ES2273640T3 - Pruebas y metodos universales para deteccion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de una secuencia diana de ácido nucleico que comprende: a) hibridar una sonda detectora con la secuencia diana, comprendiendo la sonda detectora un primer oligonucleótido que es un oligonucleótido adaptador hibridado con un segundo oligonucleótido, en donde el segundo oligonucleótido es complementario de un oligonucleótido adicional que es una sonda donadora que forma una estructura secundaria cuando no está hibridada con una secuencia complementaria; b)separar el segundo oligonucleótido del oligonucleótido adaptador de una forma dependiente de la diana, y; c) detectar la hibridación del segundo oligonucleótido con la sonda donadora como una indicación de la presencia de la secuencia diana.
Description
Pruebas y métodos universales para detección de
ácidos nucleicos.
La invención está relacionada con materiales y
métodos para la detección de secuencias diana de ácidos
nucleicos.
Durante mucho tiempo se ha utilizado la
hibridación de secuencias específicas de sondas de oligonucleótidos
marcadas para detectar e identificar secuencias de nucleótidos
determinadas, y el marcado de dichas sondas con marcadores
fluorescentes ha proporcionado un medio relativamente sensible y no
radioactivo para facilitar la detección de la hibridación de las
sondas. Para la detección de la hibridación de las sondas, algunos
métodos de detección desarrollados recientemente emplean el proceso
de transferencia de energía de fluorescencia (FET) en lugar de la
detección directa de la intensidad de fluorescencia. La
transferencia de energía de fluorescencia se produce entre un
fluoróforo donador y un cromóforo desactivador (que puede o no ser
un fluoróforo) cuando el espectro de absorción de uno (el
desactivador) se solapa con el espectro de emisión del otro (el
donador) y los dos cromóforos se encuentran muy próximos. Los
cromóforos con estas propiedades reciben el nombre de pares
cromóforos donador/desactivador o pares cromóforos de transferencia
de energía. La energía del estado excitado del fluoróforo donador
se transfiere mediante una interacción de resonancia
dipolo-dipolo inducido al desactivador próximo.
Esto da como resultado la desactivación de la fluorescencia del
donador. En algunos casos, si el desactivador es también un
fluoróforo, se puede potenciar la intensidad de su fluorescencia.
La eficiencia de la transferencia de energía depende en gran medida
de la distancia entre el donador y el desactivador, y Förster
(1948. Ann. Phys. 2, 55-57) ha desarrollado
unas ecuaciones que predicen estas relaciones. La distancia entre
los cromóforos donador y desactivador a la que la eficiencia de la
transferencia de energía es del 50% se denomina distancia de
Förster (R_{0}). También se conocen otros mecanismos para la
desactivación de la fluorescencia, incluyendo, por ejemplo, la
desactivación por transferencia de carga y por colisión.
La transferencia de energía y otros mecanismos
que se basan en la interacción entre dos cromóforos muy próximos
para producir la desactivación constituyen un medio atractivo para
la detección o identificación de secuencias de nucleótidos, puesto
que dichos ensayos se pueden llevar a cabo en diseños homogéneos.
Los diseños homogéneos de ensayo son más sencillos que los ensayos
convencionales de hibridación de sondas basados en la detección de
la fluorescencia de un único marcador fluoróforo, puesto que los
ensayos heterogéneos requieren generalmente pasos adicionales para
separar el marcador hibridado del marcador libre. Típicamente, la
FET y los métodos relacionados se han basado en la monitorización
de un cambio en las propiedades de fluorescencia de uno o de los
dos marcadores cromóforos cuando se ponen en proximidad debido a la
hibridación de dos oligonucleótidos complementarios. En este
diseño, se puede medir el cambio en las propiedades de fluorescencia
como un cambio en la magnitud de la transferencia de energía o como
un cambio en la magnitud de la desactivación de la fluorescencia,
indicado, típicamente, por un aumento en la intensidad de la
fluorescencia de uno de los cromóforos. De esta forma, se puede
detectar la secuencia de nucleótido buscada sin separación de los
oligonucleótidos hibridados y no hibridados. La hibridación se
puede producir entre dos oligonucleótidos complementarios separados,
uno de los cuales se encuentra marcado con el fluoróforo donador y
el otro marcado con el desactivador. En la forma bicatenaria la
fluorescencia del donador es menor (mayor desactivación) y/o la
transferencia de energía es mayor en comparación con los
oligonucleótidos monocatenarios. En Nonisotopic DNA Probe
Techniques (1992. Academic Press, Inc. pgs.
311-352) se revisan diversos diseños para los
ensayos de hibridación FET. Como alternativa, el donador y el
desactivador se pueden encontrar unidos a un único oligonucleótido,
de tal modo que existe una diferencia detectable en las propiedades
de fluorescencia de uno de ellos o ambos cuando el oligonucleótido
no se hibrida frente a cuando sí se hibrida con su secuencia
complementaria. En este diseño, la fluorescencia del donador
típicamente aumenta y la transferencia de energía/desactivación
disminuye cuando el oligonucleótido se ha hibridado. Por ejemplo,
un oligonucleótido autocomplementario marcado en cada extremo puede
formar una horquilla que sitúe a los dos fluoróforos (es decir, los
extremos 5' y 3') en estrecha proximidad espacial, de modo que se
puedan llevar a cabo la transferencia de energía y la desactivación.
La hibridación del oligonucleótido autocomplementario con su
secuencia complementaria en un segundo oligonucleótido escinde la
horquilla y hace crecer la distancia entre los dos cromóforos,
reduciendo así la desactivación. Una desventaja de la estructura en
horquilla es que es muy estable y la conversión a la forma hibridada
no desactivada es con frecuencia lenta y solo moderadamente
favorecida, dando como resultado generalmente un pobre
funcionamiento. Tyagi y Kramer (1996. Nature Biotech. 14,
303-308) describen una horquilla marcada como se ha
descrito más arriba que contiene una secuencia detectora en el lazo
entre los brazos autocomplementarios de la horquilla que forman el
tronco. El tronco de bases apareadas se debe fundir para que la
secuencia detectora se hibride con la diana y dé lugar a una
reducción de la desactivación. B. Bagwell, y otros (1994. Nucl.
Acids Res. 22, 2424-2425; Patente de los
Estados Unidos nº 5.607.834) describen una sonda de "doble
horquilla" y métodos para utilizarla. Estas estructuras
contienen la secuencia de unión a la diana dentro de la horquilla y,
en consecuencia, implican la hibridación competitiva entre la diana
y las secuencias autocomplementarias de la horquilla. Bagwell
resuelve el problema de la cinética desfavorable de hibridación
desestabilizando la horquilla con desemparejamiento.
