JP3793729B2

JP3793729B2 - 蛍光画像検出方法及びその装置並びにｄｎａ検査方法及びその装置

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Publication number: JP3793729B2
Application number: JP2002034805A
Authority: JP
Inventors: 良忠押田; 智高橋; 健二保田; 太作清野
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2002-02-13
Filing date: 2002-02-13
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2022-02-13
Also published as: JP2003232733A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛍光画像を検出する方法及びその装置並びに蛍光標識したＤＮＡを検出してＤＮＡ検査を行う方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガラス基板にプローブＤＮＡの種類に応じて場所を変えてスポッタで打点したり、フォトリソグラフィの技術により得られる所謂ＤＮＡマイクロアレーに蛍光標識したプローブＤＮＡをハイブリダイズした試料を読む装置が世の中で使われている。これらの装置では一定強度の１励起レーザスポットビームを蛍光標識したプローブＤＮＡに照射し、プローブＤＮＡから発生した蛍光を１つのフォトマルで検出してその検出信号から蛍光強度を読むことを、全サンプルに対して順次行っていく。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡ検査を対象とする生体組織におけるＤＮＡの発現解析等に用いようとすると、対象とするｍＲＮＡやこのコピーであるｃＤＮＡの種類間の濃度比は１対１００００を超える場合がある。このような場合でも対象を確実に検出するには、広いダイナミックレンジで検出することが非常に重要になる。
【０００４】
しかるに、上記の従来の検出方法では広いダイナミックレンジで検出することが容易でない。また広いダイナミックレンジで検出することが出来ても、非常に時間を要するなどの課題があった。
【０００５】
本発明の目的は、濃度が１００００倍以上異なるようなサンプルに対しても広いダイナミックレンジで高感度かつ高速に安定して蛍光画像を検出することが可能な、蛍光画像検出方法及びその装置を提供することにある。
また、本発明の目的は、蛍光標識したプローブＤＮＡを広いダイナミックレンジで高速高感度で安定に検出可能な、ＤＮＡ検査方法及びその装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明では、複数に分割された領域のそれぞれに蛍光体を含む試料が配置された検査対象物に励起光を照射し、該励起光の照射により発生する蛍光を検出する方法において、異なる強度の励起光を検査対象物の複数に分割されたそれぞれの領域に順次照射し、この照射により対象物のそれぞれの領域から発生する蛍光を励起光の強度に対応させて検出し、この励起光の強度に対応させて検出した蛍光に関する情報を用いて対象物が発生した蛍光値を求めるようにした。
【０００８】
また、上記目的を達成するために、本発明では、蛍光体を含む試料を有する検査対象物に強度の異なる複数の励起光を順次照射する照射工程と、この照射工程で強度の異なる複数の励起光を順次照射することにより試料から発生する蛍光強度の異なる複数の画像を順次取得する画像取得工程と、この画像取得工程で順次取得した蛍光強度の異なる複数の画像を用いて試料が発生した蛍光値を求める処理工程とを有して蛍光画像を検出するようにした。
そして、本発明では、求める蛍光値のダイナミックレンジが１０００以上であることを特徴とする。
【０００９】
更に、上記目的を達成するために、本発明では、複数に分割された領域のそれぞれに蛍光体を含む試料が配置された検査対象物に励起光を照射し、該励起光の照射により発生する蛍光を検出する装置を、強度の異なる励起光を発生する励起光発生手段と、この励起光発生手段で発生させた強度の異なる励起光を検査対象物のそれぞれの領域に順次照射する励起光照射手段と、この励起光照射手段により強度の異なる励起光を順次照射することにより対象物のそれぞれの領域から発生する蛍光を励起光の強度に対応させて検出する蛍光検出手段と、この蛍光検出手段で励起光の強度に対応させて検出した蛍光の検出信号を処理して対象物の蛍光発生に関する情報を得る処理手段とを備えて構成した。
【００１１】
