-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
Erfindung bezieht sich auf Materialien und Verfahren zum Nachweisen
von Nucleinsäure-Zielsequenzen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die
sequenzspezifische Hybridisierung von markierten Oligonucleotidsonden
wird seit langem als Mittel zum Nachweisen und Identifizieren ausgewählter Nucleotidsequenzen
eingesetzt, und das Versehen solcher Sonden mit fluoreszierenden
Markierungen sorgte für
ein relativ empfindliches, nichtradioaktives Mittel zum Ermöglichen
des Nachweisens einer Sondenhybridisierung. Bei jüngst entwickelten
Nachweismethoden wird anstelle der direkten Detektion der Fluoreszenzintensität zum Nachweisen
einer Sondenhybridisierung eher das Verfahren des Fluoreszenzenergietransfers
(FET) angewandt. Ein Fluoreszenzenergietransfer erfolgt zwischen
einem Donor-Fluorophor und einem Quencher-Farbstoff (der ein Fluorophor
sein kann oder auch nicht), wenn das Absorptionsspektrum des einen
(des Quenchers) mit dem Emissionsspektrum des anderen (des Donors) überlappt
und sich die beiden Farbstoffe in enger Nachbarschaft befinden.
Farbstoffe mit diesen Eigenschaften werden als Donor/Quencher-Farbstoffpaare
oder Energietransfer-Farbstoffpaare bezeichnet. Die Energie des
angeregten Zustands des Donor-Fluorophors wird durch eine dipolinduzierte
Resonanz-Dipol-Wechselwirkung auf den benachbarten Quencher übertragen.
Dies führt
zu einer Löschung
der Donor-Fluoreszenz. Wenn der Quencher ebenfalls ein Fluorophor
ist, kann in manchen Fällen
die Intensität seiner
Fluoreszenz verstärkt
werden. Die Effizienz der Energieübertragung hängt stark
vom Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher ab, und diese Beziehungen
vorhersagende Gleichungen wurden von Förster entwickelt (1948, Ann.
Phys. 2, 55–75).
Die Distanz zwischen dem Donor- und dem Quencher-Farbstoff, bei welcher
die Effizienz der Energieübertragung
50% beträgt,
wird als Förster-Distanz
(RO) bezeichnet. Auch andere Mechanismen
der Fluoreszenzlöschung
sind bekannt, einschließlich
z.B. der Ladungsübertragung
und der Stoßlöschung.
-
Die
Energieübertragung
und andere Mechanismen, die auf der Wechselwirkung zwischen zwei
eng benachbarten Farbstoffen beruhen, um eine Löschung hervorzurufen, stellen
ein interessantes Mittel zum Nachweisen oder Identifizieren von
Nucleotidsequenzen dar, da solche Analysen in homogenen Formaten durchgeführt werden
können.
Homogene Analyseformate sind einfacher als herkömmliche Sondenhybridisierungsanalysen,
welche auf dem Nachweis der Fluoreszenz einer einzigen Fluorophor-Markierung
beruhen, da heterogene Analysen im Allgemeinen zusätzliche
Schritte zum Abtrennen einer hybridisierten Markierung von einer
freien Markierung erfordern. Typischerweise beruhten der FET und
verwandte Methoden auf dem Überwachen
einer Veränderung
der Fluoreszenzeigenschaften einer oder beider Farbstoffmarkierungen,
wenn diese durch Hybridisierung zweier komplementärer Oligonucleotide
zusammengebracht werden. Bei diesem Format kann die Veränderung
der Fluoreszenzeigenschaften als Veränderung der Menge an Energieübertragung oder
als Veränderung
der Menge an Fluoreszenzlöschung
gemessen werden, was typischerweise als Anstieg der Fluoreszenzintensität bei einem
der Farbstoffe angezeigt wird. Auf diese Art und Weise kann die
Nucleotidsequenz, die von Interesse ist, ohne Trennung nicht hybridisierter
und hybridisierter Oligonucleotide nachgewiesen werden. Die Hybridisierung
kann zwischen zwei getrennten komplementären Oligonucleotiden erfolgen,
von denen eines mit dem Donor-Fluorophor und eines mit dem Quencher
markiert ist. In der doppelsträngigen
Form kommt es im Vergleich zu einzelsträngigen Oligonucleotiden zu
einer verminderten Donor-Fluoreszenz (gesteigerten Löschung)
und/oder zu einer erhöhten
Energieübertragung.
Mehrere Formate für FET-Hybridisierungsanalysen
werden in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992, Acadamic Press,
Inc., S. 311–352)
besprochen. Alternativ können
der Donor und der Quencher solcherart mit einem einzelnen Oligonucleotid
verkoppelt sein, dass bei den Fluoreszenzeigenschaften des einen
oder beider ein nachweisbarer Unterschied existiert, wenn das Oligonucleotid
nicht hybridisiert ist, verglichen mit dem Zustand, wenn es mit seiner
komplementären
Sequenz hybridisiert ist. In diesem Format wird die Donor-Fluoreszenz
typischerweise erhöht
und die Energieübertragung/Löschung vermindert,
wenn das Oligonucleotid hybridisiert ist. Ein an jedem Ende markiertes,
selbstkomplementäres
Oligonucleotid kann zum Beispiel eine Haarnadel formen, welche die
beiden Fluorophore (d.h. das 5'-
und das 3'-Ende)
in enge räumliche
Nähe bringt,
wo eine Energieübertragung
und -löchung
stattfinden kann. Eine Hybridisierung des selbstkomplementären Oligonucleotids
mit seiner komplementären
Sequenz in einem zweiten Oligonucleotid zerstört die Haarnadel und vergrößert den Abstand
zwischen den beiden Farbstoffen, wodurch die Löschung verringert wird. Ein
Nachteil der Haarnadelstruktur besteht darin, dass sie äußerst stabil
ist und die Umwandlung in die ungelöschte, hybridisierte Form oft
langsam erfolgt und nur mäßig bevorzugt
wird, was eine im Allgemeinen schlechte Leistung zur Folge hat. Tyagi
und Kramer (1996, Nature Biotech. 14, 303–308) beschreiben eine Haarnadel,
die wie obenstehend beschrieben markiert ist und in der Schleife
zwischen den selbstkomplementären
Armen der Haarnadel, welche den Stamm bilden, eine Detektor-Sequenz umfasst.
Der Stamm mit gepaarten Basen muss schmelzen, so dass die Detektor-Sequenz mit dem Ziel
hybridisieren und eine Verringerung der Löschung bewirken kann. Eine „Doppelhaarnadel"-Sonde und Verfahren
zu deren Verwendung sind bei B. Bagwell, et al. (1994, Nucl. Acids
Res. 22, 2424–2425;
U.S.-Patent Nr. 5,607,834) beschrieben. Diese Strukturen enthalten
die Zielbindesequenz innerhalb der Haarnadel und umfassen daher
eine kompetitive Hybridisierung zwischen dem Ziel und den selbstkomplementären Sequenzen
der Haarnadel. Bagwell löst
das Problem der nachteiligen Hybridisierungskinetik durch Destabilisierung
der Haarnadel mit Fehlpaarungen.
-
Homogene
Verfahren, bei denen Energietransfer- oder andere Mechanismen der
Fluoreszenzlöschung
zum Nachweisen einer Nucleinsäureamplifikation
eingesetzt werden, wurden ebenfalls beschrieben. L. G. Lee, et al.
(1993, Nuc. Acids Res. 21, 3761–3766)
offenbaren ein Echtzeit-Nachweisverfahren, bei dem eine doppelt
markierte Detektorsonde während
einer PCR in zielamplifikationsspezifischer Weise gespalten wird.
