DE3587549T2

DE3587549T2 - Ergänzungstestverfahren von proteine bindenden enzymen.

Info

Publication number: DE3587549T2
Application number: DE85905685T
Authority: DE
Inventors: Daniel Robert Henderson
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1984-10-29
Filing date: 1985-10-28
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2005-10-29
Also published as: EP0199801A1; JP2807209B2; JPH0862216A; JPH08242870A; AU5068385A; EP0199801A4; JPH0868793A; JPS62500633A; JP2562286B2; JP2538766B2; JPH0882624A; JPH0779717B2; JP2602638B2; JP2565669B2; WO1986002666A1; AU592324B2; JPH08256764A; JPH07179495A; JPH0882626A; DE3587549D1

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren und neue Zusammensetzungen für die qualitative und quantitative Analyse von Analyten durch Enzym-Komplementations-Assays. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf geänderte Enzyme, die stammen sowohl aus rekombinanten DNA-Methoden als auch aus chemischen Polypeptid-Synthese- Methoden, und auf Verfahren zur Verwendung dieser Enzyme in homogenen und heterogenen Enzym-Immunoassays (Immuntests). Sie umfaßt auch die aus rekombinanten DNA stammenden und chemisch synthetisierten Enzyme und Verfahren zur Verwendung dieser Enzyme in homogenen und heterogenen Rezeptor-Liganden-Komplementations-Assays.

2. Hintergrund der Erfindung

2. 1 Immunoassay-Systeme

Aus dem Stand der Technik sind viele Immunoassays bekannt, die auf der Pionier-Entwicklung des Radioimmunoassay (RIA) von Yalow und Berson, "J. Clin. Invest.", 1960, 39 : 1157, basieren. Die RIAs sind dadurch charakterisiert, daß festgelegte Mengen von radioaktiv markierten Analyten mit unbekannten Mengen von nicht-markierten Analyten konkurrieren um festgelegte Mengen eines spezifischen Antikörpers. Die Menge des radioaktiven Analyten, der entweder an einen Antikörper gebunden ist oder frei in der Lösung vorhanden ist, wird in einem geeigneten Zähler quantitativ bestimmt und die Konzentration des nicht-radioaktiven Analyten wird ermittelt. Verbesserungen dieses generellen Schemas umfassen: (1) der Ersatz des radioaktiven Tracers durch Enzym- oder fluoreszierende Tracer, (2) der Ersatz von polyklonalen Tier-Antikörpern durch monoklonale Antikörper, (3) verbesserte Methoden des Signalnachweises z. B. bei Spektrophotometern, Fluorometern, Fluoreszenzpolarisatoren und Teilchenzählern und (4) die Einführung von homogenen Assays (Tests), bei denen eine physikalische Trennung eines gebundenen Tracers von einem freien Tracer nicht erforderlich ist. Die Trennung eines gebundenen Tracers von einem freien Tracer erfordert häufig die Verwendung von festen Trägern, wie z. B. solchen aus Kunststoff, Papier, Glas oder Acrylamid. Üblicherweise ist ein Antikörper an die feste Phase gebunden, während Tracer und unbekannte Materialien frei in der Lösung vorliegen. Die Trennung von gebundenem und freiem Material erfolgt durch ein- oder mehrmaliges Waschen der festen Phase. Die zurückbleibende gebundene Aktivität wird dann gemessen. Diese Assays sind allgemein bekannt als heterogene Immunoassays (Immunotests). Zum Vergleich wird bei homogenen Assays die Notwendigkeit von ungenauen und zeitraubenden Trennstufen vermieden.
Bei der Kommerzialisierung von Immunoassays ist eine Verschiebung aufgetreten von der Anwendung von Radioimmunoassays über Enzym-gebundene Immunosorbens-Assays (ELISA) zu homogenen Assays. Diese Verschiebung ist zurückzuführen auf die kommerziellen Anforderungen an Geschwindigkeit (Empfindlichkeit), Einfachheit, Automation und Abwesenheit von Radioaktivität. Homogene Assays bestehen aus mehreren Typen: (1) Nephelometrie-, (2) Teilchenzählungs-, (3) Fluoreszenzauslöschungs-, (4) Fluoreszenz-Polarisations- und (5) Enzym-Assays.
Das erste Nephelometer zur Messung der Lichtdispersion zur quantitativen Bestimmung von Immunreaktionen wurde in den späten sechziger Jahren entwickelt. Diese frühen Nephelometer wurden 10 Jahre später verbessert mit neuen chemischen Reaktionen, kleineren Winkeln zur Messung der Dispersionswinkel und der Fähigkeit, die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion während der ersten Sekunden nach dem Mischen der Reaktanten zu bestimmen (Ritchie, Alper und Graves, "Arthritis Rheum." 12 : 693, 1969; Deaton et al., "Clin. Chem." 22 : 1465, 1976). Diese Assays weisen eine extrem schlechte Empfindlichkeit auf und sind auf die Bestimmung von Analyten in Konzentrationen von mehr als 10&supmin;&sup8; M, beispielsweise von Serum-IgE-, IgA- und IgM-Gehalten, anwendbar.
In homogenen Teilchenzählungs-Assays werden Polystyrol-Teilchen mit einem Durchmesser von 0,8 um (Latex-Teilchen) durch Antikörper beschichtet. Die Antigen-Konzentrationen können ermittelt werden durch die Konzentration der agglutinierten Latexteilchen, die mittels eines Instruments bestimmt wird, das in der Lage ist, agglutinierte Teilchen von nicht-agglutinierten Teilchen zu unterscheiden (Cambiaso et al., 1977, "J. Immunol. Meth." 18 : 33). In homogenen Fluoreszenz-Auslöschungs-Assays werden entweder Antigene oder Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Analyt-Antikörper-Fluorophor-Komplexe ergeben eine signifikant niedrigere Fluoreszenz als der Antigen-Fluorophor oder Antikörper-Fluorophor allein (Ullman et al., 1979, "J. Biol. Chem." 251 : 4172; U.S.-Patente Nr. 3 998 943, 3 996 345, 4 174 384, 4 161 515, 4 208 479 und 4 160 016). Alle diese Assays umfassen verschiedene Methoden der Auslöschungs-Fluoreszenz, wobei die Auslöschungsmenge in Beziehung steht zur Menge des unbekannten Analyten oder Antikörpers in der Probe. Diese Assays weisen eine geringe Empfindlichkeit auf (Analyten in Fluid-Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M). Die geringe Empfindlichkeit ist zurückzuführen auf eine endogene Serum-Fluoreszenz und die Ausnutzung der Fluoreszenz in einer statischen nicht-enzymatisch verstärkten Weise. Fluoreszenz-Polarisations-Assays beruhen auf der freien Drehung des Antigen-Fluorophors in Lösung, die durch die Antikörper-Bindung an den Antigen- Fluorophor signifikant vermindert wird und sich als kommerziell sehr erfolgreich erwiesen hat bei Analyten mit einem niedrigen Molekulargewicht (mit einem Molekulargewicht von unter 1000 Dalton) (Dandliker et al., 1973, "Immunochemistry" 10 : 219).
Die verschiedenen Immunoassay-Methoden weisen jeweils kommerzielle Vorteile und Nachteile auf. Die RIAs sind empfindlich und leicht durchzuführen, sie erfordern jedoch Radiaktivität, Trennungsstufen und eine teure Instrumentierung. Heterogene Assays mit Enzymen oder Fluorophoren eliminieren die Radiaktivität und einen Teil der Instrumentierung, sie erfordern jedoch die Durchführung von Trennungsstufen. Vom kommerziellen Standpunkt aus betrachtet ist es aus mehreren Gründen erwünscht, Trennungsstufen zu eliminieren. Trennungen sind (1) arbeitsintensiv, (2) zeitraubend, (3) erfordern eine zusätzliche Apparatur, (4) erhöhen die Variabilität der Ergebnisse und (5) schließen hohe Automationsgrade aus. Trotz der vielen kommerziellen Vorteile von homogenen Immunoassays haben sich nur drei Systeme als kommerziell erfolgreich erwiesen, das Enzymmarkierte System von Rubenstein et al., US-Patent Nr. 3 817 837, das Substrat-markierte System von Burd et al., 1977, "Clin. Chem.ll 23 : 1402, und die Fluoreszenz-Polarisation (Dandliker et al., 1973, "Immunochemistry"). Diese drei Assay-Systeme sind jedoch noch beschränkt auf Analyten mit einem niedrigen Molekulargewicht (von weniger als 1000) und auf Analyten, die in Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M vorliegen.

2. 2 Enzym-Immunoassay-Systeme

Die Enzym-Immunoassays sind ein sehr erfolgreicher Typ eines homogenen Immunoassays. Mehrere Varianten von homogenen Enzym-Immunoassays haben sich als kommerziell erfolgreich erwiesen: (1) das Enzym-markierte Analyten-System und (2) das Substrat-markierte Analyten-System. In dem Enzym-markierten Analyten-System nimmt die enzymatische Aktivität der Markierung ab, wenn ein spezifischer Antikörper an den Analyten-Enzym-Komplex gebunden wird. Der zu bestimmende Analyt konkurriert mit einer festgelegten Menge eines spezifischen Antikörpers für eine festgelegte Menge des Analyten. Die Enzym-Aktivität ist direkt proportional zu der unbekannten Analyt-Konzentration. Auf der Basis dieses Immunoassay-Systems wurden die folgenden Patente erteilt: US-Patente Nr. 3 817 837, 3 852 157, 3 875 011, 3 966 556, 3 905 871, 4 065 354, 4 043 872, 4 040 907, 4 039 385, 4 046 636, 4 067 774, 4 191 613 und 4 171 244. Die Kommerzialisierung dieser Technologie ist beschränkt auf Analyten mit einem niedrigen Molekulargewicht und auf eine geringe Empfindlichkeit (Analyten mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton in Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M).
Der Substrat-markierte Fluoreszenz-Immunoassay umfaßt das kovalente Kuppeln des Analyten an ein fluorogenes Substrat für ein Enzym. Dieses Analyt-Substrat-Konjugat ist nicht fluoreszierend. In Abwesenheit eines Antikörpers wird das Analyt-fluorogene Substrat durch ein Enzym hydrolysiert unter Bildung einer fluoreszierenden molekularen Species. In Gegenwart eines spezifischen Antikörpers wird der Zugang zu dem Substrat durch das Enzym eingeschränkt (vermindert), was zu einer geringeren Fluoreszenz führt (Burd et al., 1977, "Clin. Chem." 23 : 1402; Burd et al., "Anal. Biochem." 77 : 56; und Kohen, Hollander und Bognolaski, 1979, "J. Steroid Biochem." 11 : 161). Die Kommerzialisierung dieses Assay-Systems ist jedoch beschränkt auf Analyten mit einem niedrigen Molekulargewicht aufgrund sterischer Betrachtungen und auf Analyten in Konzentrationen in Fluids von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M aufgrund von Erwägungen analog zu denjenigen, wie sie oben für die Fluoreszenzauslöschungs-Assays beschrieben worden sind.
Es sind bereits zahlreiche homogene Enzym-Immunoassays beschrieben worden, die zu einer begrenzten Kommerzialisierung geführt haben.
In dem US-Patent Nr. 4 134 792 ist eine Immunoassay- Technik beschrieben, bei der ein Enzym-Modulator, wie ein Enzyminhibitor oder ein allosterischer Effektor, als Markierung verwendet wird. Wenn sich ein spezifischer Antikörper an einen Enzym-Modulator-markierten Analyten bindet, kann der Enzym-Modulator nicht mehr die Aktivität des Enzyms hemmen. Die Konkurrenz zwischen dem Enzym-Modulator-markierten Analyten und dem freien Analyten stellt die Hemmung des Enzym-Modulators wieder her. Zu weiteren Patenten auf diesem Gebiet gehören: US-Patente Nr. 3 935 074, 4 130 462, 4 160 645 und 4 193 983.
In den US-Patenten Nr. 4 213 893 und 4 318 983 sind Enzym-Immunoassays beschrieben, in denen Cofaktor-Apoenzym-Systeme verwendet werden. Insbesondere in dem US-Patent Nr. 4 318 983 (Hornby et al, 9. März 1982) ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)-markierte Konjugate und Apoenzyme, mit denen FAD als prostetische Gruppe reagiert, verwendet werden. In dem US- Patent Nr. 4 213 983 (Corrico et al., 22. Juli 1980) sind spezifische FAD-markierte Konjugate, z. B. FAD-markiertes Thyroxin, beschrieben, die für die Verwendung in dem Hornby et al.-Verfahren geeignet sind. Die FAD-markierten Konjugate werden durch Messung der Holoenzym-Aktivität überwacht, die erzeugt wird durch Inkubation eines solchen Konjugats mit einem Apoenzym, das FAD zur Erzielung einer katalytischen Aktivität benötigt. Ein Analyt wird kovalent an FAD gekuppelt, so daß der markierte Cofaktor seine Reaktionsfähigkeit mit Dehydrogenase-Enzymen beibehält. Die Menge des reduzierten FAD, die durch die Dehydrogenase-Aktivität gebildet wird, nimmt in Gegenwart eines für den Analyten spezifischen Antikörpers ab. Das fluorometrisch überwachte Auftreten von reduziertem FAD ist direkt proportional zur Menge des Analyten (Kohen et al., 1978 in "Enzyme-labeled Immunoassay for Hormones and Drugs, S.B. Pal, ed., Walter deGruiter, Berlin und New York, S. 67- 79). Ein ähnliches System für Biotin- und 2,4-Dinitrofluorobenzol-Analyten, in dem Milchsäure-Dehydrogenase und Diaphorase verwendet werden, ist ebenfalls bereits bekannt (Carrico et al., 1976, "Anal. Biochem." 72 : 271). Beide Systeme leiden an der Interferenz von endogenen Cofaktoren und Enzymen, die gemeinsam in den zu analysierenden Serumproben vorliegen.
Es wurde beobachtet, daß sich mehrere Enzyme aus Peptid-Fragmenten wieder bilden, daß jedoch nur einige wenige ihre enzymatische Aktivität wiedererlangen, wozu gehören beispielsweise Ribonuclease A (Richards und Vithayathil, 1959, "J. Biol. Chem.", 234 : 1459), Staphylococcus-Nuclease (Light et al., 1974, "J. Biol. Chem." 249 : 2285) und β-Galactosidase (Langley und Zabin, 1976, "Biochemistry" 15 : 4866). Die Proteolyse der Rinder-Pankreas-Ribonuclease durch Subtilisin ergibt zwei Komponenten, ein Peptid (S- Peptid) und ein Protein (S-Protein). Weder das S-Peptid noch das S-Protein allein weisen eine merkliche Ribonuclease-Aktivität auf. Wenn diese Komponenten jedoch in Mol-Äquivalenten miteinander gemischt werden, wird nahezu die volle enzymatische Aktivität wiedergewonnen. Das S- Peptid und das S-Protein vereinigen sich wieder sehr schnell und fest mit einem Keq = 5 · 10&supmin;&sup9; M (Richards und Vithayathil, 1959, supra). Die Staphylococcus-Nuclease zeigt eine Wiederherstellung des biologisch aktiven Enzyms aus inaktiven Peptid-Fragmenten. Die Nuclease-T-(6-48), welche die Aminosäuren 6-48 der vollen 149 Aminosäure-Staphylococcus-Nuclease-Struktur enthält, vereinigt sich wieder mit Nuclease-T-(50-149) unter Bildung von aktiver Nuclease-T1 mit einer Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung von 0,03 bis 0,05/S bei einer geringen Temperaturschwankung (Light, supra). Wie weiter oben im Detail diskutiert (Absatz 2.3) sind Polypeptid-Fragmente (z. B. M15) aus Deletions-Mutanten von E. coli bekannt, die ihre enzymatische Aktivität wiedererlangen, wenn sie mit kleinen Peptid-Fragmenten kombiniert werden, die aus einem thermisch oder mit Cyanbromid behandelten β-Galactosidase-Enzym stammen. Ein durch Cyanbromid gebildetes Fragment wird als CNBr2 bezeichnet; ein anderes wird als CNBr24 bezeichnet.
Vor kurzem wurde ein Immunoassay, der auf der Wiedervereinigung solcher Polypeptid-Fragmente basiert, von Farina und Golke (US-Patent Nr. 4 378 428 vom 29. März 1983) und von Gonelli et al. (1981, "Biochem. and Biophys. Res. Commun." 102 : 917-923) beschrieben. Alle darin beschriebenen experimentellen Beispiele basierten auf der Wiedervereinigung S-Peptid/S-Protein unter Bildung der katalytischen Ribonuclease-Aktivität. Ein Analyt wurde kovalent an ein kleines Subtilisin-Spaltungspeptid von Ribonuclease, d. h. das S-Peptid (Aminosäuren 1-20) gebunden. Dieses wurde an einen Analyten gekoppelt und mit einem S-Protein (Aminosäuren 21-124) kombiniert unter erneuter Bildung von aktiver Ribonuclease. Der für den Analyten spezifische Antikörper hemmt die erneute Bildung der Ribonuclease-Aktivität. Dieses Assay ist beschränkt aufgrund der Anwesenheit der endogenen Ribonuclease-Aktivität in allen nichtautoklavenbehandelten biologischen Lösungen.
Andere gleichfalls schwerwiegende Fehler, die diesem System niemals zugeschrieben wurden, umfassen die Unfähigkeit, ein konstantes Gleichgewicht der sich assoziierenden Polypeptide einzustellen, und die Unfähigkeit, immunoreaktive Polypeptide zu erzeugen, die an Proteine mit einem großen Molekulargewicht gekuppelt werden können, die noch in der Lage sind, wieder ein aktives Enzym zu bilden. Alle verwendeten Polypeptide waren nicht-neue katalytisch inaktive Peptide, die zur Reassoziation in der Lage waren unter Bildung von aktiver Ribonuclease.
Noch signifikantere Nachteile bei den chemischen Reaktionen, die von Farina und Golke vorgeschlagen wurden (US-Patent Nr. 4 378 428), um einen Analyten an CNBr2 oder M15 zu binden, wurden gefunden. Das Binden eines Analyten über die verfügbaren NH&sub2;-, COOH- und SH-Gruppen an eines der Polypeptide ergab in allen getesteten Fällen Polypeptide, die zu einer Komplementation nicht in der Lage waren. Beim Kuppeln an M15, das viele Amino-, Carbonsäure- und Sulfhydryl-Funktionalitäten aufweist, wurde M15 in allen Fällen inaktiviert, selbst bei sorgfältig kontrollierten Bedingungen. Die Kinetik zeigt an, daß ein einziger Schlag (Treffer) ausreicht, um die Aktivität zu inaktivieren. CNBr2 enthält keine inneren Lysine, eine einzige Sulfhydrylgruppe und mehrere Carbonsäuregruppen. In Übereinstimmung mit Langley (Doktorarbeit unter dem Titel "The Molecular Nature of β-galactosidase α-complementationll, UCLA, 1975) wird durch die Kupplung an die N-terminale α-Aminogruppe die Komplementations-Aktivität von CNBr2 inaktiviert. Bei der Herstellung von CNBr2 (Langley, Fowler und Zabin, 1975, "J. Biol. Chem." 250 : 2587), wird das Sulfhydryl in der Position 76 reduziert und alkyliert mit Jodessigsäure vor der Cyanbromid-Spaltung. Wenn das Sulfhydryl nicht alkyliert wird, kann die CNBr2-Aktivität in den ersten Stufen der Reinigung aufrechterhalten werden, sie geht jedoch vor der Reinigung bis zur Homogenität verloren. Wenn das Sulfhydryl mit einem Maleimid-Derivat eines Analyten anstatt mit Jodessigsäure alkyliert wird, verhindert die Unlöslichkeit des Konjugats eine Reinigung. Schließlich wird in allen getesteten Fällen durch Kuppeln an einen COOH-Rest von CNBr2 die Komplementationsaktivität inaktiviert. Es scheint daher schwierig zu sein, CNBr2 und M15 zur Herstellung von geeigneten immunoreaktiven und komplementierenden Reagentien zu verwenden.

2.3 Komplementation und β-Galactosidase

Das Enzym β-Galactosidase hat eine weit verbreitete Verwendung in Enzym-gebundenen Immunosorbens-Assays (ELISA) (Engvall und Perlmann, 1971, "Immunochemistry" 8 : 871) und in homogenen Substrat-markierten Assays (Burd et al., 1977, "Clin. Chem." 23 : 1402) gefunden. Außerdem bildet β-Galactosidase die Basis eines weit verbreiteten genetischen Systems für die DNA-Klonierung und die DNA-Sequenzierung (Messing, 1983, "Methods in Enzymology" 101 : 20).
β-Galactosidase ist ein tetrameres Protein mit einem Molekulargewicht (MG) von 540 000 Dalton. Die vier identischen Monomeren bestehen aus 1021 Aminosäuren, von denen jedes ein MG von 116 000 Dalton hat. Das monomere Protein, wie es in der Fig. 1 dargestellt ist, wird in drei Regionen unterteilt: (1) das N-terminale proximale Segment (die α-Region), (2) eine mittlere Region und (3) ein C-terminales distales Segment (die ω)-Region).
Von β-Galactosidase stammende Mutanten-Polypeptide sind bekannt, welche die Enzym-Aktivität komplementieren oder spontan wiederherstellen können, wenn sie Extrakten von geeigneten negativen β-Galactosidase-Mutanten zugesetzt werden. Dieses Phänomen ist bekannt als intracistronische Komplementation. Ein Beispiel für eine α-Komplementation liefert das MIS/CNBr2-Komplementations-System. Dem M15-Mutanten-Polypeptid fehlen die Aminosäuren 11 bis 41 der β-Galactosidase und es liegt in Lösung in Form eines enzymatisch inaktiven Dimers vor. Ein von β-Galactosidase durch Cyanbromid (CNBr)-Spaltung abgeleitetes Polypeptid, das CNBr2-Peptid (CNBr2), besteht aus den Aminosäuren 3- 92. CNBr2 fördert, wenn es mit dem Dimer M15 gemischt wird, spontan die Wiederherstellung des β-Galactosidase- Tetramers mit der vollen enzymatischen Aktivität (Langley und Zabin, 1976, "Biochemistry" 15 : 4866). Das M15-Peptid ist bekannt als ein α-Akzeptor und CNBr2 ist bekannt als ein α-Donor. Während dieses ein gut untersuchtes Komplementierungssystem darstellt, kann CNBr2 als α-Donor für das M-112-Dimer, eine Deletion der Aminosäuren 23-31 innerhalb der β-Galactosidase dienen (Lin, Villarejo und Zabin, 1970, "Biochem. Biophys. Res. Common." 40 : 249; Celeda und Zabin, 1979, "Biochem." 18 : 404; Welphy, Fowler und Zabin, 1981, "J. Biol. Chem." 256 : 6804; Langley et al., 1975, "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 72 : 1254). Zu anderen α-Donoren gehört ein durch Autoklavenbehandlung von β- Galactosidase abgeleitete Polypeptid. Dieses Peptid wurde niemals gereinigt und seine Sequenz ist unbekannt. Andere α-Akzeptoren als M15 und M112 sind nicht beschrieben. In dem Beispiel für die Komplementation von M15 durch CNBr2 sind die Aminosäure-Sequenzen 3-10 und 42-96 beide als Duplikat in dem enzymaitsch aktiven Komplex vorhanden.
Die intracistronische Komplementation kommt auch an dem C-Terminus der β-Galactosidase (in der ω-Region) vor. Die verfügbaren besten bekannten Sequenzdaten sind diejenigen für das X90-Akzeptor-Peptid, das die letzten 10 Aminosäuren 1011 bis 1021 deletiert. Das X90-Peptid liegt als Monomer vor und kann durch CNBr24, ein Cyanbromid-Digestionsprodukt der β-Galactosidase, das aus den Aminosäuren 990 bis 1021 besteht, komplementiert werden unter Wiederbildung des enzymatisch aktiven Tetramers (Welphy et al., 1980, "Biochem. Biophys. Res. Common." 93 : 223).

