BR112017016798B1 - Método para a calibração de um instrumento de laboratório e sistema para calibrar localizações de região de interesse para uma ou mais amostras biológicas em um instrumento de laboratório - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E SISTEMAS PARA DETERMINAR REGIÕES ÓPTICAS DE INTERESSE. Os presentes ensinamentos referem-se a um método (300) e um sistema para determinar as Regiões de Interesse (ROI) para uma ou mais amostras biológicas em um instrumento de laboratório. O método pode incluir um sistema óptico (200) que tem capacidade para imagear a emissão de fluorescência de uma pluralidade de poços de amostra (210). Uma ROI inicial, sua localização central (310) e tamanho (320) podem ser estimados a partir da fluorescência detectada a partir de cada poço. A partir dessas informações, o tamanho médio das ROIs (330) pode ser determinado, e os modelos de reticulação globais (340) podem ser derivados para localizar melhor cada uma das ROIs. Os modelos de reticulação globais podem ser, então, aplicados às ROIs para aprimorar a precisão das localizações centrais da ROI (350). Os poços de amostras que não fornecem originalmente ROIs de fluorescência podem ser recuperados (360) através do uso de funções de mapeamento. O raio de cada ROI pode, então, ser ajustado (370) para aprimorar a razão entre sinal e ruído do sistema óptico.

Description

ESTADO DA TÉCNICA

[001]A instalação e calibração de instrumentação de laboratório podem ser um processo demorado e dispendioso. Em diversos casos, os engenheiros do fornecedor de instrumento precisam estar no local para realizar esses processos. Esse custo é geralmente passado ao usuário. Em alguns casos, usuários experientes podem, apropriadamente, calibrar com sucesso instrumentos fabricados com o uso de procedimentos em múltiplas etapas. Durantes tais calibrações, padrões físicos e poços de placas podem ser usadas em combinação com procedimentos manuais. Processamento de calibração manual e inspeção de dados estão sujeitos a falhas e podem depender de medidas ad hoc ou subjetivas. Embora uma etapa de verificação de sistema final possa fornecer resistência contra aceitar calibrações insuficientes, a automação oferece objetividade e uniformidade aprimoradas durante tais atividades. Os presentes ensinamentos podem incorporar conhecimento técnico em uma calibração automatizada e sistema de verificação que fornece situação de aprovação/reprovação e retroalimentação de resolução de problemas quando uma falha é identificada. No caso de um instrumento falhar no processo de calibração, então um engenheiro de serviço pode ser solicitado. Os presentes ensinamentos podem minimizar o custo e o tempo exigido para os procedimentos de instalação e calibração.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[002]A Figura 1 ilustra um sistema de computador no qual modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implantadas.

[003]A Figura 2 ilustra um instrumento de laboratório sobre o qual modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implantadas.

[004]A Figura 3 ilustra uma sequência de etapas usadas na calibração de instrumentos de qPCR.

[005]A Figura 4 ilustra as regiões de interesse para um recipiente de 96 poços de amostras.

[006]A Figura 5 ilustra as regiões de interesse para um recipiente de 96 poços de amostras rotativos.

[007]A Figura 6 ilustra uma matriz de amostra com regiões de interesse incorretamente localizadas.

[008]A Figura 7 ilustra uma matriz de amostra com regiões de interesse corretamente localizadas.

[009]A Figura 8 ilustra uma vista mais próxima de uma matriz de amostra com regiões de interesse corretamente localizadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010]Os presentes ensinamentos se referem a um método e sistema para determinar uma Região de Interesse (ROI) para uma ou mais amostras biológicas em um instrumento de laboratório. Em uma modalidade da presente invenção, o método compreende um sistema óptico que tem capacidade para imagear a emissão de fluorescência a partir de uma pluralidade de poços de amostra. Uma ROI inicial, sua localização central e tamanho podem ser estimados a partir da fluorescência detectada a partir de cada poço. A partir dessas informações o tamanho médio das ROIs pode ser determinado e modelos de reticulação (gridding) globais podem ser derivados para localizar melhor cada uma das ROIs. Os modelos de mapeamento globais podem, então, ser aplicados às ROIs para aprimorar a precisão das localizações centrais de ROI. Os poços de amostras que não fornecem originalmente ROIs de fluorescência podem ser recuperadas através do uso de funções de mapeamento. O raio de cada ROI pode, então, ser ajustado para aprimorar a relação sinal-ruído do sistema óptico.

[011]Em outra modalidade, cada poço de amostra contém uma amostra biológica.

[012]Em outra modalidade, cada amostra biológica é excitada por uma fonte de luz.

[013]Em outra modalidade, a amostra biológica fluoresce em um comprimento de onda predeterminado em resposta à excitação.

[014]Em outra modalidade, a fluorescência é detectada pelo sistema óptico.

[015]Em outra modalidade, as amostras biológicas compreendem corantes espectralmente distinguíveis.

[016]Em outra modalidade, os modelos de reticulação globais compreendem comparar a distância de centro a centro entre ROIs às coordenadas de mapeamento de um layout de placa de poço para determinar a coordenada de mapeamento X e Y para cada ROI.

[017]Em outra modalidade, funções de mapeamento são determinadas e aplicadas às coordenadas X e Y para cada ROI para mapear cada coordenada ao centro de cada ROI.

[018]De acordo com várias modalidades, um sistema para calibrar as localizações de região de interesse (ROI) é apresentado. O sistema pode compreender um sistema de computador que compreende pelo menos um processador e pelo menos um meio legível por computador. O sistema pode compreender adicionalmente pelo menos um dispositivo de entrada, pelo menos um visor e um sistema de detecção óptica. O sistema de detecção óptica pode compreender adicionalmente uma pluralidade de filtros, pelo menos uma fonte de excitação, pelo menos um detector e uma bandeja de micropoços.