Die Detektorsonde wird stromabwärts
vom Amplifikationsprimer hybridisiert, so dass die 5'-3'-Exonucleaseaktivität von Taq-Polymerase die Detektorsonde
aufschließt,
wodurch zwei fluoreszierende Farbstoffe, die ein Energieübertragungspaar
bilden, getrennt werden. Die Fluoreszenzintensität nimmt beim Spalten der Sonde
zu.
-
Signalprimer
(manchmal auch als Detektorsonden bezeichnet), welche mit der Zielsequenz
stromabwärts
von der Hybridisierungsstelle der Amplifikationsprimer hybridisieren,
wurden hinsichtlich einer homogenen Detektion einer Nucleinsäureamplifikation
beschrieben (U.S.-Patent Nr. 5,547,861). Der Signalprimer wird durch
die Polymerase in einer Weise verlängert, die der Verlängerung
der Amplifikationsprimer ähnelt.
Die Verlängerung
des Amplifikationsprimers verdrängt
das Verlängerungsprodukt
des Signalprimers in einer zielamplifikationsabhängigen Weise, wobei ein doppelsträngiges sekundäres Amplifikationsprodukt
hergestellt wird, das als Hinweis auf eine Zielamplifikation nachgewiesen
werden kann. Beispiele für
homogene Nachweisverfahren zur Verwendung bei einzelsträngigen Signalprimern
sind im U.S.-Patent Nr. 5,550,025 (Einbau von lipophilen Farbstoffen
und Restriktions-Schnittstellen) und im U.S.-Patent Nr. 5,593,867
(Nachweis einer Fluoreszenzpolarisation) beschrieben. Erst unlängst wurden
Signalprimer für
die Detektion von Nucleinsäurezielen unter
Anwendung von FET-Verfahren
angepasst. Das U.S.-Patent 5,691,145 offenbart G-Quartettstrukturen, die
Donor/Quencher-Farbstoffpaare enthalten, welche 5' zur Zielbindesequenz
eines einzelsträngigen
Signalprimers angehängt
sind. Eine Synthese des komplementären Strangs während einer
Zielamplifikation entfaltet das G-Quartett, vergrößert dabei
den Abstand zwischen dem Donor- und dem Quencher-Farbstoff und führt zu einem
nachweisbaren Anstieg der Donor-Fluoreszenz. Teilweise einzelsträngige, teilweise
doppelsträngige Signalprimer,
die mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren markiert sind, wurden ebenfalls
vor kurzem beschrieben. Die
EP
0 878 554 offenbart beispielsweise Signalprimer mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren,
die eine einzelsträngige
Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle flankieren. Bei Vorhandensein
des Ziels wird die Restriktions-Schnittstelle doppel strängig und
durch die Restriktionsendonuclease spaltbar. Die Furchungsteilung
trennt das Farbstoffpaar und verringert die Donor-Löschung.
Die
EP 0 881 302 beschreibt
Signalprimer, an denen eine Struktur mit intramolekular gepaarten
Basen angehängt
ist. Der Donor-Farbstoff eines Donor/Quencher-Farbstoffpaars, das
an der Struktur mit intramolekular gepaarten Basen angekoppelt ist,
wird gelöscht,
wenn die Struktur gefaltet wird, bei Vorhandensein eines Ziels wird
jedoch eine zur Struktur mit intramolekular gepaarten Basen komplementäre Sequenz
synthetisiert. Dies entfaltet die Struktur mit intramolekular gepaarten
Basen und trennt den Donor- und den Quencher-Farbstoff, was zu einer
Verringerung der Donor-Löschung
führt.
Nazarenko, et al. (U.S.-Patent Nr. 5,866,336) beschreiben ein ähnliches
Verfahren, bei dem Amplifikationsprimer mit Haarnadelstrukturen
konfiguriert werden, welche Donor/Quencher-Farbstoffpaare tragen.
-
Energietransfer-
und andere Nachweismethoden der Fluoreszenzlöschung wurden ebenfalls eingesetzt,
um eine Zielsequenz durch Hybridisierung einer spezifischen Sonde
nachzuweisen. Das japanische Patent Nr. 93015439 B offenbart Verfahren
zum Messen von Polynucleotiden durch Hybridisierung des einzelsträngigen Ziels
mit einer einzelsträngigen
Polynucleotidsonde, welche mit zwei Markierungen, die ein Energieübertragungspaar
bilden, versehen ist. Das doppelsträngige Hybrid wird durch ein
Restriktionsenzym zwischen den Markierungen gespalten, und die Fluoreszenz
einer der Markierungen wird gemessen. Ein Nachteil dieses Verfahrens
besteht darin, dass die Restriktions-Schnittstelle in der Sonde
auch in der Zielsequenz, die nachgewiesen wird, vorhanden sein muss.
S. S. Ghosh, et al. (1994, Nucl. Acids Res. 22, 3155–3159) beschreiben
die Restriktionsenzym-katalysierte Furchungsteilung von Fluorophor-markierten
Oligonucleotiden, welche unter Anwendung eines Fluoreszenzresonanz-Energietransfers
analysiert werden. Bei diesen Analysen werden die komplementären Oligonucleotide
hybridisiert, um die doppelsträngige
Restriktions-Schnittstelle
herzustellen, wobei eine der fluoreszierenden Markierungen an jedem
der beiden Stränge
angekoppelt ist.
-
Yagi
S. und Craigmore FR (1996. Nature Biotechnology 14: 303–307) beschreiben
Sonden, die bei der Detektion spezifischer Nucleinsäuren in
homogenen Lösungen
nützlich
sind. Solche Sonden bestehen aus einem einzelsträngigen Nucleinsäuremolekül, das eine
Stamm-Schleifen-Struktur besitzt. Der Schleifenabschnitt des Moleküls ist eine
Sondensequenz, die zu einer vorgegebenen Zielnucleinsäuresequenz
komplementär
ist. Der Stammabschnitt des Moleküls trägt eine Fluoreszenz-Donorkomponente
und eine Quencher-Komponente,
welche in der Stamm-Schleifen-Struktur in enger Nachbarschaft gehalten
werden. Eine Hybridisierung der Sonde mit dem Ziel bewirkt eine
konformative Veränderung
der Sonde, welche die beiden Komponenten auseinander zwingt und
dabei bewirkt, dass die Donorkomponente ein Fluoreszenzsignal emittiert.
-
KURZFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Bei
der vorliegenden Erfindung wird eine Detektorsonde zum Nachweisen
von Nucleinsäure-Zielsequenzen
eingesetzt. Die Detektorsonde umfasst zwei Oligonucleotide und ist
teilweise einzelsträngig
und teilweise doppelsträngig.
Das erste Oligonucleotid wird als DNA-Linker-Oligonucleotid bezeichnet.
Das DNA-Linker-Oligonucleotid wird solcherart mit einem komplementären zweiten
Oligonucleotid hybridisiert, dass das 3'-Ende des DNA-Linker-Oligonucleotids
einen einzelsträngigen
Schwanzbereich bildet, welcher mit der Zielsequenz hybridisiert.
Jener Teil des einzelsträngigen
3'-Schwanzes, der
mit der Zielsequenz hybridisiert, wird als Zielbindesequenz bezeichnet.
