BRPI0718050A2 - Formação de imegens do endotélio vascular ativado usando agentes de contraste de mri imunomagnéticos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMAÇÃO DE IMEGENS DO ENDOTÉLIO VASCULAR ATIVADO USANDO AGEN- TES DE CONTRASTE DE MRIIMUNOMAGNÉTICOS".

REFERÊNCIA CRUZADA COM REQUERIMENTOS RELACIONADOS

Este pedido é um pedido não-provisório, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este pedido de patente, e reivindica priorida- de, em parte, do Pedido Provisório dos Estados Unidos N°. 60/856.127, de- positado em 02 de novembro de 2006. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de modo geral, a formação de imagem por diagnóstico in vivo com o uso de nanopartículas. Mais especifi- camente, esta invenção refere-se a uma técnica de formação por imagens por diagnóstico nas quais um estado de doença pode ser formado por ima- gens usando um agente de contraste direcionado formado por funcionaliza- ção de nanopartículas em um processo de revestimento que incorpora uma porção direcionada. Estes agentes de contraste são adequados para forma- ção por imagens de ressonância magnética usadas para avaliar, diagnosti- car, e tratar estados de doença tais como, mas não limitados a, câncer, do- enças cardiovasculares, cerebrovasculares, vascular periférica, autoimunes e todas as doenças inflamatórias. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a nanopartículas imunomagnéti- cas como agente de contraste e seu uso em técnicas de formação por ima- gens por diagnóstico clínico tais como, mas não limitadas a, formação por imagens de ressonância magnética ("MRI"). A presente invenção baseia-se na nova capacidade destas partículas de permanecerem suspensas e não agregarem-se, suas composições de revestimento as quais evitam agrega- ção de partículas, deste mnodo melhorando a estabilidade das partículas, sua capacidade para permitir funcionalização da superfície das partículas, e métodos para sua fabricação eficaz.

O uso de agentes de contraste em medicina diagnostica está crescendo rapidamente. Em diagnóstico por raio-X, por exemplo, contraste aumentado de órgãos internos, tais como os rins, o trato urinário, o trato di- gestivo, o sistema vascular do coração (angiografia), e etc., é obtido admi- nistrando um agente de contraste o qual é mais radiopaco do que o tecido, órgão ou espaços circundantes. Em diagnóstico por ultrassom, o contraste aumentado é obtido administrando composições tendo impedâncias acústi- cas diferentes das do sangue e de outros tecidos.

Em diagnóstico por MRI de prótons, contraste aumentado de órgãos internos e tecidos pode ser obtido administrando composições con- tendo espécies de metais paramagnéticos. Por exemplo, partículas de hidro- xilapatita são usadas para reforçar formação por imagens clínicas de órgãos e tecidos do corpo. Estas partículas são compostas do mineral apatita de cálciom com a fórmula Ca5(PO4)3(OH). É o componente mineral inorgânico dos ossos e dos dentes. Devido aos seus íons metais paramagnéticos, é útil em formação por imagens de ressonância magnética, formação por imagens de raio-X ou de ultrassom do fígado e do baço (Patente dos Estados Unidos N°. 5.690.908).

Em geral para os agentes de contraste serem eficazes, devem interferir com o comprimento da onda de radiação eletromagnética usada na técnica de formação por imagens, alterar as propriedades físicas do tecido para produzir um sinal alterado, ou proporcionar a própria fonte de radiação. Materiais comumente usados incluem moléculas orgânicas, íons metálicos, sais ou quelatos, partículas (particularmente partículas de ferro), ou peptí- deos etiquetados, proteínas, polímeros ou lipossomas. Depois da adminis- tração, o agente pode difundir-se não-especificamente por todos os compar- timentos do corpo antes de ser metabolizado e/ou excretado; estes agentes são conhecidos de modo geral como agentes não-específicos. Alternativa- mente, o agente pode ter uma afinidade específica para um compartimento do corpo particular, célula, órgão, ou tecido; estes agentes podem ser referi- dos como agentes direcionados. Para agentes injetados ou absorvidos no corpo e distribuídos

pelo sangue, é desejável ter uma meia-vida sangüínea apropriada (Patente dos Estados Unidos N°. 7.229.606). Apesar de meia-vidas extremamente longas (isto é, dias ou semanas) serem desnecessárias em situações clíni- cas de formação por imagens e possivelmente perigosa (devido ao aumento da probabilidade de toxicidade e decomposição metabólica em moléculas mais tóxicas), também não são desejáveis meia-vidas curtas. Se o reforço da imagem durar um tempo curto demais, é difícil de adquirir uma imagem de alta qualidade do paciente. Além disso, a linha rápida de um agente dire- cionado reduzirá a quantidade do agente disponível para ligar ao sítio-alvo e deste modo reduzirá o "brilho" do sítio-alvo na imagem.

