KR20170134357A

KR20170134357A - 광학 관심 영역을 결정하는 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20170134357A
Application number: KR1020177025087A
Authority: KR
Inventors: 용 추
Original assignee: 라이프 테크놀로지스 코포레이션
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-12-06
Also published as: JP2018504606A; CN107889521A; BR112017016798B1; WO2016127082A1; RU2017131052A; BR112017016798A2; US20160231250A1; EP3254081B1; US9945788B2; EP3254081A1; CN107889521B; JP6543347B2; SG11201706329WA; KR102369567B1

Abstract

본 기술은 실험실 장비에서 하나 이상의 생물학적 샘플에 대한 관심 영역(ROI)을 결정하는 방법(300) 및 시스템에 관한 것이다. 상기 방법은 복수의 샘플 웰(210)로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템(200)을 포함할 수 있다. 각각의 웰로부터 검출된 형광으로부터 초기 ROI, 그 중심 위치(310) 및 크기(320)가 추정될 수 있다. 이 정보로부터, ROI(330)의 평균 크기가 결정될 수 있고, 글로벌 그리딩 모델(340)이 유도되어 각각의 ROI의 위치를 더 잘 지정할 수 있다. 이어서, 글로벌 그리딩 모델을 ROI에 적용하여 ROI 중심 위치(350)의 정밀성을 개선할 수 있다. 원래 형광 ROI를 제공하지 않는 샘플 웰은 맵핑 함수를 이용하여 복구될 수 있다(360). 이어서, 각각의 ROI의 반경을 조정하여(370) 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 개선할 수 있다.

Description

광학 관심 영역을 결정하는 방법 및 시스템

본 기술은 실험실 장비에서 하나 이상의 생물학적 샘플에 대한 관심 영역(ROI)을 결정하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.

실험실 장비의 설치 및 보정은 시간과 비용이 많이 소요되는 프로세스일 수 있다. 많은 경우, 장비 공급업체의 엔지니어들은 이러한 프로세스를 수행하기 위해 현장에 있어야만 한다. 이 비용은 일반적으로 사용자에게 전가된다. 일부 경우, 숙련된 사용자는 적절히 제조된 장비를 다단계 절차를 이용하여 성공적으로 보정할 수 있다. 이러한 보정 중에, 물리적 표준 및 웰 플레이트가 매뉴얼 절차와 함께 사용될 수 있다. 매뉴얼 보정 처리 및 데이터 검사는 오류가 발생하기 쉬우며, 특별한 조치 또는 주관적인 조치에 의존적일 수 있다. 최종 시스템 검증 단계는 차선의 보정 수용에 대한 탄력성을 제공할 수 있고, 자동화는 이러한 활동 중에 개선된 객관성과 통일성을 제공한다. 본 기술은 전문 지식을 자동화 보정 및 검증 시스템에 통합시켜 고장이 확인되었을 때 통과/실격 상태 및 문제 해결 피드백을 제공할 수 있다. 장비가 보정 프로세스를 통과하지 못하면, 서비스 엔지니어를 부를 수 있다. 본 기술은 설치 및 보정 절차에 필요한 비용 및 시간을 최소화할 수 있다.

본 기술은 실험실 장비에서 하나 이상의 생물학적 샘플에 대한 관심 영역(ROI)을 결정하는 방법 및 시스템이 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 이 방법은 복수의 샘플 웰로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 각각의 웰로부터 검출된 형광으로부터 초기 ROI, 그 중심 위치 및 크기가 추정될 수 있다. 이 정보로부터, ROI의 평균 크기가 결정될 수 있고, 글로벌 그리딩 모델이 유도되어 각각의 ROI의 위치를 더 잘 지정할 수 있다. 이어서, 글로벌 그리딩 모델을 ROI에 적용하여 ROI 중심 위치의 정밀도를 개선할 수 있다. 원래 형광 ROI를 제공하지 않는 샘플 웰은 맵핑 함수를 이용하여 복구될 수 있다. 이어서, 각각의 ROI의 반경을 조정하여 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 개선할 수 있다.

다른 실시예에서, 각각의 샘플 웰은 생물학적 샘플을 함유한다.

다른 실시예에서, 각각의 생물학적 샘플은 광원에 의해 여기된다.

다른 실시예에서, 생물학적 샘플은 여기에 반응하여 소정의 파장의 형광을 낸다.

다른 실시예에서, 형광은 광학 시스템에 의해 검출된다.

다른 실시예에서, 생물학적 샘플은 스펙트럼으로 구별 가능한 염료를 포함한다.

다른 실시예에서, 글로벌 그리딩 모델은 ROI들 간의 중심 간 거리를 웰 플레이트 레이아웃의 그리드 좌표들과 비교하여 각각의 ROI에 대한 X 및 Y 그리드 좌표를 결정하는 단계를 포함한다.

다른 실시예에서, 맵핑 함수가 결정되고 각각의 ROI에 대한 X 및 Y 좌표에 적용되어 각각의 좌표를 각각의 ROI의 중심에 맵핑한다.

