JP2005173604A

JP2005173604A - 走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための方法及び装置

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Publication number: JP2005173604A
Application number: JP2004354160A
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Inventors: Volker Seyfried; ザイフリートフォルカー; Rafael Storz; シュトルツラファエル
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2004-12-07
Publication date: 2005-06-30
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Abstract

【課題】単純な手段により複数の異なる放射波長を分離するための方法および装置を提供すること。
【解決手段】被検対象（４）が、ビーム偏向装置によって該被検対象（４）上に案内されると共に、複数の異なる励起波長（１、２、３）を有する照明光ビーム（１０）によって走査され、及び前記被検対象（４）から射出すると共に、前記励起波長（１、２、３）に相応する複数の放射波長を含む放射光が、少なくとも１つの検出器（５）で検出されるように構成された走査顕微鏡（６）において複数の異なる放射波長を分離するための方法において、前記複数の励起波長（１、２、３）は、走査過程中に予設定可能な照明スキームに相応して選択的に前記照明光ビーム（１０）に導入されること、前記検出器（５）は、励起波長（１、２、３）の導入毎に読み出されること、及び検出された信号（複数）は、前記予設定可能な照明スキームの使用下において、前記複数の励起波長（１、２、３）に割り当てられることを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、走査顕微鏡などにおける複数の異なる放射波長の分離方法及び装置に関する。特に本発明は、被検対象が、ビーム偏向装置によって該被検対象上に案内されると共に、複数の異なる励起波長を有する照明光ビームによって走査され、及び前記被検対象から射出すると共に、前記励起波長に相応する複数の放射波長を含む放射光が、少なくとも１つの検出器で検出されるように構成された走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための方法及び装置に関する。

上述の種類の方法及び装置は、実際上、以前から知られており、とりわけ蛍光顕微鏡に使用されている。蛍光顕微鏡では、被検対象は、複数の蛍光着色物質によりしばしば着色されるため、個々の放射波長を分離することが非常に重要である。これまで知られている方法では、まず、被検対象を所定時間の間第１の励起波長によって照明してデータを取得して、被検対象の第１の撮像を実行する。次に被検対象を同じ所定時間の間第２の励起波長により照明して、被検対象の第２の撮像を実行する。この方法は、被検対象に含まれる複数の蛍光着色物質の励起波長すべてに対して順次実行され、励起波長（複数）の各々に対して独自の画像が得られる。この方法は、ラインごと又は画像ごとに実行することができ、「シーケンシャルスキャン」として知られている。

これに関する公知文献には、以下のものがある。

ＤＥ１０２２５８３８Ａ１ＤＤ２６０３４２Ａ１ＤＥ１００５４４２６Ａ１ＤＥ１０２１０７３７Ａ１ＤＥ４１１５４０１Ｃ２

既知のシーケンシャルスキャンでは、個々の画像を生成するために被検対象が何度も走査されなければならないという点で、とりわけ不利である。この過程は、撮像速度が走査過程の速度によって実質的に制限されるため、極めて時間が掛かる。そのため、通常の撮像と比べると、２つの励起波長に対して別個の画像を記録するためにはほぼ２倍の時間が必要となり、３つの励起波長に対してはほぼ３倍の時間が必要となる。このため、共焦点走査顕微鏡における画像速度は、著しく低下する。

更に、シーケンシャルスキャンの場合、例えば短いタイムスケールで被検対象の内部で進行するプロセスに基づき、急速に画像が変化する際に問題が生じる。このような急速なプロセスが発生すると、個々の画像間に相違が生じる。なぜなら、複数の異なる励起波長に対する画像（複数）は、同時には撮像されないからである。このことは、とりわけ２方向のラインシーケンシャルスキャンの場合に深刻である。なぜなら、この場合個々のピクセル間に固定的な（一定の）時間関係が存在しないからである。このようにして取得された画像データが、例えばスペクトル分離（Entfaltung）又は線形アンミキシング（Unmixing）による従来の方法により更に処理される場合、これら処理された画像（複数）には、アーチファクトが発生する。