Jener Bereich des DNA-Linker-Oligonucleotids,
der 5' zur Zielbindesequenz und
zum einzelsträngigen
3'-Schwanz gelegen
ist, hybridisiert mit dem zweiten Oligonucleotid, um ein teilweise doppelsträngiges Signalprimermolekül mit intermolekular
gepaarten Basen zu bilden, und zwar unter den für eine Hybridisierung der Detektorsonde
mit dem Ziel ausgewählten
Reaktionsbedingungen. Die Sequenz des DNA-Linker-Oligonucleotids,
mit der das zweite Oligonucleotid hybridisiert (die 5'-DNA-Linker-Sequenz),
umfasst eine Sequenz, die nicht mit dem Ziel hybridisiert. Die 5'-DNA-Linker-Sequenz
kann solcherart ausgewählt werden,
dass sie in einer Vielzahl von DNA-Linker-Oligonucleotiden mit unterschiedlichen
Zielbindesequenzen gleich ist (d.h. eine „universelle" 5'-DNA-Linker-Sequenz).
Dies vereinfacht den Nachweis einer Vielzahl verschiedener Ziele,
wie untenstehend beschrieben wird.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
hat daher den Vorteil, dass eine einzige markierte Reportersonde (untenstehend
beschrieben) zur Detektion einer Vielzahl verschiedener Zielsequenzen
verwendet werden kann, da eine gemeinsame 5'-DNA-Linker-Sequenz für die Hybridisierung
mit einem zweiten Oligonucleotid an verschiedenen Zielbindesequenzen
im DNA-Linker-Oligonucleotid angehängt werden kann. Dies vereinfacht die
Synthese von Reportersonden und reduziert die damit zusammenhängenden
Kosten. Obwohl die DNA-Linker-Oligonucleotide
für die
Erkennung verschiedener Ziele unterschiedliche Zielbindesequenzen
aufweisen müssen,
ist ihre Synthetisierung einfacher und weniger kostspielig als bei
Reportersonden, da sie für die
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung keine Markierung benötigen.
-
BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 stellt
die Detektion einer Nucleinsäure-Zielsequenz
in einer nicht zur beanspruchten Erfindung gehörigen Strangverdrängungsamplifikations(SDA)-Reaktion
dar, wobei das zweite Oligonucleotid des Signalprimers eine Reportersonde
ist.
-
2 stellt
die Detektion einer Nucleinsäure-Zielsequenz
in einer SDA-Reaktion dar, wobei das zweite Oligonucleotid des Signalprimers
eine unmarkierte Sonde ist.
-
3 zeigt
die Ergebnisse des Beispiels 1, wobei eine Reportersonde verwendet
wird, die eine Sequenz umfasst, welche spontan eine Haarnadelstruktur
bildet, wenn sie nicht mit einer komplementären Sequenz hybridisiert ist.
-
4 zeigt
die Ergebnisse des Beispiels 2, wobei eine Reportersonde verwendet
wird, die eine Sequenz umfasst, welche spontan ein G-Quartett bildet,
wenn sie nicht mit einer komplementären Sequenz hybridisiert ist.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Bestimmte,
hier verwendete Begriffe sind wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer
ist ein Primer für
die Amplifikation einer Zielsequenz durch Primerverlängerung.
Bei einer SDA hybridisiert das 3'-Ende
des Amplifikationsprimers (die Zielbindesequenz) am 3'-Ende der Zielsequenz.
Der Amplifikationsprimer umfasst in der Nähe seines 5'-Endes eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease.
Die Erkennungsstelle besteht für
eine Restriktionsendonuclease, die einen Strang eines DNA-Doppelstrangs
spaltet, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert wird („Einführen von
Einzelstrangbrüchen"), wie im U.S.-Patent
Nr. 5,455,166; im U.S.-Patent Nr. 5,270,184 und in der
EP 0 684 315 beschrieben. Eine hemimodifizierte
Erkennungsstelle ist eine doppelsträngige Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease,
bei der ein Strang zumindest ein derivatisiertes Nucleotid enthält, welches
bewirkt, dass die Restriktionsendonuclease an einem der beiden Stränge Einzelstrangbrüche einführt anstatt
beide Stränge
der Erkennungsstelle zu spalten. Der Amplifikationsprimer umfasst
auch eine 3'-OH-Gruppe,
die durch DNA-Polymerase verlängerbar
ist, wenn die Zielbindesequenz des Amplifikationsprimers mit der
Zielsequenz hybridisiert ist. Für den
größten Teil
der SDA-Reaktion
ist der Amplifikationsprimer für
eine exponentielle Amplifikation der Zielsequenz verantwortlich.
-
Da
zum Vorantreiben der Amplifikationsreaktion keine speziellen Sequenzen
oder Strukturen erforderlich sind, können Amplifikationsprimer für eine PCR
nur aus Zielbindesequenzen bestehen. Im Gegensatz dazu umfassen
Amplifikationsprimer für
eine 3SR und NASBA in der Nähe
des 5'-Endes einen
RNA-Polymerase-Promotor. Der Promotor ist an der Zielsequenz angehängt und
dient zum Vorantreiben der Amplifikationsreaktion durch Steuern
der Transcription multipler RNA-Kopien des Ziels.
-
Verlängerungsprodukte
sind Nucleinsäuren,
die einen Primer oder einen Teil eines Primers und einen neu synthetisierten
Strang umfassen, welcher das Complement der stromabwärts von
der Primerbindungsstelle gelegenen Zielsequenz ist.
-
Verlängerungsprodukte
resultieren aus der Hybridisierung eines Primers mit einer Zielsequenz
und der Verlängerung
des Primers durch Polymerase unter Verwendung der Zielsequenz als
Matrize.
-
Die
Begriffe „Ziel" oder „Zielsequenz" beziehen sich auf
zu amplifizierende oder nachzuweisende Nucleinsäuresequenzen. Diese umfassen
die ursprüngliche,
zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz,
deren komplementären
zweiten Strang und beide Stränge
einer Kopie der ursprünglichen
Sequenz, die durch Replikation oder Amplifikation erzeugt wird.
Die Zielsequenz kann auch als Matrize für die Verlängerung hybridisierter Primer
bezeichnet werden.
-
Beim
erfindungsgemäßen Verfahren
werden zwei Oligonucleotide verwendet. In der Detektorsonde werden
die Oligonucleotide solcherart hybridisiert, dass das erste Oligonucleotid
(das DNA-Linker-Oligonucleotid) einen einzelsträngigen 3'-„Schwanz" bildet, welcher
mit der Zielsequenz (der Zielbindesequenz) hybridisiert. Ein zweites
Oligonucleotid bildet Basenpaare (d.h. hybridisiert) mit einer 5'-DNA-Linker-Sequenz
im ersten Oligonucleotid, die der Zielbindesequenz benachbart und
5' zu dieser gelegen
ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "der Zielbindesequenz benachbart und
5' zu dieser gelegen", dass die gesamte
Zielbindesequenz oder ein Teil davon im 3'-Schwanz einzelsträngig gelassen wird und für eine Hybridisierung
mit dem Ziel verfügbar
ist. Das heißt,
ein Teil der Zielbindesequenz kann an der intermolekularen Basenpaarung
des benachbarten doppelsträngigen
Teils beteiligt sein, oder die gesamte Zielbindesequenz kann einen
einzelsträngigen
3'-Schwanz in der
Detektorsonde bilden. Der Rest des doppelsträngigen Teils der Detektorsonde ist
zum Ziel nicht komplementär.
