ES2273383T3 - Deteccion de acidos nucleicos mediante extincion de fluorescencia. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN OLIGONUCLEOTIDO DETECTOR QUE PRESENTA UNA SECUENCIA QUE FORMA UNA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE FORMA INTRAMOLECULAR DE BASES EMPAREJADAS, PARA SU USO EN LA DETECCION DE SECUENCIAS DIANA DE ACIDO NUCLEICO Y EN LA AMPLIFICACION DE LA SECUENCIA DIANA. EL OLIGONUCLEOTIDO DETECTOR ESTA ADEMAS MODIFICADO MEDIANTE LA UNION DE DOS TINTES QUE FORMAN UN PAR DE TINTES DE DONADOR/ACEPTOR. LOS DOS TINTES ESTAN COLOCADOS SOBRE EL OLIGONUCLEOTIDO DETECTOR DE TAL FORMA QUE SE ENCUENTRAN EN UNA CERCANA PROXIMIDAD ESPACIAL EN LA ESTRUCTURA SECUNDARIA PLEGADA DE BASES EMPAREJADAS, PROVOCANDO CON ELLO LA EXTINCION DE LA FLUORESCENCIA DEL DONADOR. EL OLIGONUCLEOTIDO DETECTOR PUEDE INCLUIR ADEMAS OPCIONALMENTE UN SITIO DE RECONOCIMIENTO PARA UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION (RERS) QUE SE MANTIENE PARCIAL O COMPLETAMENTE MONOCATENARIO EN LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE BASES EMPAREJADAS. EL RERS ESTA FLANQUEADO POR LOS DOS TINTES. EN PRESENCIA DE LA DIANA, LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE BASES EMPAREJADAS ESTASIN PLEGAR O LINEALIZADA, AUMENTANDO LA DISTANCIA ENTRE LOS TINTES DONADORES Y ACEPTORES, Y PROVOCANDO UN CAMBIO EN LA FLUORESCENCIA DEL DONADOR Y/O ACEPTOR. SI SE ENCUENTRA PRESENTA UN RERS, SE CONVIERTE EN BICATENARIO EN PRESENCIA DE LA DIANA, PERMITIENDO LA ESCISION O CORTE POR UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION, Y LA SEPARACION DE LOS DOS TINTES EN FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO SEPARADOS. ESTO PUEDE CONTRIBUIR ADEMAS A LA MAGNITUD DEL CAMBIO EN LA FLUORESCENCIA.
Description
Detección de ácidos nucleicos mediante extinción
de fluorescencia.
La invención se refiere a métodos para detectar
secuencias diana de ácidos nucleicos, y en particular a métodos de
detección que emplean extinción de fluorescencia.
La hibridación específica de secuencia con
sondas de oligonucleótidos se ha utilizado durante mucho tiempo como
un medio para detectar e identificar secuencias de nucleótidos
seleccionadas, y el marcaje de tales sondas con marcadores
fluorescentes ha proporcionado un medio no radiactivo, relativamente
sensible, para facilitar la detección de la hibridación con sonda.
Los métodos de detección desarrollados recientemente emplean el
procedimiento de transferencia de energía de fluorescencia (TEF)
para la detección de la hibridación con sonda, en lugar de la
detección directa de la intensidad de la fluorescencia. La
transferencia de energía de fluorescencia se produce entre un
fluoróforo donador y un colorante aceptor (que puede ser o no un
fluoróforo) cuando el espectro de absorción de uno (el aceptor) se
solapa con el espectro de emisión del otro (el donador) y los dos
colorantes están en proximidad cercana. La energía en el estado
excitado del fluoróforo donador se transfiere mediante una
interacción de dipolo resonante - dipolo inducida con el aceptor
vecino. Esto da como resultado la extinción de la fluorescencia del
donador. En algunos casos, si el aceptor también es un fluoróforo,
la intensidad de su fluorescencia puede aumentar. La eficacia de la
transferencia de energía es altamente dependiente de la distancia
entre el donador y el aceptor, y Förster ha desarrollado ecuaciones
que predicen estas relaciones (1948. Ann. Phys. 2,
55-75). La distancia entre los colorantes aceptores
y donadores a la que la eficacia de la transferencia de energía es
del 50% se denomina la distancia de Förster (R_{O}). También se
conocen otros mecanismos de extinción de fluorescencia incluyendo,
por ejemplo, la transferencia de carga y la extinción por
colisión.
La transferencia de energía y otros mecanismos
que se basan en la interacción de dos colorantes en proximidad
cercana para producir extinción constituyen un medio atractivo para
detectar o identificar secuencias de nucleótidos, ya que tales
ensayos pueden realizarse en formatos homogéneos. Los formatos de
ensayo homogéneos son más simples que los ensayos de hibridación con
sonda convencionales que se basan en la detección de fluorescencia
de un único marcador de fluoróforo, ya que los ensayos heterogéneos
generalmente requieren etapas adicionales para separar el marcador
hibridado del marcador libre. Normalmente, TEF y los métodos
relacionados se han basado en la monitorización de un cambio en las
propiedades de fluorescencia de uno o ambos marcadores colorantes
cuando se llevan juntos mediante la hibridación de dos
oligonucleótidos complementarios. En este formato, el cambio en las
propiedades de fluorescencia puede medirse como un cambio en la
cantidad de transferencia de energía o como un cambio en la cantidad
de extinción de fluorescencia, indicada normalmente como un aumento
en la intensidad de la fluorescencia de uno de los colorantes. De
esta forma, la secuencia de nucleótidos de interés puede detectarse
sin separación de oligonucleótidos hibridados y no hibridados. La
hibridación puede producirse entre dos oligonucleótidos
complementarios separados, uno de los cuales está marcado con el
fluoróforo donador y uno de los cuales está marcado con el aceptor.
En la forma de doble cadena, hay una disminución en la fluorescencia
del donador (aumento de la extinción) y/o un aumento en la
transferencia de energía, en comparación con los oligonucleótidos de
cadena sencilla. En Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992.
Academic Press, Inc., págs. 311-352) se revisaron
varios formatos para los ensayos de hibridación de TEF.
Alternativamente, el donador y el aceptor pueden
unirse a un único oligonucleótido de manera que haya una diferencia
detectable en las propiedades de fluorescencia de uno o ambos cuando
el oligonucleótido no está hibridado frente a cuando está hibridado
a su secuencia complementaria. En este formato, la fluorescencia del
donador normalmente aumenta y la extinción/transferencia de energía
disminuyen cuando el oligonucleótido está hibridado. Por ejemplo, un
oligonucleótido autocomplementario marcado en cada extremo puede
formar una horquilla que trae los dos fluoróforos (es decir, los
extremos 5' y 3) en proximidad cercana en la que pueden producirse
la extinción y la transferencia de energía. La hibridación del
oligonucleótido autocomplementario con su complemento en un segundo
oligonucleótido rompe la horquilla y aumenta la distancia entre los
dos colorantes, reduciendo así la extinción. Una desventaja de la
estructura de horquilla es que es muy estable y la conversión a la
forma hibridada no extinguida a menudo es lenta y sólo moderadamente
favorecida, dando como resultado un rendimiento generalmente bajo.
Tyagi y Kramer (1996. Nature Biotech. 14,
303-308) describen una horquilla marcada tal como se
describió anteriormente con una secuencia de detección en el bucle
entre los brazos autocomplementarios de la horquilla que forma el
tallo. El tallo con bases apareadas debe fundirse con el fin de que
la secuencia de detección hibride con la diana y produzca una
reducción en la extinción. B. Bagwell, et al. (1994. Nucl.
Acids Res. 22, 2424-2425; patente de los EE.UU.
número 5.607.834) describen una sonda de "doble horquilla" y
los métodos para utilizarla. Estas estructuras contienen la
secuencia de unión a la diana dentro de la horquilla y, por tanto,
suponen la hibridación competitiva entre la diana y las secuencias
autocomplementarias de la horquilla. Bagwell resuelve el problema de
la cinética de hibridación desfavorable desestabilizando la
horquilla con apareamientos erróneos, favoreciendo así la
hibridación de la diana. A diferencia de estas publicaciones, los
oligonucleótidos de detección de la invención tienen la secuencia de
unión a la diana completa o parcialmente en una región de
"cola" de cadena sencilla, en lugar de estar completamente
contenida dentro de la estructura secundaria con bases apareadas
intramolecularmente. Por tanto, no es necesario que la estructura
secundaria (por ejemplo, una horquilla) se despliegue con el fin de
hibridar inicialmente con la diana. La hibridación de la cola de
cadena sencilla no es competitiva, por lo que la cinética de la
reacción favorece la hibridación con la diana. La hibridación del
oligonucleótido de detección a través de la cola de cadena sencilla
también aumenta la concentración local de la diana, conduciendo así
a cualquier desplegamiento posterior de la estructura secundaria.
Mediante el cambio en la cinética de la reacción para favorecer
mejor el desplegamiento en presencia de la diana, los métodos de la
invención permiten el uso de estructuras secundarias con bases
apareadas perfectamente que, en caso contrario, serían demasiado
estables para ser eficaces en la detección de la diana.
Un método para detectar la presencia de una
secuencia diana que utiliza un oligonucleótido de detección que
comprende una secuencia de unión a la diana de cadena sencilla y una
horquilla que tiene unido a la misma un fluoróforo donador y un
extintor también se describe en el documento WO 98/02449 A. Este
método supone desplegar la horquilla en una reacción de extensión
principal que emplea la horquilla como molde, produciendo así un
cambio en un parámetro de fluorescencia.
También se han descrito métodos homogéneos que
emplean transferencia de energía u otros mecanismos de extinción de
fluorescencia para la detección de la amplificación de ácidos
nucleicos. R. Higuchi, et al. (1992. Biotechnology 10,
413-417) describen métodos para detectar la
amplificación de ADN en tiempo real monitorizando el aumento de la
fluorescencia para bromuro de etidio a medida que se une al ADN de
doble cadena. La sensibilidad de este método está limitada debido a
que la unión del bromuro de etidio no es específica de diana y
también se detectan los productos de la amplificación inicial. L. G.
Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res. 21,
3761-3766) describen un método de detección en
tiempo real en el que una sonda de detección marcada doblemente se
escinde de una manera específica de la amplificación de la diana
durante la PCR. La sonda de detección se hibrida en el sentido de 3'
del cebador de amplificación, de manera que la activad
5'-3' exonucleasa de la Taq polimerasa digiere la
sonda de detección, separando los dos colorantes fluorescentes que
forman un par de transferencia de energía. La intensidad de la
fluorescencia aumenta a medida que la sonda se escinde. La solicitud
PCT publicada WO 96/21144 describe ensayos fluorométricos continuos
en los que la escisión mediada por enzimas de ácidos nucleicos da
como resultado un aumento de la fluorescencia. Se sugiere la
transferencia de energía de fluorescencia para su uso en los
métodos, pero sólo en el contexto de un método que emplea un único
marcador fluorescente que se extingue mediante la hibridación con la
diana. No hay descripción específica de cómo se utilizaría una
endonucleasa de restricción en un sistema de transferencia de
energía de fluorescencia.
La transferencia de energía y otros métodos de
detección de extinción de fluorescencia también se han aplicado para
detectar una secuencia diana mediante la hibridación con una sonda
específica. La patente japonesa número 93015439 B describe métodos
para medir polinucleótidos mediante la hibridación de la diana de
cadena sencilla a una sonda de polinucleótido de cadena sencilla
marcada con dos marcadores que forman un par de transferencia de
energía. El híbrido de doble cadena se escinde mediante una enzima
de restricción entre los marcadores y se mide la fluorescencia de
uno de los marcadores. Un defecto de este método es que el sitio de
restricción en la sonda también debe estar presente en la secuencia
diana que se está detectando. La patente no describe la adaptación
de la sonda para su uso en ensayos en los que la secuencia diana no
contiene un sitio de restricción apropiado o en el que no se desea
la escisión de la diana. S. S. Ghosh, et al. (1994. Nucl.
Acids Res. 22, 3155-3159) describen reacciones
de escisión catalizadas por enzimas de restricción de
oligonucleótidos marcados con fluoróforos que se analizan utilizando
transferencia de energía de resonancia fluorescente. En estos
ensayos, los oligonucleótidos complementarios se hibridan para
producir el sitio de restricción de doble cadena, y uno de los
marcadores fluorescentes se une a cada una de las dos cadenas (es
decir, no se unen a la misma cadena, véase la figura 1 de Ghosh,
et al.). S. P. Lee, et al. (1994. Anal.
Biochem. 220, 377-383) describen técnicas de
"desextinción" de fluorescencia utilizando endonucleasas de
restricción para escindir ADN de doble cadena. Sin embargo, estos
métodos se refieren a ensayos que emplean sólo un marcador
fluorescente que se escinde mediante la interacción con el ADN, no
mediante la transferencia de energía fluorescente a partir de un
segundo marcador fluorescente. La hibridación del endonucleótido
marcado con su complemento y la escisión del sitio de restricción de
doble cadena mitigaron la extinción sin transferencia del marcador y
la fluorescencia extinguida se recuperó totalmente.
Se han descrito cebadores señal (también
denominados sondas de detección) que hibridan con las secuencias
diana en el sentido de 3' del sitio de hibridación de los cebadores
de amplificación para su uso en la detección de la amplificación del
ácido nucleico (patente de los EE.UU. número 5.547.861). El cebador
señal se extiende por la polimerasa de una manera similar a la
extensión de los cebadores de amplificación. La extensión del
cebador de amplificación desplaza el producto de extensión del
cebador señal de una manera dependiente de la amplificación de la
diana, produciendo un producto de amplificación secundario de doble
cadena que puede detectarse como una indicación de la amplificación
de la diana. Los productos de amplificación secundaria generados a
partir de los cebadores señal pueden detectarse mediante una
variedad de marcadores y grupos indicadores, sitios de restricción
en el cebador señal que se escinden para producir fragmentos de un
tamaño característico, grupos de captura y características
estructurales tales como triples hélices y sitios de reconocimiento
para las proteínas de unión al ADN de doble cadena. Ejemplos de
métodos de detección para su uso con cebadores señal se describen en
la patente de los EE.UU. número 5.550.025 (incorporación de
colorantes lipófilos y sitios de restricción) y la patente de los
EE.UU. número 5.593.867 (detección de polarización de
fluorescencia).
La presente invención emplea un oligonucleótido
de detección para detectar secuencias diana de ácidos nucleicos
mediante mecanismos de extinción de fluorescencia. El, por lo demás,
oligonucleótido de detección de cadena sencilla se selecciona de
manera que forme una estructura secundaria con bases apareadas
intramolecularmente en las condiciones de reacción seleccionadas
para la extensión de cebadores o para la hibridación con la diana.
El oligonucleótido de detección se modifica adicionalmente mediante
la unión de dos colorantes que forman un par de colorantes
donador/aceptor. Los dos colorantes se colocan sobre el
oligonucleótido de detección de manera que estén en proximidad
espacial cercana en la estructura secundaria plegada con bases
apareadas y que se extinga la fluorescencia del colorante donador.
El oligonucleótido de detección comprende además un sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción (RERS) entre los dos
colorantes que sigue siendo parcial o completamente con doble cadena
en la estructura secundaria con bases apareadas. Dado que el
oligonucleótido de detección inicialmente es de cadena sencilla,
excepto por la parte con bases apareadas de la estructura secundaria
y sigue siendo de cadena sencilla con la estructura secundaria
plegada en ausencia de diana, la fluorescencia del donador se
extingue. Sin embargo, en presencia de la diana, el oligonucleótido
de detección se despliega o linealiza, aumentando la distancia entre
los colorantes donador y aceptor y produciendo un cambio en la
fluorescencia. El RERS está presente en la parte del oligonucleótido
de detección entre los dos colorantes. Tal RERS no se puede escindir
o formar mellas en ausencia de diana. Sin embargo, el RERS se vuelve
de doble cadena en presencia de diana, lo que permite la escisión o
la formación de mellas mediante la endonucleasa de restricción y la
separación de los dos colorantes en fragmentos de ácido nucleico
separados. La escisión o formación de mellas contribuye además al
cambio en la fluorescencia, lo que indica la amplificación de la
diana o la presencia de la secuencia diana.
En realizaciones ejemplo alternativas, la
invención emplea el oligonucleótido de detección como un cebador
señal en reacciones de amplificación de diana para detectar la
amplificación de la secuencia diana, en métodos de extensión de
cebadores basados en ausencia de amplificación para la detección de
secuencias diana y en reacciones de hibridación para la detección de
secuencias diana.
La figura 1 ilustra el esquema de reacción en el
que el oligonucleótido de detección se emplea como un cebador señal
según la invención.
La figura 2 muestra el cambio en la intensidad
de fluorescencia que se produce en tiempo real a medida que una
diana se amplifica utilizando los oligonucleótidos de detección de
la invención como cebadores señales.
La presente invención emplea oligonucleótidos de
detección para producir extinción de fluorescencia reducida de una
manera dependiente de la diana. Los oligonucleótidos de detección
contienen un par de colorantes donador/aceptor unidos de manera que
se produzca la extinción de fluorescencia en ausencia de diana. El
desplegamiento o linealización de una estructura secundaria con
bases apareadas intramolecularmente en el oligonucleótido de
detección en presencia de la diana aumenta la distancia entre los
colorantes y reduce la extinción de la fluorescencia. El
desplegamiento de la estructura secundaria con bases apareadas
supone normalmente el apareamiento de bases intermolecular entre la
secuencia de la estructura secundaria y una cadena complementaria de
manera que la estructura secundaria se rompa al menos parcialmente.
Puede linealizarse completamente en presencia de una cadena
complementaria de longitud suficiente. En los oligonucleótidos de
detección está presente un RERS entre los dos colorantes de manera
que el apareamiento de bases intermolecular entre la estructura
secundaria y una cadena complementaria también da la el RERS de
doble cadena y puede haber escisión o formación de mellas mediante
una endonucleasa de restricción. La escisión o formación de mellas
mediante la endonucleasa de restricción separa los colorantes
donador y aceptor en fragmentos separados de ácido nucleico,
contribuyendo además a disminuir la extinción. En los métodos de la
invención, se monitoriza un cambio asociado en un parámetro de
fluorescencia (por ejemplo, un aumento en la intensidad de
fluorescencia del donador, una disminución en la intensidad de
fluorescencia del aceptor o una razón de fluorescencia antes y
después del desplegamiento) como una indicación de la presencia de
la secuencia diana. Se prefiere la monitorización de un cambio en la
intensidad de la fluorescencia del donador, ya que este cambio
normalmente es mayor que el cambio en la intensidad de fluorescencia
del aceptor. También pueden monitorizarse otros parámetros de
fluorescencia, tales como un cambio en la duración de la
fluorescencia.
Ciertos términos utilizados en el presente
documento se definen tal como sigue:
Un cebador de amplificación es un cebador para
la amplificación de una secuencia diana mediante una extensión de
cebador. Para la SDA (amplificación por desplazamiento de cadenas),
el extremo 3' del cebador de amplificación (la secuencia de unión a
la diana) hibrida en el extremo 3' de la secuencia diana. El cebador
de amplificación comprende un sitio de reconocimiento para una
endonucleasa de restricción cerca de su extremo 5'. El sitio de
reconocimiento es para una endonucleasa de restricción que escindirá
una cadena de un ADN bicatenario cuando se semimodifica el sitio de
reconocimiento (formación de mellas), tal como se describe en la
patente de los EE.UU. número 5.455.166; patente de los EE.UU. número
5.270.184 y; documento EP 0 684 315. Un sitio de reconocimiento
semimodificado es un sitio de reconocimiento de doble cadena para
una endonucleasa de restricción en la que una cadena contiene al
menos un nucleótido derivatizado que hace que la endonucleasa de
restricción forme mellas en la cadena del cebador en lugar de
escindir ambas cadenas del sitio de reconocimiento. Normalmente, la
cadena del cebador del sitio de reconocimiento semimodificado no
contiene nucleótidos derivatizados y se han formado mellas mediante
la endonucleasa de restricción. Alternativamente, el cebador puede
contener nucleótidos derivatizados que hacen que la cadena de la
diana no modificada se proteja de la escisión, mientras que en la
cadena del cebador modificada se forman mellas. Tales endonucleasas
de restricción pueden identificarse en sistemas de detección
habituales en los que un dNTP derivatizado se incorpora en un sitio
de reconocimiento de la endonucleasa de restricción para la enzima.
Los sitios de reconocimiento semimodificados preferidos son sitios
de reconocimiento sometidos a tratamiento con hemifosforotioato para
las endonucleasas de restricción HincII, BsoNI y BsrI. El cebador de
amplificación también comprende un grupo 3'-OH que
se puede extender mediante la ADN polimerasa cuando la secuencia de
unión a la diana del cebador de amplificación se hibrida con la
secuencia diana. Para la mayor parte de la reacción de SDA, el
cebador de amplificación es responsable de la amplificación
exponencial de la secuencia diana.