También se han descrito métodos homogéneos que
emplean la transferencia de energía u otros mecanismos de
desactivación de la fluorescencia para la detección de la
amplificación de ácidos nucleicos. L.G. Lee, y otros (1993. Nuc.
Acids Res. 21, 3761-3766) divulgan un método
para la detección en tiempo real en el cual una sonda detectora
doblemente marcada se divide de una forma específica de la
amplificación de sondas durante la PCR. La sonda detectora se
hibrida aguas abajo del cebador de amplificación, de forma que la
actividad exonucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq
digiere a la sonda detectora, separando dos cromóforos fluorescentes
que forman un par de transferencia de energía. La intensidad de la
fluorescencia aumenta a medida que la sonda se divide.
Para la detección homogénea de la amplificación
de ácidos nucleicos, se han descrito cebadores señal (también
denominados en ocasiones sondas detectoras) que se hibridan con la
secuencia diana aguas abajo del sitio de hibridación de los
cebadores de amplificación (Patente de los Estados Unidos nº
5.547.861). El cebador señal es extendido por la polimerasa de una
manera similar a la extensión de los cebadores de amplificación. La
extensión del cebador de amplificación desplaza al producto de la
extensión del cebador señal de una forma que depende de la
amplificación de la diana, dando lugar a un producto de
amplificación secundario monocatenario que se puede detectar, como
una indicación de la amplificación de la diana. En la Patente de los
Estados Unidos nº 5.550.025 (incorporación de cromóforos
lipofílicos y sitios de restricción) y en la Patente de los Estados
Unidos nº 5.593.867 (detección de la polarización de la
fluorescencia) se describen ejemplos de métodos de detección
homogéneos para ser utilizados con cebadores señal monocatenarios.
Más recientemente, se han adaptado cebadores señal para la
detección de dianas de ácidos nucleicos utilizando métodos FET. La
Patente de los Estados Unidos nº 5.691.145 divulga estructuras de
cuartetos de guanina que contienen pares cromóforos
donador/desactivador adosados al extremo 5' de la secuencia de
unión a la diana de un cebador señal monocatenario. La síntesis de
la hebra complementaria durante la amplificación de la diana
despliega el cuarteto de guanina, aumentando la distancia entre los
cromóforos donador y desactivador y dando como resultado un aumento
detectable de la fluorescencia del donador. También se han descrito
recientemente cebadores señal parcialmente monocatenarios y
parcialmente bicatenarios, marcados con pares de cromóforos
donador/desactivador. Por ejemplo, el documento EP 0 878 554
divulga cebadores señal con pares de cromóforos donador/desactivador
flanqueando el sitio de reconocimiento de una endonucleasa de
restricción monocatenaria. En presencia de la diana, el sitio de
restricción se convierte en bicatenario y escindible por la
endonucleasa de restricción. La división separa el par de
cromóforos y reduce la desactivación del donador. El documento EP 0
881 302 describe cebadores señal con una estructura de bases
intramolecularmente apareadas adosada a los mismos. El cromóforo
donador de un par de cromóforos donador/desactivador ligado a la
estructura de bases intramolecularmente apareadas se desactiva
cuando la estructura se pliega, pero se sintetiza en presencia de
una secuencia diana complementaria de la estructura de bases
intramolecularmente apareadas. Esto despliega la estructura de bases
intramolecularmente apareadas y separa los cromóforos donador y
desactivador, dando como resultado una disminución de la
desactivación del donador. Nazarenko, y otros (Patente de los
Estados Unidos nº 5.866.336) describen un método similar en el que
los cebadores de amplificación se configuran con estructuras en
horquilla que transportan pares cromóforos
donador/desactivador.
La transferencia de energía y otros métodos de
detección de la desactivación de la fluorescencia se han aplicado
también a la detección de una secuencia diana mediante hibridación
de una sonda específica. La patente japonesa nº 93015439 B divulga
unos métodos para medir polinucleótidos hibridando la diana
monocatenaria con una sonda de polinucleótido monocatenaria
etiquetada con dos marcadores que constituyen un par de
transferencia de energía. El híbrido bicatenario se divide entre
los marcadores mediante una enzima de restricción y se mide la
fluorescencia de uno de los marcadores. Una desventaja de este
método consiste en que el sitio de restricción en la sonda también
debe encontrarse presente en la secuencia diana que se desea
detectar. S.S.Ghosh, y otros, (1994. Nucl. Acids Res. 22,
3155-3159) describen la división catalizada por
enzimas de restricción de oligonucleótidos marcados con un
fluoróforo que se analizan utilizando transferencia de energía de
resonancia fluorescente. En estos ensayos, se hibridan los
oligonucleótidos complementarios para producir el sitio de
restricción bicatenario, con uno de los marcadores fluorescentes
unido a cada una de las dos hebras.
Yagi S y Craigmore FR (1996. Nature
Biotechnology 14:303-307) describen sondas útiles
para la detección de ácidos nucleicos específicos en soluciones
homogéneas. Dichas sondas están compuestas por una molécula de
ácido nucleico monocatenaria que tiene una estructura de
tallo-bucle. La porción bucle de la molécula es una
secuencia sonda complementaria de una secuencia de ácido nucleico
diana predeterminada. La porción tallo de la molécula tiene una
porción de donador de fluorescencia y una parte de desactivador que
se mantienen muy próximas en la estructura de
tallo-bucle. La hibridación de la sonda con la diana
da lugar a un cambio de conformación de la sonda que hace que las
dos porciones se separen, ocasionando que la porción donador emita
una señal de fluorescencia.
La presente invención utiliza una sonda
detectora para la detección de secuencias diana de ácidos nucleicos.
La sonda detectora comprende dos oligonucleótidos y es parcialmente
monocatenaria y parcialmente bicatenaria. El primer oligonucleótido
recibe el nombre de oligonucleótido adaptador. El oligonucleótido
adaptador se hibrida con un segundo oligonucleótido complementario
de modo que el extremo 3' del oligonucleótido adaptador forme una
región cola monocatenaria que se hibrida con la secuencia diana. La
porción de la cola 3' monocatenaria que se hibrida con la secuencia
diana recibe el nombre de secuencia de unión a la diana. La región
del oligonucleótido adaptador que es 5' para la secuencia de unión
a la diana y la cola monocatenaria 3' se hibrida con el segundo
oligonucleótido para formar una molécula de cebador de señal
parcialmente bicatenaria con bases intermolecularmente apareadas
bajo las condiciones de reacción elegidas para la hibridación de la
sonda detectora con la diana. La secuencia del oligonucleótido
adaptador con la que se hibrida el segundo oligonucleótido (la
secuencia 5' del adaptador) contiene una secuencia que no se
hibrida con la diana. La secuencia 5' del adaptador se puede elegir
de modo que sea la misma en una diversidad de oligonucleótidos
adaptadores con diferentes secuencias de unión a la diana (es
decir, una secuencia 5' "universal" del adaptador). Esto
simplifica la detección de una variedad de dianas diferentes, como
se describe más abajo.