それゆえ、本発明の課題は、簡単な手段により、複数の励起波長に対する被検対象の別個の画像（複数）を撮像するための撮像速度を大きくし、以ってとりわけ被検対象内で急速に進行するプロセスでさえも誤り（誤差、ぶれ）なく結像できるように、冒頭に述べた種類の走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための方法及び装置を構成・改善することである。

上記の課題を解決するために、本発明の方法の視点により、走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための波長分離方法が提供される。特に、被検対象が、ビーム偏向装置によって該被検対象上に案内されると共に複数の異なる励起波長を有する照明光ビームによって走査され、かつ前記被検対象から射出すると共に前記励起波長に相応する複数の放射波長を含む放射光が、少なくとも１つの検出器で検出されるように構成された走査顕微鏡において、複数の異なる放射波長を分離するための方法が提供される。この方法において、前記複数の励起波長は、走査過程中に予設定可能な照明スキームに相応して選択的に前記照明光ビームに導入（ないし差込入射）される（zugeschaltet）こと、前記検出器は、励起波長の導入毎に読み出されること、及び検出された信号（複数）は、前記予設定可能な照明スキームの使用下において、前記複数の励起波長に割り当てられることを特徴とする（形態１・基本構成１）。

更に、上記の課題を解決するために、本発明の装置の視点により、走査顕微鏡において複数の異なる放射波長の分離装置が提供される。特に、複数の異なる励起波長を有すると共に、被検対象を走査するためにビーム偏向装置によって該被検対象上に案内される照明光ビームを生成するための少なくとも１つの光源を有し、及び前記被検対象から射出すると共に、前記複数の励起波長に相応する複数の放射波長を含む放射光を検出するための少なくとも１つの検出器を有しするよう構成された走査顕微鏡において、複数の異なる放射波長を分離するための（とりわけ形態１〜１８の何れか一の方法を実行するための）、装置が提供される。この装置において、前記複数の励起波長は、走査過程の間、予設定可能な照明スキームに相応して選択的に前記照明光ビームに導入（差込入射ないし結合）可能に構成されること、前記検出器は、励起波長の導入毎に読み出し可能に構成されること、及び検出された信号（複数）は、前記予設定可能な照明スキームの使用下において前記複数の励起波長に割り当て可能に構成されることを特徴とする（形態１９・基本構成２）。

本発明の方法に係る独立請求項１及び本発明の装置に係る独立請求項１９により、上記課題に対応した効果が達成される。即ち、本発明の方法及び装置は、簡単な手段で、複数の励起波長に対する被検対象の別個の画像（複数）を撮像するための撮像速度を大きくし、以ってとりわけ被検対象内で急速に進行するプロセスでさえも誤差なく結像することを可能とする。
更に、各従属請求項により、付加的な効果が後述の通り達成される。

