DE69028104T2

DE69028104T2 - Verfahren zur proteinbindung-enzym-komplementationstests

Info

Publication number: DE69028104T2
Application number: DE69028104T
Authority: DE
Inventors: Daniel Henderson
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Microgenics Corp
Priority date: 1989-05-05
Filing date: 1990-05-04
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2010-05-05
Also published as: DE69028104D1; ES2093026T3; EP0472593A1; EP0472593A4; AU5664790A; WO1990013569A1; EP0472593B1

Description

Das Fachgebiet der vorliegenden Erfindung sind Enzymimmunassays.
Der Stand der Technik zeigt viele Immunassays, die auf der bahnbrechenden Entwicklung des Radioimmunassays (RIA) von Yalow und Berson. 1960. J. Clin. Invest. 39:1157 basieren. RIAs sind durch konkurrierende fixe Mengen radiomarkierter Analyten mit unbekannten Mengen unmarkierter Analyten um fixe Mengen an spezifischem Antikörper gekennzeichnet. Die Menge an radioaktivem Analyt, der entweder antikörpergebunden oder frei in Lösung ist, wird in einem geeigneten Zähler quantifiziert und die Konzentration an nicht-radioaktivem Analyten bestimmt. Verbesserungen dieses allgemeinen Schemas umfaßten: (1) die Substitution des radioaktiven Tracers durch Enzym oder fluoreszierende Tracer, (2) die Substitution polyklonaler Tier-Antikörper mit monoklonalen Antikörpern, (3) verbesserte Verfahren des Signalnachweises einschließlich Spektrophotometern, Fluorometern, Fluoreszenzpolarisatoren und Teilchenzählern, und (4) die Einführung homogener Assays, die keine physikalische Trennung des gebundenen Tracers vom freien Tracer erfordern. Die Trennung des gebundenen Tracers vom freien Tracer erfordert oft feste Trägermaterialien wie z.B. Kunststoff, Papier, Glas oder Acrylamid. Üblicherweise ist der Antikörper an der festen Phase gebunden, während sich Tracer und unbekannte Stoffe frei in Lösung befinden. Die gebunden/frei-Trennung erfolgt durch eine oder mehrere Waschvorgänge der festen Phase. Die gebundene Restaktivität wird dann gemessen. Diese Assays sind unter dem Sammelbegriff heterogene Immunassays bekannt. Homogene Assays hingegen machen die ungenauen und zeitaufwendigen Trennungsschritte überflüssig.
Aufgrund der Kommerzialisierung der Immunassays ist eine Verschiebung bei der Verwendung von Radioimmunassays von enzymgebundenen Immunsorptionsassays (ELISA) zu homogenen Assays eingetreten. Diese Verschiebung ist auf kommerzielle Erfordernisse wie Geschwindigkeit. Einfachheit, Automatisierung und Fehlen von Radikoaktivität zurückzuführen. Homogene Assays bestehen aus verschiedenen Arten: (1) Nephelometrie, (2) Teilchenzählung, (3) Fluoreszenzquenchen, (4) Fluoreszenzpolarisierung und (5) Enzymassays.
Das erste Nephelometer, das die Lichtdispersion mißt, um Immunreaktionen zu quantifizieren, wurde in den späten 60er Jahren entwickelt. Diese frühen Nephelometer wurden zehn Jahre später dank neuer Chemien, geringerer Winkel zur Messung von Dispersionswinkeln und der Fähigkeit, die Rate der Antigen-Antikörper-Reaktion während der ersten Sekunden nach dem Vermischen der Reaktanden zu messen (Ritchie, Alper und Graves, 1969, Arthritis Rheum 12:693; Deaton et al.. 1976. Clin. Chem. 22:1465), weiterentwickelt. Diese Assays wiesen eine extrem schlechte Empfindlichkeit auf und eignen sich nur für Bestimmungen von Analyten bei Konzentrationen von mehr als 10&supmin;&sup8; M, z.B. von IgE-, IgA- und IgM-Werten. Bei homogenen Teilchenzählassays werden Polystyrolteilchen mit einem Durchmesser von 0,8 µm (Latexteilchen) mit Antikörpern beschichtet. Die Antigenkonzentrationen können anhand der Konzentration der agglutinierten Latexteilchen ermittelt werden, was durch ein Instrument bestimmt wird, das zwischen agglutinierten und nicht-agglutinierten Teilchen unterscheiden kann (Cambiaso et al., 1977, J. Immunol. Meth. 18:33). Homogene Fluoreszenzquench-Assays markieren entweder Antigene oder Antikörper mit einem Fluorophor. Analyt-Antikörper-Fluorophor-Komplexe ergeben bedeutend weniger Fluoreszenz als Antigen-Fluorophor oder Antikörper-Fluorophor alleine (Ullman et al., 1979, J. Biol. Chem. 251:4172: US-A-3.998.943; 3.996.345; 4.174.384; 4.161.515; 4.208.479 und 4.160.016). Alle diese Assays umfassen verschiedene Verfahren des Quenchens von Fluoreszenz, sodaß die Menge des Quenchens mit der Menge des unbekannten Analyten oder Antikörpers in der Probe in Beziehung steht. Diese Assays sind von geringer Empfindlichkeit (Analyten bei Flüssigkeitskonzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M). Die geringe Empfindlichkeit ist auf endogene Serumfluoreszenz und die Verwendung von Fluoreszenz in statischer, nicht-enzymatisch amplifizierter Weise zurückzuführen. Fluoreszenzpolarisations- Assays basieren auf der freien Rotation von Antigen-Fluorophor in Lösung, welche freie Rotation durch Antikörperbindung an das Antigen-Fluorophor beträchtlich reduziert wird, und diese Assays waren bei niedermolekularen Analyten (d.h. mit einem Molekulargewicht von unter 1000 Dalton) kommerziell sehr erfolgreich sind (Dandliker et al., 1973, Imunochemistry, 10:219).
Die verschiedenen Immunassayverfahren besitzen bezüglich ihrer kommerziellen Verwendung jeweils Vor- und Nachteile. RIAs sind empfindlich und leicht zu entwickeln, erfordern jedoch Radioaktivität. Trennungsschritte und teure Geräte. Bei heterogenen Assays mit Enzymen oder Fluorophoren fallen die Radioaktivität und einige Geräte weg, doch sie benötigen Trennungsschritte. Vom kommerziellen Standpunkt ist es aus verschiedeen Gründen wünschenswert, Trennungsschritte zu eliminieren. Trennungen sind (1) arbeitsaufwendig, (2) zeitaufwendig, (3) sie erfordern zusätzliche Ausstattung, (4) sie erhöhen die Variabilität der Ergebnisse und (5) sie schließen ein hohes Maß an Automatisierung aus. Trotz der zahlreichen kommerziellen Vorteile homogener Immunassays konnten nur drei Systeme, das enzymmarkierte System von Rubenstein et al., US-A-3.817.837, das substratmarkierte System von Burd et al.. 1977, Clin. Chem. 23:1402 und die Fluoreszenzpolarisation (Dandliker et al., 1973. Immunochemistry) erfolgreich kommerziell eingesetzt werden. Diese drei Assaysysteme jedoch sind auf Analyten mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als 1000) und Analyten, die in Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M vorhanden sind, beschränkt.