更に、上記目的を達成するために、本発明では、ＤＮＡに蛍光標識を付加して形成した試料を基板上の複数の領域に配置した検査対象物に励起光を照射してこの照射により試料から発生する蛍光を検出するＤＮＡ検査方法において、異なる強度の励起光を複数の領域に配置されたそれぞれの試料に順次照射し、この照射によりそれぞれの試料から発生する蛍光を励起光の強度に対応させて検出し、この励起光の強度に対応させて検出した蛍光に関する情報を用いて検査対象物の蛍光発生に関する情報を得るようにした。
【００１３】
そして、得た試料の蛍光画像のダイナミックレンジが１０００以上であることを特徴とする。
【００１４】
更に、上記目的を達成するために、本発明では、ＤＮＡに蛍光標識を付加して形成した試料を基板上の複数の領域に配置した検査対象物に励起光を照射してこの照射により試料から発生する蛍光を検出するＤＮＡ検査装置を、強度の異なる励起光を発生する励起光発生手段と、この励起光発生手段で発生させた強度の異なる励起光を検査対象物のそれぞれの領域に配置した試料に順次照射する励起光照射手段と、この励起光照射手段により強度の異なる励起光を順次照射することによりそれぞれの領域に配置した試料から発生する蛍光を励起光の強度に対応させて検出する蛍光検出手段と、この蛍光検出手段で励起光の強度に対応させて検出した蛍光の検出信号を処理して検査対象物の蛍光発生に関する情報を得る処理手段とを備えて構成した。
【００１６】
以上に説明した蛍光を検出する方法において、蛍光を検出する際、光子１個１個を検出するフォトンカウント検出により行うことにより、より高感度に広いダイナミックレンジで検出することが可能になる。
【００１７】
上述の手段を施すことにより、フォトンカウントパルス信号のパルス幅ΔＴに対し1絵素分のフォトンカウント検出時間をＴとする時、０．５・Ｔ／ΔＴ以上のダイナミックレンジで検出することが可能になる。
【００１８】
この結果、ダイナミックレンジが１０００以上、更に１００００以上で検出することが可能になった。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を実施の形態例により詳細に説明する。
【００２０】
先ず、図１から図４を用いて、本発明の第１の実施の形態を説明する。
図１で、２は波長λ１の励起光源である。励起光源より出射した光は、励起光ビーム整形光学系２１で対物レンズ３を通して試料５上に所望のビーム形状となるようにレーザビームが整形される。試料上に照射される励起光ビームはマルチスポットビームが好ましいが、１スポットビームでもよい。励起光路の途中には波長選択ビームスプリッタ３１が配置されている。波長選択ビームスプリッタ３１は波長λ１の励起光を反射し、試料５に乗っている蛍光物質から発する波長λ２の蛍光は透過する。
【００２１】
具体例として蛍光物質としてＣｙ３（アマシャムファルマシアバイオテク（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）社の製品名）を用いる場合には励起光としてＹＡＧ第２高調波レーザ用いればλ１は５３２ｎｍとなり、蛍光波長λ２のピーク値は５７０ｎｍとなる。従って波長選択ミラー３１は５３２ｎｍで９０％以上反射し、５６０〜５９０ｎｍの蛍光は９０％近く透過する。透過した蛍光は干渉フィルタ３２で上記の蛍光波長帯域を透過させ、漏れてくる５３２ｎｍの励起光をほぼ完全に遮光する。
【００２２】
干渉フィルタ３２を透過した蛍光はフォトマル等の高感度検出器１１により検出される。高感度検出器１１で検出されたフォトンカウントパルス信号は制御回路１に送られ、デジタル情報に変換された後、フォトンを発生させた試料上の位置情報と共にメモリに保存される。本実施例では蛍光検出器としてフォトマルを用いた例を説明したが、冷却ＣＣＤ等の半導体検出器を用いてもよい。また励起スポットを広く照射し、２次元画像として冷却ＣＣＤで検出してもよい。
【００２３】
制御回路１は励起光の強度を変化させる機能を有している。即ち例えば周知のＡＯ変調器を用いて励起レーザ光の強度を図２の（ａ）に示すように時間と共に変化させる。本実施例における励起レーザ光は試料上の検出したい１絵素の寸法に相当するビーム径で試料表面を照射している。図１に示すように試料５を試料の面内のＸ方向に図示しないステージにより制御回路１の制御信号に基づき走査する。
【００２４】
図２の（ｂ）はこのステージの走査に伴う時間変化と試料の位置の関係を表している。図２の（ａ）と（ｂ）の横軸とは同じであり、時刻t₀からt₁の間に１絵素分通過し、この間に１絵素分の蛍光強度が検出される。この時刻t₀からt₁の間を２つの時間帯即ち、時刻t₀から時刻t₀ _１と、時刻t₀₁からt₁に分ける。前半は図２の（ａ）に示すように弱い励起光強度αＩ，後半はＩの強度で励起光を照射する。次に隣り合う絵素がステージの走査により検出されるが、同様にこの隣接絵素を検出する時刻t_１からt_２の間を２つの時間帯即ち、時刻t_１から時刻t_１１と、時刻t_１ ₁からt_２に分ける。前半は図２の（ａ）に示すように弱い励起光強度αＩ，後半はＩの強度で励起光を照射する。