[019]Em várias modalidades pelo menos um meio legível por computador é acoplado a pelo menos um processador e compreende instruções executáveis pelo processador.

[020]Em várias modalidades as instruções executáveis pelo processador compreendem pelo menos uma etapa de determinar ROIs e automatiza a calibração das ROIs.

[021]Em várias modalidades a pluralidade de filtros compreende pelo menos um filtro de excitação, pelo menos um filtro de emissão e pelo menos um divisor de feixes.

[022]Em várias modalidades a bandeja de micropoços contém pelo menos uma amostra biológica que compreende pelo menos um corante fluorescente.

[023]Em outras modalidades pelo menos um visor fornece informações a um usuário.

[024]Em outras modalidades pelo menos um dispositivo de entrada compreende chaves alfanuméricas e outras chaves configuradas para comunicar informações ao processador e controle de cursor para comunicar informações de direção ao processador.

DESCRIÇÃO

[025]A seguinte descrição de várias modalidades é meramente exemplificativa por natureza e de nenhuma maneira se destina a limitar os presentes ensinamentos, aplicações ou usos. Embora os presentes ensinamentos sejam discutidos em algumas modalidades com relação à amplificação de polinucleotídeo, como reação em cadeia de polimerase (PCR), tal discussão não deve ser relacionada como limitação do presente ensinamento a apenas àquelas aplicações.

[026]FIG. A figura 1 é um digrama de blocos que ilustra um sistema de computador 100 sob o qual modalidades dos presentes ensinamentos podem ser implantada. O sistema de computador 100 inclui barramento 102 ou outro mecanismo de comunicação para comunicar informações, e um processador 104 acoplado ao barramento 102 para processar informações. O sistema de computador 100 também inclui uma memória 106, que pode ser uma memória de acesso aleatório (RAM), ou outro dispositivo de armazenamento dinâmico, acoplado ao barramento 102, e instruções a serem executadas por processador 104. Memória 106 também pode ser usada para armazenar variáveis temporárias ou outras informações intermediárias durante a execução de instruções, que correspondem aos métodos e presentes ensinamentos, a serem executadas por processador 104. O sistema de computador 100 inclui adicionalmente uma memória somente de leitura (ROM) 108 ou outro dispositivo de armazenamento estático acoplado ao barramento 102 para armazenar informações e instruções estáticas para o processador 104. Um dispositivo de armazenamento 110, como, por exemplo, mas não limitado a um disco de estado sólido, um disco magnético ou disco óptico é fornecido e acoplado ao barramento 102 para armazenar informações e instruções.

[027]O sistema de computador 100 pode ser acoplado por meio de barramento 102 a um visor 112, como, por exemplo, mas não limitado a um tubo de raio catódico (CRT) ou visor de cristal líquido (LCD), para exibir informações a um usuário de computador. Um dispositivo de entrada de usuário 114, que inclui chaves alfanuméricas e outras chaves, é acoplado ao barramento 102 para comunicar informações e seleções de comando ao processador 104. Outro tipo de dispositivo de entrada de usuário é o controle de cursor 116, como, por exemplo, mas não limitado a um mouse, um trackball ou tecla de direção de cursor para comunicar informações de direção e seleções de comando ao processor 104 e para controlar o movimento de cursor no visor 112. Esse dispositivo de entrada tem, tipicamente, dois graus de liberdade em dois eixos geométricos, um primeiro eixo geométrico (por exemplo, x) e um segundo eixo geométrico (por exemplo, y), que permite que o dispositivo especifique posições em um plano.

[028]Consistente com determinadas modalidades dos presentes ensinamentos, configuração e calibração de instrumentos de laboratório podem ser realizadas por sistema de computador 100 em resposta ao processador 104 que executa uma ou mais sequências de uma ou mais instruções contidas na memória 106. Tais instruções podem ser lidas na memória 106 a partir de outro meio legível por computador, como, por exemplo, dispositivo de armazenamento 110. A execução das sequências de instruções contidas na memória 106 faz com que o processador 104 realize os estados de processo descritos no presente documento. Alternativamente, o conjunto de circuitos conectados diretamente pode ser usado no lugar de, ou em combinação com instruções de software para implantar os presentes ensinamentos. Dessa forma, implantações dos presentes ensinamentos não são limitadas a qualquer combinação específica de conjunto de circuitos de hardware e software.

[029]O termo “meio legível por computador”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer mídia que participa no fornecimento de instruções ao processador 104 para execução. Tal meio pode assumir muitas formas, incluindo, mas não limitado a mídia não volátil, mídia volátil e mídia de transmissão. A mídia não volátil pode incluir, mas não limitado a, por exemplo, discos ópticos ou magnéticos, como o dispositivo de armazenamento 110. A mídia volátil pode incluir, mas não limitado a memória dinâmica, como a memória 106. A mídia de transmissão pode incluir, mas não limitado a cabos coaxiais, fio de cobre e fibra óptica, incluindo os fios que compreendem o barramento 102. A mídia de transmissão também pode assumir a forma de ondas acústicas ou de luz, como aquelas geradas durante comunicações de dados por ondas de rádio ou infravermelho.

[030]As formas comuns de mídia legível por computador podem incluir, por exemplo, mas não limitado a um disquete, disco flexível, disco rígido, fita magnética ou qualquer outro meio magnético, um CDROM, qualquer outro meio óptico, cartões perfurados, fita de papel, qualquer outro meio físico com padrões de furos, um RAM, PROM, EPROM, FLASH-EPROM, unidade USB, unidade jump ou qualquer outro chip ou cartucho de memória, uma onda portadora ou qualquer outro meio que um computador possa ler.