다양한 실시예에 따라, 관심 영역(ROI) 위치를 보정하기 위한 시스템이 제시된다. 이 시스템은 적어도 하나의 프로세서 및 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템을 포함할 수 있다. 이 시스템은 적어도 하나의 입력 장치, 적어도 하나의 디스플레이, 및 광학 검출 시스템을 더 포함할 수 있다. 광학 검출 시스템은 복수의 필터, 적어도 하나의 여기 소스, 적어도 하나의 검출기, 및 마이크로웰 트레이를 더 포함할 수 있다.

여러 실시예에서, 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능 매체는 적어도 하나의 프로세서에 연결되고, 프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령을 포함한다.

여러 실시예에서, 프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령은 ROI를 결정하고 ROI의 보정을 자동화하는 적어도 하나의 단계를 포함한다.

여러 실시예에서, 복수의 필터는 적어도 하나의 여기 필터, 적어도 하나의 방출 필터, 및 적어도 하나의 빔 스플리터를 포함한다.

여러 실시예에서, 마이크로웰 트레이는 적어도 하나의 형광 염료를 포함하는 적어도 하나의 생물학적 샘플을 함유한다.

다른 실시예에서, 적어도 하나의 디스플레이는 사용자에게 정보를 제공한다.

다른 실시예에서, 적어도 하나의 입력 장치는 프로세서에 정보를 전달하도록 구성된 영숫자 및 다른 키들을 포함하고, 프로세서에 방향 정보를 전달하는 커서 제어부를 포함한다.

도 1은 본 기술의 실시예들이 구현될 수 있는 컴퓨터 시스템을 나타낸다.
도 2는 본 기술의 실시예들이 구현될 수 있는 실험실 장비를 나타낸다.
도 3은 qPCR 장비의 보정에 사용되는 일련의 단계를 나타낸다.
도 4는 96 웰 샘플 용기에 대한 관심 영역을 나타낸다.
도 5는 회전된 96 웰 샘플 용기에 대한 관심 영역을 나타낸다.
도 6은 관심 영역의 위치가 잘못 지정된 샘플 어레이를 나타낸다.
도 7은 관심 영역의 위치가 올바르게 지정된 샘플 어레이를 나타낸다.
도 8은 관심 영역의 위치가 올바르게 지정된 샘플 어레이의 확대도를 나타낸다.

아래의 여러 실시예에 대한 설명은 본질적으로 예시일 뿐이며, 결코 본 기술, 적용, 또는 용도를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 기술은 일부 실시예에서 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드 증폭과 관련되는 것으로 되지만, 이러한 설명이 본 기술을 그러한 적용으로만 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

도 1은 본 기술의 실시예들이 구현될 수 있는 컴퓨터 시스템(100)을 나타내는 블록도이다. 컴퓨터 시스템(100)은 정보 통신을 위한 버스(102) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 버스(102)와 연결된 정보 처리용 프로세서(104)를 포함한다. 컴퓨터 시스템(100)은 또한, 버스(102)에 연결된 메모리(106)(랜덤 액세스 메모리(RAM) 또는 다른 동적 저장 장치일 수 있음), 및 프로세서(104)에 의해 실행되는 명령을 포함한다. 메모리(106)는 또한 상기 방법 및 본 기술에 대응하여 프로세서(104)에 의해 실행되는 명령이 실행되는 동안 일시 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템(100)은 정적 정보 및 프로세서(104)를 위한 명령을 저장하기 위한 것으로서 버스(102)에 연결된 읽기 전용 메모리(ROM)(108) 또는 다른 정적 저장 장치를 더 포함한다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 반도체 디스크(SSD), 자기 디스크, 또는 광학 디스크 등과 같이 정보 및 명령을 저장하기 위한 저장 장치(110)가 제공되고 버스(102)에 연결된다.

컴퓨터 시스템(100)은 버스(102)를 통해, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 음극선관(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD)와 같이 컴퓨터 사용자에게 정보를 표시하기 위한 디스플레이(112)에 연결될 수 있다. 영숫자 및 다른 키를 포함하는 사용자 입력 장치(114)는 정보 및 명령 선택을 프로세서(104)에 전달하기 위해 버스(102)에 연결된다. 다른 종류의 사용자 입력 장치는, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 방향 정보 및 명령 선택을 프로세서(104)에 전달하고 디스플레이(112) 상의 커서 이동을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향 키와 같은 커서 제어부(116)이다. 일반적으로 이러한 입력 장치는 2개의 축, 제1 축(예컨대, x) 및 제2 축(예컨대, y)에서 장치가 평면에서의 위치를 특정할 수 있도록 하는 2개의 자유도를 갖는다.