Por lo tanto, el método de la presente invención
tiene la ventaja de que se puede utilizar una única sonda donadora
marcada (descrita más abajo) para la detección de una variedad de
secuencias diana diferentes, ya que se puede adosar una secuencia
común 5' del adaptador para la hibridación con un segundo
oligonucleótido a diferentes secuencias de unión a la diana en el
oligonucleótido adaptador. Esto simplifica la síntesis de sondas
donadoras y reduce el coste asociado. Aunque los oligonucleótidos
adaptadores pueden tener diversas secuencias de unión a la diana
para el reconocimiento de diferentes dianas, son más fáciles y menos
costosos de sintetizar que las sondas donadoras ya que no requieren
ser marcados para su utilización en la presente invención.
La Figura 1 ilustra la detección de una
secuencia diana de ácido nucleico en una reacción de Amplificación
por Desplazamiento de Hebra (SDA), que no forma parte de la
invención reivindicada, en donde el segundo oligonucleótido del
cebador señal es una sonda donadora.
La Figura 2 ilustra la detección de una
secuencia diana de ácido nucleico en una reacción SDA, en la que el
segundo oligonucleótido del cebador señal es una sonda no
marcada.
La Figura 3 muestra los resultados del Ejemplo
1, utilizando una sonda donadora que contiene una secuencia que,
cuando no se hibrida con una secuencia complementaria, forma
espontáneamente una estructura de horquilla.
La Figura 4 muestra los resultados del Ejemplo
2, utilizando una sonda donadora que contiene una secuencia que,
cuando no se hibrida con una secuencia complementaria, forma
espontáneamente un cuarteto de guanina.
Ciertos términos utilizados en la presente
invención se definen como sigue:
Un cebador de amplificación es un cebador para
la amplificación de una secuencia diana mediante extensión del
cebador. Para la SDA, el extremo 3' del cebador de amplificación (la
secuencia de unión a la diana) se hibrida con el extremo 3' de la
secuencia diana. El cebador de amplificación contiene un sitio de
reconocimiento para una endonucleasa de restricción próximo a su
extremo 5'. El sitio de reconocimiento es para una endonucleasa de
restricción que separará una hebra de un ADN dúplex cuando el sitio
de reconocimiento sea semimodificado ("nicking"), como se
describe en la Patente de los Estados Unidos nº 5.455.166, la
Patente de los Estados Unidos nº 5.270.184 y en el documento EP 0
684 315. Un sitio de reconocimiento semimodificado es un sitio de
reconocimiento bicatenario para una endonucleasa de restricción en
el cual una hebra contiene al menos un nucleótido derivatizado que
hace que la endonucleasa de restricción corte una de las dos hebras
en lugar de separar las dos hebras del sitio de reconocimiento. El
cebador de amplificación también contiene un grupo
3'-OH que es extensible por la ADN polimerasa cuando
la secuencia de unión a la diana del cebador de amplificación se
hibrida con la secuencia diana. Durante la mayor parte de la
reacción SDA, el cebador de amplificación es responsable de la
amplificación exponencial de la secuencia diana.
Puesto que no se necesitan secuencias o
estructuras especiales para llevar a cabo la reacción de
amplificación, los cebadores de amplificación para la PCR pueden
consistir únicamente en secuencias de unión a la diana. Por el
contrario, los cebadores de amplificación para la 3SR y la NASBA
contienen un promotor de la ARN polimerasa próximo al extremo 5'.
El promotor se adosa a la secuencia diana y sirve para guiar la
reacción de amplificación dirigiendo la transcripción de múltiples
copias del ARN de la diana.
Los productos de la extensión son ácidos
nucleicos que contienen un cebador o un fragmento de un cebador y
una hebra recién sintetizada que es el complemento de la secuencia
diana aguas abajo del sitio de unión del cebador. Los productos de
extensión son el resultado de la hibridación de un cebador con una
secuencia diana y de la extensión del cebador por la polimerasa
utilizando la secuencia diana como modelo.
Los términos diana o secuencia diana se refieran
a las secuencias de ácido nucleico que se desea amplificar o
detectar. Incluyen la secuencia de ácido nucleico original que se
desea amplificar, su segunda hebra complementaria y cualquiera de
las hebras de una copia de la secuencia original producida por
replicación o amplificación. También se puede hacer referencia a la
secuencia diana como modelo para la extensión de cebadores
hibridados.
El método según la presente invención utiliza
dos oligonucleótidos. En la sonda detectora, los oligonucleótidos
están hibridados de forma que el primer oligonucleótido (el
oligonucleótido adaptador) forma una "cola" 3' monocatenaria
que se hibrida con la secuencia diana (la secuencia de unión a la
diana). Un segundo oligonucleótido se une mediante apareamiento de
bases (es decir, se hibrida) con una secuencia adaptadora 5' en el
primer oligonucleótido que sea adyacente y 5' respecto a la
secuencia de unión a la diana. Tal como se utiliza en la presente
invención, el término "adyacente y 5' respecto a la secuencia de
unión a la diana" significa que la totalidad o una parte de la
secuencia de unión a la diana tiene una sola hebra izquierda en la
cola 3' y está disponible para hibridarse con la diana. Esto es, un
fragmento de la secuencia de unión a la diana puede formar parte
del apareamiento intermolecular de bases de la porción adyacente
bicatenaria o la secuencia de unión a la diana completa puede
constituir una cola 3' monocatenaria en la sonda detectora. El resto
de la porción bicatenaria de la sonda detectora no es
complementario de la diana. Los emparejamientos incorrectos en la
porción de bases intermolecularmente apareadas de la sonda detectora
pueden reducir la magnitud del cambio en la fluorescencia en
presencia de la diana, pero son aceptables si no es importante la
sensibilidad del ensayo. También son aceptables los emparejamientos
incorrectos en la secuencia de unión a la diana de la cola
monocatenaria y se pueden utilizar para detectar polimorfismos de un
único nucleótido, pero igualmente pueden reducir la sensibilidad
y/o especificidad del ensayo bajo ciertas circunstancias. Por el
contrario, el apareamiento perfecto en las secuencias que
participan en la hibridación mejora la especificidad del ensayo sin
efectos negativos significativos sobre la cinética de la
reacción.
Alternativamente, las sondas donadoras
utilizadas en la invención no necesitan hibridarse con el
oligonucleótido adaptador. En un segundo modo de realización, la
sonda detectora contiene un oligonucleótido adaptador hibridado con
un segundo oligonucleótido no marcado. También se encuentra presente
una sonda donadora no hibridada en su forma plegada, desactivada.