【００２５】
このように励起光の強度を励起光ビームが１絵素通過する間に変化させることにより、図３、図４に示すように広いダイナミックレンジで検出することが可能になる。図３は３つの絵素を通過する時の蛍光検出をフォトンカウント法によって行う例である。連続する３つの絵素における蛍光標識の濃度が時刻t₀とt_１の間は通常の濃度、時刻t_１とt_２の間は非常に低い濃度、時刻t_２とt_３の間は非常に高い濃度の場合を示している。時刻t₀とt_１の間は通常の濃度であるため、励起光強度がαＩと弱いのでフォトンパルス信号はまばらになり、フォトンパルスカウント数Ｃ_０１は小さな値になる。しかし、時刻t₀ _１とt_１の間は励起光強度が強く、飽和には達していないが飽和に近い状態であり、フォトンパルスカウント数Ｃ_０２は大きな値となる。
【００２６】
図４は蛍光検出強度を横軸に、フォトンパルスカウント数を縦軸に示したものである。蛍光検出強度が強くなると、隣接するフォトンパルスが重なってしまい、見かけ上、フォトンパルスカウント数が少なくなる。このため図４の例に示すように、検出器に来るフォトンの数が２３００程度でフォトンパルスカウント数が最大に成り、これ以上多くのフォトンが来ると逆にフォトンパルスカウント数が減少する。このため時刻t₀ _１とt_１の間のフォトンカウント数は図４にＣ_０２の矢印で示すレベルになるが、このカウント数に対応する真のフォトンパルス数の候補値は２つ存在し、そのいずれが正しいかは分からない。
【００２７】
しかし、この検出の前の時刻t_０とt₀ _１の間において弱い励起光強度αＩで検出している時のフォトンカウント数Ｃ_０１の値が分かれば上記の２つの候補値のいずれが正しいかが分かる。Ｃ_０２の値がある値より小さければ、わかった候補値における強い励起光Ｉでの検出値を用いたほうが高精度の結果が得られるため、強い励起光Ｉでの検出値を採用する。逆にＣ_０２の値がある値より大きければ弱い励起光αＩでの検出値を用いるほうが良い。もちろん図４に示すようにグラフが線形でないため後述する方法を用いて補正により真の値を計算する。
【００２８】
図３の時刻t_１とt_２の間に亘って得られる検出絵素の蛍光標識密度は非常に小さいため励起光強度がαＩの時にフォトンカウント数が０となる。しかし励起光強度がＩの時には少ないカウント数ではあるがＣ_１２の値が検出できる。このときにも強い励起光で検出したＣ_１２の値を用いて補正により真のフォトンパルス数を計算する。
【００２９】
次の時刻t_２とt_３の間に亘って得られる検出絵素の蛍光標識密度は、非常に大きい。このため、弱い励起光強度αＩでも、十分なカウント数Ｃ_２１が得られる。逆に、励起光強度がＩの時にはフォトンパルスが重なり、このときのカウント数Ｃ_２２は、かえってＣ_１２よりも小さくなる。このように強い励起光の時にカウント数Ｃ_２２が小さければ弱い励起光の時のカウント数Ｃ_２１を採用することになる。
【００３０】
以上説明したように励起光が弱い時の値と強い時の値を共に制御回路１のメモリに記録し、この二つの値からいずれかの値又は双方の値を用いて真の値を求める。又上記の実施例ではフォトンカウント法を用いているが、検出法として、アナログ検出を行う場合にも同じように強度の異なる励起光を用いてより正確で、ダイナミックレンジの広い検出が可能になる。しかしフォトンカウント法を用いる方が微弱な蛍光まで検出することが可能であり、高感度検出が必要な場合にはフォトンカウント法を採用する方が有利である。
【００３１】
また試料に照射する励起光を絵素寸法相当の寸法のスポットに絞込み、このスポットと試料を相対的に走査して、試料全体を走査検出する場合には、マルチスポット光を用いる方が検出の高速度化を実現する上で有利である。マルチスポット光のスポット数をＭとすると、例えば１絵素の検出に要する時間を√Ｍ倍かけても、試料全体を検出する時間を１／√Ｍにすることが出来る。フォトンカウント検出をする場合には、１絵素の検出にかけられる時間に比例してダイナミックレンジを広げる効果があるので、検出にかける時間がながいほど、より広いダイナミックレンジで検出することができる。
【００３２】
図５を用いて、本発明の第２の実施形態を説明する。図５の基本的な構成は図１に示したものと同じであるので、図１の番号が同じものは同一物を表す。図１の実施例とは異なり、一定の強い励起光が試料５に照射される。発生する蛍光は対物レンズ３、波長選択ビームスプリッタ３１、干渉フィルタ３２を透過した後、ビームスプリッタ１１１に入射する。ビームスプリッタ１１１は例えば９５％は透過、５％は反射する。透過及び反射後の蛍光はフォトマル１１と１１´で検出される。このようにすれば５％を検出するフォトマルは上記の図１の実施例における弱い励起光における検出と、９５％を検出するフォトマルは強い励起光における検出とほぼ同じ検出値が得られる。この結果図１の実施例同様に、フォトマル１１´と１１の両方の検出結果を制御回路１´に送り記憶し、この２つの検出結果を用いて、前述と同様にして、精度の高い、ダイナミックレンジの広い検出が可能となる。
