JP2018512880A5

JP2018512880A5 -

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Publication number: JP2018512880A5
Application number: JP2017555324A
Authority: JP
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2019-04-11

Description

上記のこれらの方法のそれぞれのある特定の実施形態では、配列タグを、それぞれの増幅プライマー対のいずれか１つまたは両方のプライマーの５’末端に結合させる。一部の実施形態では、本明細書において提供される増幅反応条件は、７個またはそれ超の核酸標的領域の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超、最大１００％から選択される百分率の７個またはそれ超の核酸標的領域の増幅を可能にする。本明細書において提供される条件は、多様な増幅プライマー対ならびに大量および少量核酸種の多様な混合物を使用する７重またはそれ超の増幅反応の多数のマルチプレックス反応に当てはまる。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１つまたは複数の少量核酸種と１つまたは複数の大量核酸種の混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
（ｉ）前記１つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が、（Ａ）前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または（Ｂ）前記１つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも１つが、前記増幅混合物中の少なくとも１つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度より低い、ステップと、
（ｃ）（ｂ）の伸長産物を分析し、それによって、前記１つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
（項目２）
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ｂ）が少なくとも２つの反応槽または区画の組において実施され、
第１の槽または区画が、前記大量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬を含むが、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含まない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含むが、前記大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含む、
項目１に記載の方法。
（項目４）
前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
１つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種を定量する方法であって、前記少量核酸種が同じ大量核酸種の変種であり、それぞれ前記大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）（ｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれ、および（ｉｉ）前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含む伸長条件下で、前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、（１）前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、かつ（２）前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
（ｃ）前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップとを含む、方法。
（項目６）
１つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種を定量するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
（ｉ）前記１つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が（Ａ）前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または（Ｂ）前記１つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも１つが前記増幅混合物中の少なくとも１つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、（１）前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、（２）前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
（ｃ）前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量（複数）の比率を決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度（複数）に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
（項目７）
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が単一のマルチプレックス反応において同定される、項目５または項目６に記載の方法。
（項目８）
前記少量および前記大量核酸種の配列が、単一塩基だけ異なり、プライマーが、異なっている前記単一塩基までまたはそれを超えて伸長する、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少量核酸種の配列が、前記大量核酸種の配列と比較して挿入または欠失を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記１つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）変種である、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記少量および前記大量核酸種がそれぞれ、同じ遺伝子のバリアントおよび野生型対立遺伝子である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記大量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記少量核酸種が前記宿主以外の対象に由来するか、または、前記少量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記大量核酸種が前記宿主以外の対象に由来する、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約１０％未満であるコピー数で存在する、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約１％〜１０％未満の間であるコピー数で存在する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約２％〜１０％未満の間であるコピー数で存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約５％またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約２％またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約１％〜約２０％の間である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約０．１％〜約１０％の間である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約０．１％〜約４％の間である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約０．０１％〜約１０％の間である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約０．０１％〜約４％の間である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記大量核酸種に対する前記鎖停止試薬の濃度が、特定の大量種／少量種トランジションに基づいて変化する、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記鎖停止試薬が鎖停止ヌクレオチドである、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記鎖停止ヌクレオチドが、独立してｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが１つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが２つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２８）
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが３つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２９）
前記鎖停止試薬が、１つまたは複数の非環式停止剤を含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
（ａ）において約３０〜約４５の間のＰＣＲ増幅サイクルを含む、項目１から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
（ｂ）の前記伸長条件が、約２０〜約３００の間のサイクルを含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
（ｂ）の前記伸長条件が少なくとも５０サイクルを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
１つまたは複数の前記鎖停止試薬が検出可能な標識を含む、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記標識が蛍光標識または色素である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標識が質量標識である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記標識の検出をさらに含み、それによって前記１つまたは複数の少量核酸種が同定または定量される、項目３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記標識が質量標識であり、検出が質量分析による、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記標識が蛍光標識または色素であり、検出が電気泳動またはリアルタイムＰＣＲによる、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約１％であるコピー数で存在する、項目１から１４および１６から３８のいずれか一項に記載の方法。

Claims

１つまたは複数の少量核酸種と１つまたは複数の大量核酸種の混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
（ｉ）前記１つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が、（Ａ）前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または（Ｂ）前記１つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも１つが、前記増幅混合物中の少なくとも１つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長し、それによって、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度より低い、ステップと、
（ｃ）（ｂ）の伸長産物を分析し、それによって、前記１つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、請求項１に記載の方法。
（ｂ）が少なくとも２つの反応槽または区画の組において実施され、
第１の槽または区画が、前記大量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬を含むが、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含まない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含むが、前記大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含む、
請求項１に記載の方法。
前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種を定量する方法であって、前記少量核酸種が同じ大量核酸種の変種であり、それぞれ前記大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）（ｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれ、および（ｉｉ）前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含む伸長条件下で、前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、（１）前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、かつ（２）前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
（ｃ）前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップとを含む、方法。
１つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記１つまたは複数の少量核酸種を定量するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
（ａ）ｄＮＴＰを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
（ｂ）鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
（ｉ）前記１つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
（ｉｉ）前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が（Ａ）前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または（Ｂ）前記１つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも１つが前記増幅混合物中の少なくとも１つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、（１）前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、（２）前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
（ｃ）前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記１つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量（複数）の比率を決定するステップと、
（ｄ）（ｃ）の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記１つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度（複数）に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が単一のマルチプレックス反応において同定される、請求項５または請求項６に記載の方法。
前記少量および前記大量核酸種の配列が、単一塩基だけ異なり、プライマーが、異なっている前記単一塩基まで伸長する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
前記少量核酸種の配列が、前記大量核酸種の配列と比較して挿入または欠失を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記少量および前記大量核酸種がそれぞれ、同じ遺伝子のバリアントおよび野生型対立遺伝子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約１％〜１０％未満の間であるコピー数で存在する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約０．０１％〜約１０％の間である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記大量核酸種に対する前記鎖停止試薬の濃度が、特定の大量種／少量種トランジションに基づいて変化する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
前記鎖停止試薬が鎖停止ヌクレオチドである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
前記鎖停止ヌクレオチドが、独立してｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＵＴＰから選択される、請求項１４に記載の方法。
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが１つの鎖停止ヌクレオチドからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが２つの鎖停止ヌクレオチドからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
１つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが３つの鎖停止ヌクレオチドからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
前記鎖停止試薬が、１つまたは複数の非環式停止剤を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の前記鎖停止試薬が検出可能な標識を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
前記標識の検出をさらに含み、それによって前記１つまたは複数の少量核酸種が同定または定量される、請求項２０に記載の方法。
前記標識が質量標識であり、検出が質量分析による、請求項２１に記載の方法。
前記標識が蛍光標識または色素であり、検出が電気泳動またはリアルタイムＰＣＲによる、請求項２１に記載の方法。