Fehlpaarungen im intermolekular gepaarte Basen aufweisenden Teil
der Detektorsonde können
das Ausmaß der
Fluoreszenzveränderung
bei Vorhandensein eines Ziels verringern, sind jedoch akzeptabel,
wenn die Analyseempfindlichkeit keine Rolle spielt. Fehlpaarungen
in der Zielbindesequenz des einzelsträngigen Schwanzes sind ebenfalls
akzeptabel und können
zum Nachweisen einzelner Nucleotid-Polymorphismen eingesetzt werden,
könnten
jedoch unter bestimmten Umständen
die Analyseempfindlichkeit und/oder -spezifität ebenfalls reduzieren. Perfekte Übereinstimmungen
in den an der Hybridisierung beteiligten Sequenzen verbessern jedoch
die Analysespezifität
ohne signifikante negative Auswirkungen auf die Reaktionskinetik.
-
Alternativ
müssen
die bei der Erfindung verwendeten Reportersonden nicht mit dem DNA-Linker-Oligonucleotid
hybridisiert werden. Bei einer zweiten Ausführungsform umfasst die Detektorsonde
ein DNA-Linker-Oligonucleotid, das mit einem unmarkierten zweiten
Oligonucleotid hybridisiert ist. Eine nicht hybridisierte Reportersonde
ist in ihrer gefalteten, gelöschten
Konformation ebenfalls vorhanden. Das unmarkierte zweite Oligonucleotid
und die Reportersonde sind hinsichtlich der Sequenz ausreichend
komplementär,
so dass sie unter den ausgewählten
Reaktionsbedingungen hybridisieren.
-
Eine
zielabhängige
Zerstörung
des Duplexabschnitts der Detektorsonde mit einer Trennung des unmarkierten
zweiten Oligonucleotids ermöglicht
eine Hybridisierung des nunmehr einzelsträngigen unmarkierten zweiten
Oligonucleotids mit seinen komplementären Sequenzen in der Reportersonde.
Vor der Hybridisierung mit dem verdrängten unmarkierten zweiten
Oligonucleotid wird die Reportersonde in eine geordnete sekundäre Struktur,
ein Zufallsknäuel
oder eine andere Konformation gefaltet, welche den Donor- und den
Quencher-Farbstoff in enge räumliche
Nähe bringt
und die Löschung
des Donors verstärkt.
Eine Hybridisierung mit dem unmarkierten zweiten Oligonucleotid
linearisiert oder entfaltet die Reportersonde solcherart, dass der
Abstand zwischen den beiden Farbstoffen vergrößert und die Fluoreszenzlöschung vermindert
wird. Die verminderte Löschung
bewirkt eine nachweisbare Veränderung
eines Fluoreszenzparameters entweder des Donors oder des Quenchers,
die als Hinweis auf das Vorhandensein der Zielsequenz detektiert
werden kann. Die beiden Elemente des Farbstoffpaars können mit
Sequenzen in der Reportersonde gekoppelt sein, die an einer Hybridisierung
mit dem verdrängten
unmarkierten zweiten Oligonucleotid beteiligt sind, oder ein Element
des Farbstoffpaars kann mit einem Teil der Reportersonde gekoppelt
sein, der nicht mit dem unmarkierten zweiten Oligonucleotid hybridisiert
ist, beispielsweise in einem einzelsträngigen Schwanz an der Reportersonde
oder an einer internen Sequenz, die zum unmarkierten zweiten Oligonucleotid
nicht komplementär
ist.
-
Ein
Donor-Fluorophor und sein korrespondierender Quencher können mit
der Reportersonde an jedweden relativen Positionen, die ihre Hybridisierung
mit dem DNA-Linker-Oligonucleotid
oder mit einer unmarkierten Sonde nicht hemmen (wie untenstehend
beschrieben), gekoppelt sein, was zu einer nachweisbaren Donor-Fluoreszenz
führt,
wenn die Reportersonde mit dem DNA-Linker oder mit der unmarkierten
Sonde hybridisiert ist, und für
eine Veränderung
eines Fluoreszenzparameters sorgt, wenn die Reportersonde zwischen dem
gefalteten und dem hybridisierten Zustand wechselt. Bei der erfindungsgemäßen Ausführungsform,
bei welcher die Reportersonde mit dem DNA-Linker-Oligonucleotid in der Detektorsonde
hybridisiert ist, ermöglicht
eine zielabhängige
Zerstörung
des Doppelstrangs mit einer Trennung der gepaarte Basen aufweisenden Oligonucleotide
ein Falten der Reportersonde in eine geordnete sekundäre Struktur,
ein Zufallsknäuel
oder eine andere Konformation, welche den Donor- und den Quencher-Farbstoff in enge
räumliche
Nähe bringt
und die Löschung
des Donors verstärkt.
Die verstärkte
Löschung
bewirkt eine nachweisbare Veränderung
eines Fluoreszenzparameters entweder des Donors oder des Quenchers,
die als Hinweis auf das Vorhandensein der Zielsequenz detektiert
werden kann. Die beiden Elemente des Farbstoffpaars können mit
Sequenzen gekoppelt sein, die an der Bildung der intermolekularen
Wasserstoffbindungen im doppelsträngigen Teil der Detektorsonde
beteiligt sind. Alternativ kann ein Element des Paars mit einem
Teil der Reportersonde gekoppelt sein, der nicht mit dem DNA-Linker
hybridisiert ist, beispielsweise in einem einzelsträngigen 3'-Schwanz an der Reportersonde,
der weder zum Ziel noch zum DNA-Linker-Oligonucleotid komplementär ist.
-
Die
Gesamtlänge
der Sequenzen, die an einer intermolekularen Basenpaarung zwischen
dem DNA-Linker und entweder dem unmarkierten Oligonucleotid oder
der Reportersonde oder zwischen dem unmarkierten zweiten Oligonucleotid
und der Reportersonde beteiligt sind, ist im Allgemeinen nicht entscheidend. Die
passende Länge
wird durch die Anzahl der Nucleotide bestimmt, die für eine stabile
Basenpaarung erforderlich ist, um unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen
ein teilweise doppelsträngiges
Molekül
aufrechtzuerhalten. Aus Gründen
der Zweckdienlichkeit sind die an der Basenpaarung beteiligten Sequenzen
typischerweise zwischen etwa 8 und 75 Nucleotide lang. Die maximale
Länge wird
nur durch praktische Überlegungen
eingeschränkt,
wie z.B. die Einfachheit und Effizienz einer Oligonucleotid-Synthese
und -Rückgewinnung.
-
Die
Sequenz des doppelsträngigen
Bereichs der Detektorsonde wird solcherart ausgewählt, dass
zumindest ein Teil von ihr zum Ziel nicht komplementär ist, und
solcherart, dass sie bei der Temperatur der Reaktion, die zu ihrer
Zerstörung
dient, relativ stabil ist. Sie darf jedoch nicht so stabil sein,
dass eine Hybridisierung mit dem Ziel unzumutbar langsam ist, oder
so stabil, dass die Polymerase nicht in der Lage ist, das zweite Oligonucleotid
für eine
Synthese des komplementären
Strangs aus dem DNA-Linker-Oligonucleotid zu verdrängen. Vorzugsweise
ist die Tm des doppelsträngigen Abschnitts der Detektorsonde,
der eine Hybridisierung zwischen dem ersten Oligonucleotid und einem
zweiten Oligonucleotid involviert, gleich oder größer als
die Temperatur, bei der die Verdrängungsreaktion stattfindet,
kann jedoch auch niedriger sein. Wenn die Tm dieses Segments
geringer ist als die Reaktionstemperatur, werden mehr als die Hälfte der
Detektor-Nucleinsäuremoleküle unabhängig vom
Vorhandensein des Ziels gänzlich
einzelsträngig
sein. Dies verringert die Analyseempfindlichkeit, kann jedoch annehmbar
sein, wenn relativ hohe Mengen an Ziel vorhanden sind. Typischerweise wird
die Tm des doppelsträngigen Abschnitts der Detektorsonde,
der eine Hybridisierung zwischen dem ersten Oligonucleotid und einem
zweiten Oligonucleotid involviert, so gewählt, um der Temperatur der
Reaktion, die das zweite Oligonucleotid verdrängt, zu entsprechen oder um
bis zu etwa 30°C
höher als
diese zu sein. Am meisten bevorzugt ist die Tm um
etwa 10–20°C höher als
jene der Reaktion, die das zweite Oligonucleotid verdrängt.