Enzymimmunassays waren eine sehr erfolgreiche Art des homogenen Immunassays. Verschiedene Varianten homogener Enzymimmunassays hatten kommerziellen Erfolg: (1) das enzymmarkierte Analytensystem und (2) das substratmarkierte Analytensystem. Im enzymmarkierten System nimmt die enzymatische Aktivität ab, wenn spezifischer Antikörper den Analyten-Enzym-Komplex bindet. Der zu messende Analyt konkurriert mit einer fixen Menge an spezifischem Antikörper um eine fixe Menge des Analyten. Die Enzymaktivität ist direkt proportional zur unbekannten Analytenkonzentration. Die folgenden Patentveröffentlichungen basieren auf diesem Immunassaysystem: US-A-3.817.837, 3.852.157, 3.875.011, 3.966.556, 3.905.871, 4.065.354, 4.043.872, 4.040.907, 4.039.385, 4.046.636, 4.067.774, 4.191.613 und 4.171.244. Die Kommerzialisierung dieser Technologie war auf niedermolekulare Analyten und eine geringe Empfindlichkeit beschränkt (Analyten mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton bei Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M).
Der substratmarkierte Fluoreszenz-Immunassay umfaßt das kovalente Kuppeln des Analyten an ein fluorogenes Substrat für ein Enzym. Dieses Analyt-Substrat-Konjugat ist nicht fluoreszierend. In Abwesenheit von Antikörper wird das Analyt-fluorogene Substrat durch ein Enzym hydrolysiert wodurch eine fluoreszierende Molekularspezies entsteht. In der Gegenwart von spezifischem Antikörper wird der Zugang zum Substrat durch das Enzym eingeschränkt was eine verringerte Fluoreszenz ergibt (Burd et al.. 1977, Clin. Chem. 23:1402; Burd et al., Anal. Biochem. 77:56; und Kohen, Hollander und Boguslaski, 1979, J. Steroid Biochem. 11:161). Die Kommerzialisierung dieses Assaysystems war bisher aufgrund sterischer Überlegungen auf niedermolekulare Analyten und aufgrund der gleichen Überlegungen wie bei den oben beschriebenen Fluoreszenzquench-Assays auf Analyten in Flüssigkeiten bei Konzentrationen von mehr als 10&supmin;¹&sup0; M beschränkt.
Es wurden zahlreiche homogene Enzymimmunassays beschrieben, die eine begrenzte Kommerzialisierung erfuhren.
US-A-4.134.792 beschreibt ein Immunassayverfahren unter Verwendung eines Immunmodulators, wie z.B. eines Enzymhemmers oder eines allosterischen Effektors, als Markierung. Wenn sich spezifischer Antikörper an einen Enzymmodulator-markierten Analyten bindet, kann der Enzymmodulator die Aktivität des Enzyms nicht länger hemmen. Somit stellt die Konkurrenz des Enzymmodulator-markierten Analyten durch freien Analyten die Hemmung des Enzymmodulators wieder her. Andere relevante Patentveröffentlichungen sind US-A-3.935.074, 4.130.462, 4.160.645 und 4.913.983.
US-A-4.2 13.893 und 4.318.983 beschreiben Enzymimmunassays unter Verwendung von Cofaktor-Apoenzym-Systemen Insbesondere beschreibt US-A-4.3 18.983 (Hornby et al. erteilt am 9.März 1982) ein Verfahren unter Verwendung von Flavinadenindinukleotid- (FAD) markierten Konjugaten und Apoenzymen, mit denen FAD als prosthetische Gruppe wechselwirkt. US-A-4.213.893 (Carrico et al., erteilt am 22.Juli 1980) beschreibt spezifische FAD-markierte Konjugate, z.B. FAD-markiertes Thyroxin, die sich für das Verfahren gemäß Hornby et al. eignen. FAD-markierte Konjugate werden durch Messen der Holoenzymaktivität überwacht, die durch Inkubation eines solchen Konjugats mit einem Apoenzym, das FAD für die katalytische Aktivität benötigt, entsteht. Ein Analyt wird solcherart kovalent an FAD gekuppelt, daß der markierte Cofaktor seine Reaktivität mit Dehydrogenase-Enzymen beibehält. Die Menge an durch die Dehydrogenase-Aktivität gebildetem reduziertem FAD nimmt in Gegenwart von für den Analyten spezifischen Antikörper ab. Das fluorometrisch überwachte Auftreten von reduziertem FAD ist direkt proportional zur Analytenmenge (Cohen et al., 1978, in: Enzyme-Labeled Immunoassay for Hormones and Drugs, S.N. Pal. Hg. Walter deGuiter, Berlin and New York, S.67-79). Ein ähnliches System für Biotin und 2,4-Dinitrofluorbenzol-Analyten mittels Milch-Dehydrogenase und Diaphorase wurde beschrieben (Carrico et al., 1976, Anal. Biochem. 73:271). Beide Systeme weisen den Nachteil der Störung durch endogene Cofaktoren und Enzyme, die in den zu analysierenden Serumproben häufig auftreten, auf.
Es wurden verschiedene Enzyme untersucht, die sich aus Peptidfragmenten rückbilden, doch nur einige wenige erlangen die enzymatische Aktivität wieder. z.B. Ribonuklease A (Richards und Vithayathil, 1959, J. Biol. Chem. 234:1459), Staphylokokken-Nuklease (Light et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:2285) und β-Galactosidase (Langley und Zabin, 1976, Biochemistry 15:4866). Die Proteolyse von Rinderpankreas-Ribonuklease durch Subtilisin ergibt zwei Komponenten, ein Peptid (S-Peptid) und ein Protein (S-Protein). Weder S-Peptid noch S- Protein alleine zeigen eine nennenswerte Ribonuklease-Aktivität. Beim Vermischen dieser Komponenten in Moläquivalenten wird fast die gesamte enzymatische Aktivität wiederhergestellt. S-Peptid und S-Protein reassoziieren sehr rasch und stark mit einem Keq = 5 x 10&supmin;&sup9; M (Richards und Vithayathil, 1959, s.o.). Staphylokokken-Nuklease zeigt eine Rückbildung von biologisch aktivem Enzym aus inaktiven Peptidfragmenten. Nuklease-T (6-48), einschließlich der Aminosäuren 6-48 der vollständigen, aus 149 Aminosäuren bestehenden Staphylokokken-Nukleasestruktur, reassoziiert mit Nuklease-T (50-149), um aktive Nuklease- T1 mit einer konstanten Rate erster Ordnung von 0.03-0.05/s mit geringer Temperaturvariabilität zu bilden (Licht. s.o.). Wie dies ausführlicher dargelegt ist, sind Polypeptidfragmente (z.B. M15) aus Deletionsmutanten von E.coli bekannt, die ihre enzymatische Aktivität wiedererlangen, wenn sie mit kleinen Peptidfragmenten, die aus thermisch oder mit Bromcyan behandeltem β-Galactosidase-Enzym stammen, kombiniert werden. Ein durch Bromcyan erzeugtes Fragment wird als CNBr2 bezeichnet ein anderes als CNBr24.