본 기술의 특정 실시예에 따라, 실험실 장비의 설치 및 보정은 메모리(106)에 포함된 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 실행하는 프로세서(104)에 응답하여 컴퓨터 시스템(100)에 의해 실행될 수 있다. 이러한 명령은 예를 들어 저장 장치(110)와 같은 또 다른 컴퓨터 판독 가능 매체로부터 메모리(106)로 읽혀질 수 있다. 메모리(106)에 포함된 명령 시퀀스의 실행은 프로세서(104)로 하여금 본원에 기재된 프로세스 상태를 수행하도록 한다. 대안적으로, 소프트웨어 명령 대신 또는 이와 함께 하드웨어에 내장 회로를 사용하여 본 기술을 구현할 수 있다. 따라서, 본 기술의 구현이 하드웨어 회로 및 소프트웨어의 임의의 특정 조합으로 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 “컴퓨터 판독 가능 매체”는 실행을 위한 프로세서(104)에 명령을 제공하는 데 관여하는 임의의 매체를 나타낸다. 이러한 매체는 비휘발성 매체, 휘발성 매체, 및 전송 매체를 포함한 여러 형태를 취할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 비휘발성 매체는, 예를 들어, 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 저장 장치(110)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 휘발성 매체는 동적 메모리, 예컨대 메모리(106)를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 전송 매체는 버스(102)를 포함하는 전선을 포함하여, 동축 케이블, 구리선, 및 광섬유를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 전송 매체는 전파 및 적외선 데이터 통신 중에 발생되는 것과 같은 음파 또는 광파의 형태를 취할 수도 있다.

컴퓨터 판독 가능 매체의 일반적인 형태는 예를 들어, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CDROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드, 종이 테이프, 홀 패턴을 가진 임의의 다른 물리적 매체, RAM, PROM, EPROM, FLASH-EPROM, USB 드라이브, 점프 드라이브 또는 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파, 또는 컴퓨터가 읽을 수 있는 임의의 다른 매체를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

다양한 형태의 컴퓨터 판독 가능 매체가 실행을 위한 프로세서(104)에 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 전달하는 데 관여할 수 있다. 예를 들어, 초기에 원격 컴퓨터의 자기 디스크 상에 명령이 전달될 수 있다. 원격 컴퓨터는 동적 메모리에 명령을 로딩할 수 있으며, 예를 들어 모뎀 또는 무선 네트워크를 이용하여 전화선을 통해 명령을 전송할 수 있다. 컴퓨터 시스템(100)에 접속된 모뎀은 전화선 상의 데이터를 수신하고, 적외선 송신기를 이용하여 데이터를 적외선 신호로 변환할 수 있다. 버스(102)에 연결된 적외선 검출기는 적외선 신호로 전달되는 데이터를 수신하고 이 데이터를 버스(102) 상에 배치할 수 있다. 버스(102)는 데이터를 메모리(106)에 전달하고, 프로세서(104)는 메모리로부터 명령을 검색하고 실행한다. 메모리(106)에 의해 수신된 명령은 선택적으로 프로세서(104)에 의한 실행 전 또는 후에 저장 장치(110)에 저장될 수 있다.

본 기술은 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 기술의 일 실시예는 웰 플레이트의 광학 이미징을 이용하는 RT-PCR 장비에 대해 구현된다. 이러한 장비는 분석 목적의 복수의 샘플 또는 스팟으로부터 신호를 동시에 또는 순차적으로 측정할 수 있고, 대개 보정을 필요로 하는데, 이러한 보정은 관심 영역(ROI)을 식별하는 단계, 다성분 분석을 위한 백그라운드 신호, 균일성 및 순수 염료 스펙트럼 보정을 결정하는 단계를 포함하는 단계들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보정은 또한, 결과가 예상되는 알려진 샘플 플레이트를 이용한 RT-PCR 검증 반응을 포함할 수 있다. 본 기술이 RT-PCR 장비에 관한 예들로 설명되었지만, 그 원칙은 결과의 정확성 및/또는 최적성을 보장하기 위해 보정 및 검증을 필요로 할 수 있는 다른 형태의 실험실 장비에 폭넓게 적용될 수 있다는 것을 당업자라면 이해할 것이다.

본 기술은 RT-PCR 장비 시스템에 적용될 수 있다. 이러한 RT-PCR 장비는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 기술은 예컨대, Applied Biosystems 서열 검출 시스템 7500/ 7900/ViiA7 및 Quant Studio 시스템, Roche Applied Science LightCycler® 2.0 PCR 증폭 및 검출 시스템, Bio-Rad MyiQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템, 또는 Stratagene Mx3000P™ 실시간 PCR 시스템과 같은 장비에 적용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 장비는 일반적으로 어떤 형태의 이미징 시스템을 사용한다. 본 기술이 전하 결합 검출기(CCD) 이미징 시스템에 대해 설명되었지만, 본 기술은 어느 형태의 이미징 시스템에도 용이하게 적용될 수 있다.

CCD 이미징 시스템을 가지는 시스템에서, CCD 카메라는 PCR 실행 중에 여러 선택된 염료 형광 방출 파장에서 샘플 플레이트(다른 번호의 웰을 가진 플레이트가 사용될 수 있거나 개별 튜브가 들어 있는 샘플 블록이 사용될 수도 있으나, 일반적으로는 96-웰 플레이트)를 이미지화한다. 이러한 장비에서, 웰은 일반적으로 각각의 염료에 적합한 파장의 여기 광에 의해 조명된다. RT-PCR 시스템을 사용하여 웰 방출 강도를 이용해 PCR 증폭을 정확히 모니터링하기 위해, 시스템은 각각의 염료 방출에 대해 보정되어야 한다.