-
Das
zweite Oligonucleotid (entweder eine Reportersonde oder ein unmarkiertes
zweites Oligonucleotid) wird so gewählt, dass, wenn es mit dem
DNA-Linker-Oligonucleotid
hybridisiert, ein Teil des DNA-Linker-Oligonucleotids als 3'-„Schwanz" einzelsträngig bleibt. Der einzelsträngige Schwanzabschnitt
der Detektorsonde ist zur nachzuweisenden Zielsequenz komplementär und dient
zum Hybridisieren der Detektorsonde mit der Zielsequenz. Die Sequenz
des Schwanzes wird vorzugsweise so gewählt, dass sie unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen
mit dem Ziel einen stabilen Doppelstrang bildet und den gewünschten
Grad an Detektionsspezifität
liefert, so wie im Stand der Technik bekannt. Um die Hybridisierung
mit einem Ziel zu begünstigen,
wird die Sequenz des einzelsträngigen
zielbindenden Schwanzbereichs des ersten Oligonucleotids vorzugsweise
ebenfalls so gewählt,
dass die Tm der Zielbindesequenz/Zielduplex
gleich oder höher
als die Reaktionstemperatur ist. Obwohl die Sequenz des Zielbindebereichs
von der Sequenz des nachzuweisenden Ziels vorgeschrieben wird, können bei
der Tm der Zielbindesequenz der Detektor-Nucleinsäure Anpassungen
durchgeführt
werden, beispielsweise durch eine Anpassung von deren Länge.
-
Die
Detektorsonde kann in Amplifikationsreaktionen als Signalprimer
eingesetzt werden, um sekundäre
Amplifikationsprodukte zu erzeugen, begleitet von einer Veränderung
eines Fluoreszenzparameters, wie im U.S.-Patent Nr. 5,547,861 beschrieben.
Der einzelsträngige
Schwanz des Signalprimers, der das 3'-Ende des DNA-Linker-Oligonucleotids umfasst, ermöglicht eine
Primerverlängerung.
Die Verwendung von Signalprimern in einer Nucleinsäureamplifikationsreaktion
gemäß einer
ersten Ausführungsform
der Erfindung ist in 1 detaillierter dargestellt
und kann wie folgt zusammengefasst werden. Bei dieser ersten Ausführungsform
ist das zweite Oligonucleotid eine Reportersonde, die ein daran
angekoppeltes Donor/Quencher-Farbstoffpaar umfasst, so dass die
Elemente des Paars räumlich
getrennt sind und die Donor-Fluoreszenz nachweisbar ist, wenn die
Reportersonde mit dem DNA-Linker hybridisiert wird. Über den
einzelsträngigen
Schwanz des DNA-Linkers hybridisiert der Signalprimer mit einem
Strang der Zielsequenz stromabwärts
von einem Amplifikationsprimer. Sowohl der Amplifikationsprimer
als auch das DNA-Linker-Oligonucleotid des Signalprimers werden
durch DNA-Polymerase verlängert,
wobei die Zielsequenz als Matrize eingesetzt wird. Das erste Verlängerungsprodukt
des Signalprimers, mit dem die Reportersonde nach wie vor hybridisiert
ist, wird durch Verlängerung
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers aus der Matrize verdrängt. Der
Signalprimer ist nach der Verdrängung
des ersten Signalprimer-Verlängerungsprodukts
aus dem Ziel noch immer teilweise doppelsträngig. Der verlängerte,
verdrängte
Signalprimer dient wiederum als Matrize für die Hybridisierung und Verlängerung
eines zweiten Amplifikationsprimers, wobei der einzelsträngige Abschnitt
des Signalprimer-Verlängerungsprodukts
anfänglich
doppelsträngig
gemacht wird. Eine weitere Polymerisation eines neuen, zum DNA-Linker
komplementären
Strangs verdrängt
aufgrund der strangverdrängenden
Aktivität
der Polymerase ebenso die Reportersonde aus dem DNA-Linker. Da die Reportersonde
eine Sequenz umfasst, die sich spontan in eine geordnete sekundäre Struktur,
ein Zufallsknäuel
oder irgendeine andere Konformation faltet, die den Donor und den
Quencher in enge räumliche
Nähe bringt,
ermöglicht
eine Trennung vom DNA-Linker-Oligonucleotid das Auftreten einer
solchen Faltung. Die Fluoreszenzlöschung wird dadurch verstärkt, und eine
Veränderung
irgendeines geeigneten Fluoreszenzparameters, die mit einer Veränderung
des Ausmaßes der
Fluoreszenzlöschung
zusammenhängt,
kann als Hinweis auf eine Amplifikation der Zielsequenz detektiert werden.
-
Ein
zweiter Signalprimer, der mit dem zweiten komplementären Strang
einer doppelsträngigen
Zielsequenz hybridisiert, kann gegebenenfalls in der Reaktion inkludiert
sein. Der zweite Signalprimer hybridisiert mit dem zweiten Strang
der Zielsequenz stromabwärts
vom zweiten Amplifikationsprimer und wird durch Verlängerung
des zweiten Amplifikationsprimers verlängert und verdrängt. Der
einzelsträngige
Abschnitt des zweiten Signalprimer-Verlängerungsprodukts wird durch
Hybridisierung und Verlängerung
des ersten Amplifikationsprimers doppelsträngig gemacht, was eine Verdrängung der
Reportersonde zur Folge hat.
-
Das
obenstehend beschriebene und in 1 dargestellte
Reaktionsschema ist dasselbe, wenn das zweite Oligonucleotid unmarkiert
ist. Die zielabhängige
Trennung des unmarkierten zweiten Oligonucleotids vom DNA-Linker-Oligonucleotid
ist jedoch nicht direkt nachweisbar. Wie in 2 gezeigt,
wird die Trennung des unmarkierten zweiten Oligonucleotids vom DNA-Linker
durch Hybridisierung mit einer Reportersonde nachgewiesen, welche
in ihrer gefalteten, gelöschten
Konformation vorliegt. Die Hybridisierung der unmarkierten Sonde
mit der komplementären
Reportersonde bewirkt eine Entfaltung oder Linearisierung der Reportersonde,
wodurch der Abstand zwischen dem Donor- und dem Quencher-Farbstoff
vergrößert und
die Fluoreszenzlöschung
verringert wird. Die Hybridisierung zwischen dem zweiten Oligonucleotid
und der Reportersonde, die ein Hinweis auf das Vorhandensein des
Ziels ist, wird als Veränderung
eines Fluoreszenzparameters nachgewiesen, welche mit einer Veränderung
des Ausmaßes
der Fluoreszenzlöschung
zusammenhängt.
-
Bei
beiden Ausführungsformen
können,
falls gewünscht,
pro Zielstrang mehrere Detektorsonden eingesetzt werden, wobei jede
mit der Zielsequenz stromabwärts
von der anderen am selben Strang hybridisiert und alle Signalprimer
stromabwärts
vom Amplifikationsprimer hybridisiert werden. Auf diese Weise wird
jeder Signalprimer durch Verlängerung
der stromaufwärts
gelegenen Detektor-Nucleinsäure
verdrängt
und der am meisten 5' gelegene
Signalprimer wird durch den Amplifikationsprimer verdrängt. Die
Verwendung mehrerer Signalprimer hat den Vorteil, das pro Ziel erzeugte
Signal zu erhöhen
oder zu verstärken,
wobei es zu einer Erhöhung
der Empfindlichkeit der Analyse kommt.