以下に、本発明の好ましい実施の形態を、上記基本構成１を形態１及び上記基本構成２を形態１９として示すが、これらの実施の形態は従属請求項の対象でもある。
（２）上記形態１の方法において、複数の異なる励起波長として離散的（diskret）な複数のレーザ線（波長）が使用されることが好ましい（形態２）。
（３）上記形態２の方法において、前記複数の励起波長は、それぞれのレーザのオン・オフ切換により前記照明光ビームに導入されることが好ましい（形態３）。
（４）上記形態１〜３の方法において、前記照明スキームによって、前記複数の励起波長の各々の導入の時点及び持続時間が設定されることが好ましい（形態４）。
（５）上記形態１〜４の方法において、前記照明スキームによって、前記複数の励起波長の各々に対する（光）強度が個別に設定されることが好ましい（形態５）。
（６）上記形態１〜５の方法において、前記被検対象上における前記照明光ビームの空間的推移と前記照明スキームとは、前記複数の励起波長の各々が前記被検対象の撮像の１つのピクセル内で少なくとも一回前記照明光ビームに導入されるように、互いに調整して規定されることが好ましい（形態６）。
（７）上記形態１〜６の方法において、前記照明スキームによって、走査過程の時間推移にわたって規則的に反復される前記複数の励起波長の個々の導入のシーケンスが設定されることが好ましい（形態７）。
（８）上記形態７の方法において、前記被検対象上における前記照明光ビームの空間的推移と前記照明スキームとは、前記反復されるシーケンスの完全な１サイクルが前記被検対象の撮像の１つのピクセルに相応するように、互いに調整して規定されることが好ましい（形態８）。
（９）上記形態７の方法において、前記被検対象上における前記照明光ビームの空間的推移と前記照明スキームとは、前記反復されるシーケンスの複数のサイクル、好ましくは２又は３サイクルが前記被検対象の撮像の１つのピクセルに相応するように、互いに調整して規定されることが好ましい（形態９）。
（１０）上記形態１〜９の方法において、前記照明光ビームには、常に、ただ１つの励起波長のみが導入されることが好ましい（形態１０）。
（１１）上記形態７〜９の方法において、前記照明光ビームには、１つのサイクル内において、予設定可能な時点に、複数の、好ましくは２つの励起波長が同時に導入されることが好ましい（形態１１）。
（１２）上記形態１〜１１の方法において、前記被検対象の個々の画像の再構成は、前記検出された信号（複数）の適正な乗算、和形成（加算）及び／又は差形成（減算）によって実行されることが好ましい（形態１２）。
（１３）上記形態１２の方法において、複数の異なる励起波長に対して再構成された画像が、オーバレイで表示されることが好ましい（形態１３）。
（１４）上記形態１〜１３の方法において、検出器として、フォトマルチプライヤ、ＡＰＤ、ＭＣＰ検出器、高速フォトダイオードアレイ等が使用されることが好ましい（形態１４）。
（１５）上記形態１〜１４の方法において、励起波長の導入の光強度及び／又は持続時間は、前記走査過程の前記時間推移にわたって変化されることが好ましい（形態１５）。
（１６）上記形態１５の方法において、前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、測定前に設定されることが好ましい（形態１６）。
（１７）上記形態１５の方法において、前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、所定の予設定可能な測定データに依存し測定中に自動的に設定されることが好ましい（形態１７）。
（１８）上記形態１５の方法において、前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、現時点の画像及び／又は事前に撮像されている複数の画像の抽出データから画像処理によって得られる情報に依存して設定されることが好ましい（形態１８）。
（２０）上記形態１９の装置において、励起波長の前記導入は、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、ＥＯＭ、機械的シャッタによって、又はレーザの直接的制御によって行われることが好ましい（形態２０）。
（２１）上記形態１９又は２０の装置において、前記導入される励起波長の光強度は、減衰器、フィルタ、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、ＥＯＭ等によって調整可能であることが好ましい（形態２１）。
（２２）上記形態２１の装置において、前記ＡＯＴＦは、前記光強度を連続的に調整するために、前記複数の励起波長を導入するためのデジタル回路と接続されるよう構成されることが好ましい（形態２２）。
（２３）上記形態１９〜２２の装置において、励起波長の導入の時間的割り当て及び前記検出器の読み出しのためのコンピュータユニットが設けられることが好ましい（形態２３）。
（２４）上記形態２３の装置において、前記コンピュータユニットは、前記検出された信号（複数）の前記複数の異なる励起波長への割り当てを制御可能に構成されることが好ましい（形態２４）。
（２５）上記形態２３又は２４の装置において、前記コンピュータユニットは、ＣＰＵ、ＤＳＰ、ＦＰＧＡ、ドライバボード等を含んで構成されることが好ましい（形態２５）。
（２６）上記形態１９〜２５の装置において、前記検出器は、フォトマルチプライヤ、ＡＰＤ、ＭＣＰ検出器、高速フォトダイオードアレイ等であることが好ましい（形態２６）。