도 2는 본 발명의 구현에 따라 형광 신호 검출에 이용되는 시스템의 개략도이다. 검출 시스템(200)은 본 발명의 양태와 관련하여 RT-PCR 데이터 수집 및 처리에 사용될 수 있는 스펙트럼 검출 시스템의 일례이다. 도시된 바와 같이, 검출 시스템(200)은 여기 광원(202), 터릿(204)으로 표시된 적어도 하나의 필터 터릿, 검출기(208), 마이크로웰 트레이(210), 및 광학 웰(212)을 포함한다. 터릿(204)은 다수의 여기 필터 또는 다수의 방출 필터 또는 특정 염료에 대해 쌍을 이루는 다수의 여기 및 방출 필터를 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 터릿(204)은 필터 큐브(206)를 포함한다. 제1필터 큐브(206A)는 스펙트럼으로 구별 가능한 검출 대상 종의 세트로부터 선택되는 하나의 스펙트럼 종에 대응하여, 여기 필터(214A), 빔 스플리터(216A), 및 방출 필터(218A)를 포함할 수 있다. 제2필터 큐브(206B)는 스펙트럼으로 구별 가능한 검출 대상 종의 세트로부터 선택되는 다른 스펙트럼 종에 대응하여, 여기 필터(214B), 빔 스플리터(216B), 및 방출 필터(218B)를 포함할 수 있다.

여기 광원(202)은 예를 들어, 레이저, 광역 스펙트럼 광원, LED 또는 시스템(200)에 의해 검출될 스펙트럼 종과 상호 작용하는 스펙트럼을 방출할 수 있는 다른 종류의 여기 소스일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 도시된 예에서, 광원(202)은 여기 필터(214A) 또는 여기 필터(214B) 중 어느 하나에 의해 필터링된 광역 스펙트럼의 광을 방출하며, 이는 빔 스플리터(216A) 또는 빔 스플리터(216B)를 통과하여 하나 이상의 스펙트럼 종이 들어 있는 마이크로웰 트레이(210)상으로 전달된다.

광원(202)으로부터 방출된 광은 여기 필터(214A), 여기 필터(214B), 또는 하나 이상의 스펙트럼 종과 밀접하게 대응하는 다른 필터를 통해 필터링될 수 있다. 본 기술은 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED, CY-3, Texas Red, CY-5, Mustang Purple, ROX(수동 기준) 또는 검출될 수 있는 신호를 방출하는 임의의 다른 형광색소 중의 하나 이상과 같은, 스펙트럼으로 구별 가능한 복수의 염료와 함께 이용될 수 있다. 선택된 여기 필터에 대한 표적 스펙트럼 종이 가장 큰 신호 응답을 제공하는 반면, 필터의 대역 통과 영역에서 신호 강도가 더 낮은 다른 스펙트럼 종은 신호 응답에 덜 기여한다. 다수의 형광색소는 이러한 중첩 여기 및 방출 스펙트럼을 가질 수 있으므로, 순수 염료 행렬을 적용하여 소량의 “크로스토크”(하나 초과의 필터 세트로 검출되는 하나의 염료로부터의 신호)에 대해 교정하는 것이 유용하다. 이러한 처리를 흔히 다성분화라고 한다.

위에 제시된 바와 같이, 본 기술은 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 기술의 일 실시예는 샘플 웰 플레이트의 광학 이미징을 이용하는 RT-PCR 장비에 대해 구현된다. 이러한 장비는 분석 목적의 복수의 샘플 또는 스팟으로부터 신호를 동시에 또는 순차적으로 측정할 수 있고, 대개 보정을 필요로 한다. 보정이 필요할 수 있는 프로세스의 예는 ROI 또는 관심 영역의 식별이다.

일반적으로 ROI 보정은 모든 필터에 대응하는 각각의 셀에서 강한 염료 방출을 갖는 샘플 웰 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. ROI가 각각의 염료 필터에 대해 동일하지 않을 수 있기 때문에, 이는 유용할 수 있다. 예를 들어, 필터에서의 약간의 각도 차이 및 기타 필터 스펙트럼 특성에 의해 필터들 간에 ROI 차이가 발생할 수 있다. 따라서, 여러 실시예는 필터 당/웰 당(PFPW)-ROI 보정을 수행한다. 이러한 PFPW-ROI 보정은 각각의 필터에 대해, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트, 또는 3072 웰 어레이에서 웰의 위치를 결정하는 데 유용하다. ROI 보정은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,518,068호에 기재된 적응형 마스크 제조 기술과 같은 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 기술은 사용자 상호 작용의 최소화 또는 제거를 통해 ROI 보정을 자동화할 수 있다. 여러 실시예는, 예를 들어, 히스토그램 분석 및 이진 검색 패턴을 이용하여 필터 당 최적 노출 시간을 결정할 수 있는 소프트웨어를 제공함으로써 프로세스를 자동화할 수 있다. 노출 시간은 샘플 웰 플레이트의 이미지를 캡처하는 데 필요한 시간이다. 또한, 이 값은 필터의 스펙트럼 특성에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, ROI 보정은 검출자의 시각에서 웰의 위치를 정의하는 정보를 생성할 수 있다. 이 정보는 글로벌 마스크 또는 서로 다른 필터에 대응하는 다수의 마스크를 가진 마스크 파일로서 저장될 수 있다.