[031]Várias formas de mídia legível por computador podem ser envolvidas ao portar uma ou mais sequências de uma ou mais instruções para o processador 104 para execução. Por exemplo, as instruções podem ser inicialmente carregadas em disco magnético de um computador remoto. O computador remoto pode carregar as instruções em sua memória dinâmica e enviar as instruções, por exemplo, por uma linha telefônica com o uso de um modem ou rede sem fio. Um modem local ao computador sistema 100 pode receber os dados na linha telefônica e usar um transmissor infravermelho para converter os dados em um sinal infravermelho. Um detector infravermelho acoplado ao barramento 102 pode receber os dados portados no sinal infravermelho e colocar os dados no barramento 102. O barramento 102 carrega os dados para a memória 106, a partir da qual o processador 104 recupera e executa as instruções. As instruções recebidas pela memória 106 podem ser opcionalmente armazenadas no dispositivo de armazenamento 110 antes ou após a execução pelo processador 104.

[032]Os presentes ensinamentos são descritos com referência aos instrumentos de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Em particular, uma modalidade dos presentes ensinamentos é implantada para instrumentos de RT-PCR que empregam o imageamento óptico de placas de poço. Tais instrumentos podem ter capacidade para medir simultânea ou sequencialmente os sinais a partir de uma pluralidade de amostras ou pontos com propósitos analíticos e exigem frequentemente a calibração, incluindo, mas sem limitação, processos que envolvem: identificar ROI (Regiões de Interesse), determinar sinal de fundo, uniformidade e calibração espectral de corante puro para análise de múltiplos componentes. A calibração também pode envolver uma reação de verificação de RT-PCR com o uso de uma placa de amostra conhecida com um resultado esperado. Uma pessoa versada na técnica notará que, embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos com exemplos pertencentes a instrumentos de RT-PCR, seus princípios são amplamente aplicáveis a outras formas de instrumentação de laboratório que pode exigir calibração e verificação a fim de garantir precisão e/ou otimização de resultados.

[033]Os presentes ensinamentos podem ser aplicados em sistemas de instrumento de RT-PCR. Tais instrumentos de RT-PCR são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, os presentes ensinamentos podem ser aplicados a instrumentos como, por exemplo, mas sem limitação aos sistemas Applied Biosystems Sequence Detection Systems 7500/7900/ViiA7 e Quant Studio, o sistema de amplificação por PCR e detecção Roche Applied Science LightCycler® 2.0, o sistema de detecção por PCR em tempo real de uma única cor Bio-Rad MyiQ, ou o sistema de PCR em tempo real Stratagene Mx3000P™. Tais instrumentos usam geralmente alguma forma de sistema de imageamento. Embora os presentes ensinamentos sejam discutidos acima em relação a um sistema de imageamento de CCD (detector acoplado de carga), os presentes ensinamentos podem ser facilmente adaptados a qualquer forma de sistema de imageamento.

[034]Em um sistema com um sistema de imageamento de CCD, uma câmera de CCD imageia uma placa de amostra (tipicamente uma placa de 96 poços, embora placas com outros números de poços possam ser usados ou blocos de amostra contendo tubos individuais também podem usados) em vários comprimentos de onda de emissão fluorescente de corante selecionados durante um teste de PCR. Em tais instrumentos, os poços são geralmente iluminados por uma luz de excitação em comprimentos de onda apropriados para cada corante. A fim de usar o sistema de RT-PCR para monitorar precisamente a amplificação por PCR com o uso das intensidades de emissão de poço, o sistema deve ser calibrado para cada emissão de corante.

[035]FIG. A Figura 2 é uma ilustração esquemática de um sistema usado para detecção de sinal fluorescente de acordo com implantações da presente invenção. O sistema de detecção 200 é um exemplo de um sistema de detecção espectral que pode ser usado para coleta de dados de RT-PCR e processamento em combinação com aspectos da presente invenção. Conforme ilustrado, o sistema de detecção 200 inclui uma fonte de luz de excitação 202, pelo menos uma torre de filtro representada pela torre 204, um detector 208, uma bandeja de micropoços 210 e fibras ópticas de poço 212. A torre 204 pode compreender múltiplos filtros de excitação ou múltiplos filtros de emissão ou múltiplos filtros de excitação e emissão pareados para um corante específico. Conforme ilustrado, a torre 204 inclui os cubos de filtro 206. Um primeiro cubo de filtro 206A pode incluir um filtro de excitação 214A, um divisor de feixes 216A e um filtro de emissão 218A correspondente a uma espécie espectral selecionada a partir de um conjunto de espécies distinguíveis de modo espectral a serem detectadas. Um segundo cubo de filtro 206B pode incluir um filtro de excitação 214B, um divisor de feixes 216B e um filtro de emissão 218B correspondentes a uma espécie espectral diferente selecionada a partir do conjunto de espécies distinguíveis de modo espectral a serem detectadas.

[036]A fonte de luz de excitação 202 pode ser, por exemplo, mas não limitado a um laser, uma fonte de luz de espectro amplo, um LED ou outro tipo de fonte de excitação com capacidade para emitir um espectro que interage com uma espécie espectral a ser detectada pelo sistema 200. Nesse exemplo ilustrado, a fonte de luz 202 emite um espectro amplo de luz filtrado pelo filtro de excitação 214A ou pelo filtro de excitação 214B que passa através do divisor de feixes 216A ou do divisor de feixes 216B para a bandeja de micropoços 210 que contém uma ou mais espécies espectrais.