2. 4 Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen

Die DNA aus dem Hepatitis B-Virus (HBV) wurde kloniert und vervielfältigt in E. coli sowohl in Form einer Reihe von Fragmenten als auch in Form von ganzen linearen Molekülen nach der Vereinigung mit Plasmid- oder Lambdoid- Phagen-Vektoren (Burrell et al., 1979, "Nature (London)", 279 : 43-47; Charnay et al., 1979, "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 76 : 2222-2226; Sninskey et al., 1979, "Nature (London), 279 : 346-468). Anschließend wurde das Oberflächenantigen von HBV (HBV-SAg) geklont und exprimiert in E. coli (McKay et al., 1981, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 78 : 4510-4514), Hefezellen (Valenzuela et al., 1982, "Nature", 298 : 347); und Säugetier-Zellen (Dubois et al., 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77 : 4549-4553).
In "Cell", 32 (1983), 131-140, sind ein α-Donor-Polypeptid aus β-Galactosidase, die an ein Protein fusioniert ist, und die Anwendung der Komplementation mit dem α-Polypeptid der β-Galactosidase das codiert wird durch das lac- Z-Gen, das die M15-Deletion enthält, zur Erzeugung der Enzymaktivität für das fusionierte Protein beschrieben. Der Donor-Polypeptid-Anteil des fusionierten Proteins wirkt als nachweisbares Tag (Markierung), das die Reinigung des restlichen Teils des fusionierten Proteins erlaubt.
In dem US-Patent Nr. 4 378 428M sind allgemein Enzym- Komplementations-Assays beschrieben, bei denen ein Analyt an einen Enzym-Donor gebunden wird. Das Komplementations- Assay wird im Prinzip beispielhaft erläutert durch das Subtilisin-Enzym-System, das Patent umfaßt aber auch ein Beispiel, bei dem die M-15/CB2β-Galactosidase-Fragmente verwendet werden.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ergibt verbesserte Verfahren und neue Zusammensetzungen für Enzym-Komplementations- Assays für die quantitative Analyse von Analyten sowohl mit einem hohen als auch mit einem niedrigen Molekulargewicht (MG 150 bis 30 000 Dalton) mit einer hohen Empfindlichkeit (10&supmin;¹&sup5; M). Die Assays können automatisiert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Polypeptide durch rekombinante DNA-Techniken oder durch chemische Polypeptid-Synthese-Techniken gebildet. [Der hier verwendete Ausdruck "Polypeptid" umfaßt Peptide und Proteine]. Die Polypeptide selbst sind enzymatisch inaktiv; wenn sie in einem wäßrigen Medium miteinander reagieren, assoziieren sie sich jedoch unter Bildung eines katalytisch aktiven Enzyms durch ein Phänomen, das als Komplementation bekannt ist. β-Galactosidase ist ein bevorzugtes Enzym, weil es mehrere Substrate hat, die unter Anwendung spektrophotometrischer und fluorometrischer Verfahren nachweisbar sind, seine Brauchbarkeit in früheren kommerziellen Immunoassays (Immuntests) bereits gezeigt hat, bei extrem niedrigen Konzentrationen gemessen werden kann und genetisch gut charakterisiert ist. Durch Erzeugung einer enzymatischen Aktivität aus einem insignifikanten Hintergrund kann ein hohes Signal/Rausch-Verhältnis erzielt werden. Die in den erfindungsgemäßen verbesserten Assays (Tests) verwendeten neuen Polypeptide umfassen (a) Fusionsproteine, in denen der Analyt an ein Polypeptid fusioniert ist, das Produkt von rekombinanten Genen, die Sequenzen enthalten, die für den Analyten und das Polypeptid codieren; (b) Polypeptide, die genetisch hergestellt werden für eine optimale Kupplung mit Analyten; (c) Polypeptide, die chemisch synthetisiert werden für eine optimale Kupplung mit Analyten; und (d) Polypeptide, die genetisch hergestellt oder chemisch synthetisiert werden zur Erzielung einer verbesserten Stabilität gegenüber Umweltfaktoren, wie Oxidation, Wärme, pH-Wert, enzymatischem Abbau und dgl.
Es werden daher Verfahren zur Erzeugung eines Immunoassays beschrieben, der basiert auf der Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken oder chemischen Polypeptid- Synthese-Techniken zur Erzeugung geeigneter Polypeptide, die (1) zur Komplementation fähig sind, (2) systematisch eingestellt werden können in bezug auf ihre Reassoziations-Gleichgewichtskonstante, (3) in der Lage sind, mit spezifischen Bindungs-Proteinen in Wechselwirkung zu treten und (4) durch Wechselwirkung mit spezifischen Bindungs-Proteinen die Bildung des aktiven Enzyms mit der für β-Galactosidase charakteristischen Aktivität steuern können.
Die genetisch hergestellten und chemisch synthetisierten Polypeptide dieser Erfindung bieten deutliche Vorteile gegenüber anderen komplementierenden Enzym-Systemen. Durch rekombinante DNA-Techniken hergestellte Polypeptide können in großer Menge bei niedrigen Kosten erzeugt werden, sie können leicht bis zur Homogenität gereinigt werden und können leicht in jeder beliebigen Größe und Sequenz hergestellt werden. Chemisch synthetisierte Polypeptide, insbesondere solche, die eine verhältnismäßig geringe Aminosäurelänge haben, können in hoher Ausbeute in einer unbegrenzten Sequenzvariation hergestellt werden. Jede präparative Technik erlaubt die Manipulation der Aminosäuresequenz, was zu Polypeptiden mit einer verbesserten Kupplungs-Chemie, einer verbesserten enzymatischen Reaktionskinetik, einer verbesserten enzymatischen Assay-Empfindlichkeit und/oder Stabilität führt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Kits zur Durchführung eines Assays (Tests) nach den erfindungsgemäßen Verfahren.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung ist leichter verständlich unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung, auf die folgenden Beispiele von spezifischen Ausführungsformen der Erfindung und auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des β-Galactosidase-Polypeptids zusammen mit Deletions-Mutanten M15, M112 und X90, die in der Natur bekannt sind. Dargestellt sind auch selektierte Cyanbromid (CNBr) -Spaltungspeptide CNBr2, CNBr2/3-41 und CNBr24;
Fig. 2 (A und B) (nicht maßstabsgetreu gezeichnet) Darstellungen des Aufbaus verschiedener rekombinanter Plasmide, die eine Analyten-Kupplungsdomäne enthalten;
Fig. 3 eine schematische Darstellung von N-Terminus- und C-Terminus-Fusionsproteinen, die α-Donor-Domänen und eine Protein-Domäne umfassen, die besteht aus dem Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBV-SAg) oder dem HBV- Kern-Antigen;
Fig. 4 (A - C) eine Darstellung der DNA- und Aminosäure-Sequenzen von beispielhaften neuen Polypeptid-Enzym- Donoren, die wie im Abschnitt 6.1 der detaillierten Beschreibung beschrieben hergestellt wurden. In der Fig. 4 gibt der Stern die Aminosäuren an, die für die Kupplung an Analyten verfügbare reaktionsfähige Gruppen aufweisen; Fig. 5 (A und B) eine schematische Darstellung von neuen Polypeptid-Enzym-Akzeptoren, die Deletionen darstellen, die in die α-Region des β-Galactosidase-Gens zusammen mit den nativen β-Galactosidase-Gen-DNA- und Aminosäuresequenzen eingeführt worden sind. Zum Vergleich sind auch die bekannten Deletions-Mutanten M15 und M112 dargestellt;
Fig. 6 eine graphische Darstellung einer Konkurrenz- Bindungskurve für einen homogenen Assay für Biotin, worin das Analyt-Bindungs-Protein Avidin ist;
Fig. 7 eine graphische Darstellung einer Konkurrenz- Bindungskurve (Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurve) für einen Assay für Biotin, worin das Analyt-Bindungs-Protein Avidin ist;
Fig. 8 eine graphische Darstellung einer Konkurrenz- Bindungskurve, welche die Hemmung der Komplementation von Enzym-Donor CNBr2 und Enzym-Akzeptor EA23 demonstriert, worin das Analyt-Bindungsprotein Agarose- immobilisiertes Avidin ist;
Fig. 9 (A und B) eine graphische Darstellung der Effekte verschiedener Kombinationen von Konzentrationen des Enzym-Akzeptors EA23 und des Enzym-Donor-Digoxin-Konjugats auf den Enzym-Immunoassay für Digoxin. Fig. 9A repräsentiert die Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurven, die mit EA23, fixiert in einer Menge von 5 · 10&supmin;&sup8; M, und dem Enzym-Donor-Konjugat bei Verdünnungen von 1 : 20 und 1 : 30 erhalten wurden. Die Fig. 9B repräsentiert die Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurven, die mit EA23, fixiert in einer Menge von 1 · 10&supmin;&sup7; M und dem Enzym-Donor-Konjugat bei Verdünnungen von 1 : 20 und 1 : 30 erhalten wurden; Fig. 10 eine graphische Darstellung der Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurven für einen Immunoassay für Digoxin, bei dem ein sekundärer Antikörper, der Ziegen-Antikaninchen-Antikörper, dazu verwendet wird, die Inhibitoreffekte der Antikörper-Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor- Konjugat bei dem Komplementations-Verfahren zu verbessern;
Fig. 11 (nicht maßstabsgetreu gezeichnet) eine schematische Darstellung des Plasmids P169, die verschiedene genetische Regionen und Restriktionsenzym-Schnittstellen zeigt;
Fig. 12 die Nucleotid-Sequenz von Abschnitten von Genen, die für ED1 und ED3 codieren. Es sind die relevanten Aminosäure-Sequenzen und Resriktionsenzym-Schnittstellen angegeben. Der Stern an dem Cys-Rest des ED3 N-terminalen Fragments zeigt einen Analyt-kuppelnden Rest an;
Fig. 13 (nicht maßstabsgetreu gezeichnet) eine schematische Darstellung von Plasmiden der P180-Reihe, die verschiedene genetische Regionen und Restriktionsenzym- Schnittstellen zeigt;
Fig. 14 die Aminosäuresequenz von ED3 und ED3A. Die Sterne über den Cys-Resten zeigen einen Analyt-kuppelnden Rest an;
Fig. 15 die Aminosäuresequenzen der ED Enzym-Donor-Reihen, wobei Fig. 15A, 15B, 15C, 15D, 15E, 15F, 15G, 15H und 15I die Aminosäuresequenz von ED3, ED4, EDS, ED7, ED8, ED13, ED14, ED15 bzw. ED17 repräsentieren. Die Sterne über bestimmten Resten zeigen einen Analyt-kuppelnden Rest an;
Fig. 16 (nicht maßstabsgetreu gezeichnet) eine schematische Darstellung von Plasmiden der P190-Reihe, die verschiedene genetische Regionen und Restriktionsenzym- Schnittstellen zeigen;
Fig. 17 eine graphische Darstellung einer Titrationskurve für Digoxin unter Verwendung von Digoxin-ED3A in einem Digoxin-Enzym-Immunoassay;
Fig. 18 eine graphische Darstellung einer Standardkurve aus einem Thyroxin (T4)-Assay, in dem ED4-T4, EA22 und ein sekundärer Antikörper verwendet werden;
Fig. 19 eine graphische Darstellung einer Standardkurve aus einem Digoxin-Assay, in dem EDS-Digoxin, EA22 und ein sekundärer Antikörper verwendet werden;
Fig. 20 (nicht maßstabsgetreu gezeichnet) eine schematische Darstellung der Plasmide P166, P175, P177, die verschiedene genetische Regionen und Restriktionsenzym- Schnittstellen zeigt; und
Fig. 21 eine graphische Darstellung einer Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurve für einen homogenen Assay für Human-Chorion-Gonadotropin.

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt verbesserte Assays (Tests) für eine Vielzahl von Analyten, bei denen enzymatisch inaktive Polypeptide verwendet werden, die hergestellt werden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken oder chemischen Polypeptid-Synthese-Techniken, die bei der gemeinsamen Inkubation in einem wäßrigen Medium einen aktiven β-Galactosidase-Enzym-Komplex nach dem Komplementations-Verfahren bilden. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können rekombinante DNA-Techniken angewendet werden zur Herstellung eines oder beider Polypeptide, die für die Komplementation erforderlich sind. Die beiden Polypeptide werden bezeichnet (1) als Enzym-Akzeptor und (2) als Enzym-Donor. DNA-Synthese-Techniken werden angewendet zur Herstellung von Gen-Sequenzen, die für Polypeptide einer Vielzahl von Längen codieren. Enzym-Donoren und Enzym- Akzeptoren werden nach diesen Techniken hergestellt. Chemische Polypeptid-Synthese-Techniken werden allgemein angewendet für die Herstellung von Polypeptiden, die eine verhältnismäßig kurze Aminosäure-Länge haben. Aus diesem Grunde sind die chemischen Techniken am besten geeignet für die Synthese von Enzym-Donoren des β-Galactosidase-Systems, da die Enzym-Donoren dieses Systems in der Regel eine typische kurze Aminosäure-Sequenz aufweisen, verglichen mit den Enzym-Akzeptoren. Dies sagt natürlich nicht, daß funktionelle Enzym-Akzeptoren nicht durch Peptid-Synthese-Techniken hergestellt werden können.
Nach der hier angewendeten Definition ist ein Enzym- Akzeptor ein enzymatisch inaktives Polypeptid, das durch eine Deletions-Mutante des β-Galactosidase-Gens hergestellt wird, das bei der Kombination mit einem Enzym-Donor in der Lage ist, nach dem Komplementations-Verfahren eine aktive β-Galactosidase zu bilden. Alle-hier hergestellten Enzym-Akzeptoren sind Deletionen innerhalb der u-Region des β-Galactosidase-Gens, das den N-Terminus des β-Galactosidase-Proteins codiert. Einige dieser Enzym-Akzeptoren wurden weiter manipuliert durch Entfernung von freiliegenden Cystein-Resten zur Erzeugung einer größeren Stabilität.
Gemäß der hier angewendeten Definition ist ein Enzym- Donor-Polypeptid-Konjugat ein enzymatisch inaktives Polypeptid, das aus zwei Domänen besteht: (a) einer α-Donor- Domäne, die eine Proteinsequenz enthält, die in der Lage ist, sich mit einem Enzym-Akzeptor zu kombinieren unter Bildung eines aktiven Enzyms; und (2) eine Analyt-Domäne, die in der Lage ist, mit einem Analyt-Bindungs-Protein in Wechselwirkung zu treten. Die Analyt-Domäne ist entweder (1) eine Analyt-kuppelnde Domäne oder (2) eine Protein-Domäne.
Gemäß der hier angewendeten Definition umfaßt eine Analyt-kuppelnde Domäne Aminosäuren, die in das Polypeptid inseriert oder substituiert worden sind unter Bildung von geeigneten Stellen für die kovalente Kupplung von Analyten. Die chemischen Kupplungs-Stellen sind meistens Sulfhydryl- oder Aminogruppen, die mit Cystin- oder Lysin-Resten assoziiert sind, es kann sich aber um jede geeignete chemisch reaktive Gruppe irgendeiner Aminosäure handeln, die in der Lage ist, den Analyten zu binden, ohne in Interferenz zu treten mit (a) dem Komplementations-Verfahren oder (b) der Wechselwirkung des Analyten mit einem Analyt- Bindungs-Protein. Die Anordnung der chemisch reaktiven Gruppe kann geändert werden, um den sterischen Hinderungsanforderungen des Assays zu genügen.
Gemäß der hier angewendeten Definition umfaßt eine Protein-Domäne ein Protein-Antigen oder eine immunoreaktive Gruppe eines Antigens (Epitop). Möglich sind beispielsweise Antigene, wie Tumor-, Bakterien, Fungi-, Viren-, Parasiten-, Mycoplasma-, Histokompatibilitäts-, Differenzierungs- und andere Zellmembran-Antigene, pathogene Oberflächenantigene, Toxine, Allergene, Arzneimittel und beliebige biologisch aktive Moleküle, wie z. B., jedoch nicht beschränkt darauf, Gonadotropin-Hormon, Follikelstimulierendes Hormon, Thyroid-stimulierendes Hormon, Ferritin oder irgendein anderes antigenes Molekül, das entspricht oder analog ist zu einem Analyten. Nach der hier angewendeten Definition werden Enzym-Donoren, bei denen die Analyten-Domäne eine Protein-Domäne ist, auch als "Fusionsproteine" bezeichnet. Während alle Enzym-Donoren, die durch genetische Herstellung erzeugt worden sind, Genfusionen darstellen, die Fusionsproteine mit α-Donor-Domänen und Analyt-Domänen codieren, ist der hier definierte Ausdruck "Fusionsprotein" nur anwendbar auf solche Enzym- Donoren, die aus einer α-Donor-Domäne und einer Protein- Domäne bestehen, die immunoreaktive Epitope eines Protein- Antigens spezifizieren. [Es ist natürlich möglich, daß die Protein-Domäne ein nicht-immunoreaktives Protein oder ein Fragment davon umfaßt, das in der Lage ist, mit einem anderen Analyt-Bindungsprotein als einem Antikörper in Wechselwirkung zu treten]. Die Protein-Domäne der Fusionsproteine vermeidet die Notwendigkeit einer kovalenten Kupplung eines Analyten an die Analyt-Domäne, wie sie erforderlich ist, wenn die Analyt-Domäne eine Analyt-Kupplungsdomäne ist. Dies ist deshalb so, weil der Protein-Domänen-Anteil eines Fusions-Proteins im wesentlichen ein Analyt (oder mindestens ein enges Analogon eines solchen) ist, der in der Lage ist, mit freiem Analyten um Analyt- Bindungs-Proteine zu konkurrieren.
Wie bei irgendeinem beliebigen Enzym-Assay für einen Analyten, der in einer Probe oder in einem Medium enthalten ist, muß ein Analyt-Bindungsprotein, das als Reagens in dem Assay-Gemisch enthalten ist, konkurrierend in Wechselwirkung treten oder sich kombinieren sowohl mit einem freien Analyten als auch mit einem Analyten, der gekuppelt ist an oder fusioniert ist als Teil der Analyten-Domäne des Enzym-Donors. Die Wechselwirkung des Analyt-Bindungsproteins mit einem Analyten, der gekuppelt ist an oder fusioniert ist innerhalb des Enzym-Donors (nachstehend als "Enzym-Donor-Konjugat" bezeichnet) muß das Komplementations-Verfahren des Enzym-Donors und Enzym-Akzeptors hemmen (inhibieren). Gemäß der hier angewendeten Definition umfassen die Analyt-Bindungsproteine spezifische Antikörper- Moleküle, die konventionelle (polyklonale) und monoklonale Antikörper (und Fragmente davon), Rezeptoren, Transport- Proteine, Lectine und andere Bindungsproteine, wie z. B., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Avidin, Thyroxinbindendes Globulin und dgl., umfassen. Gemäß der hier angewendeten Definition umfaßt der Ausdruck Analyt- Bindungsprotein proteinhaltige Substanzen, wie Glycoproteine, Lipoproteine und dgl.
Die erfindungsgemäßen verbesserten Enzym-Assay-Verfahren basieren auf Konkurrenz-Bindungsmechanismen. Erfindungsgemäß wird eine bekannte Menge eines Enzym-Donors des β-Galactosidase-Systems, das einen interessierenden gekuppelten oder fusionierten Analyten (oder ein analoges Analyt-Derivat) (d. h. ein Enzym-Donor-Konjugat) enthält, mit einer bekannten Menge eines spezifischen Analyt-Bindungsproteins und einer bekannten Menge eines Enzym-Akzeptors, der zu einer Komplementation mit dem Enzym-Donor in der Lage ist, kombiniert. Die Konkurrenz zwischen der Analyten-Domäne des Enzym-Donor-Konjugats und dem freien unbekannten Analyten in der Probe um die bekannte Menge des spezifischen Analyt-Bindungsproteins setzt das Enzym-Donor-Konjugat frei, so daß es sich an den Enzym-Akzeptor bindet. Die Assoziation eines Enzym-Donor-Konjugats und eines Enzym-Akzeptors führt zur Bildung eines katalytisch aktiven Enzym-Komplexes, wodurch die Menge der in der Probe nachweisbaren β-Galactosidase-Enzymaktivität moduliert wird. Als Folge davon wird die Menge des freien Analyten in der Probe als direkte Funktion der meßbaren Enzymaktivität bestimmt. Die Enzymaktivität wird gemessen durch Überwachung der Rate der Substratumwandlung durch die Enzym-katalysierte Reaktion nach irgendeiner Vielzahl von Techniken, wie z. B., ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, photometrischen und fluorometrischen Verfahren. Die konkurrierenden Reaktionen des erfindungsgemäßen Assays können wie folgt dargestellt werden:
wobei in dem Analyten, dem Enzym-Donor-Konjugat, dem Enzym-Akzeptor, dem Analyt-Bindungsprotein und dem β-Galactosidase-Enzym jeweils darstellen: A; ED A; EA; Abp und E
worin k2a und k2d die Assoziations- und Disassoziationskonstanten des Enzym-Donor-Konjugats und des Analyt-Bindungs-Proteins darstellen;
worin k3a und k3d die Assoziations- und Disassoziationskonstanten des Enzym-Donor-Konjugats und der Enzym-Akzeptor-Polypeptide darstellen.
Die Bindung des Analyt-Bindungsproteins (Abp) an eine zugängliche Determinante an dem Enzym-Donor-Konjugat (ED A inhibiert die Komplementations-Reaktion, so daß der Enzym-Akzeptor als inaktives Dimer zurückbleibt.
Somit konkurriert die Reaktion (2)
mit der Reaktion (3)
Bei Anwendung der bekannten Konzentrationen von Abp, ED A und EA ist die Aktivität der komplex gebundenen β- Galactosidase [E] direkt proportional zu der unbekannten Konzentration des interessierenden freien Analyten in der Probe.
Wie bei konventionellen Enzym-Assays muß zur Erzielung einer zufriedenstellenden Empfindlichkeit die Bildung eines aktiven Enzyms durch Komplementation des Enzym-Donor-Konjugats, das zusammen mit dem Enzym-Akzeptor an das Analyt-Bindungsprotein gekuppelt ist, minimal sein. Das heißt mit anderen Worten, entweder eine oder beide nachstehend angegebenen Reaktionen (4) und (5) dürfen nur minimal oder überhaupt nicht ablaufen.
worin ED A; Abp; und EA die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben; und das Substrat und das Produkt für die durch das aktive Enzym (E) katalysierte Reaktion jeweils S und P sind.
Eine kritische Komponente für die Entwicklung eines speziellen Assays mit einer zufriedenstellenden Empfindlichkeit ist die Beziehung zwischen (1) der Assoziationskonstanten für das Enzym-Donor-Konjugat und dem Enzym-Akzeptor (k3a), (2) der Konzentration des spezifischen Analyt-Bindungsproteins ([Abp]); (3) der Assoziationskonstanten für das spezifische Analyt-Bindungsprotein und dem Enzym-Donor-Konjugat (k2a) und der Konzentration des Enzym- Akzeptors ([EA]).
Bei der Entwicklung eines speziellen Assays können die folgenden, von Farina und Golke (US-Patent Nr. 4 378 428) vorgeschlagenen Ungleichungen angewendet werden:
worin K&sub1; und K&sub3; die Gleichgewichtskonstanten für die Reaktionen (1) und (3) und [Abp), [EA) und [ED A] jeweils die Konzentrationen für das Analyt-bindende Protein, den Enzym-Akzeptor und den Enzym-Donor, der an den Analyten gekuppelt ist, bedeuten. Diese Analyse geht davon aus, daß die Gleichgewichtskonstanten für die obigen Reaktionen (1) und (2) identisch sind und daß die Reaktionen (4) und (5) überhaupt nicht ablaufen.
Wie von Farina und Golke (supra) näher erläutert, ist es im allgemeinen erwünscht, daß der Assay so aufgebaut wird, daß der Ausdruck
K&sub3; [Abp]/K&sub1;
etwa 2 bis 100 mal größer ist als [EA], vorzugsweise etwa 5 bis 25 mal größer ist als [EA]. Außerdem sollte die Konzentration von ED A innerhalb eines Faktors liegen, der etwa dem 10- bis 100-fachen derjenigen der angenommenen unbekannten Analyt-Konzentration entspricht. Dies erlaubt es, auf die bei der Reaktion (3) gebildete Menge des katalytisch aktiven Enzyms in zufriedenstellender Weise zu antworten (anzusprechen) durch Variieren der Analyt- Konzentrationen in den zu untersuchenden Proben.
Die Komponenten der erfindungsgemäßen Enzym-Komplementations-Assays können in einem Kit abgepackt sein, entweder in einem wäßrigen Medium oder in lyophilisierter Form. Jede Komponente oder jedes Reagens kann entweder getrennt oder zusammen mit einer anderen Komponente abgepackt sein, so lange die Empfindlichkeit des Assays nicht verändert wird und die Komponente nicht in nachteiliger Weise beeinflußt wird. Eine kommerzielle Ausführungsform der Kits wird als Cloned Enzyme-Donor Immunoassay [CEDIA ®] bezeichnet.

5.1 Enzym-Donoren

Erfindungsgemäß werden verbessere Enzym-Assays erzielt durch Verwendung von Enzym-Donoren und Enzym-Akzeptoren, die unter Anwendung der rekombinanten DNA-Techniken und/oder chemischen Polypeptidsynthese-Techniken hergestellt worden sind. Diese Techniken erlauben eine verbesserte Chemie für die kovalente Kupplung zwischen den Enzym-Donoren und den Analyten über die Insertion oder Substitution von Aminosäuren mit den geeigneten reaktionsfähigen Gruppen, beispielsweise mit Amino-, Sulfhydryl-, Carboxylgruppen und dgl. Diese Techniken erlauben eine genauere Kontrolle der Assoziationskonstanten zwischen dem Enzym-Akzeptor und dem Enzym-Donor durch systematische Bestimmung der Aminosäuresequenz der komplementierenden Polypeptide. Zusätzlich ergeben diese Techniken billige, zuverlässige Quellen für diese Polypeptide.