本発明では、まず、複数の励起波長に対して撮像速度が低下するという観点から、（走査過程の際に）走査過程自体が時間短縮（ないし高速化）されなければならないことが認識されている。なぜなら、走査過程は、撮像速度の設定に決定的役割を有するからである。次に、この知見に基づき、検査されるべき複数の励起波長は、すべて、ただ１つの走査過程で処理可能であるということが認識されている。このため、本発明では、複数の励起波長が、走査過程の間、予設定可能な照明スキームに相応して選択的に照明光ビームに導入（ないし差込入射：zuschalten）される。励起波長の導入毎に、検出器は、少なくとも一回読み出され、及び上記（既知の）予設定可能な照明スキームに基づいて、検出された信号（複数）は、励起波長（複数）に割り当てられる。このようにして、ただ１つの走査過程のみにより、励起波長（複数）の各々に対して１つの独自の画像を撮像することができる。このため別個の画像（複数）を記録するために必要な時間が、既知のシーケンシャルスキャンと比べて格段に短縮される。さらに、本発明の方法により、例えば生物学的又は生化学的プロセスのような被検対象内部での急速なプロセスをエラーないしずれ無しで撮像することができる。なぜなら個々の励起波長に対する画像（複数）が実質的に同時に撮像されるからである。

有利な一態様では、複数の異なる励起波長として離散的レーザ線（波長）が使用可能である。この場合、個々の励起波長は、例えばそれぞれのレーザ（光源）を単にオン・オフ切換することにより極めて簡単に照明光ビームに導入することができる。

検出された信号（複数）を個々の励起波長に簡単に割り当てるという観点から、励起波長（複数）の各々の導入の時点及び持続時間は、何れも、照明スキームにおいて正確に設定することが可能である。さらに、被検対象の正確な定量的検査のために、励起波長が導入される際のその（光）強度が、照明スキームにおいて、励起波長（複数）の各々に対し個別に設定することができる。

被検対象ののちの撮像において撮像の各ピクセルが励起波長（複数）の各々に関する情報を含むようにするために、複数の励起波長の各々が被検対象の撮像の１つのピクセル内で少なくとも一回照明光ビームに導入されるように、被検対象上での照明光ビームの空間的推移及び照明スキームは互いに調整して規定可能である。所定の被検対象領域に対し特定の励起波長（複数）がとりわけ重要であるならば、このような励起波長は、ピクセル毎に複数回導入することができる。これに対し、特定の励起波長の導入は、「関心のない」被検対象領域に対応するピクセルに対してはまったく実行しないことも可能である。

好ましい一実施形態では、照明スキームにおいて、走査過程の時間推移にわたって規則的に反復される（繰り返し実行される）個々の励起波長の導入のシーケンスが設定される。この場合、反復されるシーケンスの完全な１サイクルが被検対象の撮像の１つのピクセルに対応するように、被検対象上の照明光ビームの空間的推移及び照明スキームは互いに調整して規定可能である。このため、具体的な（１つの）励起波長の（１つの）所定の画像の複数のピクセルが互いに直接比較可能であることが達成される。なぜなら、すべてのピクセル情報は、その都度の同じ照射から生じるからである。このことは撮像された複数の画像のどの１つに対しても当てはまる。

同様に、完全なただ１つのサイクルの代わりに、反復されるシーケンスの複数の、好ましくは２又は３のサイクルが、被検対象の撮像の１つのピクセルと対応するように構成することも可能である。被検対象上における照明光ビームの空間的推移と照明スキームとをこのように互いに調整して規定することによって、ピクセルごとに、比較的大きい照明強度と、これにより改善された光子統計が実現可能となる。

検出された信号（複数）を個々の励起波長にとりわけ簡単に割り当てるという観点から、照明光ビームには、走査過程の任意の時点において、その都度常にただ１つの励起波長のみが導入されるよう構成することができる。或いは、この構成の代わりに、照明光ビームに、予設定可能な複数の時点（の各々）において、複数の、好ましくは２つの励起波長が同時に導入されるよう構成することも可能である。後者の措置により、走査速度が同じでも光子統計が改善され、又は光子統計が同じでも走査過程の速度が高められることが可能となる。

その都度選択される照明スキームに依存して、被検対象の個々の画像の再構成（再生）は、検出された信号（複数）の適正な乗算、和形成及び／又は差形成によって実行することができる。一般的には、個々の画像を再構成するために、相応の一次（線形）方程式システムを解くことが必要である。検査された被検対象に関する最大情報密度を生成するために、複数の異なる励起波長に対し再構成された画像（複数）をオーバレイ（Overlay）で表示することができる。

