JP2007521802A - 情報システムを用いて反応を解析する方法およびシステム - Google Patents
情報システムを用いて反応を解析する方法およびシステム Download PDFInfo
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Abstract
Description
Bustin SA, Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR assays, Journal of Molecular Endocrinology 25: 169-193 (2000).
Bustin SA., Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR: trends and problems, J Mol Endocrinol. 29: 23-29 (2002)。
(2)「イエス」であれば、標的配列の初期レベルまたは量はいくらか?
(3)結果は正確か?
(4)一連の反応は正しく行われたか?
(5)所望の反応または予想される反応の阻害はなかったか?
(6)サンプル調製物回収は許容されるか?
(7)基準データを用いる場合には、その基準データに対する較正が、なおも妥当であるか?
本発明の一部の実施形態によれば、対象領域(例:FCN)および標的および/または内部対照反応の効率関連値(例:MR)を確認することで、これらの質問の1以上に答えることができる。他の実施形態では、本明細書において基準データ、基準曲線および/または基準データセットと称されるデータセットとそのような値を比較することで、これらの質問の1以上に答えることができる。別の実施形態では、同じ反応混合物中の内部対照(例:二次増幅対照反応)について得られたそのような値をそれの基準データとして比較することで、これらの質問の1以上に答えることができる。さらに別の実施形態では、標的反応について得られたそのような値を、それらの個々の基準データとして同じ反応混合物中の内部対照反応について得られたそのような値と比較することで、これらの質問の1以上に答えることができる。
(2)存在した初期標的の絶対量はいくらだったか?
(3)信頼度はどの程度か(例えば、質問1または2に対する回答が正しいという信頼値として表現される場合がある)?
(4)2つの異なるサンプルに存在する標的の相対的な量はいくらか?
多くの方法が開発されており、研究および他の状況でそれらを用いて、これらの質問の1以上に回答することができる。
1例として、代表的なリアルタイムPCR反応検出システムによって、1以上の検出色素から発生するシグナルを記憶するデータファイルを作成する。図1には、本発明による解析方法で使用することができる捕捉反応データのプロットを示してある。この例では、1色素シグナル(DYE1)が捕捉標的データを提供し、別の色素シグナル(DYE2)が捕捉内部対照データを提供し、さらに別の色素シグナル(DYE3)が任意の捕捉基準データを提供する。これらのデータは、標準出力ファイルから取った単一の反応からのデータを代表するものである。この特定のプロットは、何らかの形の複数成分アルゴリズムが適用された初期データを表すものと理解することができる。このプロットにおいて、x軸はサイクル数(例:1〜45)、y軸は相対的な蛍光単位で検出される色素強度を示す。この図においては、3種類の異なる捕捉データセットを、連続曲線として示している。しかしながら実際の捕捉データ値は、各サイクル数で捕捉される別個のシグナル値である。従って、図1に示した初期データセットは、3組(標的、対照および基準)の好適な別個の値(例えば、この場合には約50値)からなるものであることができる。
任意ではあるが、いくつかの異なる方法で、捕捉データについて正規化を行うことができる。一つの方法には、相当する基準色素シグナルによる各サイクル読み取り時での標的値と対照値の分割が関与する。あるいは、約数は全サイクルにわたる基準値であったり、一定のサイクルにおける平均であることができる。別の別途実施形態では、増幅シグナルが検出されない場合には、約数は、1以上の比較的初期の(ベースライン)サイクルでの標的色素もしくは対照色素の平均または標的色素および対照色素の平均であることができる。公知の正規化方法を、データ解析に用いることができる。PCRシステムによってすでに正規化されているデータとともに、本発明を用いることができる。図2は、本発明に従って正規化された標的および対照データセットを示す捕捉反応データのプロットである。この例では、正規化の結果として、y軸スケールは単純な数字で表わされる。この場合、数字は約0〜9である。他の正規化方法が当業界で公知であり、その数字を0〜100の値や他の所望の範囲に変換することができる。
