に含まれている１セットの試料として入手可能である。しかしながら、標準試料は、例えば別々の既定の濃度にて溶液中に試料検体を溶解することにより、使用者によって調製できる。パラメータｃ１は、従来のキャリブレーション法を使用して決定できる。

好ましくは、本発明による方法は、更なるステップ：
−第一の検体、又は好ましくは第二の検体に割り当てられた試料光の少なくとも１つの第二の強度Ｉ＿ｍ２を計測するための少なくとも１つの第二の感度パラメータＳ＿ｍ２を使用し；
−同じ又は別の標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）と少なくとも１つの測定点（Ｓ＿ｍ２；Ｉ＿ｍ２）を利用することによって測定される線の傾きの尺度である量Ｑ２を決定し；
−Ｑ２に依存し、且つ、好ましくは第二の検体値であり、第二の検体に割り当てられ、そして、少なくとも１つの試料中の特に検体、好ましくは第二の検体の濃度に関する検体、好ましくは第二の検体の特性に特徴的である検体値Ｃ＿ｍ２を、特に式：
Ｑ２＝（Ｉ＿ｍ２−Ｉ＿ｆｉｘ）／（Ｓ＿ｍ２−Ｓ＿ｆｉｘ）
に従って、又は（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）と複数の異なった測定点（Ｓ＿ｍ２；Ｉ＿ｍ２）を通る回帰線に従って計算するために、量Ｑ２を使用すること、
−ここで、特に、Ｃ＿ｍ２はＱ２に比例している、特にＣ＿ｍ２＝Ｑ２である、
を含む。

これは特に、２つの検体が計測される場合、例えば少なくとも２つの検体が計測される場合、適用される。この場合、特に、本発明による方法は、好ましくは比較値を決定するために、第一の標本値Ｃ＿ｍ１と第二の標本値Ｃ＿ｍ２を比較する更なるステップを含む。比較は、例えば（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ２）に比例する結果を得るために、例えば、差を計算することによっておこなわれ得る。例えば、更に、比較は、例えば（Ｃ＿ｍ１／Ｃ＿ｍ２）に比例する結果を得るために、例えば除算演算を計算することによっておこなわれ得る。他の比較演算も可能である。特に、Ｃ＿ｍ２は、第一の検体を使用しても計測できる。この場合、２つの異なった感度パラメータにおける同じ第一の検体の計測が、例えば＜Ｃ＿ｍ＞＝０．５^*（Ｃ＿ｍ１＋Ｃ＿ｍ２）になり得る平均量＜Ｃ＿ｍ＞を測定するために使用できる。これは、第一の検体の特性、例えば、濃度を測定した結果の精度を改善する。

標準化点を決定する方法において、第二の関数Ｉ＿２（Ｓ）はＩ＿２（Ｓ）＝定数、例えばＩ＿２（Ｓ）＝０であり得る。これは、異なった感度パラメータにて異なった検体について計測された、異なった強度の比較演算に関して十分な精度を達成する。

好ましくは、標準化点を決定するステップにおいて、Ｉ＿２（Ｓ）＝ｃ２^*（Ｓ−Ｓ＿２＿０）＋Ｉ＿２＿０（式中、ｃ２は、第二の光学標準に依存する係数であり、且つ、従来のキャリブレーション法によって得られる）に従って、可変感度パラメータＳの第二の関数Ｉ＿２（Ｓ）として同様に少なくとも第二の標準試料光の第二の強度Ｉ＿２を更に決定するために、少なくとも２つの光学標準試料が使用される。Ｓ＿２＿０及びＩ＿２＿０は、直線を規定するパラメータであり、そしてそのパラメータは、データセット（Ｓ；Ｉ＿２）を使用して測定される。Ｉ＿２（Ｓ）はＳの変化量によって計算され、関連する強度Ｉ＿２（Ｓ）を検出する。Ｉ＿２（Ｓ）の決定方法は、関数Ｉ＿２（Ｓ）を計測値の対（Ｓ；Ｉ＿２）に当てはめるための従来の回帰法又は補間法を含み得る。多くの場合、２本の直線Ｉ＿１（Ｓ）及びＩ＿２（Ｓ）の使用は、異なった感度パラメータにて異なった検体について計測された異なった強度の比較演算に関して十分な精度を達成することが判明した。

