JP5400768B2 - Pcr及び他のデータセットにおけるクロストーク係数を決定するシステム及び方法 - Google Patents
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Description
図1bを参照することによって、2つ又は3つ以上の検出チャネルを使用するPCR増幅処理を分析する検出システムのためにクロストーク係数を決定する、本発明に係る1つの実施形態である処理100を簡単に説明できる。ある態様では、PCR検出システムは、PCR実験からの放射線放出を分析するための検出器を含む。検出システムは、さらなる分析のために波長帯を分離する操作がそれぞれ可能な光学素子を含む。これらの光学素子は、特定の色素の発光帯域内の放射を分離するなど、PCR増幅処理において使用される蛍光プローブ又はマーカの発光特性に整合するように通常選択される。例えばある態様において、発光素子は、規定した波長帯の全ての放射が通過できる1つ又は2つ以上の光学フィルタを含む。他の光学素子は、回折格子を含むことができる。それぞれの光学素子は、検出素子が受信した波長帯などの検出チャネルを規定する。
従来のクロストークモデルにおいて、クロストーク係数は、概して以下のように計算される。
(1)チャネル1及び2のプラト信号領域における5つのデータ点の平均を取る
PLAvg1 = 平均(プラトチャネル1の5つの点)
PLAvg2 = 平均(プラトチャネル2の5つの点)
(2)サンプルのクロストーク係数を計算する
XT-dye2-channel1 = PLAvg2/ PLAvg1
(3)ここでサンプルの大きさを96マルチウェルプレートに増加し、チャネル1->チャネル2のXTを計算する
XT(1->2) = 平均(XT1,XT2,.....,XT96)
(1) 式(1)に示すように、単純なゲイン「q」を使用して、それぞれの蛍光信号とクロストーク信号との間の二乗和を最小化する。
特定の2チャネルの場合を考える。図2A及び2Bに示すように、HPV較正検定におけるFAM信号と、HEXチャネル内のFAM信号のクロストークである。FAMとHEXとは、異なる励起特性及び発光特性を有する周知の蛍光色素である。ノイズが少なくプラトが明確であるので、図2A及び2Bの信号は、ほぼ理想的である。したがって、従来の方法で計算したときと、式(1)〜(3)の方法で計算したときとでクロストーク係数がほぼ等しくなることが期待されるであろう。
クロストークデータからプラト領域の5つの点のデータの平均を取り、全体の信号(pure signal)からプラト領域の5つの点の平均によって分割する。そして、クロストーク係数は、サーマルサイクラー(商標)の全てのウェル(wells)にクロストーク係数の平均として規定される。結果は、(Mathematica(登録商標)によって示される)。
特定の4チャネルの場合を考える。HPV較正検定におけるFAM、HEX、JA270、及びCY5.5のクロストーク係数の全てを比較することは有益である。以下の表2には、従来の方法をしようして計算されたクロストーク係数が示される。一方、表3は、式(1)を使用して計算された係数を示す。式(1)は、対角要素(a11、a22、a33、a44)を使用しない。そこでこれらのセルは「−」が付される。このHPV較正の組について既に説明したように、ノイズが最小限でありプラトが明確であるときは、クロストーク係数の2つの組は、ほぼ同一になるように期待される。
クロストーク係数を適用する従来の方法は、以下の式(4)に示す付加的な線形モデルを仮定する。
f1 = a11c1 + a12c2 + a13c3 + a14c4
f2 = a21c1 + a22c2 + a23c3 + a24c4
f3 = a31c1 + a32c2 + a33c3 + a34c4
f4 = a41c1 + a42c2 + a43c3 + a44c4 (4)
ここでfiは、測定された信号であり、ciは、蛍光色素信号であり、係数aIJは、チャネルJからチャネルIへのクロストーク係数である。
f1c =f1 -(a12f2 + a13f3 + a14f4)
f2c =f2 -(a21f1 + a23f3 + a24f4)
f3c =f3 -(a31f1 + a32f2 + a34f4) (6)
f4c =f4 -(a41f1 + a42f2 + a43f3)
ここでfiは、チャネル(i)の測定された蛍光色素信号であり、ficは、チャネル(i)の補正したクロストーク信号であり、係数aIJは、チャネル(J)からチャネル(I)へのクロストーク係数を示す。このモデルは、異なるチャネルの中の基準信号の分析において何も仮定しない。
f1c =f1 -(a12f2 + a13f3 + a14f4) - (r + S*i)
f2c =f2 -(a21f1 + a23f3 + a24f4) - (r + S*i)
f3c =f3 -(a31f1 + a32f2 + a34f4) - (r + S*i) (7)
f4c =f4 -(a41f1 + a42f2 + a43f3) - (r + S*i)
ここでfiは、チャネル(i)の測定された蛍光色素信号であり、ficは、チャネル(i)の補正したクロストーク信号である。係数aIJは、チャネル(J)からチャネル(I)へのクロストーク係数を示す。式(7)は、全てのチャネルに共通するゲイン及び線形項、r及びsを使用する。
f1c =f1 -(a12f2 + a13f3 + a14f4) - (r1 + S1*i)
f2c =f2 -(a21f1 + a23f3 + a24f4) - (r2 + S2*i)
f3c =f3 -(a31f1 + a32f2 + a34f4) - (r3 + S3*i) (8)
f4c =f4 -(a41f1 + a42f2 + a43f3) - (r4 + S4*i)
ここでfiは、チャネル(i)の測定された蛍光色素信号であり、ficは、チャネル(i)の補正したクロストーク信号である。係数aIJは、チャネル(J)からチャネル(I)へのクロストーク係数を示す。式(8)は、それぞれのチャネルで異なるゲイン及び線形項、r及びsを使用する。
図3に示される色素スペクトルを考える。ここで、スペクトル10は、色素1(FAM)を示し、スペクトル20は、色素2(HEX)を示す。FAM色素とHEX色素とがオーバラップする領域によって示されるクロストークを除去することが要求される。
f1c =f1 - a12f2 (11)
f2c =f2 - a21f1 (12)
FAMチャネル及びHEXチャネルのみを有するHPVを現在の方法と式(1)〜(3)とを使用してテストする。このデータは、FAMチャネルに標的を包含し、HEXチャネルには標的を包含しない。これらの方法は、HEXチャネルのクロストーク信号に適用され、結果として生じる残差プロットを調べる。理想的には、残差は、傾きがゼロであるゼロ切片の周囲に集中するであろう。
図4は、24個のそれぞれの残差プロットを示す。一方、図5は、端から端までの24個のプロットを示し、図6は、全ての24個のプロットの重ね合わせを示す。最適な補正では、残差は、傾き及び切片がセロでありX軸の周りに集中することが期待されるであろう。しかしながら、図4では、サイクル1からサイクル60に残差が実質的に減少し、最適なクロストークが実施されていないことを多くのグラフが示す。