検出器としては、例えばフォトマルチプライヤ、ＡＰＤ（アバランシュ・フォトダイオード）、ＭＣＰ（マイクロチャネル・プレート・ディテクタ）又はフォトダイオードアレイを使用することができる。これに関連して重要なことは、励起波長の導入毎に（少なくとも１回）検出器が読み出し可能であるように、検出器の速度が十分に大きいことである。

とりわけ好ましい一実施形態では、励起波長の導入の光強度及び／又は持続時間が、走査過程の時間推移にわたって変化可能に構成される。そのため、例えばＲＯＩ（関心局所ないし目的領域：Regions of Interest）、即ち特定の理由からとりわけ関心が持たれる被検対象の局所的に限定された領域において、所定のレーザ線（複数）を増強又は低減して導入（差込入射）することが可能であり、又は完全に遮断（導入解除）することも可能である。

この場合、光強度及び／又は持続時間の変更（変化）は、測定前に予め設定することも可能である。本発明の方法の大きな柔軟性の観点から、この変更は、測定中に設定することも可能であり、これにより所定の予設定可能な測定データに対しアクティブに反応することも可能である。例えば検出された信号（複数）において複数の放射波長の１つが過度に小さい強度で現出すれば、測定過程中に対応する励起波長の強度を大きくすることができ、又はこの反対の場合には、逆に（励起波長の強度を）小さくすることができる。光強度及び／又は持続時間の相応の変更は、実際の（各瞬間瞬間の）画像又は先行する（複数の）画像の抽出データから画像処理によって得られた決定基準を用いて実行することも可能である。

本発明の装置の好ましい一実施形態では、励起波長の導入は、具体的には、ＡＯＴＦ（音響光学同調フィルタ：Acousto-Optical Tunable Filter）、ＡＯＭ（音響光学変調器：Acousto-Optical Modulator）、ＥＯＭ（電子光学変調器：Electro-Optical Modulator）、機械的シャッタによって又はレーザの直接的制御によって実行することができる。レーザの直接的制御は、半導体レーザの場合は、そのスイッチング周波数がＧＨｚ領域で実現可能であるので、とりわけ有利である。

導入される励起波長（複数）の光強度は、従来のように、調整（制御）ユニットを介し減衰器、フィルタ、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、ＥＯＭ等によって調整することができる。さらに、光強度は、デューティサイクル又はピクセル当りの１サイクル反復回数を介しても上記のように調整することができる。とりわけ有利な一実施形態では、光強度の連続的調整のための、例えばＡＯＴＦとして構成される調整ユニットが、個々の励起波長を導入するためのデジタル回路と結合される。

更に有利な一実施形態では、励起波長の導入の時間的に割り当て及び検出器の読み出しのためのコンピュータユニットが設けられる。コンピュータユニットは、更に、検出された信号（複数）の複数の異なる励起波長への割り当てを制御することができるように構成される。コンピュータユニットは、具体的には、ＣＰＵ、ＤＳＰ、ＦＰＧＡ又はドライバボードを含むよう構成することが可能である。

以下に、本発明の実施例を図面を参照して説明する。なお、以下の実施例は、発明の理解の容易化のためのものであり、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を排除することは意図しない。また、特許請求の範囲に付した図面参照符号も発明の理解の容易化のためのものであり、本発明を図示の態様に限定することは意図しない。なお、これらの点に関しては、補正・訂正後においても同様である。

図１に示した２つの線図のうち、紙面上側の線図は、走査過程の時間推移（経過）に対する被検対象４の照明強度を示す。被検対象４は、全部で３つの励起波長１、２、３により予設定可能な照明スキームに相応して照射される。図１に示した実施例では、走査過程の時間推移にわたって規則的に反復され（繰り返し実行され）て導入される励起波長１、２、３のシーケンスを示す照明スキームが選択されている。この反復シーケンスは、当該シーケンスの１サイクルが、それぞれ、のちの撮像の１ピクセルと対応するように選択されている。