전술한 것과 같은 보정 프로세스는 예를 들어, 행과 열 프로젝션 및 강도 프로파일을 이용할 수 있다. 이로 인해 ROI 결정이 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 웰 내의 인공 결함 및 포화, 그리드 회전, 확대 계수의 변화, 및 광학 반경 수차에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 따라서, 이러한 민감성을 최소화하고, 예를 들어, 검출된 방출 데이터에서의 왜곡 및 기타 원하지 않는 백그라운드 노이즈를 제거하기 위해서는 보다 강력한 ROI 결정을 갖는 것이 유리할 수 있다.

백그라운드 노이즈는 예를 들어, 고유의 시스템 노이즈뿐만 아니라 기타 원하지 않는 신호를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 데이터의 일부 백그라운드 노이즈는 기판 상의 물리적 원인, 예컨대 먼지 입자 또는 스크래치에 기인할 수 있다. 백그라운드 노이즈를 초래할 수 있는 물리적 원인의 다른 예는 샘플을 담거나 봉입하는 홀더 또는 케이스이다. 데이터의 다른 백그라운드 노이즈는 장비의 표면으로부터의 자연 방사선, 예컨대 반사 및 자연 형광에 기인할 수 있다. 다른 백그라운드 노이즈는 예를 들어, 방출 데이터 또는 광원을 검출하는 광학 시스템으로부터의 결과일 수도 있다.

생물학적 시스템은 수백에서 수천 개의 샘플(모든 샘플은, 예를 들어 1 나노리터 미만의 작은 부피일 수 있음)을 검출하는 것일 수 있다. 이와 같이, 다른 백그라운드 노이즈 제거 방법을 단독으로 또는 다양한 실시예에 따른 본 문서에 기재된 보정 방법과 함께 이용하여 샘플 부피로부터 방출 데이터를 결정하고 분석할 수 있다. 일부 실시예에서, 보다 정확한 분석을 수행하기 위해 샘플의 위치를 기판 내에서 보다 정확히 결정할 수 있다. 예를 들어, 디지털 PCR 분석에서, 비반응에 대해 샘플 부피에서의 반응을 보다 정확히 구별할 수 있으므로, 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 여러 실시예에 따르면, 비어 있는 웰 또는 스루홀은 반응하지 않은 웰 또는 스루홀의 샘플 부피와 구별될 수 있으며, 이는 또한 반응한 웰 또는 스루홀의 샘플 부피와 구별될 수도 있다.

본원에 기재된 여러 실시예에 따르면, 백그라운드 노이즈 제거는 이미지 데이터 분석 및 처리를 포함할 수 있다. 이 방법은 기판의 이미지로부터 제거될 수 있는 백그라운드 노이즈를 보간하기 위해 이미지 데이터의 강도 값들을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방식로, 이미지 내의 관심 영역의 위치가 결정될 수도 있다. 백그라운드 노이즈 제거는 관심 영역을 포함하는 것으로 알려진 이미지의 영역으로부터 데이터를 보간하는 것을 또한 포함할 수 있다. 이미지 상에서 배경 노이즈를 결정한 후, 배경 노이즈를 이미지 데이터로부터 뺄 수 있다. 당업자는 여러 실시예들의 작동이 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 또는 이들의 조합을 이용하여 적절히 구현될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 프로세스는 소프트웨어, 펌웨어, 또는 하드웨어에 내장된 논리의 제어 하에 프로세서 또는 다른 디지털 회로를 이용하여 수행될 수 있다. (본원에서 용어 “논리”는 언급된 기능을 실행하는 것으로 당업자가 인식하는, 고정 하드웨어, 프로그램 가능한 논리 및/또는 이들의 적절한 조합을 말한다.) 소프트웨어 및 펌웨어는 앞서 정의된 바와 같은 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다. 일부 다른 프로세스는, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 아날로그 회로를 이용하여 구현될 수 있다. 또한, 통신 구성 요소와 더불어 메모리 또는 다른 기억 장치가 본 발명의 실시예들에서 이용될 수 있다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 예시적인 인실리코 방법(300)을 나타낸다. 인실리코 방법(300)은 생명공학 프로세스에 대한 서브루틴을 포함할 수 있는 컴퓨터 판독 가능한 형식으로 복수의 설정 워크플로우 서브루틴을 포함한다. 도 3은 단지 예시적인 방법이며, 당업자는, 본 개시에 비추어, 서브루틴의 실제 수가 적어도 약 2개의 서브루틴부터 여러 개(예를 들어, 2~10, 2~20, 2~30, 2~n (여기에서 n은 3~100, 3~1000 등의 임의의 서브루틴 수일 수 있음))의 서브루틴까지 다양할 수 있음을 이해할 것이다. 각각의 세트 서브루틴 310~370은, 또한 컴퓨터 판독 가능한 형식으로, 단일 단계 또는 작업을 포함하거나, 또는 선택적으로 하나보다 많은 단계 또는 작업을 포함할 수 있고, 각각의 단계는 추가의 선택적 사용자 정의(customizable) 단계 또는 작업을 더 포함할 수 있다. 각각의 선택적/사용자 정의 단계 또는 작업은 사용자가 검사, 검토, 설정 또는 사용자 정의할 수 있는 하나 이상의 선택적 파라미터(옵션)를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 인실리코 방법은 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 이용하여 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대한 적어도 하나의 파라미터를 선택하는 생명공학 프로세스의 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대해 사용자가 적어도 하나의 파라미터 각각을 선택하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 워크플로우의 서브루틴의 모든 단계 및 모든 파라미터를 사용자가 검사하고, 선택적으로 편집할 수 있다. 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 바이오인포매틱스 프로그램은 일반적으로 이러한 파라미터 및/또는 단계의 일부를 사용자에게 감추는데, 이는 특히 인실리코 설계된 실험의 결과가 사용자의 예상 결과가 아닌 경우, 사용자 불만 및 비효율을 초래한다.