スケール調整は任意であるが、それを行って、オペレータがデータを目視しやすくすることが可能である。スケール調整は解析結果に影響するものではない。スケール調整は、正規化に加えて、正規化を行わずに、または正規化の前もしくは後に行うことができる。
捕捉データに1以上のデジタルフィルタリング法を適用して、シグナルデータセットを「クリーンアップ」し、シグナル/ノイズ比を高めることができる。多くの異なるフィルタリングアルゴリズムが知られている。本発明は、ゼロなしの4極フィルターを用いることができる。それによって、フィルタリングされたシグナルのオーバーシュートの可能性がなくなる。例として、それは、前方および後方の両方のフィルターが位相ずれ(時間遅延)を排除するMATLABのシグナル処理ツールボックス(Signal Processing Toolbox)が添付されたMATLAB関数「フィルトフィルト(filtfilt)」で行うことができる。パラメータおよびMATLAB関数呼び出しの1例は次の通りである。
a=[1.0000−1.00000.3750−0.06250.0039];
データ(:,:,アッセイ)=フィルトフィルト(b,a,データ(:,:,アッセイ));
データ(:,:,ic)=フィルトフィルト(b,a,データ(:,:,ic));
この例では、「b」および「a」はフィルター係数を含む。「データ(:,:,アッセイ)」および「データ(:,:,ic)」は、正規化、スケール調整またはその両方を行っていても良いまたは行っていなくとも良い捕捉データを含む。この場合、フィルタリングされたデータについて、正規化とスケール調整の両方を行う。図4は、デジタルフィルタリング後の標的および対照データを示す捕捉反応データのプロットである。値はデジタルフィルタリングによって変化しないが、データセットは若干「平坦化」される。
任意の傾き除去方法を用いて、検出可能な実際のシグナルが生じる前に早期ベースラインシグナルに存在する残存傾斜を除去することができる。この手順はベースライン化と称することもできるが、一部の実施形態ではオフセットは除去せず、傾きのみである。本発明によれば、傾き除去の場合、標的(DYE1)および対照(DYE2)シグナルの両方を同時に調べる。いずれか最初に出た方のシグナルが前方回帰点を規定し、メソッドは10サイクル戻る。10サイクル戻りがサイクル5以前である場合は、サイクル5を初期回帰点として用いて、比較的早期の一過性シグナルを回避する。これらの点間のシグナルデータを用いて線形回帰線を計算し、各色素についての回帰の傾きを色素のシグナルから引く。この場合、傾き除去を、上記で記載の正規化、スケール調整およびフィルタリングしたデータに適用する。図5は、勾配値を除去した標的および対照データを示す捕捉反応データのプロットである。これらの各図において、早期サイクルでは傾きはほとんど存在しなかった。従って、傾き除去は捕捉データ値にほとんど影響していない。
本発明の方法の1実施形態は、MaxRatio法である。この方法では、順次測定値間の比率を計算することで、一連の比率を得て、そのそれぞれを時間値およびサイクル数にインデックス付けすることができる。これらの比率を計算する好適な手段が多くあり、いずれか好適な手段を用いることができる。最も簡単なこの比率計算法は、下記の関数を利用するものである。
式中、nはサイクル数を表し、s(n)はサイクルnでのシグナルを表し。この計算は、応答のベースライン領域において約1で開始し、成長領域中に最大まで上昇し、平坦領域で約1に戻る曲線を提供する。この計算を効率的に行うMATLAB表現は、下記の通りである。
式中、「s」は、各列が別個の応答を表すシグナル応答行列を表す。
サイクル数の分離能を高めるため、内挿を行うことができる。この操作を行うには多くの方法が当業界で知られている。本発明の文脈における一つの内挿方法は、三次スプライン補間であり、それは平滑な内挿を提供することで、捕捉データセットの二次導関数であっても連続的となるものである。本発明を用いて一連のデータ全体を内挿することができる。本発明を用いて、対象の領域を決定し、その領域のみで内挿を行って、周期より小さいまたはサイクルより小さい分離能を達成することができる。三次スプライン補間を行うためのMATLABコマンドの1例は、下記の通りである。
式中、「x」は周期(またはサイクル)数(1、2、3...)を表し、「in」はそれらのサイクルでの未内挿シグナルを表し、「x2」は相対的に高分離能周期(またはサイクル)ベクトル(1.00、1.01、1.02、...)を表し、「out」は「x2」での部分サイクルに相当する内挿シグナルを表す。
別の段階は、一連のデータにおいてピークを選択するというものである。この操作では、(1)局所ピークを発見する段階および(2)任意に基準データ(前記で定義)を用いて、局所ピークから1以上のさらなる解析用ピークを選択する段階を行う。
