JP7325467B2 - 少量の対立遺伝子および多型の同定ならびに定量のためのマルチプレックス法 - Google Patents
少量の対立遺伝子および多型の同定ならびに定量のためのマルチプレックス法 Download PDFInfo
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Description
本願は、米国仮特許出願第62/280951号(2016年1月20日に出願され、MULTIPLEXED METHOD FOR THE IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF MINOR ALLELES AND POLYMORPHISMSと題され、発明者としてAnders Nygrenが指名され、代理人ドケット番号AGB-7001-PV2が割り当てられる)の利益を主張する。この特許出願は、米国仮出願第62/152697号(2015年4月24日に出願され、MULTIPLEXED METHOD FOR THE IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF MINOR ALLELES AND POLYMORPHISMSと題され、発明者としてAnders Nygrenが指名され、代理人ドケット番号AGB-7001-PVが割り当てられる)の利益も主張する。この特許出願は、米国特許出願第10/903,268号(2004年1月30日に出願され、現在は米国特許第8,003,317号であり、発明者としてMartin BeaulieuおよびDirk Johannes van den Boomが指名され、METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAN REACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONSと題され、代理人ドケット番号SEQ-2079-UTを有し、この米国特許法第119条(e)項のもとの優先権の利益は、米国仮出願第60/492,102号(2003年7月31日に出願され、Martin BeaulieuおよびDirk van den Boomに対して、「METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAIN REACTIONS AND HOMOGENEOUS MASS EXTENSION REACTIONS」と題され、代理人ドケット番号17082-087P01(P2079)を有する))の継続出願である、米国特許出願第13/193,390号(2011年7月28日に出願され、現在は米国特許第8,349,566号であり、発明者としてMartin BeaulieuおよびDirk Johannes van den Boomが指名され、METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAN REACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONSと題され、代理人ドケット番号AGB-2079-CTを有する)の継続出願である、米国特許出願第13/718,758号(2012年12月18日に出願され、発明者としてMartin BeaulieuおよびDirk Johannes van den Boomが指名され、METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAN REACTIONS AND HOMOGENOUS MASS EXTENSION REACTIONSと題され、代理人ドケット番号AGB-2079-CT2を有する)に関連する。本願は、国際PC出願第PCT/US2004/024953号(2012年12月18日に出願され、「METHODS FOR HIGH LEVEL MULTIPLEXED POLYMERASE CHAIN REACTIONS AND HOMOGENEOUS MASS EXTENSION REACTIONS」と題され、発明者としてMartin BeaulieuおよびDirk van den Boomが指名される)にも関連する。これら出願の文章、表および図を含むそれぞれの主題は、全体が参照によって組み込まれる。
本技術は、部分的に核酸変種、例えば野生型対立遺伝子の多型またはバリアント変種を同定および/または定量することに関する。
特異的核酸の検出は、診断医学および分子生物学の研究にとって重要なツールである。核酸アッセイは、例えば宿主対象における細菌およびウイルスなどの感染性生物を同定する、正常な遺伝子の発現を探索してがん遺伝子などのバリアント遺伝子を同定する、組織移植前に適合性に関して組織の型を決定する、法医学のために組織または血液試料を合致させる、異なる種の遺伝子間の相同性を分析する、ならびに遺伝子の変種である多型および対立遺伝子を同定することができる。これらの応用はしばしば、相対的に多量の非標的(大量)核酸種を含有する核酸試料または混合物に存在する相対的に少量の目的の少量核酸種(例えば、野生型対立遺伝子の少量の対立遺伝子変種またはがん遺伝子)を検出および/または定量する能力を必要とする。この能力は、核酸アッセイをマルチプレックス方式で、すなわち複数の核酸がスクリーニングされるように実施することができれば(例えば、効率に関して)さらに増強される。
本明細書において、高い検出感度を高い精度と組み合わせて、そうでなければ検出されないかまたは最適に検出もしくは定量されないある特定の低頻度変種の改善された同定および/または定量を提供する、マルチプレックス法を含む方法を提供する。
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて、混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと;
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で増幅混合物を伸長プライマーに接触させるステップであって、
(i)1つまたは複数の大量核酸種が、大量核酸種に対して特異的であるが、少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、少量核酸種に対して特異的であるが、大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬が(A)増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または(B)1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによってプライマーが、大量核酸種と比較して少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、少量核酸種および大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬のそれぞれの濃度より低い、
ステップと、
(c)(b)の伸長産物を分析し、それによって1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと、
を含むマルチプレックス方法を提供する。
第1の槽または区画は、大量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含有するが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含有しない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含有するが、大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含有しない伸長条件を含む。一部の実施形態では、鎖停止試薬のそれぞれの濃度は既知である。
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含有する核酸の増幅混合物を産生するステップと;
(b)(i)1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれ、および(ii)大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含む伸長条件下で、増幅混合物を伸長プライマーに接触させるステップであって、それによってプライマーが、大量核酸種と比較して少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、少量核酸種および大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、(1)鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、(2)大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度より低い、
ステップと、
(c)大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度と比較した、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度に基づいて、大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと、
を含む方法が提供される。
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で増幅混合物を伸長プライマーに接触させるステップであって、
(i)1つまたは複数の大量核酸種が、大量核酸種に対して特異的であるが、少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、少量核酸種に対して特異的であるが、大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬が(A)増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または(B)1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによってプライマーが、大量核酸種と比較して少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、少量核酸種および大量核酸種にそれぞれ対応する連鎖停止伸長産物が生成され、(1)鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、(2)大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度より低い、
ステップと、
(c)大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度と比較した、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度に基づいて、大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと、
を含むマルチプレックス方法が提供される。
第1の槽または区画は、大量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含有するが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含有しない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれは、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含有するが、大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含有しない伸長条件を含む。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
1つまたは複数の少量核酸種と1つまたは複数の大量核酸種の混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が、(A)前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが、前記増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度より低い、ステップと、
(c)(b)の伸長産物を分析し、それによって、前記1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
(項目2)
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、項目1に記載の方法。