好ましくは、標準化点の測定方法は、以下のステップ：
・少なくとも３つの光学標準を利用して、関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）として少なくとも３つの標準試料光の３つの強度を測定し；
・少なくとも３つの関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）及びＩ＿３（Ｓ）の間の推定交点である（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）を、数学的な推定法を使用して決定すること、
を含む。

本明細書において、Ｉ＿３（Ｓ）＝ｃ３^*（Ｓ−Ｓ＿３＿０）＋Ｉ＿３＿０（式中、ｃ３は、第三の光学標準試料に依存する係数であり、且つ、従来のキャリブレーション法によって得られる）に従って、可変感度パラメータＳの第三の関数Ｉ＿３（Ｓ）として同様に少なくとも第三の標準光の第三の強度Ｉ＿３が更に決定される。Ｓ＿３＿０及びＩ＿３＿０は、直線を規定するパラメータであり、そしてそのパラメータは、データセット（Ｓ；Ｉ＿３）を使用して測定される。Ｉ＿３（Ｓ）の決定方法は、関数Ｉ＿３（Ｓ）を計測値の対（Ｓ；Ｉ＿３）に当てはめるための従来の回帰法又は補間法を含み得る。

３つ又はそれ以上の関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）が（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定するために使用される場合に、その３つ以上の関数が１つの交点を持たない可能性がある。おそらく、関数の組の３つの交点は存在する。この場合、好ましくは、推定交点であるべき交点を規定する任意の数学的方法が使用できる。その数学的な推定法は、幾何学的方法、若しくは関数の組の交点の座標を平均する方法、又はその他の回帰法であり得る。

大抵の場合、少なくとも３本の直線Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）の使用は、異なった感度パラメータにて異なった検体について計測された、異なった強度の比較演算に関して相応な努力により効果的に最適の精度を達成することが分かった。

好ましくは、数学的な推定法は、以下のステップ：
・少なくとも３つの関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）によって囲まれている（enframed）領域内の点である（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
をもたらす。

大抵の場合、（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）のこの選択は、最も効果的であり、且つ、異なった感度パラメータにて異なった検体について計測される、異なった強度の比較演算のために十分な精度を示す。

好ましくは、少なくとも３つ又はちょうど３つの光学標準試料が、３本の直線関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）及びＩ＿３（Ｓ）を決定するために使用され、そしてそこでは、数学的な推定法が、以下のステップ：
・３組の直線（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿２（Ｓ））、（Ｉ＿２（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））、及び（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））の３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２及びＩＳ３を決定し；
・３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３によって規定される三角形の３つの角の二等分線の交点である（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
をもたらす。

（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）のこの選択は、非常に効果的であり、且つ、異なった感度パラメータにて異なった検体について計測される、異なった強度の比較演算のために改善された精度を示す。

好ましくは少なくとも１つの固有検出波長について、異なった感度パラメータＳ＿ｍ１、Ｓ＿ｍ２、Ｓ＿ｍ３、Ｓ＿ｍ４、．．．Ｓ＿ｍＭを用いたすべての測定値Ｃ＿ｍ１、Ｃ＿ｍ２、Ｃ＿ｍ３、Ｃ＿ｍ４、．．．Ｃ＿ｍＮに使用される共通の標準化点を使用する代わりに、各値Ｃ＿ｍ１、Ｃ＿ｍ２、Ｃ＿ｍ３、Ｃ＿ｍ４、．．．Ｃ＿ｍＮをより正確に測定するために試料中の１つの検体を複数回使用することが、本発明による方法の別の好ましい実施形態におけるアプローチである。この場合、特に、本発明による方法は、少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を決定する、変更されたステップ：
・可変感度パラメータＳに依存する第一の基準光の第一の強度の組Ｉ＿１によるデータセットを測定することによって、前記試料からの少なくとも１つの基準光を検出器デバイスに検出させるように第一の検体に割り当てられた少なくとも１つの更なる試料光を使用し；
・データセットのうちの少なくとも１組（Ｓ；Ｉ＿１）を利用して、（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）＝（Ｓ；Ｉ＿１）である、少なくとも１つの基準点を決定すること、
を含む。