上記で論じた方法において、多くの極大ピークが標的データおよび対照データの両方で確認される場合が多い。それらの極大ピークのどれを用いてFCNおよびERVを求めるかを選択するのに、各種方法を用いることができる。
他の実施形態において、効率関連値(例:MR値)を、既知濃度の多くのデータセットに関するそれらの反応点値(FCN)値の関するとしてプロットして、特定のアッセイに特徴的な基準曲線を得ることができる。その基準曲線は、特定のアッセイ設計および検出プロトコールの特徴を有し、陽性/陰性結果を高信頼性で求め、ある特定の結果が信頼性がないものとして棄却するか否かを決定し、結果の信頼性尺度を求め、またはそれらの組み合わせを行うのに用いることができる。概して、基準曲線より下にある反応データのペアは、非反応性サンプルまたはかなりの阻害を受ける反応のような非機能性反応を示す。
(X2,Y2)=(20,0.036)
(X3,Y3)=(25,0.026)
(X4,Y4)=(45,0.026)。
(X2,Y2)=(10,0.10)
(X3,Y3)=(20,0.05)
(X4,Y4)=(40,0.05)。
上記で測定される効率関連値のFCN値を調節して、さらに再現性の高い定量値を得ることができるという効果があることが、経験的に認められている。例えば図12は、同じ初期濃度を有するサンプルについての反応曲線が各種反応異常のためにどのように変動し得るかを示した2組の反応データのプロットである。この図には、等しい量のHIV標的核酸を含むサンプルについての2つの応答を図示してある。しかしながら、一方の応答では、その反応から得られたシグナルは、反応における異常のために早期に低下している。この低下は、図13に示すように、シフト比曲線の最大値から求めたFCN値を2つのサンプル間で大きく変動させ得る。しかしながらこの図は、その2つの勾配曲線が、グラフのx軸上にプロットされた初期または早期サイクル数と比較的大きく類似していることも示している。
各種反応解析において定量が望ましい場合が多い。例えばPCR反応において、定量とは、反応を解析することによって、未知濃度を有する標的の開始時の量もしくは濃度を計算することを指す。本発明には、効率関連値およびサイクル数値(例:FCN)を用いて定量を行うための方法もしくはシステムまたはその両方が関与する。具体的には、試験サンプルのERVを、それぞれが既知量の標的核酸を含む少なくとも1個のキャリブレータ、好ましくは少なくとも2個のキャリブレータ、そして任意に3、4、5もしくは6個のキャリブレータの1以上のERVと比較する。
この式は、下記のようにも表現することができる。
式中、Log10(Conc0(FCN))は、初期標的濃度の対数(底10)を表し;mは、線形標準曲線の傾きを表し;bは、線形標準曲線の切片を表す。
PCR反応が阻害を受ける場合、得られるリアルタイムPCRシグナル強度は、抑制されるか遅延し得る。このシグナル劣化がMRなどの効率関連値に与える効果は、その値における低下である。さらに、部分サイクル数に対するシグナル劣化の効果は、阻害を受けない反応で予想されるものより早いサイクル数でのFCNの確認である。これらの要素により、FCNの関数としての対数(濃度)のプロットが、線形曲線適合関数によって十分に記述されないようになる。標準曲線には比較的高次の曲線適合関数を適用することができるが、直線回帰は相対的に低い較正レベルを必要とし、計算が相対的に簡単である。
Log2(Conc0(FCN強度Adj))∝FCN−Log2(強度)
Log2(Conc0(FCNMRAdj))∝FCN−Log2(MR)。
FCNMRAdj=FCN−Log2(MR)。
既知濃度からの標準曲線の作成と定量におけるそれの使用は当業界で公知であり、下記の実施例からさらに理解が進む。代表的な例では、各増幅または一連の増幅時に多くの較正反応(初期濃度が既知であるウェルでのものなど)を用いて、較正操作を行う。広い範囲の可能な初期濃度でサンプル中の標的核酸を定量しようとした場合に生じる一つの問題は、特定の反応での比較的低量の標的核酸の定量がより困難になるという点である。例えば図14には、試験サンプル中のHIVの量を定量するよう設計されたアッセイについてのデータを示してある。それらの反応は、50;500;5000;50000;500000;および5000000コピー/mLという標的核酸の6種類の既知濃度について8連で行った。アッセイデータは、コピー数が低い(曲線が右に対して最も遠い)反応での有意なシグナル抑制を示している。標的核酸の4つの最高濃度の量(左側の曲線集合)によって低い変動係数で正確な結果が得られたが、2つの最低濃度では、正確さの低い曲線が得られた。ダイナミックレンジが100000〜1またはそれ以上であるアッセイでの低濃度の標的核酸を定量する上での難しさが原因で生じるその不正確さは、下記の本発明の方法によって扱うことができる。