(項目3)
(b)が少なくとも2つの反応槽または区画の組において実施され、
第1の槽または区画が、前記大量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬を含むが、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含まない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含むが、前記大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含む、
項目1に記載の方法。
(項目4)
前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知である、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
1つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種を定量する方法であって、前記少量核酸種が同じ大量核酸種の変種であり、それぞれ前記大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)(i)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれ、および(ii)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含む伸長条件下で、前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、(1)前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、かつ(2)前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
(c)前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、方法。
(項目6)
1つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種を定量するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が(A)前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが前記増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、(1)前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、(2)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
(c)前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量(複数)の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度(複数)に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
(項目7)
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が単一のマルチプレックス反応において同定される、項目5または項目6に記載の方法。
(項目8)
前記少量および前記大量核酸種の配列が、単一塩基だけ異なり、プライマーが、異なっている前記単一塩基までまたはそれを超えて伸長する、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記少量核酸種の配列が、前記大量核酸種の配列と比較して挿入または欠失を含む、項目1から8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の単一ヌクレオチド多型(SNP)変種である、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記少量および前記大量核酸種がそれぞれ、同じ遺伝子のバリアントおよび野生型対立遺伝子である、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記大量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記少量核酸種が前記宿主以外の対象に由来するか、または、前記少量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記大量核酸種が前記宿主以外の対象に由来する、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約10%未満であるコピー数で存在する、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約1%~10%未満の間であるコピー数で存在する、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約2%~10%未満の間であるコピー数で存在する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約5%またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約2%またはそれ未満であるコピー数で存在する、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約1%~約20%の間である、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.1%~約10%の間である、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.1%~約4%の間である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.01%~約10%の間である、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.01%~約4%の間である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記大量核酸種に対する前記鎖停止試薬の濃度が、特定の大量種/少量種トランジションに基づいて変化する、項目1から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記鎖停止試薬が鎖停止ヌクレオチドである、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記鎖停止ヌクレオチドが、独立してddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP、およびddUTPから選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが1つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目24または25に記載の方法。
(項目27)
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが2つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目24または25に記載の方法。
(項目28)
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが3つの鎖停止ヌクレオチドからなる、項目24または25に記載の方法。
(項目29)
前記鎖停止試薬が、1つまたは複数の非環式停止剤を含む、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
(a)において約30~約45の間のPCR増幅サイクルを含む、項目1から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
(b)の前記伸長条件が、約20~約300の間のサイクルを含む、項目1から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
(b)の前記伸長条件が少なくとも50サイクルを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
1つまたは複数の前記鎖停止試薬が検出可能な標識を含む、項目1から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記標識が蛍光標識または色素である、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記標識が質量標識である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記標識の検出をさらに含み、それによって前記1つまたは複数の少量核酸種が同定または定量される、項目33から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記標識が質量標識であり、検出が質量分析による、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記標識が蛍光標識または色素であり、検出が電気泳動またはリアルタイムPCRによる、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約1%であるコピー数で存在する、項目1から14および16から38のいずれか一項に記載の方法。
本明細書において、1つまたは複数の少量核酸種と1つまたは複数の大量核酸種の混合物を含有する試料中に存在する複数の少量核酸種中の1つまたは複数の存在または非存在を同定する方法が提供される。同様に、試料中の大量核酸種の量と比較して少量核酸種(例えば、頻度またはコピー数)を定量する方法も提供される。
本明細書において使用される用語「核酸」は、天然の核酸(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、合成核酸、非天然核酸(例えば、ペプチド核酸(PNA))、非修飾核酸、修飾核酸(例えば、メチル化DNAまたはRNA、標識DNAまたはRNA、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを有するDNAまたはRNA)を含むがこれらに限定されるわけではない、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。核酸を「ポリヌクレオチド」と呼ぶことは、共有結合によって連結された2つまたはそれ超のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を指す。核酸は、本明細書において記載されるプロセスと共に使用するために適した任意のタイプの核酸でありうる。ある特定の実施形態では、核酸は、DNA(例えば、相補的DNA(cDNA)、ゲノムDNA(gDNA)、プラスミドおよびベクターDNAなど)、RNA(例えば、ウイルスRNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、リボソームRNA(rRNA)、tRNAなど)、および/またはDNAもしくはRNA類似体(例えば、塩基類似体、糖類似体、および/または非ネイティブ骨格などを含有する)でありうる。核酸は、本明細書におけるプロセスを行うために有用な任意の形態(例えば、線形、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など)でありうる。核酸は、ある特定の実施形態では、プラスミド、ファージ、自律複製配列(ARS)、セントロメア、人工染色体、染色体、細胞、細胞核、もしくは細胞の細胞質であってもよく、またはそれらに由来してもよい。一部の実施形態では、核酸は、単一の染色体(例えば、核酸試料は、二倍体生物から得た試料の1つの染色体に由来しうる)に由来する。胎児核酸の場合、核酸は、父親の対立遺伝子、母親の対立遺伝子、または母親と父親の対立遺伝子に由来しうる。