図１の紙面下側の線図は、走査過程の時間推移に対する、励起波長１、２、３に対応する放射波長の検出された強度を示す。検出器５は導入された励起波長１、２、３の各々に対し各別に読み出される。検出器５の読み出しは、この線図では、黒丸で示した。検出された信号（複数）は、本発明により、上記既知の（予設定可能な）照明スキームを使用して励起波長１、２、３に割り当てられる（対応付けられる）。下側の線図から分かるように、このようにして、複数の励起波長１、２、３のひとつひとつに対しそれ固有の（１つの）画像をピクセル的に構成（合成）することができる。

図２も同様に、図１に示した照明スキームに類似する照明スキームを線図で示す。被検対象４は、この場合も、走査過程の時間推移にわたって規則的に反復される３つの励起波長１、２、３のシーケンスによって照射される。図１の実施例とのただ１つの相違は、個々の励起波長１、２、３の導入が、反復されるシーケンスの全部で３つの完全なサイクルが、被検対象４の撮像の１つのピクセルに対応するように、実行されることである。ピクセルごとに個々の励起波長１、２、３をそれぞれ３回導入することにより、被検対象４は、一方では一様に照明され、他方ではピクセル毎に、励起波長１、２、３の各々に対する比較的大きい光子統計が達成可能となる。

図３では、紙面上側の線図に、走査過程の時間推移に対する照明強度を示す。図１及び図２の照明スキームとは異なり、被検対象４は、この実施例では、部分的に励起波長１、２、３の２つの異なる組合せにより同時に照射される。具体的には、被検対象４は、まず、２つの励起波長１及び２の組合せによって照射される。次いで、２つの励起波長２及び３によって同時に照射され、最後に励起波長３のみによって照射される。このシーケンスは、規則的に繰り返されるが、この場合も、完全な１サイクルは、撮像の１ピクセルに対応する。

図３の紙面下側の線図には、再び、走査過程の時間推移に対する検出された（放射光）強度を示す。黒丸は、それぞれ、検出器５の読み出しを表す。個々の励起波長１、２、３に対し各別の画像を生成するために、検出された信号（複数）は、まず、予選別される。励起波長１及び２による照明中に得られた信号（複数）は、画像１のための生データに分類され、励起波長２及び３による照明により得られた信号（複数）は、画像２のための生データに分類され、最後に励起波長３による照明中に受容された信号（複数）は、画像３のための生データに分類される。個々の励起波長１、２、３に対する最終的画像は、生データを適切に乗算、和形成（加算）及び／又は差形成（減算）することにより生成することができる。この実施例では、例えば励起波長２に対する画像は、画像２のための生データから画像３のための生データをピクセル的に減算することにより簡単に生成することができる。そして、更なる１ステップにおいて、励起波長１に対する撮像を再構成することができる。一般的には、即ち複雑な照明スキームでは、個々の画像を再構成するために、相応の一次（線形）方程式システムを解かなければならない。

図４は、走査顕微鏡６において複数の異なる放射波長を分離するための本発明の装置の一実施例に関し、その各構成要素間の関係をブロック図で模式的に示す。この装置は、光源９の光ビーム８から所定の波長を遮断（遮光）し、かつ予設定可能な励起波長１、２、３（のみ）を通過（透過）させるように作動するＡＯＴＦ７を有する。換言すれば、ＡＯＴＦ７は、予設定可能な励起波長１、２、３を時間的に正確に照明光ビーム１０に導入（差込入射）するために用いられる。このようにして形成された照明光ビーム１０は、顕微鏡６に差込入射され、顕微鏡６に配されたビーム偏向装置によって被検対象４上に案内される。

検出器５により受容（検出）された信号は、個々の励起波長１、２、３の導入と検出と間の時間的割り当てを制御する中央処理装置（ＣＰＵ）１１に供給される。中央処理装置１１は、更に、検出された信号（複数）の複数の異なる励起波長１、２、３への割り当ても担当する。個々の励起波長１、２、３に割り当てられたデータ（複数）は、別個のデータチャネル１２、１３、１４でさらに処理され、最終的に励起波長１、２、３の各々に対し、被検対象４のそれぞれ１つの独自の画像を生成する。