5.1.1 Enzym-Donoren: Verbesserte chemische Kupplungsreaktionen

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Enzym-Donoren mit einer α-Donor-Domäne und einer Analyten-Domäne hergestellt durch Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken zur Verbesserung der chemischen Reaktionen für die Kupplung eines Analyten an die Analyten- Domäne. Diese Enzym-Donor-Polypeptide ergeben geeignete Kupplungsstellen für die kovalente Bindung des Analyten in variierenden Abständen von der α-Donor-Domänen-Sequenz, die für die Komplementation erforderlich ist.
Zur Erzielung von Enzym-Donor-Polypeptiden des Typs, der eine Analyt-Kupplungs-Domäne enthält, kann das dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Plasmid pUC13 (vgl. Fig. 2A) an unterschiedlichen Stellen in dem u-Bereich mit einer Vielzahl von Enzymen geschnitten (gespalten) werden. So ergibt beispielsweise ein Schneiden (Spalten) mit HaeII, BqlI, MstI oder PvuI die jeweiligen α-Regionen der H-Reihen, der B-Reihen, der M-Reihen und der P-Reihen. Die P- und H-Reihen werden mit T4 DNA-Polymerase und S1- Nuclease behandelt, die M-Reihen und P-Reihen werden nicht behandelt. Jede der DNA-Reihen wird mit SacI an der multiplen Klonierungsstelle digestiert und die kleinen DNAs, die ein α-komplementierendes Peptid codieren, werden durch Agarosegelreinigung gereinigt, auf einem DEAE-Cellulosepapier elektrophoretisch behandelt, eluiert und mit Ethanol präzipitiert.
Außerdem kann ein Plasmid genetisch hergestellt werden, das die α-Donor-Sequenz unter die Regulierungskontrolle eines Temperatur-induzierbaren Promotors stellt. Dies kann erzielt werden durch Verwendung eines λPr-Promotors in Kombination mit einem λ-Repressor-Protein (codiert durch das λCI-Gen), das temperaturempfindlich ist, und dies erlaubt die Temperaturinduktion der Protein- Expression. Das λ Mutanten-Gen CI857 codiert für ein temperaturempfindliches Repressor-Protein, das bei Temperaturen oberhalb 37ºC inaktiv ist. Nachstehend beziehen sich die Hinweise auf das λCI-Gen auf das CI857-Mutanten-Gen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Enzym-Donoren mit einer α-Donor-Domäne und einer Analyten-Kupplungs-Domäne hergestellt durch Anwendung von chemischen Polypeptid-Synthesetechniken zur Verbesserung der chemischen Reaktionen für die Kupplung eines Analyten an die Analyten-Domäne. Diese Enzym-Donor- Polypeptide ergeben geeignete Kupplungsstellen für die kovalente Bindung des Analyten in variierenden Abständen von der α-Donor-Domänen-Sequenz, die für die Komplementation erforderlich ist. Es können auch chemische Peptid-Synthesetechniken angewendet werden zur Herstellung von Enzym- Donoren, die eine α-Domäne und eine Protein-Domäne umfassen. Enzym-Donor-Peptide werden unter Anwendung von Standard-Synthesetechniken auf einem automatisierten Peptid- Synthesizer synthetisiert. Das heißt, eine geschützte Aminosäure, welche die Carboxy-Terminus-Aminosäure des gewünschten Peptids darstellt, wird an vernetzten Polystyrol-Perlen fixiert (gebunden). Die Harzperlen fungieren als feste Phase, an die weitere Aminosäuren stufenweise gekuppelt werden können. Das Peptid wird erzeugt, indem man die Kette nacheinander von dem Carboxy-Terminus zu dem N-Terminus wachsen läßt. Die feste Phase erleichtert die schnelle Verschiebung der Reaktion zur 100% -Vervollständigung durch Verwendung von Überschußreagentien. Die Überschußreagentien können dann leicht weggewaschen werden. Nach Beendigung der Synthesestufen wird das Peptid aus dem Harz entfernt und gereinigt.
Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Enzym-Donor-Polypeptide weisen eine bessere Kupplungschemie für die Bindung an Analyten auf als die konventionellen Polypeptide der CNBr&sub2;/M15-, CNBr&sub2;/M112-, und CNBr&sub2;&sub4;/X90-Komplementationssysteme.
Die Kupplung von Analyten an M15, das viele Amino-, Carbonsäure- und Sulfhydrylgruppen aufweist, inaktiviert M15 in allen Fällen, selbst unter vorsichtig kontrollierten Bedingungen. Kinetische Experimente zeigen, daß ein einziger Schlag (Treffer) ausreicht, um die Aktivität zu inaktivieren. Analoge Ergebnisse sind mit M112 und X90 zu erwarten.
Die kovalente Bindung des Analyten an das CNBr&sub2;-Peptid über NH&sub2;-, COOH- und SH-Gruppen führte in allen untersuchten Fällen zu Polypeptiden, die zur Komplementation nicht in der Lage waren. CNBr&sub2; enthält keine internen Lysine (keine verfügbaren NH&sub2;-Gruppen), eine einzige Sulfhydryl-Gruppe und mehrere Carbonsäure-Gruppen. Es wurde gezeigt, daß zuerst in Übereinstimmung mit Langley (Doktorarbeit "The Molecular Nature of β-galactosidase αcomplementation", UCLA, 1975) die Kupplung an die N-terminale α-Aminogruppe die Komplementations-Aktivität von CNBr&sub2; inaktiviert. In einer Reihe von Experimenten wurde eine Reihe von Verbindungen mit variierendem Molekulargewicht kovalent an die einzige Aminogruppe gebunden, die an dem N-Terminus des CNBr&sub2;-Peptids angeordnet war. Die folgenden Verbindungen wurden mit der N-terminalen Aminogruppe des Peptids umgesetzt Bernsteinsäureanhydrid (MG (Molekulargewicht) 100 Dalton); Biotin-N-Hydroxysuccinimidester (MG 342 Dalton); 4-Phenylspiro [Furan-2(3HO,-1'- phthalon]-3,3'-dion (Fluorescamin) (MG 278 Dalton); und Dichlorotriazinylamino-fluorescein-dihydrochlorid (MG 568 Dalton). Die Komplementation durch diese Enzym-Donor- Konjugate wurde verglichen mit der Komplementation durch freies CNBr&sub2;-Peptid. Die Fähigkeit von CNBr&sub2;, entweder M15- oder EA23-Enzym-Akzeptor-Polypeptide zu komplementieren, wurde durch die gebundenen Verbindungen zu etwa 25%, 39%, 46% bzw. 63% inhibiert. Es sei darauf hingewiesen, daß eine analoge kovalente Bindung dieser gleichen Verbindungen an die N-terminale Aminogruppe von Enzym-Donor-Polypeptiden, die unter Anwendung von rekombinanten DNA- Techniken hergestellt wurden, in entsprechender Weise die Komplementation inhibierte. So wird durch Kuppeln der Analyten, insbesondere derjenigen mit einem MG von größer als etwa 500 Dalton, an die Aminogruppe des N-Terminus die Komplementation durch die Enzym-Donor-Polypeptide stark eingeschränkt.
Zweitens gibt es keine freie Sulfhydrylgruppe, die für die kovalente Bindung von Analyten in gereinigtem CNBr&sub2;-Peptid verfügbar sind. Bei der Herstellung von CNBr&sub2; (Langley, Fowler und Zabin, 1975, "J Biol. Chem.", 250 : 2587), wird die 5ulfhydrylgruppe in der Position 76 mit Jodessigsäure reduziert und alkyliert vor dem Schneiden (Spalten) mit Cyanbromid. Wenn die Sulfhydrylgruppe nicht alkyliert wird, kann die CNBr&sub2;-Aktivität in den Anfangsstufen der Reinigung aufrechterhalten werden, vor der Reinigung bis zur Homogenität geht sie jedoch verloren. Auch wenn die Sulfhydrylgruppe mit einem Maleimidderivat eines Analyten anstatt mit Jodessigsäure alkyliert wird, verhindert die Unlöslichkeit des Konjugats eine Reinigung.
Drittens wurde in allen untersuchten Fällen durch die Kupplung an einen COOH-Rest von CNBr&sub2; die Komplementations-Aktivität inaktiviert. So wurde beispielsweise Theophyllin-8-propylamin verwendet in einem Versuch, Theophyllin an CNBr&sub2; zu kuppeln mit dem wasserlöslichen Carbodiimid-1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Theophyllin-8-butyrat wurde nach Cook et al (1976, "Res. Comm. Chem. Path. Pharm." 13 : 497-505) synthetisiert und in Theophyllin-8- propylamin umgewandelt durch eine modifizierte Curtius-Umlagerung (Washborne und Peterson, "Synthetic Comm." 1972, 2 (4): 227-230). Die Struktur des gereinigten Produkts wurde durch Massenspektroskopie von Dr. T. Vanaman an der Duke Universität bestätigt. Zu mehreren Reagensgläschen (Röhrchen), die 2 · 10&supmin;¹¹ mol CNBr&sub2; in 0,5 ml 0,1 M NaPO&sub4;, pH 7,4, und 1 · 10&supmin;&sup5; mol Theophyllin-8-propylamin enthielten, wurden abnehmende Mengen an EDAC zugegeben. Die resultierende Komplementations-Aktivität wurde in einem 0,5 M PM2-Puffer mit M15 als Enzym-Akzeptor und o-Nitrophenylβ-D-galactopyranosid als Substrat gemessen. EDAC wurde gelöst und verdünnt in kaltem Wasser unmittelbar vor der Verwendung und es wurden 10 ul der verschiedenen Verdünnungen den Reaktionsröhrchen zugegeben. Die optische Dichte (414 nm) von 1,403; 0,000; 0,000; 0,010; 0,018; 0,125; und 0,983 wurde bestimmt unter Verwendung der jeweiligen EDAC-Konzentrationen 0; 1 · 10&supmin;&sup6;; 1 · 10&supmin;&sup7;; 1 · 10&supmin;&sup8;; 1 · 10&supmin;&sup9;; 1 · 10&supmin;¹&sup0;; 1 · 10&supmin;¹¹ mol. Diese Daten zeigen die schnelle Inaktivierung von CNBr&sub2;-Probe-Kupplungen mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.
Im Gegensatz dazu werden die Enzym-Donor-Polypeptide erfindungsgemäß genetisch so hergestellt oder chemisch synthetisiert, daß sie genügend Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen ergeben oder chemisch synthetisierte Gruppen werden aus dem N-Terminus entfernt, so daß die Analyten kovalent an diese Gruppen gebunden werden, ohne die Fähigkeit des Enzym-Donor-Konjugats, einen katalytisch aktiven Enzym-Komplex mit einem Enzym-Akzeptor zu bilden, zu beeinträchtigen. Sulfhydryl- und Aminogruppen sind bevorzugt.
Wenn eine freie Sulfhydrylgruppe vorliegt, kann sie mit einer reaktionsfähigen Gruppe, die an dem Analyten vorhanden ist, reagieren. Zu solchen reaktionsfähigen Gruppen gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, reaktionsfähige Halogenalkylgruppen und Säure/Halogen-Gruppen, p-Quecksilber(II)benzoat-Gruppen und Gruppen, die zu Additionsreaktionen vom Michael-Typ in der Lage sind (z. B. Maleimide und Gruppen des Typs, wie sie von Mitral und Lawton, 1979 in "J Amer. Chem. Soc." 101 : 3097- 3110) beschrieben sind. Das hier definierte Halogenalkyl umfaßt eine beliebige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, die substituiert ist durch Brom, Jod oder Chlor. Wenn der Analyt keine derartige reaktionsfähige Gruppe für die Kupplung an die freie Sulfhydrylgruppe des Enzym-Donors aufweist, kann ein Derivat des Analyten hergestellt werden, das eine solche reaktionsfähige Gruppe enthält.

5. 1. 2 Enzym-Donoren: Fusions-Proteine

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Enzym-Donor-Polypeptid hergestellt durch Ligieren oder Fusionieren eines Gens, das für eine α-Donor-Domäne codiert, mit einem anderen Gen, das für den Protein-Analyten (oder einen Teil davon), der untersucht werden soll, codiert. Die Expression der ligierten Gene in eine geeignete Wirtszelle führt zu einem Fusionsproteinprodukt, das sowohl zur Komplementation mit einem Enzym-Akzeptor als auch zur spezifischen Bindung an das Analyt-Bindungsprotein in der Lage ist. So umfassen die gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hergestellten Fusionsproteine zwei Domänen: (1) eine α-Donor-Domäne und (2) eine Protein-Domäne, die beide durch ein fusioniertes Gen codiert werden. Wie weiter oben angegeben, umfassen die erfindungsgemäß verwendeten Protein-Domänen immunoreaktive Epitope von Protein-Antigenen.
Zur Herstellung eines Gens, das für ein Fusionsprotein codiert, müssen die beiden fraglichen Gene mit ihren codierenden Sequenzen so miteinander vereinigt werden, daß die Translationslesephase aufrechterhalten wird und durch Terminationssignale nicht unterbrochen wird. Wenn die Wirtszelle ein Stamm ist, der einen Repressor enthält, wird das Fusionsprotein nur als Antwort auf die Inaktivierung des Repressors der Induktion gebildet. Die Fusionsproteine werden im Hinblick auf ihre Komplementations-Aktivität identifiziert durch in vivo-Komplementation eines Enzym-Akzeptors. Anreicherungen (Screening) von genetischen Konstruktionen für die Immunoreaktivität und die immunspezifische Inhibierung der Komplementation durch Wechselwirkung zwischen einem Antikörper und der Protein- Domäne werden in vitro erhalten.
Es können Fusionsproteine hergestellt werden, bei denen das immunreaktive Polypeptid an den N-Terminus der α-Donor-Domäne oder an den C-Terminus des Enzym-Donor-Polypeptids gebunden ist (vgl. Fig. 4). Eine Spacer-Sequenz (Abstandhalter-Sequenz) zwischen der α-Donor-Domäne und der Protein-Domäne kann angewendet werden zur Verbesserung der Komplementation oder zur Erhöhung des Inhibierungseffekts der Wechselwirkung mit einem spezifischen Bindungsprotein bei der Komplementation.
Außerdem kann es sein, daß die Fusion eines ganzen Gens, das für einen speziellen Protein-Analyten codiert, nicht erforderlich ist. So bestehen beispielsweise die verwandten Human-Glycoproteine Leutropin (ein Leuteinisierungshormon LH), Follitropin (ein Follikel-stimulierendes Hormon F5H), Thyrotropin (ein Thyroid-stimulierendes Hormon TSH) und Human-Chorion-Gonadotropin (hCG) aus α- und β-Subeinheiten. Die α-Subeinheiten aller dieser Hormone sind identisch. In jedem Falle ist jedoch die β-Subeinheit verschieden und trägt zu der einzigartigen Spezifität und biologischen Aktivität jedes Hormons bei. So braucht nur die β-Subeinheit mit der α-Donor-Domänen-Sequenz fusioniert zu werden, um ein Immunoassay zu konstruieren, das für ein spezielles Hormon dieser Gruppe spezifisch ist.
Alternativ kann die immunoreaktive Sequenz, die für die Protein-Domäne codiert, die mit der α-Donor-codierenden Gensequenz fusioniert ist, ein singuläres immunreaktives Epitop darstellen. So braucht beispielsweise nur die singuläre Carboxy-terminale 30 Aminosäure-Extension der β- Subeinheit von hCG als Protein-Domäne in einem Assay für hCG verwendet zu werden (Birken et al., 1982, "Endocrinology" 110 : 1555).
Als ein weiteres erläuterndes Beispiel kann die Sequenz für das gesamte Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen oder nur ein kleiner Teil dieser Sequenz als immunreaktives Epitop für das Hepatitis B-Virus verwendet werden (Lernere et al., 1981, "Proc. Natl. Acad. Sci." USA, 78 : 3403).
Die Enzym-Donoren können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, beispielsweise unter Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie einschließlich der direkten Synthese von DNA unter Verwendung eines kommerziellen DNA-Synthesizers und dgl.

5. 2 Enzym-Akzeptoren

Wie oben angegeben, ist die Assoziationskonstante zwischen den Enzym-Donor- und Enzym-Akzeptor-Polypeptiden ein wichtiger Parameter für die Erzielung einer zufriedenstellenden Empfindlichkeit bei einem Enzym-Komplementations-Assay-System. Erfindungsgemäß wird zur Einstellung der Assoziationskonstanten zwischen dem Enzym-Donor und dem Enzym-Akzeptor die Aminosäuresequenz entweder der Enzym- Donor-α-Domäne (vgl. den obigen Abschnitt 5.1) oder des Enzym-Akzeptors systematisch verändert.
Enzym-Akzeptoren mit variierenden Affinitäten für einen Enzym-Donor werden hergestellt unter Verwendung einer Vielzahl von rekombinanten DNA-Techniken, beispielsweise, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, von Deletions-Konstruktionen oder der direkten Synthese von DNA, welche die gewünschte Aminosäuresequenz trägt, gefolgt von der in Phase-Ligation in die DNA-Sequenz der α- Region des lacZ-Gens, das für native β-Galactosidase codiert.
Erläuternde Techniken zur Herstellung von Enzym-Akzeptoren durch Deletions-Konstruktionen werden im weiter unten folgenden Abschnitt 6 im Detail erläutert. Die Deletionskonstruktions-Techniken führen zur Einführung von Stellen, die für spezielle Restriktionsenzyme spezifisch sind, in die α-Region des β-Galactosidase Z-Gens, woran sich eine Stellen-spezifische Digestion, beispielsweise eine Bal31-Digestion, anschließt, welche die gewünschte Aminosäuresequenz liefert. Nach der Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen werden die lebensfähigen Enzym-Akzeptoren unter Ausnutzung des in vivo-Komplementations- Vermögens isoliert. So kann beispielsweise eine Komplementation durch Screening erzielt werden durch Transformation von Plasmiden, die thermoinduzierbare Gene tragen, die für einen Enzym-Donor sowie den interessierenden Enzym-Akzeptor codieren, in einen Stamm, wie AMA1004 (AMA1004 ist galU, galK, StrAr, hsdR&supmin;, leuB6, trpC, Δ(lacIPOZ)C29 (Casadaban et al., 1983, "Methods in Enzymology" 100 : 293) und Selektion auf Platten, die das Induktionsmittel- Isopropylthiogalactosid und das chromogene Substrat 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid enthalten. Kolonien, die bei 30ºC weiß sind, jedoch bei 42ºC blau sind, zeigen die Bildung von lebensfähigen Enzym-Akzeptoren an. Die DNA aus diesen Enzym-Akzeptoren wird mit SalI geschnitten, erneut ligiert und in AMA1004 transformiert. Dann werden die Enzym-Akzeptor-Polypeptide gereinigt.
Alternativ werden die Enzym-Akzeptoren hergestellt durch direkte Synthese der DNA unter Verwendung irgendeines beliebigen handelsüblichen DNA-Synthesizers. Die gewünchte synthetische DNA-Sequenz wird dann hybridisiert und in einen geeigneten Plasmid-Vektor ligiert. So wird beispielsweise das Plasmid p150 mit BamHI- und XhoI-Restriktionsenzymen digestiert. Die gewünschte synthetische DNA-Sequenz wird dann in den BamHI/XhoI-Zwischenraum inseriert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Enzym-Akzeptoren mit einer verbesserten Stabilität hergestellt für die Verwendung in Enzym-Komplementations- Assays. Die Instabilität von Enzym-Akzeptoren wird insbesondere durch oxidierende Bedingungen hervorgerufen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit, verbessern dramatisch die Stabilität von Enzym-Akzeptoren. Diese Ergebnisse weisen auf frei liegende Sulfhydrylgruppen an den Enzym-Akzeptoren hin als Ursache für die Instabilität. Nach Jornvall, Fowler and Zabin ("Biochemistry" 1978, 17 : 5160- 5164) sind zwei der 16 Cystein-Reste der Monomer-Polypeptid-Kette von nativer β-Galactosidase an der Oberfläche des Enzyms angeordnet. Der Enzym-Akzeptor M15 enthält jedoch 5 Cysteinreste an der Oberfläche. Deshalb werden zur Verbesserung der Enzym-Akzeptor-Stabilität die freiliegenden Cysteinreste systematisch aus den verbesserten Enzym- Akzeptoren entfernt, wie im Abschnitt 6.2 beschrieben. Die Gene, welche für die Enzym-Akzeptoren codieren, werden in den geeigneten M13-Bacteriophagen einkloniert, die Einfachstrang-DNA wird isoliert und hybridisiert zu geeigneten Oligonucleotid-Startern, die auf dem DNA-Synthetisizer der Applied Biosystems Inc. synthetisiert werden. In diesen Konstruktionen werden Standardverfahren, wie sie von Zoller und Smith (in "Methods in Enzymology" 1983, 100, 468-500, Academic Press) beschrieben sind, angewendet.

5.3 Analyten

Die verbesserten Verfahren und neuen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können angewendet werden zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge einer Vielzahl von Analyten, die umfassen Arzneimittel und Arzneimittelmetabolite, biologisch aktive Moleküle, Steroide, Vitamine, industrielle Schadstoffe, Pestizide und ihre Metabolite, Lebensmittelzusätze, Herbicide und ihre Metabolite, Geschmacksbildner und Lebensmittelgifte, Pathogene und Toxine, die sie bilden, sowie andere interessierende Substanzen. Analyten mit einem verhältnismäßig hohen Molekulargewicht, beispielsweise Proteine mit einem MG von mehr als etwa 2000 Dalton, sowie kleinere Analyte können mit den verbesserten Assays und Zusammensetzungen dieser Erfindung nachgewiesen und/oder bestimmt werden. Zu erläuternden Beispielen für diese Analyten gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, die folgenden:
hohes Molekulargewicht niedriges Molekulargewicht
Carcinoembryo-Antigen Östriol
Ferritin Digoxin
Human T-Zellen-Leukämie-Virus Thyroxin
Insulin Propranolol
α-Fetoprotein Methotrexat
Rubella-Virus Phencyclidin
Herpesvirus Methadon
Cytomegalovirus Morphin
Follikel-stimulierendes
Hormon Diazepam
Thyroid-stimulierendes Hormon Oxazepam
Leutinisierungshormon Chinidin
Hepatitis-Virus Propoxyphen
Chorion-Gonadotropin N-Acetylprocainamid
Östrogen-Rezeptor Secobarbital
Thyroid-stimulierender Hormon-Rezeptor Tobramycin
Poliovirus-Rezeptor Gentamicin
Insulin-Transport-Protein Theophyllin
Protein A Amphetamin
Con A Lectin Benzoyl-ecogonin
Weizenkeim-Agglutinin-Lectin Phenytoin
Sekretorisches Protein Procainamid
Cholera-Toxin Lidocain
Avidin Carbamazepin
Primiden
Valpronsäure
Phenobarbital
Ethosuccinimid
Biotin

5. 4 Enzym-Substrate

In den erfindungsgemäßen verbesserten Enzym-Assays wird die Menge des unbekannten Analyten in einer Probenmischung als direkte Funktion der Aktivität der β-Galactosidase-Enzyme gemessen. Die Enzymaktivität wird durch das Auftreten eines Produkts der enzymatisch katalysierten Reaktion oder durch das Verschwinden des Enzymsubstrats überwacht. Dies ist die Geschwindigkeit (Rate) der Umwandlung des Substrats. Zu Beispielen für Substrate für β-Galactosidase, die für die spektrophotometrische oder fluorometrische Analyse geeignet sind, gehören, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, p-Aminophenyl-β-D-galactopyranosid; 2'-N-(Hexadecanol)-N-(amino-4'-nitrophenyl)β-D-galactopyranosid; 4-Methylumbeliferyl-β-D-galactopyranosid; Napahthyl-AS-B1-β-D-galactopyranosid; 1-Naphthyl-β- D-galactopyranosid; 2-Naphthyl-β-D-galactopyranosidmonohydrat; O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid; m-Nitrophenyl-β- D-galactopyranosid; p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid und Phenyl-β-D-galactopyranosid, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β- D-galactopyranosid, Resorufin-β-D-galactopyranosid, 7-Hydroxy-4-trifluoromethyl-cumarin, -Nitrostyryl-β-D-galactopyranosid und Fluorescein-β-D-galactopyranosid.

5.5 Analyt-bindende Proteine

In den erfindungsgemäßen Enzym-Assays wird die konkurrierende Wechselwirkung eines Analyt-bindenden Proteins (Analyt-Bindungsproteins) zwischen dem freien Analyten und einem Enzym-Donor-Konjugat ausgenutzt. Die Wechselwirkung des Enzym-Donor-Konjugats inhibiert die Komplementations- Reaktion. Wie in den weiter unten folgenden Beispielen in den Abschnitten 12 und 13 im Detail beschrieben, kann die Bindung eines Antikörpers oder eines Antikörper-Fragments, der (das) für das Analyt-Bindungsprotein spezifisch ist, nützlich sein zur Verbesserung der sterischen Hinderungseffekte und sie kann somit zur Inhibierung der Komplementation durch das an das Analyt-Bindungsprotein gebundene Enzym-Donor-Konjugat beitragen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Analyt-Bindungsprotein ein Antikörper-Molekül. In diesem Falle ist der Assay ein Enzym-Immunoassay. Zu den für solche Assays verwendbaren Antikörper-Molekülen gehören sowohl konventionelle (polyklonale) als auch monoklonale Antikörper (und Fragmente von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern), die spezifisch sind für den zu bestimmenden Analyten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Analyt-Bindungsprotein um Avidin, das eine spezielle Affinität für Biotin hat. In diesem Falle ist der Enzym-Assay verwendbar zur Bestimmung nicht nur von Biotin, sondern auch von Derivaten von Biotin, die eine Affinität für Avidin beibehalten.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Analyt-Bindungsprotein um ein Bindungsprotein, das umfaßt, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Rezeptoren, Lectine, Transport-Proteine und dgl.