-
Mehrere
Detektorsonden können
auch dazu verwendet werden, um gleichzeitig eine Mehrzahl von verschiedenen
Zielsequenzen nachzuweisen. In diesem Fall ist die 5'-DNA-Linker-Sequenz des
DNA-Linker-Oligonucleotids vorzugsweise bei jedem nachzuweisenden
Ziel unterschiedlich. Durch Markierung von Reportersonden, die für die 5'-DNA-Linker- Sequenz jedes zielspezifischen
DNA-Linker-Oligonucleotids spezifisch sind, mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren,
welche unterscheidbar sind, kann das Vorhandensein jedes Ziels durch
den Nachweis von Veränderungen
im Ausmaß der
Fluoreszenzlöschung
bei der auf jedes Ziel gerichteten Reportersonde ermittelt werden.
-
Wie
in den 1 und 2 gezeigt, wird der einzelsträngige Abschnitt
der Detektorsonde durch Hybridisierung und Verlängerung eines Amplifikationsprimers
in die doppelsträngige
Form umgewandelt. Eine Strangverdrängung durch die Polymerase
verdrängt
auch die Reportersonde oder das unmarkierte zweite Oligonucleotid
aus dem DNA-Linker-Oligonucleotid, während die Polymerase ihren
komplementären
Strang synthetisiert. Da die strangverdrängende Aktivität der Polymerase
eine Reportersonde vom DNA-Linker-Oligonucleotid trennt, faltet
sich die Reportersonde und wird der Abstand zwischen dem Donor-
und dem Quencher-Farbstoff verringert, wodurch die Löschung der
Donor-Fluoreszenz verstärkt
wird. Das heißt,
die so produzierte einzelsträngige
verdrängte
Reportersonde kann sich frei selbst hybridisieren oder anderweitig
intramolekular interagieren, um die Farbstoffe in engere räumliche
Nähe zu
bringen. Wenn das einzelsträngige
verdrängte
Oligonucleotid ein unmarkiertes zweites Oligonucleotid ist, wird
es frei, um mit einer Reportersonde zu hybridisieren, die sich in
ihrem gefalteten, gelöschten
Zustand befindet, und zwar entweder in einer Lösung oder befestigt an einer
festen Phase. Eine Hybridisierung des verdrängten unmarkierten zweiten
Oligonucleotids mit der Reportersonde entfaltet diese zumindest
teilweise, wodurch der Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher
vergrößert und
die Löschung
der Donor-Fluoreszenz verringert wird. Bei beiden Ausführungsformen
kann die Veränderung
der Fluoreszenz entweder des Donor- oder des Quencher-Farbstoffs
als Hinweis auf eine Amplifikation der Zielsequenz überwacht
oder detektiert werden. Für
die Verdrängung
einer Reportersonde kann eine Abnahme der Donor-Fluoreszenzintensität oder ein
Anstieg der Quencher-Fluoreszenzintensität als Hinweis detektiert und/oder überwacht
werden, dass eine Zielamplifikation stattfindet oder stattgefunden
hat. Für
die Verdrängung
eines unmarkierten zweiten Oligonucleotids kann ein Anstieg der
Donor-Fluoreszenzintensität
oder eine Abnahme der Quencher-Fluoreszenzintensität als Hinweis
detektiert und/oder überwacht
werden, dass eine Zielamplifikation stattfindet oder stattgefunden
hat. Andere Fluoreszenzparameter, die durch die Nähe des Donor-Fluorophors
und seines Quenchers beeinflusst werden (z.B. Fluoreszenzlebensdauer
oder eine Veränderung
im Verhältnis
von Donor- und/oder Akzeptor-Fluoreszenzintensität), können ebenso bei beiden Ausführungsformen überwacht
werden.
-
Es
ist zu erkennen, dass die Detektorsonde zusätzlich zur SDA für die Verwendung
als Signalprimer bei anderen Primerverlängerungsamplifikationsverfahren
(z.B. PCR, 3SR, TMA oder NASBA) angepasst werden kann. Beispielsweise
können
die Verfahren für
die Verwendung in einer PCR angepasst werden, indem in der PCR PCR-Amplifikationsprimer
und eine Strangverdrängungs-DNA-Polymerase,
die keine 5'→3'-Exonucleaseaktivität aufweist,
verwendet werden (z.B. Sequencing Grade Taq von Promega oder exo
Vent oder exo Deep Vent von New England BioLabs). Die Signalprimer
hybridisieren mit dem Ziel stromabwärts von den PCR-Amplifikationsprimern.
Sie werden verlängert,
aus dem Ziel verdrängt
und doppelsträngig
gemacht, wobei es zu einer Verdrängung
der Reportersonde oder des unmarkierten zweiten Oligonucleotids
kommt, und zwar im Wesentlichen so, wie hinsichtlich der SDA beschrieben.
Wie bei SDA-Systemen führt
eine Verdrängung
der Reportersonde oder des unmarkierten zweiten Oligonucleotids
zu einer Veränderung
der Nähe
zwischen den Donor/Akzeptor-Farbstoffpaaren und verändert den
Grad der Fluoreszenzlöschung.
Eine damit zusammenhängende
Veränderung
eines Fluoreszenzparameters, wie z.B. der Intensität, dient
als Hinweis auf eine Zielamplifikation.
-
Zur
Anpassung der erfindungsgemäßen Verfahren
an 3SR, TMA oder NASBA wird eine 5'→3'-Exonuclease-defiziente
Reverse Transcriptase mit strangverdrängender Aktivität eingesetzt,
wobei es zu einer Hybridisierung des Signalprimers mit dem RNA-Ziel
stromabwärts
von einem Amplifikationsprimer, der einen RNA-Polymerase-Promotor
enthält,
kommt. In einem Reaktionsschema, welches dem zuvor beschriebenen ähnelt, wird
der hybridisierte Signalprimer, der die hybridisierte Reportersonde
oder das unmarkierte zweite Oligonucleotid umfasst, 1) verlängert und
2) durch Verlängerung
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers verdrängt. Das verdrängte Verlängerungsprodukt
wird dann durch Hybridisierung und Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers
gänzlich
doppelsträngig
gemacht. Dies verdrängt
die Reportersonde oder das unmarkierte zweite Oligonucleotid aus
dem DNA-Linker-Oligonucleotid des Signalprimers, wodurch der Abstand
zwischen dem Donor- und dem Quencher-Farbstoff einer Reportersonde
verändert
wird und sich eine Veränderung
des Grads der Fluoreszenzlöschung
des Donor-Fluorophors ergibt. Der Signalprimer für 3SR oder NASBA enthält keine
RNA-Polymerase-Promotorsequenz und kann daher nicht als Amplifikationsprimer wirken,
wodurch das nichtspezifische Hintergrundsignal verringert wird.
Dies ist analog zum Signalprimer in einer SDA, der keine mit Einzelstrangbrüchen versehbare
RERS enthält
und daher nicht maßgeblich
zu einer exponentiellen Hintergrundamplifikation nichtspezifischer
Ziele beiträgt.
-
In
Hinblick auf einen reduzierten Hintergrund wird bevorzugt, dass
die erfindungsgemäßen Signalprimer
wie obenstehend beschrieben verwendet werden, wobei das Signalprimer-Verlängerungsprodukt
durch Verdrängung
aufgrund einer Verlängerung
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers von der Zielsequenz getrennt wird.