Formação por imagens de ressonância magnética (MRI) é uma técnica que usa um poderoso campo magnético e sinais de rádio para criar sofisticadas imagens verticais, transversais e tridimensionais de estruturas e órgãos dentro de um corpo. MRI é mais eficaz para proporcionar imagens de tecidos e órgãos que contêm água, tais como o cérebro, órgãos internos, glândulas, vasos sangüíneos e articulações. Quando pulsos de ondas de rádio focalizados são transmitidos em direção a átomos de hidrogênio ali- nhados magneticamente em um tecido de interesse, os átomos de hidrogê- nio retornam um sinal como conseqüência da relaxação de prótons. As sutis diferenças no sinal de vários tecidos corporais possibilitam que MRI diferen- cie órgãos, e potencialmente contrastam tecido benigno e maligno, tornando MRI útil para detectar tumores, sangramento, aneurismas, lesões, bloqueio, infecção, lesões de articulações, e etc.

Quando usados em MRI, agentes de contraste alteram o tempo de relaxação dos tecidos que ocupam. Agentes de contraste para MRI são tipicamente materiais magnéticos que aumentam o tempo de relaxação dos prótons de água em uma faixa próxima estreito devido a uma interação dipo- Iar magnética de tempo-dependente entre os momentos magnéticos do a- gente de contraste e os prótons de água. Agentes de contraste para MRI são ou agentes positivos que dão brilho ao tecido que ocupam, ou são agentes negativos que fazem um tecido aparecer mais escuro. Para diagnóstico in vivo, MRI proporciona características de boa resolução (cerca de 2 mm), no entanto, oferece sensibilidade pobre quando comparado com outras técnicas de formação por imagens. A administração de agentes de contraste aumenta bastante a sensibilidade de formação por imagens. Espécies de gadolínio paramagnético (Gd) tais como Gd-DTPA (por exemplo, OMNISCAN®) dão brilho ao tecido e têm sido usadas clinicamente como agentes de contraste em MRI.

A especificidade de agentes de contraste é uma propriedade

desejada para reforçar a proporção de sinal-para-ruído em um sítio de inte- resse e proporcionar informação funcional através de formação por imagens. A distribuição natural de agentes de contraste depende do tamanho, da car- ga, da química superficial e da via de administração. Os agentes de contras- te podem se concentrar em tecidos saudáveis ou sítios de lesão e aumen- tam o contraste entre o tecido normal e a lesão. De modo a aumentar o con- traste, é necessário concentrar os agentes no sítio de interesse e aumentar a relaxividade. Além disso, também é desejável aumentar a captação dos agentes por células doentes em relação a células saudáveis. A maioria dos agentes de contraste são um tanto órgão-

específicos devido ao fato de que são excretados ou pelo fígado ou pelos rins. Estudos iniciais usando quelatos de gadolínio como agentes direciona- dos por receptores exigiram um alto nível de agente de contraste para uma relaxação significativamente reduzida (Eur. Radiol. 2001. 11:2319-2331, Y.- X. J. Wang, S. M. Hussain, G. P. Krestin). Comparadas aos quelatos de ga- dolínio, partículas de magnetita possuem suscetibilidade magnética cerca de duas a três ordens de maior magnitude (Eur. Radiol. 2001. 11:2319-2331, Y.-X. J. Wang, S. M. Hussain, G. P. Krestin). Portanto, agentes de contraste de oxido de ferro potencialmente oferecem um sinal mais forte em uma do- sagem mais baixa do que quelatos de gadolínio. A maior sensibilidade de agentes de óxido de ferro proporciona benefícios adicionais devido ao núme- ro limitado de alvos disponíveis para ligar em um dado tecido.