6. Beispiele: Herstellung von Enzym-Donoren und Enzym- Akzeptoren durch Rekombinanten-Verfahren

In allen folgenden Experimenten wurden alle DNA-Restriktions- und -Modifizierungsenzyme aus den New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen und sie wurden nach den Angaben des Herstellers verwendet.

6.1 Enzym-Donoren

6.1.1 pl25 Enzym-Donor

Das Plasmid pl25 wurde genetisch hergestellt, um eine α-Donor-Sequenz unter die Regulationskontrolle eines Temperatur-induzierbaren Promotors (λPr) zu stellen. Außerdem enthält das exprimierte α-Donor-Peptid einen singulären Cystein-Rest in der Nähe des C-terminalen Endes. Dies wurde erzielt durch Schneiden (Spalten) des Plasmids pUC13 mit BglI und die resultierenden Einfachstrang-Termini wurden durch Behandlung mit S1-Nuclease entfernt. Das Plasmid wurde dann mit BamHI digestiert. Dann wurde das DNA-Fragment von etwa 170 bp, welches das β-Galactosidase-α-Gen codiert, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt (vgl. Fig. 2).
Das Plasmid pβga12 ist ein Derivat des Plasmids-pCVQ2 (Queen, 1983, "J. Molec. Applied Genetics" 2 : 1), welches den lac-Operon unter der Regulationskontrolle des Temperatur-induzierbaren λPr-Promotors trägt. Um die λ-Regulationssequenzen für andere genetische Konstruktionen verfügbar zu machen, wurde das Plasmid pβga12 modifiziert. Das Plasmid pβga12 wurde mit BamHI und SalI digestiert und die DNA-Sequenzen, die für den lac-Operon codieren, wurden entfernt. Das die pBR322-Sequenzen (einschließlich ampr und ori) enthaltende DNA-Fragment und CI wurden durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert u Synthetische DNA-Linker, die Erkennungssequenzen für BamHI, EcoRI, HindIII, SalI und XbaI enthielten, wurden ligiert und dann geschnitten (gespalten) mit BamHI und SalI, um kürzere Multi-Linker- Segmente mit kohäsiven BamHI- und SalI-Enden zu erzeugen. Diese DNA-Fragmente wurden an das aus pβga12 isolierte BamHI/SalI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid p121B enthält EcoRI- und XbaI-Erkennungsstellen zwischen dem BamHI und SalI des Vektors. Das Plasmid p121B wurde mit BamHI und PvuII digestiert. Das BamHI/PvuII-DNA-Fragment, welches das β-Lactamase-Gen (das Resistenz gegenüber Ampicillin, ampr verleiht), das Phagen-λCI-Gen (ein Temperatur-gesteuerter Repressor) und den Plasmid-Replikationsursprung (ori) enthielt, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das BglI(-)/BamHI-DNA-Fragment aus pUC13 und das BamHI/PvuII-DNA-Fragment aus p121B wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert wie in Fig. 2A dargestellt. Das rekombinante Plasmid wurde in JM83, einen E. coli-Bakterienwirt für das Wachstum des Einzelstrang- Phagen M13 transformiert und seine Rekombinanten, die für das β-Galactosidase-Mutanten-Polypeptid M15 (Messing, 1979, "Rekombinant DNA Technical Bulletin", NIH Publication Nr. 79-99, 2, Nr. 2 : 43-48) und das Plasmid p125 codieren, wurden selektiert. Die in vivo-Komplementation trat bei 42ºC, nicht jedoch bei 32ºC auf, was zeigt, daß das Plasmid p125 ein Temperatur-induzierbares β-Galactosidase-α-Protein bildet.

6.1.2 Enzym-Donoren der H-, B- M- und P-Reihen

In einer Reihe von Experimenten wurden zur Herstellung von Enzym-Donor-Peptiden des Typs, der eine Analyten- Kupplungs-Domäne enthält (vgl. Abschnitt 5.1.1) verschieden große α-Regionen aus pUC13 isoliert (Vieira und Messing, 1982, "Gene" 19 : 259-268; Messing, 1983, "Methods in Enzymology" 101 : 20-78; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) mit HaeII, BglI, MstI oder PvuI digestiert, wobei man die H-Reihen, P-Reihen, M-Reihen bzw. P- Reihen erhielt. Die B-, P- und H-Reihen wurden mit T4 DNA- Polymerase und S1-Nuclease behandelt. Die M-Reihen wurden nicht behandelt. Jede Reihe von DNA wurde mit SacI digestiert, das an der Mehrfachklonierungsstelle angeordnet ist, und die kleinen DNAs, die für ein α-Komplementierungs-Peptid codieren, wurden durch Agarosegel-Reinigung gereinigt, auf einem DEAE-Cellulosepapier elektrophoretisiert (Schleicher und Schuell, Keene, NH), eluiert und mit Ethanol präzipitiert, wie vom Hersteller beschrieben.
Das Plasmid p141, das einen E. coli trp-Promotor trägt (EcoRI-SstI, 120 bp), der in das 2.3 kb EcoRI-PvuII- Fragment von pBR322 einkloniert ist, wurde mit NdeI digestiert und mit dem DNA-Polymerase-Klenow-Fragment und dATP und dTTP (PL-Biochemicals, Milwaukee, WI) behandelt. Die resultierende DNA wurde mit SacI digestiert und als Vektor verwendet zur Aufnahme der M-, B-, H- und P-Reihen der DNAs. Nach der Behandlung mit T4 DNA-Ligase wurden die DNAs in den E. coli-Stamm E9001 transformiert (Δlac pro, thi, supE, F' proAB, lacIQ, Z M15, auch als Stamm 71.18 bezeichnet; Messing et al., 1977, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 75, 3642-3646). Die DNA-Konstruktionen wurden nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert sequenziert (1980, "Methods in Enzymology" 67, 499) und sind in der Fig. 4 dargestellt. Dargestellt (*) sind auch die Stellen für die kovalente Bindung eines Analyten.
Die resultierenden Stämme, die für u-Regionen unter Trp-Kontrolle in dem E. coli-Stamm E9001 codieren, waren für die B-Reihen der Stamm Mg130, der das Plasmid p130 trägt; für die M-Reihen der Stamm MG129, der das Plasmid p129 trägt; und für die H-Reihen der Stamm MG131, der das Plasmid p131 trägt.
Zur Verbesserung der Expressionswerte der verschiedenen klonierten α-Regionen wurden die u-Regionen in neue Plasmide umgewandelt und unter die Kontrolle des XPr-Operator-Promotors gestellt. So wurde beispielsweise zur Herstellung von MG141 das die DNA-Sequenzen von H16 aus den H-Reihen codiere Gen unter die Pr-Kontrolle gestellt durch Ersatz des Trp-Promotors durch die nachstehend beschriebenen λPr- und λCI-Gene.
Das Plasmid p131, das H6 unter der Trp Operator-Promotor-Kontrolle enthielt, wurde mit EcoRI digestiert und das größere Fragment von etwa 2,1 kb wurde durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Die λPr- und λCI-Gene wurden einer Gel-Reinigung unterzogen aus dem kleinen Fragment einer EcoRI-Digestion von p125. Das 2,1 kb-Fragment von p131 wurde an das kleine Fragment von p125 ligiert, um den Trp-Promotor durch das λPr- und λCI-Promotor-System zu ersetzen. Dieser Versuch wurde auch wiederholt mit p130 und p129, wobei man die folgenden Plasmide und Stämme unter Pr-Kontrolle für die B-Reihen den Stamm MG139, der das Plasmid p139 trägt; für die M-Reihen den Stamm MG140, der das Plasmid p140 trägt; und für die H-Reihen den Stamm MG141, der das Plasmid pH6 trägt, erhielt. Die DNA-Konstruktionen wurden nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert in "Methods in Enzymology" 67 : 499 (1980), sequenziert und sind in der Fig. 4 dargestellt.

6.1.3 p148 Enzym-Donor

Unter Verwendung der Pr-Sequenz aus p125 wurde ein neues Plasmid hergestellt zur Bereitstellung eines Cystein-Restes in Richtung auf das N-terminale Ende des Peptids. Dieses neue Plasmid p148 enthielt auch drei Cystein- Reste, die in der Nähe des C-terminalen Endes des Peptids angeordnet waren. Das Plasmid pl25 wurde mit BamHI und EcoRI digestiert, ein etwa 1100 bP großes Fragment wurde von dem Vektor abgespalten (abgeschnitten) und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Dieses Fragment enthält die Pr-Sequenz, die in die singulären BamHI/EcoRI- Restriktionsstellen von pUc12 ligiert wurde (Messing, 1983, "Methods in Enzymology" 101 : 20-78). Dieses rekombinante Plasmid wurde in JM83-Zellen transformiert und es wurde gefunden, daß es bei 42ºC auf analoge Weise wie die oben beschriebene Konstruktion von p125 in vivo komplementiert. Die Struktur des Enzym-Donors p148 ist ebenfalls in Fig. 4 angegeben einschließlich der Positionen der Amino- und Sulfhydrylgruppen-Kupplungsstellen, die erfindungsgemäß zum Binden des Analyten ausgenutzt werden.

6.1.4 Enzym-Donor 3

Ein Enzym-Donor 3 (ED3) wurde hergestellt aus dem Enzym-Donor 1 (ED1), der aus H6 hergestellt wurde. ED1 wurde wie folgt hergestellt:
Die Synthese von DNA-Fragmenten wurde auf einem DNA- Synthesizer, Modell 380A, der Firma Applied Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, CA) durchgeführt. Jede Sequenz wurde in den Programmspeicher eingegeben und die Vorrichtung stellte automatisch den gewünschten Einzelstrang von DNA her, spaltete (schnitt) jedes Fragment aus dem kontrollierten Porenglasträger und sammelte die DNA in einer Phiole. DNA-Proben wurden mit 1,5 ml konzentriertem NH&sub4;OH 6 bis 24 h lang bei 55ºC behandelt und dann in einem Savant Speed Vac-Konzentrator zur Trockne eingedampft.
Das getrocknete Pellet jedes DNA-Fragments wurde in einer geringen Menge Formamid (100 bis 200 ul) gelöst und auf einem 12% Acrylamid-Gel gereinigt (BRL Modell SO, 34- 40 cm, 1,6 mm Dicke) und über Nacht bei 200 Volt elektrophoretisiert. Die gewünschte Bande wurde sichtbar gemacht unter Verwendung von Baker-Flex-Silicagel IB-F (der Firma J.T. Baker Chemical Co.) als fluoreszierender Hintergrund. Die gewünschte DNA-Bande wurde mittels einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wurde aus dem Acrylamidgel-Fragment elektrophoretisiert in einer Einheit, Modell UEA, der Firma International Biotechnologies, Inc. (IBI) nach den Angaben des Herstellers. Die DNA wurde in einem geringen Puffervolumen gesammelt und mit Ethanol ausgefällt. Die Fragmente wurden mit T4 Polynucleotid-Kinase nach den Angaben des Herstellers behandelt. Komplementäre DNA-Stränge wurden miteinander kombiniert, 2 min lang auf 90ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die hybridisierten DNAs wurden durch Agarosegel- Elektrophorese gereinigt zur Entfernung von nicht-hybridisierten Strängen und in Ligationensreaktionen verwendet.
Das Ausgangs-Plasmid war p169, welches das H6-Gen unter λPr-Kontrolle enthielt, das zwischen die Restriktionsstellen BamHI und SalI inseriert worden war (vgl. Fig. 11). Die Änderung von H6 zu ED1 brachte eine Änderung sowohl des N-Terminus als auch des C-Terminus von H6 mit sich, wobei die α-Domäne dazwischen intakt blieb. Zwei aliquote Anteile von p169 wurden mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten. Das erste Aliquot wurde mit EcoRI und BglI digestiert und das kleine Fragment von 150 bP wurde mit einem Gel gereinigt. Das zweite Aliquot von p169 wurde mit BamHI und SalI digestiert. Dadurch wurde das Plasmid in den Vektor und die α-Donor-Genregion zerschnitten. Der Vektor-Abschnitt wurde mit einem Gel gereinigt.
Die neue N-terminale Codierungsregion von ED1 war ein 75 bp DNA-Fragment, das mittels einer Vorrichtung der Firma Applied Bioystem, Inc. synthetisiert wurde (vgl. Fig. 12). Die neue C-terminale Codierungsregion, ein 50 pb DNA-Fragment, wurde ebenfalls synthetisiert (vgl. Fig. 12). Die beiden (2) neuen DNA-Fragmente wurden zu dem kleinen EcoRI-BglI H6 DNA-Fragment ligiert. Diese Mischung wurde mit BamHI und SalI geschnitten, wobei man das neue ED-Gen von etwa 275 bps erhielt. Dieses DNA-Stück wurde Gel-gereinigt und in den Vektor BamHI-SaII DNA-Fragment ligiert.
Nach Bestätigung der ED1-Sequenz wurde dieses Plasmid (p181, vgl. Fig. 13) mit BamHI und EcoRI geschnitten, die den 75 bp ED1 N-Terminus entfernten. Diese Region wurde durch ein neu synthetisiertes Fragment von 30 bps ersetzt (vgl. Fig. 12), das in den BamHI-EcoRI-Zwischenraum eingeführt worden war.
Somit ist das ED3 um 15 Aminosäuren kürzer als das ED1 und weist einen Cystein-Rest in der Nähe seines N-Terminus auf. Das ED1 weist kein Cystein oder Lysin in seiner Sequenz auf. Die Fig. 14 zeigt die Aminosäuresequenz von ED3.

6.1.5 Enzym-Donor 3A

Die Aminosäure-Sequenz des Enzym-Donors 3A (ED3A) ist in Fig. 14 dargestellt. Das Peptid wird auf einem Beckman (Palo Alto, CA) 990B-Peptid-Synthesizer synthetisiert. Syntheseverfahren werden von Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis", 176pp, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, 1984) beschrieben. Die Chemikalien stammen generell von der Firma Aldrich (Milwaukee, WI) u Die BOC-Aminosäuren stammen aus den Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Die Seitenketten-Schutzgruppen sind Boc-Thr (OBzl), Boc-Glu (OBzl), Boc-Ser (OBzl), Boc-Asp (OBzl), Cys (MeOBzl), Boc-Asn/HOBT, Boc-Arg (TOS) und Boc-His (TOS) u Aminomethylpolystyrol-Festphasen-Harzperlen von der Firma Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) werden zu p-Hydroxymethylphenylessigsäure-Boc-Thr (OBzl) mit Dicyclohexylcarbodiimid verestert, wie von Stewart und Young (1984) beschrieben. Der angewendete Synthesemaßstab beträgt 1 mmol Boc-Thr, welches an das Festphasen-Harz gebunden ist, und 3 mmol jeder Boc-Aminosäure.
Der Synthesizer wird dann so programmiert, daß er die Synthese durchführt. Das resultierende Peptid wird mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure von dem Harz abgespalten und mit Essigsäure extrahiert. Nach der Hydrierung wird das Peptid durch präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Waters Phenyl-Säule mit einem 0 bis 80% Acetonitril-Gradienten in Wasser, das 0,1% TFA und 0,1% Thioethan enthält, gereinigt. Das partiell gereinigte Peptid wird in 1 mM NH&sub4;HCO&sub3;, 1 mM 2-Mercaptoethanol erschöpfend dialysiert und lyophilisiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids ist in der Tabelle I angegeben. Tabelle I Aminosäureanalyse von ED3A Aminosäure theoretischer Wert gefundener Wert
Das Molekulargewicht hat den Wert 4942,53, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht einer Aminosäure 114,943 beträgt.
Zusammenfassend ergeben die in Fig. 4 dargestellten Polypeptide geeignete Kupplungs-Seitenketten in variierenden Abständen von der erforderlichen α-Komplementierungs- Sequenz. Die DNA-Sequenzen, welche für die Peptide codieren, die nach Rekombinanten-Verfahren hergestellt worden sind, wurden nach den standard-Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt, wobei die vorhergesagten Strukturen bestätigt wurden. Die Aminosäurezusammensetzung von H6 wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt.

6.1.6 ED Enzym-Donor-Reihen

Eine Reihe von Enzym-Donoren, als ED-Reihen bezeichnet, wurde hergestellt unter Anwendung von rekombinanten DNA-Techniken. ED3 wurde bereits beschrieben in dem Abschnitt 6.1.4. Zu Beispielen für andere Vertreter der Reihen gehören ED4, EDS, ED7, ED8, ED13, ED15 und ED17. Die Aminosäuresequenzen der ED-Reihen von Enzym-Donoren sind in Fig. 15, A-I angegeben.
Das ED4 codierende Gen wurde hergestellt, indem zuerst ein DNA-Fragment auf einem DNA-Synthesizer, Modell 380A, der Firma Applied Biosystems, Inc. (wie im Abschnitt 6.1.4 beschrieben) mit der folgenden Sequenz hergestellt wurde:
Das mit einem Stern markierte "T" repräsentiert eine Änderung gegenüber einem "C". Dieses Fragment wurde an das BamHI-PvuI-Stück aus dem Plasmid p181 (ED1) ligiert (vgl. Fig. 13). Das resultierende Stück wurde wieder in den Vektor (aus ED1-p181) ligiert, aus dem die BamHI-SphI-Region entfernt wurde. Die C → T-Änderung erzeugt einen Cystein (cys)-Rest und zerstört die PvuI-Stelle nach der Ligation (die klebrigen Enden bleiben die gleichen für die Ligation).
Das für EDS codierende Gen wurde hergestellt, indem man zuerst ein DNA-Fragment mit der folgenden Sequenz synthetisierte:
Das mit einem Stern markierte "T" stellt eine Änderung gegenüber einem "C" dar. Das mit einem Doppelstern markierte "T" stellt eine Änderung gegenüber einem "A" dar. Die C → T-Änderung zerstört die PvuII-Stelle. Die A T-Änderung ändert einen Serin-Rest in einen Cystein-Rest. Dieses Fragment wurde an das BamHI-PvuII-Stückund die PvuI-SaII-Stücke aus der Plasmid p182 (ED2 oder M15) DNA ligiert (vgl. Fig. 13). Das ligierte Material wurde mit BamHI und SalI geschnitten und in p182 inseriert, wobei die BamHI-SaII-Region entfernt wurde.
Das für ED7 codierende Gen wurde hergestellt durch Schneiden von p183 (ED3)- und p184 (ED4)-Plasmiden (vgl. Fig. 13) sowohl mit EcoRI als auch mit SalI. Der Vektor aus p183 wurde Gel-gereinigt zur wirksamen Entfernung der EcoRI-SalI (α)-Region. Im Gegensatz dazu wurde die kleine EcoRI-SaII (α)-Region aus p184 Gel-gereinigt. Die p184 EcoRI-SalI-Region wurde dann inseriert in und ligiert in den p183 EcoRI-SalI-Vektor.
Das für ED8 codierende. Gen wurde hergestellt unter Verwendung der spezifischen Stellen-Mutagenese in der M13 mp11 Phagen-DNA. Es wurde ein Starter (Primer) hergestellt (Sequenz GGT AAC GCA AGG GRT TTC CCA GTC). Dieser Starter war komplementär zu dem codierenden Strang der α-Region, die für die Aminosäuren 15-22 codiert. Die gewünschte Änderung war die Änderung G → T in dem Codon 20, die ein Gly in ein Cys änderte bei der Aminosäure 20 in der α-Region der M13 mp11 DNA. Dies wurde erzielt durch Hybridisierung des Starters zu einer Einzelstrang-M13 mp11 Phagen-DNA und Extendieren (Verlängern) des Starters unter Verwendung des DNA-Polymerase I-"Klenow Fragments" und von T4 DNA-Ligase über Nacht bei Raumtemperatur. Diese DNA wurde mit S1-Nuclease behandelt, um die nicht-doppelsträngige DNA zu eliminieren, und dann in JN103-Zellen tranformiert. Der Phage aus dieser Transformation wurde isoliert; die DNA wurde gereinigt und die Starter-Extension und die Transformation wurden insgesamt dreimal wiederholt. Bei jeder Wiederholung wurde das gewünschte Produkt angereichert. Schließlich wurde eine Mini-Präp-Analyse bei der M13 RF-DNA aus individuellen Plaques durchgeführt. Durch die gewünschte Basenänderung wurde die BstNI-Stelle eliminiert. Durch Restriktionsanalyse der Mini-Prep-DNA mit BstNI wurden die Kandidaten identifiziert. Aus der doppelsträngigen M13 RF-DNA, welche die gewünschte Änderung trug, wurde ein BamHI-BglI-Stück herausgeschnitten und ausgetauscht gegen ein BamHI-BglI-Stück in dem für ED2 Codierenden Plasmid.
Das für ED13 codierende Gen (p193, vgl. Fig. 16) wurde hergestellt, indem man zuerst ein DNA-Fragment der nachstehend angegebenen Sequenz (wie oben) synthetisierte:
Zur Herstellung von ED3 wurde dieses synthetisierte Fragment in p182 (ED2) wie im Abschnitt 6.1.4 beschrieben eingesetzt.
Das für ED14 codierende Gen (p194, vgl. Fig. 16) wurde hergestellt, indem man zuerst (wie oben) ein DNA- Fragment mit der folgenden Sequenz synthetisierte:
Dieses synthetisierte Fragment wurde nach der gleichen Strategie, wie sie für ED4 angewendet worden war, hergestellt, wobei jedoch ein Lysin-Rest anstelle einer Cystein-Substitution erhalten wurde.
Das für ED15 codierende Gen (p195, vgl. Fig. 16) wurde hergestellt, indem man zuerst (wie oben) ein DNA- Fragment mit der folgenden Sequenz synthetisierte:
Dieses Fragment wurde auf die gleiche Weise, wie sie zur Herstellung von ED5 angewendet worden war, in p182 (ED2 oder M15) inseriert.
Das für ED17 codierende Gen (p197, vgl. Fig. 16) ist eine Kombination der ED13- und ED14-Gene, die auf die gleiche Weise wie das für ED7 codierende Gen hergestellt wurde.
Nachstehend sind die Enzym-Akzeptoren aufgezählt, die bei den Enzym-Donoren der ED-Reihen verwendet werden könnnen:
* Andere Enzym-Akzeptoren wurden nicht getestet.
Aus den-obengenannten Enzym-Donor- und Enzym-Akzeptor-Paaren stellt die Kombination aus EDS und EA22 das am meisten bevorzugte Paar für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Komplementations-Assays dar.