도 3에 개괄적으로 도시된 본 발명의 예시적 인실리코 방법은, 예를 들어, 검사, 선택, 변경 또는 입력할 수 있는 하나 이상의 파라미터를 각각 가질 수 있는 사용자 정의 단계(A, B, C)의 복수의 서브루틴(10, 20, 30..)에 대한 컴퓨터 판독 가능한 명령을 포함하는 적어도 하나의 방법 파일을 컴퓨터 시스템에서 생성하고; 적어도 하나의 생명공학 생성물을 얻기 위해 컴퓨터 판독 가능한 명령을 포함하는 적어도 하나의 방법 파일의 실행을 포함하는 인실리코 생명과학 프로세스를 컴퓨터 시스템에 의해 수행함으로써 이행, 수행 또는 실행될 수 있다.

일부 실시예에서, 적어도 하나의 사용자 정의/선택적 파라미터는 기본 파라미터로부터 선택되며, 기본 파라미터는 컴퓨터 시스템의 구성 요소(예컨대, 기억 장치, 데이터베이스 등)에 저장된다.

도 3을 다시 참조하면, ROI 위치를 계산하는 첫 번째 단계는 단계 310에서 형광 임계치로부터 초기 ROI 중심을 추정하는 것이다. 복수의 생물학적 샘플을 함유하도록 구성된 샘플 플레이트가 제공되고, PCR 공정을 통해 생물학적 샘플을 분석할 수 있는 분석 장비에 삽입된다. 각각의 생물학적 샘플은 샘플 웰에 담기고, 광원에 의해 여기될 수 있으며, 여기에 반응하여, 형광 검출기에 의해 검출될 수 있는 소정의 파장의 형광을 낼 수 있다. 도 2와 관련하여 위에서 제시된 바와 같이, 광원(202)은 레이저, LED, 또는 시스템(200)에 의해 검출될 스펙트럼 종과 상호 작용하는 스펙트럼을 방출할 수 있는 다른 종류의 여기 소스일 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 스펙트럼으로 구별 가능한 염료, 예컨대 FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Texas Red, CY-5, ROX(수동 기준) 또는 검출될 수 있는 신호를 방출하는 임의의 다른 형광색소 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.

생물학적 샘플을 여기시키기 전에, ROI 결정에 대한 시작점을 제공하기 위해 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 설정된다. 입력 파라미터는 예를 들어, 임계치 범위 및 단계, 웰 크기, 웰 중심 간 거리, 서브어레이 사이의 간격, 밀리미터 당 광학 픽셀, 및 플레이트 레이아웃을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 플레이트 레이아웃은 웰의 총수 및 샘플 웰의 구성을 포함할 수 있다. 주로 이용되는 구성은 복수의 행과 복수의 열을 포함하는 직사각형 어레이일 수 있지만, 당업자는 사용되는 장비에 적합한 임의의 형상의 구성일 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 웰의 총수는 달라질 수 있다. 당업자는 단일 샘플 플레이트 또는 샘플 수납 구조에서 총 1개 내지 수천 개의 웰 구성에 익숙할 것이다. ROI 검색 알고리즘 파라미터는 웰 크기, 웰 중심 간 거리, 및 최소 진원도에 대한 허용 범위를 설정할 수 있다. 진원도는 계산 값이며, 예를 들어, 면적에 대한 둘레의 비일 수 있다.

입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 일단 결정되면, 복수의 샘플이 적절한 광원의 에너지로 여기될 수 있고, 샘플 플레이트의 각각의 샘플로부터 방출된 형광의 이미지가 수집될 수 있다. 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터를 기초로 ROI 후보를 선택하기 위해 샘플 플레이트의 형광 이미지를 추가로 분석할 수 있다. 파라미터를 만족하는 ROI 후보는 추가 분석을 위해 저장될 수 있으며, 각각의 웰의 크기 및 진원도는 단계 320에서 결정된다. 파라미터를 만족하지 않는 ROI 후보는 형광을 내지 않은 모든 위치와 함께 폐기될 수 있다. 웰 사이의 간격 파라미터 및 웰 사이의 간격에 대한 허용 범위 파라미터를 기초로 ROI 사이의 거리를 결정하기 위해 잔류 ROI 후보를 더 평가할 수 있다. 웰 대 웰 파라미터를 기초로 서로 근접한 중심을 갖는 ROI는 동일한 샘플 웰로 간주될 수 있으며, 진원도가 가장 좋은 것이 해당 웰에 대한 ROI로 선택된다. 모든 ROI 후보가 일단 결정되면, 평균 웰 크기가 계산될 수 있고, 단계 330에서 각각의 샘플 웰 ROI에 평균이 할당될 수 있으며, 초기 추정 ROI가 저장될 수 있다.

