JP6381659B2 - メチル化検出方法 - Google Patents
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Description
下記ヌクレオチド塩基配列の113個のヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体(ATDBioなどから入手)を、これを含む水溶液を95℃に加熱し、次いで10分/℃の速度で室温まで除冷することにより、70番目の塩基を軸に折りたたんだ。
1.HaemoklenTaq DNAポリメラーゼが、dCTPヌクレオチドを第1のオリゴヌクレオチドの3’陥凹末端に取り込むステップ。
2.Taqリガーゼが、dCTPを取り込んだ第1のオリゴヌクレオチドのみについて、3’陥凹末端に第2のオリゴヌクレオチドをライゲートし、「完成型」の補足分子を形成するステップ。
3.取り込まれたdCTPがメチル化されていた場合、Axol制限エンドヌクレアーゼが完成型の補足分子のそれぞれを2つに切断するステップ。取り込まれたdCTPがメチル化されていない場合、切断は起こらない。
下記ヌクレオチド塩基配列の113個のヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体(ATDBioから入手)を、これを含む水溶液を95℃に加熱し、次いで10分/℃の速度で室温まで除冷することにより、70番目の塩基を軸に折りたたんだ。
(YはAlexa Fluor 633(蛍光体)で標識したT塩基、QはクエンチャーBHQ−2で標識したT塩基である)。次いで、メチル化dCTPまたは非メチル化dCTPを含む溶液を添加した。
1.HaemoklenTaq DNAポリメラーゼが、dCTPヌクレオチドを第1のオリゴヌクレオチドの3’陥凹末端に取り込むステップ。
2.Taqリガーゼが、dCTPを取り込んだ第1のオリゴヌクレオチドのみについて、3’陥凹末端に第2のオリゴヌクレオチドをライゲートし、「完成型」の補足分子を形成するステップ。
3.取り込まれたdCTPがメチル化されていなかった場合、Axol制限エンドヌクレアーゼが完成型の補足分子のそれぞれを2つに切断するステップ。取り込まれたdCTPがメチル化されていた場合、切断は起こらない。
Claims (22)
- 所定の単一ヌクレオチドがメチル化されているか否かを決定する方法であって、
(a)前記単一ヌクレオチドを1つ以上のハイブリダイゼーションプローブ種と接触させるステップであって、前記ハイブリダイゼーションプローブ種は、それぞれ、未使用形態において、(1)1つ以上の第1の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、さらに、(i)二本鎖領域および一本鎖領域、ならびに、(ii)エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含む第1のオリゴヌクレオチドであって、前記第1のオリゴヌクレオチドは、折り返されて、一本鎖ヌクレオチドのループ領域と、前記二本鎖領域と、陥凹末端とが形成され、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は前記第1のオリゴヌクレオチドの陥凹末端に結合し、前記1つ以上の第1の検出可能なエレメントは前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域と前記一本鎖ヌクレオチドのループ領域との間に位置する前記第1のオリゴヌクレオチドと、(2)1つ以上の第2の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、前記第1のオリゴヌクレオチドの陥凹末端を超えて2ヌクレオチドの出発点からアラインした場合に少なくとも部分的に前記第1のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域とヌクレオチド配列が相補的な鎖となるようにされた第2の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、ステップ;
(b)関連する前記ハイブリダイゼーションプローブ種について、(i)前記単一ヌクレオチドを、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域および前記一本鎖領域に結合させ、かつ、(ii)前記第2のオリゴヌクレオチドを、前記単一ヌクレオチドおよび前記一本鎖領域に結合させて、実質的に二本鎖の使用済プローブを形成するステップ;
(c1)前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して2つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物に切断される条件で、前記使用済みプローブをメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ、または、(c2)前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記使用済みプローブが前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域に隣接して2つの二本鎖オリゴヌクレオチド生成物に切断される条件で、前記使用済みプローブをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理するステップ;および、
(d1)ステップ(c1)の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第1の検出可能なエレメントのみを、または、前記第1の検出可能なエレメントおよび前記第2の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第2の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップ、または、(d2)ステップ(c2)の前記生成物をエキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼで処理し、前記単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、前記第1の検出可能なエレメントのみを、または、前記第1の検出可能なエレメントおよび前記第2の検出可能なエレメントの両方を検出可能な状態で遊離させるか、あるいは、前記単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、前記第2の検出可能なエレメントのみを遊離させるステップを含む、方法。 - 前記第1のオリゴヌクレオチドの形状がj型であり、前記第2のオリゴヌクレオチドの形状がi型である、請求項1に記載の方法。