【００３３】
この方式の場合フォトマルを２つ用いる必要があるが、励起光を強弱制御する必要がなく、また励起光を強弱と時分割して変えて検出しないので、ほぼ２倍の検出時間をかけてフォトンカウント検出できるため、その分ダイナミックレンジを広げることが可能となる。
【００３４】
フォトンパルス信号のパルス幅ΔＴに対し，図２と図３で示した１絵素分のフォトンカウント時間ｔ_ｎ ₊ _１-ｔ_ｎ（ｎ整数）＝Ｔとする時、従来の方法では図４に示したようにダイナミックレンジが０．５・Ｔ／ΔＴ以下になる。図１又は図５に示す本発明による方式を採用することにより、初めて０．５・Ｔ／ΔＴ以上のダイナミックレンジで検出することが可能になった。この具体的な値として、従来法では１０００以上を得ることが困難であったが、本方法によりこれが可能になった。
【００３５】
また更に複数段階の励起光強度の採用もしくは蛍光検出光を複数に分岐し、それぞれの強度比を１:数十あるいは１:数百にし、並列に検出することにより、上記のダイナミックレンジを１００００以上にすることが初めて可能になった。
【００３６】
また、上記のフォトンカウント法を用いることにより非常に微弱な蛍光まで検出することが可能になり、上記のダイナミックレンジを満足し、かつ蛍光検出感度が５０蛍光分子数以下／絵素で検出することが可能になった。また上記のダイナミックレンジを満足し、かつ蛍光検出感度が１０蛍光分子以下／mｍ^２で検出することが可能になった。
【００３７】
図６は、本発明の第３の実施形態を説明する図である。２Ａ及び２Ｂは試料５´のＤＮＡ検査対象を励起する波長の異なる励起レーザ光源である。２Ａは波長４８８ｎｍのレーザ、２Ｂは波長５３２ｎｍのレーザである。それぞれのレーザの出力は１００〜２００ｍＷである。試料５´は所謂ＤＮＡマイクロアレーである。蛍光標識を付加されたターゲットＤＮＡを基板５´の上にあるプローブＤＮＡにハイブリダイズした試料である。２種類の励起レーザ光源２Ａ、２Ｂより発したレーザ光は以下に図１０で示すようにマルチビームを形成する。
【００３８】
図１０は、励起光４８８ｎｍの系であるが、励起光５３２ｎｍも同じ構成である。図１０で、光源２Ａより発したレーザ光は、周知のＡＯ変調器２１１Ａによりレーザ光の強度をマイクロ秒の切り替え速度で制御回路１の信号に基づいて変化させることが可能である。ＡＯ変調器の１次回折光として得られる励起光はミラー２１２Ａ、コリメータレンズ２１３Ａ、２１３２Ａ及び、ピンホールマスク２１３１Ａを通過し、所望のビーム径と広がり角になり、以下に説明するマルチビーム発生器に入る。
【００３９】
２１４１Ａと２１４２Ａは方解石から成るマルチビーム発生器であり、１本のビームを２１４１Ａに入射させたとき、２１４２Ａからは４本のビームに分岐して出射される。なお両方解石の間及び２１４２Ａの出射面には図示していない１／４波長板が挿入されている。２１４２Ａ出射後の４本のビームは交互に右と左の円偏光になっている。この４本のビームは平行四辺形と直角２等分三角形が接着され、この接着面が偏光ビームスプリッタとなっている２組のプリズム２１５１Ａと２１５３Ａに入射する。この２組のプリズムは寸法が１対２となっておりその間と出射面とにそれぞれ１／４波長板２１５２Ａと５１５４Ａとがある。入射した４本のビームはこれら２つのプリズムで１６本のビームとなる。
【００４０】
１６本のビームはマイクロレンズアレイ２１６Ａにより、４０μｍスポットに絞り込まれると共に、厚さ（高さ）のわずかに異なる２個の台形プリズムが底辺の偏光ビームスプリット面で接着さた台形プリズム２１７１Ａに入射する。この台形プリズム２１７１Ａにより１６本のビームはそれぞれのビームが２本づつに分岐されてピッチが半分の３２本のビームになる。台形プリズム２１７１Ａの出射面には１／４波長板があり３２本のビームは交互に右および左回転の円偏光になっている。
【００４１】
台形プリズム２１７１Ａを出射した３２本のビームは上記説明の台形プリズム２１７１Ａと同じ構造をしており、厚さの差が半分の第２の台形プリズム２１７３Ａに入射し、それぞれのビームが更に２本づつに分岐されてピッチが更に半分の６４本のビームとなって出射される。この出射面には１／４波長板２１７４Ａがあり、これを通過させることにより、交互に右回りと左回りとの合計６４本の円偏光ビーム２１１０Ａが得られる。
【００４２】