前記データセットは、２つ以上の点（Ｓ＿ｍｉ；Ｉ＿ｍｉ）を含み得る。前記の値Ｃ＿ｍ１は、第一の検体の測定値の２つの点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）及び（Ｓ＿ｍ２、Ｉ＿ｍ２）を通過する直線の傾きから得られる。この方法は、Ｃ＿ｍ１＝ｄ^*Ｉ＿ｍ１（ｄがキャリブレーション係数又は関数である）を決定するより高い精度を有することを示した。

前記の値Ｃ＿ｍ１は、第一の検体の測定値の複数の点（Ｓ＿ｎｉ；Ｉ＿ｎｉ）を通過する直線の傾きから更に得られる：好ましくは、複数の基準点は、異なった感度パラメータＳ＿ｎ１にて第一の検体に割り当てられた試料光の検出された強度Ｉ＿ｎ１を使用して決定され、そこでは、従来の回帰法が、測定点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）及び複数の基準点（Ｓ＿ｎ１；Ｉ＿ｎ１）を通る回帰線を規定するために使用され、且つ、そこでは、前記第一の検体値Ｃ＿ｍ１が前記回帰線の傾きｃ＿ｉから得られ、そこでは、Ｃ＿ｍ１は特にｃ＿ｉに比例している。

好ましくは、前記第一の検体値Ｃ＿ｍ１は、ＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１）又はＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ０）（式中、ａは、特に従来のキャリブレーション法を使用して決定できる既定の関数又は定数であり、且つ、Ｃ＿ｍ０は、検体を含まないブランク試料の値である）に従って、少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度を決定するために使用される。Ｃ＿ｍ０は、同じ試料ホルダー、試料容器、及び好ましくは検体を溶解するために使用したのと同じ溶液を含む方法をおこなうための実験機器を使用して、バックグラウンド放射の計測、例えばバックグラウンド蛍光測定をおこなうことによって測定できる。前記試料は、その中に検体が溶解されている溶液を伴った検体と規定できる。好ましくは、ＣＯＮ１は、Ｃ＿ｍ１又は（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ０）に比例している。

前記感度パラメータは、検出器デバイスを備えた実験機器の操作パラメータのいずれかであることが理解でき、そしてそのパラメータが、検出器デバイスによってシグナルを検出する実験機器の能力を制御している。通常、センサーの「感度」は、入力における規定の変化に対する出力電圧の変化と規定される。好ましくは、感度パラメータは、検出器デバイスの少なくとも１つの操作パラメータ、例えば、電気検出器デバイス、例えば光度計の電子利得係数の変化量によって変えられる。感度パラメータが、少なくとも１つの試料中の少なくとも１つの検体を計測するために使用される光源光の強度の変化量によって変えられることもまた、可能であって、且つ、好ましい。この場合も同様に、検出されたシグナル値が増強されるが、そのことは、光源の強度を増強する効果がセンサーの感度を増強するのと同等であることを意味している。

少なくとも１つの実験用試料中の少なくとも１つの検体の特徴的性質の定量的な光学的測定、特に少なくとも１つの生化学的又は生物学的な試料中の蛍光測定のための、本発明による実験機器は、光源光で少なくとも１つの試料を照らすための少なくとも１つの光源、試料光を検出するための少なくとも１つの検出器デバイス、及び電気制御デバイスを含み、そこでは、前記電気制御デバイスが、本発明による方法又はその好ましい実施形態を使用して、第一の検体の特性、特に少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度に特徴的である第一の検体値Ｃ＿ｍ１を、Ｑ１に依存して少なくとも自動的に計算するように構成されている。

好ましくは、本発明による方法は、好ましくはコンピュータープログラムコードを利用することによって前記実験機器又は制御デバイスに実装され、そしてそれは、好ましくはメモリデバイス、例えば光学データディスク又はフラッシュメモリ上に保存される。好ましくは、本発明による実験機器は、実験機器内のデータメモリ上に前記コンピュータープログラムコードを保存するように構成されている。好ましくは、前記コンピュータープログラムコードは実行可能であり、且つ、本発明による実験機器は、本発明による方法を適用するためのコンピュータープログラムコードを実行するように構成されている。

好ましくは、本発明による実験機器は、蛍光光度計、蛍光分光計、又はリアルタイムＰＣＲ装置になるように構成されている。他の好ましい方法ステップは、本発明による実験機器の機能の説明から派生する。