FCN2=−3.0637*Log10(Conc0)+25.006
FCNMRadj=−3.2344*Log10(Conc0)+33.271
FCNInt.adj=−3.2870*Log10(Conc0)+32.775。
上記の異なるサイクル数関連値を用いた較正の異なる特性を調べるため、既知濃度を有する各種サンプルについて定量を行い、計算濃度を既知濃度と比較することができる。そのような比較の1例では、上記で得られたパラメータを有する標準曲線を用いて、図14に示したアッセイの定量を行った。各既知濃度での8連の計算濃度の平均を、既知濃度値と比較した。図16は、既知濃度値のlog10(x軸)を、各濃度での8個のサンプルについての各計算濃度のlog10の平均と比較するものである。
1点較正を定量に用いることができる。この場合、50000コピー/mL濃度(Log(4.7))での2つのウェルを較正に用いた。較正定数を計算するため、下記式:K=Conc0*2FCN[式中、Kは較正定数を表し;Conc0はキャリブレータの既知濃度を表し;FCNはキャリブレータの部分サイクル数を表し;前述した反応効率eは1であると仮定する。]を用いる。FCN2、FCNMRAdj.およびFCNInt.Adj.などの比例関係を用いて、同様の較正定数を得ることができる。
10コピー/反応から109コピー/反応および陰性の範囲の対照溶液のHBVアッセイを、各濃度6連でABIプリズム(Prism)7000で処理した。捕捉データは、デジタルフィルターのみを用いて処理した。次に、上記のMRアルゴリズムを用いてFCN値を計算した。それらの濃度は、基準キャリブレータとして109コピー/反応での応答のうちの3つを用いる1点較正によって計算した。
本実施例では、対照溶液のHIVアッセイを、6連での陰性、50コピー/mL、および100コピー/mL〜106コピー/mLの濃度で行った。応答は、正規化およびベースライン調整を行うFCNMRAdj.を用いるMRアルゴリズムによって処理した。図21は、MR解析および例えばキャリブレータとして2連の102および105コピー/mL応答を用いる2点較正を使用した本実施例の結果を示した。陰性と50コピー/mLアッセイとの間に明瞭な区別があり、偽陽性も偽陰性もなかった。図でわかる通り、良好な線形性と精度がある。
反応時間もしくはサイクル数値および効率関連値のペア(例:FCN−MR値のペア)が核酸増幅反応、例えばPCR反応についての貴重な情報を得ることができ、それはさらに、内部対照および標的増幅反応の両方についてデータペアを考慮することでさらに向上させることができることが認められている。標的反応単独のペアは反応効率についての重要な情報を有し、基準データとの比較に用いることができるが、サンプルの処理またはサンプル自体で生じる別の要素も、対照データを考慮することでより良好に解析することが可能である。
サイクル数値−効率関連値のペア(例:FCN−MRペア)についての多重基準曲線を作成することができ、それは特に妥当性決定での使用において、異なる用途および重要性レベルを有し得る。例えば、第一の基準曲線を選択して、反応性増幅シグナルを非反応性応答から区別可能とすることができる。第二の基準曲線を選択して、第一のものより制約を厳しくすることで、定量において相対的に低い信頼性を有すると考えられる部分阻害を有するものと対照して、正確な定量をもたらすサンプル応答を確認する上でそれが有用となるようにすることが可能である。図22は、2種類の基準データを示すプロットであり、図中において下方の水平線は、陰性反応を反応性反応から区別する上で好適な基準データを表す。第二の直線集合は、FCN−MRペア応答における正常範囲を示す基準データを表す。これらの基準を用いて、部分的反応阻害が原因であるこの範囲外の値に関連すると考えられる相対的に低い信頼性との対照で、定量における高信頼性を識別することができる。
図25は、内部対照および標的増幅反応の両方についてのERV(例:MR)を引いたサイクル数(例:FCN)のペアの解析によるアッセイ妥当性の評価のための論理解析ツリーを示すフローチャートである。図26は、サイクル数(例:FCN)−ERV(例:MR)のペアを用いる妥当性基準評価とともに標的結果を報告する論理解析ツリーを示すフローチャートである。
増幅応答を説明する単一の値のみを提供する先行技術における従来のCt解析とは対照的に、効率関連値解析(および好ましくはMR解析)は、増幅反応全体またはそれの一部の時間値またはサイクル数値に相当するデータを効率関連変換値曲線に提供することができる。具体的なアッセイ形態内では、正常アッセイ応答は非常に再現性の高い効率関連変換値曲線を与えることが発見されている。特に、一つの特徴は、効率関連変換値曲線のピークの幅である。例えば最大高さの半値での幅によって定義される効率関連変換値のピークの幅は、蛍光強度の大きさが大きく変動する場合であってもほとんど変動しないことが認められている。