In jüngerer Zeit wurde ein Immunassay auf Basis der Reassoziation solcher Polypeptidfragmente durch Farina und Golke (US-A-4.378.428, veröffentlicht am 29.März 1983) und Gonelli et al., (1981, Biochem. and Biophys. Res. Commun. 102:917-923) beschrieben. Alle darin geoffenbarten Versuchsbeispiele basierten auf der Reassoziation von S-Peptidis-Protin, um katalytische Ribonuklease-Aktivität zu bilden. Ein Analyt wurde kovalent an ein kleines Subtilisin-Spaltungspeptid von Ribonuklease, d.h. an S-Peptid (Aminosäuren 1-20), befestigt. Dieses wurde an einen Analyten gekuppelt und mit S-Protein (Aminosäuren 21-124) vereint, um erneut aktive Ribonuklease zu bilden. Für den Analyten spezifischer Antikörper hemmt die Rückbildung der Ribonuklease-Aktivität. Dieser Assay ist aufgrund der Gegenwart endogener Ribonuklease-Aktivität in allen nicht-autoklavierten biologischen Lösungen eingeschränkt.
Andere ebenso große - und nicht beseitigte - Schwachstellen dieses Systems sind die Unfähigkeit, die Gleichgewichtskonstante der assoziierenden Polypeptide einzustellen und immunreaktive Polypeptide zu bilden, die sich an höhermolekulare Proteine kuppeln könnten und weiterhin in der Lage sind, erneut aktives Enzym zu bilden. Alle verwendeten Polypeptide waren keine neuartigen, katalytisch inaktive Peptide, die zur Reassozuerung fähig waren, um aktive Ribonuklease zu bilden.
Man stieß auf noch größere Nachteile mit den durch Farina und Golke (US-A-4.378.428) vorgeschlagenen Chemien, einen Analyten an CNBr2 oder M15 zu befestigen. Die Befestigung eines Analyten über die vorhandenen NH&sub2;-, COOH- und SH-Gruppen auf jedem der beiden Polypeptide ergab in allen untersuchten Fällen Polypeptide, die zu keiner Komplementierung fähig sind. Das Kuppeln an M15, welches viele Amino-, Carbonsäure und Sulfhydrylfunktionalitäten aufweist, inaktivierte M15 in allen Fällen, selbst unter vorsichtig gesteuerten Bedingungen. Die Kinetik zeigt an, daß ein einziger Treffer ausreicht, um die Aktivität zu inaktivieren. CNBr2 enthält keine inneren Lysine, eine einzige Sulfhydrylgruppe und verschiedene Carbonsäuregruppen. In Übereinstimmung mit Langley (Doktorarbeit mit dem Titel "The Molecular Nature of β-Galactosidase α-Complementation", UCLA, 1975) inaktiviert das Kuppeln an die N-terminale α-Aminogruppe die Komplementierungsaktivität von CNBr2. Bei der Herstellung von CNBr2 (Langley, Fowler und Zabin, 1975, J. Biol. Chem. 250:2587) wird das Sulfhydryl an Position 76 vor der Bromcyan-Spaltung reduziert und mit Iodessigsäure alkyliert. Wenn das Sulfhydryl nicht alkyliert ist. kann die CNBr2- Aktivität in den frühen Reinigungsschritten aufrechterhalten werden, doch sie geht vor der Reinigung zur Homogenität verloren. Ebenso wenn das Sulfhydryl mit einem Maleimidderivat eines Analyten anstelle von Iodessigsäure alkyliert wird, verhindert die Unlöslichkeit des Konjugats die Reinigung. Schließlich inaktivierte in allen untersuchten Fällen die Kupplung an eine COOH-Gruppe von CNBr2 die Komplementierungsaktivität. Daher scheint es schwierig zu sein. CNBr2 und M15 zur Herstellung geeigneter immunreaktiver und komplementierender Reagentien zu verwenden.
Es sind aus β-Galactosidase stammende Polypeptidmutanten bekannt, die bei Zugabe zu Extrakten geeigneter β-Galactosidase-negativer Mutanten die Enzymaktivität komplementieren oder spontan wiederherstellen können. Dieses Phänomen ist als intracistronische Komplementierung bekannt. Ein Beispiel der α-Komplementierung ist das M15/CNBr2- Komplementierungssystem. Der M15-Polypeptidmutante fehlen die Aminosäuren 11-41 der β-Galactosidase und sie besteht in Lösung als enzymatisch inaktives Dimer. Ein Polypeptid, das aus β-Galactosidase durch Bromcyan- (CNBr) Spaltung hergestellt wird, das CNBr2- Peptid (CNBr2), besteht aus den Aminosäuren 3-92. CNBr2 fördert, wenn es mit dem Dimer M15 vermischt wird, die spontane Rückbildung des β-Galactosidase-Tetramers mit voller enzymatischer Aktivität (Langley und Zabin, 1976, Biochemistry 15:4866). Das M15-Peptid ist als α-Akzeptor und CNBr2 als α-Donor bekannt. Während dies ein gut untersuchtes Komplementiersystem darstellt, kann CNBr2 als α-Donor für das M112-Dimer dienen, eine Deletion der Aminosäuren 23-31 innerhalb der β-Galactosidase (Lin. Villarejo und Zabin, 1970, Biochem. Biophys. Res. Commun. 40:249; Celeda und Zabin, 1979, Biochem. 18:404; Welphy, Fowler und Zabin, 1981, J. Biol. Chem. 256:6804; Langley et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1254). Andere α-Donoren umfassen ein Polypeptid, das durch das Autoklavieren von β-Galactosidase entsteht. Dieses Peptid wurde jedoch nicht gereinigt, und seine Sequenz ist unbekannt. Andere α-Akzeptoren als M15 und M112 wurden nicht beschrieben. Im Beispiel der Komplementierung von M15 durch CNBr2 sind die Aminosäuren 3-10 und 42-96 beide doppelt im enzymatisch aktiven Komplex vorhanden.
Die intracistronische Komplementierung tritt auch am C-Terminus der β-Galactosidase (dem ω-Bereich) auf. Die bekanntesten verfügbaren Seuqenzdaten betreffen das X90 ω- Akzeptorpeptid, dem die letzten 10 Aminosäuren, 1011-1021, fehlen. Das X90-Peptid besteht als Monomer und kann durch CNBr24, ein Bromcyan-Spaltprodukt der β-Aminosäuren 990- 1023, komplementiert werden, um erneut enzymatisch das aktive Tetramer zu bilden (Welphy et al., 1980, Biochem. Biophys. Res. Common. 93:223).
US-A-4.708.929 beschreibt Komplementierungsassays unter Verwendung zweier Enzymfragmente, z.B. von β-Galactosidase, die in einem Assaymedium kombinierbar sind, um aktives Enzym zu liefern.
Die vorliegende Erfindung bietet neuartige Assays für Liganden und Rezeptoren und Zusammensetzungen zur Verwendung in den Assays, umfassend Enzym-Komplementierungsfragmente, worin das Enzymdonorfragment an einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, wobei der Analyt mit dem konjugierten Bestandteil des spezifischen Bindungspaars kreuzreaktiv oder zu einem solchen konjugierten Bestandteil komplementär ist. Die Reagentien werden mit der Probe in einem geeigneten Assaymedium kombiniert und die Bildungsrate des enzymatischen Produkts als Anzeichen der Gegenwart von Analyten im Medium bestimmt. Die Enzym-Komplementierungsfragmente sind modifizierte Sequenzen, die für die Gegenwart einer Aminosäure mit einer Funktionalität für die Verbindung zum spezifischen Bindungspaarbestandteil sorgen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Assays sowie Reagentien zur Verwendung in den diagnostischen Assays bereitgestellt. Die Reagentien umfassen zwei komplementäre Fragmente, die komplexiert ein aktives β-Galactosidase-Enzym liefern. Es sind ebenso für die mutierten Fragmente kodierende Nukleinsäuresequenzen und Bakterien, die die Sequenzen enthaltenden Vektoren umfassen, bereitgestellt. Verfahren zur Herstellung der mutierten Fragmente, einschließlich der Fusionsproteine mit Aminosäuresequenzen, die die Epitope von Interesse definieren, und Verfahren zum Exprimieren solcher Produkte sind hierin geoffenbart.