6. 2 Enzym-Akzeptoren

Bei einer Gruppe von Experimenten wurde eine Reihe von in Phase-Sequenz-Deletionen des β-Galactosidase-Gens konstruiert zur Herstellung einer Reihe von Enzym-Akzeptoren nach den im obigen Abschnitt 6.1 beschriebenen Verfahren. pUC13 wurde mit PvuII digestiert (unter Bildung eines glatten Endes) und an einen synthetischen 8 bp DNA-Linker, der eine XhoI-Restriktionsstelle enthielt, ligiert zur Erzeugung eines neuen Plasmids pUC13X.
Die die XhoI-Restriktionsstelle enthaltende α-Region wurde dann in dem gesamten lacZ-Gen ersetzt, das native β- Galactosidase codiert, ohne den Rest des lacZ-Gens oder das Hintergrund-Plasmid zu unterbrechen. Das Z-Gen enthält zwei BglI-Stellen. Die erste dieser BglI-Stellen ist innerhalb der u-Region in pUC13 stromabwärts von der PvuII- Stelle enthalten, wo der XhoI-Linker inseriert wurde. Die u-Region wurde aus pUC13X entfernt aus dem Rest des Plasmids durch Digestieren mit BamHI und BglI und der 170 bp- Fragmente, als BlX bezeichnet.
Der Rest des lacZ-Gens, der β-Galactosidase codiert, wurde aus dem Plasmid pβga12 erhalten (Queen, 1983, "J. Mol. Appl. Genet." 2 : 1). Dieses Plasmid wurde mit BglI und EcoRI digestiert und die beiden DNA-Fragmente, die 93% des Z-Gens darstellen, wurden isoliert. Die Enden jedes Fragments waren von irgendwelchen anderen Enden, die bei dieser Konstruktion verwendet wurden, verschieden. Die isolierten Fragmente waren 2115 bp (nachstehend als B2 bezeichnet) und 737 bp (nachstehend als B3 bezeichnet). Die EcoRI-Restriktionsstelle in dem Z-Gen liegt in der Nähe des C-terminalen Endes des Gens. Dieser Terminus muß vorhanden sein, wenn das eine XhoI-Stelle enthaltende Z-Gen hergestellt wird.
Das Mutanten-Z-Gen wurde in pF29 inseriert. Das Plasmid pF29 enthält eine an das C-terminale Ende des Z-Gens an der EcoRI-Stelle fusionierte Z-Gen-α-Region. Diese α- Region wird kontrolliert (gesteuert) durch den an einer BamHI-Stelle inserierten λPr-Promotor. Zur Herstellung von pF29 wurden zwei dazwischenliegende Plasmide pF15 und pF16 hergestellt. pβga12 wurde mit AvaI digestiert und das kohäsive 3'-Ende wurde gefüllt unter Verwendung des Klenow-Fragments und der vier dNTPs zur Erzeugung von glatten Enden. Ein SalI-Linker (GGTCGACC) (New England BioLabs, Beverly, MA) wurde an das linearisierte Plasmid ligiert unter Verwendung von T4 DNA-Ligase. Die resultierende DNA wurde mit EcoRI und SalI digestiert und ein 300 bp DNA- Fragment, welches das ω-Ende des β-Galactosidase-Z-Gens darstellt, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Diese ω-Region wurde unter der Kontrolle von λPr wie nachstehend angegeben an eine α-Region fusioniert. pUC12 DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) wurde mit BglI digestiert und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment und den vier dNTPs wurden glatte Enden erzeugt. EcoRI-Linker (GGAATTCC) (New England BioLabs, Beverly, MA) wurden an die glatten Enden ligiert mit T4 DNA- Ligase. Die DNA wurde mit BamHI und EcoRI digestiert und ein 180 bp-Fragment, welches die α-Region des Z-Gens repräsentiert, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der zur Aufnahme der α- und ω-Gen-Fragmente verwendete Vektor war pβga12, digestiert mit BamHI und SalI und er wurde gereinigt durch Agarosegel-Elektrophorese zur Entfernung der lac-Operon-Sequenzen. Der Vektor, die Q- Gen- und ω-Gen-Fragmente wurden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase miteinander ligiert. Die singulären Enden der DNA-Fragmente legen die Reihenfolge fest, in der diese Fragmente geklont werden. Das Produkt-Plasmid wurde als pF15 bezeichnet.
pF15 wurde weiter modifiziert durch Umwandlung der singulären PvuII-Stelle in die Vektor SalI-Stelle unter Verwendung von SalI-Linkern, die an die glatten Enden ligiert waren, die erzeugt wurden durch Digestieren von pF15 mit PvuII. Dieses modifizierte pF15 wurde dann mit BamHI und SalI digestiert und das größte DNA-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, wodurch die α-ω-Gen-Sequenz und ein DNA-Fragment, das zwischen der SalI- Stelle und der PvuII-Stelle angeordnet war, entfernt wurde. Das nicht-modifizierte pF15 wurde ebenfalls mit BamHI und SalI digestiert und das α-ω-Fragment wurde gereinigt. Wenn das große Fragment aus dem modifizierten pF15 an das α-ω-Fragment ligiert wurde, wurde das Plasmid pF16 erzeugt.
pF16 ist um etwa 1350 Basenpaare kleiner als pF15 und hat die Wirkung, eine singuläre NdeI-Stelle zu entfernen, die viel näher bei der SalI-Stelle angeordnet ist. Durch dieses Manöver wird verhindert, daß unnötige DNA-Sequenzen durch die nachfolgenden Konstruktionen mitgeschleppt werden.
Zur Herstellung von pF29 wurde pF16 mit ClaI und NdeI digestiert und das 1400 bp-DNA-Fragment, das λCI, λPr und die α- und ω-Regionen von β-Galactosidase codiert, wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das pUC13 wurde mit AccI und NdeI digestiert und der Vektor wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Da die AccI- und ClaI-Restriktionsstellen identische kohäsive Enden haben und die NdeI-Restriktionsstellen gemeinsame identische Termini aufweisen, kann die Ligation des DNA-Inserts aus pF16 und dem pUC13-Vektor nur in einer Orientierung erfolgen. Die Ligation mit T4 DNA-Ligase ergab pF29. pF29 enthält eine EcoRI-Stelle und keine CIaI-Stellen, was erwünscht war, da eine zweite EcoRI-Stelle und die ClaI- Stelle die Herstellung von modifizierten Plasmiden gestört hätte (z. B. p149 und die nachfolgende Analyse der Deletions-Mutanten, erzeugt aus p150, wie nachstehend beschrieben).
pF29 wurde mit BamHI und EcoRI digestiert, der störende α-Donor wurde entfernt und dieser Vektor wurde unter Verwendung von BlX plus B2 plus B3 eingefüllt (B1X+B2+B3). Das singuläre Einzelstrang-Ende jedes Stückes definiert die Reihenfolge, in der die Stücke miteinander ligiert werden können. B1X, B2 und B3 wurden in den mit BamHI und EcoRI wie vorstehend beschrieben digestierten pF29-Vektor ligiert zur Wiederherstellung eines Z-Gens mit einem XhoI- Linker mit bp 102, der die Aminosäure 34 codiert unter Pr-Kontrolle. Das resultierende Plasmid wurde mit p149 bezeichnet.
Zur Erzeugung eines Verfahrens für die Anreichung (Screening) für die Herstellung von lebensfähigen Enzym- Akzeptoren und das nachfolgende Digestieren mit XhoI und Bal31-Digestion wurde ein getrennter α-Donor ohne die XhoI-Stelle in p149 inseriert. Ein FnuDII-Digestionsfragment aus pUC13, das den lacZ-Operator, einen Promotor und einen α-Donor enthält, wurde in die SalI-Stelle von p149 inseriert, das mit dem Klenow-Fragment gefüllt worden war. Das resultierende Plasmid wurde als p150 bezeichnet. Es wurden Deletionen erzeugt durch Digestieren von p150 mit XhoI und anschließendes Digestieren der DNA mit Bal31-Exonuclease. Nach der Bal31-Behandlung wurde das Plasmid mit T4 DNA-Ligase ligiert und in AMA1004-Wirtszellen transformiert (AMA1004 steht für galU, galK, strAr, hsdR&supmin;, leuB6, trpC 9830, Δ(lacIPOZ) C29 (Casadaban et al., 1983, "Methods in Enzymology", 100 : 293) und auf Luria-Bertani- Platten angereichert, die das Induktionsmittel Isopropylthiogalactosid (IPTG) und das chromogene Substrat 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (Xgal, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielten. Kolonien, die bei 30ºC weiß waren, jedoch bei 42ºC blau wurden, zeigten die Bildung von lebensfähigen Enzym-Akzeptoren an. Es wurden Kolonien ausgewählt und Plasmid-DNAs hergestellt. Dies Plasmid DNAs wurden mit SalI digestiert zur Entfernung des α-Donors, religiert und in AMA1004-Wirtszellen transformiert. Die Sequenz-Deletionen wurden durch Maxam und Gilbert-Sequenzierung bestätigt und die Enzym-Akzeptor-Proteine wurden wie im Abschnitt 7.1 beschrieben gereinigt. Die resultierenden Stämme sind in der Fig. 5 dargestellt.
Es wurden Enzym-Akzeptoren hergestellt unter Anwendung von DNA-Synthese-Techniken. Zum Beispiel wurde ein Enzym-Akzeptor 1 (EA1) aus p149 hergestellt, wobei diesmal jedoch die a-Region, die den XhoI-Linker enthielt, durch die folgenden synthetisierten DNA-Fragmente (5' → 3') ersetzt wurde:
(1) CAA GAG TTG CGC AGC CTG AA
(2) AGG CTG CGC AAC TGT TGG GAA GGG CGA TCG
(3) ACC CAA CTT AAT ACC CAT CGC CCT TCC
(4) GTA TAA AGT TGG GTA ACG CCA GGG CCT TCC CA
(5) CAA CGT CGT GAC TGG GAA GGC CCT GGC GTT
(6) GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC GAG TGA ATT CGA GCT CGC CCG GG
(7) GAT CCC CGG GCG AGC TCG AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA
Diese Fragmente codieren eine in Phase-Deletion der Aminosäuren 26 bis 43 des lac Z-Gens und tragen klebrige BamHI und BglI-Enden. Diese Fragmente wurden hybridisiert, durch Gel-Elektrophorese gereinigt, mit BamHI behandelt und an B2 plus B3 und den pF29-Vektor ligiert. Eine positive Kolonie wurde selektiert und durch DNA-Sequenz-Analyse bestätigt.

6.2. 1 Vergleich des Komplementations-Wirkungsgrades

Um den Komplementations-Wirkungsgrad der wie im Abschnitt 6.2 beschrieben hergestellten Enzym-Akzeptoren zu bestimmen, wurden repräsentative Enzym-Akzeptor-Präparatate unter Verwendung von H6 als Enzym-Donor miteinander verglichen.
Es wurde eine Mikrotiter-Platte verwendet, die umfaßte ein Gesamtvolumen von 200 ul PM2-Puffer (0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0, 1 mM MgSO&sub4;, 0,18 mM MnSO&sub4;, 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20), das 2,5 · 10&supmin;&sup8; M des geeigneten Enzym-Akzeptor-Präparats und 1,25 mg/ml O-Ni trophenol-β-D-galactopyranosid-Substrat enthielt. Es wurde eine Reihe von H6-Verdünnungen (1 : 20; 1 : 40; 1 : 80) zugegeben, um die Komplementation zu initiieren. Die optische Dichte (414 nm) wurde nach 30- und 45-minütiger Inkubation bei 37ºC gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II dargestellt. Tabelle II A. OD&sub4;&sub1;&sub4; nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC Verdünnung
Wie in Tabelle I gezeigt, variierte der Komplementations-Wirkungsgrad der verschiedenen Enzym-Akzeptoren beträchtlich. Die relativen Komplementations-Wirkungsgrade betrugen EA14 = EA22 > EA20 > EA24 > EA23.

7. Beispiel: Enzym-Immunoassay für Thyroxin

Dieses Beispiel erläutert einen Immunoassay für Thyroxin unter Verwendung eines für Thyroxin spezifischen Antikörpers als Analyt-Bindungs-Protein. Bei dem verwendeten Enzym-Donor-Antigen handelt es sich um ED4 und bei dem Enzym-Akzeptor handelt es sich um EA22.

7.1 Herstellung eines Enzym-Akzeptors

Die Deletions-Mutanten-Polypeptide von β-Galactosidase wurden hergestellt durch Züchten des gewünschten Enzym-Akzeptor-Stammes in TY-Brühe (1 l enthält 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose, pH 7,5). Bei 42ºC wurden Zellen gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit einem Breaking-Puffer (BB) gewaschen (0,2 M Tris® -HCl pH 7,6, 0,2 M NaCl, 0,01 M Mg-Acetat, 0,01 M 2-Mercaptoethanol, 5% Glycerin), dann durch Zentrifugieren pelletisiert und eingefroren.
Zellen-Pellets (15 g) wurden in 40 ml BB suspendiert. Lysozym (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) wurde zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 0,20 mg/ml und die Suspension wurde 30 min lang auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension in einem Alkoholbad von -70ºC eingefroren und schnell aufgetaut in einem Wasserbad von 37ºC. Sorgfältig wurde die Temperatur der Auftau-Suspension unter 4ºC gehalten. Die Viskosität des Lysats wurde durch Ultraschallbehandlung mit einem Virsonic-Zellen-Disruptor (Modell 16-850 der Firma Virtis Co., Gardiner, NY) herabgesetzt. Es wurde Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF der Firma Sigma Chemical) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben und unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren entfernt (16 000 · g, 30 min). Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde langsam ein Zehntel des Volumens einer 30%igen Streptomycinsulfat-Lösung zugegeben. Nach 15 min auf Eis wurden die ausgefallenen Nucleinsäuren durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 16 000 · g entfernt. Das geklärte Lysat wurde auf eine 40%ige Sättigung mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gebracht durch langsame Zugabe eines gleichen Volumens einer 80%igen gesättigten Lösung. Nach 2-stündigem Rühren bei 4ºC wurde das ausgefallene Material durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 16000 · g gesammelt.
Das Pellet wurde in BB wieder aufgelöst und gegen 1000 Volumenteile 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,2, 50 mM NaCl, 1 mM MgSO&sub4;, 10 mM 2-Mercaptoethanol in Wasser dialysiert, wobei nach 6 h eine Änderung auftrat. Der dialysierte Enzym-Akzeptor-Extrakt wurde auf eine 2,5 · 6 cm-Säule von p-Aminophenyl-1-thio-β-D-galactopyranosid aufgegeben, das kovalent an Agarose gebunden war, in dem gleichen Puffer. Die Säule wurde gewaschen, zuerst mit 0,1 M NaPO&sub4;, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, dann mit 0,1 M NaPO&sub4;, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol und schließlich mit 0,1 M NaPO&sub4;, pH 7,2, 50 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol und schließlich mit 0,1 M NaPO&sub4;&sub1; pH 7,2, 50 mM Na-Borat, pH 9,0, 10 mM 2-Mercaptoethanol in einem gleichen Volumen von 2,5 M Tris® HCl, pH 7,0. Alle Kolonnen-Arbeitsgänge wurden bei 4ºC durchgeführt.
Der eluierte Enzym-Akzeptor wurde sofort intensiv dialysiert gegen 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,2, 70 mM NaCl, 1 mM MgSO (MgSO&sub4;) und 10 mM 2-Mercaptoethanol. Nach der Dialyse wurde Glycerin bis zu einer Menge von 10% zugegeben und der Extrakt wurde bei -20ºC aufbewahrt. Diese Präparate ergaben eine einzelne Bande in dem diskontinuierlichen Polyacrylamidgel-System nach Laemmli (Laemmli, 1970, "Nature" 227 : 690).

7.2 Herstellung von Enzym-Donoren

Die weiter oben beschriebenen verschiedenen Enzym-Donor-Polypeptide konnten aus den Wirts-Zellen nicht direkt gereinigt werden. So waren beispielsweise die Gehalte an diesen Polypeptiden in dem E. coli-Stamm AMA1004 insignifikant. Wenn dagegen die Plasmide, die für die komplementierenden Peptide codieren, in den Stamm E9001 transferiert wurden (Δlac-pro, thi, supE, F' proAB, lacIQ, Z M15, auch als 71.18 bezeichnet; Messing et al., 1977, "Pro. Natl. Acad. Sci." USA 75 : 3642-3646), wurde durch in vivo-Komplementation aktive β-Galactosidase gebildet. Die β-Galactosidase wurde gereinigt und die komplementierenden Peptide wurden durch Denaturierung des Enzym-Komplexes mit 6 M Harnstoff zurückgewonnen.
In Luria-Bertani-Medien, ergänzt mit 0,1% Glucose, 50 ug/ml Ampicillin und 0,3 mM IPTG, wurden 16 h lang bei 42ºC Zellen gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet. Alle nachfolgenden Stufen wurden, wenn nichts anders angegeben ist, bei 4ºC durchgeführt.
Etwa 40 g Zellen aus einem Gesamtkulturvolumen von 12 L wurden in 80 ml eines Puffers A (50 mM Tris®, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol) wieder suspendiert. Es wurde Lysozym (Sigma Chemical, St. Louis, MO) bis zu einer Endkonzentration von 0,20 mg/ml zugegeben und die Suspension wurde in einem Alkoholbad von -70ºC eingefroren und in einem Wasserbad von 37ºC schnell aufgetaut. Vorsichtig wurde die Temperatur der Auftaususpension unter 4ºC gehalten. Die Viskosität des Lysats wurde durch Ultraschallbehandlung mit einem Versonic-Zellendisruptor (Modell 16-850) herabgesetzt. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Chemical) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben und unlösliches Material wurde durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 16 000 · g entfernt. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde ein Zehntel Volumenteil einer 30%igen Streptomycinsulfat-Lösung zugegeben. Nach 15 min auf Eis wurden die ausgefallenen Nucleinsäuren durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 16 000 · g entfernt. Das geklärte Lysat wurde auf eine 40%ige Sättigung mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gebracht durch langsame Zugabe eines gleichen Volumens einer 80%igen gesättigten Lösung. Nach 2-stündigem Rühren bei 4ºC wurde das ausgefallene Material durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 16 000 · g gesammelt. Das Pellet wurde in einem minimalen Volumen eines Puffers B (40 mM Tris®, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol) gelöst und über Nacht gegen 200 Volumenteile des gleichen Puffers dialysiert.
Die dialysierte Lösung wurde auf eine 2,5 cm · 20 cm große Säule, gefüllt mit 30 ml DEAD-Cellulose (Whatman DE- 52), die mit dem Puffer B äquilibriert war, aufgegeben. Die Säule wurde mit 150 ml Puffer B gewaschen, um das nicht-absorbierte Material zu entfernen. Das Enzym wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert: 0,01 bis 0,50 M NaCl in 40 mM Tris®, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2- Mercatpethanol. Das Volumen jeder Pufferkomponente betrug 75 ml und die Strömungsrate betrug 0,50 ml/min. Die Fraktionen wurden auf die Enzym-Aktivität hin untersucht wie beschrieben. Die Spitzen-Aktivität trat bei etwa 0,3 M NaCl auf. Die Fraktionen, die eine Enzym-Aktivität aufwiesen, wurden gesammelt und das Ganze wurde auf eine 40%ige Sättigung mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gebracht. Nach 2-stündigem Rühren wurde das ausgefallene Material durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 12 000 · g gesammelt. Das Pellet wurde in einem minimalen Volumen des Puffers B gelöst, dann aufgegeben auf eine 1,0 · 120 cm-Säule, gefüllt mit Bio-Gel A-1,5 m (Bettvolumen 86 ml, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Die Säule wurde mit dem Puffer B mit einer Rate von 0,10 ml/min entwickelt. Die Fraktionen wurden auf ihre Enzym- Aktivität hin untersucht und die Fraktionen, die eine Peak-Aaktivität aufwiesen, wurden gesammelt. Es wurde langsam ein gleiches Volumen einer zu 100% gesättigten (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung zugegeben. Nach 2 h auf Eis wurde das ausgefallene Material durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 12 000 · g gesammelt.
Das Pellet wurde in einem minimalen Volumen von 50 mM KH&sub2;PO&sub4;&sub1; pH 7,3, 1 mM EDTA gelöst. Pro ml Lösung wurden 0,496 g fester, elektrophoretisch reiner Harnstoff (Bio- Rad, Richmond, CA) langsam zugegeben, um die End-Harnstoffkonzentration des Pools auf 6,0 M zu bringen. Der Pool wurde 5 min lang nach der Zugabe des Substrats auf Eis gehalten, bis keine Enzym-Aktivität sichtbar war. Der denaturierte Enzym-Pool wurde dann auf eine 1,0 · 120 cm- Säule, gefüllt mit Sephadex G-75 (Bettvolumen 84 ml, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) aufgegeben. Die Säule wurde mit 6,0 M Harnstoff, 50 mM Tris®, pH 7,6, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA bei einer Strömungsrate von 0,10 ml/min entwickelt. Die Fraktionen wurden untersucht zur Bestimmung der Komplementations-Aktivität mit M15. Die eine Komplementations-Aktivität aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt. Der Fraktions-Pool wurde dreimal gegen 4 l 1 mM NH&sub4;HCO&sub3; dialysiert und lyophilisiert.

7. 3 Thyroxin-Immunoassay

Das Enzym-Donor-Konjugat von m-Maleimid-benzoyl-L- thyroxin-H6 wurde wie folgt hergestellt: L-Thyroxin wurde als freie Säure (680 mg) mit wasserfreiem Methylalkohol (6,0 ml) überschichtet und die Lösung wurde mit einem starken Strom von trockenem Chlorwasserstoff gesättigt. Nach dem Abkühlen wurde das Sättigungsverfahren wiederholt und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende kristalline Niederschlag wurde abfiltriert, mit absolutem Ethylalkohol, dann mit Diethyläther gewaschen und schließlich getrocknet. Das getrocknete Thyroxinmethylesterhydrochlorid wurde in 50%igem wäßrigen Ethylalkohol gelöst und die Lösung wurde mit 2 N Natriumhydroxid (1 Äquivalent) behandelt. Es entstand sofort ein reichhaltiger weißer Niederschlag und es wurde zusätzliches Wasser zugegeben, um die Fällung zu vervollständigen. Nach dem Stehenlassen des ausgefallenen L-Thyroxinmethylesters als freie Base in der Kälte für 1 h wurde das Produkt durch Zentrifugieren abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Der L-Thyroxinmethylester in Form der freien Base (10 mg) und m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester (MBSE) (5 mg) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wurden in 1,0 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, dann wurden 10 mg wasserfreies gepulvertes Natriumcarbonat zugegeben. Die Mischung wurde 30 min lang unter Rückfluß erhitzt. Die Überprüfung der Reaktionsmischung durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Silicagel G, bei der Siα 250F TLC-Platten von 50 · 20 cm (Baker, Phillipsburg, NJ), enthaltend einen fluoreszierenden Indikator und Ethylacetat als Lösungsmittelsystem, verwendet wurden, zeigte, daß die Reaktion zu etwa 70% beendet war. Das Produkt von L-Thyroxinmethylester als freie Base und MBSE, m-Maleimid-benzoyl-L- thyroxin (MBTM), wurde unter Verwendung einer Silicagel- Säule gereinigt, wobei Chloroform : Methanol-Mischungen als Eluierungslösungsmittel verwendet wurden. Das isolierte blaßgelbe Pulver aus MBTM war zu etwa 80% rein, wie durch TLC bestimmt wurde, und wies einen Rf-Wert auf, der vollständig verschieden war sowohl von MBSE als auch von L-Thyroxinmethylester. Das MBTM ergab die charakteristische orange Farbe für Thyroxin bei der Bestrahlung mit kurzwelligem UV-Licht auf Silicagel G, das einen fluoreszierenden Indikator enthielt, war gegenüber Ninhydrin negativ und die Anwesenheit der Maleiimid-Gruppe bestätigte seine Fähigkeit, mit Cysteinen zu reagieren unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (Sigma Chemical, St. Louis, MO).
Das H6 Enzym-Donor-Polypeptid (10 ug) wurde in 0,15 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, gelöst. Zu der obengenannten gerührten Lösung wurden zwei 5 ul-Aliquote m-Maleimiddibenzoyl-L-thyroxinmethylester mit 0,3 mg in 1,0 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung auf einer Bio-Gel P-2-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) von 0,6 · 16,0 cm gereinigt, mit einem 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 9,0, eluiert. Dann wurden 10 Tropfen-Fraktionen gesammelt. Aliquote jeder Fraktion wurden untersucht zur Bestimmung der Komplementationsaktivität in Gegenwart des EA23-Dimers und von O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid. Die Fraktionen 10 und 11 enthielten die höchste Komplementations-Aktivität und wurden gesammelt.
Dieses Beispiel erläutert einen Immunoassay für Thyroxin als Analyt unter Verwendung des H&sub6;-Thyroxin-Konjugats als Enzym-Donor, von EA23 als Enzym-Akzeptor und eines Anti-Thyroxin-Antikörpers und einer Reihe von Konzentrationen von Thyroxin.
Die Reagentien für den Assay wurden wie folgt hergestellt:
L-Thyroxin-Standard: 2,6 mg L-Thyroxin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurden in 200 ul absolutem Ethanol gelöst. Dann wurden 800 ul 0,15 M NaHCO&sub3; zugegeben und die Mischung wurde bei 25ºC gelagert. Es wurden Zweifach-Verdünnungen von Thyroxin in Ethanol hergestellt: 0,15 M NaHCO&sub3; (1 : 4).
L-Thyroxin-Antikörper: Antiseren gegen Thyroxin (T4) wurden von der Firma Western Chemical Research Corp., Denver, CO, gekauft. Mehrere Proben wurden auf ihren Titer und eine Gleichgewichtskonstante in einem Radioimmunoassay mit IgM Sorb (Enzyme Center, Malden, MA) getestet. Die Proben variierten in bezug auf den Titer von 1 : 100 bis 1 : 8000. Die Gleichgewichtskonstanten variierten von 4,5 · 108 L/M bis 1 · 1010 L/M. Es wurde eine Probe Nr. A420, Titer 1 : 8000 (Zero-Bindung = 67%) und Keq = 2 1010 L/M verwendet.
EA23 Akzeptor-Enzym: 6,3 · 10&supmin;&sup7; M in dem Lagerungspuffer. Substrat: O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosit (ONPG) wurde in 2,5 · Z-Puffer gelöst bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml Lösung.
Der Assay wurde in Mikrotiter-Platten (Dynatech Cat #001-012-9200 American Scientific Products, Sunnyvale, CA) durchgeführt und abgelesen auf einer Titertak Multiscan Mikrotiter-Platten-Skala, die mit einem 414 nm-Filter (Flow Laboratories, Rockville, MD) ausgestattet war. In jede Vertiefung wurden 100 ul PM2-Puffer gegeben, der 0,05 % Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. In jede Vertiefung wurden nacheinander 2,5 ul H5-Thyroxin-Konjugat, 2,5 ul Antithyroxin-Antikörper, 2,5 ul der Thyroxin-Standards und 40 ul EA23 gegeben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III dargestellt. Tabelle III Enzym-Immunoassay für Thyroxin Vertiefung Antikörper Thyroxin
(a) H6-T4 bezeichnet das m-Maleimid-Benzoyl-L-thyroxin- H6-Konjugat
(b) EA23 bezeichnet das Enzym-Akzeptor-Polypeptid (vgl. Fig. 5)
8. Beispiel: Hepatitis B-Virus-Oberflächenantiqen-Assay Dieses Beispiel erläutert einen Immunoassay zur Bestimmung des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens (HBV- SAg) unter Verwendung von N-terminalen oder C-terminalen Fusionsproteinen als Enzym-Donoren.

8.1 N-terminale Fusion

Das Plasmid pBR322, welches das gesamte Genom von HBV, inseriert in die singuläre EcoRI-Stelle enthielt, wurde mit HincII geschnitten. Das Fragment B (Sninskey et al., 1979, supra) wurde in die singuläre HincII-Stelle von pUC13 kloniert (Messing, 1983, supra). Aus diesem Klon wurde ein BamHI-AhaIII-Fragment, das den größten Teil des HBV-Sag-Gens enthielt, in puC13 inseriert, das mit BamHI und SmaI digestiert worden war. Dieses rekombinante DNA- Plasmid 122 wurde in den JM83-Stamm von E. coli transformiert und es wurden hellblaue Kolonien, die eine in vivo- Komplementation durch einen HBV-SAg-Enzym-Donor anzeigen, auf Xgal-Platten selektiert. Dieser Klon MG122 enthielt, wie durch Cross-Reaktion in dem Abbott Auszyme II (1)-Test (Abbott Laboratories, Chicago, IL) gefunden wurde, HBV- SAg. Diese HBV-SAg-α-Donor-Fusion kann auf einen anderen Expressionsvektor übertragen werden zur Bildung von großen Mengen an Fusionsprodukt.