図7〜9は、式(1)〜(3)のそれぞれの端から端までの残差プロットを示す。同様に図10〜12は、式(1)〜(3)の重ね合わせた残差プロットを示す。図6と図10〜12とを比較すると、有利には、本発明に係る技術を使用する残差の範囲が従来の方法よりも狭いことは、明らかである。さらに、本発明に係る技術を使用すると、重ね合わせたプロットの傾向線は、目標のゼロにより近い傾き及び切片を有する。この例において、FAXクロストークとHEMクロストークとは、約2%だった。このため、これらのプロットは、本発明に係る技術のロバスト性を表す、より最適な補正を示す。本発明に係る技術の優位性は、より多くの色素があり且つクロストークが2〜20%の範囲にある実施例において、より明らかになるであろう。
FAMチャネルに標的を有し、HEXチャネルには標的を有しないHIV試験のPCR実験を、FAMフィルタについて図13に示し、HEXフィルタについて図14に示す。図13及び14のデータを使用すると、FAM−>HEXクロストーク(a21)のクロストーク係数は、従来の方法と式(1)との双方でa21=0.051と計算される。
Claims (10)
- 特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも2つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)光学検出システムのクロストーク係数の決定方法であって、
PCR成長処理の獲得範囲に亘りPCRデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得するステップと、
少なくとも2つのフィルタの範囲における少なくとも2つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するステップであって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘って獲得されるステップと、
前記獲得範囲に亘る前記PCRデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するステップと、
を含み、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘る前記PCRデータの組と前記クロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含むことを特徴とする決定方法。 - 前記データ獲得範囲は、複数のPCRサイクルを示し、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘るそれぞれのPCRデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含む請求項1に記載の決定方法。
- それぞれのPCRデータの組と、それぞれのクロストークデータの組とのベースラインを決定するステップと、
クロストーク係数を決定するステップに先立ち、それぞれのデータの組から前記それぞれのベースラインを除去するステップと、
をさらに含む請求項1に記載の決定方法。 - 線形除法モデルを使用して前記決定したクロストーク係数をPCRデータの組に適用して、補正したクロストークデータの組を生成するステップをさらに含む請求項1に記載の決定方法。
- プロセッサを制御するコードを有して、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも2つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)光学検出システムのクロストーク係数を決定するコンピュータが読み取り可能な媒体であって、前記コードは、
ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含むPCR成長処理の獲得範囲に亘り獲得するPCRデータの組をそれぞれの光学素子のために受信手段により受信する命令と、
少なくとも2つのフィルタの範囲における少なくとも2つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるそれぞれのフィルタのクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために受信手段により同時に受信する命令であって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘り獲得される命令と、
前記獲得範囲に亘る前記PCRデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定手段により決定する命令と、
を含み、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘る前記PCRデータの組と前記クロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含むことを特徴とするコンピュータが読み取り可能な媒体。 - キネティック・ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムであって、
特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも2つの光学素子を有する光学検出モジュールであって、
ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含むPCR成長処理の獲得範囲に亘るPCRデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得し、
少なくとも2つのフィルタの範囲における少なくとも2つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するように構成される光学検出モジュールであって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘って獲得される光学検出モジュールと、
前記獲得したPCRデータの組と前記獲得したクロストークデータの組とを処理して、前記獲得範囲に亘る前記PCRデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するように構成されるインテリジェンスモジュールと、
を含み、前記インテリジェンスモジュールは、前記獲得範囲に亘るそれぞれのPCRデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによって前記クロストーク係数を決定することを特徴とするシステム。 - 核酸融解分析システムであって、
特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも2つの光学素子を有する光学検出モジュールであって、
温度獲得範囲に亘る融解データの組をそれぞれの光学素子のために獲得し、少なくとも2つのフィルタの範囲における少なくとも2つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成され且つ前記温度獲得範囲に亘って獲得されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得し、
前記獲得範囲に亘るそれぞれの融解データの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定する、
ように構成される光学検出モジュールを含むことを特徴とするシステム。
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