[037]A luz emitida a partir da fonte de luz 202 pode ser filtrada através do filtro de excitação 214A, do filtro de excitação 214B ou outros filtros que correspondem aproximadamente a uma ou mais espécies espectrais. Os presentes ensinamentos podem ser usados com uma pluralidade de corantes distinguíveis de modo espectral como, por exemplo, mas sem limitação, um ou mais dentre FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Texas Red, CY-5, Mustang Purple, ROX (referência passiva) ou quaisquer outros fluorocromos que emitem um sinal com capacidade para ser detectado. A espécie espectral alvo para o filtro de excitação selecionado fornece a maior resposta de sinal enquanto outra espécie espectral com força de sinal mais baixa na região passa-banda do filtro contribui com menos resposta de sinal. Devido aos múltiplos fluorocromos que podem ter essa excitação de sobreposição e espectros de emissão, é útil aplicar uma mistura de corante puro para corrigir a quantidade pequena de “diafonia” (sinal de um corante detectado com mais de um conjunto de filtros). Esse processo é frequentemente denominado “multicomponente”.

[038]Conforme apresentado acima, os presentes ensinamentos são descritos em referência a instrumentos de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (RT-PCR). Em particular, uma modalidade dos presentes ensinamentos é implantada para instrumentos de RT-PCR que empregam imageamento óptico de placas de poço de amostra. Tais instrumentos podem ter capacidade para medir simultaneamente sinais de uma pluralidade de amostras ou pontos para propósitos analíticos e, em geral, exigem calibração. Um exemplo de um processo que pode exigir calibração é a identificação de ROIs ou Regiões de Interesse.

[039]Em geral, calibração de ROI pode ser realizada com o uso de uma placa de poço de amostra com emissões de corante forte em cada célula que corresponde a todos os filtros. Isso pode ser útil visto que as ROIs podem não ser idênticas para cada filtro de corante. As diferenças nas ROIs entre filtros podem ser ocasionadas, por exemplo, por diferenças angulares pequenas nos filtros e outras características espectrais de filtro. Desse modo, diversas modalidades realizam calibração de ROI-por filtro/por poço (PFPW). Essas calibrações de PFPW-ROI são úteis para determinar localizações de poços, por exemplo, porém, sem limitação a uma placa de 96 poços, uma placa de 384 poços ou um arranjo de 3.072 poços para cada filtro. A calibração de ROI pode ser realizada com o uso de um método, como os ensinamentos de Adaptive Mask Making, conforme descrito na Patente no U.S. 6.518.068, que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os presentes ensinamentos podem automatizar a calibração de ROI através de minimização ou eliminação de interação de usuário. Diversas modalidades podem automatizar o processo fornecendo-se software que pode, por exemplo, determinar o tempo de exposição ideal por filtro com o uso de análise de histograma e um padrão de busca binário. O tempo de exposição é a quantidade de tempo exigido para capturar uma imagem da placa de poço de amostra. Novamente, esse valor pode variar de acordo com características espectrais do filtro. Em geral, a calibração de ROI pode produzir informações que definem as posições de poços no campo de visão do detector. Essas informações podem ser armazenadas como arquivos de máscara ou com uma máscara global ou múltiplas máscaras que correspondem a filtros diferentes.

[040]Os processos de calibração como aqueles que são descritos acima podem, por exemplo, usar projeções de fileira e coluna e perfis de intensidade. Isso pode resultar em determinações de ROI que são susceptíveis, por exemplo, porém, não limitado a artefatos e saturação no interior dos poços, rotação de grade, variação de fatores de magnificação e distorção radial óptica. Portanto, pode ser vantajoso ter uma determinação mais robusta de ROIs para minimizar tais susceptibilidades e remover, por exemplo, distorções e outro ruído de fundo indesejado nos dados de emissão detectados.

[041]O ruído de fundo pode se referir, por exemplo, a ruído de sistema inerente, bem como outros sinais indesejados. Por exemplo, algum ruído de fundo nos dados pode ser devido a fontes físicas no substrato, como partículas de poeira ou arranhões. Outro exemplo de uma fonte física que pode fornecer ruído de fundo é um suporte ou retentor ou que envolve a amostra. Outro ruído de fundo nos dados pode ser devido a uma radiação natural das superfícies no instrumento, como reflexão e fluorescência natural. Outro ruído de fundo também pode ser um resultado do sistema óptico que detecta os dados de emissão ou a fonte de luz, por exemplo.

[042]O sistema biológico pode ser para detectar diversas centenas a diversos milhares de amostras, em que todas as quais podem ter um volume muito pequeno como, por exemplo, menos que um nanolitro. Como tal, outros métodos de remoção de ruído de fundo podem ser usados sozinhos ou em combinação com os métodos de calibração descritos neste documento de acordo com diversas modalidades para ter capacidade para determinar e analisar os dados de emissão dos volumes de amostra. Em algumas modalidades, a localização de amostras pode ser determinada de modo mais preciso no interior do substrato para realizar uma análise mais precisa. Por exemplo, em análises de PCR digital, ter capacidade para reações de distinção mais precisas em volumes de amostra versus não reação pode produzir resultados mais precisos. Ainda assim, de acordo com diversas modalidades descritas no presente documento, poços vazios ou orifícios atravessantes podem ser distinguidos a partir de volumes de amostra em poços ou orifícios atravessantes que não reagem, que também podem ser distinguidos a partir de volumes de amostra em poços ou orifícios atravessantes que reagem.