図５は、基本的には図４の装置と同様であるが、被検対象４における複数の異なる蛍光着色物質１６、１７、１８を更に良好に分離するための線形（リニア）アンミキシングを実行可能とする付加的ユニット１５を更に含む装置の一例に関し、その各構成要素間の関係をブロック図で模式的に示す。この種のアンミキシングは、文献から十分に知られているので、本書では詳細に説明しない。その代わりに、単なる例であるが、ＤＥ１９９１５１３７Ｃ２及びＵＳ６０６６４５９を挙げておく。これらの記載は本書に引用をもって繰込むものとする。

蛍光着色物質（染料）の放射が複数のスペクトル検出器又は複数の検出器チャネルによって受容（検出）される場合、本発明の方法によって得られたデータの線形アンミキシングは、とりわけ有利な態様で、同時に、励起スペクトルにも放射スペクトルにも適用することができる。

本発明の装置は、とりわけスペクトル検出器、スペクトロメータ、蛍光寿命（Lebensdauer）顕微法、蛍光相関分光法（Korrelations-Spektroskopie）等の組合せで使用するのに適する。

走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための本発明の方法の照明スキームの第１実施例を示す線図。本発明の方法の照明スキームの第２実施例を示す線図。本発明の方法の照明スキームの第３実施例を示す線図。走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための本発明の装置の第１実施例の模式図。線形（リニア）アンミキシングのための付加ユニットを有する図４の装置の模式図。

符号の説明

１励起波長
２励起波長
３励起波長
４被検対象
５検出器
６走査顕微鏡
７ＡＯＴＦ
８光ビーム
９光源
１０照明光ビーム
１１ＣＰＵ
１２データチャンネル
１３データチャンネル
１４データチャンネル
１５付加ユニット
１６蛍光着色物質（染料）
１７蛍光着色物質（染料）
１８蛍光着色物質（染料）