Dado que no se requieren secuencias ni
estructuras especiales para dirigir la reacción de amplificación,
los cebadores de amplificación para la PCR pueden consistir sólo en
secuencias de unión a la diana. Los cebadores de amplificación por
3SR (Self-sustained Sequence Replication,
replicación de secuencia autosostenida) y NASBA (Nucleic Acid
Sequence-Based Amplification, amplificación basada
en la secuencia de aminoácidos) por el contrario, comprenden un
promotor de la ARN polimerasa cerca del extremo 5'. El promotor se
añade a la secuencia diana y sirve para dirigir la reacción de
amplificación mediante la dirección de la transcripción de múltiples
copias de ARN de la diana.
Los productos de extensión son ácidos nucleicos
que comprenden un cebador o una parte de un cebador y una cadena
recientemente sintetizada que es el complemento de la secuencia
diana en el sentido de 3' del sitio de unión al cebador. Los
productos de la extensión resultan de la hibridación de un cebador
con una secuencia diana y la extensión del cebador mediante la
polimerasa utilizando la secuencia diana como molde.
Los términos diana o secuencia diana se refieren
a las secuencias de ácido nucleico que van a amplificarse o
detectarse. Estas incluyen la secuencia de ácido nucleico original
que va a amplificarse, su segunda cadena complementaria y, cualquier
cadena de una copia de la secuencia original que se produce mediante
replicación o amplificación. La secuencia diana también puede
denominarse como molde para la extensión de los cebadores
hibridados.
Un oligonucleótido de detección es un
oligonucleótido que comprende una "cola" en 5' o 3' de cadena
sencilla que hibrida con la secuencia diana (secuencia de unión a la
diana) y una estructura secundaria con bases apareadas
intramolecularmente adyacente a la secuencia de unión a la diana.
Los oligonucleótidos de detección de la invención comprenden además
un par de colorantes donador/aceptor unido al oligonucleótido de
detección, de manera que la fluorescencia del donador se extingue
cuando la estructura secundaria tiene bases apareadas
intramolecularmente y el despliegue o linealización de la estructura
secundaria da como resultado una disminución en la extinción de la
fluorescencia.
La escisión de un oligonucleótido se refiere a
la rotura de los enlaces fosfodiéster de ambas cadenas de un ADN
bicatenario o a la rotura del enlace fosfodiéster del ADN de cadena
sencilla. Esto está en contraposición a la formación de mellas, que
se refiere a la rotura del enlace fosfodiéster de sólo una de las
dos cadenas en un ADN bicatenario.
Los oligonucleótidos de detección de la
invención comprenden una secuencia que forma una estructura
secundaria con bases apareadas intramolecularmente en las
condiciones de reacción seleccionadas para la extensión o
hibridación del cebador. La estructura secundaria se coloca
adyacente a la secuencia de unión a la diana del oligonucleótido de
detección, de modo que al menos una parte de la secuencia de unión a
la diana forma una cola en 3' o 5' de cadena sencilla. Tal como se
usa en el presente documento, el término "adyacente a la secuencia
de unión a la diana" significa que toda o parte de la secuencia
de unión a la diana se queda como cadena sencilla en una cola en 5'
o 3' que está disponible para la hibridación a la diana. Es decir,
la estructura secundaria no comprende la totalidad de la secuencia
de unión a la diana. Una parte de la secuencia de unión a la diana
puede participar en el apareamiento de bases intramolecular de la
estructura secundaria adyacente o la totalidad de la secuencia de
unión a la diana puede formar una cola en 5' o 3' de cadena sencilla
en el oligonucleótido de detección. Si una parte de la secuencia de
unión a la diana del oligonucleótido de detección participa en el
apareamiento de bases intramolecular en la estructura secundaria,
puede incluir toda o parte de una primera secuencia que participa en
el apareamiento de bases intramolecular en la estructura secundaria,
pero preferiblemente no se extiende su secuencia complementaria. Por
ejemplo, si la estructura secundaria es una estructura de tallo -
bucle (es decir, una "horquilla") y la secuencia de unión a la
diana del oligonucleótido de detección está presente como una cola
en 3' de cadena sencilla, la secuencia de unión a la diana también
puede extenderse en 5' a través de todo o parte del primer brazo del
tallo y, opcionalmente a través de todo o parte del bucle. Sin
embargo, la secuencia de unión a la diana no se extiende
preferiblemente hacia el segundo brazo de la secuencia que participa
en el apareamiento de bases intramolecular del tallo. Es decir, es
deseable evitar que ambas secuencias participen en el apareamiento
de bases intramolecular en una estructura secundaria que puede
hibridar con la diana. Los apareamientos erróneos en la parte con
bases apareadas intramolecularmente de la estructura secundaria del
oligonucleótido de detección pueden reducir la magnitud del cambio
en la fluorescencia en presencia de una diana, pero son aceptables
si la sensibilidad del ensayo no es una preocupación. Los
apareamientos erróneos en la secuencia de unión a la diana de la
cola de cadena sencilla también son aceptables pero pueden reducir
de manera similar la sensibilidad y/o la especificidad del ensayo.
Sin embargo, es una característica de la presente invención que el
apareamiento de bases perfecto tanto en la estructura secundaria
como en la secuencia de unión a la diana no pone en peligro la
reacción. Los apareamientos correctos en las secuencias que
participan en la hibridación mejoran la especificidad del ensayo sin
efectos negativos en la cinética de la reacción.
El oligonucleótido de detección comprende además
un fluoróforo donador y un colorante aceptor unidos en posiciones en
el oligonucleótido de detección de manera que el apareamiento de
bases intramolecular de la estructura secundaria lleva a los
colorantes en proximidad espacial cercana y da como resultado la
extinción de la fluorescencia. Preferiblemente, ninguno de los
colorantes está en el extremo terminal 3' del oligonucleótido de
detección cuando se utiliza como cebador, ya que un marcador
terminal en 3' puede interferir con la hibridación y/o la extensión
del oligonucleótido. Sin embargo, un fluoróforo donador o colorante
aceptor seleccionados pueden unirse en cualquier posición que no
inhiba la hibridación y/o la extensión, lo que da como resultado la
extinción en la estructura secundaria plegada y que proporciona un
cambio en un parámetro de fluorescencia con el desplegamiento o
linealización. Los colorantes donador y aceptor también se unen de
manera que el desplegamiento de la estructura secundaria aumente la
distancia entre ellos y reduzca la extinción de fluorescencia, dando
como resultado un cambio detectable en un parámetro de
fluorescencia.
El donador y un colorante aceptor se unen al
oligonucleótido de detección de manera que la fluorescencia del
donador se extingue total o parcialmente cuando el oligonucleótido
de detección forma la estructura secundaria con bases apareadas
intramolecularmente. Los dos colorantes deben estar en proximidad
suficientemente cercada cuando la estructura secundaria se pliega,
de manera que se producirá la extinción. Sin embargo, la distancia
entre ellos en la secuencia de nucleótidos lineal del
oligonucleótido de detección debe proporcionar un cambio en la
proximidad suficiente para producir un cambio detectable en un
parámetro de fluorescencia del donador o del aceptor cuando la
estructura secundaria se despliega o linealiza. Ambos colorantes
pueden unirse a secuencias que participan en la formación de la
estructura secundaria en posiciones de manera que el desplegamiento
aumenta la distancia entre ellos. Alternativamente, un colorante
puede unirse en la secuencia de estructura secundaria y el otro
puede unirse a la secuencia de unión a la diana de cadena sencilla,
de manera que el desplegamiento de la estructura secundaria aumenta
la distancia entre ellos. Preferiblemente, ambos colorantes se unen
al oligonucleótido de detección de modo que se incorporan ambos en
la estructura secundaria y están en brazos opuestos de una secuencia
con bases apareadas intramolecularmente (es decir, un colorante en o
cerca de cada una de las dos secuencias complementarias que
participan en el apareamiento de bases intramolecular).
La proximidad de los colorantes también debe
permitir el acceso a la endonucleasa de restricción al RERS en la
estructura linealizada o desplegada para la unión y la
escisión/formación de mellas cuando la diana está presente. En
general, al menos son necesarios aproximadamente ocho nucleótidos
entre los dos colorantes para proporcionar escisión o formación de
mellas suficientemente eficaz por la endonucleasa de restricción.
Preferiblemente, hay al menos aproximadamente 11 nucleótidos entre
los colorantes. En general, la longitud global de la secuencia que
participa en el apareamiento de bases intramolecular en la
estructura secundaria no es crítica. La longitud apropiada se
determina mediante el número de nucleótidos necesario para el
plegamiento y el apareamiento de bases estable en la estructura
secundaria seleccionada. Por conveniencia, normalmente está entre
aproximadamente 8 y 75 nucleótidos en longitud. Las secuencias más
largas que forman la estructura secundaria permiten que los
colorantes donador y aceptor se unan de manera que se separarán en
distancias mayores en la forma linealizada que los colorantes unidos
a secuencias más cortas de formación de la estructura secundaria.
Por ejemplo, cuanto más largo es el tallo y/o el bucle de una
horquilla, más separados estarán unidos los colorantes en ella
cuando se linealice. Las secuencias que forman horquillas son
simples de sintetizar y, por tanto, preferidas para su uso en la
invención. Normalmente, al menos son necesarios aproximadamente
siete nucleótidos para formar una horquilla estable. El tamaño
máximo está limitado sólo por motivos prácticos, tales como la
facilidad y la eficacia de la síntesis y la recuperación de los
oligonucleótidos. Se prefieren las horquillas que comprenden
aproximadamente 10-30 nucleótidos para su uso en la
invención, porque proporcionan buena sensibilidad al ensayo pero son
lo suficientemente pequeñas como para sintetizarse fácilmente. Las
estructuras secundarias en horquilla se utilizan en el presente
documento como ejemplos ilustrativos. Sin embargo, cualquier
secuencia que se pliegue espontáneamente en una estructura
secundaria ordenada con bases apareadas intramolecularmente en las
condiciones de hibridación o extensión del cebador de la reacción,
es adecuada para su uso en los oligonucleótidos de detección de la
invención. Estas incluyen además, pero sin limitarse a, secuencias
que forman triples hélices o pseudonudos (pseudoknots).