8.2 C-terminale Fusion

So konnte beispielsweise das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBV-SAg) an dem Carboxy-Terminus eines Enzym-Donor-Polypeptids geklont werden. Eine Versuchsanordnung, die angewendet werden kann, wird nachstehend kurz als erläuterndes Beispiel angegeben.
Ein 1,2 kb FnuDII-Fragment wird aus einem Klon des gesamten HBV-Genoms isoliert und in pBR322 inseriert. Ein PvuI-Partial-Digest von p125, das mit S1-Nuclease und Kalbsintestinal-Phosphatase behandelt worden ist, wird dann einer Agarosegel-Reinigung unterzogen, um lineare Moleküle in voller Länge zu isolieren. Nach der Ligation des FnuDII-Fragments an die lineare DNA von p125 wird die DNA in ein E. coli transformiert (z. B. in JM83). Ampicillinresistente Kolonien, die auf Xgal-Platten bei 30ºC weiß und bei 42ºC blau sind, werden dann selektiert und angereichert zur Herstellung auf HBV-SAg (z. B. durch den Abbott Auszyme II-Test). Die Fusionsproteine werden dann durch Standard-Ionenaustausch- und Affinitäts-Säulen-Verfahren zur Bestimmung der Komplementation gereinigt.

8.3 Enzym-Immunoassay für HBV-SAg

Ein Immunoassay zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von HBV-Sag in einer Probe kann entwickelt werden durch Konkurrierenlassen von unbekanntem HBV-SAg in der interessierenden Probe mit einem α-HBV-SAg-Fusionsprotein um einen homologen Antikörper. Die Menge an freiem α-HBV- SAg-Protein, die für die Komplementation von EA23 bildender aktiver β-Galactosidase zur Verfügung steht, ist umgekehrt proportional zur bestimmten Menge des unbekannten freien HBV-SAg.

9. Beispiel: Hepatitis B-Virus-Kernantigen-Assay

Zur Herstellung von zwei großen DNA-Fragmenten wurde die Hepatitis B-Virus (HBV)-Genom-DNA mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI geschnitten. Eines dieser großen Fragmente trägt das Kerngen, welches das Kern-Antigen codiert (HBV-CAg). Dieses Fragment wurde in die multiple Klonungs-Stelle der M13 mp10 RF DNA inseriert. Nach dem Selektieren und Screening für einen M13-Phagen, der dieses HBV-Insert trägt, wurde ein kleines Phagen-Präparat gereinigt. Die einzelsträngige DNA, die den (-)-Polaritäts-Strang (entgegengesetzte Polarität zur Messenger-RNA) des Kern-Gens trägt, wurde aus dem Phagen isoliert.
Wie die meisten Gene beginnt das Kerngen mit einem ATG-Codon. Da der Expressionsvektor, in dem das Kerngen geklont wurde, bereits einen ATG-Codon lieferte, war es erforderlich, ein DNA-Fragment zu erhalten, das bei dem zweiten Kern-Codon begann. Dies wurde erzielt durch Synthetisieren eines 12-Basenpaar-Einzelstrang-Oligomers, welches den (+)-Strang (mit der gleichen Polarität wie die Messenger-RNA) der Codons 2-5 des Kern-Gens (GACATTGACCCT) darstellt. Dieses Oligomer wurde zu der einzelsträngigen M13 Phagen-DNA hybridisiert und in vitro durch die E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) erweitert. Dieses Prä- - parat wurde mit HincII digestiert, das die HBV-DNA außerhalb des Kerngens 3' zu dem Translations-Terminations-Codon schnitt. Danach wurde Nuclease S1 verwendet zum Digestieren der einzelsträngigen DNA in 5'-Stellung zu dem zweiten Codon des Kerngens. Dieses schneidet ein 686 Basenpaar-Fragment und viele kleinere doppelsträngige Fragmente verschiedener Längen ab. Das 686 Basenpaar-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der verwendete Plasmid-Expressionsvektor trug einen λPr-Promotor und einen ATG-Start-Codon benachbart zu einer BamHI-Restriktion. Der Vektor wurde mit BamHI digestiert und mit Nuclease S1 behandelt, um daraus einen Vektor mit glatten Enden zu machen.
Der Expressionsvektor mit glatten Enden und das Kerngen-Fragment wurden dann miteinander ligiert unter Verwendung von T4 DNA-Ligase und in geeignete Bakterien transformiert. Die resultierenden Kolonien wurden einem Screening unterworfen und ein Plasmid wurde identifiziert, welches das in der richtigen Orientierung inserierte Kerngen trug. Die Kolonien wurden getestet zur Bestimmung der Anwesenheit des Kernantigen-Proteins in dem Zell-Lysat unter Anwendung des Abbott Core Antigen ELISA-Tests (Abbott Laboratories). Ein stark immunoreaktiver positiver Klon, als MG152 bezeichnet, der das Plasmid p152 enthielt, wurde selektiert und die DNA-Sequenz wurde durch Maxim und Gilbert-DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Kernantigen wurde gereinigt und zur Wiederherstellung des Antikörpers verwendet.
Da keine der Restriktionsstellen an dem Amino-terminalen Ende der α-Region von pF29 kompatibel war für die Fusion des Kerngens mit der α-Region, war es erforderlich, ein zweites Plasmid mit anderen Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungs-Region an dem Amino-terminalen Ende des α-Gens herzustellen. pUC13 wurde mit EcoRI digestiert und die kohäsiven Enden wurden mit dem großen DNA-Polymerase-Fragment (Klenow-Fragment) plus allen vier dNTPs gefüllt. Eine PvuII 8 bp (GCAGCTGC)-Linker-DNA wurde in diese Stelle ligiert. Dieses modifizierte Plasmid wurde mit BamHI und PvuII digestiert und der N-Terminus des α- Stückes wurde unter Zugabe des PvuII-Linkers in der multiplen Klonierungs-Stelle isoliert. Die pF29-Plasmid-DNA wurde ebenfalls mit BamHI und PvuI digestiert und die pF29 α-Region wurde entfernt und ersetzt durch eine α-Region, welche die neue Sequenz in der multiplen Klonierungs-Region des N-Terminus der α-Region enthielt. Dieses neue Plasmid wurde als p154 bezeichnet.
Zur Herstellung eines Kern-α-Fusions-Proteins wurde das Kerngen von p152 unter λPr-Kontrolle in die multiple Klonierungs-Stelle des α-Gens von p154 inseriert. Die P154-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BclI und AvaI digestiert. Das durch dieses Schneiden erzeugte intervenierende DNA-Fragment trägt den größten Teil des CI Gens und den Pr-Promotor plus das Kerngen, jedoch ohne die vier 3'-terminalen Codons des Kerngens. Dieses DNA-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Das Plasmid p154 wurde mit den Restriktionsenzymen BclI und XmaI digestiert und das intervenierende Stück wurde entfernt und durch das BcII-AvaI-DNA-Fragment aus p152 ersetzt (XmaI und AvaI weisen kompatible kohäsive Enden auf). So wurde das Kerngen unter der Pr-Kontrolle abzüglich der vier terminalen 3'-Codons in die multiple Klonierungs-Stelle der α-Region in p154 inseriert unter Erzeugung einer in Phase-Genfusion, die ein HBV-Kernantigen-α- Fusions-Peptid exprimiert. Dieses neue Kern-α-Expressions- Plasmid wird als Plasmid p157 bezeichnet. Das Fusionspeptid wird gereinigt und zusammen mit einem Antikörper verwendet zur Entwicklung eines Immunoassays für das Hepatitis-Kernantigen in einem Verfahren analog zu demjenigen, wie es im Abschnitt 8.3 beschrieben worden ist.

10. Beispiel: Immunoassay für Human-Chorion-Gonadotropin

10. 1 Herstellung von Human-Chorion-Gonadotropin-Enzym-Donor-Fusionspeptiden durch rekombinante Verfahren

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von β-Human-Chorion-Gonadotropin (β-hCG) -Fusionspeptiden für die Verwendung in einem Immunoassay (Immuntest) für β-hCG.
hCG ist ein Glycoprotein, das aus zwei nicht-kovalent gebundenen Subeinheiten besteht, die mit α(MG 16 000 Dalton) und β(MG 22 000 Dalton) bezeichnet werden. Dies α- Subeinheit ist dem hCG und den verwandten Glycoproteinen, Leutropin (LH), Thyrotropin (TSH) und Follitropin (FSH) gemeinsam. Die β-Subeinheiten dieser Hormone weisen einen hohen Grad an Aminosäure-Homologie auf, obgleich sie verschieden sind. Die β-Subeinheit von hCG enthält jedoch eine singuläre 30 Amino-Extension an dem Carboxy-Terminus.
Diese singuläre Sequenz wurde durch rekombinante DNA- Verfahren hergestellt. Vier DNA-Fragmente wurden auf einem DNA-Synthesizer, Modell 380A, der Firma Applied Biosystems, Inc. (wie im Abschnitt 6.1.4 beschrieben) synthetisiert und sie wiesen die folgenden Sequenzen auf:
(a) hCCBl (62 mer)
(b) hCGS2 (37 mer)
(c) hCGNI (62 mer)
(d) hCGN2 (37 mer)
Die DNA-Fragmente (a) und (b) wurden ligiert und die Fragmente (c) und (d) wurden ligiert. Dieses zwei komplementären DNA-Stränge wurden hybridisiert zur Bildung eines DNA-Fragments, das für die 30 Aminosäuren-Carboxy-Terminus-Extension der nachstehend angegebenen β-hGG-Subeinheit codiert:
Das DNA-Fragment enthält eine 5'-EcoRI-Restriktionsenzym-Stelle und eine SalI-Restriktionsenzym-Stelle an dem 3'-Ende, das auf den Translations-Terminations-Codon TAA folgt.
Dieses DNA-Fragment wurde wie im Abschnitt 9 beschrieben in das Plasmid p154 inseriert. Das Plasmid p154 wurde mit EcoRI und SalI geschnitten (gespalten) zur Entfernung der ω-Region aus dem Enzym-Donor (ED) -Gen und an einem Agarosegel gereinigt. Das EcoRI-SalI-β-hCG-DNA-Fragment wurde mit dem Gel-gereinigten p154-Vektor ligiert. Das resultierende Plasmid, als p166 bezeichnet, enthält ein Gen, das für ein ED-β-hCG-Carboxyterminus-Fusionspeptid codiert (vgl. Fig. 20). Das Enzym-Donor-Peptid ED166 enthält 93 Aminosäuren; die Aminosäuren 1 bis 63 codieren für die α-Donor-Domäne und die Aminosäuren 64(*)-93 codieren für den β-hCG-Carboxyterminus, wie nachstehend angegeben:
Ein zweites β-hCG-Fusionspeptid wurde hergestellt, indem man zuerst ein DNA-Fragment mit der folgenden Sequenz herstellte:
Das Plasmid p154 wurde mit BamHI und PvuI geschnitten (gespalten) und die kleine α-Donor-Region wurde Gel-gereinigt. Das BamHI-PvuI-Fragment wurde mit dem synthetisierten DNA-Fragment ligiert. Dieses Fragment wurde mit BamHI- EcoRI geschnitten und die reduzierte α-Region-Domäne wurde anstelle der BamHI-EcoRI-α-Domäne in p166 eingeführt. Das resultierende Plasmid, mit p175 bezeichnete codierte für einen Enzym-Donor (ED175) aus 85 Aminosäuren. Wie nachstehend angegeben, codieren die Aminosäuren 1 bis 55 für die α-Donor-Domäne und die Aminosäuren 56(*)-86 codieren für einen Teil des β-hCG-Peptids:
Eine andere α-Donor-Domäne, die an die β-hCG-Carboxyterminus-Sequenz fusioniert war, wies den gleichen Aminoterminus auf wie die im Abschnitt 6.1.4 beschriebene und in Fig. 11 angegebene H6 α-Donor-Domäne. Das Plasmid P169, das ED H6 enthielt, wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten und der lineare Vektor wurde Gel-gereinigt. Ein synthetisches DNA-Fragment H6PM mit der folgenden Sequenz:
wurde in das Plasmid p169 inseriert. Die Insertion dieses synthetischen DNA-Fragments zerstörte die EcoRI-Stelle, sie führte jedoch nicht zu einer Änderung in der Aminosäuresequenz. Das resultierende Plasmid weist deshalb keine EcoRI-Stelle auf. Die α-Domäne wurde aus diesem Plasmid entfernt durch Digestion mit BamHI und PvuI und nach der Digestion von p154 mit BamHI und PvuI (wie oben für die Herstellung von p154 beschrieben) in p175 eingeführt zur Erzeugung von p174.
Das Plasmid p174 codiert für eine α-Donor-Domäne von 51 Aminosäuren und enthält eine EcoRI-Stelle zwischen den Enzym-Donor-α und -ω-Regionen. Die α-Donor-Domäne wurde durch Digestion mit BamHI und EcoRI aus p174 entfernt und Gel-gereinigt. Das Plasmid p166 wurde mit BamHI und EcoRI digestiert und die α-Donor-Domäne aus p177 enthält eine α- Donor-Domäne, die an das Carboxyterminus-β-hCG-DNA-Fragment fusioniert ist. Dieses Enzym-Donor-Peptid ED177 weist 81 Aminosäuren auf. ED177 ist somit um 4 Aminosäuren kürzer als ED175.

10. 2 Human-Chorion-Gonadotropin-Assay

Dieses Beispiel zeigt einen hochempfindlichen homogen klonierten Enzym-Donor-Immunoassay für Human-Cho)ion-Gonadotropin (hCG). Außerdem verbessert in diesem Beispiel die Bindung eines sekundären Antikörpers (Kaninchen-Anti-hCG) die Inhibierung der Komplementation mit EA22 (vgl. den nachfolgenden Abschnitt 14).
Der β-hCG-Enzym-Donor wurde so hergestellt, wie im Abschnitt 10.1 beschrieben. In diesem Experiment wurde ED175 als Enzym-Donor verwendet.
Der Immunoassay wurde durchgeführt unter Verwendung einer Mikrotiter-Platte. Die Assays wurden durchgeführt durch Zugabe von 50 ul der geeigneten Konzentration an hCG (1 · 10³, 3 · 10³ und 5 · 10³ mIU); 50 ul einer 1 : 100-Verdünnung des polyklonalen Kaninchen-Anti-hCG-Antikörpers (Probe Nr. 01-302-57, Immunosearch, Toms River, NJ); und 50 ul ED175 (1 · 10&supmin;&sup8; M). Alle Verdünnungen wurden mit einem PM2-Puffer durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert. 50 ul einer 1 : 10-Verdünnung eines Ziegen-Antikaninchen-Antikörpers wurde zugegeben (Antibodies, Inc., Davis, CA) und die Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurde die Mischung mit 50 ul des Enzym-Akzeptors EA22 (1 · 10&supmin;&sup7; M) und ONPG-Substrat (5 mg/ml) umgesetzt. Die Mikrotiter- Platten wurden bei 37ºC inkubiert und die OD&sub4;&sub1;&sub4; wurde gemessen.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 21 graphisch dargestellt. Dieses Beispiel zeigt einen Dosis-Ansprech-Kurve, die für die Verwendung in einem homogenen Immunoassay (Immuntest) geeignet ist. Dieser Assay kann zur Bestimmung von hCG entweder als Tumor-Markierungsstoff oder als Indikator für eine Schwangerschaft angewendet werden.

11. Beispiel: Assay für Biotin

Dieses Beispiel erläutert einen Konkurrenz-Bindungs- Assay für Biotin, bei dem das Glycoprotein Avidin als Analytbindungs-Protein verwendet wird.
Avidin (MG=67 000 Dalton) bindet Biotin (MG=244 Dalton) mit einer Assoziationskonstanten von 1015 L/M. Biotin wurde in der Position 65 und an der N-terminalen α-Aminogruppe von H6 an das Lysin gebunden. Gelöstes Avidin wurde als Analyt-Bindungsprotein verwendet, um zu bestimmen, ob das an den Enzym-Donor gekoppelte Avidin die Komplementation mit EA23 inhibierte.
Die Kupplung von Biotin an den Enzym-Donor H6 wurde wie folgt durchgeführt: lyophilisiertes H6, hergestellt wie im Abschnitt 6 beschrieben, wurde in 0,15 ml 0,1 M Na- Phosphat, pH 7,5, gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Zwei 5 ul-Aliquote von N-Hydroxysuccinimidobiotin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) mit 10 mg/ml N,N-Dimethylformamid (DMF) wurden zugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die Lösung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Bio-Gel P-2 (0,6 · 16 cm) Säule (BioRad Labs, Richmond, CA), die mit 0,1 M Na-Borat von pH 9,0 äquilibriert war, aufgegeben und mit dem gleichen Puffer eluiert. 10 Tropfen-Fraktionen wurden gesammelt und die das Biotinyl-H6-Konjugat (d. h. eine Komplementations- Aktivität) enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt.
In einem vorläufigen Experiment wurde eine Titration durchgeführt, um die Konzentration an Avidin zu bestimmen, die für die Inhibierung der Komplementationen erforderlich war. Zu der Mikrotiter-Platte wurden der PM2-Puffer, ein biotinyliertes H6, Avidin, EA23 und das Substrat O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid zugegeben. Nach 15 min bei 37ºC wurde die optische Dichte bei 414 nm (OD&sub4;&sub1;&sub4;) bestimmt. Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse. Diese Daten zeigen, daß 0,5 ug Avidin (7,5 · 10&supmin;¹² mol) 75% der Komplementations-Reaktion inhibieren. Tabelle IV Inhibierung der Komplementation durch Bindung an Avidina Vertiefung
(a) 2,5 ul von biotinyliertem H&sub6;, hergestellt wie beschrieben; 20 ul EA23 (3,6 · 10&sup7; M); und 100 ul Substrat O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) (10 mg/ml) wurden verwendet pro Vertiefung. Es wurde genügend PM2-Puffer in jede Vertiefung gegeben, um das Endvolumen auf 200 ul zu bringen.
Ein Konkurrenz-Bindungs-Assay für Biotin wurde durchgeführt, wie für das vorläufige Experiment beschrieben, mit der Ausnahme, daß variierende Konzentrationen an freiem D-Biotin (Sigma Chemical, St. Louids, MO) zugegeben werden, um eine Konkurrenz-Bindungs-Kurve zu erzeugen. Dabei enthielt jede Vertiefung: 5 ul Biotin-H6; 0,5 ug Avidin; 20 ul EA23 (3,6 · 10&supmin;&sup7; M); 100 ul ONPG (10 mg/ml) Substrat und 1 bis 8 ul D-Biotin (1 ug/ml) mit ausreichend PM2-Puffer, um das Gesamtvolumen auf etwa 200 ul zu bringen. Die optische Dichte (414 nm) wurde nach 15 min gemessen. Die Daten sind in der Fig. 6 graphisch dargestellt. Wie gezeigt, ergibt dieses Assay-System einen guten Assay für Biotin über den Bereich von 1 bis 8 mg oder 4-32 x 10&supmin;¹² M Biotin. Das Avidin-Biotin-System (ka = 2 · 10¹&sup5; L/M) weist eine ausreichende Affinität auf, um die Komplementation zu kontrollieren bzw. zu steuern (ka = 1-2 · 10&sup5; L/M) innerhalb eines 15 Minuten-Assays.

12. Beispiel: Heterogener Komplementations-Assay für Biotin

Dieses Beispiel erläutert ein heterogenes Assay-System für Biotin unter Verwendung von Avidin als spezifischem Analyt-Bindungs-Protein. Der Enzym-Akzeptor ist EA23 und der Enzym-Donor ist CNBr2, gekoppelt an Biotin (nachstehend als CNBr2-Biotin-Konjugat bezeichnet).
Das CNBr2-Biotin-Konjugat wurde wie folgt synthetisiert: 900 ug lyophilisiertes CNBr2-Polypeptid wurden in 300 ul eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers, pH 7,5, gelöst. Ein 200 ul-Aliquot an N,N-Dimethylformamid (DMF), das 2,1 mg [N-Hydroxy- (d-biotin-succinimidester oder N-Hydroxysuccinimidobiotin) succinimid-aktiviertes Biotin (Sigma Chemical Co., Stl. Louis, MO)] enthielt, wurde in 20 ul-Aliquoten unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung an einer Biogel P-2-Säule (1,5 · 48 cm) unter Verwendung eines 0,1 M Natriumborat-Puffers, pH 9,0, chromatographiert. Die das CNBr2-Biotin-Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden durch die Komplementations-Reaktion mit EA23 identifiziert.
Mit Avidin-immobilisiertes Agarose-Ausgangsmaterial (Avidin-Agarose, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (17,5 Einheiten pro 41 Suspension, wobei eine Einheit 1 ug Biotin bindet) wurde in einer bei niedriger Temperatur gelierenden Agarose-Suspension (6 mg/ml) verdünnt zur Erzielung des gewünschten Gehaltes an Avidin-Agarose.

12.1 Inhibierung der CNBr2-Biotion-Komplementations-Aktivität durch Avidin-Agarose

20 ul CNBr2-Biotin-Konjugat-Ausgangslösung (5 · 10&supmin;&sup7; M), 90 ul PM2-Puffer und 20 ul Avidin-Agarose verschiedener Verdünnungen wurden in Eppendorf-Phiolen gut miteinander gemischt und 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Phiolen wurden dann 5 min lang zentrifugiert und 100 ul der überstehenden Flüssigkeit wurden aus jeder Phiole entnommen und in Mikrotiter-Vertiefungen überführt, die jeweils 10 ul EA23-Ausgangslösung (1,5 · 10&supmin;&sup6; M) enthielten, und 15 min lang bei 37ºC inkubiert. Das Substrat ONPG (100 ul von 10 mg/ml) wurde dann zugegeben und die Absorption jeder Vertiefung bei 414 nm wurde nach 30 min bei 37ºC gemessen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 7 graphisch dargestellt.

12.2 Konkurrenz-Bindung von Biotin mit einem CNBr2-Biotin- Konjugat für immobilisiertes Avidin

Unter Verwendung des obengenannten Titer-Wertes wurde die Biotin-Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurve wie folgt erhalten: 20 ul einer Avidin-Agarose-Suspension (insgesamt 0,35 Einheiten) und 90 ul eines PM2-Puffers, der variierende Gehalten an Biotin enthielt, wurden in Eppendorf- Phiolen gut miteinander gemischt und 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 20 ul CNBr2-Biotin-Konjugat-Ausgangslösung (5 · 10&supmin;&sup7; M) zugegeben, gut gemischt und 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Phiolen 5 min lang zentrifugiert und es wurden 100 ul der überstehenden Flüssigkeit aus jeder Phiole entnommen und in Mikrotiter-Vertiefungen überführt, die jeweils 10 ul EA23-Ausgangslösung (1,5 · 10&supmin;&sup6; M) enthielten, und 15 min lang bei 37ºC inkubiert. Es wurde das Substrat ONPG (100 ul von 10 mg/ml) zugegeben und die Absorption jeder Vertiefung bei 414 nm wurden nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC gemessen. Die Dosis-Ansprechempfindlichkeits- Kurve ist in der Fig. 8 graphisch dargestellt. Eine solche Kurve kann verwendet werden zur quantitativen Bestimmung der Menge an Biotin in einer unbekannten Probe.

13. Beispiel: Enzyme-Immunoassay für Digoxin

Dieses Beispiel erläutert einen Enzym-Immunoassay, in dem der Analyt das cardiotonische Digitalis-Glycosid Digoxin ist. Das Analyt-Bindungsprotein ist ein für Digoxin spezifischer Antikörper. Das Beispiel erläutert ferner, daß der Mechanismus der Wirkung des Assays nicht analog zu dem sterischen Hinderungs-Enzym-Immunoassay ist, bei dem β-Galactosidase verwendet wird, wie von Castro und Monji (1981, "Methods in Enzymology" 73 : 523-542) beschrieben.