[043]De acordo com diversas modalidades descritas no presente documento, a remoção de ruído de fundo pode incluir análise e processamento de dados de imagem. O método pode incluir analisar valores de intensidade dos dados de imagem para interpolar o ruído de fundo que pode ser removido da imagem do substrato. Dessa maneira, as localizações das regiões de interesse no interior da imagem também podem ser determinadas. A remoção de ruído de fundo também pode incluir interpolar dados de áreas da imagem conhecidas por incluir regiões de interesse. Após determinar o ruído de fundo através da imagem, o ruído de fundo pode ser subtraído dos dados de imagem. Aqueles versados na técnica reconhecerão que as operações das diversas modalidades podem ser implantadas com o uso de hardware, software, firmware ou combinações dos mesmos, conforme apropriado. Por exemplo, alguns processos podem ser realizados com o uso de processadores ou outro conjunto de circuitos digital sob o controle de software, firmware ou lógica conectada diretamente. (O termo “lógica”, no presente documento, se refere a hardware fixo, lógica programável e/ou uma combinação apropriada dos mesmos, conforme seria reconhecido por um indivíduo versado na técnica para realizar as funções citadas). Software e firmware podem ser armazenados em mídia legível por computador, conforme anteriormente definido. Alguns outros processos podem ser implantados com o uso de conjunto de circuitos análogo, conforme é bem conhecido por um indivíduo de habilidade comum na técnica. Adicionalmente, memória ou outro armazenamento, bem como componentes de comunicação, podem ser empregados em modalidades da invenção.

[044]A Figura 3 representa um método in silico exemplificativo 300 de acordo com uma modalidade da presente invenção. O método in silico 300 inclui uma pluralidade de sub-rotinas de fluxo de trabalho definidas em um formato legível por computador que podem incluir sub-rotinas para um processo biotecnológico. A Figura 3 é meramente um método exemplificativo e o artesão versado, à luz desta revelação, constatará que o número real de sub-rotinas pode variar de pelo menos cerca de 2 sub-rotinas a cerca de muitos (por exemplo, 2 a 10, 2 a 20, 2 a 30, 2 a n (em que n pode ser qualquer número de sub-rotinas de 3 a 100, 3 a 1.000 e assim por diante)). Cada sub-rotina definida 310 a 370 pode incluir uma etapa ou tarefa única ou, opcionalmente, pode incluir mais de 1 etapa ou tarefa, também em um formato legível por computador, e cada etapa pode incluir adicionalmente etapas ou tarefas personalizáveis opcionais adicionais. Cada uma das etapas ou tarefas personalizáveis/opcionais pode ter um ou mais parâmetros opcionais (opções) que podem ser visualizados, visualizados novamente, definidos ou personalizados por um usuário. Em algumas modalidades, um método in silico da invenção inclui seleção por um usuário de pelo menos um parâmetro cada, para cada etapa opcional/personalizável do processo biotecnológico com o uso de uma interface gráfica de usuário (GUI) para selecionar o pelo menos um parâmetro para cada etapa opcional/personalizável. Em determinadas modalidades, cada etapa e cada parâmetro das sub-rotinas de um fluxo de trabalho estão disponíveis para um usuário visualizar e, opcionalmente, editar. Conforme é bem conhecido na técnica, programas de bioinformática escondem tipicamente alguns desses parâmetros e/ou etapas dos usuários, o que ocasiona frustação do usuário e ineficácia, especialmente quando o resultado de um experimento projetado in silico não é o resultado esperado por um usuário.

[045]Em um método in silico exemplar da divulgação ilustrada genericamente na FIG. Um método in silico exemplificativo da divulgação ilustrada, em geral, na Figura 3 pode ser realizado, operado ou executado gerando-se pelo menos um arquivo de método em um sistema de computador, em que o arquivo de método compreende instruções legíveis por computador para uma pluralidade de sub-rotinas (10, 20, 30...) de etapas personalizáveis (A, B, C), em que cada uma das quais pode ter um ou mais parâmetros que podem ser, por exemplo, visualizados, selecionados, alterados ou inseridos; e realizar o processo biotecnológico in silico compreende executar o pelo menos um arquivo de método que compreende instruções legíveis por computador pelo sistema de computador para obter pelo menos um produto biotecnológico.

[046]Em algumas modalidades, pelo menos um parâmetro customizável/opcional é selecionado a partir de um parâmetro padrão, em que o parâmetro padrão é armazenado em um componente do sistema de computador (como armazenamento, banco de dados etc.).

[047]Referindo-se novamente à Figura 3, a primeira etapa no cálculo de localizações de ROI é estimular centros de ROI iniciais a partir dos limiares de fluorescência na etapa 310. Uma placa de amostra configurada para conter uma pluralidade de amostras biológicas é fornecida e inserida em um instrumento analítico que tem capacidade para analisar amostras biológicas através do processo de PCR. Cada amostra biológica está contida em uma poço de amostra e pode ser excitada por uma fonte de luz e, em resposta à excitação, pode produzir fluorescência a um comprimento de onda predeterminado que pode ser detectado por um detector de fluorescência. Conforme apresentado acima em relação à Figura 2, a fonte de luz 202 pode ser um laser, LED ou outro tipo de fonte de excitação que tem a capacidade de emitir um espectro que interage com espécies espectrais a serem detectadas pelo sistema 200. Adicionalmente, as amostras biológicas podem incluir corantes espectralmente distinguíveis, como um ou mais dentre FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Texas Red, CY-5, ROX (referência passiva) ou quaisquer outros fluorocromos que emitam um sinal que tem capacidade para ser detectado.