本明細書において提供される方法の実施形態では、核酸種(例えば、少量および/または大量核酸種)は、ある特定の実施形態では増幅することができる。本明細書において使用される用語「増幅する」およびその文法的変化形は、鋳型核酸のコピーを生成するプロセスを指す。例えば、核酸鋳型を、鋳型または鋳型の一部のヌクレオチド配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する2つまたはそれ超の核酸アンプリコン(コピー)を線形または指数的に生成するプロセスに供してもよい。核酸増幅はしばしば特異的(例えば、アンプリコンは同じまたは実質的に同じ配列を有する)であるが、ある特定の実施形態では、時に非特異的でありうる(例えば、アンプリコンは異なる配列を有する)。核酸増幅は時に、試料中に存在する標的配列の量が少ないときに有益である。標的配列を増幅して、合成されたアンプリコンを検出することによって、標的核酸の検出のためにアッセイの最初に必要な標的配列がより少なくてすむことから、アッセイの感度を改善することができる。核酸種(少量または大量核酸種)は時に、ある特定の実施形態では、伸長オリゴヌクレオチド(プライマー、すなわちUEP)にハイブリダイズする前に増幅されない。
本明細書において使用される用語「識別可能な標識」および「識別可能なタグ」は、互いに識別することができ、タグが結合する核酸を同定するために使用することができる標識またはタグのタイプを指す。多様なタイプの標識およびタグが、本明細書において提供されるマルチプレックス方法で選択および使用されうる。例えば、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、小有機分子、光放射分子、吸光分子、光散乱分子、発光分子、同位元素、酵素等が、識別可能な標識またはタグとして使用されうる。ある特定の実施形態では、多様な長さ、多様な質量対電荷比、多様な電気泳動移動度(例えば、キャピラリー電気泳動移動度)、および/または多様な質量のオリゴヌクレオチド、アミノ酸、および/または低分子有機分子もまた、識別可能な標識またはタグとして使用されうる。したがって、蛍光体、放射性同位元素、比色剤、光放射剤、化学発光剤、光散乱剤等が、標識として使用されうる。標識の選択は、必要な感度、核酸とのコンジュゲーションの容易さ、安定性の要件、および利用可能な機器に依存しうる。本明細書において識別可能な標識およびタグに対して使用される用語「識別可能な特徴」は、別の標識またはタグ(例えば、質量および本明細書において記載される他のもの)と識別することができる1つの標識またはタグの任意の特徴を指す。一部の実施形態では、識別可能な標識およびタグの標識組成物は、質量分析において最適な飛行挙動が得られるように、および高いマルチプレックスレベルで標識およびタグを識別することができるように、選択および/または設計することができる。
本明細書において使用される、標識の「検出」という用語は、標識種の同定を指す。任意の適した検出装置を使用して、試料中の標識種を識別することができる。質量識別可能な標識を検出するために適した検出装置には、ある特定の質量分析、およびゲル電気泳動装置が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。質量分析フォーマットの例には、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析(MS)、MALDI直交型TOF MS(OTOF MS;二次元)、レーザー脱離質量分析(LDMS)、エレクトロスプレー(ES)MS、イオンサイクロトロン共鳴(ICR)MS、およびフーリエ変換MSが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において記載される方法は、検体を揮発させてイオン化する質量分析フォーマット(「イオン化MS」、例えばMALDI-TOF MS、LDMS、ESMS、線形TOF、OTOF)に容易に応用可能である。直交型イオン抽出MALDI-TOFおよびアキシャルMALDI-TOFは、比較的高い分解能をもたらすことができ、それによって相対的に高レベルのマルチプレックス化をもたらすことができる。光放射、吸光、および/または光散乱標識を検出するために適した検出装置は、ある特定の光検出器および光子検出器(例えば、蛍光、化学発光、吸収、および/または光散乱標識)を含むがこれらに限定されるわけではない。
以下は、本明細書において記載されるマルチプレックス技術の非制限的な応用の例である。
疾患のゲノム基礎およびそのマーカーを同定する改善された方法を提供する。本明細書において提供される方法によって同定することができる配列バリエーション(例えば、遺伝子変種)候補体は、多型である配列バリエーションを含む配列を含む。多型は、天然に存在する体細胞配列バリエーション、および変異により生じるものの両方を含む。多型は、局在化領域における1つまたは複数のヌクレオチドが個体によって異なる配列マイクロバリアント、1つのヌクレオチドから数百万塩基までサイズが異なりうる挿入および欠失、ならびに反復配列の数が異なるマイクロサテライトまたはヌクレオチド反復配列を含むがこれらに限定されるわけではない。ヌクレオチド反復配列は、何回も同じ配列が反復される同種反復配列、例えばジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはより大きい反復配列、および同様に配列モチーフが反復することが見出されるヘテロヌクレオチド反復配列を含む。所定の座に関して、ヌクレオチド反復配列の数は、個体に応じて変化しうる。
本明細書において、疾患を診断するまたは疾患の予後を決定するために使用することができる、疾患の遺伝子マーカーである配列バリエーションの迅速かつ正確な同定方法が提供される。遺伝子マーカーによって特徴付けられる疾患には、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、自己免疫疾患、およびがんが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。全ての生物の疾患は、遺伝性であるかまたはウイルスおよび毒素などの環境ストレスに対する体の反応に起因する遺伝的成分を有する。進行中のゲノム研究の最終的な目標は、この情報を使用して、これらの疾患を同定、処置、およびおそらく治癒する新規方法を開発することである。第1のステップは、疾患組織をスクリーニングして、個々の試料のレベルでゲノムの変化を同定することであった。これらの「疾患」マーカーの同定は、逸脱した遺伝子または配列変種を同定するために、ゲノムマーカーの変化の検出能に依存する。ゲノムマーカー(単一ヌクレオチド多型(SNP)、マイクロサテライト、ならびに他の非コードゲノム領域、タンデム反復配列、イントロンおよびエキソンを含む全ての遺伝子座)を、ヒトを含む全ての生物の同定のために使用することができる。これらのマーカーは、集団を同定する方法のみならず、疾患に対するその反応、薬物処置、環境物質に対する抵抗性、および他の要因に従って集団の階層化を可能にする方法を提供する。疾患マーカーは時に変異であり、一部の実施形態では、例えば野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する体細胞変異(例えば、がん組織対正常組織、バリアントウイルス型対正常なウイルス型(例えば、HIV))などの比較的まれな対立遺伝子でありうる。一部の実施形態では、まれな対立遺伝子または変異は、野生型の5%、4%、3%、2%、1%、0.8%、0.75%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%未満に相当する。一部の実施形態では、まれな対立遺伝子または変異は、野生型の1%未満に相当しうる。
本明細書において、微生物およびウイルスの属、種、株、またはサブタイプを同定するプロセスまたは方法が提供される。微生物およびウイルスは、細菌、真菌、原虫、繊毛虫、およびウイルスを含むがこれらに限定されるわけではない多様な生物から選択される。微生物は、特定の属、種、株、サブタイプ、または血清型または他の任意の分類に限定されない。微生物およびウイルスは、1つまたは複数の参照配列または試料と比較して標的微生物配列中の配列バリエーションを決定することによって同定されうる。参照配列は、例えば、同じもしくは異なる属、種、株、もしくは血清型もしくは他の任意の分類の他の微生物から得ることができ、または宿主原核生物もしくは真核生物もしくは任意の混合集団から得ることができる。
本明細書において提供される方法を使用して、1つまたは複数の参照配列と比較してウイルスまたは細菌核酸配列中に存在する配列バリエーションを同定することによって、感染症を示すウイルスまたは細菌核酸配列の存在を決定することができる。参照配列は、感染性生物、関連する非感染性生物から得た配列、または宿主生物からの配列を含みうるがこれらに限定されるわけではない。
本明細書において提供される方法は、抗生物質耐性を含む薬物耐性に関係するヌクレオチド変化を検出する速度および精度を改善することができる。イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、フルオロキノロン、およびエチオナミドに対する耐性に関係する遺伝子座が同定されている[Heymら、Lancet、344号:293頁(1994年)およびMorrisら、J. Infect. Dis. 171巻:954頁(1995年)]。ピラジナミドおよびエタンブトールまたはストレプトマイシンと共にイソニアジド(inh)およびリファンピン(rif)の併用は、M.tuberculosisの確認された症例に対する第一選択薬として日常的に使用されている[Banerjeeら、Science 263巻:227頁(1994年)]。そのような耐性菌の頻度の増加により、それらを検出するための迅速なアッセイの開発が必要となり、それによって無効な、およびおそらく有害な処置を続行する費用および地域社会の健康に及ぼす害を低減させる。薬物耐性に関係する遺伝子座の一部の同定によって、薬物耐性が起こるヌクレオチド変化の迅速なスクリーニングへの変異検出技術の採用が促進されている。加えて、技術は、処置のモニタリングおよび追跡、または微生物集団構造ならびに処置の際の調査モニタリングを促進する。加えて、混合集団の相関および調査モニタリングを実施することができる。
本明細書において提供される方法は、一倍体を検出するために使用することができる。任意の二倍体細胞において、任意の遺伝子または他の染色体セグメントに少なくとも1つの識別可能な相違を含有する2つの一倍体が存在する。多くの十分に研究された遺伝子系において、一倍体は、単一ヌクレオチドバリエーションよりも表現型に強力に相関する。このため、一倍体の決定は、疾患の素因または感受性、治療介入に対する応答を含む多様な表現型、ならびに医学、動物飼育、および農業における目的の他の表現型の遺伝的基礎を理解するために極めて重要である。
本明細書において提供される方法は、マイクロサテライト配列バリエーションの迅速で、明白な検出を可能にする。マイクロサテライト(時に、反復回数が異なるタンデム反復配列またはVNTRと呼ばれる)は、1~7塩基またはそれ超の短いタンデム反復ヌクレオチド単位であり、その中で最も顕著なものは、ジ、トリ、およびテトラヌクレオチド反復配列である。マイクロサテライトは、ゲノムDNAにおいて100,000bpごとに存在する(J. L. WeberおよびP. E. Can、Am. J. Hum. Genet. 44巻、388頁(1989年);J. Weissenbachら、Nature 359巻、794頁(1992年))。例えば、CAジヌクレオチド反復配列は、ヒトミトコンドリア外のゲノムの約0.5%を構成し、CTおよびAG反復配列は、共に約0.2%を構成する。CG反復配列はまれであり、その理由はCpGアイランドの調節機能による可能性が最も高い。マイクロサテライトは、長さに関して非常に多型であり、ゲノム全体にわたって広く、非コード配列に主に多量に分布しており、ゲノム内でのその機能は不明である。ある集団は、その集団にとって特徴的で、雑種ではない他の集団とは異なる多様なマイクロサテライトを維持することから、マイクロサテライトは法医学応用において重要でありうる。
本明細書において提供される方法を使用して、例えばSTR領域を含有しないヒトゲノム中の参照配列と比較して、ヒトゲノムの一部の標的配列における短いタンデム反復配列(STR)領域を同定することができる。STR領域は、いかなる疾患または状態にも関連しない多型領域である。ヒトゲノムにおける多くの座が多型の短いタンデム反復配列(STR)領域を含有する。STR座は、長さが3~7塩基対の短い反復配列エレメントを含有する。200,000個の予想される三量体および四量体STRが存在すると推定され、これはヒトゲノムにおいて15kbごとに1回の頻度で存在する(例えば、国際PCT出願公開第9213969 A1号、Edwardsら、Nucl. Acids Res. 19巻:4791頁(1991年);Beckmannら(1992年)Genomics 12巻:627~631頁を参照されたい)。これらのSTR座のほぼ半分が多型であり、遺伝子マーカーの豊富な起源を提供する。特定の座での反復単位の数のバリエーションは、観察された配列バリエーションの原因であり、これらは、反復回数が異なるヌクレオチドタンデム反復配列(VNTR)座(Nakamuraら (1987年)Science 235巻:1616~1622頁);およびより長い反復単位を含有するミニサテライト座(Jeffreysら(1985年)Nature 314巻:67~73頁)、ならびにマイクロサテライトまたはジヌクレオチド反復座(Lutyら (1991年)Nucleic Acids Res. 19巻:4308頁;Littら(1990)Nucleic Acids Res. 18巻:4301頁;Littら(1990年)Nucleic Acids Res. 18巻:5921頁;Lutyら(1990年)Am. J. Hum. Genet.46巻:776~783頁;Tautz(1989年)Nucl. Acids Res. 17巻:6463~6471頁;Weberら(1989年)Am. J. Hum. Genet. 44巻:388~396頁;Beckmannら(1992年)Genomics 12巻:627~631頁)を想起させる。VNTR型決定は、微生物の型決定、例えばM.tuberculosis(MIRU型決定)において十分に確立されたツールである。