Há uma variedade de nanopartículas magnéticas tais como magnetodedrímeros, magnetolipossomas e nanopartículas revestidas com polímero (tais como dextrano, álcool polivinílico, e etc.) que são compostas de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas cristalinas embuti- das em um revestimento orgânico. A maioria dos agentes de contraste comerciais são à base de dextrano ou derivados de dextrano, onde são empregadas partículas de ta- manho relativamente pequeno. No entanto, revestimentos de dextrano têm sido reivindicados como sendo instáveis nas condições alcalinas da síntese de partículas, e sua composição química portanto tem sido questionada. A- dicionalmente, reações anafiláticas induzidas por dextrano apresentam pro- blemas potenciais (Patente dos Estados Unidos N°. 5.492.814).

Convencionalmente, nanopartículas de óxido de ferro são sinte- tizadas e precipitadas a partir de soluções aquosas alcalinas na presença de moléculas orgânicas solúveis em água tais como dextrano, e tais nanopartí- culas geralmente têm um revestimento orgânico. Nanopartículas obtidas por tais métodos tendem a ter uma distribuição de tamanho ampla do óxido de ferro paramagnético, e, em conseqüência, as partículas revestidas também apresentam uma ampla distribuição de tamanho. Além disso, este método proporciona pouco controle sobre o grau de revestimento levando a partícu- las contendo múltiplas nanopartículas de óxido de ferro dentro de um único agente. Técnicas de fabricação extensivas, incluindo múltiplas etapas de purificação e de separação de tamanho, são necessárias para obter os ta- manhos das partículas desejados. O tamanho da partícula, bem como a composição do revestimento orgânico, é muito importante uma vez que afeta diretamente a farmacocinética das nanopartículas. O tamanho do óxido de ferro refere-se diretamente ao paramagnetismo e a relaxividade do agente. Portanto, uma ampla distribuição de tamanho geralmente traduz-se em uma sensibilidade média.

Nanopartículas obtidas usando métodos convencionais também

têm um baixo nível de cristalinidade, o qual significativamente impacta a sensibilidade do agente de contraste. Além disso, nanopartículas tendem a se aglomerar devido a sua alta energia superficial, a qual é um problema significativo encontrado durante as etapas de síntese e purificação. Tal a- glomeração aumenta o tamanho da partícula, resultando em rápida limpeza sangüínea bem como reduzindo a eficiência do direcionamento, e pode re- sultar em uma redução na relaxividade. O tamanho, o tempo na circulação sangüínea e o revestimento orgânico afetam a eficiência do direcionamento de diferentes modos. Quando emprega-se partículas grandes, somente uns poucos Iigantes de direcionamento podem ser fixados antes das partículas tornarem-se grandes demais para serem limpas do sangue e do fracasso do agente de atingir a direção pretendido. Tamanhos de partículas menores podem ser muito "mais pegajosos" nos sítios onde ocorre reconhecimento entre o biomarcador e o ligante. Quando os revestimentos são globulares, sítios reativos pretendidos para fixação de ligante são geralmente impedidos, deste modo reduzindo a eficiência da conjugação. Além disso, uma vez Iiga- dos, os Iigantes podem estar presentes no interior de revestimentos globula- res, prevenindo fácil acesso aos biomarcadores.

Os agentes de formação por imagens atuais e seu uso propor- cionam essencialmente informação anatômica. No entanto, subjacentes a estados de doença estão os processos bioquímicos que propagam a doença bem antes de sintomas físicos visíveis aparecerem. Ter a capacidade de formar imagens, os caminhos bioquímicos, ou marcadores específicos nos caminhos, nos estágios precoces da doença proporcionaria informação fun- cional.

São necessários agentes de contraste que são direcionados pa- ra marcadores moleculares particulares que são capazes de detectar a pre- sença aumentada dos biomarcadores químicos cruciais, e deste modo pro- porcionam informação bioquímica sobre a presença precoce de um estado de doença específico. Agentes de contraste moleculares capazes de dire- cionamento de sítios de uma lesão são necessários para tratar a necessida- de médica para diagnóstico precoce e tratamento da doença. Uma das prin- cipais necessidades relativas ao desenvolvimento em formação por imagens moleculares e liberação direcionada dos agentes de contraste é a identifica- ção dos biomarcadores. Agentes de contraste, no entanto, têm problemas inerentes que limitam a eficiência do direcionamento, tais como baixa sensi- bilidade, baixa proporção de sinal-para-ruído, tamanhos de partículas gran- des, rápido limpeza sangüínea, baixa eficiência de fixação de ligante eaa- cessibilidade de Iigantes aos alvos dos biomarcadores. Exemplos anteriores de liberação direcionada de agentes de contraste envolvidos usando nanopartículas de óxido de ferro revestidas com dextrano reticulado e subseqüentemente adicionando anticorpos ou peptídeos (Kelly, Κ. A., Allport, J. R., Tsourkas1 A., Shinde-Patil, V. R., Jose- phson, L., and Weissleder, R. (2005) Circ Res 96, 327-336; Wunderbaldin- ger, P., Josephson, L., and Weissleder, R. (2002) Bioconjug Chem 13, 264- 268). Apesar de ser realizada conjugação das moléculas e liberação de a- gente em um sítio de interesse, concluiu-se que os agentes tornaram-se maiores (>65 nm) na bioconjugação e demonstraram meia-vida sangüínea muito baixa (<50 minutos) a qual pode afetar dramaticamente a eficácia em seres humanos.