[048]Antes da excitação das amostras biológicas, parâmetros de entrada e parâmetros de algoritmo são definidos para fornecer um ponto de partida para a determinação de ROI. Os parâmetros de entrada podem incluir, por exemplo, porém, não limitada a etapa e faixa limiar, tamanho de poço, distância de centro a centro de poço, espaçamento entre subarranjos, pixels ópticos por milímetro e layout de placa. O layout de placa pode incluir o número total de poços e a configuração das poços de amostra. Uma configuração frequentemente usada pode ser um arranjo retangular que compreende uma pluralidade de linhas e uma pluralidade de colunas, entretanto, uma pessoa versada na técnica entenderá que a configuração pode ser qualquer geometria adequada para o instrumento sendo usado. Ademais, o número total de poços pode variar. Uma pessoa versada na técnica estará familiarizada com as configurações que totalizam de 1 poço a centenas de poços em uma única placa de amostra ou estrutura de contenção de amostra. Os parâmetros de algoritmo de busca de ROI podem definir faixas aceitáveis para tamanho de poço, distância de centro a centro de poço e circularidade mínima. A circularidade é um valor calculado e pode ser, por exemplo, uma razão entre o perímetro e a área.

[049]Uma vez que os parâmetros de entrada e os parâmetros de algoritmo foram determinados, a pluralidade de amostras pode ser excitada com energia de uma fonte de luz apropriada, e imagens podem ser coletadas da fluorescência emitida a partir de cada poço de amostra na placa de amostra. As imagens de fluorescência da placa de amostra podem ser adicionalmente analisadas para selecionar candidatos de ROI com base nos parâmetros de entrada e os parâmetros de algoritmo. Os candidatos de ROI que satisfazem os parâmetros podem ser salvos para análise adicional, e o tamanho e a circularidade de cada poço são determinados na etapa 320. Os candidatos de ROI que não satisfazem os parâmetros podem ser descartados juntamente com quaisquer localizações que não produziram fluorescência. Os candidatos de ROI retidos podem ser adicionalmente avaliados para determinar a distância entre ROIs com base no parâmetro de espaçamento de poço a poço e no parâmetro de faixa permitida para o espaçamento de poço a poço. ROIs que têm centros que estão em estreita proximidade um ao outro com base nos parâmetros de poço a poço podem ser consideradas como sendo a mesma poço de amostra, e aquela com a melhor circularidade é selecionada como a ROI para essa poço. Uma vez que todos os candidatos de ROI foram determinados, o tamanho médio de poço pode ser calculado, a média pode ser atribuída a cada poço de amostra ROI na etapa 330, e as ROIs estimadas iniciais podem ser salvas.

[050]As localizações de poço esperadas podem ser dispostas em um padrão de grade. O padrão de mapeamento pode ser determinado com base no parâmetro de layout de placa. Esse parâmetro pode incluir o número de poços, o número de colunas e o número de linhas na placa ou subarranjo inteiro em que cada poço tem um conjunto esperado de coordenadas de grade XY com base no parâmetro de layout de placa. A análise adicional pode agora de iniciada nas ROIs estimadas iniciais para definir melhor as localizações de cada ROI inicial e pode ser denominada reticulação global. A primeira etapa na reticulação global é analisar os centros das ROIs estimadas iniciais para encontrar ROIs adjacentes. Isso pode ser determinado comparando-se a distância de centro a centro entre as ROIs às coordenadas de mapeamento com base no layout de placa. As coordenadas de mapeamento de XY podem, então, ser determinadas para cada uma das ROIs estimadas iniciais com base na relação espacial entre as ROIs.

[051]A fim de aprimorar a precisão das localizações de ROI, pode ser vantajoso relacionar as coordenadas de ROI de centro a centro às coordenadas de grade do layout de placa. Isso pode ser realizado determinando-se e aplicando-se funções de mapeamento. As funções de mapeamento são um par de funções polinomiais quadráticas bidimensionais. Essas funções são calculadas para mapear localizações de grade X (ou Y) às localizações de centro de ROI na direção X (ou Y). Uma vez que as funções foram determinadas, as mesmas podem ser aplicadas às coordenadas de mapeamento esperadas para fornecer diversos benefícios. Em primeiro lugar, a precisão das localizações de centro de ROI pode ser aprimorada, em segundo lugar, pode ser possível recuperar as ROIs que estavam ausentes durante a busca de ROI inicial, a distância de centro de poço a poço nas imagens pode ser calculada, sendo que a distância pode ser usada para determinar o tamanho real de poço nas imagens.

[052]O ajuste adicional de ROIs pode fornecer benefícios adicionais ao desempenho óptico. Os inventores revelaram que houve uma relação entre o tamanho de ROI e a relação sinal-ruído (SNR) do sistema óptico. Uma pessoa versada na técnica saberia que há diversas funções matemáticas para calcular a SNR de sistemas elétricos e ópticos. Os inventores caracterizaram a SNR com a Equação 1 abaixo:

Em que: SNR = Relação Sinal-Ruído

= a soma de todas as intensidades de pixel dentro das ROIs das imagens de fundo

= a soma de todas as intensidades de pixel dentro das ROIs das Llrr MII L ii 1 imagens de corante N= o número de pixels dentro de uma ROI

= o deslocamento de câmera G= o ganho de câmera

= o ruído de leitura

[053]Um experimento foi conduzido com o uso de um sistema óptico que incluía seis pares de filtros. Cada par de filtros incluía um filtro de excitação (Xn) e um filtro de emissão (Mn). Cada filtro era sensível a uma banda estreita de comprimentos de onda que correspondiam à frequência de excitação e à frequência de emissão correspondendo a um corante fluorescente configurado para ser compatível com o processo de PCR. Adicionalmente, as ROIs foram otimizadas de acordo com os ensinamentos apresentados neste documento. A fim de estudar o efeito do tamanho de ROI na relação sinal-ruído, a fluorescência foi detectada a partir de uma placa de amostra de 96 poços com o uso de 6 pares de filtros. O raio de cada ROI foi estendido incrementalmente por 1 pixel. A Equação 1 foi usada para calcular a SNR para cada um dos 6 pares de filtro e cada incremento de pixel. Os resultados do experimento são mostrados abaixo na Tabela 1:

As entradas em negrito identificam a SNR mais alta para cada um dos 6 pares de filtro, e uma extensão de raio de 2 pixels (\=- = 2) fornece uma melhoria geral na SNR de aproximadamente 6% através dos 6 pares de filtro.