- 前記単一ヌクレオチドが結合する部位に隣接する前記第1のオリゴヌクレオチドの陥凹末端が3’末端である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域が、2つのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖の使用済みの前記プローブが、一本鎖のオーバーハング領域を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ以上のプローブが使用され、それぞれ、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上のヌクレオチドが異なる種類である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 2種類の第1のオリゴヌクレオチドを含む2種類のプローブが使用され、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上の2種類のヌクレオチドが、グアニンとシトシンのヌクレオチド塩基の対、および、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシルのヌクレオチド塩基の対のうちの1つを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 4種類の第1のオリゴヌクレオチドを含む4種類のプローブが使用され、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域のすぐ隣の一本鎖領域上の4種類のヌクレオチドが、(a)グアニン、シトシン、アデニン、および、チミンの4つのヌクレオチド塩基のうちの1つ、または、(b)グアニン、シトシン、アデニン、および、ウラシルの4つのヌクレオチド塩基のうちの1つを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、自身に特徴的な検出可能なエレメントを含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 使用する前記第1のオリゴヌクレオチド種の少なくとも一部が、複数の第1の検出可能なエレメントを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、複数の第2の検出可能なエレメントを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 様々な前記第1の検出可能なエレメントおよび前記第2の検出可能なエレメントが、それぞれ異なる検出特性を示す異なる蛍光体または量子ドットを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能なエレメントが蛍光体であり、当該蛍光体が、プローブ内において、クエンチャーの存在によりまたは互いの自己消光により検出不可能とされている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼが、3’→5’二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するが、5
’→3’エキソヌクレアーゼ活性および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有さない、請求
項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(d1)またはステップ(d2)で使用される前記エキソヌクレアーゼが、熱により活性化されるものである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素が、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域が前記第2のオリゴヌクレオチドを含む切断プローブ部分に結合したままとなるように使用済みの前記プローブを切断する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- (e)ステップ(d1)またはステップ(d2)で遊離した前記様々な検出可能なエレメントを検出するステップを更に含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ヌクレオチドが、ポリヌクレオチド検体のプログレッシブな加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解に由来する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチド三リン酸を含む単一ヌクレオチドを含む液滴中で実施される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 液滴のストリームに適用され、前記液滴の少なくとも一部がポリヌクレオチド検体に由来する単一のヌクレオチド三リン酸を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記液滴のストリームにおける前記液滴中の前記単一のヌクレオチド三リン酸の順序は、前記検体のヌクレオチド配列に対応する、請求項20に記載の方法。
- 未使用状態でエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性がある2成分ハイブリダイゼーションプローブであって、
1つ以上の第1の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合し、かつ、さらに、(i)二本鎖領域および一本鎖領域、ならびに、(ii)エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含むj型の第1のオリゴヌクレオチドであって、前記j型の第1のオリゴヌクレオチドは、折り返されて、一本鎖ヌクレオチドのループ領域と、前記二本鎖領域と、3’陥凹末端と、5’突出末端とが形成されており、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は前記j型の第1のオリゴヌクレオチドの3’陥凹末端に結合し、前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域は、ホスホロチオエート結合で結合している、前記3’陥凹末端に隣接する少なくとも一部のヌクレオチドであり、前記1つ以上の第1の検出可能なエレメントは前記エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域と前記一本鎖ヌクレオチドのループ領域との間に位置するj型の第1のオリゴヌクレオチドと、
前記3’陥凹末端を超えて2ヌクレオチドの出発点からアラインした場合に、ヌクレオチド配列が前記第1のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ヌクレオチド領域と少なくとも部分的に相補的であり、かつ、前記第1のオリゴヌクレオチド上に、単一ヌクレオチドを補足することができる部位を構成する、ハイブリダイズされていない単一ヌクレオチドのキャビティを前記3’陥凹末端のすぐ隣に残すように、前記第1のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ヌクレオチド領域にハイブリダイズする第2の一本鎖オリゴヌクレオチドであって、1つ以上の第2の検出可能なエレメントが実質的に検出不可能な状態で結合している第2の一本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、2成分ハイブリダイゼーションプローブ。
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