La secuencia de la estructura secundaria en el
oligonucleótido de detección se selecciona preferiblemente de manera
que la estructura secundaria con bases apareadas intramolecularmente
sea menos estable que la molécula bicatenaria con bases apareadas
intramolecularmente que se forma en presencia de la diana. La
temperatura media de transición (T_{m}) es una media útil para
calcular estas estabilidades relativas, aunque también pueden
considerarse otros factores. En general, la T_{m} de la estructura
secundaria cuando las bases se aparean intramolecularmente es
preferiblemente igual a o menor que la T_{m} de la molécula
bicatenaria con bases apareadas intramolecularmente que se forma en
presencia de la diana. Más preferiblemente, la T_{m} de la
estructura secundaria es aproximadamente 5-45ºC
menos que la T_{m} de la molécula bicatenaria con bases apareadas
intramolecularmente, más preferiblemente aproximadamente
10-25ºC menos. Esto favorece el mantenimiento de la
molécula bicatenaria con bases apareadas intramolecularmente con
respecto a la autocomplementación y optimiza el cambio total en la
fluorescencia mediante la reducción de la "recuperación" del
oligonucleótido de detección en la estructura secundaria con bases
apareadas intramolecularmente, proporcionando una mayor sensibilidad
del ensayo cuando se requiera. La secuencia de la estructura
secundaria también se selecciona de manera que sea relativamente
estable a la temperatura de la reacción que sirve para desplegarla o
linealizarla. Sin embargo, no debe ser tan estable que la
hibridación con la diana sea inaceptablemente lenta o tan estable
que la polimerasa no pueda desestabilizar la estructura secundaria
para la síntesis de la cadena complementaria. Preferiblemente, la
T_{m} de la estructura secundaria es igual o mayor que la
temperatura a la que se producirá la reacción de desplegamiento o
linealización, pero puede ser inferior. Si la T_{m} de la
estructura secundaria es menor que la temperatura de reacción, más
de la mitad de las moléculas del oligonucleótido de detección se
desplegarán independientemente de la presencia de la diana. Esto
reduce la sensibilidad del ensayo, pero puede ser aceptable cuando
están presentes cantidades relativamente altas de la diana.
Normalmente, la T_{m} de la estructura secundaria se selecciona
para que sea igual o hasta aproximadamente 30ºC superior que la
temperatura de la reacción de desplegamiento o linealización. Más
preferiblemente, la T_{m} de la estructura secundaria es
aproximadamente 10-20ºC superior que la temperatura
de la reacción de desplegamiento o linealización. Para favorecer la
hibridación con la diana, la secuencia de la región de la cola de
unión a la diana de cadena sencilla también se selecciona
preferiblemente de manera que la T_{m} de la secuencia de unión a
la diana/molécula bicatenaria de la diana sea igual a o superior a
la temperatura de reacción. Aunque la secuencia de la región de
unión a la diana viene dictada por la secuencia de la diana, pueden
realizarse ajustes en la T_{m} de la secuencia de unión a la diana
del oligonucleótido de detección, por ejemplo, ajustando su
longitud.
Los colorantes donador y aceptor flanquean un
sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción (RERS) en la
estructura secundaria, tal como se muestra en el oligonucleótido de
detección representado en la figura 1 (cuadro resaltado). Es decir,
un RERS está presente en la secuencia de formación de la estructura
secundaria del oligonucleótido de detección en una posición entre el
colorante donante y el aceptor. La inclusión de un RERS proporciona
la ventaja de la conversión permanente del oligonucleótido de
detección en una forma estructural que muestra fluorescencia
modificada, es decir, la escisión o la formación de mellas evita la
asociación de nuevo del oligonucleótido de detección en la
estructura extinguida. El plegamiento de la estructura secundaria
lleva a los colorantes hacia una proximidad espacial cercana,
mientras que el RERS sigue siendo parcial o completamente de cadena
sencilla en una parte con bases desapareadas de la estructura
secundaria entre los dos colorantes. En el oligonucleótido de
detección, la secuencia del RERS corresponde a una cadena del RERS
de doble cadena. El colorante donador o el aceptor se unen en la
posición 3' del oligonucleótido de detección con respecto al RERS.
El fluoróforo donador (si el aceptor está en la posición 3' con
respecto al RERS) o el aceptor (si el donador está en la posición 3'
con respecto al RERS) está unido al oligonucleótido de detección en
la posición 5' con respecto al RERS. Es decir, los colorantes
donador y aceptor flanquean el RERS. Los colorantes están
preferiblemente unidos en cada lado del RERS en posiciones
suficientemente alejadas para permitir el acceso a la endonucleasa
de restricción al RERS para la escisión o formación de mellas. Al
menos aproximadamente ocho nucleótidos entre los colorantes
normalmente son necesarios para la escisión o la formación de mellas
suficientes del RERS mediante la endonucleasa de restricción.
En una primera realización, los oligonucleótidos
de detección de la invención pueden utilizarse como cebadores señal
en una reacción de amplificación para generar productos de
amplificación secundarios de doble cadena con un cambio adjunto en
un parámetro de fluorescencia. Cuando se usa como un cebador señal
en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, la cola de
cadena sencilla del oligonucleótido de detección está en el extremo
3' para permitir la extensión del cebador. Por tanto, la estructura
secundaria está en posición 5' con respecto a la secuencia de unión
a la diana cuando se utiliza el oligonucleótido de detección como un
cebador señal. El término "en posición 5' con respecto a la
secuencia de unión a la diana" indica que toda o parte de la
secuencia de unión a la diana está presente como una cola en 3' de
cadena sencilla. Es decir, la estructura secundaria puede comprender
una parte de la secuencia de unión a la diana o la totalidad de la
secuencia de unión a la diana puede estar presente en la cola en 3'
de cadena sencilla. La reacción del cebador señal del
oligonucleótido de detección se ilustra en la figura 1 y puede
resumirse tal como sigue. Un cebador señal del oligonucleótido de
detección hibrida con una cadena de la secuencia diana en el sentido
de 3' de un cebador de amplificación. Tanto el cebador de
amplificación como el oligonucleótido de detección se extienden
mediante una ADN polimerasa utilizando la secuencia diana como
molde. El producto de extensión del oligonucleótido de detección se
desplaza desde el molde mediante la extensión del cebador de
amplificación en el sentido de 5' y a su vez, sirve como molde para
la hibridación y la extensión de un segundo cebador de
amplificación, dando el producto de extensión del oligonucleótido de
detección de doble cadena. Un segundo oligonucleótido de detección
que hibrida con la segunda cadena complementaria de una secuencia
diana de doble cadena puede incluirse opcionalmente en la reacción
(no mostrada en la figura 1). El segundo oligonucleótido de
detección hibrida con la segunda cadena de la secuencia diana en el
sentido de 3' del segundo cebador de amplificación y se extiende y
se desplaza por la extensión del segundo cebador de amplificación.
El segundo producto de extensión del oligonucleótido de detección da
una doble cadena mediante la hibridación y la extensión del primer
cebador de amplificación. Si se desea, pueden emplearse múltiples
oligonucleótidos de detección por cadena de la diana, hibridando
cada uno con la secuencia diana en el sentido de 3' del otro en la
misma cadena, e hibridando todos los oligonucleótidos de detección
en el sentido de 3' del cebador de amplificación. De esta manera,
cada oligonucleótido de detección se desplaza mediante la extensión
del oligonucleótido de detección en el sentido de 5' y la mayor
parte del oligonucleótido de detección en la posición 5' se desplaza
por el cebador de amplificación. El uso de múltiples
oligonucleótidos de detección tiene la ventaja de aumentar o
amplificar la señal generada por la diana con un aumento en la
sensibilidad del ensayo.
Cuando se usa como un cebador señal en las
reacciones de SDA, el RERS del oligonucleótido de detección puede
ser una secuencia que se reconoce por la misma enzima de restricción
tal como proporciona la función de formación de mellas central a
SDA. Es decir, pueden emplearse dos secuencias de reconocimiento
diferentes para la misma endonucleasa de restricción (una en el
cebador señal del oligonucleótido de detección y una en el cebador
de amplificación). En esta realización, la secuencia del RERS del
oligonucleótido de detección puede seleccionarse de manera que no se
evite la escisión de doble cadena cuando se incorporen los
nucleótidos modificados de SDA. Por el contrario, la secuencia del
RERS del cebador de amplificación se selecciona de manera que se
induzca la formación de mellas por la endonucleasa de restricción
mediante la incorporación de nucleótidos modificados. Por ejemplo,
los sitios de reconocimiento CTCGAG y CCCGAG para BsoBI siguen
pudiendo escindirse cuando se semimodifican, mientras que en el
sitio de reconocimiento CTCGGG para la misma enzima se forman mellas
cuando se semimodifica. Alternativamente, puede estar presente un
sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción
diferente de la que proporciona la función de formación de mellas en
la reacción de SDA en el cebador señal del oligonucleótido de
detección. De nuevo, sin embargo, el RERS en el cebador señal del
oligonucleótido de detección se selecciona preferiblemente de manera
que no se ponga en peligro la escisión de doble cadena mediante la
incorporación de nucleótidos modificados. Todavía en otra
realización alternativa, el RERS en el oligonucleótido de detección
se selecciona de manera que se formen mellas una vez por la
endonucleasa de restricción, regenerando un RERS en el que no se
pueden volver a formar mellas con la reparación por la polimerasa y
la incorporación del nucleótido modificado. Tales sitios "con
formación de mella única" pueden reconocerse, o bien por la misma
endonucleasa de restricción que proporcionan la función de formación
de mellas en la reacción de SDA o por una endonucleasa de
restricción diferente. Los sitios en los que pueden formarse mellas
únicas generalmente son regulares y contienen un nucleótido en el
sitio de formación de mellas que es el mismo que el desoxinucleósido
trifosfato modificado en la reacción de SDA. Por ejemplo, en el
sitio de reconocimiento CCCGGG para BsoBI se forman mellas entre el
primer y el segundo C. Cuando se incorpora en un cebador señal del
oligonucleótido de detección en una reacción de SDA que emplea
dCTP\alphaS, la reparación de la mella y el desplazamiento de la
cadena en el sentido de 3' de la mella incorpora el nucleótido C
modificado en el sitio de formación de la mella. La modificación del
sitio de formación de mella inhibe la nueva formación de mella, pero
la mella inicial separa los colorantes donador y aceptor permitiendo
el desplazamiento de la cadena del fragmento en el sentido de 3' que
lleva uno de los colorantes. Los sitios en los que se puede formar
una mella única son deseables en la invención porque evitan la
amplificación del cebador señal del oligonucleótido de detección
independientemente de la amplificación de la secuencia diana.