β-Galactosidase ist ein Tetramerprotein mit einem Molekulargewicht von 540 kD. Die vier identischen Untereinheiten oder Monomere bestehen aus 1023 Aminosäuren, wobei jede Untereinheit jeweils ein Molekulargewicht von 116 kD aufweist. Das Monomer kann in zwei Abschnitte unterteilt werden, einen α-Abschnitt von etwa 70-100 Aminosäuren des N- Terminus und einen restlichen Abschnitt des Moleküls, der zum Teil den α-Abschnitt überlappen kann. Diese zwei Moleküle können verwendet werden, um sich zu ergänzen und einen Komplex zu bilden, der ein aktives Enzym ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der α-Bereich oder N-terminale Abschnitt als Enzymdonor (ED) und der restliche Abschnitt als Enzymakzeptor (EA) bezeichnet. Der Enzymdonor ist normalerweise das kleinere Fragment, außer wenn er als Fusionsprotein dient. Der Enzymakzeptor ist normalerweise das größere Protein. Der ED ist die Konjugationsstelle.
Die natürliche Sequenz von β-Galactosidase kann durch Insertionen, Deletionen, Substitutionen und Kombinationen davon geändert werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden zumindest zwei Substitutionen verwendet. Eine Substitution umfaßt zumeist das Austauschen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die eine Funktionalität, wie z.B. Sulfhydryl. Amino, Hydroxyl oder Carboxyl, aufweist, die eine Konjugation an dieser Stelle ermöglicht. Zwei der Substitutionen erfolgen zu einem Cystein oder Lysin und sind an den Positionen 68 und 23.
Die Grundsequenz, auf die Bezug genommen wird, ist wie folgt:
Die Zahlen unter den Buchstaben kennzeichnen die Numerierung der Wildtyp-β- Galactosidase.
* Kennzeichnet die möolichen Stellen der Aminosäuresubstitutionen zu C (Cystein) oder K (Lysin)
Bevorzugte Bereiche für Substitutionen umfassen den Bereich etwa von Aminosäure 1 bis Aminosäure 30; von Aminosäure 35 bis Aminosäure 45; von Aminosäure 60 bis Aminosäure 89. Vorzugsweise sind die Substitutionen um zumindest etwa 5 Aminosäuren, noch bevorzugter um zumindest etwa 10 Aminosäuren und am bevorzugtesten von etwa 20 bis 60 Aminosäuren, getrennt. Vorzugsweise wird der Bereich von etwa den Aminosäuren 48 bis 61 nicht zur Substitution herangezogen, obwohl die spezielle Substitutionsstelle wesentlich von der Beschaffenheit des Konjugats abhängt. Somit kann eine Stelle gegenüber einer anderen bevorzugt werden, wenn ein Konjugat im Gegensatz zu einem anderen hergestellt wird.
Die Stellen von besonderem Interesse sind die Aminosäuren 23, 25, 39, 42, 45, 61 und 68. Die Deletionsbereiche umfassen den Bereich von den Aminosäuren 1 bis 20, insbesondere 5 bis 20 oder jede darin befindliche Sequenz. Substitutionsbereiche von Interesse mit Ausnahme einer Konjugationsstelle umfassen den Bereich von etwa 70 bis 85, insbesondere von etwa 72 bis 80, vor allem von 74 bis 77, worin eine größere oder kleinere Anzahl an Aminosäuren eingeführt werden kann und die Substitutionen konvervativ oder nichtkonservativ sein können. Unter "konservativ" ist die gleiche oder im wesentlichen gleiche Ladungsart und allgemein Konformation zu verstehen, z.B. neutrale Aminosäuren können durch andere neutrale Aminosäuren, aromatische Aminosäuren durch andere aromatische Aminosäuren, geladene Aminosäuren durch andere geladene Aminosäuren des gleichen Ladungstyps udgl.. substituiert werden. Außerdem bedeuten konservative Änderungen dasw Beibehalten eines hydrophoben Bereichs im Vergleich zu einem hydrophilen Bereich, wohingegen "nichtkonservativ" die Änderung der Beschaffenheit des Bereichs von hydrophil zu hydrophob oder umgekehrt wäre.
Es können viele verschiedene Verbindungsgruppen zur Verbindung einer Vielzahl unterschiedlicher spezifischer Bindungspaarbestandteile an eine im ED vorhandene Funktionalität verwendet werden. Wie bereits angeführt, ist die auf dem ED zur Verbindung vorhandene Funktionalität zumeists eine Mercaptan- oder Aminogruppe. Bei den Mercaptanen ist vor allem eine Vielzahl an leicht erhältlichen Reagentien von Interesse, z.B. aktiviertes Halogen, aktiviertes Olefin oder Mercapto, wobei die ersten zwei Thioether bilden und das zweite ein Disulfid. Spezifische Verbindungen umfassen N-Maleimidbenzoesäure, α- Bromacetatamidcyclohexancarbonsäure, N-Maleimidbernsteinsäure, Methyldithioessigsäure usw. Bei den Aminogruppen können viele verschiedene aktive Halogene oder Carbonsäuregruppen eingesetzt werden, insbesondere aktivierte Carbonsäuregruppen worin diese mit Carbodiimid, aktiven Estern wie z.B. N-Hydroxysuccinimid, o-Nitrophenol, p-Nitrophenol usw. aktiviert sein können. Die Konjugationsverfahren sind in der Literatur allgemein bekannt und in US-A-3.817.837, 4.262.089, 4.233.401, 4.220.722 und 4.374.925 ausführlich beschrieben.
Die Verbindungsgruppe kann lediglich eine Bindung sein. z.B. wenn der Ligand eine Carbonsäuregruppe autweist, die aktiviert werden kann, um mit der Aminogruppe von ED zu reagieren, oder kann eines oder mehrere Atome außer Wasserstoff sein, üblicherweise von etwa 1 bis 24 Atomen, noch üblicher von etwa 1 bis 12 Atomen. Neben Kohlenstoffatomen können die Atome in der Kette Stickstoff Schwefel. Sauerstoff o.dgl. umfassen.
Neben der Konjugation durch eine chemische Reaktion kann man ein fusioniertes Protein bereitstellen, indem eine Nukleinsäuresequenz gebildet wird, die für den ED, der mit einer Aminosäuresequenz verbunden ist, welche immunologisch mit einem Peptid von Interesse kreuzreaktiv ist, kodiert. Man kann geeignete Stränge von Desoxynukleotiden synthetisieren, die ein Fusionsprotein des Epitops bzw. der Epitope von Interesse mit dem ED liefern, worin das oder die Epitop(e) von Interesse am N- oder C-Terminus des ED, vorzugsweise am N- Terminus, angeordnet sein können.
Das Fusionsprotein kann jede beliebige Größe aufweisen, wobei es üblicherweise nicht mehr als etwa 500 Aminosäuren, noch üblicher nicht mehr als etwa 200 Aminosäuren und vorzugsweise nicht mehr als etwa 150 Aminosäuren einschließlich der ED-Sequenz umfaßt.