多型STR座および遺伝子の他の多型領域は、ヒトの身元確認、父親および母親の検査、遺伝子マッピング、移民、および相続争い、双生児における接合性試験、ヒトにおける近親交配の試験、ヒト培養細胞の品質管理、古い死体の身元確認、並びに法医学における精液試料、血液染色、微生物、および他の材料の試験のための極めて有用なマーカーである配列バリエーションである。そのような座はまた、商業的動物育種および血統分析、および商業的植物育種において有用なマーカーである。作物および動物における経済学的に重要な形質を、多型DNAマーカーを使用して連鎖分析を通して同定することができる。そのような座がどの座かを決定するための効率的かつ正確な方法が本明細書において提供される。
本明細書において提供される方法は、対立遺伝子変種のハイスループットの迅速かつ正確な検出を可能にする。対立遺伝子バリエーションの試験は、複雑なバックグラウンドにおける特異的配列の検出のみならず、少数のまたは単一のヌクレオチドの差を有する配列間の識別を伴う。PCRによって対立遺伝子特異的変種を検出する1つの方法は、鋳型鎖とプライマーの3’末端との間にミスマッチが存在するときにTaqポリメラーゼがDNA鎖を合成することが難しいという事実に基づく。対立遺伝子特異的変種は、可能性がある対立遺伝子の1つのみと完全にマッチするプライマーを使用することによって検出することができ、他の対立遺伝子に対するミスマッチは、プライマーの伸長を防止するように作用して、それによってその配列の増幅を防止する。本明細書における方法は、会合試験、コピー数バリエーション、疾患マーカーの検出、および型決定のためのSNPの組等に応用可能である。
本明細書において記載される方法は、年齢、民族群、性別、または他のいくつかの基準の関数として、集団内でその頻度が変化する1つまたは複数の遺伝子マーカーを同定するために極めて重要である。例えば、ApoE遺伝子型の年齢依存的分布は、当技術分野で公知である(例えば、Schechterら、(1994年)Nature Genetics 6巻:29~32頁を参照されたい)。疾患に何らかのレベルで関連することが公知である配列バリエーションの頻度もまた、疾患状態の進行を検出またはモニターするために使用することができる。例えば、リポタンパク質リパーゼ遺伝子のN291S多型(N291S)は、それによってアミノ酸コドン291位のアスパラギンの代わりにセリンへの置換が起こり、それによって男性のアテローム性動脈硬化症、特に心筋梗塞のリスクの増加に関連する高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)レベルが低減される(Reymerら、(1995年)Nature Genetics 10巻:28~34頁を参照されたい)。加えて、対立遺伝子頻度の変化を決定することにより、これまで未知の配列バリエーション、ならびに最終的には疾患の開始および進行に関係する遺伝子または経路を同定することができる。
本明細書において提供される方法は、配列に基づかない、参照核酸またはタンパク質と比較して標的核酸またはタンパク質におけるバリエーション、例えば核酸またはタンパク質の天然に存在する単量体単位である塩基またはアミノ酸がどのようなものかを試験するために使用することができる。例えば、メチル化パターンなどの配列非依存的特徴の差、修飾塩基もしくはアミノ酸の存在、または標的分子と参照分子の間のより高次構造の差を認識するために、本明細書において提供される方法を使用して、配列非依存的部位で切断される断片を生成することができる。エピジェネティクスは、遺伝子配列の差よりむしろ遺伝子発現の差に基づく情報の遺伝に関する研究である。エピジェネティック変化は、核酸配列の変化によって説明することができない遺伝子機能の有糸分裂および/もしくは減数分裂によって遺伝される変化、または高次核酸構造の変化を指す。エピジェネティックバリエーションまたは変化に供される特徴の例には、動物におけるDNAメチル化パターン、ヒストン修飾およびポリコーム-トライソラックス群(Pc-G/tx)タンパク質複合体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない(例えば、Bird, A.、Genes Dev. 16巻:6~21頁(2002年)を参照されたい)。
本明細書において提供される方法は、標的配列におけるメチル化パターンの変化などの標的配列におけるエピジェネティック変化である配列バリエーションを検出するために使用することができる。細胞メチル化の分析は、新たに出現した研究課題である。メチル基のシトシンへの共有結合による付加は、CpGヌクレオチドに主に存在する(マイクロサテライト)。プロモーター領域に存在しないCpGアイランドの機能は、なおも研究されなければならないが、プロモーター領域におけるCpGアイランドは、そのメチル化状態が関連遺伝子の転写および発現を調節することから、特に重要である。プロモーター領域のメチル化によって、遺伝子発現のサイレンシングが起こる。このサイレンシングは永続的であり、有糸分裂のプロセスを通して持続する。遺伝子発現におけるその重要な役割により、DNAメチル化は、発達プロセス、インプリンティング、およびX-染色体不活化ならびに腫瘍の発生、加齢、および同様に寄生DNAの抑制に影響を及ぼす。メチル化は、肺がん、乳がん、および結腸がんなどの多くの広範な腫瘍、ならびに白血病の発がんに関係すると考えられている。同様に、メチル化とタンパク質機能障害(Q-T延長症候群)または代謝疾患(一過性の新生児糖尿病、2型糖尿病)との間には関連がある。
様々な生物から利用可能なゲノム配列情報の量は劇的に増えつつあり、配列情報を、機能、表現型、または種類に相関させるために大規模な比較配列分析を可能にする技術の必要性が高まっている。そのような技術の比較配列分析への応用は、病原体のSNP発見および配列特異的同定を含めて、広範でありうる。したがって、再シークエンシングおよびハイスループット変異シークエンシング技術は、疾患の基礎となる変異の同定ならびに異なる薬物応答の基礎となる遺伝的多様性にとって重要である。
地球規模での輸送および旅行の時代に、病原性の風土病の発生は、その世界中の流行を防止して制御を可能にするために厳密なモニタリングを必要とする。ハイスループット技術によるDNAに基づく型決定は、発生の状況で必要とされる比較的短時間で迅速な試料処理量を可能にする(例えば、病院の環境でのモニタリング、早期警告システム)。モニタリングは、使用される微生物マーカー領域に依存するが、属、種、株、またはサブタイプ特異的レベルでのモニタリングを促進しうる。そのようなアプローチは、生体防御、臨床および薬学的モニタリング、ならびにメタジェノミクス応用(例えば、腸菌叢の分析)において有用でありうる。処置の進行または失敗のそのようなモニタリングは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第7,255,992号、米国特許第7,217,510号、米国特許第7,226,739号、および米国特許第7,108,974号において記載されている。
本明細書において提供される方法は、ワクチンでありうるか、または例えばインスリンもしくは他の任意の生産クローンもしくは生物学的もしくは医学的産物でありうる組み換え型生産クローン(ワクチンに限定されない)が何かを管理するために使用することができる。
本明細書において提供される方法は、例えば、そのような産物におけるある特定の微生物標的核酸の存在または非存在を検出することによって、薬理学的産物の品質を管理するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書において記載される方法を実施するためのキットが提供される。キットはしばしば、本明細書において記載される1つまたは複数の成分を含有する1つまたは複数の容器を含む。キットは、任意の数の個別の容器、パケット、チューブ、バイアル、マルチウェルプレート等において1つもしくは複数の成分を含み、または成分はそのような容器中に様々な組合せで混合されうる。例えば、以下の成分の1つまたは複数をキットに含めてもよい:(i)その1つまたは複数が検出標識を含みうる、1つまたは複数のヌクレオチド(例えば、停止ヌクレオチドおよび/または非停止ヌクレオチド);(ii)捕捉剤を含む1つまたは複数のヌクレオチド;(iii)その1つまたは複数が検出標識(例えば、増幅プライマー、1つまたは複数の伸長プライマー(UEP)、タグを含むオリゴヌクレオチド、捕捉剤を含むオリゴヌクレオチド)を含みうる、1つまたは複数のオリゴヌクレオチド;(iv)1つまたは複数の酵素(例えば、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素等);(v)制御成分(例えば、制御ゲノムDNA、プライマー、合成鋳型、標的核酸等);(vi)1つまたは複数の緩衝剤;ならびに(vii)印刷物(例えば、指示、表示等)。キットの実施形態では、提供される指示に従って溶解時に、大量核酸種に対して特異的な鎖停止ヌクレオチドの濃度(C[WT])が、少量核酸種に対して特異的な鎖停止ヌクレオチドの濃度(C[Mut])より低くなるように、停止ヌクレオチドの相対量が溶液中に存在するか、または相対量で存在する。実施形態では、大量核酸種に対して特異的な鎖停止ヌクレオチドの濃度C[WT]は、少量核酸種に対して特異的な鎖停止ヌクレオチドの濃度(C[Mut])の20%未満であり、C[WT]は一般的に、C[Mut]の約0.5%~約20%未満の間、C[Mut]の約0.5%~約15%未満、C[Mut]の約1%~約15%、C[Mut]の約1%~約10%、C[Mut]の約2%~約10%、またはC[Mut]の約1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%である。ある特定の実施形態では、C[WT]は、C[Mut]の約0.1%~約10%の間、C[Mut]の約0.01%~約10%の間、またはC[Mut]の約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、もしくは10%である。
PCR増幅
本明細書において提供される方法についての実施形態では、1つまたは複数の大量核酸種および1つまたは複数の少量核酸種の混合物を含有する試料または試料の組合せに対し、適切な増幅プライマーを使用してPCR増幅を行う。例示的な増幅条件が、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0237428A1号、米国特許第8,349,566号、および米国特許第8,003,317号、および2006年11月10日出版のOethら、SEQUENOM(登録商標)Application Note、Document No.8876-006、R04に示されている。例えば、以下の通り増幅条件を設定することができる:
MALDI-TOF分析
CLEAN Resin(Sequenom)6mgを添加することにより、実施例3に従って形成された伸長産物の脱塩を行う。切断反応液15nlを、ナノディスペンサーを使用して、マトリックスが予めローディングされたシリコンチップ(SpectroCHIP(登録商標)、SEQUENOM(登録商標))に、ロボット制御により分配する。MassARRAY Compact Analyser(MALDI-TOF質量分析計)を使用して質量分析スペクトルを得る。384ウェルSPECTROCHIP(登録商標)-(SEQUENOM(登録商標);San Diego、CA)に試料を移す。試料の自動測定が可能なBRUKER/SEQUENOM(登録商標)質量分析計に、SPECTROCHIP(登録商標)マイクロチップ全体を移す。陽イオンが分析され、約100のシングルショットスペクトルが累積される(例えば、5ラスター位置X20ショット/位置)。試料は全て、遅延イオン引き出しおよび全加速電圧20kVを使用して直線飛行時間モードで分析する。説明用にSEQUENOM(登録商標)(San Diego、CA)から入手可能である、MASSARRAY(登録商標)Nanodispenser User's Guideの「Dispensing Primer Mass Extension Reaction Products onto SPECTROCHIP(登録商標)」章を参照のこと。これもSEQUENOM(登録商標)-(San Diego、CA)から入手可能である、MASSARRAY(登録商標)Typer User's Guideの「SPECTROACQUIRE」の章に記載されているように、MASSARRAY(登録商標)Typerシステム(Typerバージョン3.0)を使用して、SPECTROCHIP(登録商標)からスペクトルを得る。