Cuando se añade a la reacción de amplificación,
los cebadores señal del oligonucleótido de detección de la invención
se convierten en la forma de doble cadena mediante la hibridación y
la extensión de un cebador de amplificación, tal como se describió
anteriormente. El desplazamiento de la cadena por la polimerasa
también despliega o linealiza la estructura secundaria y la
convierte en la forma de doble cadena mediante la síntesis de una
cadena complementaria. El RERS también se convierte en doble cadena
y se puede escindir o se pueden formar mellas mediante la
endonucleasa de restricción. Dado que la estructura secundaria se
despliega o linealiza mediante la actividad de desplazamiento de la
polimerasa, la distancia entre el colorante donador y el aceptor
aumenta, reduciendo así la extinción de la fluorescencia del
donador. El cambio asociado en la fluorescencia del colorante
donador o el aceptor puede monitorizarse o detectarse como una
indicación de la amplificación de la secuencia diana. La escisión o
la formación de mellas del RERS generalmente aumenta adicionalmente
la magnitud del cambio en la fluorescencia produciendo dos
fragmentos separados del producto de amplificación secundario de
doble cadena, teniendo cada uno, uno de los dos colorantes unidos a
él. Estos fragmentos son libres para difundir en la disolución de
reacción, aumentando adicionalmente la distancia entre los
colorantes del par donador/aceptor. Un aumento en la intensidad de
fluorescencia del donador o una disminución en la intensidad de
fluorescencia del aceptor puede detectarse y/o monitorizarse como
una indicación de que se está produciendo o se ha producido la
amplificación de la diana, pero también pueden monitorizarse otros
parámetros de fluorescencia que resultan afectados por la proximidad
del par de colorantes donador/aceptor. Un cambio en la intensidad de
fluorescencia del donador o del aceptor también puede detectarse
como un cambio en una razón de las intensidades de fluorescencia del
donador y/o del aceptor. Por ejemplo, un cambio en la intensidad de
fluorescencia puede detectarse como a) un aumento en la razón de la
fluorescencia del fluoróforo donador tras linealizarse o desplegarse
la estructura secundaria y en la fluorescencia del fluoróforo en el
oligonucleótido de detección antes de linealizarse o desplegarse, o
b) como una disminución en la razón de la fluorescencia del
colorante aceptor tras linealizarse o desplegarse y en la
fluorescencia del colorante aceptor en el oligonucleótido de
detección antes de linealizarse o desplegarse.
Será evidente que, además de la SDA, los
oligonucleótidos de detección de la invención pueden adaptarse para
su uso como cebadores señal en otros métodos de amplificación de
extensión del cebador (por ejemplo, PCR, 3SR, TMA o NASBA). Por
ejemplo, los métodos pueden adaptarse para su uso en PCR, mediante
el uso de cebadores de amplificación de PCR y una ADN polimerasa de
desplazamiento de cadena que carece de la actividad exonucleasa 5'
\rightarrow 3' (por ejemplo, Taq de calidad de secuenciación de
Promega o exo^{-} Vent o exo^{-} Deep Vent de New England
BioLabs) en la PCR. Los cebadores señal del oligonucleótido de
detección hibridan con la diana en el sentido de 3' desde los
cebadores de amplificación de la PCR, se desplazan y se convierten
en doble cadena esencialmente tal como se ha descrito para la SDA.
En la PCR, puede seleccionarse opcionalmente cualquier RERS para su
uso en el oligonucleótido de detección, ya que normalmente no hay
desoxinucleósido trifosfatos modificados presentes que pudieran
inducir la formación de mellas en lugar de la escisión del RERS.
Puesto que el termociclado es una característica de la amplificación
por PCR, la endonucleasa de restricción se añade preferiblemente a
baja temperatura tras el ciclo final de la extensión y el
apareamiento del cebador para la detección del punto final de la
amplificación. Sin embargo, una endonucleasa de restricción
termófila que permanece activa a través de fases de temperatura alta
de la reacción de PCR podría estar presente durante la amplificación
para proporcionar un ensayo en tiempo real. Al igual que en los
sistemas de SDA, la linealización de la estructura secundaria y la
separación del par de colorantes reduce la extinción de la
fluorescencia, con un cambio en un parámetro de fluorescencia tal
como la intensidad que sirve como indicación de la amplificación de
la diana.
Para la adaptación de los métodos de la
invención a 3SR, TMA o NASBA, se emplea una transcriptasa inversa
deficiente en la actividad exonucleasa 5' \rightarrow 3' con
actividad de desplazamiento de cadena, con hibridación del
oligonucleótido de detección con la diana de ARN en el sentido de 3'
de un cebador de amplificación que contiene un promotor de la ARN
polimerasa. En un esquema de reacción similar al descrito
anteriormente, el oligonucleótido de detección hibridado que
contiene la estructura secundaria 1) se extiende, y 2) se desplaza
mediante la extensión del cebador de amplificación en el sentido de
5'. El producto de la extensión desplazado se vuelve entonces de
doble cadena mediante la hibridación y la extensión del segundo
cebador de amplificación. Esto despliega o linealiza la estructura
secundaria, aumentando la distancia entre los colorantes donador y
aceptor y reduciendo la extinción de fluorescencia del fluoróforo
donador. El cebador señal del oligonucleótido de detección para 3SR
o NASBA no contiene una secuencia promotora de la ARN polimerasa y,
por tanto, no puede funcionar como un cebador de amplificación,
reduciendo la señal inicial no específica. Esto es análogo al
cebador señal en la SDA, que no contiene un RERS en el que se puedan
formar mellas y, por tanto, no contribuye significativamente a la
amplificación inicial exponencial de las dianas no específicas.
Para una señal inicial reducida, se prefiere que
los oligonucleótidos de detección se utilicen como cebadores señal
en los métodos de la invención, estando separado el producto de
extensión del oligonucleótido de detección de la secuencia diana
mediante el desplazamiento debido a la extensión del cebador de
amplificación en el sentido de 5'. Sin embargo, será evidente que
los cebadores de amplificación conocidos para su uso en las diversas
reacciones de amplificación de ácidos nucleicos también pueden
modificarse mediante la unión de una estructura secundaria con bases
apareadas intramolecularmente, tal como se describe para los
cebadores señal del oligonucleótido de detección. En esta
realización, el producto de extensión del cebador de amplificación,
con la estructura secundaria en 5', puede separarse de la secuencia
diana mediante el desplazamiento debido a la extensión de un cebador
de no amplificación en el sentido de 5' (por ejemplo, cebadores
"bumper" (utilizado para desplazar productos de extensión del
cebador) en una SDA), mediante desnaturalización (por ejemplo,
calentando como en la PCR) o mediante digestión enzimática de la
cadena diana (por ejemplo, RNAasa H como en 3SR). Los cebadores de
amplificación que comprenden el par de colorantes donador/aceptor y
la estructura secundaria en 5' eliminan la necesidad del
oligonucleótido de detección adicional en la reacción, pero dado que
el fondo puede ser mayor en esta realización, la sensibilidad del
ensayo puede disminuir. Para la PCR, el cebador de amplificación se
modifica mediante la adición de la estructura secundaria en 5' con
respecto a la secuencia de unión a la diana. Este cebador es
estructuralmente idéntico al cebador señal del oligonucleótido de
detección de la PCR, tal como se describió anteriormente. Sin
embargo, funcionalmente es diferente porque no hay cebador en el
sentido de 3' que se extienda y se desplace y el cebador de
amplificación proporciona por sí mismo el cambio en la
fluorescencia. Para 3SR, NASBA y TMA, la estructura secundaria con
los colorantes unidos puede situarse en 5' con respecto al promotor
de un cebador de amplificación, de modo que la estructura secundaria
esté desplegada o linealizada en la parte de ADN de doble cadena del
ciclo de amplificación. El RERS está en posición 5' con respecto al
promotor, de modo que la escisión no elimine el promotor del cebador
de amplificación y la generación de los transcritos de ARN continua
para mantener la amplificación de la diana. Un segundo cebador de
amplificación que no contiene una secuencia del promotor (por
ejemplo, como en NASBA) puede contener también o de manera
alternativa la estructura secundaria en 5' con respecto a la
secuencia de unión a la diana.
Dado que las estructuras secundarias con bases
apareadas intramolecularmente son muy estables, no se sabía si la
polimerasa podría o no desplazar o linealizar las cadenas en
condiciones de extensión de cebador in vitro. En particular,
el apareamiento de bases intramolecular de la estructura secundaria
puede situar los dos colorantes voluminosos en proximidad cercana en
los brazos opuestos de una molécula bicatenaria con bases apareadas
intramolecularmente, y no estaba clara la capacidad de la polimerasa
para desplazar la cadena a través de dos colorantes voluminosos en
condiciones in vitro sin atascarse o disociarse del ADN. La
eficacia de esta función se consideró incluso más impredecible en la
SDA, en la que se reduce la eficacia de la polimerasa por la
necesidad de incorporar nucleótidos modificados.
En realizaciones alternativas, el
oligonucleótido de detección puede utilizarse en formatos de ensayos
no basados en amplificación para detectar oligonucleótidos de diana.
En una primera realización, la secuencia de unión a la diana de
cadena sencilla en posición 3' del oligonucleótido de detección
hibrida con el extremo 3' del oligonucleótido de diana, de manera
que la estructura secundaria con bases apareadas forma una
proyección en 5'. La secuencia diana funciona como un cebador en una
reacción de extensión del cebador para sintetizar el complemento de
la estructura secundaria con bases apareadas utilizando una
polimerasa de desplazamiento de cadena que extiende la secuencia
diana utilizando la proyección en 5' (es decir, la secuencia de la
estructura secundaria con bases apareadas) como molde. Si la
secuencia de unión a la diana del oligonucleótido de detección
hibrida con sólo una parte de la secuencia diana, la secuencia diana
también forma una proyección en 5' y el oligonucleótido de detección
se extiende de manera similar utilizando la proyección en 5' de la
diana como molde. Si la secuencia de unión a la diana del
oligonucleótido de detección es complementaria a la longitud total
de la secuencia diana, sólo se extiende la diana. En cualquier caso,
la estructura secundaria del oligonucleótido de detección se
despliega o linealiza de esta manera con un cambio adjunto en el
parámetro de fluorescencia. La extensión para desplegar o linealizar
la estructura secundaria y producir un cambio en la fluorescencia
tiene lugar sólo en presencia de la diana. De manera similar, el
RERS sólo puede escindirse o formarse mellas en presencia de la
diana. Puesto que este método no requiere SDA ni ninguna otra
reacción de amplificación, no son necesarios nucleótidos
modificados, y puede emplearse cualquier RERS en el oligonucleótido
de detección. Sin embargo, si en el RERS tienen que formarse mellas
en lugar de escindirse, pueden emplearse nucleótidos modificados,
tal como se describió anteriormente para producir un sitio con
formación de mella única.