예상 웰 위치들은 그리드 패턴으로 배열될 수 있다. 그리드 패턴은 플레이트 레이아웃 파라미터를 기초로 결정될 수 있다. 이 파라미터는 전체 플레이트 또는 서브어레이에서의 웰의 수, 열의 수, 및 행의 수를 포함할 수 있고, 각각의 웰은 플레이트 레이아웃 파라미터를 기초로 예상되는 XY 그리드 좌표 세트를 갖는다. 이제는 각각의 초기 ROI의 위치를 더 잘 정의하기 위해 초기 추정 ROI에 대해 추가 분석이 개시될 수 있으며, 이를 글로벌 그리딩이라 할 수 있다. 글로벌 그리딩의 첫 단계는 초기 추정 ROI의 중심을 분석하여 인접한 ROI를 찾는 것이다. 이는 ROI 사이의 중심 간 거리를 플레이트 레이아웃 기반의 그리드 좌표와 비교하여 결정될 수 있다. 이어서, ROI 간의 공간적 관계를 기초로 각각의 초기 추정 ROI에 대해 XY 그리드 좌표가 결정될 수 있다.

ROI 위치의 정밀도를 개선하기 위해, 중심 간 ROI 좌표를 플레이트 레이아웃의 그리드 좌표와 연관시키는 것 유리할 수 있다. 이는 맵핑 함수를 결정하고 적용함으로써 달성될 수 있다. 맵핑 함수는 2차원 이차 다항식 함수의 쌍이다. 이 함수는 X(또는 Y) 그리드 위치를 X(또는 Y) 방향으로 ROI 중심 위치에 맵핑하도록 계산된다. 맵핑 함수가 일단 결정되면, 예상 그리드 좌표에 적용하여 여러 장점을 제공할 수 있다. 첫째, RIO 중심 위치의 정밀도가 개선될 수 있고, 둘째, 초기 ROI 검색 중에 누락되었던 ROI를 복구할 수 있으며, 이미지에서 웰 간 중심 거리가 계산될 수 있고, 이는 이미지에서 실제 웰 크기를 결정하는 데 이용될 수 있다.

ROI를 추가로 조정하면 광학 성능에 추가적인 이점을 제공 할 수 있다. 본 발명자들은 ROI 크기와 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비(SNR) 사이에 관계가 있다는 것을 발견하였다. 당업자는 전기 및 광학 시스템의 SNR을 계산하는 여러 수학 함수가 있다는 것을 알 것이다. 본 발명자들은 아래의 식 1로 SNR을 특성화하였다:

여기에서: SNR = 신호 대 노이즈 비

S _dye _plate = S _dye

S _BG = 백그라운드 이미지의 ROI 내 모든 픽셀 강도의 합

S _dye = 염료 이미지의 ROI 내 모든 픽셀 강도의 합

N = ROI 내 픽셀의 합

offset = 카메라 오프셋

G = 카메라 게인

δ ² _R,y = 판독 노이즈

여섯 쌍의 필터를 포함한 광학 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 각각의 필터 쌍은 여기 필터(Xn) 및 방출 필터(Mn)를 포함하였다. 각각의 필터는 PCR 공정에 적합하도록 구성된 형광 염료에 해당하는 여기 주파수 및 방출 주파수에 해당된 좁은 파장 대역에 민감했다. 또한, 본 문서에 제시된 기술에 따라 ROI를 최적화하였다. 신호 대 노이즈에 미치는 ROI 크기의 영향을 검토하기 위해, 6쌍의 필터를 이용하여 96 웰 샘플 플레이트로부터 형광을 검출하였다. 각각의 ROI의 반경을 1 픽셀씩 점진적으로 확대하였다. 식 1을 이용하여 6개의 필터 쌍 각각 및 각각의 픽셀 증가에 대한 SNR을 계산하였다. 실험의 결과를 아래 표 1에 나타내었다:

굵은 글씨로 표시된 항목은 6개의 필터 쌍 각각에 대한 가장 높은 SNR을 나타내며, 2 픽셀 반경 확대(

)는 6개의 필터 쌍에 걸쳐 약 6%의 전반적인 SNR 개선을 제공한다.

도 4는 96 웰(410)을 갖는 샘플 플레이트의 이미지를 나타낸다. 96 웰(410) 각각은 형광 이미지를 생성하였다. 본 문서의 기술을 적용한 후, ROI는 최적화되었고, 청색 원은 각 웰 위치에 대한 ROI를 나타낸다. 본 기술의 강력함을 시험하기 위해, 여러 시험 케이스를 수행하였다.

시험 케이스 1을 도 5에 나타내었다. ROI 채널 이미지를 반시계 방향으로 1° 수동으로 회전하였고, 그 이미지에 ROI 기술을 적용하였다. 도 5의 결과는 회전에도 불구하고 ROI 알고리즘이 모든 96 ROI를 위치시켰음을 보여준다.