偏ったddNTP濃度を使用した、例示的なプロトコールおよび結果
論じられるように、本明細書において提供される方法は、少量対立遺伝子などの、試料中の少量核酸種についての改善された検出感度を、大量対立遺伝子などの大量核酸種と比較した少量核酸種の頻度、量またはコピー数を定量する能力と組み合わせるものである。これは、伸長反応における、大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬(例えばddNTP)の濃度範囲を、少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度未満にして、それにより少量核酸種由来のシグナルの検出限界を増加させるように調整し、ただし、大量核酸種シグナルがバックグラウンドノイズのレベルまで低減してしまうことにより大量核酸種シグナルが陽性対照(この方法の完全性を保証するため、すなわち、少量核酸種に対応するシグナルの存在または非存在について検出したとき、観察された結果が正しいことを保証するため)として、または少量核酸種の相対量(例えば頻度、コピー数)を定量するための基準として使用されることが防げられるほど低くてしないように調整することで遂行される。例示的なプロトコールは以下の通りである:
各アッセイは、3つのプライマー、2つのPCRプライマーおよび1つの単一塩基伸長プライマーからなる。アンプリコン(核酸の長さ)は変化してよいが、通常は、循環無細胞DNA、およびFFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋組織)から単離された分解DNAなどの試料における増幅を確実に成功させるため、長さ150bp未満とすることが推奨されうる。組み込まれていないPCRプライマーを分析質量窓から除くため、または次世代シークエンシングを使用した検査を可能にするため、質量タグをプライマーの5’末端に付加する。伸長プローブデザインもいくつかの必要条件を有する。まず、伸長産物の質量は、アッセイ間の競合(例えば、シグナルの重複)がないように、質量差によって十分に間隔がなければならない。次に、マルチプレックス化は、各反応容器が、同じ、組み込まれる特異的な鎖停止ヌクレオチドを有する核酸種に限定されるようにデザインされた反応に基づく。例えば「A」マルチプレックス反応では、反応において、核酸種全てに対する鎖停止ヌクレオチドがddAであり、この停止ヌクレオチドによるアッセイは全て組み合わせることができる。リバースデザインを可能にすること、すなわち、反対鎖の配列を探索することにより、デザインにおけるさらなる自由が得られ、この場合、反対鎖の「A」を標的とするプローブとして、「T」を調べることができる。
1mM MgCl2を補充した1x PCR緩衝剤、125μMのdNTP、0.125Uのウラシル-DNAグリコシラーゼ(New England Biolabs(登録商標)、Ipswich、MA、USA)、4UのTaqポリメラーゼ、および100nMの各PCRプライマーからなるマスターミックス10μLを補充したDNA鋳型10μL、総体積20μL中でPCRを実施した。まず反応液を30℃で10分間、その後94℃で2分間インキュベートした。94℃で30秒間、56℃で30秒間、および72℃で1分間のPCRを45サイクル実施した。72℃で5分間の最終インキュベーションでPCRを完了した。増幅産物5μLを、0.5Uエビアルカリホスファターゼ(SAP)の0.24x SAP緩衝剤溶液2μlの添加により総体積7μLで、37℃で40分間コンディショニングし、その後、85℃で10分間SAP酵素を変性させた。使用した試薬は全て、別途明記されない限り、Agena Bioscience,Inc.から得た。
0.2x伸長緩衝剤、200μMの少量対立遺伝子変種ヌクレオチドアンプリコンおよび0.25μM~20μMの範囲の様々な濃度の大量対立遺伝子変種ヌクレオチドアンプリコン、各種濃度の伸長プライマー、および0.14UのiPLEX(登録商標)Pro酵素からなるマスターミックス2μLを添加することにより、単一塩基伸長を実施した。総体積9μLで単一塩基伸長反応を実施した。反応パラメータは、94℃で30秒間の最初のインキュベーション、その後の、52℃で5秒間、次いで80℃で5秒間のネステッドサイクル5回を伴う、94℃で5秒間の40サイクルを含んでいた。72℃で3分間のインキュベーションで単一塩基伸長を完了した。
ナノディスペンシングの前に、脱塩のためアニオン交換樹脂スラリー5μL(3mg)で産物をコンディショニングした。最後に、RS1000ナノディスペンサーを使用して、Spectrochip(登録商標)II固体支持体に分析物を分配した。MassARRAY(登録商標)4装置を使用したMALDI-TOF質量分析により、データを得た。
iPLEX+可能性研究
MassARRAYシステムで実施されるiPLEX化学反応により、単一ヌクレオチド多型(SNP)、体細胞変異およびコピー数バリエーション(CNV)の正確かつ感度のよい検出がもたらされる。理論により限定されるものではないが、体細胞変異による少量変種の検出におけるiPLEX化学反応の感度は10%およびそれ超である。少量対立遺伝子頻度閾値10%は、MassARRAYプラットフォーム特性に由来する、iPLEX法の実用的限界である。MassARRAYは、最大ダイナミックレンジ50X(スペクトルの最小~最大ピーク)を有する80cmリニアTOF分析装置を特徴とするMALDI-TOF質量分析計である。このダイナミックレンジ50Xは、イオンシグナル含量およびノイズの量によりさらに低減する。例えば、保守的なダイナミックレンジ閾値10X(少量変種頻度10%)が、iPLEX体細胞変異への適用に採用されている。iPLEX+化学反応は、既存のiPLEX化学反応の感度を、少量変種10%未満のレベルまで増加させようとするものである。
低頻度変異を模倣し、かつ可能性のある全てのWT-バリアント対立遺伝子の組合せを調べるために使用したモデルシステムは、ヒトおよびチンパンジー(Pan Troglodytes)ゲノムDNAの混合物であった。ヒトhg19参照アセンブリとP.troglodytes 2013アセンブリとの間で全ゲノム配列アラインメントを行って、ヒトとチンパンジーとの間で単一の安定なヌクレオチドミスマッチを有する短いオーソロガス配列を選択した。これらの領域がiPLEX+アッセイ候補となった。オーソロガス領域に適用される別の一連の基準は、エクソン5つまたはそれ超のORF内のヒトエクソンに位置しなければならないこと、および同じ染色体上の領域間の距離が5,000b.p超でなければならないことである。資格を満たしたアッセイ候補の最終的な数は5,822であった。
Agena Bioscience Assay Design Suite 2.0を使用して、ヒト-チンパンジーモデルからの候補を使用するiPLEX+アッセイをデザインした。最大マルチプレックスレベル15の「体細胞変異」設定を使用して、アッセイデザインを実施した。iPLEX+は、一般的なiPLEXアッセイデザインの一部でない、マルチプレックス化による制約を示す。WTを枯渇組成の停止ミックスにより、4種のヌクレオチドのうち1種が、「チャネル」における全てのアッセイについてのWTであるシナリオが作り出される。全てがWT大量対立遺伝子をAとして有するアッセイのマルチプレックスはA-チャネルまたはA-トランジションと呼ばれる。Aトランジションは、全ての大量WT産物を伸長させる枯渇させたAヌクレオチド、ならびに少量産物を伸長させるC、GおよびTヌクレオチドを有する。相補的ヌクレオチド(アッセイデザイナーの一般的な特性)によるリバースアッセイデザインを排除するため、デザインの前に指定されるアッセイ方向性を有するインプット配列を用いてアッセイデザインを行った。アッセイデザインを4種のチャネル(WT-A、C、G、T)について別々に行い、マルチプレックスを最終デザインに組み合わせた。最終デザインは、可能性のある12種のWT-少量トランジション、WT停止剤ごとに3種のトランジション(例えば、A-チャネルは3種のWT-少量トランジションa/C、a/G、a/Tを有する)の全てを特徴としていた。組み合わされたアッセイデザインは、24マルチプレックスにおける334のアッセイを特徴とし、少なくとも20アッセイで表される、可能性のあるトランジション全てを有する。
プールされたヒトゲノムHapMap01(Coriell)DNA試料、および単一の個体、Max由来のチンパンジーDNA(Coriell)を使用して、生物試料を作り出した。全てのヒト-チンパンジー混合物において、ヒトDNAはWT対立遺伝子をもたらす大量成分であり、チンパンジーDNAは少量成分として使用した。試料(純粋であれ混合物であれ)あたりのDNA総量を、試料あたりのDNA10ngに相当する、約3,300ゲノムDNAコピーに設定した。
100%ヒト試料、100%チンパンジー試料および50%ヒト-チンパンジー混合物を使用する通常のiPLEX化学反応を使用して、334のアッセイを検査した。通常のiPLEXによる最初の検査を行って、性能が不十分なアッセイを決定した。性能が不十分なアッセイとは、伸長率が低い(通常80%未満)アッセイ、およびアッセイの偏りで現れる不十分な鋳型特異性(非鋳型対立遺伝子の非特異的な伸長)を有するアッセイである。UEPを含む全てのアッセイピークのうちのアッセイ産物ピークの割合として、アッセイ伸長率を算出する。
iPLEX+実験の第1のラウンドは以下の研究からなっていた。ヒト/チンパンジーDNAを、0%、1%、2.5%および5%チンパンジー寄与率に相当するように希釈系列にプールした。0%チンパンジー試料は100%ヒトWT対照試料である。WT停止ヌクレオチドの割合を、4種の停止剤ミックス(a/CGT、c/AGT、g/CATおよびt/ACG)全てで1%に設定した。各希釈系列を16の技術的反復で調べた。方法の性能を決定する際、以下の基準を評価した:
・ 0%チンパンジー試料におけるアッセイ伸長、
・ 0%チンパンジー試料におけるチンパンジー頻度、
・ アッセイ感度、
・ トランジション性能および感度、
・ 全体の感度。
各アッセイについて得られるデータ点16個(反復14個およびNTC 2個)を生じる、5%チンパンジー希釈液の技術的反復を使用して、ヌクレオチド停止剤の最適化を行った。以下の停止ミックスを評価した:2%、4%、8%および16%WTヌクレオチド。ヌクレオチド停止剤最適化の目標は、各トランジションにおけるWTヌクレオチド停止剤の最適な割合を決定することであった。最適化の基準は、WTピークに対する5%チンパンジー少量対立遺伝子ピークの相対的なピーク高さであった。最適化の目標は、WTおよび5%チンパンジーピークで等しいピーク高さを生じる停止剤混合物を作り出すことであった。
iPLEX+可能性研究の第2のラウンドは、停止ミックスを除いて、レイアウトおよび範囲においては第1のラウンドと同一であった。ラウンド1は共通のヌクレオチド混合物中の1%WTヌクレオチド停止剤を使用して実施したが、ラウンド2はトランジション特異的なWTヌクレオチド量(表4)を使用して行った。iPLEX+実現可能性のラウンド2は以下の研究からなっていた。ヒト/チンパンジーDNAを、0%、1%、2.5%および5%チンパンジー寄与率に相当するように希釈系列にプールした。各希釈系列を、16の技術的反復で調べた。ラウンド1の場合と同様に、方法の性能を決定する際、以下の基準を評価した:
・ 0%チンパンジー試料におけるアッセイ伸長、
・ 0%チンパンジー試料におけるチンパンジー頻度、
・ アッセイ感度、
・ トランジション性能および感度、
・ 全体の感度。