En una segunda realización no basada en la
amplificación de la invención, el oligonucleótido de detección se
hibrida con la secuencia diana, de manera que se produzca un cambio
en la fluorescencia. Por tanto, la secuencia de unión a la diana de
cadena sencilla puede estar en el extremo 5' o 3' del
oligonucleótido de detección cuando se utiliza como una sonda de
hibridación. Es decir, dado que la extensión de cebador no es
necesaria, la estructura secundaria puede estar en 5' o en 3' con
respecto a la cola de cadena sencilla, comprendiendo opcionalmente
una parte de la secuencia de unión a la diana. En esta realización,
la estructura secundaria comprende preferiblemente un parte de la
secuencia de unión a la diana con la secuencia de unión a la diana
restante presente en la cola de cadena sencilla en 3' ó 5' que está
disponible para la hibridación no competitiva con la diana. La
hibridación rompe así la estructura secundaria y da como resultado
el desplegamiento. Sin embargo, tal como se muestra en los ejemplos
siguientes, también pueden observarse cambios en la fluorescencia
con la hibridación cuando la secuencia de unión a la diana está en
su totalidad en la cola de cadena sencilla y no es posible el
apareamiento de bases entre la diana y la estructura secundaria.
Cuando está presente la diana, el oligonucleótido de detección
hibrida inicialmente con ella mediante la cola de cadena sencilla.
Esto trae a cualquier secuencia complementaria con la diana de la
estructura secundaria que pueda estar presente en proximidad cercana
con sus secuencias complementarias en la diana. La secuencia de
unión a la diana en la estructura secundaria hibrida con su
secuencia complementaria en la diana, rompiendo así el apareamiento
de bases intramolecular en la estructura secundaria y aumentando la
distancia entre los colorantes donador y aceptor, a medida que se
despliega la estructura secundaria. El cambio resultante en un
parámetro de fluorescencia puede detectarse como una indicación de
la presencia de la secuencia diana. Se cree que la unión de la cola
en 5' o 3' de cadena sencilla del oligonucleótido de detección a la
secuencia diana facilita la rotura de la estructura secundaria
manteniendo las secuencias complementarias de la diana y la
estructura secundaria en proximidad cercana, favoreciendo mejor el
apareamiento de bases intermolecular. Tal unión cooperativa puede
permitir que la diana compita más eficazmente contra la secuencia
correspondiente en el oligonucleótido de detección por la
hibridación con la secuencia complementaria en la estructura
secundaria. Sin la unión cooperativa proporcionada por la secuencia
de unión a la diana de cadena sencilla en la cola en 3' o 5' del
oligonucleótido de detección, la estructura secundaria tendería a
permanecer intacta y es probable que se observara un cambio pequeño
o ausencia del mismo en la fluorescencia, incluso en presencia de la
diana.
Bagwell enseña la introducción de apareamientos
erróneos dentro de la estructura secundaria para desestabilizar el
apareamiento de bases intramolecular y para permitir que la diana
compita eficazmente contra la formación de la estructura secundaria.
El ajuste de la estabilidad de la estructura secundaria mediante la
introducción de apareamientos erróneos es un procedimiento tedioso y
que lleva mucho tiempo, ya que generalmente son necesarios múltiples
intentos de ensayo y error antes de que se identifique un equilibrio
adecuado de apareamientos erróneos para la detección de una diana
particular. Los oligonucleótidos de detección de la invención
eliminan la necesidad de apareamientos erróneos en la estructura
secundaria proporcionando una secuencia de cola de unión a la diana
de cadena sencilla colocada adyacente a la estructura secundaria, de
manera que cuando el oligonucleótido de detección se hibrida con la
diana, la estructura secundaria se despliega más fácilmente.
La presente invención también elimina la
necesidad de situar la región de unión a la diana de la sonda en un
bucle de la estructura secundaria según enseñan Tyagi et al.
(documento WO 95/13399). Normalmente, el bucle debe ser de
20-60 nucleótidos de longitud para albergar la
secuencia de unión a la diana. Por tanto, la selección del bucle
debe equilibrarse frente a la selección de las partes con bases
apareadas intramolecularmente de la estructura secundaria de modo
que la estructura permanece plegada de manera estable en ausencia de
la diana pero desplegada cuando está presente la diana. Este proceso
de selección es complicado por el hecho de que la termoestabilidad
de las estructuras secundarias que contienen grandes bucles puede
ser difícil de predecir. En las estructuras secundarias de los
oligonucleótidos de detección de la invención no hay necesidad de
bucles grandes y de cadena sencilla potencialmente impredecibles
porque la región de unión a la diana reside en una secuencia de cola
adyacente, y opcionalmente, de manera parcial en una parte con bases
apareadas intramolecularmente de la estructura secundaria. Aunque la
secuencia de unión a la diana puede incluir también un bucle de la
estructura secundaria, el bucle puede hacerse más pequeño y por
tanto, más predecible dado que la secuencia de unión a la diana se
localiza principalmente en la cola en 3' o 5' adyacente.
La presente invención también se distingue de
las composiciones y métodos de Bagwell y Tyagi, et al. en que
no se requiere que la diana se hibride inicialmente con las
secuencias de la propia estructura secundaria. La hibridación
competitiva inicial con la estructura secundaria tal como enseñan
Bagwell y Tyagi, et al. reduce la afinidad de la sonda por la
diana y disminuye la sensibilidad del ensayo. Por el contrario, la
unión no competitiva inicial de la invención favorece mejor la
hibridación intermolecular en cualquier reacción de hibridación
competitiva posterior. La longitud de la cola en 3' o 5' de cadena
sencilla puede ajustarse sin afectar a las propiedades
termodinámicas de la estructura secundaria, de modo que puede
optimizarse la hibridación con la diana sin requerir un nuevo diseño
de la estructura secundaria. Esto simplifica enormemente el diseño
de la sonda de detección en comparación con la técnica anterior.
Además de detectar la presencia o ausencia de la
diana y de detectar la amplificación de una diana, los
oligonucleótidos de detección y los métodos de la invención pueden
utilizarse como cebadores o sondas de hibridación para distinguir
entre dianas que difieren en uno o más nucleótidos. Para realizar
tales análisis, la secuencia de unión a la diana en la cola de
cadena sencilla del oligonucleótido de detección se selecciona de
tal manera que sólo se produzca la hibridación estable con la diana
cuando se potencia la hibridación mediante el apareamiento de bases
de la diana con uno o más nucleótidos implicados en el apareamiento
de bases intramolecular en la estructura secundaria. El
oligonucleótido de detección se diseña además de tal manera que la
hibridación con una diana que contiene una o más diferencias de
nucleótidos que van a detectarse daría como resultado uno o más
pares de bases con apareamiento erróneo o bien en la secuencia de
cola o bien en la secuencia de la estructura secundaria. La
estabilidad reducida del apareamiento erróneo junto con la
competencia de la formación de la estructura secundaria reduce la
hibridación con la diana que contiene la(s)
diferencia(s) de nucleótidos, reduciendo así la magnitud del
cambio en la fluorescencia comparado con una diana perfectamente
apareada (es decir, una diana sin la diferencia de nucleótidos). Los
números crecientes de apareamientos erróneos producen en
consecuencia cambios menores en la fluorescencia. Menos
apareamientos erróneos dan como resultado en consecuencia cambios
mayores en la fluorescencia. Según disminuye el número de
apareamientos erróneos, se aproxima la magnitud del cambio en la
fluorescencia al observado para secuencias perfectamente apareadas,
con la capacidad para discriminar diferencias de nucleótidos
individuales. Pueden utilizarse métodos similares para detectar
mutaciones del marco de lectura.
El cambio en la fluorescencia que resulta del
desplegamiento o la linealización de los oligonucleótidos de
detección puede detectarse en un punto final seleccionado en la
reacción. Sin embargo, dado que las estructuras secundarias
linealizadas se producen de manera concurrente con la hibridación o
extensión de cebadores, también puede monitorizarse en cambio en la
fluorescencia según se produce la reacción, es decir, en "tiempo
real". Este formato de ensayo en tiempo real, homogéneo puede
utilizarse para proporcionar información semicuantitativa o
cuantitativa sobre la cantidad inicial de diana presente. Por
ejemplo, la velocidad a la que cambia la intensidad de fluorescencia
durante la reacción de desplegamiento o linealización (ya sea como
parte de la amplificación de la diana o en métodos de detección sin
amplificación) es una indicación de los niveles iniciales de diana.
Como resultado, cuando están presentes más copias iniciales de la
secuencia diana, la fluorescencia del donador alcanza más
rápidamente un valor umbral seleccionado (es decir, un tiempo más
corto hasta la positividad). La disminución en la fluorescencia del
aceptor muestra de manera similar un tiempo más corto hasta la
positividad, detectado como el tiempo requerido para alcanzar un
valor mínimo seleccionado. Además, la velocidad de cambio en los
parámetros de fluorescencia durante el transcurso de la reacción es
más rápida en muestras que contienen cantidades iniciales superiores
de diana que en muestras que contienen cantidades iniciales
inferiores de diana (es decir, aumento de la pendiente de la curva
de fluorescencia). Pueden realizarse estas y otras mediciones, tal
como se conoce en la técnica, como una indicación de la presencia de
diana o como una indicación de la amplificación de la diana. La
cantidad inicial de diana se determina normalmente por comparación
de los resultados experimentales con los resultados para cantidades
conocidas de diana.
Pueden realizarse ensayos para determinar la
presencia de una secuencia diana seleccionada según los métodos de
la invención en disolución o en fase sólida. Los ensayos homogéneos
en tiempo real o de punto final en los que el oligonucleótido de
detección funciona como un cebador se realizan normalmente en
disolución. Los ensayos de hibridación que utilizan los
oligonucleótidos de detección de la invención también pueden
realizarse en disolución (por ejemplo, como ensayos en tiempo real
homogéneos) pero son particularmente muy adecuados para ensayos en
fase sólida para la detección en tiempo real o de punto final de la
diana. En un ensayo en fase sólida, los oligonucleótidos de
detección pueden inmovilizarse sobre la fase sólida (por ejemplo,
perlas, membranas o el recipiente de reacción) a través de
marcadores internos o terminales utilizando métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, puede inmovilizarse un oligonucleótido de
detección marcado con biotina sobre una fase sólida modificada con
avidina en la que se producirá un cambio en la fluorescencia cuando
se exponga a la diana en condiciones de hibridación apropiadas. La
captura de la diana de esta manera facilita la separación de la
diana de la muestra y permite la eliminación de sustancias en la
muestra que pueden interferir con la detección de la señal u otros
aspectos del ensayo.