本発明のシステムを、多数の好適なコンピュータ製品または情報機器に組み込むことができる。MRソフトウェア実行の若干の詳細を以下に提供する。具体的なユーザーインターフェースの説明および図示は、具体的な実施形態を説明するためにのみ取ったものであり、情報処理業界で公知の多くの異なるユーザーインターフェース方法を、本発明を具体化するシステムで用いることができる。本発明は、下記の実質的に全ての選択肢が存在し、計算され、もしくは情報システムによって提供され、結果的にほとんどユーザーインターフェース選択肢を提供しないシステムも用いることができる。場合により、試作システムの詳細および/または選択肢が例示を目的として説明されており、それらの選択肢および/または詳細の多くが、製造システムには無関係であったり、利用できない場合がある。
図32は、本発明の各種態様を具体化することができる論理素子の1例を示すブロック図である。本明細書にある内容からわかるように、本発明はハードウェアもしくはソフトウェアまたはその両方で実行することができる。一部の実施形態では、本発明の各種態様を、クライアント側ロジックまたはサーバー側ロジックのいずれかで実行することができる。さらに、本発明または本発明の構成要素は、適切に構成されたコンピュータデバイスにロードされた時に、そのデバイスを本発明に従って実行させることができる論理機器もしくはデータまたはその両方を含む固定メディアプログラムコンポーネントで具体化することができる。論理装置を含む固定メディアコンポーネントは、閲覧者のコンピュータに物理的にロードするための固定メディア上で閲覧者に送ることができるか、または論理装置を含む固定メディアが、閲覧者が通信媒体を通じてアクセスしてプログラムコンポーネントをダウンロードできる遠隔サーバー上にあっても良い。
以上、具体的な実施形態を参照しながら、本発明について説明した。他の実施形態は、当業者には明らかであろう。特には、ビューワデジタル情報機器は、パーソナルコンピュータなどのコンピュータワークステーションとして説明してきた。しかしながら、そのデジタルコンピュータ装置は本発明の論理方法を実行するのに好適ないずれの機器も意味するものであって、デジタル的に可能な実験室システムもしくは装置、デジタル的に可能なテレビ、携帯電話、携帯情報端末などの機器を含むことができると考えられる。本発明の精神の範囲内での変更は、当業者には明らかであろう。さらに、各種の異なる作業を用いて、本発明の具体的な実施携帯によるシステムとの相互作用を実行することが可能である。例えば、オペレータが音声コマンドを話すことができ、オペレータがキーを押すことができ、クライアント側科学装置上のボタンをオペレータが押すことができ、またはポインティングデバイスを用いる選択をユーザーが行うことができる。
Claims (57)
- 試験サンプルが標的核酸を含むか否かを決定する方法であって、
(a)前記試験サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプルの前記標的核酸の少なくとも一部を増幅する段階;
(c)前記増幅における各種点で得られる、存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを測定する段階;
(d)前記増幅反応の効率関連変換値を求める段階;
(e)前記効率関連変換値の最大の大きさである効率関連値を求める段階;および
(f)前記増幅における前記効率関連値が特定の値を超える場合に、前記試験サンプルが標的核酸を含むと決定する段階
を有する前記方法。 - 増幅反応の効率関連変換値が、(1)増幅から得られるシグナルの比変換、(2)増幅から得られるシグナルの対数の導関数、および(3)増幅から得られるシグナルの一次導関数からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 効率関連変換値が増幅から得られるシグナルの一次導関数であり;増幅反応から得られるシグナルの前記一次導関数が、連続するシグナル間の間隔の大きさで割った増幅反応から得られた2つの連続するシグナル間の差に等しい請求項2に記載の方法。
- 効率関連変換値が、増幅から得られるシグナルの一次導関数であり;増幅反応から得られるシグナルの前記一次導関数が、増幅反応から得られるシグナルに適合される曲線の数学的操作によって計算される請求項2に記載の方法。
- 効率関連値が特定の値を超えるか否かを決定する段階を、効率関連値を基準曲線と比較することで行い;前記基準曲線を、
(a)陰性サンプルについて複数の増幅反応を行い(前記陰性サンプルは、標的核酸を含まないサンプルである);
(b)各陰性サンプルについて効率関連値を求め;