このようにして４８８ｎｍの光源２Ａから発してマルチスポット光学系２１Ａを介して得られた６４本のマルチビーム２１１０Ａと、全く同様の光学系で５３２ｎｍの光源２Ｂから発してマルチスポット光学系２１Ｂを介して得られた６４本のマルチビーム２１１０Ｂとは、図６に示すようにプリズム２個からなるビーム間隔調整器２２Ａ、２２Ｂにそれぞれ入射する。これらを通過した２色のマルチビームは波長選択ビームスプリッタ３１´で反射し、ＮＡの大きな対物レンズ３を通過し、試料５´の蛍光標識をマルチスポット状態で励起照明する。
【００４３】
図７は、この２色のマルチスポットが試料上を照射する状態を表す。５１は対物レンズの視野である。２１１０Ａは４８８ｎｍの６４スポットからなるマルチスポット励起光であり、２１１０Ｂは５３２ｎｍの６４スポットからなるマルチスポット励起光である。試料５´は図示していないステージとステージ駆動回路により図５の矢印の方向、即ち図７の６４マルチスポットアレーのアレー方向と直角の方向に走査される。マルチスポットの１個のスポット径は試料の必要分解能により決められるが、本実施例では２μｍであり、スポットのピッチは２０μｍである。
【００４４】
このような２つの励起光で励起され、発生する蛍光は図５で対物レンズ３、波長選択ビームスプリッタ３１´を通過した後、蛍光分離ミラー１１２により、それぞれの蛍光波長で分離検出するために、２つの蛍光波長帯の蛍光に分岐される。即ち、４８８ｎｍの励起光で発生した５００ｎｍ近傍の蛍光は蛍光分離ミラー１１２で反射し、５００ｎｍに中心を持つ干渉フィルタ３２１Ａを透過して６４チャンネルのフォトマル１１Ａに入射する。同様に５３２ｎｍの励起光で発生した５７０ｎｍ近傍の蛍光は蛍光分離ミラー１１２を透過し、５７０ｎｍに中心を持つ干渉フィルタ３２１Ｂを透過して６４チャンネルのフォトマル１１Ｂに入射する。
【００４５】
蛍光分離ミラー１１２は図８に示すように下半分の１１２Ａの部分が５００ｎｍを反射し、５７０ｎｍを透過する。又上半分の１１２Ｂの部分が５７０ｎｍを透過し、５００ｎｍを反射する。図９はフォトマル１１Ａと１１Ｂの詳細図である。この図では、フォトマル１１Ａとフォトマル１１Ｂとを代表して便宜上フォトマル１１として説明する。フォトマル１１の前にはマスク１１０２があり、６４チャンネルの開口アレー１１０１の前に配置され、中心部に狭いスリット１１０３が形成されている。試料５´がマルチスポットで励起されて発生した各スポットに対応する蛍光は、対物レンズ３を介してこのマルチチャンネルのフォトマルの各開口に蛍光スポット像１１２１として結像する。
【００４６】
このようにして試料５´上の各スポットからの蛍光が分離検出され、図６の制御回路でフォトンカウント信号が各励起光に対し、同時に６４のデータが得られる。試料５´は前述のようにマルチスポットアレーに直交する方向に走査され、走査端に至れば、マルチスポットアレーの並びの方向にスポット径分移動させ、逆の方向に走査することを繰り返して蛍光検出を行うことにより、所望の領域の蛍光検出を行うことが出来る。
【００４７】
この際、１絵素分を通過する時間Ｔの間を２つに分け、前述のように、ＡＯ変調器２１１Ａ（２１１Ｂ）を用いて励起光強度を変えて検出することにより、広いダイナミックレンジで検出することが可能になる。
【００４８】
励起光強度を２段階あるいは３段階にして検出する具体的実施形態を以下に説明する。各励起光強度の段階での検出時間Ｔを４０μｓとし、フォトンパルス幅ΔＴを１０ｎｓとする。このパルス幅ΔＴをｍ（例えば１０００）等分する。以下ΔＴ／ｍを時刻のサンプル点とする。検出時間Ｔの間にフォトンパルスが平均ｎ個検出されるとする。検出時間Ｔ内の任意の時点に着目し、この着目時点（時刻）ｔ_０でフォトンパルス信号の立ち上がりがあったとする。Ｔ／ΔＴをＮとすると、各サンプル点でフォトンパルス信号が立ち上がる確率ｐはｎ／Ｎｍであるので、上記着目時点から前のｍ+１個のサンプル点にフォトンパルスの立ち上がりが発生しない確率は（１-ｐ）^ｍ ⁺ ^１と成る。即ち着目パルスが前方のパルスと重ならない確率ｐ_０は次式で与えられる。
【００４９】
【数１】
ｐ_０＝（１-ｐ）^ｍ ⁺ ^１（数１）
但し
【数２】
ｐ＝ｎ／Ｎｍ（数２）
逆に着目パルスの前方にパルスが発生し、重なる確率は１-ｐ_０である。従って２個のパルスが連なっている確率は、着目パルスの前方の時間ΔＴ内に１-ｐ_０の確率でパルスの立ち上がりがあり、その前方の時間ΔＴ内に確率ｐ_０でパルスの立ち上がりがない場合であるので、ｐ_０（１-ｐ_０）となる。同様にｍパルス重なる確立はｐ_０（１-ｐ_０）^ｍとなる。
【００５０】
この結果重なりがなければ検出時間Ｔの間に平均ｎパルスカウントされるが、実際は重なりが生じパルスカウント数が減少する。この減少数ｄ_ｎは下記の式で与えられる。
【００５１】
【数３】

【００５２】
従って、検出時間Ｔの間で検出されるパルスカウント数ｎ_ｅは
【００５３】
【数４】

【００５４】
となる。これはほぼ図４のようになる。
【００５５】