[054]FIG. A Figura 4 mostra uma imagem de uma placa de amostra com 96 poços 410. Cada um dos 96 poços 410 produziu uma imagem fluorescente. Após aplicar os ensinamentos deste documento, as ROIs foram otimizadas, e os círculos azuis identificam a ROI para cada posição de poço. Para testar a robustez dos ensinamentos, diversos casos de teste foram conduzidos.

[055]O caso de teste 1 é mostrado na Figura 5. 5. Uma imagem de canal de ROI foi girada manualmente em 1° no sentido anti-horário, e os ensinamentos de ROI foram aplicados à imagem. O resultado na Figura. O resultado na Figura 5 mostra que o algoritmo de ROI localizou todas as 96 ROIs a despeito da rotação.

[056]O caso de teste 2 é mostrado na figura 6 e representa uma falha na determinação de ROIs para um arranjo que tem 3.072 localizações de poço devido à não uniformidade de iluminação e distorção óptica. A falha no alinhamento das ROIs pode ser vista no topo da imagem como dobra para a direita das colunas das ROIs. A mesma imagem foi submetida ao algoritmo ensinado neste documento, e os resultados são apresentados na figura 7. Pode-se notar claramente que os ensinamentos da presente invenção corrigiram a distorção anteriormente mostrada na Figura 6. A precisão de localizações de ROI é também representada na Figura 8.

[057]Para os propósitos deste relatório descritivo e reivindicações anexas, a não ser que indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, porcentagens ou proporções de materiais, condições de reação e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”. De modo correspondente, a não ser que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se busca obter pela presente invenção. No mínimo e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina dos equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado, pelo menos, à luz do número de algarismos significativos relatados e através da aplicação de técnicas comuns de arredondamento.

[058]Apesar de as faixas e parâmetros numéricos que estabelecem o escopo amplo da invenção serem aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contém inerentemente determinados erros que necessariamente resultam do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. Além disso, todas as faixas reveladas no presente documento devem ser entendidas como abrangendo quaisquer e todas as subfaixas nas mesmas. Por exemplo, uma faixa de “1 a 10” inclui quaisquer e todas as subfaixas entre (e incluindo) o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 10, ou seja, quaisquer e todas as subfaixas que têm um valor mínimo igual ou maior que 1 e um valor máximo igual ou menor que 10, por exemplo, 5,5 a 10.

[059]Percebe-se que, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem os referentes no plural a não ser que expressa e inequivocadamente limitado a um referente. Assim, por exemplo, a referência a “um monômero” inclui dois ou mais monômeros.

[060]Ficará evidente aos versados na técnica que várias modificações, variações e otimizações podem ser realizadas a várias modalidades descritas no presente documento sem afastamento do escopo dos presentes ensinamentos. Assim, entende-se que as várias modalidades descritas no presente documento abrangem outras modificações, variações e otimizações dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

Claims (19)

1. Método (300) para a calibração de um instrumento de laboratório, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: proporcionar um sistema óptico (200) que compreende uma fonte de luz (202) com capacidade para imagear emissão de fluorescência de uma pluralidade de amostras biológicas por excitação pela fonte de luz (202), onde cada amostra biológica está contida em uma dentre uma pluralidade de poços de amostra (210) em uma placa de poço de amostra, o sistema óptico (200) compreendendo pares de filtros de excitação e emissão; estimar (310) uma região de interesse inicial, ROI, a partir de limiares de fluorescência de cada poço de amostra na imagem de fluorescência; estimar pelo menos uma região de interesse inicial (ROI) utilizando o sistema óptico (200) para detectar emissões de fluorescência na pluralidade de poços de amostra (210) em relação a um ou mais limiares de fluorescência de cada poço de amostra (210); estimar (320) uma ou mais localizações centrais de cada ROI; estimar (320) um tamanho de cada ROI; determinar (330) um tamanho médio das ROIs a partir da pluralidade de poços de amostra (210); derivar (340) um ou mais modelos de reticulação (gridding) globais, em que os modelos de reticulação globais analisam as localizações centrais estimadas de cada ROI para determinar ROIs adjacentes comparando uma distância de centro a centro entre ROIs com coordenadas de mapeamento de um layout de placa de poço e determinando uma coordenada de mapeamento X e Y para cada uma das localizações centrais de ROI; aplicar (350) os modelos de reticulação globais para aprimorar a precisão das localizações centrais de ROI, relacionando as localizações centrais estimadas com uma ou mais coordenadas de localização de um layout da placa de poço de amostra determinando e aplicando funções de mapeamento que mapeiam as coordenadas de mapeamento X ou Y para as localizações centrais de cada ROI na direção X ou Y, sendo as funções de mapeamento um par de funções polinomiais quadráticas bidimensionais; recuperar (360) ROIs ausentes com uma ou mais funções de mapeamento dos modelos de reticulação globais; para cada par de filtros do instrumento, estendendo incrementalmente o raio de cada uma das ROIs; e calcular uma relação sinal-ruído para cada incremento, em que um raio otimizado para cada uma das ROIs é determinado como o raio estendido das ROIs que fornece a relação sinal-ruído mais aprimorada do sistema óptico (200).