前記実験機器は、好ましくは他の部品、例えば、試料ホルダーを収容するため、少なくとも１つの試料容器を保持するため、特に１つの容器、例えば試料チューブ、キャップがされたもの若しくはキャップがされていないものを保持するため、或いは複数の試料容器、例えばマイクロタイタープレート若しくはＰＣＲプレートを保持するための試料ホルダー部分、ユーザインタフェース、例えばキーボード、ディスプレイ又はタッチスクリーン、データ変換インタフェース、並びに接続部品を含む。前記実験機器、特に試料ホルダーは、試料ホルダーを加熱及び／又は冷却するための温度デバイス、例えばペルチェ素子、並びに／或いは、熱センサーを含み得る。前記実験機器及び電気制御デバイスは、それぞれ試料ホルダー又は試料の温度を制御するために電気制御ループを含み得る。好ましくは、前記実験機器は、例えば、異なった温度レベルに至るまで試料ホルダーの温度を連続的に調整する（熱サイクルする）ために、試料ホルダーに昇温プログラムを適用するように構成される。好ましくは、前記実験機器は、リアルタイムＰＣＲをおこなうためのサーモサイクラーになるように構成される。

本発明による方法又は本発明による実験機器の好ましい使用は、生化学的試料又は生物学的試料、特にＰＣＲ試料の蛍光を光学的に計測することである。

そのうえ、本発明の更なる利点、特徴、及び適用は、図面を参照することで本発明による方法及び実験機器の以下の実施形態から得られる。次には、同じ引用符号が、同じデバイスを実質的に説明している。

本発明による方法を適用するように構成された本発明による実験デバイスのある実施形態を図式的に示す。 本発明による方法のある実施形態に関するフローチャートを図式的に示す。 図２に記載の方法のステップ１１において標準化点を決定する際に使用される曲線の略図を示す。 図２に記載の方法のステップ１１において標準化点を決定する際に使用される曲線の略図を示す。 図２に記載の方法のステップ１１において標準化点を決定する際に使用される曲線の略図を示す。 図２に記載の方法のステップ１１において標準化点を決定する際に使用される曲線の略図を示す。 本発明による方法及び実験機器の実施形態によって使用できる表を示しており、その表では、図２に記載の方法のステップ１６に従って、試料光の検出された強度に感度パラメータを割り当てている。 図２に記載の方法のステップ１７に従って、試料中の検体濃度が測定点と標準化点からどのように得られるかを図式的に示す。 本発明による方法の別の実施形態に関するフローチャートを図式的に示す。 図６に記載の方法のステップ２３に従って、試料中の検体濃度が測定点と標準化点からどのように得られるかを図式的に示す。

図１．図２に示されている方法１０を適用するように構成される本発明による実験デバイス１。前記実験機器は、複数の生物化学的又は生物学的試料、例えばＰＣＲ試料の蛍光測定をおこなうための蛍光分光計１である。前記実験機器には、光源２がある。４７０ｎｍの１つの励起波長にて発光するように、実施形態の場合には、特に試料ホルダー４内の第一の試料５に対して光３を放射し、それに続いて又は同時に試料ホルダーの各試料中の各検体に光３を放射するように構成されている。２つの試薬を含む１つの試料容器だけが与えられたのであれば、実験機器の実施形態は同様に動作する。前記実験機器には更に、検出器デバイス７を含む。試料光６、６’を検出する電気信号を提供するため、且つ、試料光６、６’の強度を定量化するための少なくとも１つの光検出器８がある。その検出器デバイス７は、市販のFluoSens-module、QIAGEN GmbH, Germanyである。FluoSens-moduleの感度パラメータは、光源（励起光を放つＬＥＤ）の強度を制御することによって変更できる。前記光検出器は、実施形態において、５２０ｎｍと５６０ｎｍの２つの固有検出波長を有する。

そのうえ、検出器デバイス又は実験機器のそれぞれには、電気制御デバイス９がある。前記電気制御デバイス９は、好ましくはマイクロプロセッサ、又は少なくともＣＰＵとメモリ、特にＲＡＭと固体メモリを含んで成る。前記電気制御デバイスは、好ましくは本発明による方法、特に方法１０又は２０を適用するように構成されている。このことは、例えば、電気制御デバイスが、本発明による方法をおこなうようにプログラムされたプログラマブル回路を含むことを意味する。前記プログラミングは、コンピュータープログラムコードを使用したソフトプログラミングであり得る。