Enzymakzeptoren

Der Enzymakzeptor kann ein in der Natur vorkommender oder ein synthetischer sein. Unter "synthetisch" ist die Anwendung rekombinanter DNA-Verfahren zur Bildung der erwünschten Aminosäuresequenz zu verstehen. In den meisten Fällen wird die M15-Sequenz als Grundsequenz für den Enzymakzeptor (EA) verwendet. Von besonderem Interesse ist die Verringerung der Zahl verfügbarer Sulfhydrylgruppen, die in der Sequenz vorhanden sind. EA M15 scheint 5 Cysteinreste auf der Oberfäche verfügbar aufzuweisen. Einige EAs haben möglicherweise aufgrund der Substitutionen des Cysteins, besonders aufgrund konservativer Substitutionen wie G, A, M, S, T usw., weniger als 5 Cysteinreste.

Analyten

Der Analyt kann jeder beliebige Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars sein, das Liganden und Rezeptoren umfaßt, worin ein komplementärer Bestandteil eines Paars eine hohe Affinität für den anderen Bestandteil des Paars aufweist, üblicherweise zumindest etwa 10&supmin;&sup6;/Mol. Die Liganden weisen ein Molekulargewicht von zumindest etwa 125 Dalton und üblicherweise mehr auf, noch üblicher zumindest etwa 150 D, manchmal 500.000 D oder mehr. Meistens besitzen die Liganden ein Molekulargewicht von weniger als 200 kD, noch üblicher von weniger als 100 kD. In vielen Fällen kann, wenn der Ligand ein höheres Molekulargewicht (mehr als 50 kD) aufweist, im Konjugat ein Fragment des Liganden, das mit dem Liganden immunologisch kreuzreaktiv ist, verwendet werden.
In US-A-3.996.345 sind zahlreiche Liganden aufgelistet, Liganden sind zumeist Arzneimittel, Arzneimittel-Metaboliten, biologisch aktive Moleküle wie z.B. Steroide, Vitamine, Proteine, Rezeptoren, Lymphokin-Wachstumsfaktoren usw., industrielle Schadstoffe, Pestizide und ihre Metaboliten, Herbizide und ihre Metaboliten, Geschmacksstoffe, Lebensmittelgifte, Komponenten von Pathogenen. Toxine sowie jede andere Substanz von Interesse.
Rezeptoranalyten können jedes Protein, jede Nukleinsäure oder jedes Saccharid sein., das bzw. die willkürlich als Rezeptor ausgewählt wird und üblicherweise einen Spalt oder eine Oberflächenkonkavität aufweist, wo sich der Ligand bindet. Rezeptoren sind in den meisten Fällen Immunglobuline, Oberflächenmembranproteine, die T-Zellrezeptoren einschließen, MHC-Antigene, Blutproteine wie z.B. Thyroxin-Bindeglobulin, Lipoproteine usw., Enzyme, Avidin u.dgl.
Somit kann jede Verbindung, für die ein komplementärer Bindungsbestandteil gefünden oder gebildet werden kann, durch die vorliegenden Assays bestimmt werden. Der Analyt muß keine einzelne Verbindung sein, sondern kann eine Äggregation von Verbindungen sein, wie man sie z.B. in Mikroorganismen wie z.B. Viren und Bakterien, in Membranfragmenten oder anderen aggregierten oder komplexen Molekülorganisationen vorfindet.