El segundo oligonucleótido no marcado y la sonda donadora son
suficientemente complementarios en sus secuencias, por lo que se
hibridarán bajo las condiciones de reacción elegidas. La rotura
condicionada por la diana de la porción dúplex de la sonda detectora
con separación del segundo oligonucleótido no marcado permite al
segundo oligonucleótido no marcado, que ahora es monocatenario,
hibridarse con sus secuencias complementarias en la sonda donadora.
Antes de la hibridación con el segundo oligonucleótido no marcado
desplazado, la sonda donadora se pliega en una estructura
secundaria ordenada, en un arrollamiento aleatorio u otra
conformación que sitúa a los cromóforos donador y desactivador en
estrecha proximidad espacial e incrementa la desactivación del
donador. La hibridación con el segundo oligonucleótido no marcado
estira o despliega la sonda donadora de modo que la distancia entre
los dos cromóforos aumenta y se reduce la desactivación de la
fluorescencia. La desactivación reducida da lugar a un cambio
detectable en un parámetro de fluorescencia tanto del donador como
del desactivador, que se puede detectar como indicación de la
presencia de la secuencia diana. Los dos miembros del par de
cromóforos pueden estar unidos a secuencias en la sonda donadora que
participan en la hibridación con el segundo oligonucleótido no
marcado desplazado, o uno de los miembros del par de cromóforos
puede estar unido a una porción de la sonda donadora que no está
hibridada con el segundo oligonucleótido no marcado, por ejemplo,
en una cola monocatenaria de la sonda donadora o en una secuencia
interna que no es complementaria del segundo oligonucleótido no
marcado.
Un fluoróforo donador y su desactivador
correspondiente pueden estar unidos a la sonda donadora en
cualesquiera posiciones relativas que no inhiban su hibridación con
el oligonucleótido adaptador o con una sonda no marcada (como se
describe más abajo), que den como resultado una fluorescencia
detectable del donador cuando la sonda donadora se hibrida con el
adaptador o con la sonda no marcada, y que produzcan un cambio en un
parámetro de fluorescencia cuando la sonda donadora cambia entre
los estados de plegamiento e hibridado. En el modo de realización
de la invención en el que la sonda donadora se hibrida con el
oligonucleótido adaptador en la sonda detectora, la rotura
condicionada por la diana del dúplex con separación de los
oligonucleótidos apareados por las bases permite a la sonda
donadora plegarse en una estructura secundaria ordenada, en un
arrollamiento aleatorio u otra conformación que sitúa a los
cromóforos donador y desactivador en estrecha proximidad espacial e
incrementa la desactivación del donador. La mayor desactivación da
lugar a un cambio detectable en un parámetro de fluorescencia tanto
del donador como del desactivador, que se puede detectar como
indicación de la presencia de la secuencia diana. Los dos miembros
del par de cromóforos pueden estar unidos a secuencias que
participan en la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares
en la porción bicatenaria de la sonda detectora. Alternativamente,
un miembro del par puede estar unido a una porción de la sonda
donadora que no se haya hibridado con el adaptador, por ejemplo, en
una cola 3' monocatenaria de la sonda donadora que no es
complementaria de ninguno de los oligonucleótidos diana o
adaptador.
En general, la longitud total de las secuencias
involucradas en el apareamiento intermolecular de bases entre el
adaptador y el oligonucleótido no marcado o la sonda donadora, o
entre el segundo oligonucleótido no marcado y la sonda donadora, no
es crítica. La longitud apropiada está determina por el número de
nucleótidos necesarios para que el apareamiento de bases estable
mantenga una molécula parcialmente bicatenaria bajo las condiciones
de reacción elegidas. Por conveniencia, las secuencias involucradas
en el apareamiento de bases tiene típicamente una longitud entre
aproximadamente 8 y 75 nucleótidos. La longitud máxima está limitada
únicamente por consideraciones prácticas, como, por ejemplo, la
facilidad y eficiencia de la síntesis y recuperación de los
oligonucleótidos.
La secuencia de la región bicatenaria de la
sonda detectora se elige de modo que al menos una porción de la
misma no sea complementaria de la diana y de forma que sea
relativamente estable a la temperatura de la reacción que sirve
para romperla. No obstante, no debe ser tan estable como para que la
hibridación con la diana sea inaceptablemente lenta, o tan estable
que la polimerasa no sea capaz de desplazar al segundo
oligonucleótido del oligonucleótido adaptador para la síntesis de
la hebra complementaria. Preferiblemente, la T_{m} de la porción
bicatenaria de la sonda detectora que implica la hibridación entre
el primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido es igual o
mayor que la temperatura a la que tendrá lugar la reacción de
desplazamiento, pero puede ser inferior. Si la T_{m} de este
segmento es menor que la temperatura de la reacción, más de la
mitad de las moléculas de ácidos nucleicos detectoras serán
totalmente monocatenarias, independientemente de la presencia de la
diana. Esto reduce la sensibilidad del ensayo, pero puede ser
aceptable cuando se encuentran presentes cantidades relativamente
altas de la diana. Típicamente, la T_{m} de la porción bicatenaria
de la sonda detectora que implica la hibridación entre el primer
oligonucleótido y un segundo oligonucleótido se elige para que sea
igual a o hasta aproximadamente 30ºC más alta que la temperatura de
la reacción que desplaza al segundo oligonucleótido. Más
preferiblemente, la T_{m} es aproximadamente
10-20ºC más alta que la de la reacción que desplaza
al segundo oligonucleótido.
El segundo oligonucleótido (sea una sonda
donadora o un segundo oligonucleótido no marcado) se elige de modo
que cuando se hibride con el oligonucleótido adaptador, una porción
del oligonucleótido adaptador permanezca con una hebra en forma de
"cola" 3'. La porción de cola monocatenaria de la sonda
detectora es complementaria de la secuencia diana que se desea
detectar y sirve para hibridar la sonda detectora con la secuencia
diana. La secuencia de la cola se elige preferiblemente de modo que
forme un dúplex estable con la diana bajo las condiciones de
reacción elegidas y proporcione el grado deseado de especificidad de
detección conocido en la técnica. Para favorecer la hibridación con
la diana, la secuencia de la región de la cola de unión de la diana
monocatenaria del primer oligonucleótido también se elige
preferiblemente de modo que la T_{m} de la secuencia de unión a
la diana/dúplex diana sea igual o mayor que la temperatura de la
reacción. Aunque la secuencia de la región de unión a la diana está
dictada por la secuencia de la diana que se desea detectar, los
ajustes de la T_{m} de la secuencia de unión a la diana del ácido
nucleico detector se pueden realizar, por ejemplo, regulando su
longitud.