図２は、少なくとも１つの生化学的又は生物学的試料５の定量的蛍光測定のための方法１０に関するフローチャートを示す。典型的なタスクは、複数の別々の試料又は１つの単一試料中の複数の検体の濃度を測定し、そして、測定した濃度を正確に比較することである。方法１０は、検出された検体濃度のその後の比較を伴うそうした計測の十分な精度を達成するために好適である。方法１０は、実験機器１によって自動的に実施され、いずれの実質的な使用者による追加的な関わりなしに前記の正確な計測値を提供するので、それは、使用者にとって快適であり、且つ、実験室におけるワークフローの効率を高める。

初めに、方法１０は、実験機器の調節ステップ１１を提供する。前記調節は、標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）である、ステップ１１における基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を決定するための、３つの光学標準試料、例えば、使用者の準備した標準試料の使用をもたらす。複数の感度パラメータＳ＿ｍ１．．．Ｓ＿ｍＭを使用した複数の検体の測定量Ｃ＿ｍ１．．．Ｃ＿ｍＮを正確に測定するために、単一の標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）が使用される。

当該実施形態の場合には、２つの標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）−１及び（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）−２が決定され（未掲載）、そこでは、（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）−１が、５２０ｎｍ（すなわち、５２０ｎｍ付近のかなり狭いスペクトル内）の光だけで検出するために検出器デバイスの５２０ｎｍの固有波長を使用して測定され、そして、（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）−２が、５６０ｎｍの固有波長を使用して測定される。以下のステップは、５２０ｎｍにおける計測について記載するが、実施形態において、５６０ｎｍにて計測するために繰り返される必要がある。

標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）の測定に関するステップ１２において、第一のデータセットの複数の点（Ｓ＿１；Ｉ＿１）が５２０ｎｍの固有波長にて測定される。このことは、第一の光学標準に関して、既定の光強度が試料に照射され、そして複数（少なくとも２つ）の異なった感度パラメータＳ＿１を使用しながら、励起した試料光が検出器デバイスによって検出されることを意味している。Ｓ＿１の各値について、試料光の強度Ｉ＿１が検出され、計測され、そして、保存される。得られたデータセットは、図３ａの図表に図式的に示されている。

第一の直線Ｉ＿１（Ｓ）は、前記のデータセットの点を通って当てはめられる。一般に、データセットの２つの点で、線を引くために十分である。しかしながら、複数の点を提供することで、推定法の精度が増強される。前記推定法は、データセットの点を通る（又はその間の）直線を当てはめるための従来の曲線フィッティング方法、例えば、最小二乗近似を使用したフィッティング方法を使用した、従来の推定方法である。好ましくは、少なくとも（及び／又は最大）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０又は異なった数の点が、データセットを決定するために使用され、そしてそれが、直線を効率的に規定する。好ましくは、更なるアルゴリズムが、ノイズ又はシグナル飽和のため起こる異常値を選別するために提供される。

標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）の決定に関するステップ１３において、第二のデータセットの複数の点（Ｓ＿２；Ｉ＿２）が測定される。このことは、第二の光学標準に関して、既定の光強度が試料に照射され、そして、複数（少なくとも２つ）の異なった感度パラメータＳ＿２を使用しながら、励起した試料光が（同じ固有波長にて）検出器デバイスによって検出されることを意味している。Ｓ＿２の各値について、試料光の強度Ｉ＿２が検出され、計測され、そして、保存される。得られたデータセットは、データセット（Ｓ＿１；Ｉ＿１）に加えて、図３ｂの図表に図式的に示されている。

標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）の決定に関するステップ１４において、第三のデータセットの複数の点（Ｓ＿３；Ｉ＿Ｓ）が測定される。このことは、第三の光学標準に関して、既定の光強度が試料に照射され、そして、複数（少なくとも２つ）の異なった感度パラメータＳ＿３を使用しながら、励起した試料光が（同じ固有波長にて）検出器デバイスによって検出されることを意味している。Ｓ＿３の各値について、試料光の強度Ｉ＿３が検出され、計測され、そして、保存される。得られたデータセットは、データセット（Ｓ＿１；Ｉ＿１）及び（Ｓ＿２；Ｉ＿２）に加えて、図３ｃの図表に図式的に示されている。