Herstellungsverfahren

Die vorliegenden Polypeptidsequenzen können durch beliebige herkömmliche Mittel hergestellt werden. Somit können die Sequenzen auf im Handel erhältlichen Synthetisierern synthetisiert werden. Wenn die Sequenz jedoch größer als etwa 50 Aminosäuren sein soll, sinkt die Effizienz der Synthese, sodaß andere Verfahren günstiger werden können. Eines der alternativen Verfahren ist die Anwendung rekombinanter Technologie, worin einstrangige Desoxynukleotidsequenzen hergestellt werden, die für Abschnitte der Sequenz von Interesse kodieren oder eine dazu komplementäre Sequenz. Die Stränge sind zumeist überlappend, sodaß beim Hybridisieren und Ligieren die resultierende doppelstrangige DNA-Sequenz für die erwünschte Aminosäuresequenz kodiert. Die Sequenz kann dann in jeden geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden. Es sind zahlreiche Expressionsvektoren im Handel erhältlich oder in der Literatur beschrieben worden. In den meisten Fällen werden prokaryotische Wirte verwendet, doch in einigen Fällen sind eukaryotische Wirte zweckmäßig - besonders dann, wenn Fusionsproteine vorhanden sind und es erwünscht ist, daß das Fusionsprotein verarbeitet wird. Der Vektor umfaßt normalerweise die Kodiersequenz 5' in Transkriptionsrichtung von der Kodiersequenz, einen Transkriptionsinitiations-Steuerungsbereich oder ein Promotor und - 3' vom Kodierbereich in Transkriptionsrichtung - einen Transkriptions- und Translationsterminations-Steuerungsbereich, um eine Expressionskassette bereitzustellen. Besonders zur Transformation in Prokaryoten steht ein Replikationssystem zur Verfügung, das im Wirt fünktional ist und für eine stabile Beibehaltung des Vektors sorgt. Eine Vielzahl an Replikationssystemen wurde identifiziert und in Prokaryoten sowie Eukaryoten verwendet. Normalerweise ist auch ein Marker zur Auswahl jeder Wirtszellen, die mit dem Vektor umwandelt wurden, vorhanden. Zumeist ist der Marker eine Resistenz gegenüber einem Toxin, z.B. einem Antibiotikum, oder ermöglicht die Komplementierung eines auxotrophen Wirten, um Prototrophie zu ergeben.
Die Umwandlung kann durch Transfektion mittels eines viralen Vektors, Protoplastenfusion, Umwandlung mittels kalziumgefällter DNA oder ein anderes zweckmäßiges Verfahren erfolgen. Die Umwandlungsmethoden sind herkömmlich und finden sich in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor, NY 1982.
Auf Wunsch kann die Sequenz eine Signalsequenz zur Sekretion des Polypeptidprodukts aus dem Wirt enthalten. Eine Vielzahl an Signalsequenzen sind verwendbar, insbesondere für eukaryotische Organismen. Ohne Verwendung einer Signalsequenz ist es notwendig, die Zellen zu lysieren, um das erwünschte Polypeptid zu extrahieren.
Die transformierten Wirtszellen können in einem geeigneten Medium über einen ausreichenden Zeitraum, damit das erwünschte Polypeptid gebildet und das Produkt isoliert werden kann, gezüchtet werden, wobei die Vorgangsweise davon abhangt, ob das Produkt ausgeschieden oder im Zytoplasma zurückgehalten wurde. Sobald das Produkt isoliert ist, kann es in herkömmlicher Weise durch Chromatographie, Elektrophorese, Gradienten- Dichtetrennung o.dgl. gereinigt werden.
Der Enzymakzeptor kann in gleicher Weise hergestellt oder aus dem Wirt, der die M15- Sequenz natürlich erzeugt, isoliert werden. Die jeweilige Herstellungsweise des Enzymakzeptors ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend.
Sobald man die Fragmente erhalten hat, können sie - wie zuvor beschrieben - modifiziert werden. Im Falle des Enzymakzeptors können die Sulfhydrylgruppen geschützt oder in anderer zweckmäßiger Weise modifziert werden.

Assay

Die Arbeitsvorschriften für den Assay können abhängig davon ob ein manuelles oder automatisches System verwendet wird, von der Empfindlichkeit des Assays, von der Geschwindigkeit, mit der der Assay durchgeführt werden soll, der Art des Analyten u.dgl. stark variieren. Der Assay kann - wiederum je nach Beschaffenheit des Analyten kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Die verschiedenen Komponenten des Assays können hintereinander oder gleichzeitig zugegeben werden. Die Probe kann zuvor vorbereitet oder oder als solches verwendet werden.
Das Assaymedium ist zumeist bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 8 mit einem herkömmlichen Puffer wie z.B. phosphatgepufferter Salzlösung, Tris o.dgl. gepuffert. Wesentlich dabei ist, daß der Puffer die Enzymreaktion nicht hemmt. Die ionische Stärke ist nicht entscheidend. Die Temperatur des Assays liegt üblicherweise bei etwa 20ºC, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, jedoch unter 60ºC, vorzugsweise unter etwa 40ºC. Die Assays werden bei atmosphärischem Dmck durchgeführt.
Die Konzentration des Enzymdonor-Konjugats im Assaymedium liegt üblicherweise im Bereich von etwa 1 nM bis etwa 60 nM, noch üblicher bei etwa 5 nM bis 50 nM, vorzugsweise bei etwa 10 nM bis 25 nM. Der Enzymakzeptor ist üblicherweise in einem beträchtlichen molaren Überschuß, üblicherweise in zumindest etwa 1,5fachem, vorzugsweise in zumindest etwa 5fachen molaren Überschuß, vorhanden. Die Molverhältnisse des Enzymdonor-Konjugats zum Enzymakzeptor liegen herkömmlicherweise im Bereich von etwa 1:30 bis 1:80, noch üblicher zwischen 1:50 und 1:60. Die Konzentration des Enzymdonor-Konjugats übersteigt üblicherweise die höchste Konzentration des Analyten, die man in der Probe erwartet.
Wenn Ligand im Konjugat vorhanden ist wird das optimale Verhältnis des ED-Analyten- Konjugats und des anti-Analytenantikörpers in der Gegenwart von EA bestimmt, um den dynamischen Bereich des Assays zu überspannen und auch die Hintergrundaktivität zu minimieren. Die Reaktion der enzymkatalysierten Rate auf die Analytenkonzentration wird in Bezug auf den Hintergrundwert optimiert.
Das Verhältnis der Konzentration des BD-Analyten-Konjugats und des anti-Analytenantikörpers ist solcherart, daß unter Assaybedingungen ohne Ligandenanalyt im wesentlichen eine minimale Enzymrate erreicht wird, während die Linearität der mit der Analytenkonzentration variierenden Rate im erwünschten Assaybereich aufrechterhalten wird. Üblicherweise machen die Konzentrationen von Antikörper und Konjugat zumindest etwa 85%, noch üblicher zumindest etwa 95%, der zur Optimierung der Bedingungen erforderlichen Konzentrationen aus.
Verschiedene Probemengen können je nach Konzentration des Analyten der Beschaffenheit der Probe und der Empfindlichkeit des Assays verwendet werden. Wenn der Assay ein Serumassay ist, umfaßt die Probe von etwa 1% bis 10% des Volumens des Assaymediums.
Ein Enzymsubstrat wird verwendet, das bei der Spaltung durch das Enzym zu einer Änderung der Lichtmenge der Absorption (der optischen Dichte) oder der Emission des Assaymediums führt. D.h. das Spalten des Substrats führt zum Auftreten oder zum Verschwinden eines gefärbten oder fluoreszierenden Produkts. Bevorzugte Enzymsubstrate umfassen o-Nitrophenylgalactosid (ONPG) und Chlorphenylrot-β-Galactosid (CPRG). ONPG, CPRG und andere vergleichbare Enzymsubstrate sind im Handel erhältlich. ONPG wird im allgemeinen in einer Konzentration von 0,5 bis 2,0 mg/ml verwendet. Andere Substrate werden in Konzentrationen verwendet, die ein mit ONPG vergleichbares Signal liefern.
Die Probe und das Konjugat werden in einem geeigneten Assaymedium kombiniert. Der EA kann vorhanden sein oder anschließend zugegeben werden. Der komplementäre Bestandteil des spezifischen Bindepaarbestandteus des Konjugats kann als Analyt in der Probe vorhanden sein oder als Reagens zugegeben werden, wobei er normalerweise spätestens beim Kombinieren des ED-Konjugats mit EA vorhanden ist. Man kann jedoch auch die Reihenfolge umkehren und zunächst die Bildung des Enzyms gestatten, gefolgt von der Zugabe des komplementären spezifischen Bindungspaarbestandteils und die Änderung der Enzymaktivität im Lauf der Zeit beobachten. Das Enzymsubstrat kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt zugegeben werden, wird aber üblicherweise nach der Inkubation der verschiedenen Komponenten des Assays zugegeben.
Normalerweise werden nach der Inkubation eine oder mehrere Ablesungen vorgenommen, wobei das Intervall von etwa 30 Sekunden bis etwa 20 Minuten, üblicherweise von etwa 1 bis 10 Minuten, zwischen den Ablesungen reicht. Die Zeit für die erste Ablesung nach der Zugabe von Enzymsubstrat reicht im allgemeinen von 30 Sekunden bis etwa 10 Minuten und liegt noch üblicher innerhalb von etwa 5 Minuten. Man kann zwar auch eine einzige Ablesung vornehmen, doch ist es üblicherweise wünschenswert, mehr als eine Ablesung vorzunehmen, sodaß häufige Fehler ausgeschaltet werden können.
Wünschenswerterweise werden Standardlösungen mit bekannter Analytenkonzentrationen hergestellt, um als Vergleichsstandards mit der Probe zu dienen. Auf diese Weise kann man genau quantitative Bestimmungen erhalten.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Arbeitsvorschriften, durch die man eine Reihe von Enzymendonor- und Enzymakzeptormolekülen, einschließlich der Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, erhalten, untersuchen und verwenden kann, z.B. in diagnostischen Assays. Von den speziell erwähnten Enzymdonormolekülen ist ED 28 mit Substitutionen zu Cys an den Positionen 1 und 46 (Wildtyp-Numerierung) ein erfindungsgemäßer Donor.