2. Método (300), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que cada amostra biológica compreende um ou mais corantes espectralmente distinguíveis.

3. Método (300), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica fluoresce em um predeterminado comprimento de onda em resposta à excitação.

4. Método (300), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o instrumento de laboratório é configurado para analisar a uma ou mais amostras biológicas através do processo de reação em cadeia de polimerase (PCR).

5. Método (300), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte de luz (202) compreende um laser, diodo emissor de luz (LED), ou fonte de luz de espectro amplo.

6. Método (300), de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os modelos de reticulação globais compreendem comparar a distância de centro a centro entre ROIs às coordenadas de grade de um layout de placa de poço para determinar uma coordenada de grade X e Y para cada ROI.

7. Método (300), de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda determinar e aplicar funções de mapeamento para mapear cada coordenada de grade a um centro de ROI.

8. Sistema para calibrar localizações de região de interesse (ROI) para uma ou mais amostras biológicas em um instrumento de laboratório, o sistema sendo capaz de reproduzir um método conforme definido nas reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um sistema de detecção óptico (200) que compreende: uma pluralidade de filtros (214A, 218A) compreendendo pares de filtros de excitação e emissão; pelo menos uma fonte de excitação (202); pelo menos um detector (208) configurado para coletar uma ou mais imagens de emissão de fluorescência a partir da uma ou mais amostras biológicas mediante excitação por a pelo menos uma fonte de excitação (202); e uma bandeja de micropoços que compreende uma pluralidade de poços de amostra (210), onde cada amostra biológica está contida em um poço de amostra (210), o sistema de detecção óptico (200) sendo capaz de gerar imagens de emissão de fluorescência da pluralidade de poços de amostra (210); e um sistema de computador (100) que compreende: pelo menos um processador (104) configurado para: definir estimativas de um ou mais localizações centrais de ROI com base na uma ou mais imagens de emissões de fluorescência a partir da uma ou mais amostras biológicas, e um ou mais parâmetros de entrada recebidos de um usuário; adquirir uma imagem de fluorescência da pluralidade de poços de amostra; estimar (310) uma região de interesse inicial, ROI, a partir de limiares de fluorescência de cada poço de amostra na imagem de fluorescência; estimar (320) localizações centrais de cada ROI estimar um tamanho de cada ROI; determinar um tamanho médio da ROI a partir de uma pluralidade de poços de amostra; derivar (340) um ou mais modelos de reticulação (gridding) globais, em que derivar compreende analisar as localizações centrais estimadas de cada ROI para determinar ROIs adjacentes comparando uma distância de centro a centro entre ROIs com coordenadas de mapeamento de um layout de placa de poço e determinando uma coordenada de mapeamento X e Y para cada uma das localizações centrais de ROI; aplicar (350) os modelos de reticulação globais para os ROIs, determinando e aplicando funções de mapeamento que mapeiam as coordenadas de mapeamento X ou Y para as localizações centrais de cada ROI na direção X ou Y, sendo as funções de mapeamento um par de funções polinomiais quadráticas bidimensionais; recuperar (360) ROIs ausentes com as funções de mapeamento; para cada par de filtros do instrumento, estendendo incrementalmente o raio de cada uma das ROIs; e calcular uma relação sinal-ruído para cada incremento, em que um raio otimizado para cada uma das ROIs é determinado como o raio estendido das ROIs que fornece a relação sinal-ruído mais aprimorada do sistema óptico (200). analisar as localizações centrais estimadas de ROI para encontrar ROIs adjacentes; e ajustar os tamanhos das ROIs para ajustar a relação sinal-ruído do sistema de detecção óptica (200); pelo menos um meio legível por computador (106, 108, 110); pelo menos um dispositivo de entrada (114) acoplado ao pelo menos um processador (104) e configurado para receber o um ou mais parâmetros de entrada do usuário; e pelo menos um visor (112).

9. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um meio legível por computador (106, 108, 110) é acoplado ao processador (104).

10. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio legível por computador (106, 108, 110) compreende instruções executáveis pelo processador (104).

11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que as instruções executadas pelo processador (104) compreendem pelo menos uma etapa para determinar ROIs e automatizar a calibração das localizações de ROIs.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de filtros (214A, 218A) compreende pelo menos um filtro de excitação (214A, 214B), pelo menos um filtro de emissão (218A, 218B) e pelo menos um divisor de feixes (216A, 216B).

13. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma amostra biológica compreende pelo menos um corante fluorescente.

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma interface gráfica de usuário (GUI) configurada para permitir que um usuário selecione o um ou mais parâmetros de entrada.

15. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais parâmetros de entrada incluem um ou mais dentre: faixa limiar e etapa, tamanho de poço, distância de centro a centro de poço, espaçamento entre subarranjos, pixels ópticos por milímetro e layout da placa.

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um dispositivo de entrada (114) compreende teclas alfanuméricas e outras configuradas para comunicar informações ao processador (104).

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um dispositivo de entrada (114) compreende ainda um controle de cursor para comunicar informações de direção ao processador (104).

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de poços de amostras é disposta em um padrão de grade compreendendo um ou mais parâmetros de layout de placa.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais parâmetros de layout da placa compreendem um número de poços, um número de colunas e um número de linhas, em que cada poço compreende um conjunto de coordenadas XY.

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