それぞれ、直線Ｉ＿１（Ｓ）及びＩ＿２（ＤＳ）は、データセット（Ｓ＿１；Ｉ＿１）及び（Ｓ＿２；Ｉ＿２）に当てはめられる。

標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）の決定に関するステップ１５において、３組の直線（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿２（Ｓ））、（Ｉ＿２（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））、（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））の３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３が決定される。標準化点は、３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３によって規定される三角形の３つの角の二等分線の交点になるように決定される。三角形の面積の大きさは、標準化点の決定方法の品質係数を評価するために使用できる。交点は、例えば、実験機器の電気制御デバイスによって、数値的に決定される。３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２及びＩＳ３によって規定される三角形の３つの角の二等分線の交点である標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定する「幾何学的」方法が、図３ｄに示されている。

方法１０に関するステップ１６において、感度Ｓ＿ｍ１は自動的に決定され、そしてそれは、計測される第一の検体に割り当てられる試料光の強度を計測するために好適である。前記計測は、初期設定値のＳ＿ｍ１で始まり、そして、Ｉ＿ｍ１を測定する。表（例えば、図４の表）は、検出値のＩ＿ｍ１が表に含まれている強度（図４、「下限」；「上限」）の範囲内に含まれるかどうか確認するため、並びに計測されたＩ＿ｍ１を含む強度の範囲に割り当てられる表中のＳ＿ｍ１（図４、「得られた感度」）の関連値を決定するために使用できる。測定値のＩ＿ｍ１が表による強度の範囲内に含まれていなければ、有効値Ｓ＿ｍ１が見つかるまで、ステップ１６はＳ＿ｍ１の別の値を用いて自動的に繰り返される。有効値のＳ＿ｍ１に関連している強度Ｉ＿ｍ１が保存される。

方法１０に関るステップ１７において、標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）は、式Ｃ＿ｍ１＝（Ｉ＿ｍ１−Ｉ＿ｒｅｆ）／（Ｓ＿ｍ１−Ｓ＿ｒｅｆ）に従って、第一の検体の特性、特に少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度に特徴的である第一の検体値Ｃ＿ｍ１を計算するために利用される。Ｃ＿ｍ１は、２つの点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）及び（Ｓ＿ｍ１、Ｉ＿ｍ１）を通過する直線の傾きである。これは、図５に図式的に示されている。

方法１０に関するステップ１８において、試料中の検体の濃度ＣＯＮ１の値は、好ましくはＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ０）（式中、ａは、従来のキャリブレーション法によって前もって決定される係数又は関数であり、且つ、Ｃ＿ｍ０は、少なくとも実験機器内の光路の部品、試料ホルダー、試料容器、及び検体を含んでいない溶液を含む光学システムのバックグラウンド蛍光の計測の結果である）に従って、Ｃ＿ｍ１から計算される。従来のキャリブレーション法は、特に標準的な強度、標準的な周波数を有し得る標準的な光源光を使用して、好ましくは光源の標準的な照射及び／又は検出時間、及び／又は標準的な出力エネルギーを使用して、試料に対応する強度を記録することによって、既定の濃度で試料検体をそれぞれ含む試料のセットを提供するステップを含む。

方法ステップ１６〜１８は、特に計算ステップによって正確に比較され得る測定値の正確な結果を得るために、固有検出波長の１つについて又は複数の波長について、同じ又は別の標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；ｉ＿ｆｉｘ）を使用して、複数の試料及び複数の検体について繰り返され得る。