BEISPIELE

Enzymdonoren

p125 Enzymdonor

Das Plasmid p125 wurde gentechnisch hergestellt um eine α-Donorsequenz unter die regulierende Steuerung eines durch Temperatur induzierbaren Promotors (λPr) zu geben. Außerdem enthält das exprimierte α-Donorpeptid einen einzelnen Cysteinrest in der Nähe des C-terminalen Endes. Dies wurde durch Spalten des Plasmids pUC 13 mit BglI erreicht, und die resultierenden einstrangigen Termini wurden durch Behandlung mit S1-Nuklease entfernt. Das Plasmid wurde dann mit BamHI gespalten. Das für das β-Galactosidase-α-Gen kodierende DNA-Fragment mit etwa 170 bp wurde dann durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. (Siehe US-A-4.708.929, Fig.2. mit Bezugnahme auf die Figuren in der nachfolgenden Beschreibung, wobei die Figuren der angeführten Patentschrift gemeint sind.)
Das Plasmid pβgal2 ist ein Derivat des Plasmids pCVQ2 (Queen, 1983, J. Molec. Applied Genetics 2:1), das das lac-Operon unter der regulierenden Steuerung des temperaturinduzierbaren λPr-Promotors trägt. Um die regulierenden λ-Sequenzen für andere genetische Konstruktionen zur Verfügung zu stellen, wurde das Plasmid pβgal2 modifiziert. Plasmid pβgal2 wurde mit BamHI und SalI gespalten, und die für das lac-Operon kodierenden DNA- Sequenzen wurden entfernt. Das pBR322-Sequenzen (einschließlich ampr und ori) enthaltende DNA-Fragment und λCI wurden durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Synthetische DNA-Linker, die Erkennungssequenzen für BamHI, EcoRI, HindIII, SalI und XbaI enthalten, wurden ligiert und dann mit BamHI und SalI gespalten, um kürzere Multilinkersegmente mit kohäsiven BamHI- und SalI-Enden zu schaffen. Diese DNA- Fragmente wurden an das aus pβgal2 isolierte BamHI/SalI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid, p121B, enthält EcoRI- und XbaI-Erkennungsstellen zwischen BamHI und SalI des Vektors. Das Plasmid p121B wurde mit BamHI und PvuII gespalten. Das BamHI/PvuII- DNA-Fragment, das das β-Lactamase-Gen (das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht. ampr), das Phagen-λCI-Gen (einen temperaturgesteuerten Repressor) und den Plasmid- Replikationsursprung (ori) enthält, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Das BglI(-)/BamHI-DNA-Fragment aus pUC13 und das BamHI/PvuII-DNA-Fragment aus p121B wurden mittels T4-DNA-Ligase ligiert, wie in Fig.2A gezeigt. Das rekombinante Plasmid wurde in JM83, einen bakteriellen E.coli-Wirt, transformiert, um den einstrangigen Phagen M13 und seine Rekombinante, die für das β-Galactosidase-Mutantenpolypeptid M15 kodiert (Messing, 1979, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publications No.79-99, 2, Nr.2:43-48) zu züchten und das Plasmid p125 wurde ausgewählt. Die in vivo- Komplementierung trat bei 42ºC, aber nicht bei 32ºC ein, was anzeigt, daß das Plasmid p125 ein temperaturinduzierbares β-Galactosidase-α-Protein erzeugt.