13.1 Herstellung eines Digoxin-H6-Konjugats

Ein Urethanderivat von Digoxin, insbesondere 3-O-[m- Maleimidophenylcarbamoyl) digoxigenin, dargestellt durch - die Formel
[nachstehend als "Digoxin-Maleimid-Addukt" bezeichnet] wurde wie folgt hergestellt:
In einen mit einer Magnetrühreinrichtung, einem Argon-Einlaß und einem Rückflußkühler ausgestatteten trockenen 10 ml-Rundkolben wurden 3-Carboxylphenylmaleimid (67 mg oder 0,307 mmol), trockenes Benzol (3 ml) und trockenes Triethylamin (0,043 ml oder 0,307 mmol) eingeführt. Die Mischung wurde 30 min lang unter Rückfluß erhitzt. Eine Infrarot-Spektralanalyse (IR) eines aliquoten Anteils zeigte die Umwandlung in Carbonylazid (2150 cm&supmin;¹). Dann wurden Digoxigenin (80 mg oder 0,205 mmol) und trockenes Tetrahydrofuran (2 ml) zu der Reaktionsmischung zugegeben. Nach 3,5-stündigem Erhitzen unter Rückfluß wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, einmal mit 50 ml kaltem, 1%igem wäßrigem NaOH und einmal mit 50 ml gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; gewaschen. Dann wurde die organische Schicht über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in etwa 1 bis 2 ml Aceton gelöst und auf 2 präparative Dünnschichtchromatographie (TLC)-Platten (1500 um-Silicagel-Analtech-Uniplate der Firma Analtech, Newark, DE) aufgegeben. Wenn das Aceton verdampft war, wurden die Platten mit Ethylacetat/Benzol (80/20) eluiert. Das nicht-umgesetzte Digoxigenin wurde durch Abkratzen der richtigen UV-aktiven Bande von der Platte und dreimaliges Waschen desselben mit 30 ml Ethylacetat entfernt. Dieses Verfahren wurde für die nächsten beiden Flecken oberhalb Digoxigenin wiederholt. Diese Reinigung ergab Digoxigenin (20 mg), das gewünschte Produkt Digoxin-Maleimid-Addukt (31 mg oder 37% Ausbeute, bezogen auf das nicht-umgesetzte Ausgangsmaterial) und 12- O-(m-Maleimidophenylcarbamyl)digoxigenin (28 mg oder 33% Ausbeute, bezogen auf nicht-umgesetztes Ausgangsmaterial) . .
Es wurde eine Dünnschichtchromatographie in 2,5% MeOH-CH&sub2;Cl&sub2; durchgeführt, um die Reinheit des Digoxin- Maleimid-Addukts zu gewährleisten. Wenn eine höhere Reinheit erwünscht ist, ist es am besten, eine präparative TLC mit 3% MEOH/CH&sub2;Cl&sub2; (zwei Elutionen) durchzuführen. Das Digoxin-Maleimid-Addukt wies die folgenden spektralen Eigenschaften auf:
Infrarot (Nujol-Mull): 3490, 3350, 1805, 1760, 1725, 1700, 1615, 1550, 1460, 1305, 1240, 1160, 960, 935, 905, 880, 840, 810, 790, 710 cm&supmin;¹
NMR (kernmagnetische Resonanz)-Aceton d&sub6;: 0.8 (3 H, s), 0.93 (3 H, s), 3.38 (1 H, brs) , 3.40 (1 H, q, J = 4.78 Hz(, 4.84 (2 H, t, J = 1.5 Hz), 5.00 (1 H, m), 5.78 (1 H, t, J = 1.5 Hz), 6.98 (s, 2 HO), 6.8-7.7 (4 H, m), 8.75 (1 H, br s).
Massenspektrum (CDI-NH&sub3;): 622 (M + NH&sub4;&spplus;), 605 (M + H&spplus;), 587 (M + H&spplus;-H&sub2;O), 391, 373, 355, 337, 214, 191, 189.
Dann wurde das Digoxin-Maleimid-Addukt weiter gereinigt auf einem RP-8 SynChropak 250 · 10 mm I.D. (SynChrom, Inc., Linden, ID) unter Verwendung eines Hochleistungs- Flüssigchromatographie-Systems, Beckman Modell 332 (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). Es wurde eine Gradienten-Elution durchgeführt von 0 bis 80% Acetontril in H&sub2;O über 60 min bei einer Strömungsrate von 1,5 ml/min. Das Digoxin-Maleimid-Addukt wurde gesammelt und lyophilisiert.
Das gereinigte Digoxin-Maleimid-Addukt wurde dann an den Enzym-Donor H6 gekoppelt, der wie oben beschrieben hergestellt worden war, zur Bildung von Digoxin-H6, einem Enzym-Donor-Analyt-Konjugat. H6 (1,5 mg) wurde-in 240 ul Acetonitril-50 mM Natriumphosphat (3 : 2) bei pH 6,0 gelöst. Digoxin-Maleimid-Addukt (1,0 mg) wurde direkt der Reaktionsmischung zugesetzt, die 2 h lang bei 37ºC gehalten wurde. Nach Beendigung der Kupplungsreaktion wurden 60 ul- Aliquote der Mischung in eine Bondapak® Phenyl-Säule 10 · 30 cm (Waters Associates, Milford, MA) injiziert. Die Säule wurde mit einem 60 min-Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in H&sub2;O, 0,1% Trifluoressigsäure entwickelt. Die die Enzym-Donor-Aktivität aufweisenden Proben wurden gesammelt.

13.2 Immunoassay für Digoxin

In Enzym-Immunoassay-Systemen, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden waren, können variierende Kombinationen von Konzentrationen an Enzym-Akzeptor- und Enzym-Donor-Konjugat (d. h. von an den Analyten gekuppeltem Enzym-Donor) zur Erzeugung einer gegebenen β- Galactosidase-Konzentration über das Komplementations-Verfahren verwendet werden. Das Massenwirkungsgesetz macht es erforderlich, daß bei verhältnismäßig hohen Konzentrationen an Enzym-Akzeptor der inhibierende Einfluß des Antikörpers auf das Komplementations-Verfahren abnimmt. Dies zeigt sich durch die flachen oder fehlenden Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Charakteristiken bei variierenden Konzentrationen an dem Analyten, wie z. B. Digoxin. Umgekehrt geht bei verhältnismäßig hohen Konzentrationen an dem Enzym-Donor-Konjugat (im Vergleich zu dem Antikörper) der inhibierende Einfluß des Antikörpers auf das Komplementations-Verfahren ebenfalls verloren. Die zuletzt genannte Situation zeigt sich ebenfalls an den flachen oder fehlenden Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Charakteristiken und einem erhöhten Hintergrund.
Dieses Beispiel erläutert, daß genau wie bei den konventionellen Enzym-Immunoassays die relativen Konzentrationen an Enzym-Akzeptor, Enzym-Donor und spezifischem Antikörper so definiert werden müssen, daß ein Assay mit Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Charakteristiken mit einer geeigneten Genauigkeit (Gefälle) und einer ausreichenden Empfindlichkeit für die Verwendung in-einem diagnostischen Assay für den Analyten gebildet wird.
In einer Reihe von Experimenten, in denen eine Mikrotiter-Platte verwendet wurde, wurde die Empfindlichkeit des Systems bestimmt durch Verwendung unterschiedlicher Kombinationen von Digoxin-H6-Enzym-Donor- und EA23-Enzym- Akzeptor-Konzentrationen.
Die Assays wurden durchgeführt durch Zugabe von vier aufeinanderfolgenden Portionen von jeweils 50 ul an Digoxin (Analyt), Enzym-Donor-H6 Digoxin-Konjugat, spezifischem Antikörper für Digoxin (Anti-Digoxin) und Lösung, die beide Enzyme, enthielt, Enzym-Akzeptor (EA23) und O- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) 5 mg/l als Substrat. Alle Verdünnungen wurden in einem PM2-Puffer (0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, 1 mM MgSO&sub4;, 0,18 mM MnSO&sub4;, 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3; und 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)] durchgeführt. Die Konzentrationen an dem Digoxin-Analyten betrugen: 0, 1, 10, 100, 200, 500 und 1000 ng/ml. Der für Digoxin spezifische Antikörper wurde erhalten durch Injektion des Digoxin-Konjugats in Kaninchen auf die folgende Weise: es wurden primäre intramuskuläre Injektionen durchgeführt unter Verwendung von 50 ug Konjugat in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml eines vollständigen Freund-Adjuvans. Es wurden Verstärkungsmittel (Booster (intramuskulär) in vier Wochen-Intervallen verabreicht zusammen mit 25 ug Konjugat in einem Volumen von 1,0 ml eines vollständigen Freund-Adjuvans. 50 ml-Blutproben wurden alle zwei Wochen gesammelt, beginnend 90 Tage nach der primären Injektion. Das Sammeln erfolgte durch Phlebotomie der medialen Arterie oder durch Einstechen in die marginalen Ohrvenen. Man ließ das Blut koagulieren und 25 ml Serum/SO ml Blut wurden als überstehende Flüssigkeit nach 30-minütigem Zentrifugieren bei 1000 · g gewonnen.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 9 (A und B) graphisch dargestellt. Ein Vergleich der Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurven in der Fig. 9A und in der Fig. 9B zeigt, daß eine selektive Abnahme der Konzentration an Enzym-Akzeptor oder Enzym-Donor-Konjugat eine steilere und daher empfindlichere Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurve ergibt.

13.3 Mechanismus des Digoxin-Immunoassays

Um zu bestimmen, ob der mit dem Enzym-Donor-Digoxin- Konjugat reagierende Anti-Digoxin-Antikörper das Komplementations-Verfahren eher stört als die Umwandlung des Substrats durch polymerisiertes β-Galactosidase-Enzym, wurde das Komplementationsverfahren bis zur Vollständigkeit ablaufen gelassen vor der Zugabe eines Antikörpers in einer Reihe von Experimenten.
Das Protokoll der Experimente war wie folgt: 300 ul PM2-Puffer und das Digoxin-H6-Konjugat wurden 60 min lang mit 150 ul des Enzym-Akzeptors EA23 (4,1 · 10&supmin;&sup6; M) umgesetzt. Dies erlaubte den Ablauf der Komplementation bis zur Vollständigkeit. Ein aliquoter Anteil (125 ul) der obigen Reaktionsmischung wurde entnommen und einem aliquoten Anteil (50 ul) Kaninchen-Antidigoxin-Antikörper (verdünnt mit PM2-Puffer im Verhältnis 1 : 100) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann 30 min lang inkubiert. Am Ende dieser Zeitspanne wurde das ONPG-Substrat (Endkonzentration 1 mg/ml) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei 37ºC inkubiert. Die optische Dichte der Reaktionsmischung wurde 7 min und 16 min nach der Inkubation bei 37ºC bestimmt. Kontroll-Röhrchen wurden in entsprechender Weise behandelt, jedoch mit der Ausnahme, daß 50 ul entweder von normalem Kanainchen-Serum, verdünnt mit dem PM2-Puffer im Verhältnis 1 : 1, oder des PM2-Puffers anstelle des Kaninchen-Antidigoxin-Antiserums zugegeben wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben. Tabelle V optische Dichte Inkubationszeit Probe Antidigoxina NRSbb PM2c Substrat-Rohling
(a) Antidigoxin steht für Kaninchen 539 (50 ul, Verdünnung in PM2-Puffer 1 : 100)
(b) NRS steht für normales Kaninchenserum (50 ul, Verdünnung in PM2-Puffer 1 : 100)
(c) PM2-Puffer: 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0, 1 mM MgSO&sub4;, 0,18 mM MnSO&sub4;&sub1; 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3;&sub1; 0,05% Tween 20)
Wie in der Tabelle V angegeben, inhibierte der Antikörper die Umwandlung des Substrats durch die vorher polymerisierte β-Galactosidase (vollständige Komplementation von Digoxin-H6 und EA23 Enzym-Akzeptor) nicht. Die während des Enzym-Assays beobachtete verminderte Substratumwandlung ist das Ergebnis der Antikörper-inhibierten Komplementation, nicht eine verminderte Enzym-Substrat-Umwandlung. Deshalb ist der Mechanismus der Wirkung des erfindungsgemäßen Assays nicht analog zu dem sterisch gehinderten Enzym-Aminoassay, bei dem β-Galactosidase verwendet wird, wie von Castro und Monji (1981, "Methods in Enzymology" 73 : 523-542) beschrieben.

13.3.1 Effekt des Anti-Digoxin-Antikörpers auf die Komplementation bei Verwendung einer Vielzahl von Enzym-Akzeptoren

Bei einer Reihe von Experimenten wurde der Inhibierungseffekt eines spezifischen Antikörpers gegenüber Dioxin bestimmt unter Verwendung von drei Enzym-Akzeptoren und des Enzym-Donor-Digoxin-H6-Konjugats, das wie in den Abschnitten 7.2 und 13.1 beschrieben hergestellt wurde.
Die Reaktionsmischung wurde wie folgt hergestellt: 50 ul PM2-Puffer, 50 ul der geeigneten Verdünnung (1 : 20, 1 : 40, 1 : 80) des Digoxin-H6-Konjugats in dem PM2-Puffer; 50 ul des geeigneten Antikörpers (d. h. entweder ein Antidigoxin-Antikörper oder normales Kaninchenserum) und 50 ul der geeigneten Mischung aus dem Enzym-Akzeptor (1 · 10&supmin;&sup7; M EA14, EA20 oder EA22) und dem Substrat O-Nitrophenol-β-D- galactopyranosid (ONPG) (5 mg/ml) wurden für die angegebenen Zeitspannen bei 37ºC inkubiert. Die optische Dichte bei 414 nm wurde 45 min lang in 5 min-Intervallen bestimmt.
Die Inhibierungswirkung des Antikörpers auf die Komplementation in diesem System scheint in Beziehung zu stehen zur Größe der Deletion in dem Enzym-Akzeptor. Der Enzym-Akzeptor EA22, der die Aminosäuren 13 bis 40 deletiert (vgl. Fig. 5) und die in diesem Experiment getestete größte Deletion darstellt, wurde mindestens durch den Antikörper inhibiert. Der Enzym-Akzeptor EA14, der die Aminosäuren 30 bis 37 deletiert (vgl. Fig. 5) ist der kleinste der getesteten Gruppe und er wurde durch den Antikörper am stärksten inhibiert. EA20, das die Aminosäuren 26 bis 45 umfaßt (vgl. Fig. 5) und in bezug auf seine Größe zwischen EA22 und EA14 liegt, wurde verhältnismäßig mäßig inhibiert. Der native Komplementations-Wirkungsgrad von EA20 ist jedoch geringer als derjenige von EA14 oder EA22. Der Enzym-Akzeptor muß zwei Kriterien genügen: (a) der native Komplementations-Wirkungsgrad (z. B. von EA14 und EA22) ist wirksamer als bei anderen, wie in der Fig. 5 dargestellt, bezogen auf äquimolare Konzentrationen; und (b) die Fähigkeit eines spezifischen Analyt-Bindungs-Proteins, die Komplementation zu inhibieren.

14. Beispiel: Effekt eines zweiten Antikörpers auf den Digoxin-Enzym-Immunoassay

Die in dem obigen Abschnitt 12.3 angegebenen Ergebnisse lassen vermuten, daß die Kupplung des Antidioxin-Antikörpers an die erfindungsgemäßen Enzym-Donor-Digoxin- Konjugate auch die Geschwindigkeit der Komplementation von Enzym-Akzeptor und Enzym-Donor-Konjugat verlangsamen. Diese Kupplung verhindert jedoch nicht vollständig die Komplementation. Deshalb hat das System, wie im Abschnitt 13.3 angegeben, die höchste Empfindlichkeit bei etwa 15- minütiger Inkubation des Enzym-Akzeptors und des Enzym-Donor-Konjugats.
Das System erreicht ein maximales Extinktionsdifferential nach etwa 15 min. Zu diesem Zeitpunkt ist die Konzentration der β-Galactosidase in einem System mit deinem vorhandenen Antidigoxin-Antikörper die gleiche wie in einem System, in dem der Antikörper fehlt oder in dem der Digoxin-Antikörper neutralisiert ist (z. B. bei hohen Digoxin-Werten). Da die β-Galactosidase-Konzentration die gleiche ist, ist auch die Geschwindigkeit der Substratumwandlung die gleiche. Es tritt kein zusätzliches Extinktionsdifferential auf. Dieses Phänomen, das die Wirksamkeit des Antikörpers auf die Komplementation beschränkt, ergibt einen engen Extinktionsbereich für eine Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurve, flache Steigungs-Charakteristiken und eine unzureichende Empfindlichkeit des Assays für einige diagnostische Anwendungen.
Das folgende Beispiel zeigt, daß die Bindung eines sekundären Antikörpers, der spezifisch ist für den Antidigoxin-Konjugat-Antikörper, die Inhibierung der Komplementation verbessert.

14.1 Bindung eines ganzen sekundären Antikörpers

In einer Reihe von Experimenten wurden 50 ul Kaninchen-Antidigoxin-Antikörper (Verdünnung 1 : 1000) in einer Gruppe von Mikrotiter-Vertiefungen kombiniert mit 50 ul Digoxin-H6 (verdünnt in einem PM2-Puffer im Verhältnis 1 : 50) und 50 ul Digoxin in einer Menge in dem Bereich von 0, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 100 ng/ml. Ein 50 ul-Aliquot eines sekundären Antikörper-Präparats (Bethyl Lab, Montgomery, TX, Ziegen-Antikaninchen-Serum 1 : 50-1 : 800) wurde jeder Vertiefung zugesetzt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen VI und VII zusammengefaßt. Tabelle VI Effekt des sekundären Antikörpers auf die Geschwindigkeit der Substratumwandlung Geschwindigkeit der Substratumwandlung (OD&sub4;&sub1;&sub4;/Zeit)a Verdünnung des sekundären Antikörpers OD/Zeit Prim.
(a) In allen Fällen wurde die Geschwindigkeit (Rate) der Substratumwandlung durch das Assay-System unter Verwendung eines primären Antikörpers ohne den sekundären Antikörper auf 100% festgelegt. Die gemessene Geschwindigkeit (Rate) für dieses Präparat (OD&sub4;&sub1;&sub4;/Zeit) betrug 0,003, 0,007, 0,013, 0,015 bei 0 bis 16 min; 16 bis 30 min; 30 bis 45 min bzw. 45 bis 60 min.
(b) Der verwendete sekundäre Antikörper war ein Ziegen- Antikaninchen-Antikörper (Bethyl Labs, Montgomery TX). Alle Verdünnungen wurden hergestellt unter Verwendung des PM2-Puffers. Der primäre Antikörper war ein Kaninchen-Antidigoxin-Antikörper, der in allen Fällen im Verhältnis 1 : 1000 verdünnt wurde.
Wie in der Tabelle VI dargestellt, ist der Inhibierungseffekt auf die Komplementation, der durch Bindung eines sekundären Antikörpers an das Antikörper-Digoxin H6- Konjugat erzielt wird, bei einer Verdünnung von 1 : 50 oder weniger des sekundären Antikörpers optimal. Bei einer Verdünnung von 1 : 200 bis 1 : 300 des sekundären Antikörpers geht die gesamte synergistische Inhibierung verloren. Die Inhibierung der Komplementation mit oder ohne einen sekundären Antikörper ist daher bei dieser Verdünnung oder einer höheren Verdünnung die gleiche. Tabelle VII Effekt eines sekundären Antikörpers auf die Substratumwandlung Primärer Antikörpera) Verdünnung des sekundären Antikörpersb) Geschwindigkeit der Substratumwandlung OD/Zeit Max.
* In den Vertiefungen wurde eine Ausfällung festgestellt
(a) Der primäre Antikörper war entweder ein Kaninchen-Antidigoxin (Rα Dg) oder ein normales Kaninchenserum (NRS), verdünnt mit dem PM2-Puffer im Verhältnis 1 : 1000
(b) Der sekundäre Antikörper steht für einen Zeigen-Antikaninchen-Antikörper
Wie die Tabelle VII zeigt, erreichte die Geschwindigkeit (Rate) der Substratumwandlung ohne einen sekundären halb von 30 min ein Maximum von 70%. Mit einem sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1 : 40 betrug die Geschwindigkeit (Rate) der Substratumwandlung etwa 25% des Maximums. Bei größeren Verdünnungen als 1 : 40 des sekundären Antikörpers nahm der Inhibierungseffekt auf die Komplementation ab, wie durch die steigenden Geschwindigkeiten (Raten) der Substratumwandlung mit der Zeit gezeigt wird.
Bei Verdünnungen von 1 : 40 oder größer ist der Effekt ein Anstieg der Geschwindigkeit (Rate) der Substratumwandlung.
Bei allen Konzentrationen des getesteten sekundären Antikörpers wurde die Geschwindigkeit (Rate) der Substratumwandlung (d. h. die β-Galactosidase-Konzentration) linear (d. h. es wurde keine neue β-Galactosidase gebildet) bei Werten unterhalb der maximalen Konzentration der β-Galactosidase, die das System erlauben würde (z. B. wenn NRS den sekundären Antikörper ersetzt). Dies zeigt an, daß die Bindung des sekundären Antikörpers die sterische Interferenz des primären Antikörpers erhöht und die Komplementation vollständig verhindern kann durch diese Enzym-Donor-Population, die gebunden ist.

14.1.1 Dosis-Ansprechempfindlichkeit: EA14 und Digoxin- P6

In einer weiteren Reihe von Experimenten wurde die Empfindlichkeit des Enzym-Immunoassays bestimmt unter Verwendung von Digoxin (Analyt)-Konzentrationen in dem Bereich von 0, 1, 10, 100, 1000 ng/ml, des Enzym-Akzeptors EA14, des Kaninchen-Antidigoxin-Antikörpers und des Ziegen-Antikaninchen-Antikörpers als sekundärem Antikörper. Bei diesen Experimenten wurden verschiedene Kombinationen von Konzentrationen des Enzym-Donor-Digoxin-P6, hergestellt auf analoge Weise zu derjenigen, wie für das Digoxin-H6-Konjugat (im Abschnitt 13) beschrieben, und des Enzym-Akzeptors EA14 verwendet. In jedem Falle wurde das folgende Versuchsprotokoll angewendet:
In eine Mikrotiter-Platte wurden nacheinander 50 ul jeweils von Digoxin-P6, freiem Digoxin-Analyt und Antidigoxin-Antikörper gegeben. Dann wurden 50 ul Ziegen-Antikaninchen (1 : 80) zugegeben. Die Platten wurden dann 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden jeweils 50 ul der geeigneten Verdünnung der Vorratslösung EA14 (2,64 · 10&supmin;&sup5; M) und O-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid-Substrat (5 mg/ml) zugegeben. Die Platten wurden erneut bei 37ºC inkubiert und die Extinktion der Reaktionsmischung wurde nach 15 und 30 min bestimmt. Die Extinktion des Substrat- Rohlings wurde von allen Proben abgezogen.
Die in der Fig. 10 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen Dosis-Ansprechempfindlichkeits-Kurven, die für die Verwendung in dem Digoxin-Assay geeignet sind.

14.2 Bindung eines Fragments eines sekundären Antikörpers

Um zu bestimmen, ob die beim Kuppeln eines sekundären Antikörpers an das primäre Antikörper-Enzym-Donor-Konjugat zu beobachtende erhöhte Inhibierung auf die sterische Hinderung oder das Einfangen des Enzym-Donor-Konjugats in einem Präzipitin-Komplex zurückzuführen sein könnte, wurden als sekundäre Antikörper monovalente Fab-Fragmente (Antigen-bindende Fragmente mit einem MG von etwa 50 000 Dalton) von Ziegen-Antikaninchen-Immunoglobulin verwendet. Da die Fab-Fragmente das Antigen nicht vernetzen können, sind sie nicht in der Lage, eine Präzipitin- oder Agglutionationsreaktion einzuleiten. Jede Inhibierung der Komplementation, die bei diesem Präparat festgestellt wird, ist auf die erhöhten sterischen Effekte bei der Komplementation und nicht auf den erhöhten Einschluß des Konjugats zurückzuführen.
In eine Mikrotiter-Platte wurden nacheinander fünf gleiche Zugaben von jeweils 50 ul Digoxin (0, 1, 4, 10, 1000 ng/ml); Digoxin-H6-Konjugat; primärem Kaninchen-Antidigoxin-Antikörper (1 : 4000) und sekundärem Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (Bethyl Labs, Montgomery, TX) in einer Verdünnung von 1 : 80 gegeben. Alle Verdünnungen wurden in einem PM2-Puffer vorgenommen. Der sekundäre Antikörper wurde ersetzt durch normales Kaninchenserum (1 : 80) und das Fab-Fragment des Ziegen-Antikaninchen-Serums (Cappel Laboratories, West Chester, PA) in Verdünnungen von 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurden 50 ul von 1 · 10&supmin;&sup6; M EA14 und 5 mg/ml des Substrats ONPG zugegeben und die Inkubationen wurden 30 min lang bei 37ºC fortgesetzt. Es wurde die OD414 gemessen und es wurde die Bindung/maximale Bindung (B/Bmax) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle VIII dargestellt. Tabelle VIII Effekt der Fab-Fragmente Geschwindigkeit der Substratumwandlung Verdünnung des sekundären Antikörperpräparatsa Konzentration an Digoxin Ziegen-Antikaninchen Fab Ziegen-Antikaninchen
(a) Alle sekundären Antikörper-Präparate wurden unter Verwendung eines primären Antikörpers in einer Verdünnung von 1 : 4000 getestet
(b) Ziegen-Antikaninchen-Immunoglobulin-Antiserum (Bethyl Labs, Montgomery, TX)
(c) "-" bedeutet, daß kein sekundärer Antikörper verwendet wurde. Eine 1 : 80-Verdünnung von normalem Kaninchenserum ersetzte in diesen Beispielen den sekundären Antikörper
(d) Fab-Ziegen-Antikaninchen-IgG steht für das Fab-Fragment, das von H und L Sp erhalten wurde (Cappel 0412- 0081, Probe #23167) (Cappel Laboratories, West Chester, PA)
Wie in der Tabelle VIII gezeigt, ergibt sich offensichtlich eine verminderte Komplementation, wenn das Ziegen-Antikaninchen-Immunoglobulin (Fab-Fragment) an das primäre Antikörper-Enzym-Donor-Konjugat gekuppelt ist. Die Inhibierung der durch das Fab-Fragment induzierten Komplementation ist etwa äquivalent zu der Inhibierung, die beobachtet wird, wenn der ganze Antikörper verwendet wird.
Wie in der Tabelle VIII gezeigt, wies der sekundäre Antikörper einen höheren Inhibierungseffekt auf die Komplementation bei einer niedrigen Dosis (d. h. eine höhere Antikörper/Enzym-Donor-Wechselwirkung) auf als bei einer hohen Dosis (d. h. durch einen Überschuß an freiem Analyten wird eine geringere Antikörper-Enzym-Donor-Wechselwirkung hervorgerufen werden).
Die abnehmende Fab-Konzentration führte zu einer linearen Abnahme der Komplementations-Inhibierung. In der Tabelle VI ergaben intakte Moleküle eine Abnahme der sekundären Antikörper-Wirksamkeit bei einer höheren Verdünnung als 1 : 40. In entsprechender Weise ist das gleiche Phänomen zu beobachten ab einer Verdünnung des Fab-Präparats von 1 : 40.