Muchos pares de colorantes donador/aceptor
conocidos en la técnica son útiles en la presente invención. Estos
incluyen, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína
(FITC)/isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), FITC/Texas
Red^{TM} (Molecular Probes), FITC/1-pirenobutirato
de N-hidroxisuccinimidilo (PYB), FITC/isotiocianato
de eosina (EITC), 1-pirenosulfonato de
N-hidroxisuccinimidilo (PYS)/FITC, FITC/rodamina X,
FITC/tetrametilrodamina
(TAMRA), N-(4-aminobutil)-N-etilisoluminol (ABEI)/TAMRA y otros. La selección de un par de fluoróforos donador/aceptor particular no es crítica. Para mecanismos de extinción de la transferencia de energía sólo es necesario que las longitudes de onda de emisión del fluoróforo donador solapen con las longitudes de onda de excitación del fluoróforo aceptor, es decir, deben hacer suficiente solapamiento espectral entre los dos colorantes para permitir una transferencia de energía, transferencia de carga o extinción de fluorescencia eficaz. El ácido p-(dimetil-aminofenilazo)benzoico es un colorante aceptor no fluorescente que extingue eficazmente la fluorescencia de un fluoróforo adyacente, por ejemplo, fluoresceína o 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno (EDANS). Ciertos pares de donador/aceptor se ponen como ejemplo anteriormente y en los siguientes ejemplos, sin embargo, serán evidentes otros para los expertos en la técnica y son también útiles en la invención. Cualquier par de colorantes que produzca extinción de fluorescencia en los oligonucleótidos de detección de la invención son adecuados para su uso en los métodos de la invención, independientemente del mecanismo por el que se produce la extinción. Se ha observado que tetrametil-indodicarbocianina N,N-modificada (Cy5) y ROX son un par de colorantes especialmente útil para su uso en los métodos y oligonucleótidos de detección de la invención, proporcionando un cambio en la fluorescencia de aproximadamente 20 veces en presencia de la diana.
(TAMRA), N-(4-aminobutil)-N-etilisoluminol (ABEI)/TAMRA y otros. La selección de un par de fluoróforos donador/aceptor particular no es crítica. Para mecanismos de extinción de la transferencia de energía sólo es necesario que las longitudes de onda de emisión del fluoróforo donador solapen con las longitudes de onda de excitación del fluoróforo aceptor, es decir, deben hacer suficiente solapamiento espectral entre los dos colorantes para permitir una transferencia de energía, transferencia de carga o extinción de fluorescencia eficaz. El ácido p-(dimetil-aminofenilazo)benzoico es un colorante aceptor no fluorescente que extingue eficazmente la fluorescencia de un fluoróforo adyacente, por ejemplo, fluoresceína o 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno (EDANS). Ciertos pares de donador/aceptor se ponen como ejemplo anteriormente y en los siguientes ejemplos, sin embargo, serán evidentes otros para los expertos en la técnica y son también útiles en la invención. Cualquier par de colorantes que produzca extinción de fluorescencia en los oligonucleótidos de detección de la invención son adecuados para su uso en los métodos de la invención, independientemente del mecanismo por el que se produce la extinción. Se ha observado que tetrametil-indodicarbocianina N,N-modificada (Cy5) y ROX son un par de colorantes especialmente útil para su uso en los métodos y oligonucleótidos de detección de la invención, proporcionando un cambio en la fluorescencia de aproximadamente 20 veces en presencia de la diana.
También se conocen en la técnica métodos de
marcaje terminal e interno y pueden utilizarse para unir los
colorantes donador y aceptor en sus respectivos sitios en el
oligonucleótido de detección. Los ejemplos de métodos de marcaje
5'-terminal incluyen a) oxidación con peryodato de
un ribonucleótido acoplado 5' a 5' seguido por reacción con un
marcador que contiene amina, b) condensación de etilendiamina con un
polinucleótido fosforilado en 5' seguido por reacción con un
marcador reactivo con amina y c) introducción de un sustituyente de
amina alifática utilizando un reactivo de fosfito de aminohexilo en
la síntesis de ADN en fase sólida seguido por reacción con un
marcador reactivo con amina. Los marcadores también pueden unirse a
oligonucleótidos de ADN sintéticos en ubicaciones específicas
utilizando reactivos de fosforamidita nucleotídicos que contienen
aminas alifáticas especiales. La selección de un método apropiado
para unir los marcadores seleccionados al oligonucleótido de
detección y la realización de las reacciones de unión son rutinarias
en la técnica.
Se preparó ADN diana para los siguientes
ejemplos experimentales a partir de disoluciones madre de cuerpos
elementales (CE) de Chlamydia trachomatis almacenadas a
concentraciones de 10^{6} CE/\mul en glicerol al 50%. Las
disoluciones madre de CE se diluyeron 1:10 con agua, se llevaron a
ebullición durante 15 minutos y se prepararon como diluciones en
serie de 10 veces en ADN placentario humano 10 ng/\mul. Estas
disoluciones madre contenían de 1 a 100 copias genómicas/\mul de
diana. El fluoróforo donador se conjugó con el fosfato en 5'. Se
obtuvieron mediciones con un fluorómetro de calidad para
investigación SLM 8100 equipado con un baño con circulación para
mantener la temperatura del compartimento de la muestra, una lámpara
de arco de xenón y monocromadores de rejilla para controlar las
longitudes de onda de excitación y emisión. Los experimentos con
fluoresceína (FAM) como el donador utilizaron 488 nm para la
longitud de onda de excitación y 525 nm para la emisión. Los
experimentos en los que ROX era el donador utilizaron una excitación
a 580 nm y una emisión a 604 nm.
Se realizó SDA tal como se describe generalmente
en el documento EP 0 684 315, con la adición del oligonucleótido de
detección marcado en el extremo 5' con FAM y en T15 con ROX. Las
concentraciones finales de los componentes en cada reacción en 100
\mul fueron K_{i}PO_{4} 40 mM pH 7,5, MgOAc 6 mM, cada dTTP,
dGTP, dATP 0,2 mM, dCTP\alphaS 1,4 mM, BSA acetilada 20 \mug/ml,
3% de DMSO, 8% (v/v) de glicerol, 100 ng de ADN placentario humano,
25 unidades de Bst polimerasa (fragmento Klenow exo^{-}, New
England Biolabs), 150 unidades de AvaI (un isoesquizómero de BsoBI,
New England Biolabs, Beverly, MA) y ADN de 0, 10, 100 o 1.000
cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis. Cada muestra
contenía además los siguientes cebadores:
SEQ ID NO:1 (oligonucleótido de detección, 50
nM, 5'-FAM/T15-ROX)
- _{FAM-}TAGCACCCGAGTGCT_{ROX}*AGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA
SEQ ID NO:2 (cebador de amplificación S1.1, 750
nM)
- ACCGCATCGAATCGATGTCTCGGGTAGAAAATCGCATGCAAGATA
SEQ ID NO:3 (cebador de amplificación S2.1, 188
nM)
- CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAGCTGCCTCAGAATATACTCAG
SEQ ID NO:4 (cebador tope B1, 75 nM)
- TAAACATGAAAACTCGTTCCG
SEQ ID NO:5 (cebador tope B2, 75 nM)
- TTTTATGATGAGAACACTTAAACTCA
Las secuencias en cursiva en SEQ ID NO:1 forman
el tallo de bases apareadas de una estructura de horquilla. Los
sitios AvaI se muestran en negrita. Las secuencias en 3' a los
sitios AvaI son secuencias de unión a la diana complementarias a la
diana. Cada reacción se ensambló para que contuviera todos los
reactivos excepto Bst y AvaI, y luego se calentaron las muestras
durante 2 min. a 95ºC. Se transfirieron a un baño de agua a 53,5ºC
durante 3-5 min. y se añadieron las enzimas para un
volumen de muestra total de 100 \mul. Las muestras se
transfirieron entonces a cubetas de 225 \mul y se colocaron en un
espectrofluorímetro SLM 8100 de calidad para investigación
(Spectronic Instruments, Rochester, NY). La temperatura de las
cubetas se mantuvo a 53-54ºC mediante un baño de
agua con circulación, y se registró la emisión de fluorescencia de
cada cubeta a 520 nm (\lambda_{excitación} = 488 nm) cada 8 seg.
Las reacciones prosiguieron normalmente durante
60-90 minutos.
La figura 2 muestra los resultados. La
fluorescencia permaneció baja (extinguida) en la reacción de control
que no contenía diana (sin amplificación) pero aumentó
significativamente en las reacciones que contenían 10, 100 y 1.000
dianas, demostrando la detección específica de la amplificación de
la diana. La sensibilidad de este ensayo, en el que la horquilla se
convierte en una conformación lineal, de doble cadena y se escinde,
es de aproximadamente 10 copias genómicas de la diana. El aumento en
la fluorescencia fue de aproximadamente 8 veces para 1.000 copias
genómicas, que es un cambio superior al observado normalmente para
la escisión sola con cantidades comparables de diana (normalmente un
aumento de aproximadamente 5 veces). También hay un cambio en la
fluorescencia aproximadamente 3 veces mayor que el observado
normalmente para el desplegamiento de una horquilla sin posterior
escisión o formación de mellas. Estos resultados indican que
introduciendo una estructura secundaria en el oligonucleótido de
detección, el par de colorantes puede ponerse en estrecha proximidad
para optimizar la extinción, mientras que al mismo tiempo se
maximiza la distancia lineal entre los colorantes en presencia de la
diana. Cuando se utiliza RERS solo, minimizar la distancia entre los
colorantes proporciona una extinción óptima (y por tanto, una
sensibilidad máxima para el ensayo) pero también reduce la eficacia
de la escisión o formación de mellas debido al bloqueo físico del
RERS por los colorantes voluminosos, de modo que la separación de
los colorantes en presencia de la diana está comprometida. La
presente invención proporciona una solución a este problema y
permite al profesional optimizar tanto la extinción como la
posterior separación de los colorantes para mejorar la sensibilidad
del ensayo.