図４は１絵素を検出するのに要する時間Ｔを４０μｓ、フォトンパルス信号の時間幅ΔＴを１０ｎｓとしている。従って上記のＮの値は、Ｎ＝Ｔ／ΔＴ＝４０００となる。ｍ＝１０００とし、上記の式（１）〜（４）を用いて、検出時間Ｔ内の平均フォトンパルス数ｎに対し、実際に検出されるフォトンパルスカウント数ｎ_ｅは表１（但し、表１においては、フォトンパルスカウント数を略してパルスカウント数と記載している）のようになる。
【００５６】
【表１】

【００５７】
図４及び表１からも分かるようにフォトンパルスｎが２２００前後で、フォトンパルスカウント数ｎ_ｅは１５１５程度で最大と成り、更にｎが大きくなるとｎ_ｅは減少する。また最大値近辺ではグラフの微分値が小さくなり、精度が落ちる。従ってフォトンパルスカウント数として、この例では１４００程度までを用いる。
【００５８】
フォトンパルスカウント数が１４００以下の時のフォトンパルス数は２つの候補値があるので、小さいほうの候補値を用いる。またｎとｎ_ｅの関係は線形でないので、表１で概略が示されるような関係を数値テーブルとして用意し、検出されるフォトンパルスカウント数ｎ_ｅから真のフォトンパルス数ｎを求める。上記の数値テーブルを用いずｎ_ｅとｎ関係を数式で近似して、即ちｎをｎ_ｅの関数式ｎ（ｎ_ｅ）として近似し、この式を用いてｎ_ｅからｎを求めても良い。
【００５９】
このようにフォトンパルス数が大きくなると、フォトンパルスカウント数は減少するため、次に具体的に示すように励起光を２段階あるいは３段階に変化させて検出する。表２及び表３にそれぞれ２段階及び３段階の励起光強度で検出する例を示す。検出時間Ｔ及びフォトンパルス時間幅ΔＴは上記の表１の説明で用いた値を用いる。
【００６０】
【表２】

【００６１】
表２は２段階の励起光強度Ｉ_ｓとＩ_ｗで励起する場合であり、Ｉ_ｗの強度はＩ_ｓの強度の１／２０である。励起光強度Ｉ_ｓによるカウント値が１以上１２００以下で、励起光強度Ｉ_ｗによるカウント値が６０以下のときには、表２において真中の列の太枠で囲った励起光強度Ｉ_ｓのカウント値を採用する。励起光強度Ｉ_ｗによるカウント値が６０以上のときには、表２において右の列の太枠で囲った励起光強度Ｉ_ｗのカウント値を採用する。このようにすればフォトンパルスが１〜２００００までを８０μｓで検出できることになる。従来の一定レベルの励起光強度での検出では８０μｓかけて１〜３０００程度が限界であったから大幅なダイナミックレンジの向上が図れている。
【００６２】
上記の説明では１カウントが最低レベルとしているが、フォトンの検出はランダムであるため平均１カウントでは０になることもある。そこで最低カウントを４カウントとすれば、本方式でのダイナミックレンジは５０００、従来の方法では７５０が限界となる。
【００６３】
【表３】

【００６４】
表３は３段階の励起光強度Ｉ_ｓ，Ｉ_ｍ，Ｉ_ｗである。それぞれの強度比は１００対１０対１である。
【００６５】
励起光強度Ｉ_ｓによるカウント値が１以上１２００以下で、励起光強度Ｉ_ｍによるカウント値が１２０以下のときには、表２において左から２番目の列（Ｉ_ｓの列）の太枠で囲った励起光強度Ｉ_ｓのカウント値を採用する。
【００６６】
励起光強度Ｉ_ｍによるカウント値が１２０以上１２００以下で、励起光強度Ｉ_ｓによるカウント値が１２０以下のときには、表３において真中の列の太枠で囲った励起光強度Ｉ_ｍのカウント値を採用する。励起光強度Ｉ_ｍによるカウント値が１２０以上のときには、表３において右の列の太枠で囲った励起光強度Ｉ_ｗのカウント値を採用する。このようにすれば１〜２０００００フォトンパルスまで検出することが出来るようになる。
【００６７】
前述の表２と同様に、４カウントを最低検出値とすればダイナミックレンジは５００００となり、従来に比べけた違いに広いダイナミックレンジ検出が可能になる。また前述した、最低カウントを４カウントとすれば、本方式でのダイナミックレンジは１２５００となる。
【００６８】
上記表２及び、表３を用いて説明したダイナミックレンジの向上は、励起光強度の２及び３段階変化による検出である。しかし、図５で説明した検出励起光を１：２０あるいは１：１０：１００に比で分岐して複数のフォトマルで検出しても、同じ結果が得られる。このときには並列で検出しているから検出時間は２段階では１／２、３段階では１／３になる。
【００６９】
上記の例では励起光強度の一方のみの値を最終的な値として採用したが、採用データの切り替え領域に近いところで２つの情報から重み付け平均を行い、最終データとしても良い。例えば表２の１０００〜２０００の境界では励起光強度がＩ_ｓのカウント値ｎ_ｅｓに対する前述のテーブルを用いて求めたフォトンパルス数ｎ（ｎ_ｅｓ）と、Ｉ_ｗのカウント値ｎ_ｅｗに対する前述のテーブルを用いて求めたフォトンパルス数ｎ（ｎ_ｅｗ）とを用いる。
【００７０】
両方のデータから下記の式でフォトンパルス数ｎ_０を求め、この値を採用する。
【００７１】
【数５】
ｎ_０＝（α×２０×ｎ（ｎ_ｅｓ）+β×ｎ（ｎ_ｅｗ））／（α+β）・・・（数５）