시험 케이스 2는 도 6에 나타나 있는데, 조도 불균일성 및 광학적 왜곡으로 인해 3072 웰 위치를 갖는 어레이에 대한 ROI 결정에 실패한 것을 보여준다. ROI 정렬의 실패는 이미지의 상부에서 ROI의 열이 오른쪽으로 휜 것으로 확인될 수 있다. 동일한 이미지를 본 문서에 기술된 알고리즘에 적용하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 본 발명의 기술이 앞서 도 6에 나타난 왜곡을 교정했음을 명확하게 알 수 있다. ROI 위치의 정밀도를 도 8에도 나타내었다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해서, 달리 나타내지 않는 한, 성분의 양, 물질의 퍼센트 또는 비율, 반응 조건을 나타내는 모든 숫자, 및 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 다른 수치들은 모든 경우에 용어 “약”으로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터들은 본 발명에 의해 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치들이다. 적어도, 그리고 균등론의 적용을 청구범위의 범위로 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 수를 고려하여 그리고 통상적인 반올림법을 적용하여 이해되어야 한다.

발명의 넓은 범위를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치는 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적인 발생하는 특정 오류를 본질적으로 포함한다. 또한, 본원에 개시된 모든 범위는 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, “1 내지 10”의 범위는 최소값 1과 최대값 10 사이의 (그리고 이들을 포함하는) 모든 하위 범위, 즉, 1 이상의 최소값 및 10 이하의 최대값을 갖는 모든 하위 범위(예를 들어, 5.5 내지 10)를 포함한다.

참고로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 명시적으로 그리고 명백히 하나의 지시대상으로 한정하지 않는 한, 단수형은 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “모노머”에 대한 언급은 둘 이상의 모노머를 포함한다.

본 기술의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본원에 기술된 여러 실시예들을 다양하게 수정하고, 변경하고, 최적화할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기술된 여러 실시예들은 첨부된 청구범위 및 그 균등 범위 내의 다른 수정, 변경, 및 최적화를 포함하는 것으로 의도된다.

Claims

실험실 장비의 보정 방법으로서,
복수의 샘플 웰로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 제공하는 단계;
각각의 샘플 웰로부터의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하는 단계;
각각의 ROI의 중심 위치를 추정하는 단계;
각각의 ROI의 크기를 추정하는 단계;
복수의 샘플 웰로부터 ROI의 평균 크기를 결정하는 단계;
각각의 ROI의 위치를 더 잘 정의하는 글로벌 그리딩 모델을 유도하는 단계;
상기 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하여 상기 ROI의 중심 위치의 정밀성을 개선하는 단계;
맵핑 함수로 누락 ROI를 복구하는 단계;
ROI의 반경을 조정하여 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 개선하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 각각의 샘플 웰은 생물학적 샘플을 함유하는 방법.
제1항 및 제2항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 광원에 의해 여기되는 방법.
제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 상기 여기에 반응하여 소정의 파장의 형광을 내는 방법.
제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 형광은 상기 광학 시스템에 의해 검출되는 방법.
제1항 및 제2항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 스펙트럼으로 구별 가능한 염료를 포함하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글로벌 그리딩 모델은 ROI들 간의 중심 간 거리를 웰 플레이트 레이아웃의 그리드 좌표들과 비교하여 각각의 ROI에 대한 X 및 Y 그리드 좌표를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 및 제7항에 있어서, 맵핑 함수를 결정하고 적용하여 각각의 그리드 좌표를 ROI 중심에 맵핑하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
관심 영역(ROI) 위치를 보정하기 위한 시스템으로서,
적어도 하나의 프로세서 및 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템;
적어도 하나의 입력 장치;
적어도 하나의 디스플레이; 및
복수의 필터, 적어도 하나의 여기 소스, 적어도 하나의 검출기, 및 마이크로웰 트레이를 포함하는 광학 검출 시스템을 포함하는 시스템.
제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 컴퓨터 판독 가능 매체는 상기 프로세서에 연결된 시스템.
제9항 내지 제10항에 있어서, 상기 컴퓨터 판독 가능 매체는 상기 프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령을 포함하는 시스템.
제9항 내지 제11항에 있어서, 상기 프로세서에 의해 실행되는 상기 명령은 ROI를 결정하고 상기 ROI의 보정을 자동화하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 시스템.
제9항에 있어서, 상기 복수의 필터는 적어도 하나의 여기 필터, 적어도 하나의 방출 필터, 및 적어도 하나의 빔 스플리터를 포함하는 시스템.
제9항에 있어서, 상기 마이크로웰 트레이는 적어도 하나의 형광 염료를 포함하는 적어도 하나의 생물학적 샘플을 함유하는 시스템.
제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출기는 적어도 하나의 형광 염료를 포함하는 적어도 하나의 생물학적 샘플을 이미징하는 시스템.
제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 디스플레이는 사용자에게 정보를 제공하는 시스템.
제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 입력 장치는 상기 프로세서에 정보를 전달하도록 구성된 영숫자 및 다른 키들을 포함하는 시스템.
제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 입력 장치는 상기 프로세서에 방향 정보를 전달하는 커서 제어부를 더 포함하는 시스템.