Las sondas detectoras se pueden utilizar como
cebadores señal en las reacciones de amplificación para dar lugar a
productos secundarios de la amplificación, acompañados por un cambio
en un parámetro de fluorescencia, como se describe en la Patente de
los Estados Unidos nº 5.547.861. La cola monocatenaria del cebador
señal, que comprende el extremo 3' del oligonucleótido adaptador,
permite la extensión del cebador. En la Fig. 1 se ilustra con más
detalle la utilización de cebadores señal en una reacción de
amplificación de un ácido nucleico según un primer modo de
realización de la invención, que se puede resumir como sigue. En
este primer modo de realización, el segundo oligonucleótido es una
sonda donadora que comprende un par cromóforo donador/desactivador
unido a la misma de tal modo que los miembros del par están
espacialmente separados y la fluorescencia del donador es
detectable cuando la sonda donadora se hibrida con el adaptador. A
través de la cola monocatenaria del adaptador, el cebador señal se
hibrida con una de las hebras de la secuencia diana aguas abajo del
cebador de amplificación. Tanto el cebador de amplificación como el
oligonucleótido adaptador del cebador señal son extendidos por la
ADN polimerasa utilizando la secuencia diana como modelo. El primer
producto de la extensión del cebador señal, con la sonda donadora
todavía hibridada con él, es desplazado del modelo por la extensión
del cebador de amplificación aguas arriba. El cebador señal todavía
es parcialmente bicatenario tras el desplazamiento del primer
producto de la extensión del cebador señal de la diana. El cebador
señal extendido desplazado sirve a su vez como modelo para la
hibridación y extensión de un segundo cebador de amplificación,
convirtiendo inicialmente en bicatenaria la porción monocatenaria
producto de la extensión del cebador señal. La posterior
polimerización de una nueva hebra complementaria de la del adaptador
también desplaza la sonda donadora del adaptador debido a la
actividad de desplazamiento de hebras de la polimerasa. Como la
sonda donadora contiene una secuencia que se pliega espontáneamente
en una estructura secundaria ordenada, en un arrollamiento aleatorio
u otra conformación que sitúa al donador y al desactivador en
estrecha proximidad espacial, la separación del oligonucleótido
adaptador permite que tenga lugar dicho plegamiento. Por
consiguiente, la desactivación de la fluorescencia aumenta y se
puede detectar un cambio en cualquiera de los parámetros de
fluorescencia apropiados, asociado al cambio en la magnitud de la
desactivación de la fluorescencia, como indicación de la
amplificación de la secuencia diana.
En la reacción se puede incluir, opcionalmente,
un segundo cebador señal que se hibrida con la segunda hebra
complementaria de una secuencia diana bicatenaria. El segundo
cebador señal se hibrida con la segunda hebra de la secuencia diana
aguas debajo del segundo cebador de amplificación y es extendido y
desplazado por la extensión del segundo cebador de amplificación.
La porción monocatenaria del producto de la extensión del segundo
cebador señal se convierte en bicatenaria por la hibridación y
extensión del primer cebador de amplificación, dando como resultado
el desplazamiento de la sonda donadora.
El esquema de la reacción descrita más arriba e
ilustrada en la Fig. 1 es el mismo cuando el segundo oligonucleótido
no está marcado. Sin embargo, la separación del segundo
oligonucleótido no marcado, condicionada por la diana, del
oligonucleótido adaptador no es detectable directamente. Como se
muestra en la Fig. 2, la separación del segundo oligonucleótido no
marcado del adaptador se detecta mediante la hibridación con una
sonda donadora que se encuentra presente en su forma plegada y
desactivada. La hibridación de la sonda no marcada con la sonda
donadora complementaria hace que la sonda donadora se despliegue o
estire, aumentando la distancia entre los cromóforos donador y
desactivador y reduciendo la desactivación de la fluorescencia. La
hibridación entre el segundo oligonucleótido y la sonda donadora,
que es una indicación de la presencia de la diana, se detecta como
un cambio en un parámetro de fluorescencia asociado a un cambio en
la magnitud de la desactivación de la fluorescencia.
Si se desea, en cualquiera de los modos de
realización se pueden emplear múltiples sondas detectoras por cada
hebra de la diana, cada una de las cuales se hibrida con la
secuencia diana aguas abajo de la otra en la misma hebra, con todos
los cebadores señal siendo hibridados aguas abajo del cebador de
amplificación. De este modo, cada cebador señal es desplazado por
extensión del ácido nucleico detector aguas arriba y el cebador
señal más cercano al extremo 5' es desplazado por el cebador de
amplificación. La utilización de múltiples cebadores señal tiene la
ventaja de aumentar o amplificar la señal generada por la diana, con
un incremento en la sensibilidad del ensayo.
También se pueden utilizar múltiples sondas
detectoras para detectar simultáneamente una pluralidad de
secuencias diana diferentes. En este caso, la secuencia adaptadora
5' del oligonucleótido adaptador es preferiblemente diferente para
cada diana que se vaya a detectar. Marcando sondas donadoras
específicamente para la secuencia 5' del adaptador de cada
oligonucleótido adaptador específico de una diana con pares de
cromóforos donador/desactivador que sean distinguibles, se puede
determinar la presencia de cada diana detectando cambios en la
magnitud de la desactivación de la fluorescencia en la sonda
donadora dirigida a cada diana.
Como se muestra en las Figs. 1 y 2, la porción
monocatenaria de la sonda detectora se convierte en la forma
bicatenaria por la hibridación y extensión de un cebador de
amplificación. El desplazamiento de la hebra por la polimerasa
también desplaza a la sonda donadora o al segundo oligonucleótido no
marcado del oligonucleótido adaptador, a medida que la polimerasa
sintetiza su hebra complementaria. A medida que la actividad de
desplazamiento de la hebra separa una sonda donadora del
oligonucleótido adaptador, la sonda donadora se pliega y la
distancia entre los cromóforos donador y desactivador disminuye,
aumentado en consecuencia la desactivación de la fluorescencia del
donador. Es decir, la sonda donadora monocatenaria desplazada
producida de este modo es libre para autohibridarse o, por el
contrario, interaccionar intramolecularmente para situar a los
cromóforos en estrecha proximidad espacial. Si el oligonucleótido
monocatenario desplazado es un segundo oligonucleótido no marcado,
queda libre para hibridarse con una sonda donadora que se encuentre
plegada en estado desactivado, tanto en solución como unida a una
fase sólida. La hibridación del segundo oligonucleótido no marcado
desplazado con la sonda donadora hace que esta se despliegue, al
menos parcialmente, incrementando por consiguiente la distancia
entre el donador y el desactivador y reduciendo la desactivación de
la fluorescencia del donador. En cualquiera de los modos de
realización, el cambio en la fluorescencia del cromóforo donador o
del desactivador se puede monitorizar o detectar como una
indicación de la amplificación de la secuencia diana. Para el
desplazamiento de una sonda donadora, se puede detectar y/o
monitorizar una disminución en la intensidad de la fluorescencia del
donador o un aumento en la intensidad de la fluorescencia del
desactivador como una indicación de que se está produciendo o se ha
producido la amplificación de la diana. Para el desplazamiento de un
segundo oligonucleótido no marcado, se puede detectar y/o
monitorizar un aumento en la intensidad de la fluorescencia del
donador o una disminución en la intensidad de la fluorescencia del
desactivador como una indicación de que se está produciendo o se ha
producido la amplificación de la diana. En cualquiera de los modos
de realización, también se pueden monitorizar otros parámetros de
fluorescencia que se ven afectados por la proximidad del fluoróforo
donador y su desactivador (p.e., la duración de la fluorescencia o
un cambio en un indicador de las intensidades de fluorescencia del
donador y/o del receptor).