ここで２０は励起光強度の比であり、αとβは重み付けの係数である。重み付け係数として例えば下記の式のものを採用する。
【００７２】
【数６】
α＝（１５００−ｎ_ｅｓ）×ｎ_ｅｓ／１０００００
β＝（ｎ_ｅｗ）^２／１０００・・・（数６）
このようにすればＩ_ｓが約１２００以上のときに励起光強度がＩ_ｗの方に急激に重みが付き、逆にＩ_ｓが約１２００以下のときに励起光強度がＩ_ｓの方に急激に重みが付く。
【００７３】
この結果、自動的に表２の太枠部分の値を主に採用していることになる。重み付けの方法は上記の以外に種々考えられるが、表１や図４のフォトンパルス数とパルスカウント数の関係を吟味し、決めればよい。
【００７４】
このようにして求めたフォトンパルス数ｎ_０の情報を、試料上のプローブＤＮＡの位置情報と共に記憶手段に記憶する。またこのとき、検査の条件や、プローブＤＮＡに関する情報、試料に関する情報なども上記情報と関連付けて一緒に記憶しておいても良い。
【００７５】
この記憶したデータを別途記憶しておいたデータと比較することにより、蛍光検出したＤＮＡの状態を検査・評価することができる。
また、上記求めたフォトンパルス数ｎ_０の情報を、試料上のプローブＤＮＡの位置情報と共に、図示していない画面上に表示して、オペレータに結果を閲覧できるようにしても良い。
【００７６】
更に、この求めたフォトンパルス数ｎ_０の情報を、試料上のプローブＤＮＡの位置情報と共に、通信手段を介して解析装置や分析装置、他の検査装置などに送信して用いることもできる。
【００７７】
上記の実施形態例では、励起光として、２つの波長の励起光を用いているが３つ以上の励起光を用いても良い。また上記５´はＤＮＡマイクロアレーとして説明したが、蛍光特性を有する物質を含む対象であれば何でも良く、蛋白質等の検査にも本発明は適用できる。また検出対象が基板上に固定されたものである必要はなく、ビーズの１次元あるいは２次元配列のサンプルでも良いし、キャピラリーチューブ内の蛍光物質を含む液体、固体でも良い。
【００７８】
又上記の蛍光検出では２次元画像を走査により検出した実施例のみを用いて説明したが、強弱の２段階以上の励起光で高感度の２次元撮像装置で検出することによっても本発明を実現できることは明らかである。
【００７９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明により、蛍光分子の密度が場所によって千以上、更に１万倍以上異なるような試料に対しても、広いダイナミックレンジを持って定量的に検出できるようになり、またこの広いダイナミックレンジを維持した状態で高感度に検出を行うことも可能になった。
【００８０】
また、このように広いダイナミックレンジによる高感度な検出にマルチスポットビームを採用することにより、１つの試料全面の蛍光を検出するのに要する時間を短くすることが可能になり、スループットが高い高速検出を行うことができる。
【００８１】
この結果、特に今後のＤＮＡ発現解析分野等の広ダイナミックレンジ・高感度・高速蛍光検出が必要な分野で効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によるＤＮＡ検査装置の第１の実施形態の概略構成を示す正面図である。
【図２】図２（ａ）は、本発明による励起光強度の時間変化を示すグラフ、（ｂ）はステージ走査量の時間変化を示すグラフである。
【図３】図３は、フォトンカウント信号を説明する図である。
【図４】図４は、フォトンパルス信号とフォトンカウント数の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明によるＤＮＡ検査装置の第２の実施形態の概略構成を示す正面図である。
【図６】図６は、本発明によるＤＮＡ検査装置の第３の実施形態の概略構成を示す正面図である。
【図７】図７は、２色励起光での試料上の照射スポットアレーを示す対物レンズ視野の平面図である。
【図８】図８は、２つの蛍光を分離する蛍光分離ミラーの正面図である。
【図９】図９は、マルチスポットからの蛍光を検出するマルチチャンネルフォトマルの斜視図である。
【図１０】図１０は、励起レーザ光源からマルチスポットを得る光学系の基本構成を示す正面図である。
【符号の説明】
１・・・制御回路２・・・励起光源３・・・対物レンズ５・・・試料１１・・・蛍光検出器２１・・・マルチスポット光学系３１・・・波長選択ビームスプリッタ３２・・・干渉フィルタ

Claims

複数に分割された領域のそれぞれに蛍光体を含む試料が配置された検査対象物に励起光を照射し、該励起光の照射により発生する蛍光を検出する方法であって、異なる強度の励起光を検査対象物の複数に分割されたそれぞれの領域に順次照射し、該照射により前記対象物のそれぞれの領域から発生する蛍光を前記励起光の強度に対応させて検出し、該励起光の強度に対応させて検出した蛍光に関する情報を用いて前記対象物が発生した蛍光値を求めることを特徴とする蛍光画像検出方法。