ラウンド1、ヌクレオチド最適化およびラウンド2研究の後、iPLEX+開発で使用したヒト-チンパンジーモデルシステムを検証するため、一連の実験を行った。ヒトおよびチンパンジーゲノムで異なる標的領域を調べるためのアッセイ(これまでにモデルシステムに記載)を作り出し、大量ヒト対立遺伝子のバックグラウンドに対して0%チンパンジー、1%チンパンジー、2.5%チンパンジーおよび5%チンパンジー少量対立遺伝子頻度に相当するように希釈系列試料を作り出した。Ion Torrent PGM(Life Technologies)を使用して一連の実験を行い、標的領域を検査し希釈の程度を検証した。iPLEX PCRカクテルおよびdNTPを使用して、iPLEX(+)でデザインされたアンプリコンを増幅することにより、シークエンシング用のライブラリーを調製した。このPCR反応への推奨されるgDNAインプットは、マルチプレックスあたり10~20ngであった。各マルチプレックスのDNA含量をBioAnalyzer DNA1000キットで測定し、等モル部分にプールした。Ion Torrent用NEBNext(登録商標)Fast DNA Fragmentation & Library Prep Setへのインプットアンプリコンライブラリーは、各マルチプレックスで50ngであった。Ion Torrentライブラリー調製は、末端修復、P1およびAアダプターによるアダプターライゲーション、ニックトランスレーション、ならびにスモール6xサイクルPCRを伴った。個々のステップ後の精製はAmpure XP Beadsによるものであった。BioAnalyzer DNA1000キットを使用してライブラリーQCおよび定量化を実施し、Ion Torrent-PGM OT2 200キットへのライブラリーインプットは26pmolであった。Ion Torrent OT2 ES機を使用して、鋳型ISPの濃縮を実施した。Ion Torrent 200シークエンシングキットおよび240フローのヌクレオチドを使用するPGMシステムで、これらの鋳型ISPのシークエンシングを実施した。単数の318または318 v2チップを使用して各モデルをシークエンシングした。シークエンシングリードを、iPLEX(+)によりデザインされた標的アンプリコンのゲノム座標を含有するBEDファイルにアラインメントすることにより、データ分析を実施した。Ion Torrentカバレッジ分析および変種コーラープラグインを使用して、標的表示および少量変種頻度を自動的に算出、および検査した。
iPLEX+実現可能性ラウンド2の後、WT試料におけるiPLEX+アッセイの伸長率を改善することについての研究を継続させた。トランジション特異的な様式でWTヌクレオチド濃度を増加させた結果、WTでの不十分な伸長のため失敗となるアッセイ数が2.2減少した。さらに、伸長反応の以下のパラメータを、WT試料を使用してiPLEX+パネルを調べる研究で検討し、WT試料でのアッセイ伸長率に対する影響について調べた:
・ PCRアニーリング時間-伸長中のアニーリング時間を増加させると、ポリメラーゼ(Thermosequenase)がより長時間、枯渇させたWTヌクレオチドを「見つける」ことができる。
・ 総ヌクレオチド濃度-ラウンド2と同じWTヌクレオチド比率を維持するが総量をより多くすると、WT組込み率が増加する。
・ 300サイクルPCR-サイクル数を200から300に増加させると、より多くの産物、および強度がより大きい対立遺伝子ピークが生じる。
・ ポリメラーゼ量を増加させること-ポリメラーゼ濃度を増加させると、より早い回転により産物量が増加し、強度がより大きい対立遺伝子ピークが生じる。
iPLEX+可能性研究の第3および最終ラウンドでは、これまでに決定されたトランジション特異的なWTヌクレオチド濃度および2X総ヌクレオチド濃度を利用した。ラウンド1および2と同様に、iPLEX+実現可能性のラウンド3は以下の研究からなっていた。ヒト/チンパンジーDNAを、0%、1%、2.5%および5%チンパンジー寄与率に相当するように希釈系列にプールした。各希釈系列を、16の技術的反復で調べた。ラウンド1の場合と同様に、方法の性能を決定する際、以下の基準を評価した:
・ 0%チンパンジー試料におけるアッセイ伸長、
・ 0%チンパンジー試料におけるチンパンジー頻度、
・ アッセイ感度、
・ トランジション性能および感度、
・ 全体の感度。
iPLEX Plus検証研究
iPLEX Plusアッセイを検証するための研究を実施した。NRASおよびEGFR遺伝子(モデル)における変異についての体細胞変異検出に関する機能、感度および再現性について、アッセイを試験した。
実験では、5%バリアントとして200コピー/μlのバリアントを使用した。その他の少量変種は全て、この開始値から滴定した。野生型の寄与率は4000コピー/μlであった。
・ 野生型の鋳型および標準的なiPLEX停止ミックスを使用して、適切な野生型伸長についてアッセイを評価した。適切な野生型ヌクレオチドを伸長することができなかったアッセイを非特異的な相互作用について評価し、適宜再デザインするか別のプレックスに移した。
・ 非鋳型対照における非特異的な伸長についてアッセイを評価し、適宜別のプレックスに移した。
・ カスタムヌクレオチドミックスを使用して、5%バリアントモデルにおける適切な伸長についてアッセイを評価した。適切な変種の遺伝子型が全て観察された。
・ エクソヌクレアーゼ活性およびさらなるシグナルについてアッセイを評価した。
・ ピークSNR(シグナルノイズ比)によりアッセイを評価した。開発中、3つのアッセイがピークSNRにおいて、繰り返される不十分な性能を示した。各アッセイを原因について検査した。提案された原因を、新たなデザインおよび/またはプレックスの再割当てにより軽減させた。
最初の研究では、5%およびそれ未満(最初のヌクレオチドミックス)での少量変種検出を行うのに必要なヌクレオチド比率を調べた。試料は3連でランし、WT試料も各プレックスにつき3連でランした。最初のヌクレオチドミックスでは必要な感度が生じなかった。野生型シグナルが高いことによってバリアントの比率が小さくなり、それによりその他のバリアントクラスとの区別が不可能となる(データは示さない)。
感度実験に使用した各少量変種モデル(5%、2.5%、1%、およびWT)を、24反復で(WTは96反復で)評価した。各モデルの少量変種クラスが、統計的に有意差のある分布を生じた(データは示さない)。
実施形態の非限定的な実施例
ここから、本技術についてのある特定の実施形態の非限定的な実施例を提供する。
1つまたは複数の少量核酸種と1つまたは複数の大量核酸種の混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が、(A)前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または
(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが、前記増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度より低い、ステップと、
(c)(b)の伸長産物を分析し、それによって、前記1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、実施形態A1に記載の方法。
(b)が少なくとも2つの反応槽または区画の組において実施され、
第1の槽または区画が、前記大量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬を含むが、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的である鎖停止試薬を含まない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含むが、前記大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含む、
実施形態A1に記載の方法。
前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知である、実施形態A1からA3のいずれかに記載の方法。
1つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種を定量する方法であって、前記少量核酸種が同じ大量核酸種の変種であり、それぞれ前記大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)(i)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれ、および(ii)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含む伸長条件下で、前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、(1)前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、かつ(2)前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
(c)前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、方法。
1つまたは複数の少量核酸種と大量核酸種との混合物を含む核酸集団において前記1つまたは複数の少量核酸種を定量するマルチプレックス方法であって、それぞれの少量核酸種が対応する大量核酸種の変種であり、その対応する大量核酸種のコピー数より少ないコピー数で存在し、前記方法が、
(a)dNTPを含む増幅条件下で増幅プライマー対を用いて前記混合物の標的領域を同時に増幅し、それによって大量および少量核酸種を含む核酸の増幅混合物を産生するステップと、
(b)鎖停止試薬を含む伸長条件下で前記増幅混合物に伸長プライマーを接触させるステップであって、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種が、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない共通の鎖停止試薬を共有し、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止試薬を有し、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止試薬が(A)前記増幅混合物中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅混合物中の他の少量核酸種によって共有されないか、または(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが前記増幅混合物中の少なくとも1つの他の少量核酸種と共通の鎖停止試薬を共有し、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長するかまたはそれを超えて伸長し、それによって前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、(1)前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度が既知であり、(2)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度より低い、ステップと、
(c)前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量(複数)の比率を決定するステップと、
(d)(c)の比率に基づいて、および前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度と比較した、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度(複数)に基づいて、前記大量核酸種の量と比較した少量核酸種の量を定量するステップと
を含む、マルチプレックス方法。
前記核酸集団が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が単一のマルチプレックス反応において同定される、実施形態B1または実施形態C1に記載の方法。
(b)が少なくとも2つの反応槽または区画の組において実施され、
第1の槽または区画が、大量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含むが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含み、
残りの槽または区画のそれぞれが、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的かつ共通である単一の鎖停止試薬を含むが、大量核酸種に対して特異的または共通の単一の鎖停止試薬を共有しない少量核酸種に対して特異的な鎖停止試薬を含まない伸長条件を含む、実施形態C1の方法。
前記少量および前記大量核酸種の配列が、単一塩基だけ異なり、プライマーが、異なっている前記単一塩基までまたはそれを超えて伸長する、実施形態A1からA4、B1およびC1からC3のいずれかに記載の方法。
前記少量核酸種の配列が、前記大量核酸種の配列と比較して挿入または欠失を含む、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1のいずれかに記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の単一ヌクレオチド多型(SNP)変種である、実施形態A1からA4、B1、C1からC3、D1およびD2のいずれかに記載の方法。
前記少量および前記大量核酸種がそれぞれ、同じ遺伝子のバリアントおよび野生型対立遺伝子である、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD3のいずれかに記載の方法。