Quedará claro que, además de la SDA, la sonda
detectora se puede adaptar para ser utilizada como cebador señal en
otros métodos de amplificación y extensión del cebador (p.e., PCR,
3SR, TMA o NASBA). Por ejemplo, los métodos se pueden adaptar para
ser utilizados en la PCR utilizando cebadores de amplificación PCR y
una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra que carezca de
actividad exonucleasa 5'\rightarrow3' (p.e., Sequencing Grade Taq
de Promega, o exo^{-} Vent o exo^{-} Deep Vent de New England
BioLabs) en la PCR. Los cebadores señal se hibridan con la diana
aguas debajo de los cebadores de amplificación de la PCR. Son
extendidos, desplazados de la diana y convertidos en bicatenarios
con desplazamiento de la sonda donadora o del segundo
oligonucleótido no marcado esencialmente como se ha descrito para
la SDA. Como en los sistemas SDA, el desplazamiento de la sonda
donadora o del segundo oligonucleótido no marcado da lugar a un
cambio en la proximidad de los pares de cromóforos
donador/desactivador y modifica el nivel de desactivación de la
fluorescencia. Un cambio asociado en un parámetro de fluorescencia,
como, por ejemplo, la intensidad, sirve como una indicación de la
amplificación de la diana.
Para la adaptación de los métodos inventivos a
la 3SR, TMA o NASBA, se utiliza una transcriptasa inversa deficiente
en la actividad exonucleasa 5'\rightarrow3' con actividad de
desplazamiento de hebra, con hibridación del cebador señal con el
ARN diana aguas debajo de un cebador de amplificación que contenga
un promotor de ARN polimerasa. En un esquema de reacción similar al
que se ha descrito previamente, el cebador señal hibridado que
comprende la sonda donadora o el segundo oligonucleótido no marcado
hibridados es 1) extendido, y 2) desplazado por extensión del
cebador de amplificación aguas arriba. El producto de la extensión
desplazado se hace entonces completamente bicatenario mediante
hibridación y extensión del segundo cebador de amplificación. Este
desplaza a la sonda donadora o al segundo oligonucleótido no
marcado del oligonucleótido adaptador del cebador señal, alterando
la distancia entre los cromóforos donador y desactivador de una
sonda donadora y dando como resultado un cambio en el nivel de
desactivación de la fluorescencia del fluoróforo donador. El cebador
señal para la 3SR o la NASBA no contiene una secuencia promotora de
la ARN polimerasa y, por lo tanto, no puede funcionar como un
cebador de amplificación, reduciendo la señal de fondo no
específica. Esto es análogo al cebador señal en la SDA, que no
contiene un RERS que se pueda cortar y, por lo tanto, no contribuye
significativamente a la amplificación exponencial de fondo de
dianas no específicas.
Para un trasfondo reducido, se prefiere que los
cebadores señal de la invención se utilicen como se ha descrito más
arriba, de modo que el producto de la extensión del cebador señal
sea separado de la secuencia diana por desplazamiento debido a la
extensión del cebador de amplificación aguas arriba. No obstante,
quedará claro que los cebadores de amplificación conocidos para ser
utilizados en las diversas reacciones de amplificación de ácidos
nucleicos también se pueden modificar mediante la adición de una
secuencia 5' de bases intermolecularmente apareadas, como se ha
descrito para los cebadores señal de la invención. En este modo de
realización, el producto de la extensión del cebador de
amplificación, con la porción bicatenaria 5', se puede separar de la
secuencia diana por desplazamiento debido a la extensión de un
cebador de no-amplificación aguas arriba (p.e.,
cebadores bumper, como en la SDA), por desnaturalización (p.e.,
mediante calor, como en la PCR) o por digestión enzimática de la
hebra diana (p.e., RNasa H, como en la 3SR). Los cebadores de
amplificación que contienen la porción bicatenaria 5' y el par de
cromóforos donador/desactivador, hacen que no sea necesario el
cebador señal adicional en la reacción, pero en este modo de
realización la sensibilidad del ensayo puede disminuir debido a que
el trasfondo puede ser más alto.
Para la PCR, el cebador de amplificación se
modifica para que sea un oligonucleótido adaptador mediante la
adición de secuencias 5' a la secuencia de unión a la diana,
complementarias de la sonda donadora o del segundo oligonucleótido
no marcado. A continuación, la sonda donadora o el segundo
oligonucleótido no marcado se hibridan con la secuencia 5' añadida.
Este cebador es estructuralmente idéntico al cebador señal de la PCR
descrito más arriba. Funcionalmente, sin embargo, es diferente por
el hecho de que no hay un cebador aguas abajo para ser extendido y
desplazado y es el propio cebador de amplificación el que produce el
cambio en la fluorescencia. Para la 3SR, la NASBA y la TMA, la
secuencia complementaria del segundo nucleótido se puede colocar en
el extremo 5' respecto al promotor de un cebador de amplificación y
el segundo oligonucleótido hibridarse con ella, de modo que el
segundo oligonucleótido sea desplazado y el oligonucleótido
adaptador se convierta completamente en bicatenario en la porción
del ADN bicatenario del ciclo de amplificación. Un segundo cebador
de amplificación que no contenga una secuencia promotora (p.e.,
como en la NASBA) puede contener también, o alternativamente, las
secuencias complementarias del segundo oligonucleótido hibridado 5'
respecto a la secuencia de unión a la diana.