前記励起光が複数のビームにより構成されており、該複数のビームをそれぞれ前記対象物の異なる領域に同時に照射することを特徴とする請求項２記載の蛍光検出方法。
前記蛍光を励起光の強度に対応して検出することにより前記対象物から複数の蛍光検出信号を得、該得た複数の蛍光検出信号の中から何れかの励起光強度に対応する蛍光検出信号の情報を用いて前記対象物の蛍光画像を得ることを特徴とする請求項１記載の蛍光画像検出方法。
蛍光体を含む試料を有する検査対象物に強度の異なる複数の励起光を順次照射する照射工程と、該照射工程で強度の異なる複数の励起光を順次照射することにより前記試料から発生する蛍光強度の異なる複数の画像を順次取得する画像取得工程と、該画像取得工程で順次取得した蛍光強度の異なる複数の画像を用いて前記試料が発生した蛍光値を求める処理工程とを有することを特徴とする蛍光画像検出方法。
前記検査対象物は蛍光体を含む試料が複数に分割された領域に配置されており、前記照射工程において前記検査対象物の複数の領域の試料に同時に励起光を照射し、前記画像取得工程において前記同時に励起光を照射した複数の領域の画像を同時に取得することを特徴とする請求項６記載の蛍光画像検出方法。
前記求める蛍光値のダイナミックレンジが１０００以上であることを特徴とする請求項１乃至４の何れかに記載の蛍光画像検出方法。
複数に分割された領域のそれぞれに蛍光体を含む試料が配置された検査対象物に励起光を照射し、該励起光の照射により発生する蛍光を検出する装置であって、強度の異なる励起光を発生する励起光発生手段と、該励起光発生手段で発生させた強度の異なる励起光を前記検査対象物のそれぞれの領域に順次照射する励起光照射手段と、該励起光照射手段により強度の異なる励起光を順次照射することにより前記対象物のそれぞれの領域から発生する蛍光を前記励起光の強度に対応させて検出する蛍光検出手段と、該蛍光検出手段で前記励起光の強度に対応させて検出した蛍光の検出信号を処理して前記対象物の蛍光発生に関する情報を得る処理手段とを備えたことを特徴とする蛍光画像検出装置。
前記励起光発生手段は励起光として複数のビームを発射し、該複数のビームをそれぞれ前記対象物の異なる領域に同時に照射することを特徴とする請求項７記載の蛍光画像検出装置。
前記蛍光を励起光の強度に対応して検出することにより前記対象物から複数の蛍光検出信号を得、該得た複数の蛍光検出信号の中から何れかの励起光強度に対応する蛍光検出信号の情報を用いて前記対象物の蛍光画像を得ることを特徴とする請求項７記載の蛍光画像検出装置。
ＤＮＡに蛍光標識を付加して形成した試料を基板上の複数の領域に配置した検査対象物に励起光を照射して該照射により前記試料から発生する蛍光を検出するＤＮＡ検査方法であって、異なる強度の励起光を前記複数の領域に配置されたそれぞれ試料に順次照射し、該照射により前記それぞれの試料から発生する蛍光を前記励起光の強度に対応させて検出し、該励起光の強度の対応させて検出した蛍光に関する情報を用いて前記検査対象物の蛍光発生に関する情報を得ることを特徴とするＤＮＡ検査方法。
前記励起光が複数のビームにより構成されており、該複数のビームをそれぞれ前記異なる領域に配置した試料に同時に照射することを特徴とする請求項１０記載のＤＮＡ検査方法。
ＤＮＡに蛍光標識を付加して形成した試料を基板上の複数の領域に配置した検査対象物に励起光を照射して該照射により前記試料から発生する蛍光を検出するＤＮＡ検査装置であって、強度の異なる励起光を発生する励起光発生手段と、該励起光発生手段で発生させた強度の異なる励起光を前記検査対象物のそれぞれの領域に配置した試料に順次照射する励起光照射手段と、該励起光照射手段により強度の異なる励起光を順次照射することにより前記それぞれの領域に配置した試料から発生する蛍光を前記励起光の強度に対応させて検出する蛍光検出手段と、該蛍光検出手段で前記励起光の強度に対応させて検出した蛍光の検出信号を処理して前記検査対象物の蛍光発生に関する情報を得る処理手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ検査出装置。
前記励起光発生手段は励起光として複数のビームを発射し、該複数のビームをそれぞれ前記対象物の異なる領域に配置した試料に同時に照射することを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡ検査装置。
前記蛍光を励起光の強度に対応して検出することにより前記対象物から複数の蛍光検出信号を得、該得た複数の蛍光検出信号の中から何れかの励起光強度に対応する蛍光検出信号の情報を用いて前記対象物の蛍光画像を得ることを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡ検査装置。