(c)前記陰性サンプルの前記効率関連値の平均および標準偏差を求め;そして
(d)前記陰性サンプルの前記効率関連値の前記標準偏差の特定倍だけ前記平均を超える効率関連値を有するサンプルを確認することで決定する請求項1に記載の方法。 - 陰性サンプルの効率関連変換値の標準偏差の1から約20倍だけ平均を超える効率関連値を有するサンプルが標的核酸を含むと見なされる請求項5に記載の方法。
- 段階(e)の特定値が、効率関連値が起こる特定の反応点に応じて変動する請求項1に記載の方法。
- 段階(e)の特定値を、(1)複数のサンプルを増幅して効率関連値を求め、そして(2)陰性サンプルについての効率関連値の全てより高い値を選択することで求める請求項1に記載の方法。
- 特定値を、(1)複数のサンプルを増幅して効率関連値を求め、そして(2)陰性サンプルの効率関連値を陽性サンプルの効率関連値から分離する値を選択することで求める請求項1に記載の方法。
- 効率関連値が、増幅応答の対数の最大勾配である請求項1に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大比である請求項1に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大一次導関数である請求項1に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の濃度を定量する方法であって、
(a)前記核酸サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の前記標的核酸の少なくとも一部を増幅させる段階;
(c)前記増幅における各種点で得られる、存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを測定する段階;
(d)段階(c)で測定された前記シグナルに比率変換を適用する段階;
(e)前記段階(c)および(d)で得られた前記比率の最大値に相当する前記増幅反応における反応点を確認する段階;および
(f)段階(e)で確認された前記反応点から、前記サンプル中の標的核酸の濃度を計算する段階
を有する前記方法。 - 第一のシグナルが、第二のシグナルが得られる反応点の次の反応点で得られて;確認された反応点は、段階(e)で得られた比率の最大値に相当する請求項13に記載の方法。
- 点が増幅のサイクルを表し;得られるシグナル間の期間が、各増幅サイクルを完了するのに必要な期間に等しく;一つの第一のシグナルおよび一つの第二のシグナルがある請求項14に記載の方法。
- 点が増幅における時間点を表し;得られるシグナル間の期間が、各増幅サイクルを完了するのに必要な期間に等しく;一つの第一のシグナルおよび一つの第二のシグナルがある請求項14に記載の方法。
- 段階(d)を実行する前に段階(c)で測定されたシグナルからのベースラインシグナルから求められる傾きを取り除く段階をさらに有する請求項13に記載の方法。
- 段階(c)で測定されるシグナル点間に内挿することで、追加のシグナル値を発生させる請求項13に記載の方法。
- 段階(d)がさらに、得られる各比率から定数を減算する段階をさらに有する請求項13に記載の方法。
- 定数が約1であって、それによってシフト比が得られる請求項19に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の濃度を定量する方法であって、
(a)前記試験サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の前記標的核酸の少なくとも一部を増幅させる段階;
(c)前記増幅における各種点で得られる、存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを測定する段階;
(d)前記増幅反応の効率関連変換値を求める段階;
(e)前記効率関連変換値の最大の大きさである効率関連値を求める段階;
(e)段階(e)で得られた前記効率関連値の前記最大の大きさに相当する前記増幅反応での反応点を確認する段階;および
(f)調節反応点を計算する段階
を有する前記方法。 - 調節反応点が、反応点−効率関連値の対数(底数2)に等しい請求項21に記載の方法。
- 調節反応点が、反応点−バックグラウンド上のシグナル強度の対数(底数2)に等しい請求項21に記載の方法。
- 効率関連値が、増幅応答のシフト比から誘導される請求項21に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大比である請求項21に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の対数の最大勾配である請求項1に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大一次導関数である請求項1に記載の方法。