14.3 Inhibierung der Komplementation durch Analyt-spezifische Antikörper: ein Vergleich von ED-Digoxin-Konjuraten

Es wurde ein Vergleich zwischen verschiedenen ED-Digoxin-Konjugaten für die spezifische Inhibierung der Komplementations-Aktivität durch spezifische Analyt-Antikörper durchgeführt. In dem nachstehend dargestellten Experiment wurde die Komplementations-Aktivität des Enzym-Donors, der mit EA22 gekuppelt war, normalisiert. Es wurden Digoxin-Konjugate der verschiedenen ED wie vorstehend beschrieben hergestellt, jedoch mit der Ausnahme für ED4 (2- Digoxin) der Kupplungs-pH-Wert auf pH 9,5 erhöht wurde, um das Digoxin-Maleimid sowohl an die α-Aminogruppe als auch an das Cystein, das von der α-Region entfernt war, zu kuppeln. Die Antidigoxin-Antikörper- und Ziegen-Antikaninchen-Antikörper-Konzentrationen wurden beide normalisiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle IX angegeben. Tabelle IX Inhibierung der Komplementation durch Analyt-spezifische Antikörper Enzym-Donor % Inhibierung der Komplementation

15. Verbesserte Thyroxin- und Digoxin-Assays durch Verwendung eines sekundären Antikörpers

Die Thyroxin- und Digoxin-Enzym-Komplementation-Immunoassays wurden mit einem sekundären Antikörper durchgeführt.
Der Thyroxin (T4)-Assay wurde weiter verfeinert mit EA22 und ED4 auf einem Zentrifugal-Analysator, Modell EN- CORE® von der Firma Baker Instruments (Allentown, PA). Das Assay-System bestand aus 10 ul Patienten-Probe, 100 ul Enzym-Akzeptor-Reagens, das auch Anti-T4-Antikörper und Salicylat enthielt, und 200 ul Enzym-Donor-Reagens, das auch einen sekundären Ziegen-Antikaninchen-Antikörper und das Substrat o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) enthielt. Die End-System-Konzentrationen waren wie folgt:
Enzym-Akzeptor (EA22) 0. 625·10&supmin;&sup7;M
primärer T4-Antikörper 1/1200
Salicylat 10mM
Enzym-Donor (ED4 -T4) 1/276
sekundärer Ziegen-Antikaninchen-Antikörper 1/200
ONPG 0.51 mg/ml
Nach 900 Sekunden wurden Ablesungen durchgeführt. Bei Verwendung verschiedener Patienten-T4-Proben müssen die Änderungen der OD/min aufgetragen werden als Folge von ± 50 m OD-Input bei OD&sub4;&sub0;&sub5; aus den einzelnen Patienten-Proben. Die Fig. 18 zeigt einen T4-Assay mit Eichsubstanzen, die in Gesamt-Humanserum hergestellt wurden. Die Änderung der Extinktion zwischen den Eichsubstanzen bei 900 s sind gegen die Serum-T4-Konzentration aufgetragen.
Der Digoxin-Assay wurde verfeinert unter Verwendung von ED5 und EA22 und des Baker ECORE® Zentrifugal-Analysators. Es wurden Digoxin-Standards in Human-Serum hergestellt. Der Assay bestand aus 30 ul Seren, 200 ul ED5-Digoxin-Reagens und 100 ul EA22-Reagens. Das ED5-Digoxin- Reagens enthielt auch das Substrat o-Nitrophenyl-β-D galactopyranosid und Ziegen-Antikaninchen-Antikörper. Das EA22-Reagens enthielt Kaninchen-Antidigoxin-Antikörper. Die End-System-Konzentrationen waren wie folgt
Serum 9.1%
EA22 2·10&supmin;&sup7;
ED5-Digoxin 1 : 1500
primärer Digoxin-Antikörper 1 : 59,400
sekundärer Ziegen-Antikaninchen-Antikörper 1 : 200
ONPG 0.5 ing/ml
Eine Standardkurve für diesen Assay ist in Fig. 19 dargestellt.

16. Vergleich der Leistung von genetisch hergestellten und chemisch synthetisierten Enzym-Donoren in dem Digoxin-Immunoassay

Um die mit chemisch synthetisierten Komponenten und die mit genetisch hergestellten Komponenten durchgeführten Enzym-Immunoassays miteinander zu vergleichen, wurden zwei analoge Enzym-Donoren hergestellt, einer durch rekombinante DNA-Techniken und der andere durch chemische Peptidsynthese. Die Aminosäuresequenzen von ED3, erzeugt durch genetische Herstellung (vgl. Abschnitt 6.1.4), und ED3A, erzeugt durch Polypeptid-Synthese (vgl. Abschnitt 6.1.5), sind in Fig. 14 dargestellt. Die herausragenden Merkmale dieser beiden Peptide sind der analoge Cystein- Rest (Cys), in der Fig. 14 mit einem Stern markiert, die für die chemische Kupplung an den Analyten und die analoge α-Donor-Domäne verwendet werden, die in ED3 zwischen den Aminosäuren Nr. 12 und einschließlich 50 bzw. in ED3A zwischen den Aminosäuren Nr. 5 und einschließlich 43 angeordnet ist und den Aminosäuren Nr. 6 bis 44 der β-Galactosidase vom Wild-Typ entsprechen.
Die Konjugation von Digoxin an ED3 und ED3A wurde mit 3-O-[m-Maleimidophenylcarbamyl]digoxigenin, wie im Abschnitt 13.1 beschrieben, durchgeführt. Präparate von ED3, ED3A, Digoxin-ED3 und Digoxin-ED3A wurden einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) auf einer präparativen HPLC-Henyl-Säule (Waters uBondapak, Waters Assoc., Milford, MA) unterworfen unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in Wasser, das 0,1% TFA als Eluierungsmittel enthielt. Die Säulen-Fraktionen jedes Enzym-Donors wurden im Hinblick auf die Komplementation untersucht, wie im Abschnitt 6.2.1 beschrieben, unter Verwendung von M15 als Enzym-Akzeptor. Der relative Komplementations-Wirkungsgrad von ED3-Dioxin war viermal höher als derjenige von ED3A-Digoxin.
Die Digoxin-ED3 und Digoxin-ED3A entsprechenden Säulen-Fraktionen wurden getrennt gesammelt und in einem konkurrierenden Enzym-Immunoassay für Digoxin miteinander verglichen.
Zur Durchführung des Assays wurde eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verwendet. Der Assay umfaßte 25 ul Humanserum-Standards, 0, 0,5, 1, 2, 4, 10, 100 und 1000 ng/ml Dioxin, 100 ul Reagens I, das 4 · 10&supmin;&sup7; M M15 Enzym- Akzeptor und Digoxin-Antikörper enthielt, und 130 ul Reagens II. Das Reagens II enthielt verschiedene Verdünnungen von Digoxin-ED3 oder Digoxin-ED3A, den sekundären Ziegen- Antikaninchen-Antikörper und 1,1 mg/ml o-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid. Die Ergebnisse nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC und dem Ablesen bei 405 nm in einer Titertek-Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung sind in der Tabelle X angegeben. Wie aus der Tabelle X ersichtlich, wurden die konkurrierenden Immunoassays sowohl mit Digoxin-ED3 als auch mit Digoxin-ED3A durchgeführt. Eine Kurve für Dogoxin bei Verwendung von Digoxin-ED3A ist in der Fig. 17 dargestellt. Der Digoxin-Immunoassay mit Digoxin- ED3 ergab eine bessere Signalunterscheidung bei den niedrigen Dosen von 0,5 und 1 mg/ml als mit Digoxin-ED3A.
Diese Diskrepanz kann zurückzuführen sein auf die Anwesenheit von Verunreinigungen in dem ED3A-Präparat, die während der HPLC-Analyse festgestellt wurden.
Diese Experimente zeigen die Anwendbarkeit sowohl von synthetisierten Polypeptiden als auch von gentechnisch hergestellten Polypeptiden bei der Kontrolle der Komplementation von β-Galactosidase-Polypeptiden durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion. Die chemische Polypeptid-Synthese kann somit angewendet werden zur Erzeugung von Enzym-Donoren zum Zwecke des Nachweises von Proteinen mit einem hohen Molekulargewicht. Gen-Fusionen, die immunologisch reaktive Polypeptid-Epitope codieren, die an die α-Donor-Domäne fusioniert sind, können ebenfalls synthetisiert werden. Die Grenzen für diesen Versuch umfassen nicht nur die Fähigkeit zur Synthese immer größerer Polypeptide gemäß Stand der Technik, sondern auch die Kenntnis der Sequenz sowohl der erforderlichen α-Donor-Domäne als auch der immunologisch reaktiven Protein-Domäne. Tabelle X Digoxin-Assay mit ED3 und ED3A Konjugat-Verdünnung Digoxin-Dosis ng/ml

17. Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden E. coli-Stämme, welche die aufgelisteten Plasmide tragen, wurden bei In Vitro International, Inc. (IVI), Ann Arbor, MI, oder bei der Agricultural Research Culture Collection (NPRL), Peoria, IL hinterlegt und ihnen wurden die folgenden Hinterlegungsnummern zugeteilt: E. Coli-Stamm Plasmid Hinterlegungs-Nummer
Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10034 und der Stamm JM83, IVI 10037 enthalten die Plasmide p122 bzw. p157, die Gene tragen, die für Fusionsproteine eines Teils des Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens und eines α-Donors codieren, wie in den Abschnitten 8.1 und 9 beschrieben. Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10035 enthält das Plasmid p125, wie im Abschnitt 6.1.1 beschrieben, welches ein Gen trägt, das für einen Enzym-Donor codiert. Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10038 und der Stamm JM83, IVI 10036 enthalten jeweils die Plasmide pF29 bzw. p150, wie in dem Abschnitt 6.2 beschrieben, wobei p150 ein Gen trägt, das für einen Enzym-Akzeptor codiert. Der E. coli-Stamm AMA 1004, IVI 10050 enthält das Plasmid pMG14, das ein Gen für ein β- Galactosid-Protein (einen Enzym-Akzeptor) trägt mit deletierten (ausgelöschten) Aminosäuren Nr. 30 bis 37 (vgl. Fig. 5). Der E. coli-StammAMA 1004, IVI 10051 enthält das Plasmid pMG22, das ein Gen für ein β-Galactosidase-Protein (einen Enzym-Akzeptor) trägt, bei dem die Aminosäuren Nr. 13 bis 40 deletiert (ausgelöscht) sind (vgl. Fig. 5). Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10052 enthält p169, ein Plasmid, das ein Gen trägt, das für ein Fragment (EDH6) von β-Galactosidase codiert, das einen Cystein-Rest an der Aminosäure Nr. 62 und einen Lysin-Rest an der Aminosäure Nr. 64 aufweist (vgl. Abschnitt 6.1.2). Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10053, enthält p-183, ein Plasmid, das ein Gen trägt, das für ein Fragment (ED3) von β-Galactosidase codiert, das einen Cystein-Rest an der Aminosäure Nr. 3 aufweist (vgl. Abschnitt 6.1.4). Der E. coli-Stamm E9001, IVI 10054 enthält p185, ein Plasmid, das ein Gen trägt, das für ein Fragment (ED5) von β-Galactosidase codiert, das einen Cystein-Rest an der Aminosäure Nr. 39 aufweist (vgl. Abschnitt 6.1.6). Der E. coli-Stamm AMA 1004, NRRL B-18006 enthält das Plasmid p175, das ein Gen trägt, das für ein Fusionsprotein der Carboxy-Termini des B-hCG-Proteins und einen α-Donor codiert, wie im Abschnitt 11 beschrieben und in Fig. 20 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung ist in bezug auf ihren Schutzumfang nicht beschränkt durch die hinter legten Mikroorganismen, da die hinterlegten Ausführungsformen einzelne Erläuterungen bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung darstellen und beliebige Mikroorganismen, die funktionelle äquivalent sind, ebenfalls innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen. Tatsächlich sind für den Fachmann auf diesem Gebiet aufgrund der Angaben in der vorhergehenden Beschreibung und in den beiliegenden Zeichnungen verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den dargestellten und beschriebenen ohne weiteres ersichtlich. Diese Modifikationen fallen ebenfalls unter die beiliegenden Patentansprüche.
Es ist auch selbstverständlich, daß alle Basenpaaren (bp)-Größen, die für Nucleotide angegeben sind, ungefähre Angaben sind und zur Erläuterung der Erfindung verwendet wurden.

Claims

1. Enzym-Ergänzungstestverfahren zur Bestimmung der Menge eines er warteten Analyten in einer Probe, umfassend die Stufen:

(a) der Bildung eines Reaktionsgemischs durch Kombination in einem Medium von (1) der Probe; (2) einem Enzym-Donor-Polypeptid- Konjugat; (3) einem Analyten-bindendem Protein, das spezifisch für den Analyten ist; (4) einem Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat geeignet ist, zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit der katalytischen Aktivität von β-Galactosidase; und (5) einem Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlungsrate durch das aktive Enzym überwacht werden kann, wobei das Enzym-Donor-Konjugat zur konkurrierenden Bindung an das den Analyten-bindende Protein und an den Enzym- Akzeptor geeignet ist, wobei das den Analyten-bindende Protein die Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes in Abwesenheit des Analyten inhibiert, und wobei die Konzentrationen des den Analyten-bindenden Proteins, des Enzym-Akzeptors und des Enzym-Donor- Konjugats derart sind, daß die Menge des in dem System festgestellten Analyten direkt mit der Umwandlungsrate des Substrates variiert;

(b) des Messens der Umwandlungsrate des Substrats in dem Reaktionsgemisch; und

(c) der Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe durch Vergleich der Umwandlungsrate des Substrats mit den Umwandlungsraten des Substrats, erhalten unter Verwendung einer bekannten Konzentration des Analyten, und

(d) der Verwendung eines Enzym-Donor-Polypeptids, hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure, mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen, wobei die reaktive Gruppe geeignet ist zur kovalenten Bindung an Analyt oder Analyt-Derivat, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Donor- Konjugat und Enzym-Akzeptor unter Bildung eines aktiven Enzym- Komplexes oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor- Konjugat an das den Analyten-bindende Protein und Enzym-Akzeptor, einzugreifen

2. Enzym-Ergänzungstestverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Menge eines vermuteten Analyten in einer Probe, umfassend die Stufen:

(a) der Bildung eines Reaktionsgemischs durch Kombination in einem Medium von (1) der Probe; (2) einem Enzym-Donor-Polypeptid- Konjugat; (3) einem Analyten-bindenden Protein, das spezifisch für den Analyten ist; (4) einem Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das geeignet ist zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat, zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit der katalytischen Aktivität von β-Galactosidase; und (5) einem Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlungsrate durch das aktive Enzym überwacht werden kann, wobei das Enzym-Donor-Konjugat geeignet ist zur konkurrierenden Bindung an das den Analyten-bindende Protein und an den Enzym-Akzeptor, wobei das den Analyten-bindende Protein die Bildung des aktiven Enzym-Komplexes in Abwesenheit des Analyten inhibiert, wobei die Konzentrationen von den Analyten-bindendem Protein, Enzym-Akzeptor und Enzym-Donor-Konjugat derart sind, daß die Menge an in dem System festgestelltem Analyten direkt mit der Umwandlungsrate des Substrats variiert, wobei das Enzym- Donor-Polypeptid-Konjugat ein Enzym-Donor-Polypeptid mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen umfaßt, wobei diese reaktive Gruppe kovalent an einen Analyten oder ein Analyten-Derivat gebunden wird, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Donor-Konjugat und Enzym-Akzeptor unter Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor-Konjugat an den Analyten-bindendes Protein und Enzym-Akzeptor, einzugreifen, und

(b) des Messens der Umwandlungsrate des Substrats in dem Reaktionsgemisch; und

(c) der Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe durch Vergleich der Umwandlungsrate des Substrats mit den Umwandlungsraten des Substrats, erhalten unter Verwendung einer bekannten Konzentration des Analyten,

(d) der Verwendung mindestens eines Enzym-Donor- oder Enzym-Akzeptor-Polypeptids, hergestellt durch rekombinante DNA-Techniken, zur Erhöhung der Affinität, die konstant für die Wechselwirkung von Enzym-Donor-Konjugat und Enzym-Akzeptor ist.

3. Enzym-Ergänzungstestverfahren zur Bestimmung der Menge eines vermuteten Analyten in einer Probe, umfassend die Stufen:

(a) der Bildung eines Reaktionsgemischs durch Kombination in einem Medium von (1) der Probe; (2) einem Enzym-Donor-Polypeptid- Konjugat; (3) einem Analyten-bindenden Protein, das spezifisch für den Analyten ist; (4) einem Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das geeignet ist zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat, zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit der katalytischen Aktivität von β-Galactosidase; und (5) einem Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlungsrate durch das aktive Enzym überwacht werden kann, wobei das Enzym-Donor-Konjugat geeignet ist zur konkurrierenden Bindung an das den Analyten-bindende Protein und an den Enzym-Akzeptor, wobei das den Analyten-bindende Protein die Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes in Abwesenheit von Analyt inhibiert, wobei die Konzentrationen an Analyten-bindendem Protein, Enzym-Akzeptor und Enzym-Donor-Konjugat derart sind, daß die Menge des in dem System festgestellten Analyten direkt mit der Umwandlungsrate des Substrats variiert;

(b) des Messens der Umwandlungsrate des Substrats in dem Reaktionsgemisch; und

(c) der Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe durch Vergleich der Umwandlungsrate des Substrats mit den Umwandlungsraten des Substrats, die man unter Verwendung einer bekannten Konzentration des Analyten enthält, und

(d) der Verwendung eines Enzym-Donor-Polypeptids, hergestellt durch chemische Polypeptid-Synthesetechniken, mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure, mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen, wobei diese reaktiven Gruppen geeignet sind zur kovalenten Bindung an Analyt oder Analyten-Derivat, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Oonor-Konjugat und Enzym-Akzeptor unter Bildung eines aktiven Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor-Konjugat an Analyten-bindendes Protein und Enzym-Akzeptor, einzugreifen.

4. Enzym-Ergänzungstestverfahren zur Bestimmung der Menge eines vermuteten Analyten in einer Probe, umfassend die Stufen:

(a) der Bildung eines Reaktionsgemischs durch Kombination in einem Medium von (1) der Probe; (2) einem Enzym-Donor-Polypeptid- Konjugat; (3) einem Analyten-bindenden Protein, das spezifisch für den Analyten ist; (4) einem Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das geeignet ist zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat, unter Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit der katalytischen Aktivität von β-Galactosidase; und (5) einem Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlungsrate durch das aktive Enzym überwacht werden kann, wobei das Enzym-Donor-Konjugat geeignet ist zur konkurrierenden Bindung an das den Analyten-bindende Protein und an den Enzym-Akzeptor, wobei das den Analyten-bindende Protein die Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes in Abwesenheit des Analyten inhibiert, wobei die Konzentrationen an den Analyten-bindendem Protein, Enzym-Akzeptor und Enzym-Donor-Konjugat derart sind, daß die Menge des in dem System festgestellten Analyten direkt mit der Umwandlungsrate des Substrats variiert; wobei das Enzym-Donor-Polypeptid-Konjugat ein Enzym-Donor-Polypeptid mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen, umfaßt, wobei diese reaktive Gruppe kovalent an einen Analyten oder ein Analyten-Derivat gebunden wird, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Donor-Konjugat und Enzym-Akzeptor zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor-Konjugat an den Analyten-bindendes Protein und Enzym-Akzeptor, einzugreifen und

(b) des Messens der Umwandlungsrate des Substrats in dem Reaktionsgemisch; und

(c) der Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe durch Vergleich der Umwandlungsrate des Substrats mit den Umwandlungsraten, erhalten unter Verwendung einer bekannten Konzentration des Analyten, und

(d) der Verwendung eines Enzym-Akzeptor-Polypeptids mit verbesserter Stabilität gegen oxidierende Bedingungen, wobei dieses Enzym- Akzeptor-Polypeptid, einen oxidierbaren Aminosäurerest aufwies, der mittels rekombinanter DNA-Änderung eines Gens, das für einen weniger stabilen Enzym-Akzeptor kodiert, entfernt wurde.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, worin das den Analyten-bindende Protein ein Antikörper ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, worin das Enzym-Donor-Polypeptid ED3 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED4 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED5 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED7 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid EDB mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED13 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED14 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED15 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid ED17 mit der folgenden Aminosäuresequenz ist:

15. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Enzym-Akzeptor EA22 ist, der ein β-Galactosidase-Enzym-Molekül darstellt, das eine Sequenz-Streichung der Aminosäuren 13 - 40 aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Enzym-Donor-Polypeptid ED3A mit folgender Aminosäuresequenz ist:

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym-Donor- Polypeptid geeignet ist zur Wechselwirkung mit einem Enzym-Akzeptor, unter Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes, mit einer Aktivität, die charakteristisch für β-Galactosidase ist und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin das Enzym-Donor- oder Enzym-Akzeptor-Polypeptid hergestellt ist durch rekombinante Technik unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Vectors, umfassend: eine DNA-Sequenz, die für ein Enzym-Donor-Polypeptid oder ein Enzym- Akzeptor-Polypeptid kodiert, das geeignet ist zur Wechselwirkung mit einem Enzym-Akzeptor bzw. einem Enzym-Donor, unter Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit für β-Galactosidase charakteristischer Aktivität, wobei der Enzym-Donor eine reaktive Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen aufweist, wobei diese reaktive Gruppe geeignet ist zur kovalenten Bindung an einen Analyten oder ein Analyten-Derivat, ohne in die Wechselwirkung des Enzym-Donor-Konjugats und des Enzym-Akzeptors zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor-Konjugat an den Analyten-bindendes Protein und Enzym- Akzeptor, einzugreifen.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend die Verwendung eines Systems, welches die folgenden Bestandteile umfaßt:

(1) ein Enzym-Donor-Konjugat, umfassend ein Enzym-Donor-Polypeptid, hergestellt unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen, wobei diese reaktive Gruppe geeignet ist zur kovalenten Bindung an einen Analyten oder ein Analyten- Derivat, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Donor-Konjugat und Enzym-Akzeptor zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor-Konjugat an den Analyten-bindendes Protein und Enzym-Akzeptor, gekuppelt an einen Analyten, einzugreifen;

(2) ein Analyten-bindendes Protein, das für den Analyten spezifisch ist;

(3) ein Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das geeignet ist zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat, zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit katalytischer Aktivität, die charakteristisch für β-Galactosidase ist; und

(4) ein Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlung durch das aktive Enzym überwacht werden kann;

wobei das Enzym-Donor-Konjugat, das den Analyten-bindende Protein, der Enzym-Akzeptor und das Substrat jeweils in Mengen vorhanden sind, die zur Bestimmung eines Analyten ausreichen.

20. Verfahren nach Anspruch 3, umfassend die Verwendung eines Systems, welches die folgenden Bestandteile enthält:

(1) ein Enzym-Donor-Konjugat, enthaltend ein Enzym-Donor-Polypeptid, hergestellt unter Anwendung chemischer Polypeptid-Synthesetechniken, mit einer eingeführten oder substituierten Aminosäure, mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe von Sulfhydryl-, Amino- und Carboxylgruppen, wobei diese reaktive Gruppe geeignet ist zur kovalenten Bindung an einen Analyten oder ein Analyten-Derivat, ohne in die Wechselwirkung von Enzym-Donor- Konjugat und Enzym-Akzeptor unter Bildung eines aktiven Enzym- Komplexes, oder in die konkurrierende Bindung von Enzym-Donor- Konjugat an den Analyten-bindendes Protein und den Enzym-Akzeptor, gekuppelt an einen Analyten, einzugreifen;

(2) ein den Analyten-bindendes Protein, das für den Analyten spezifisch ist;

(3) ein Enzym-Akzeptor-Polypeptid, das zur Wechselwirkung mit dem Enzym-Donor-Konjugat zur Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes mit katalytischer Aktivität, die charakteristisch für β-Galactosidase ist, geeignet ist; und

(4) ein Substrat, das geeignet ist zur Reaktion mit dem aktiven Enzym-Komplex, derart, daß seine Umwandlung durch das aktive Enzym überwacht werden kann,

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das System darüberhinaus umfaßt: einen Satz von analytischen Standard-Lösungen in Konzentrationen, die dem erwarteten Konzentrationsbereich des Analyten äquivalent sind.