En otro modo de realización alternativo, la
sonda detectora se puede utilizar en diseños de ensayo basados en
la no amplificación para detectar oligonucleótidos diana. En un
primer modo de realización sin amplificación, la secuencia
monocatenaria de unión a la diana 3' del adaptador se hibrida con el
extremo 3' del oligonucleótido diana, de modo que la porción dúplex
de bases apareadas del cebador señal forme un protuberante 5'. La
secuencia diana funciona como cebador en una reacción de extensión
del cebador para sintetizar una hebra complementaria al
oligonucleótido adaptador utilizando una polimerasa de
desplazamiento de hebra que extiende la secuencia diana utilizando
el protuberante 5' (es decir, la secuencia del adaptador que está
apareada por las bases al segundo oligonucleótido) como modelo. Si
la secuencia de unión a la diana del ácido nucleico detector se
hibrida solo con una porción de la secuencia diana, la secuencia
diana también forma un protuberante 5' y el oligonucleótido
adaptador del cebador señal es extendido del mismo modo utilizando
el protuberante 5' de la diana como modelo. Si la secuencia de
unión a la diana del cebador señal es complementaria de la secuencia
diana en toda su longitud, sólo se extiende la diana. En todo caso,
el segundo oligonucleótido del cebador señal es desplazado de este
modo del adaptador, junto con un cambio en un parámetro de
fluorescencia como se ha descrito más arriba. La extensión con
desplazamiento del segundo oligonucleótido para producir un cambio
en la fluorescencia sólo puede tener lugar en presencia de la
diana.
diana.
Es una característica de la invención que no se
requiera inicialmente la diana para hibridarse con las secuencias
de bases apareadas en el ácido nucleico detector. En muchos ensayos
de la técnica anterior, la hibridación inicial en competencia
reduce la afinidad de una sonda o de un cebador por la diana y
reduce la sensibilidad del ensayo. Por el contrario, la unión
inicial sin competencia de los cebadores señal de la invención
favorece más la hibridación intermolecular en cualquier reacción de
hibridación en competencia subsiguiente. La longitud de la cola 3'
monocatenaria se puede ajustar sin afectar a las propiedades
termodinámicas de la porción dúplex del cebador señal, de modo que
se puede optimizar la hibridación de la diana sin que sea necesario
diseñar de nuevo la porción dúplex del cebador señal. Esto
simplifica en gran medida el diseño del cebador en comparación con
la técnica
anterior.
anterior.
El cambio en la fluorescencia que resulta del
desplazamiento de la sonda donadora o del segundo oligonucleótido
no marcado se puede detectar en un punto final elegido en la
reacción. Sin embargo, puesto que se producen segundos
oligonucleótidos completa o parcialmente desplazados
concurrentemente con la hibridación y con la extensión del cebador,
el cambio en la fluorescencia también se puede monitorizar mientras
la reacción está teniendo lugar, es decir, en "tiempo real".
Este diseño de ensayo homogéneo en tiempo real se puede utilizar
para proporcionar información semicuantitativa o cuantitativa acerca
de la cantidad de diana presente inicialmente. Por ejemplo, la
velocidad a la que cambia la intensidad de la fluorescencia durante
la reacción de desplazamiento del segundo oligonucleótido (sea como
parte de la amplificación de la diana, o en métodos de detección sin
amplificación) es una indicación de los niveles iniciales de la
diana. Como resultado, cuando inicialmente están presentes más
copias de la secuencia diana, la fluorescencia alcanza más
rápidamente un valor umbral elegido (es decir, menos tiempo para la
positividad). Además, la velocidad de cambio en los parámetros de
fluorescencia durante el transcurso de la reacción de desplazamiento
del segundo oligonucleótido es mayor en muestras que contienen
mayores cantidades iniciales de la diana que en muestras que
contienen menores cantidades iniciales de la diana. Estas u otras
medidas se pueden realizar como se conoce en la técnica como una
indicación de la presencia de la diana o como una indicación de la
amplificación de la diana. La cantidad inicial de diana se
determina generalmente por comparación de los resultados
experimentales con resultados para cantidades de diana
conocidas.
Muchos pares de cromóforos donador/desactivador
conocidos en la técnica son útiles en la presente invención. Estos
incluyen, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína
(FITC)/isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), FITC/
Texas Red® (Molecular Probes), FITC/N-hidroxisuccinimidil 1-pirenbutirato (PYB), FITC/isotiocianato de eosina (EITC), N-hidroxisuccinimidil 1-pirensulfonato (PYS)/FITC, FITC/Rodamina X, FITC/tetrametilrodamina (TAMRA), y otros. La elección de un par donador/desactivador particular no es crítica. Para los mecanismos de desactivación de la transferencia de energía sólo es necesario que las longitudes de onda de emisión del fluoróforo donador se solapen con las longitudes de onda de excitación del desactivador, es decir, debe existir un solapamiento espectral suficiente entre los dos cromóforos para permitir una transferencia de energía, transferencia de carga o desactivación de la fluorescencia eficientes. El ácido P-(dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL) es un cromóforo desactivador no fluorescente que desactiva de forma efectiva la fluorescencia de un fluoróforo adyacente, p.e., fluoresceína o 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno (EDANS). Ciertos pares donador/desactivador se ejemplifican más arriba y en los siguientes Ejemplos; sin embargo, otros resultarán evidentes para aquellos experimentados en la técnica y también son útiles en la invención. Cualquier par de cromóforos que produzca desactivación de la fluorescencia en los ácidos nucleicos detectores de la invención es apropiado para ser utilizado en los métodos de la invención, con independencia del mecanismo por el que se produce la desactivación. En la técnica también son conocidos métodos de marcado de terminales e interno que se pueden utilizar de forma rutinaria para unir los cromóforos donador y desactivador a sus sitios respectivos en el ácido nucleico detector.
Texas Red® (Molecular Probes), FITC/N-hidroxisuccinimidil 1-pirenbutirato (PYB), FITC/isotiocianato de eosina (EITC), N-hidroxisuccinimidil 1-pirensulfonato (PYS)/FITC, FITC/Rodamina X, FITC/tetrametilrodamina (TAMRA), y otros. La elección de un par donador/desactivador particular no es crítica. Para los mecanismos de desactivación de la transferencia de energía sólo es necesario que las longitudes de onda de emisión del fluoróforo donador se solapen con las longitudes de onda de excitación del desactivador, es decir, debe existir un solapamiento espectral suficiente entre los dos cromóforos para permitir una transferencia de energía, transferencia de carga o desactivación de la fluorescencia eficientes. El ácido P-(dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL) es un cromóforo desactivador no fluorescente que desactiva de forma efectiva la fluorescencia de un fluoróforo adyacente, p.e., fluoresceína o 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno (EDANS). Ciertos pares donador/desactivador se ejemplifican más arriba y en los siguientes Ejemplos; sin embargo, otros resultarán evidentes para aquellos experimentados en la técnica y también son útiles en la invención. Cualquier par de cromóforos que produzca desactivación de la fluorescencia en los ácidos nucleicos detectores de la invención es apropiado para ser utilizado en los métodos de la invención, con independencia del mecanismo por el que se produce la desactivación. En la técnica también son conocidos métodos de marcado de terminales e interno que se pueden utilizar de forma rutinaria para unir los cromóforos donador y desactivador a sus sitios respectivos en el ácido nucleico detector.