図６では、本発明による方法の代替の実施形態、すなわち方法２０が示されている。共通の標準化点になるように基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を計算する代わりに、基準点が、光学標準試料を利用する代わりに、第一の検体を含む試料を使用してステップ２１で計算される。前記方法は、好ましくは１種類の検出波長だけで実施されるが、各固有検出波長についても同様に一度実施できる。方法２０は、可変感度パラメータＳ＿ｍ１（Ｓ＿ｍ２）に依存する計測された強度Ｉ＿ｍ１（Ｉ＿ｍ２）の組を伴った、点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）及び（Ｓ＿ｍ２、Ｉ＿ｍ２）を用いたデータセットを測定することによって、試料からの少なくとも１つの基準光にて検出器デバイスに検出させるように第一の検体に割り当てられた少なくとも１つの更なる試料光を使用することから成るステップ２２を含む。本明細書中では、Ｉ＿ｍ１、Ｉ＿ｍ２の「有効な」値が、例えば図４に示されているような表を使用することによって検出されるように、値Ｓ＿ｍ１、Ｓ＿ｍ２が決定される；ステップ２２では、（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）＝（Ｓ＿ｍ２；Ｉ＿ｍ２）となるように少なくとも１つの基準点を決定するために（Ｓ＿ｍ２；Ｉ＿ｍ２）が利用される。ステップ２３において、前記の２つの点が、２つの点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）及び（Ｓ＿ｍ２、Ｉ＿ｍ２）を通過する直線の傾きとしてＣ＿ｍ１を導き出すために使用される。これは、図７に図式的に示されている。ステップ２４において、試料中の検体の濃度ＣＯＮ１の値は、好ましくはＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ０）（式中、ａは、従来のキャリブレーション法によって前もって決定される係数又は関数であり、且つ、Ｃ＿ｍ０は、バックグラウンド蛍光の測定結果である）に従って、Ｃ＿ｍ１から計算される。更に長い計測時間が許容される場合には、直線をよりいっそう正確に規定し、そして、従来の回帰法を使用して傾きを導き出すために、複数の基準点（Ｓ＿ｎ１；Ｉ＿ｎ１）が使用でき、そしてそれが、ＣＯＮ１のより正確な計測につながる。同じ方法２０が、各検体に適用できる。

Claims (12)