Umas poucas nanopartículas de óxido de ferro paramagnéticas que foram avaliadas em medicina como agentes de contraste para MRI. Al- guns destes produtos estão disponíveis no mercado, tais como Feridex IV®, Abdoscan® e Lumirem® como agentes de contraste usados em aplicações clínicas para formação por imagens do fígado e do baço.

Nanopartículas são classificadas grandes com base no tamanho, (1,5 a cerca de 50 micra), pequenas (0,7 a 1,5 micra) ou coloidais (<200 nm). As últimas, as quais também são conhecidas como ferrofluidos ou ma- teriais similares a ferrofluido, são algumas vezes referidas aqui, como partí- culas paramagnéticas coloidais.

Foi demonstrado que partículas magnéticas pequenas do tipo descrito acima são bastante úteis em análises envolvendo reações de afini- dade bioespecíficas, uma vez que são convenientemente revestidas com polímeros biofuncionais (por exemplo, proteínas), proporcionam áreas super- ficiais muito elevadas e dão razoável cinética de reação. Partículas magnéti- cas variando de 0,7 a 1,5 micra foram descritas na literatura de patente, in- cluindo, a título de exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 3.970.518; 4.018.886; 4.230.685; 4.267.234; 4.452.773; 4.554.088; e 4.659.678. Partículas magnéticas pequenas, tais como as mencionadas a-

cima, de modo geral estão dentro de duas categorias amplas. A primeira categoria inclui partículas que são permanentemente magnetizáveis, ou fer- romagnéticas; e a segunda compreende partículas que apresentam compor- tamento magnético em massa somente quando submetidas a um campo magnético. As últimas são referidas como partículas magneticamente res- ponsivas. Materiais apresentando comportamento magneticamente respon- sivo são algumas vezes descritos como paramagnéticos. No entanto, mate- riais normalmente considerados ferromagnéticos, por exemplo, oxido de fer- ro magnético, podem ser caracterizados como paramagnéticos quando pro- porcionados em cristais de cerca de 30 nm ou menos de diâmetro. Cristais relativamente maiores de materiais ferromagnéticos, por contraste, conser- vam características de magneto permanentes depois de exposição a um campo magnético e tendem a agregar depois disso devido a fortes intera- ções partícula-partícula.

Como as partículas magnéticas pequenas mencionadas acima, grandes partículas magnéticas (> 1,5 micra a cerca de 50 micra) também podem apresentar comportamento paramagnético. Típicos de tais materiais são os descritos por Ugelstad na Patente dos Estados Unidos N°. 4.654.267 e fabricados por Dynal, (Oslo, Noruega).

A Patente dos Estados Unidos N°. 4.795.698 para Owen e ou- tros refere-se a partículas paramagnéticas coloidais revestidas com políme- ro, as quais são produzidas pela formação de magnetita a partir de sais de Fe+2/Fe+3 na presença do polímero. A Patente dos Estados Unidos N°. 4.452.773 para Molday descreve um material similar em propriedades àque- les descritos em Owen e outros, o qual é produzido formando magnetita e outros óxidos de ferro a partir de Fe+2/Fe+3 através de adição de base na presença de concentrações muito elevadas de dextrano. As partículas resul- tantes de ambos os procedimentos apresentam uma tendência apreciável a não-sedimentar a partir de suspensões aquosas por períodos de observação tão longos quanto vários meses. Materiais produzidos deste modo têm pro- priedades coloidais e comprovaram-se muito úteis em separação celular. A tecnologia de Molday tem sido comercializada por Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha e Terry Thomas, Vancouver, Canadá.