Claims

走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための方法であって、
被検対象（４）が、ビーム偏向装置によって該被検対象（４）上に案内されると共に複数の異なる励起波長（１、２、３）を有する照明光ビーム（１０）によって走査され、かつ前記被検対象（４）から射出すると共に前記励起波長（１、２、３）に相応する複数の放射波長を含む放射光が、少なくとも１つの検出器（５）で検出される波長分離方法において、
前記複数の励起波長（１、２、３）は、走査過程中に予設定可能な照明スキームに相応して選択的に前記照明光ビーム（１０）に導入されること、
前記検出器（５）は、励起波長（１、２、３）の導入毎に読み出されること、及び
検出された信号（複数）は、前記予設定可能な照明スキームの使用下において、前記複数の励起波長（１、２、３）に割り当てられること
を特徴とする方法。
複数の異なる励起波長（１、２、３）として離散的な複数のレーザ線が使用されること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
前記複数の励起波長（１、２、３）は、それぞれのレーザのオン・オフ切換により前記照明光ビーム（１０）に導入されること
を特徴とする請求項２に記載の方法。
前記照明スキームによって、前記複数の励起波長（１、２、３）の各々の導入の時点及び持続時間が設定されること
を特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
前記照明スキームによって、前記複数の励起波長（１、２、３）の各々に対する強度が個別に設定されること
を特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
前記被検対象（４）上における前記照明光ビーム（１０）の空間的推移と前記照明スキームとは、前記複数の励起波長（１、２、３）の各々が前記被検対象（４）の撮像の１つのピクセル内で少なくとも一回前記照明光ビーム（１０）に導入されるように、互いに調整して規定されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
前記照明スキームによって、走査過程の時間推移にわたって規則的に反復される前記複数の励起波長（１、２、３）の個々の導入のシーケンスが設定されること
を特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
前記被検対象（４）上における前記照明光ビーム（１０）の空間的推移と前記照明スキームとは、前記反復されるシーケンスの完全な１サイクルが前記被検対象（４）の撮像の１つのピクセルに相応するように、互いに調整して規定されること
を特徴とする請求項７に記載の方法。
前記被検対象（４）上における前記照明光ビーム（１０）の空間的推移と前記照明スキームとは、前記反復されるシーケンスの複数のサイクルが前記被検対象（４）の撮像の１つのピクセルに相応するように、互いに調整して規定されること
を特徴とする請求項７に記載の方法。
前記照明光ビーム（１０）には、常に、ただ１つの励起波長（１、２、３）のみが導入されること
を特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
前記照明光ビーム（１０）には、１つのサイクル内において、予設定可能な時点に、複数の励起波長（１、２、３）が同時に導入されること
を特徴とする請求項７〜９の何れか１項に記載の方法。
前記被検対象（４）の個々の画像の再構成は、前記検出された信号（複数）の適正な乗算、和形成及び／又は差形成によって実行されること
を特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
複数の異なる励起波長（１、２、３）に対して再構成された画像が、オーバレイで表示されること
を特徴とする請求項１２に記載の方法。
検出器（５）として、フォトマルチプライヤ、ＡＰＤ、ＭＣＰ検出器、又は高速フォトダイオードアレイが使用されること
を特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
励起波長（１、２、３）の導入の光強度及び／又は持続時間は、前記走査過程の前記時間推移にわたって変化されること
を特徴とする請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、測定前に設定されること
を特徴とする請求項１５に記載の方法。
前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、所定の予設定可能な測定データに依存し測定中に自動的に設定されること
を特徴とする請求項１５に記載の方法。
前記光強度及び／又は前記持続時間の前記変化は、現時点の画像及び／又は事前に撮像されている複数の画像の抽出データから画像処理によって得られる情報に依存して設定されること
を特徴とする請求項１５に記載の方法。
走査顕微鏡において複数の異なる放射波長を分離するための波長分離装置であって、
複数の異なる励起波長（１、２、３）を有すると共に、被検対象（４）を走査するためにビーム偏向装置によって該被検対象（４）上に案内される照明光ビーム（１０）を生成するための少なくとも１つの光源（９）を有し、及び前記被検対象（４）から射出すると共に、前記複数の励起波長（１、２、３）に相応する複数の放射波長を含む放射光を検出するための少なくとも１つの検出器（５）を有するよう構成された装置において、
前記複数の励起波長（１、２、３）は、走査過程の間、予設定可能な照明スキームに相応して選択的に前記照明光ビーム（１０）に導入可能に構成されること、
前記検出器（５）は、励起波長（１、２、３）の導入毎に読み出し可能に構成されること、及び
検出された信号（複数）は、前記予設定可能な照明スキームの使用下において前記複数の励起波長（１、２、３）に割り当て可能に構成されること
を特徴とする波長分離装置。
励起波長（１、２、３）の前記導入は、ＡＯＴＦ（７）、ＡＯＭ、ＥＯＭ、機械的シャッタによって、又はレーザの直接的制御によって行われること
を特徴とする請求項１９に記載の装置。
前記導入される励起波長（１、２、３）の光強度は、減衰器、フィルタ、ＡＯＴＦ（７）、ＡＯＭ、及び／又はＥＯＭによって調整可能であること
を特徴とする請求項１９又は２０に記載の装置。
前記ＡＯＴＦ（７）は、前記光強度を連続的に調整するために、前記複数の励起波長（１、２、３）を導入するためのデジタル回路と接続されるよう構成されること
を特徴とする請求項２１に記載の装置。
励起波長（１、２、３）の導入の時間的割り当て及び前記検出器（５）の読み出しのためのコンピュータユニット（１１）が設けられること
を特徴とする請求項１９〜２２の何れか１項に記載の装置。
前記コンピュータユニット（１１）は、前記検出された信号（複数）の前記複数の異なる励起波長（１、２、３）への割り当てを制御可能に構成されること
を特徴とする請求項２３に記載の装置。
前記コンピュータユニット（１１）は、ＣＰＵ、ＤＳＰ、ＦＰＧＡ、及び／又はドライバボードを含んで構成されること
を特徴とする請求項２３又は２４に記載の装置。
前記検出器（５）は、フォトマルチプライヤ、ＡＰＤ、ＭＣＰ検出器、又は高速フォトダイオードアレイであること
を特徴とする請求項１９〜２５の何れか１項に記載の装置。