- 下記段階を有する核酸増幅反応の解析方法:
(a)核酸サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の標的核酸の少なくとも一部を増幅させる段階;
(c)前記増幅における各種点で得られる、存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを測定する段階;
(d)前記増幅反応の効率関連変換値を求める段階;
(e)前記効率関連変換値の最大の大きさである効率関連値を求める段階;
(f)効率関連値および反応点値を含むデータペアの範囲を確立する段階;
(g)特定の反応点値で生じる効率関連値が段階(f)で確立された前記範囲内に入るか否かを決定する段階;および
(h)前記効率関連値が特定の反応点値に相当する前記効率関連値について確立された値の前記範囲内にない場合、前記反応が誤差を受けている可能性があると見なす段階。 - 効率関連値が増幅応答の対数の最大勾配である請求項28に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大比である請求項28に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大一次導関数である請求項28に記載の方法。
- 反応点値がサイクル数である請求項28に記載の方法。
- サイクル数が分割サイクル数である請求項32に記載の方法。
- 核酸増幅反応を、核酸サンプル中の標的核酸の有無を検出するように設計する請求項28に記載の方法。
- 核酸増幅反応が標準、キャリブレータまたは対照核酸を増幅する請求項28に記載の方法。
- 一連のサンプルを増幅してアッセイ特性決定データセットを得て;各サンプルについて、最大効率関連値および反応点値を確立し;各反応点値についての信頼性のある効率関連値の範囲を確立する請求項25に記載の方法。
- 信頼性のある効率関連値の前記範囲が、特性決定データセットで表される各反応点値についての平均最大効率関連値より大きい、およびそれより小さい標準偏差の特定数である請求項36に記載の方法。
- 効率関連値が特定範囲内にあってサンプルが標的核酸を含まない、標的核酸検出のためのアッセイから矛盾した結果を観察する段階;ならびに
特定の反応点値で許容される効率関連変換値の特定範囲を変更することで、前記矛盾する結果を生じた反応の効率関連値を除外する段階をさらに有する請求項25に記載の方法。 - 下記段階を有する核酸増幅反応の解析方法:
(a)核酸を含むサンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の前記核酸の少なくとも一部を増幅する段階;
(c)存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを定期的に測定する段階;
(d)前記増幅反応全体における点の段階(c)で収集されたデータから得られる前記増幅反応の効率関連変換値を求める段階;
(e)前記効率関連変換値におけるピークを、時間またはサイクル数の関数として確認する段階;
(g)前記ピークの幅を求める段階;
(h)前記ピークの前記幅を、許容されるピーク幅の特定範囲と比較する段階;および
(i)前記の求めたピーク幅が許容されるピーク幅の前記特定範囲より大きいか小さい場合には、前記核酸増幅反応が異常であると宣言する段階。 - ピーク幅を、効率関連値の反応点値時またはその前に生じる効率関連変換値のみを用いて計算する請求項39に記載の方法。
- 効率関連変換値がシフト比である請求項39に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の対数の最大勾配である請求項39に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大比である請求項39に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大一次導関数である請求項39に記載の方法。
- 増幅反応における点を、分割サイクル数で測定する請求項39に記載の方法。
- サンプル中の標的核酸の濃度を定量する方法であって、
(a)前記核酸サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の前記標的核酸の少なくとも一部を増幅する段階;
(c)存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを定期的に測定する段階;
(d)前記増幅反応に関して段階(c)で測定した前記シグナルから効率関連変換値を求める段階であって、