Es ist jedoch zu erkennen, dass die für eine Verwendung in den verschiedenen
Nucleinsäureamplifikationsreaktionen
bekannten Amplifikationsprimer auch durch Hinzufügung einer 5'- Sequenz mit intermolekular gepaarten
Basen modifiziert werden können,
wie hinsichtlich der erfindungsgemäßen Signalprimer beschrieben
wurde. Bei dieser Ausführungsform
kann das Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt mit dem doppelsträngigen 5'-Abschnitt durch
Verdrängung
aufgrund einer Verlängerung
eines stromaufwärts
gelegenen Nicht-Amplifikationsprimers
(z.B. von Bumperprimern wie bei einer SDA), durch Denaturierung
(z.B. Erhitzung wie bei einer PCR) oder durch enzymatischen Aufschluss
des Zielstrangs (z.B. RNase H wie bei einer 3SR) von der Zielsequenz
getrennt werden. Amplifikationsprimer, die den doppelsträngigen 5'-Abschnitt und das
Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar umfassen, beseitigen den Bedarf an
dem zusätzlichen
Signalprimer in der Reaktion, da jedoch bei dieser Ausführungsform
der Hintergrund höher
sein könnte,
kann die Empfindlichkeit der Analyse verringert werden.
-
Bei
einer PCR wird der Amplifikationsprimer durch Hinzufügen von
Sequenzen 5' zur
Zielbindesequenz, welche zur Reportersonde oder zum unmarkierten
zweiten Oligonucleotid komplementär sind, zu einem DNA-Linker-Oligonucleotid
modifiziert. Die Reportersonde oder das unmarkierte zweite Oligonucleotid wird
dann mit der hinzugefügten
5'-Sequenz hybridisiert.
Dieser Primer ist mit dem obenstehend beschriebenen PCR-Signalprimer strukturell
identisch. In funktioneller Hinsicht unterscheidet er sich allerdings
dadurch, dass kein zu verlängernder
und zu verdrängender,
stromabwärts
gelegener Primer vorhanden ist und der Amplifikationsprimer selbst
für die
Veränderung
der Fluoreszenz sorgt. Bei einer 3SR, NASBA und TMA kann die zum
zweiten Oligonucleotid komplementäre Sequenz 5' zum Promotor eines
Amplifikationsprimers platziert und das zweite Oligonucleotid mit
dieser hybridisiert werden, so dass das zweite Oligonucleotid verdrängt und das
DNA-Linker-Oligonucleotid im doppelsträngigen DNA-Abschnitt des Amplifikationszyklus
vollständig
doppelsträngig
gemacht wird. Ein zweiter Amplifikationsprimer, der keine Promotorsequenz
enthält
(wie z.B. bei einer NASBA), kann ebenso oder alternativ die zum
hybridisierten zweiten Oligonucleotid komplementären Sequenzen 5' zur Zielbindesequenz
enthalten.
-
Bei
einer weiteren alternativen Ausführungsform
kann die Detektorsonde in Analyseformaten, die nicht auf einer Amplifikation
beruhen, zum Nachweisen von Ziel-Oligonucleotiden
verwendet werden. Bei einer ersten Ausführungsform einer Nicht-Amplifikation hybridisiert
die einzelsträngige
3'-Zielbindesequenz
des DNA-Linkers solcherart mit dem 3'-Ende des Ziel-Oligonucleotids, dass
der gepaarte Basen aufweisende Duplexabschnitt des Signalprimers
einen 5'-Überhang
bildet. Die Zielsequenz wirkt in einer Primerverlängerungsreaktion
als Primer, um einen zum DNA-Linker-Oligonucleotid komplementären Strang
zu synthetisieren, wobei eine strangverdrängende Polymerase verwendet
wird, welche die Zielsequenz verlängert, wobei der 5'-Überhang (d.h. die Sequenz des
DNA-Linkers, die mit dem zweiten Oligonucleotid Basenpaare bildet)
als Matrize verwendet wird. Wenn die Zielbindesequenz der Detektor-Nucleinsäure nur
mit einem Teil der Zielsequenz hybridisiert, bildet die Zielsequenz
ebenfalls einen 5'-Überhang
und wird das DNA-Linker-Oligonucleotid des Signalprimers gleichermaßen verlängert, wobei
der 5'-Überhang
des Ziels als Matrize verwendet wird. Wenn die Zielbindesequenz
des Signalprimers zur gesamten Länge
der Zielsequenz komplementär
ist, wird nur das Ziel verlängert.
In beiden Fällen
wird somit das zweite Oligonucleotid des Signalprimers aus dem DNA-Linker
verdrängt,
begleitet von einer Veränderung
eines Fluoreszenzparameters, wie obenstehend beschrieben. Eine Verlängerung
mit einer Verdrängung
des zweiten Oligonucleotids zum Bewirken einer Fluoreszenzveränderung
kann nur bei Vorhandensein eines Ziels stattfinden.
-
Ein
Merkmal der Erfindung besteht darin, dass eine anfängliche
Hybridisierung des Ziels mit den gepaarte Basen aufweisenden Sequenzen
in der Detektor-Nucleinsäure
nicht erforderlich ist. Bei zahlreichen Analysen des Stands der
Technik verringert eine anfängliche
kompetitive Hybridisierung die Affinität einer Sonde oder eines Primers
für das
Ziel und vermindert die Analyseempfindlichkeit. Im Gegensatz dazu
begünstigt die
anfängliche,
nicht kompetitive Bindung der erfindungsgemäßen Signalprimer eher eine
intermolekulare Hybridisierung bei jeder nachfolgenden kompetitiven
Hybridisierungsreaktion. Die Länge
des einzelsträngigen 3'-Schwanzes kann angepasst
werden, ohne die thermodynamischen Eigenschaften des Duplexabschnitts des
Signalprimers zu beeinflussen, so dass eine Zielhybridisierung optimiert
werden kann, ohne eine Neugestaltung des Duplexabschnitts des Signalprimers
zu erfordern. Dies vereinfacht maßgeblich das Primerdesign im
Vergleich zum Stand der Technik.
-
Die
Veränderung
der Fluoreszenz, die aus einer Verdrängung der Reportersonde oder
des unmarkierten zweiten Oligonucleotids resultiert, kann an einem
ausgewählten
Endpunkt in der Reaktion detektiert werden. Da vollständig oder
teilweise verdrängte
zweite Oligonucleotide gleichzeitig mit einer Hybridisierung und Primerverlängerung
hergestellt werden, kann die Veränderung
der Fluoreszenz jedoch auch bei Stattfinden der Reaktion, d.h. in "Echtzeit", überwacht
werden. Dieses homogene Echtzeit-Analyseformat kann zur Bereitstellung
semiquantitativer oder quantitativer Informationen über die
anfänglich
vorhandene Menge an Ziel eingesetzt werden. Beispielsweise ist die
Geschwindigkeit, mit der sich die Fluoreszenzintensität während der Verdrängungsreaktion
des zweiten Oligonucleotids (entweder als Teil einer Zielamplifikation
oder in Nichtamplifikations-Detektionsverfahren) ändert, ein
Hinweis auf anfängliche
Zielpegel. Als Ergebnis erreicht die Fluoreszenz rascher einen ausgewählten Schwellenwert
(d.h. in kürzerer
Zeit zur Positivität),
wenn mehr Anfangskopien der Zielsequenz vorhanden sind. Außerdem ist
die Geschwindigkeit der Veränderung
von Fluoreszenzparametern während
des Ablaufs der Verdrängungsreaktion
des zweiten Oligonucleotids in Proben, die größere anfängliche Zielmengen enthalten,
höher als
in Proben, die geringere anfängliche
Zielmengen enthalten. Diese oder andere Messungen, die im Stand
der Technik bekannt sind, können
als Hinweis auf das Vorhandensein eines Ziels oder als Hinweis auf
eine Zielamplifikation vorgenommen werden. Die anfängliche
Zielmenge wird typischerweise durch einen Vergleich der Versuchsergebnisse
mit Ergebnissen hinsichtlich bekannter Zielmengen bestimmt.