Outro método para produzir partículas coloidais paramagnéticas é descrito na Patente dos Estados Unidos N°. 5.597.531. Em contraste com as partículas descritas nas patentes de Owen e outros, ou Molday, estas últimas partículas são produzidas revestindo diretamente um polímero bio- funcional sobre cristais superparamagnéticos pré-formados os quais foram dispersados por energia sônica de alta potência em aglomerados cristalinos quase-estáveis variando de 25 a 120 nm. As partículas resultantes, referidas aqui, como partículas revestidas diretas, apresentam um momento magnéti- co significativamente maior do que partículas coloidais do mesmo tamanho total, tais como as descritas por Molday ou Owen e outros. Existe uma tremenda necessidade de avançar os limites de de-

tecção, aumentar a resolução, obter informação em um nível molecular, de- tectar doenças em seus estágios iniciais, e obter informações fisiológicas através de investigação por MRI. Estes desafiam requerem um aprimora- mento na sensibilidade, seletividade e tempo de circulação sangüínea do agente de contraste e também na caracterização de biomarcadores e dire- cionamento de ligantes.

Em conseqüência do precedente, seria extremamente útil um método e/ou composição pelo/com o qual nanopartículas proporcionariam reforçada relaxividade, proporção de sinal-para-ruído e capacidades de dire- cionamento com resistência à aglomeração e uma capacidade para controlar o tamanho das partículas, a taxa de clearance sangüíneo e a distribuição. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona métodos e composições para aprimorado formação por imagens de diagnóstico clínico. Um novo agente de contraste é revelado para uso em MRI. O agente consiste em anticorpos monoclonais conjugados (mAb) direcionados contra a isoforma murino de um marcador de ativação de células endoteliais, tal como, mas não limitada a, a isoforma murino de anti-ICAM (marcador de ativação de células endote- liais CD54). Tipicamente, agentes de contraste para MRI direcionados pro- porcionam reforçada relaxividade, aprimorado sinal-para-ruído, capacidade de direcionamento, e resistência à aglomeração. Os métodos para produzir os agentes de contraste para MRI referidos proporcionam melhor controle sobre o tamanho das partículas, e métodos de uso de tais agentes de con- traste para MRI tipicamente proporcionam aumentadas taxas de limpeza sangüíneo e distribuição.

CD54-FF é usado como um agente de contraste para MRI no direcionamento de células endoteliais vasculares compreendendo uma partí- cula de óxido de ferro revestida com BSA conjugada a um antiCD54 monoti- olado. O complexo extinto é armazenado em DIH2O.

A presente invenção refere-se a métodos para usar agentes de contraste direcionados em uma técnica de formação por imagens tal como MRI. Tais usos referidos podem envolver liberação em células in vitro e/ou liberação a um sujeito mamífero in vivo. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

figura 1: Sumário para FF preparado para MRI. Partículas de óxido de ferro revestidas com BSA foram submetidas à série de etapas de separação e concentração de modo a obter partículas de menor tamanho na matriz e concentração corretas para a etapa de conjugação. Em seguida, FF foi rea- gido com SMCC e conjugado ao anticorpo monotiolado. O conjugado FF- MAb resultante foi extinto e lavado e armazenado em Dl H20. figura 2: Direcionamento de partículas anti-ICAM/FF para células endoteliais de camundongo (microscopia por fluorescência)

figura 3: Direcionamento de partículas anti-ICAM/FF a células endoteliais de camundongo (NMR minispec)

figura 4: Relaxação T2 depois de injeção a 5 mg/kg FF figura 5: Relaxação T2 depois de injeção a 15 mg/kg FF figura 6: Relaxação T2 em diferentes órgãos depois de 60 min a 5 mg/kg FF figura 7: Relaxação T2 em diferentes órgãos depois de 60 min a 15 mg/kg FF