前記大量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記少量核酸種が前記宿主以外の対象に由来するか、または、前記少量核酸種が宿主対象に由来し、そして前記大量核酸種が前記宿主以外の対象に由来する、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD4のいずれかに記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約10%未満であるコピー数で存在する、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD5のいずれかに記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約1%~10%未満の間であるコピー数で存在する、実施形態D6に記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約2%~10%未満の間であるコピー数で存在する、実施形態D7に記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約5%またはそれ未満であるコピー数で存在する、実施形態D7に記載の方法。
前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種のコピー数の約2%またはそれ未満であるコピー数で存在する、実施形態D7に記載の方法。
1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、大量核酸種のコピー数の約1%であるコピー数で存在する、実施形態D7の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約1%~約20%の間である、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD10.1のいずれかに記載の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.1%~約10%の間である、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD10.1のいずれかに記載の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.1%~約4%の間である、実施形態D12に記載の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.01%~約10%の間である、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD10.1のいずれかに記載の方法。
前記大量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止試薬のそれぞれの濃度の約0.01%~約4%の間である、実施形態D13.1に記載の方法。
前記大量核酸種に対する前記鎖停止試薬の濃度が、特定の大量種/少量種トランジションに基づいて変化する、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD13.2のいずれかに記載の方法。
前記鎖停止試薬が鎖停止ヌクレオチドである、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD14のいずれか一項に記載の方法。
前記鎖停止ヌクレオチドが、独立してddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP、およびddUTPから選択される、実施形態D15に記載の方法。
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが1つの鎖停止ヌクレオチドからなる、実施形態D15またはD16に記載の方法。
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが2つの鎖停止ヌクレオチドからなる、実施形態D15またはD16に記載の方法。
1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが3つの鎖停止ヌクレオチドからなる、実施形態D15またはD16に記載の方法。
前記鎖停止試薬が、1つまたは複数の非環式停止剤を含む、実施形態A1からA4、B1、C3およびD1からD19のいずれかに記載の方法。
(a)において約30~約45の間のPCR増幅サイクルを含む、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD20のいずれかに記載の方法。
(b)の前記伸長条件が、約20~約300の間のサイクルを含む、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD21のいずれかに記載の方法。
(b)の前記伸長条件が少なくとも50サイクルを含む、実施形態D22に記載の方法。
1つまたは複数の前記鎖停止試薬が検出可能な標識を含む、実施形態A1からA4、B1、C1からC3およびD1からD23のいずれかに記載の方法。
前記標識が蛍光標識または色素である、実施形態D24に記載の方法。
前記標識が質量標識である、実施形態D24に記載の方法。
前記標識の検出をさらに含み、それによって前記1つまたは複数の少量核酸種が同定または定量される、実施形態D24からD26のいずれかに記載の方法。
前記標識が質量標識であり、検出が質量分析による、実施形態D27に記載の方法。
前記標識が蛍光標識または色素であり、検出が電気泳動またはリアルタイムPCRによる、実施形態D27に記載の方法。
(a)の増幅反応条件が、水、ゲノムDNA、緩衝剤、dNTP、プライマー対、MgCl2、およびポリメラーゼを含み、dNTPのそれぞれ1つの濃度に対するMgCl2の濃度の比率が、10:1以下、9:1以下、8:1以下、7:1以下、6:1以下、または5:1以下から選択される、実施形態A1~A4、B1、C1~C3およびD1~D28.1のいずれかの方法。
ポリメラーゼが、少なくとも濃度約0.03unit/μlのTaqポリメラーゼである、実施形態D29の方法。
(a)の増幅反応条件が、約400~700μMの間の各dNTP、約100nMのプライマー対、および約1.6~最大約4.8mMの間のMgCl2を含む、実施形態A1~A4、B1、C1~C3およびD1~D30のいずれかの方法。
配列タグが、増幅プライマー対における1つまたは複数のプライマーに結合される、実施形態A1~A4、B1、C1~C3およびD1~D31のいずれかの方法。
遊離Mg2+濃度が1.0~2.0mMの間である、実施形態A1~A4、B1、C1~C3およびD1~D32のいずれかの方法。
Claims (32)
- 1つまたは複数の標的核酸を含む試料において1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するマルチプレックス方法であって、前記方法が、
(a)前記試料の標的核酸を同時に増幅するステップであって、それぞれの標的核酸が、1つの大量核酸種と1つまたは複数の少量核酸種とを有し、それぞれの少量核酸種が、前記大量核酸種の低頻度変種またはコピー数変種である、ステップと、
(b)1つまたは複数の大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤と、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な1つまたは複数の鎖停止剤とを含む伸長条件下で(a)の前記増幅核酸に1つまたは複数の伸長プライマーを接触させるステップであって、dNTPが前記伸長条件に存在する場合、前記dNTPに存在する「N」と同一の塩基を含む鎖停止剤は、前記伸長条件には存在せず、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種がすべて、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない同じ鎖停止剤により停止され、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止剤により停止され、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止剤が、(A)前記増幅核酸中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅核酸中の他の少量核酸種には独自でないか、または(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが、前記増幅核酸中の少なくとも1つの他の少量核酸種の鎖停止剤と同じ鎖停止剤により停止され、
(iii)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度より低く、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置までまたは前記ヌクレオチド位置を通って伸長し、それによって、前記試料中に存在する、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成される、ステップと、
(c)(b)の伸長産物を分析し、前記少量核酸種に対応する1つまたは複数の鎖停止伸長産物の存在または非存在を検出し、それによって、前記1つまたは複数の少量核酸種の存在または非存在を同定するステップと
を含み、
ここで、前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度またはコピー数の0.25%~10%未満、または、0.5%~10%未満、または、1%~10%未満の間の頻度またはコピー数で存在するか、あるいは、前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の30%未満、20%未満、15%未満、10%未満、8%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.8%未満、0.75%未満、0.5%未満、0.1%未満、0.05%未満または0.01%未満に相当し、
前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度の1%~20%、または0.1%~10%、または、0.01%~5%である、マルチプレックス方法。 - 前記核酸試料が、単一の大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸試料が、それぞれが1つまたは複数の少量核酸種を有する複数の大量核酸種を含み、前記少量核酸種が単一のマルチプレックス反応において同定される、請求項1に記載の方法。
- (c)において1つまたは複数の大量核酸種の存在または非存在を同定することをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸を含む核酸試料において大量核酸種の量に対して1つまたは複数の少量核酸種を定量する方法であって、前記方法が、
(a)前記試料の標的核酸を同時に増幅するステップであって、前記標的核酸が、1つの大量核酸種と1つまたは複数の少量核酸種とを有し、前記1つまたは複数の少量核酸種が、同じ大量核酸種の変種であり、それぞれの少量核酸種が、前記大量核酸種の低頻度変種またはコピー数変種である、ステップと、
(b)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対して特異的な鎖停止剤と、前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤とを含む伸長条件下で(a)の前記増幅核酸に伸長プライマーを接触させるステップであって、それによって、前記プライマーが前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置までまたは前記ヌクレオチド位置を通って伸長し、それによって、前記試料中に存在する、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成され、dNTPが前記伸長条件に存在する場合、前記dNTPに存在する「N」と同一の塩基を含む鎖停止剤は、前記伸長条件には存在せず、(1)前記鎖停止剤のそれぞれの濃度が既知であり、かつ、(2)前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度より少ない、ステップと、
(c)前記1つまたは複数の少量核酸種の伸長産物のそれぞれに対応する検出シグナルと、前記大量核酸種の伸長産物に対応する検出シグナルを検出することにより、前記大量核酸種の伸長産物に対応する検出シグナルに対する、前記1つまたは複数の少量核酸種の伸長産物のそれぞれに対応する検出シグナルの割合に基づき、前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比を決定するステップと、