1. 少なくとも１つの実験用試料中の少なくとも１つの検体の特徴的性質の定量的な光学的測定の方法（１０；２０）であって、
   ここで前記方法は、少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの検出器デバイスを備えた実験機器を使用し、
   ここで前記実験機器は、少なくとも１つの前記検出器デバイスによってシグナルを検出する前記実験機器の能力を制御する、少なくとも１つの感度パラメータＳを利用し、
   前記方法は、少なくとも１つの前記試料が試料光の放出を引き起こすための光源光、及び試料光を検出するための少なくとも１つの前記検出器デバイスを使用し、そして
   前記方法は、対応する少なくとも１つの試料光の強度Ｉを検出するために少なくとも１つの感度パラメータＳを利用し、
   前記方法は、以下のステップ：
   ・（１１）少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を測定し；
   ・（１６）第一の検体に割り当てられた試料光の少なくとも１つの第一の強度Ｉ＿ｍ１を計測するために、Ｓ＿ｒｅｆと同一ではない少なくとも１つの第一の感度パラメータＳ＿ｍ１を使用し；
   ・（１７）少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）と少なくとも１つの測定点（Ｓ＿ｍ１；Ｉ＿ｍ１）を利用することによって決定される線の傾きの尺度である量Ｑ１を決定し；
   ・Ｑ１に依存し、且つ、前記第一の検体の特性に特徴的である、第一の検体値Ｃ＿ｍ１を計算するために量Ｑ１を使用すること、
   を含み、
   ここで、
   前記基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）が、標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）＝（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）であり、且つ、標準化点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定するステップが、以下のステップ：
   ・少なくとも１つの標準試料に少なくとも１つの標準試料光を放射させるために、且つ、Ｉ＿１（Ｓ）＝ｃ１ ^* （Ｓ−Ｓ＿１＿０）＋Ｉ＿１＿０（式中、ｃ１は、第一の光学標準試料に依存する係数であり、且つ、Ｓ＿１＿０とＩ＿１＿０は、直線を規定するためのパラメータである）に従って、検出器デバイスの可変感度パラメータＳの第一の関数として少なくとも第一の標準試料光の第一の強度Ｉ＿１を測定するために、前記少なくとも１つの標準試料光を検出器デバイスに検出させるために、光源光及び少なくとも１つの光学標準試料を使用し；
   ・少なくとも１つの第二の関数Ｉ＿２（Ｓ）を利用し；
   ・少なくとも２つの関数Ｉ＿１（Ｓ）及びＩ＿２（Ｓ）の間の交点である、（Ｓ＿ｆｉｘ、Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
   を含み、
   前記の標準化点を決定するステップが、以下のステップ：
   ・少なくとも３つの光学標準試料を利用して、関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）として少なくとも３つの標準試料光の３つの強度を測定し；
   ・前記少なくとも３つの関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）の推定交点である、交点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を、数学的な推定法を使用して決定すること、
   を含む、前記方法。
2. 前記の量Ｑ１が、少なくとも２つの点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）及び（Ｓ＿ｍ１、Ｉ＿ｍ１）によって規定される直線の傾きであり、以下の式：
   Ｑ１＝（Ｉ＿ｍ１−Ｉ＿ｒｅｆ）／（Ｓ＿ｍ１−Ｓ＿ｒｅｆ）
   に従って計算され、
   且つ、Ｃ＿ｍ１がＱ１に比例する、請求項１に記載の方法。
3. 前記の標準化点を決定するステップにおいて、Ｉ＿２（Ｓ）＝ｃ２^*（Ｓ−Ｓ＿２＿０）＋Ｉ＿２＿０（式中、ｃ２は、第二の光学標準試料に依存する係数であり、且つ、Ｓ＿２＿０及びＩ＿２＿０は、直線を規定するためのパラメータである）に従って、可変感度パラメータＳの第二の関数Ｉ＿２（Ｓ）として少なくとも第二の標準試料光の第二の強度Ｉ＿２も更に決定するために、少なくとも更に１つの光学標準試料が使用される、請求項１に記載の方法。
4. 前記推定法が、以下のステップ：
   ・少なくとも３つの関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）、及びＩ＿３（Ｓ）によって囲まれている領域内の点である、（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
   をもたらす、請求項１に記載の方法。
5. 前記の３つの光学標準試料が、３本の直線関数Ｉ＿１（Ｓ）、Ｉ＿２（Ｓ）及びＩ＿３（Ｓ）を決定するために使用され、ここで前記推定法が、以下のステップ：
   ・３組の直線（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿２（Ｓ））、（Ｉ＿２（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））、及び（Ｉ＿１（Ｓ）；Ｉ＿３（Ｓ））の３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２及びＩＳ３を決定し；
   ・前記３つの交点ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３によって規定される三角形の３つの角の二等分線の交点である、推定交点（Ｓ＿ｆｉｘ；Ｉ＿ｆｉｘ）を決定すること、
   をもたらす、請求項１又は４に記載の方法。
6. 少なくとも１つの既定の固有検出波長に依存する試料光の強度を検出器デバイスに検出させるステップをさらに含み、且つ、少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）が固有波長に依存してそれぞれ測定され、それにより、少なくとも１つの基準点（Ｓ＿ｒｅｆ；Ｉ＿ｒｅｆ）を各固有検出波長に割り当てる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 更なるステップ（１８）において、第一の検体値Ｃ＿ｍ１が、ＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１）又はＣＯＮ１＝ａ（Ｃ＿ｍ１−Ｃ＿ｍ０）（式中、ａは定数であるか、又は従来のキャリブレーション法を使用して決定できる、既定の関数であり、そしてＣ＿ｍ０は、検体を含まないブランク試料の値である）に従って、少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度を決定するために使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記感度パラメータが、検出器デバイスの少なくとも１つの操作パラメータの変化によって変えられるか、又は前記感度パラメータが、少なくとも１つの試料中の少なくとも１つの検体を計測するために使用される励起光の強度の変化によって変えられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記第一の検体値Ｃ＿ｍ１は、前記少なくとも１つの試料中の第一の検体の濃度に特徴的である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 少なくとも１つの実験用試料中の少なくとも１つの検体の特徴的性質の定量的な光学的測定のための実験機器であって、
    光源光で少なくとも１つの試料を照らすための少なくとも１つの光源、
    試料光を検出するための少なくとも１つの検出器デバイス、及び
    電気制御デバイス
    を含み、ここで前記電気制御デバイスが、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して、第一の検体の特性に特徴的である第一の検体値Ｃ＿ｍ１を、Ｑ１に依存して少なくとも自動的に計算するように構成されている、前記実験機器。
11. 蛍光光度計、蛍光分光計、又はリアルタイムＰＣＲ装置になるように構成されている、請求項１０に記載の実験機器。
12. 生化学的試料又は生物学的試料の蛍光を光学的に計測するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法の、又は請求項１０又は１１に記載の実験機器の使用。

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