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção utiliza uma partícula magnética revestida compreendendo um núcleo de nanopartícula de material magnético, e um revestimento de material de base sobre o núcleo magnético (Patente dos Estados Unidos N°. 6.365.362). Estas partículas magnéticas são caracteri- zadas por ligação não-específica extremamente baixa. O material do núcleo magnético das partículas descritas pode compreender no mínimo um óxido de metal de transição e um revestimento de material de base adequado compreende uma proteína. Proteínas adequadas para revestir partículas magnéticas incluem mas não estão limitadas a albumina sérica bovina e ca- seína. O material de revestimento adicional pode ser as proteínas do reves- timento original ou um membro de um par de ligação específico o qual é a- coplado ao material de base sobre o núcleo magnético. Pares de ligação específicos exemplares incluem biotina-estreptavidina, antígeno-anticorpo, receptor-hormônio, receptor-ligante, agonista-antagonista, Iectina- carboidrato, Proteína Α-anticorpo Fe, e avidina-biotina. O membro do par de ligação específico pode ser acoplado ao revestimento de material de base através de um composto de ligação bifuncional. Compostos de ligação bio- funcional exemplares incluem succinimidil-propiono-ditiopiridina (SPDP), e sulfossuccinimidil-4-[maleimidometil]ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), no entanto uma variedade de outros tais compostos encadeadores heterobifun- cionais estão disponíveis em Pierce, Rockford, III.

As partículas magnéticas revestidas da invenção preferencial- mente têm entre 70 a 90% de massa magnética. Uma maior porção das par- tículas magnéticas têm um tamanho de partícula na faixa de 90 a 150, prefe- rencialmente de 15 a 70 nm. As partículas podem ser sintetizadas de tal mo- do que sejam monodispersas, por exemplo, na faixa de 15 a 30 nm. As par- tículas da invenção são tipicamente suspensos em um meio biologicamente compatível.

Freqüentemente é desejável formar por imagens disfunção da

ativação e/ou morte do endotélio Iuminal vascular que ocorre em uma varie- dade de estados de doença - câncer, doença cardiovascular, cerebrovascu- lar, e autoimune para nomear somente algumas. Em conseqüência, a inte- gridade do endotélio pode ser comprometida resultando em sua destruição parcial ou completa em uma ou mais regiões de um leito vascular. A capaci- dade para visualizar in vivo a localização e o grau de tal dano pode propor- cionar informações de diagnóstico e de prognóstico potencialmente úteis. Tais informações podem adicionalmente auxiliar na liberação e no monito- ramento de terapias específicas alvo-endoteliais. Anticorpos monoclonais (mAb) funcionalizados através de conjugação a nanopartículas magnéticas são usados na presente invenção como um agente de contraste para MRI.

Disfunção da ativação e/ou morte do endotélio Iuminal vascular

ocorre em uma variedade de estados de doença - câncer, doença cardio- vascular, cerebrovascular, e autoimune para nomear somente algumas. Em conseqüência, a integridade do endotélio pode ser comprometida resultando em sua destruição parcial ou completa em uma ou mais regiões de um leito vascular. A capacidade de visualizar in vivo a localização e o grau de tal da- no pode proporcionar informações de diagnóstico e de prognóstico potenci- almente úteis. Tais informações podem adicionalmente auxiliar na liberação e no monitoramento de terapias específicas alvo-endoteliais. A presente in- venção incorpora o uso de anticorpos monoclonais (mAb) conjugados a na- nopartículas magnéticas para uso como um agente de contraste para MRI para direcionar um marcador de ativação superficial de células endoteliais.

O agente de contraste é desenvolvido conjugando mAb de rato (clone YN1) direcionado contra a isoforma murino de anti-ICAM (CD54 um marcador de ativação de células endoteliais) para nanopartículas de ferro- fluido magnético (FF) - resultando partícula ~ 75 nm de diâmetro (figura 1). Um controle de isotipo é produzido conjugando IgG de rato normal a FF para produzir IgG-FF (64 nm de diâmetro, Fe = 11,48 mg/mL). A reatividade an- tiCD54-FF in vitro é determinada incubando o agente com células endoteliais murinas (EC) tratadas durante a noite com TNFa para reforçar a expressão de ICAM-1 (figura 2). Depois de contracoloração com anticorpo secundário marcado com FITC1 as células são inspecionadas por microscopia por fluo- rescência (FM). As células são em seguida Iisadas e é traçado o direciona- mento medindo os tempos de relaxação T2 NMR minispec (figura 3).: Ca- mundongos não-reativos endógamos anestesiados (N = 3) são em seguida injetados IV com ou 5 mg/kg ou 15 mg/kg de antiCD54-FF ou IgG-FF e o sangue é coletado em 1 min, 30 min e 60 min pós-injeção (figuras 4 e 5). Os animais são sacrificados em 1 hora e os órgãos são colhidos e analisados por FM e NMR minispec. Por último, 5 mg/kg é injetado IV em 4 camundon- gos: 2 foram pré-tratados com TNFa, 2 sem. 4 outros camundongos (2 TN- Fa+, 2 TNFa-) receberam 5 mg/kg de IgG-FF e um controle não recebeu infusão IV. Depois de 1 hora os animais são sacrificados e armazenados a 4C. Todos os 9 cadáveres são em seguida estudados por imagens usando um instrumento 7T 21 cm Varian MRI para pequenos animais com uma bo- bina de RF para formação por imagens de gaiola em quadratura de 108/38 mm (O.D./I.D.). São realizadas imagens T2 e T2* do tórax e do abdômen. A duração do formação por imagens é de 1 hora/animal, com 30 min/animal para análise de dados. Alterações em T2 e T2* são calculadas para determi- nar direcionamento específico.