-
Zahlreiche,
im Stand der Technik bekannte Donor/Quencher-Farbstoffpaare sind
bei der vorliegenden Erfindung nützlich.
Diese umfassen beispielsweise Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)/Tetramethylrhodaminisothiocyanat
(TRITC), FITC/Texas RedTM (Molecular Probes),
FITC/N-Hydroxysuccinimidyl-1-pyrenbutyrat (PYB), FITC/Eosinisothiocyanat
(EITC), N-Hydroxysuccinimidyl-1-pyrensulfonat (PYS)/FITC, FITC/Rhodamin X,
FITC/Tetramethylrhodamin (TAMRA) und andere. Die Auswahl eines bestimmten
Donor/Quencher-Paars ist nicht entscheidend. Bei Energietransfer-Löschungsmechanismen ist es nur
erforderlich, dass die Emissionswellenlängen des Donor-Fluorophors mit den
Anregungswellenlängen
des Quenchers überlappen,
d.h., zwischen den beiden Farbstoffen muss eine ausreichende spektrale Überlappung
bestehen, um eine effiziente Energieübertragung, Ladungsübertragung
oder Fluoreszenzlöschung
zu ermöglichen.
P-(Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) ist ein nicht
fluoreszierender Quencher-Farbstoff, welcher die Fluoreszenz aus einem
benachbarten Fluorophor, z.B. Fluoreszein oder 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin
(EDANS), wirksam löscht.
Bestimmte Donor/Quencher-Paare sind obenstehend und in den nachfolgenden
Beispielen veranschaulicht, andere sind dem Fachmann jedoch offensichtlich
und bei der Erfindung ebenfalls von Nutzen. Jedes Farbstoffpaar,
das bei den erfindungsgemäßen Detektor-Nucleinsäuren eine
Fluoreszenzlöschung
bewirkt, ist für
die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, und
zwar ungeachtet des Mechanismus, durch den die Löschung erfolgt. Terminale und
interne Markierungsverfahren sind im Stand der Technik ebenfalls
bekannt und können
routinemäßig eingesetzt
werden, um den Donor- und den Quencher-Farbstoff an deren jeweiligen
Stellen in der Detektor-Nucleinsäure
zu verkoppeln.
-
BEISPIEL 1
-
Strangverdrängungsamplifikationsreaktionen,
die erfindungsgemäße Detektorsonden
enthielten, wurden im Wesentlichen so ablaufen gelassen, wie im
U.S.-Patent Nr. 5,547,861 hinsichtlich der Detektion einer synthetischen
Zielsequenz beschrieben. Eine erste Reaktion enthielt 106 Kopien der für eine Amplifikation der synthetischen
Zielsequenz geeigneten Zielsequenz-SDA-Amplifikationsprimer und
eine erfindungsgemäße Detektorsonde
(UDP1), umfassend ein DNA-Linker-Oligonucleotid mit einer für das Ziel
spezifischen Zielbinde sequenz und einer zu einer Reportersonde komplementären 5'-Sequenz, sowie eine
mit Fluorescein und Dabcyl markierte Reportersonde. Die Sequenz
der Reportersonde wurde so gewählt,
dass sie sich spontan zu einer Haarnadelstruktur falten würde, wenn
sie nicht mit ihrer komplementären
Sequenz hybridisiert ist, wodurch die beiden Farbstoffe in engere
räumliche
Nähe gebracht
und die Fluoreszenzlöschung
verstärkt
wird, verglichen mit dem Ausmaß der
Fluoreszenzlöschung
bei einer Hybridisierung der Reportersonde mit einer komplementären Sequenz.
Die Sequenzen der Detektorsonde (in 5'- bis 3'-Richtung dargestellt) waren wie folgt.
Die Zielbindesequenz des DNA-Linker-Oligonucleotids ist kursiv gedruckt,
und die komplementären
Sequenzen im DNA-Linker-Oligonucleotid und in der Reportersonde
sind unterstrichen. Die 5'-
und die 3'-Sequenz
der Reportersonde hybridisieren zwecks Bildung einer Haarnadel.
-
DNA-Linker-Oligonucleotid
(SEQ ID NO: 1):
-
Reportersonde
(SEQ ID NO: 2):
-
Eine
zweite Reaktion enthielt kein Ziel und dieselbe Detektorsonde wie
in der ersten Reaktion. Eine dritte Reaktion war eine Kontrollreaktion,
die nur 106 Kopien des Ziels und die Reportersonde
(d.h. kein DNA-Linker-Oligonucleotid) enthielt. Die Fluorescein-Fluoreszenzintensität wurde
während
der Amplifikationsreaktionen in Echtzeit nachgewiesen. Wie in 3 dargestellt,
blieb die Donor-Fluoreszenz bei Fehlen eines Ziels während der
gesamten Reaktion hoch (relativ ungelöscht), was darauf hinweist,
dass die Reportersonde aus dem DNA-Linker-Oligonucleotid im Signalprimer
nicht verdrängt
wurde. Bei Vorhandensein eines Ziels war die Donor-Fluoreszenz jedoch
anfänglich
hoch (relativ ungelöscht),
nahm allerdings während
des Zeitverlaufs der Amplifikationsreaktion ab, da die Reportersonde
verdrängt
wurde und ihre verhältnismäßig stärker gelöschte Konformation
einnahm. Bei Fehlen einer Detektorsonde blieb die Donor-Fluoreszenz
während
der gesamten Amplifikationsreaktion gelöscht. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die erfindungsgemäße Detektorsonde zum
Nachweisen einer Nucleinsäure-Zielsequenz
durch Überwachung
von Veränderungen
im Ausmaß der Fluoreszenzlöschung eingesetzt
werden kann.
-
BEISPIEL 2
-
Beispiel
1 wurde wiederholt, wobei eine Reportersondensequenz (UDP5) verwendet
wurde, die spontan eine G-Quartettstruktur bildet, wenn sie nicht
mit ihrem Complement hybridisiert ist, welche G-Quartettstruktur
den Donor- und den Quencher-Farbstoff in eine engere räumliche
Nähe bringt
als bei einer Hybridisierung der Reportersonde mit einer komplementären Sequenz.
Das DNA-Linker-Oligonucleotid und die Reportersondensequenzen werden
nachstehend gezeigt. Die gesamte Sequenz der Reportersonde ist im G-Quartett eingebaut,
wenn die Reportersonde nicht mit einer komplementären Sequenz
hybridisiert ist.
-
DNA-Linker-Oligonucleotid
(SEQ ID NO: 3):
-
Reportersonde
(SEQ ID NO: 4):
-
Wiederum
führte
eine Zielamplifikation zu einer verminderten Donor-Fluoreszenz,
da die Reportersonde aus dem DNA-Linker-Oligonucleotid des Signalprimers
verdrängt
wurde. Die Reportersonde allein erkannte das Ziel nicht, und es
wurde keine Veränderung
der Donor-Fluoreszenz beobachtet, wenn kein Ziel vorhanden war.
Diese Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
-
-