Además, la velocidad de aumento de la intensidad
de fluorescencia del donador (una medida de la velocidad de
disminución de la extinción del donador) fue más rápida en las
muestras que contenían mayores cantidades iniciales de diana. La
velocidad de aumento en la fluorescencia del donador proporciona,
por tanto, no sólo la detección de la amplificación en tiempo real,
sino también una medida semicuantitativa o relativa de los niveles
iniciales de diana. Además, comparando la velocidad de aumento en la
fluorescencia en una muestra que contiene una cantidad desconocida
de diana con el aumento en la fluorescencia en una serie de
reacciones que contienen cantidades variables conocidas de diana
(produciendo una curva patrón tal como se conoce en la técnica),
puede obtenerse una medida cuantitativa de los niveles de diana en
la muestra desconocida. Alternativamente, puede utilizarse la
detección de un aumento en la intensidad de fluorescencia superior a
un valor umbral predeterminado como una indicación de que la diana
está presente y se ha amplificado en un formato de ensayo
positivo/negativo sencillo. Alternativamente, puede utilizarse la
coamplificación de la diana o dianas y una secuencia de control
interna utilizando los métodos y oligonucleótidos de detección de la
invención como medio para la cuantificación de la diana. En la
técnica se conocen varios métodos de coamplificación de este
tipo.
Se diseñaron oligonucleótidos diana sintéticos
(SED ID NO: 6-9) para hibridarse con un
oligonucleótido de detección según la invención (SEQ ID NO:1), tal
como se muestra a continuación:
SEQ ID NO:6 (JN5)
- TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAGACTCATCTGAGTAACCAGAC
SEQ ID NO:7 (JN6)
- TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAGACTC TA CTGAGTAACCAGAC
SEQ ID NO:8 (JN7)
- TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAGACTC TAGC GAGTAACCAGAC
SEQ ID NO:9 (JN8)
- TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAGACTC TAGCAC GTAACCAGAC
SEQ ID NO:1 (JBP70)
- _{FAM-}TAGCACCCGAGTGCT_{ROX}*AGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA
Los dos brazos que forman el tallo de bases
apareadas intramolecularmente de la horquilla de SEQ ID NO:1 se
muestran en cursiva. El primer brazo no está en negrita y el segundo
brazo está en negrita. Las secuencias diana sintéticas tienen un
extremo 5' común compuesto por treinta y dos nucleótidos que se
hibridan con el extremo 3' de SEQ ID NO:1 (la cola en 3' de cadena
sencilla). También pueden emparejarse por bases nucleótidos
adicionales de las diversas secuencias diana con SEQ ID NO:1 pero
esto requiere la perturbación del apareamiento de bases
intramolecular del tallo de la horquilla, dando como resultado la
competencia entre el primer brazo del tallo y la diana para la
hibridación con el segundo brazo del tallo. Los nucleótidos de las
secuencias diana que pueden emparejarse por bases potencialmente con
SEQ ID NO:1 están subrayados. SEQ ID NO:6 está apareada por bases
con el oligonucleótido de detección hasta la unión entre el tallo de
la horquilla y la cola en 3' de SEQ ID NO:1 pero no está apareada
por bases con ningún nucleótido del tallo. SEQ ID NO:7 tiene el
potencial para aparearse por bases con la cola en 3' y dos
nucleótidos del tallo adyacentes a la cola en 3' (mostrado en
negrita). SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 se aparean potencialmente con la
cola en 3' y cuatro o seis nucleótidos del tallo adyacentes a la
cola en 3', respectivamente.
Se combinó SEQ ID NO:1 (100 nM) con un exceso
molar de 5 veces de cualquiera de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID
NO:8 o SEQ ID NO:9 en tampón fosfato de potasio en condiciones
adecuadas para la hibridación. Una muestra que no contenía diana
sirvió como control. Las disoluciones se excitaron a 488 nm y se
midió la emisión de fluorescencia de fluoresceína (el donador) a 520
nm (55ºC) tras un periodo de tiempo suficiente para la
hibridación.
Los resultados se muestran en la siguiente
tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
| Intensidad de | |
| fluorescencia | |
| Diana | normalizada (520 nm) |
| Ninguna | 1,0 |
| SEQ ID NO:6 | 1,74 |
| SEQ ID NO:7 | 2,56 |
| SEQ ID NO:8 | 4,15 |
| SEQ ID NO:9 | 5,17 |
Todas las secuencias diana se detectaron
satisfactoriamente mediante hibridación con el oligonucleótido de
detección. Inesperadamente, la hibridación de SEQ ID NO:6 produjo un
aumento en la fluorescencia incluso cuando no es posible el
apareamiento de bases con el tallo de la horquilla, lo que sugiere
que el apareamiento de bases cerca de la estructura secundaria puede
conducir a cierta perturbación del apareamiento de bases
intramolecular. En las condiciones del ensayo utilizadas, todas las
secuencias diana deben hibridarse de manera estable con la cola en
3' de cadena sencilla de SEQ ID NO:1, de modo que las diferencias en
la intensidad de fluorescencia pueden atribuirse a diferencias en el
grado de perturbación de la estructura secundaria. La hibridación de
SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 mostró que la intensidad de
fluorescencia del donador aumenta según aumenta el número de
apareamientos de bases potenciales entre la diana y el tallo de la
horquilla, indicando el aumento del desplegamiento de la estructura
secundaria y el aumento de la distancia entre los colorantes donador
y aceptor cuando se hibridan la diana y el oligonucleótido de
detección. Los cambios en la intensidad de fluorescencia resultan lo
más probablemente de o bien un desplazamiento en el número de
moléculas plegadas o bien de un cambio en el número medio de
emparejamientos de bases por estructura plegada. Estos dos
mecanismos podrían no distinguirse en este experimento, pero se
demostró claramente que se requería la presencia de la diana para
que se produjera un cambio en la fluorescencia.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1 Becton Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Franklin Lakes
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07417
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EXTINCIÓN DE FLUORESCENCIA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGCACCCGA GTGCTAGAGT CTTCAAATAT CAGAGCTTTA CCTAACAA
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGCATCGA ATCGATGTCT CGGGTAGAAA ATCGCATGCA AGATA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGCTGC CTCAGAATAT ACTCAG
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAACATGAA AACTCGTTCC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTATGATG AGAACACTTA AACTCA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTTAGGTA AAGCTCTGAT ATTTGAAGAC TCATCTGAGT AACCAGAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTTAGGTA AAGCTCTGAT ATTTGAAGAC TCTACTGAGT AACCAGAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTTAGGTA AGCTCTGAT ATTTGAAGAC TCTAGCGAGT AACCAGAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTTAGGTA AAGCTCTGAT ATTTGAAGAC TCTAGCACGT AACCAGAC
\hfill48
Claims (7)
1. Método para detectar una secuencia diana de
ácido nucleico que comprende:
a) hibridar la secuencia diana con un
oligonucleótido de detección que comprende una secuencia de unión a
la diana de cadena sencilla y una estructura secundaria con bases
apareadas intramolecularmente en 5' a la secuencia de unión a la
diana, teniendo unida la estructura secundaria a ella un fluoróforo
donador y un colorante aceptor de tal manera que se extingue la
fluorescencia del fluoróforo donador y de tal manera que se separan
el fluoróforo donador y el colorante aceptor en de 8 a 15
nucleótidos cuando tal estructura secundaria se linealiza o
despliega, comprendiendo además dicha estructura secundaria un sitio
de reconocimiento de endonucleasa de restricción parcial o
completamente de cadena sencilla situado entre dicho fluoróforo
donador y dicho colorante aceptor;
b) en una reacción de extensión de cebadores,
sintetizar una cadena complementaria utilizando la estructura
secundaria con bases apareadas como molde y la secuencia diana como
cebador, linealizando o desplegando así la estructura secundaria con
bases apareadas, convirtiendo dicho sitio de reconocimiento de
endonucleasa de restricción en de doble cadena y produciendo un
cambio en un parámetro de fluorescencia;
c) escindir o formar mellas del sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción de doble cadena,
y;
d) detectar el cambio en el parámetro de
fluorescencia como una indicación de la presencia de la secuencia
diana.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
se detecta un aumento en la intensidad de fluorescencia del donador
o una disminución en la intensidad de fluorescencia del aceptor como
una indicación de la presencia de la secuencia diana.
3. Método para detectar la amplificación de una
secuencia diana, que comprende, en una reacción de
amplificación:
a) hibridar la secuencia diana con un
oligonucleótido de detección que comprende una secuencia de unión a
la diana de cadena sencilla y una estructura secundaria con bases
apareadas intramolecularmente en 5' a la secuencia de unión a la
diana, comprendiendo además dicha estructura secundaria con bases
apareadas intramolecularmente un sitio de reconocimiento de
endonucleasa de restricción parcial o completamente de cadena
sencilla situado entre dicho fluoróforo donador y dicho colorante
aceptor, teniendo unida la estructura secundaria a ella un
fluoróforo donador y un colorante aceptor de tal manera que se
extingue la fluorescencia del fluoróforo donador y de tal manera que
se separan el fluoróforo donador y el colorante aceptor en de 8 a 15
nucleótidos cuando tal estructura secundaria se linealiza o
despliega;
b) extender el oligonucleótido de detección
hibridado en la secuencia diana con una polimerasa para producir un
producto de extensión del oligonucleótido de detección que tiene una
parte extendida y separar el producto de extensión del
oligonucleótido de detección de la secuencia diana;
c) hibridar un cebador con la parte extendida
del producto de extensión del oligonucleótido de detección y
extender el cebador con la polimerasa, linealizando o desplegando
así la estructura secundaria con bases apareadas, convirtiendo el
sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en de doble
cadena, y produciendo un cambio en un parámetro de
fluorescencia;
d) escindir o formar mellas del sitio de
reconocimiento de endonucleasa de restricción de doble cadena,
y;
e) detectar el cambio en el parámetro de
fluorescencia como una indicación de la presencia de la secuencia
diana.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dicha separación del producto de extensión del oligonucleótido de
detección de la secuencia diana comprende hibridar un cebador
adicional con la secuencia diana en el sentido de 5' del
oligonucleótido de detección y extender el cebador adicional
hibridado con una polimerasa para producir el desplazamiento del
producto de extensión del oligonucleótido de detección de la
secuencia diana.
5. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el
que la secuencia diana se amplifica mediante amplificación por
desplazamiento de cadenas.
6. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el
que se detecta un aumento en la intensidad de fluorescencia del
fluoróforo donador o una disminución en la intensidad de
fluorescencia del colorante aceptor como una indicación de la
presencia de la secuencia diana.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el cambio en la intensidad de fluorescencia se detecta en tiempo
real.
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