Traçado de fluorescência anti-CD54-FF (2a coloração de mAb) e tempos de relaxação T2 apresentam direcionamento específico para células endoteliais de camundongo cultivadas vs. controle de IgG/FF, ambos a 4C ou 37C com o maior sinal a 37C (figura 2). Camundongos injetados IV (n = 3) com anti-ICAM/FF vs. IgG/FF quer a 15 mg/kg ou a 5 mg/kg, apresenta- ram substancial direcionamento de CD54-FF do fígado e do baço com um tanto menos no rim e no pulmão. O coração e o cérebro também apresenta- ram concentrações mensuráveis do agente de contraste. Dos próximos nove camundongos estudados por imagens, o reforço do controle de IgG-FF está localizado no baço e no fígado somente em animais TNFa+/-, ao passo que animais injetados com CD54-FF apresentaram tempos de relaxação T2 re- duzidos nos órgãos dos animais TNFa+ vs. o grupo TNFa negativo (figuras 6 θ 7).

CD54-FF funciona como um agente de contraste para MRI dire-

cionando células endoteliais vasculares ativadas em múltiplos órgãos inclu- indo o cérebro conforme demonstrado pelos reduzidos tempos de relaxação em animais pré-tratados com citocina TNFa. Apesar dos dados sugerirem que o direcionamento mais específico é para o pulmão, o baço e o fígado apresentaram concentrações aumentadas tanto para IgG quanto para CD54- FF, mais provavelmente devido a captação mediada por Fc pelo sistema re- tículo endotelial. Além disso, dados de 5C vs. 37C dos estudos de linhagens celulares cultivadas também indica que estas nanopartículas podem ser en- docitosadas por células endoteliais.

Apesar das modalidades da presente invenção terem sido des- critas e especificamente exemplificadas acima, não se pretende que a in- venção seja limitada a tais modalidades. Podem ser feitas várias modifica- ções das mesmas sem se afastar do espírito da presente invenção, o pleno âmbito dos aprimoramentos são delineados nas seguintes reivindicações.

Claims (8)

1. Método para formação por imagens compreendendo: a. obter um sujeito para formação por imagens in vivo\ b. introduzir um agente de contraste no referido sujeito em que o referido agente de contraste substancialmente compreende um marcador de ativa- ção de células endoteliais acoplado a uma nanopartícula superparamagnéti- ca tendo um revestimento de base de polímero biofuncional; c. permitir que o referido agente de contraste interaja com o lúmen vas- cular; d. estudar por imagens a referida interação em que o referido formação por imagens é MRI; e e. analisar o referido formação por imagens para áreas alvo específicas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido marcador de células endoteliais é anti-ICAM.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido agente de contraste é anti-CD54-FF.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida nanopartícula paramagnética tem no mínimo um óxido de metal de transição em seu núcleo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido revestimento de base é de um grupo consistindo em proteína, albumina séri- ca bovina, caseína e combinações das mesmas.

6. Agente de contraste para MRI direcionado usado para forma- ção por imagens in vivo compreendendo: a. um núcleo de nanopartícula coloidal tendo no mínimo um óxido de metal de transição; b. a referida nanopartícula tendo um revestimento de base de polímero bio- funcional em que o referido polímero é de um grupo consistindo em proteína, albumina sérica bovina, caseína e combinações das mesmas; e c. um anticorpo monoclonal funcionalizado através da referida nanopartícula.

7. Agente de contraste como definido na reivindicação 2, em que o referido anticorpo monoclonal é anti-CD54.

8. Agente de contraste como definido na reivindicação 2, em que a referida nanopartícula tem menos de 75 nm de diâmetro.