前記効率関連変換値が、段階(c)の前記シグナルの比変換値、段階(c)の前記シグナルのシフト比変換値、段階(c)の前記シグナルの一次導関数、段階(c)で得られた連続するシグナル間の差および段階(c)で得られた前記シグナルの対数の傾きもしくは勾配からなる群から選択され;
前記効率関連変換値が、少なくとも2つの確認可能なデータサブセット、すなわち前記効率関連変換値が実質的に一定であるベースライン部分を形成する第一のデータサブセットおよび前記効率関連変換値が最大値に近づくかそれに達する成長領域を形成する第二のデータサブセットを有する段階;
(e)段階(d)の前記効率関連変換値の前記ベースライン領域について線の適合を行うか平均値を求める段階;
(f)段階(e)の前記線に平行であって、その線より大きい値を有する閾値線を選択するか、または段階(e)の前記平均値より大きい値を有する閾値を選択する段階;
(g)段階(d)の前記効率関連変換値が段階(f)の前記閾値線または閾値を超える反応点値を求める段階;および
(h)段階(g)の結果を用いて、前記サンプル中の標的核酸の量を求める段階
を有する前記方法。 - 段階(c)で測定されるシグナル間に点を内挿することで、追加のシグナル値を形成する請求項47に記載の方法。
- 下記段階を有するサンプル中の標的核酸の濃度を定量する方法:
(a)前記核酸サンプルを少なくとも1種類の増幅試薬と接触させる段階;
(b)前記サンプル中の前記標的核酸の少なくとも一部を増幅する段階;
(c)存在する前記標的核酸の量に比例するシグナルを定期的に測定する段階;
(d)前記増幅反応に関して段階(c)で測定した前記シグナルからの効率関連変換値を求める段階であって、
前記効率関連変換値が、段階(c)で測定された前記シグナルの比変換値および段階(c)で測定された前記シグナルのシフト比変換値からなる群から選択され;
前記効率関連変換値が、少なくとも2つの確認可能なデータサブセット、すなわち前記効率関連変換値が実質的の一定であるベースライン部分を形成する第一のデータサブセットおよび前記効率関連変換値が最大値に近づくかそれに達する成長領域を形成する第二のデータサブセットを有する段階;
(e)段階(d)の前記比率の前記ベースライン領域について線の適合を行うか、平均値を求める段階;
(f)段階(e)の前記線に平行であって、その線より大きい値を有する閾値線を選択するか、または段階(e)の前記平均値より大きい値を有する閾値を選択する段階;
(g)段階(d)の前記効率関連変換値が段階(f)の前記閾値線または閾値を超える反応点値を求める段階;および
(h)段階(g)の結果を用いて、前記サンプル中の標的核酸の量を求める段階。 - 段階(c)で測定される前記シグナル間の点を内挿することで、追加のシグナル値を形成する請求項49に記載の方法。
- 下記段階を有するサンプル中の標的核酸の定量方法:
(a)前記サンプルを増幅試薬もしくは検出試薬と、該標的核酸が増幅されるように接触させる段階;
(b)時間基準もしくはサイクル基準の間隔で、前記サンプル中の前記核酸の量または核酸の増幅量に比例するシグナルを測定および記録する段階;
(c)時間もしくはサイクルn+1でのシグナル/時間もしくはサイクルnでのシグナルの比が最大である最大比となる時間もしくはサイクルを求める段階;および
(d)前記サンプル中の前記標的核酸の量を求める段階。 - 最大比の大きさを基準と比較することで、増幅反応におけるサンプル中の標的核酸の量を求める請求項51に記載の方法。
- 増幅試薬が、標的核酸存在下にPCR反応を生じさせる能力を有する請求項51に記載の方法。
- 下記段階を有するサンプル中の標的核酸の定量方法:
(a)前記サンプルを増幅試薬もしくは検出試薬と、前記標的核酸が増幅されるように接触させる段階;
(b)時間基準もしくはサイクル基準の間隔で、前記サンプル中の前記核酸の量または核酸の増幅量に比例するシグナルを測定および記録する段階;
(c)(a)時間もしくはサイクルn+1でのシグナル/時間もしくはサイクルnでのシグナルの比および(b)時間もしくはサイクルnでのシグナル/時間もしくはサイクルn−1でのシグナルの比の平均が最大である前記データ中の領域を求める段階;および
(d)前記サンプル中の前記標的核酸の量を求める段階。 - 最大比の大きさを基準と比較することで、増幅反応におけるサンプル中の標的核酸の量を求める請求項54に記載の方法。
- 増幅試薬が、標的核酸存在下にPCR反応を生じさせる能力を有する請求項54に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大シフト比変換値である請求項1に記載の方法。
- 効率関連値が増幅応答の最大シフト比変換値である請求項28に記載の方法。
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