Se llevaron a cabo reacciones de Amplificación
por Desplazamiento de Hebra que contenían sondas detectoras según
la invención, esencialmente como se describe en la Patente de los
Estados Unidos nº 5.547.861, para la detección de una secuencia
diana sintética. Una primera reacción contenía 10^{6} copias de
cebadores de amplificación de la SDA para la secuencia diana,
apropiados para la amplificación de la secuencia diana sintética, y
una sonda detectora (UDP1) según la invención que contenía un
oligonucleótido adaptador que tenía una secuencia de unión a la
diana específica para la diana y una secuencia 5' complementaria de
una sonda donadora, y una sonda donadora marcada con fluoresceína y
dabcyl. La secuencia de la sonda donadora se eligió de tal modo que
cuando no se encontrara hibridada con su secuencia complementaria se
plegara espontáneamente en una estructura de horquilla, situando a
los dos cromóforos en estrecha proximidad espacial y aumentando la
desactivación de la fluorescencia en comparación con la magnitud de
la desactivación de la fluorescencia cuando la sonda donadora se
encontraba hibridada con una secuencia complementaria. Las
secuencias de la sonda detectora (que se muestran en la dirección
de 5' a 3') fueron las siguientes. La secuencia de unión a la diana
del oligonucleótido adaptador se muestra en cursiva y las secuencias
complementarias en el oligonucleótido adaptador y en la sonda
donadora están subrayadas. Las secuencias 5'y 3' de la sonda
donadora se hibridan para formar una horquilla.
Oligonucleótido Adaptador (SEQ ID NO:1):
- TCGGGTGGCTCCTTCTGATAATG ACTCACTGAGCTGGAACGTCGT
Sonda donadora (SEQ ID NO:2):
- fluoresceína-CAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCGATAATGCTG-dabcyl
Una segunda reacción no contenía diana pero sí
contenía la misma sonda detectora que la primera reacción. Una
tercera reacción era de control y contenía 10^{6} copias de la
diana y de la sonda donadora únicamente (es decir, sin
oligonucleótido adaptador). Se detectó la intensidad de la
fluorescencia de la fluoresceína en tiempo real durante las
reacciones de amplificación. Como se ilustra en la Fig. 3, en
ausencia de la diana la fluorescencia del donador se mantuvo alta
(relativamente no desactivada) a lo largo de toda la reacción,
indicando que la sonda donadora no era desplazada del
oligonucleótido adaptador en el cebador señal. Sin embargo, en
presencia de la diana la fluorescencia del donador era inicialmente
alta (relativamente no desactivada) pero decreció durante el
transcurso del tiempo de la reacción de amplificación a medida que
la sonda donadora era desplazada y asumía su forma relativamente
más desactivada. En ausencia de la sonda detectora, la fluorescencia
del donador se mantuvo desactivada a través de la reacción de
amplificación. Estos resultados demuestran que se puede utilizar la
sonda detectora de la invención para detectar una secuencia diana de
ácidos nucleicos monitorizando los cambios en la magnitud de la
desactivación de la fluorescencia.
Se repitió el Ejemplo 1 utilizando una secuencia
de sonda donadora (UDP5) que cuando no se encuentra hibridada con
su complementaria forma espontáneamente una estructura de cuarteto
de guanina que sitúa a los cromóforos donador y desactivador en una
proximidad espacial más estrecha que cuando la sonda donadora se ha
hibridado con una secuencia complementaria. Las secuencias del
oligonucleótido adaptador y de la sonda donadora se muestran más
abajo. La secuencia completa de la sonda donadora se une al cuarteto
de guanina cuando la sonda donadora no se ha hibridado con una
secuencia complementaria.
Oligonucleótido Adaptador (SEQ ID NO:3):
- CCCAAAACCCAAAACCCAAAACCC ACTCACTGAGCTGGAACGTCGT
Sonda donadora (SEQ ID NO:4):
- fluoresceína-GGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGG-dabcyl
De nuevo, la amplificación de la diana dio como
resultado una disminución de la fluorescencia del donador a medida
que la sonda donadora era desplazada del oligonucleótido adaptador
del cebador señal. La sonda donadora por sí sola no reconoció la
diana y no se observó ningún cambio en la fluorescencia del donador
cuando la diana no estaba presente. Estos resultados se muestran en
la Fig. 4.
<110> Nadeau, James G.
\hskip1cmLinn, C. Preston
\hskip1cmPitner, J. Bruce
\hskip1cmDean, Cheryl H.
\hskip1cmWalker, G. Terrance
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Pruebas y métodos universales para
detección de ácidos nucléicos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Pruebas universales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintética hipotética para fines de ejemplos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgggtggct ccttctgata atgactcact gagctggaac gtcgt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintética hipotética para fines de ejemplos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcattatc agaaggagcc acccgataat gctg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintética hipotética para fines de ejemplos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaaaaccc aaaacccaaa acccactcac tgagctggaa cgtcgt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
secuencia sintética hipotética para fines de ejemplos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggttttggg ttttgggttt tggg
\hfill
Claims (4)
1. Un método para la detección de una
secuencia diana de ácido nucleico que comprende:
a) hibridar una sonda detectora con la secuencia
diana, comprendiendo la sonda detectora un primer oligonucleótido
que es un oligonucleótido adaptador hibridado con un segundo
oligonucleótido, en donde el segundo oligonucleótido es
complementario de un oligonucleótido adicional que es una sonda
donadora que forma una estructura secundaria cuando no está
hibridada con una secuencia complementaria;
b)separar el segundo oligonucleótido del
oligonucleótido adaptador de una forma dependiente de la diana,
y;
c) detectar la hibridación del segundo
oligonucleótido con la sonda donadora como una indicación de la
presencia de la secuencia diana.
2. El método de la reivindicación 1, en donde
la hibridación del segundo oligonucleótido con la sonda donadora se
detecta por un cambio en la fluorescencia.
3. El método de la reivindicación 2, en donde
la sonda donadora está marcada con un par cromóforo
donador/desactivador y la hibridación del segundo oligonucleótido
se detecta por un incremento en la fluorescencia del donador.
4. El método de la reivindicación 1, en donde
el oligonucleótido adaptador de la sonda detectora comprende una
secuencia adaptadora para la hibridación con el segundo
oligonucleótido, que es sustancialmente idéntica a una secuencia
adaptadora de un segundo oligonucleótido adaptador de una segunda
sonda detectora para la detección de una segunda secuencia
diana.
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