(d)(c)で決定した前記比に基づき、かつ、前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度に基づき、標準化係数を用いて、前記大量核酸種の量に対する前記少量核酸種の量を定量するステップと、
を含み、
ここで、前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度またはコピー数の0.25%~10%未満、または、0.5%~10%未満、または、1%~10%未満の間の頻度またはコピー数で存在するか、あるいは、前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の30%未満、20%未満、15%未満、10%未満、8%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.8%未満、0.75%未満、0.5%未満、0.1%未満、0.05%未満または0.01%未満に相当し、
前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度の1%~20%、または0.1%~10%、または、0.01%~5%である、方法。 - 1つまたは複数の標的核酸を含む核酸試料において大量核酸種の量に対して1つまたは複数の少量核酸種を定量するマルチプレックス方法であって、前記方法が、
(a)前記試料の標的核酸を同時に増幅するステップであって、それぞれの標的核酸が、1つの大量核酸種と1つまたは複数の少量核酸種とを有し、それぞれの少量核酸種が、前記大量核酸種の低頻度変種またはコピー数変種である、ステップと、
(b)1つまたは複数の大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤と、1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な1つまたは複数の鎖停止剤とを含む伸長条件下で(a)の前記増幅核酸に伸長プライマーを接触させるステップであって、dNTPが前記伸長条件に存在する場合、前記dNTPに存在する「N」と同一の塩基を含む鎖停止剤は、前記伸長条件には存在せず、
(i)前記1つまたは複数の大量核酸種がすべて、前記大量核酸種に対して特異的であるが、前記少量核酸種に対して特異的でない同じ鎖停止剤により停止され、
(ii)前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれが、前記少量核酸種に対して特異的であるが、前記大量核酸種に対して特異的でない鎖停止剤により停止され、前記少量核酸種に対して特異的である前記鎖停止剤が、(A)前記増幅核酸中の特定の少量核酸種に独自のものであり、前記増幅核酸中の他の少量核酸種には独自でないか、または(B)前記1つもしくは複数の少量核酸種のうちの少なくとも1つが、前記増幅核酸中の少なくとも1つの他の少量核酸種の鎖停止剤と同じ鎖停止剤により停止され、
(iii)前記鎖停止剤のそれぞれの濃度が既知であり、前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度より低く、
それによって前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置までまたは前記ヌクレオチド位置を通って伸長し、それによって、前記試料中に存在する、前記少量核酸種および前記大量核酸種にそれぞれ対応する鎖停止伸長産物が生成される、ステップと、
(c)前記1つまたは複数の少量核酸種の伸長産物のそれぞれに対応する検出シグナルと、前記大量核酸種の伸長産物に対応する検出シグナルを検出することにより、前記大量核酸種の伸長産物に対応する検出シグナルに対する、前記1つまたは複数の少量核酸種の伸長産物のそれぞれに対応する検出シグナルの割合に基づき、前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比を決定するステップと、
(d)(c)で決定した前記比に基づき、かつ、前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度に基づき、標準化係数を用いて、前記大量核酸種の量に対する前記少量核酸種の量を定量するステップと、
を含み、
ここで、前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度またはコピー数の0.25%~10%未満、または、0.5%~10%未満、または、1%~10%未満の間の頻度またはコピー数で存在するか、あるいは、前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の30%未満、20%未満、15%未満、10%未満、8%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.8%未満、0.75%未満、0.5%未満、0.1%未満、0.05%未満または0.01%未満に相当し、
前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度の1%~20%、または0.1%~10%、または、0.01%~5%である、マルチプレックス方法。 - 前記標準化係数が、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度と比較した、前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度の比に反比例する、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記核酸試料が、1つの大量核酸種の変種である複数の少量核酸種を含み、前記複数の少量核酸種が、単一のマルチプレックス反応において同定される、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記プライマーが、前記大量核酸種と比較して前記少量核酸種において異なるヌクレオチド位置まで伸長する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少量および前記大量核酸種の配列が、単一塩基だけ異なり、前記プライマーが、異なっている前記単一塩基まで伸長する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少量核酸種の配列が、前記大量核酸種の配列と比較して挿入または欠失を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の少量核酸種が、前記大量核酸種の単一ヌクレオチド多型(SNP)変種である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少量および前記大量核酸種がそれぞれ、同じ遺伝子のバリアントおよび野生型対立遺伝子であるか、または、前記1つまたは複数の少量核酸種が、野生型の大量核酸種の体細胞変異体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種が宿主被験体由来であり、前記少量核酸種が前記宿主以外の被験体由来であるか、または、前記少量核酸種が宿主被験体由来であり、前記大量核酸種が前記宿主以外の被験体由来である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度またはコピー数の10%未満、もしくは5%未満、もしくは4%未満、または、2%~10%未満の間、もしくは1%~10%未満の間、もしくは1%~5%の間、もしくは1%~4%の間、もしくは1%~3.5%の間、もしくは1%~3%の間の頻度またはコピー数で存在する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度が、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤のそれぞれの濃度の5%未満、または、0.5%~15%未満の間、もしくは1%~10%の間、もしくは1%~2%の間、もしくは6%~7%の間である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度と、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度の比が、前記大量核酸種に対して特異的な特定の鎖停止剤および前記少量核酸種に対して特異的な特定の鎖停止剤に基づいて選択される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度と、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度の比が、1:15であり、前記少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度の10%未満の頻度で存在する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度と、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度の比が、0.2であり、前記少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度の約5%の頻度で存在し、ここで、「約」は示した値の±10%を意味する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度と、前記少量核酸種に対して特異的な鎖停止剤の濃度の比が、0.05であり、前記少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度の約5%、約2.5%、または約1.25%の頻度で存在し、ここで、「約」は示した値の±10%を意味する、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖停止剤が鎖停止ヌクレオチドであり、任意選択的に1つまたは複数の非環式停止剤を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖停止ヌクレオチドが、独立してddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP、およびddUTPから選択される、請求項21に記載の方法。
- 1つまたは複数の前記少量核酸種に対して特異的な前記鎖停止ヌクレオチドが、1つの鎖停止ヌクレオチド、2つの鎖停止ヌクレオチド、または3つの鎖停止ヌクレオチドからなる、請求項21または請求項22に記載の方法。
- (a)において30~45の間のPCR増幅サイクルを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 伸長反応が前記伸長条件下で行われ、前記伸長条件が複数の伸長サイクルを含み、前記伸長反応が、少なくとも65、70、75、80、85、90、95または100回繰り返されるか、または、200~300回繰り返されるか、または、200回繰り返される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の少量核酸種がそれぞれ、前記大量核酸種の頻度またはコピー数の約1%の頻度またはコピー数で存在し、ここで、「約」は示した値の±10%を意味する、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖停止剤が検出可能な標識を含まない、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記伸長産物が、質量分析スペクトルにより分析される、請求項27に記載の方法。
- 前記大量核酸種に対応する伸長産物の量に対する、前記1つまたは複数の少量核酸種のそれぞれに対応する伸長産物の量の比が、質量分析スペクトルによる分析により生成された前記大量核酸種のシグナルに対する、質量分析スペクトルによる分析により生成された前記少量核酸種のシグナルの比として決定される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の前記鎖停止剤が検出可能な標識を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識の検出をさらに含み、それによって前記1つまたは複数の少量核酸種が同定または定量される、請求項30に記載の方法。
- 前記標識が質量標識であり、検出が質量分析スペクトルによるか、または前記標識が蛍光標識もしくは色素であり、検出が電気泳動またはリアルタイムPCRによる、請求項31に記載の方法。
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