Enzymdonoren der H-, B-, M- und P-Reihen

In einer Versuchsreihe wurden zur Bildung von Enzymdonorpeptiden jenes Typs, der eine Analytenkupplungsdomäne umfaßt, α-Bereiche verschiedener Größe aus pUC13 isoliert (Vieira und Messing, 1982, Gene 19:259-268; Messing, 1983, Methods in Enzymology 101:20-78; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) mit HaeII, BglI, MstI oder PvuI gespalten, um die H-, B-, M- bzw. P-Reihe zu ergeben. Die B-, P- und H-Reihen wurden mit T4-DNA-Polymerase und S1-Nuklease behandelt. Die M-Reihen wurden nicht behandelt. Jede DNA-Reihe wurde mit SacI, das sich in der Mehrfach-Klonierstelle befindet, gespalten, und die kleinen, für ein α-Komplementierungspeptid kodierenden DNAs wurden durch Agarose-Gelreinigung gereinigt, auf DEAE-Cellulosepapier einer Elektrophorese unterzogen (Schleicher und Schuell, Keene, NH), eluiert und ethanolgefällt, wie dies durch den Hersteller beschrieben ist.
Das Plasmid p141, das einen E.coli-trp-Promotor (EcoRI-SstI, 120 bp), der an das 2,3 kb- EcoRI-PvuII-Fragment von pBR322 kloniert ist, tragt, wurde mit NdeI gespalten und mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment sowie dATP und dTTP (PL Biochemicals, Milwaukee, WI, USA) behandelt. Die resultierende DNA wurde mit SacI gespalten und als Vektor verwendet, um die M-, B-, H- und P-DNA-Reihen zu erhalten. Nach der Behandlung mit T4- DNA-Ligase wurden die DNAs in den E.coli-Stamm E9001 transformiert (Δlac pro, thi, supE, F', proAB, lacIQ, Z M15, auch als Stamm 71.18 bezeichnet; Messing et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3642-3646). Die DNA-Konstruktionen wurden gemäß dem Verfahren von Maxam und Gilbert sequenziert (1980, Methods in Enzymology, 67:499) und sind in Fig.4 dargestellt. Durch * sind auch die Stellen zur kovalenten Befestigung eines Analyten gekennzeichnet.
Die resultierenden Stämme, die für α-Bereiche unter Trp-Steuerung im E.coli-Stamm E9001 kodieren, waren für die B-Reihe Stamm MG130, der Plasmid p130 trägt; für die M-Reihe Stamm MG129, der Plasmid p129 trägt und für die H-Reihe Stamm MG131, der Plasmid p131 trägt.
Zur Verbesserung der Expressionswerte der unterschiedlichen klonierten α-Bereiche wurden die α-Bereiche auf neue Plasmide übertragen und unter die Kontrolle des λPr-Operator- Promotors gebracht. Z.B. wurde zur Konstruktion von MG141 das für die DNA-Sequenzen von H6 aus der H-Reihe kodierende Gen durch Ersetzen des Trp-Promotors durch die λPr- und λCl-Gene unter Pr-Kontrolle gestellt, wie weiter unten beschrieben.
Das Plasmid p131, das H6 unter Trp-Operator-Promotor-Steuerung enthält, wurde mit EcoRI gespalten und das größere Fragment mit etwa 2,1 kb durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Die λPr und λCI-Gene wurden aus dem kleinen Fragment einer EcoRI-Spaltung von p125 gelgereinigt. Das 2,1 kb-Fragment von p131 wurde an das kleine Fragment von p125 ligiert, wodurch der Trp-Promotor durch das λPr- und λCI-Promotorsystem ersetzt wurde. Diese Arbeitsvorschrift wird mit p130 und p129 wiederholt, um die folgenden Plasmide und Stämme unter λPr-Steuerung zu ergeben: für Reihe B Stamm MG139 (trägt Plasmid p139); für Reihe M Stamm MG140 (trägt Plasmid p140); für Reihe H Stamm MG141 (trägt Plasmid pH6). Die DNA-Konstruktionen wurden gemäß dem Verfahren von Maxam und Gilbert, Methods in Enzymology 67:499 (1980) sequenziert und sind in Fig.4 dargestellt.

Enzymdonor 3

Enzymdonor 3 (ED3) wurde aus Enzymdonor 1 (ED1) konstruiert, der aus H6 konstruiert war. ED1 wurde wie folgt konstruiert:
Die Synthese von DNA-Fragmenten erfolgte auf einem 380A-DNA-Synthesizer von Applied Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, CA, USA). Jede Sequenz wurde in den Programmspeicher eingegeben, und die Maschine stellte den erwünschten DNA-Einzelstrang automatisch her, spaltete jedes Fragment vom Glasträgermaterial mit gesteuerter Porengröße und sammelte die DNA in einem Fläschchen. Die DNA-Proben wurden mit 1,5 ml konzentriertem NH&sub4;OH 6-24 Stunden lang bei 55ºC behandelt und in einem Savant Speed Vac Concentrator bis zur Trockenheit gebracht.
Das getrocknete Pellet jedes DNA-Fragments wurde in einer kleinen Menge Formamid (100- 200 µl) aufgelöst und auf einem 12%-igen Acrylamidgel (BRL Model SO, 34-40 cm, 1,6 mm Dicke) gereinigt und über Nacht bei 200 Volt einer Elektrophorese unterzogen. Die erwünschte Bande wurde mittels Baker-Flex-Silikagel 1B-F (J.T. Baker Chemical Co.) als Fluoreszenzhintergrund sichtbar gemacht. Die erwünschte DNA-Bande wurde mit einer Rasierklinge aus dem Gel geschnitten und die DNA aus dem Acrylamidgel-Fragment in einer UEA-Einheit von International Biotechnologies, Inc. (IBI) gemäß den Anweisungen der Herstellerfirma einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA wurde in einem kleinen Puffervolumen gesammelt und ethanolgefällt. Die Fragmente wurden mit T4-Polynukleotid- Kinase gemäß den Anweisungen der Herstellerfirma behandelt. Die komplementären DNA- Stränge wurden kombiniert, 2 Minuten lang auf 90ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die annelierten DNAs wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, um unhybridisierte Stränge zu entfernen und in den Ligationsreaktionen verwendet.
Das Ausgangsplasmid war p169, das das H6-Gen unter λPr-Steuerung und zwischen den Restriktionsstellen BamHI und SalI eingefügt enthält (siehe Fig. 11). Die Änderung von H6 zu ED1 umfaßte die Änderung des N-Terminus und des C-Terminus von H6 während die α- Domäne dazwischen intakt blieb. Zwei Aliquote von p169 wurden mit Restriktionsenzymen geschnitten. Das erste Aliquot wurde mit EcoRI und BglI gespalten und das kleine 150 bp- Fragment gelgereinigt. Das zweite Aliquot von p169 wurde mit BamHI und SalI gespalten. Dies spaltet das Plasmid in Vektor und den α-Donor-Genbereich. Der Vektorabschnitt wurde gelgereinigt.
Der neue N-terminale Kodierbereich von ED1 war ein 75 bp-DNA-Fragment, das durch die Applied Biosystems, Inc.-Maschine synthetisiert wurde (siehe Fig. 12). Der neue C-terminale Kodierbereich, ein 50 bp-DNA-Fragment, wurde ebenfalls synthetisiert (siehe Fig.12). Die zwei neuen DNA-Fragmente wurden an das kleine EcoRI-BglI-H6-DNA-Fragment ligiert. Diese Mischung wurde mit BamHI und SalI geschnitten um das neue ED-Gen mit etwa 275 bp zu ergeben. Dieses DNA-Fragment wurde gelgereinigt und in das Vektor-Bam-Sal- DNA-Fragment ligiert.
Nach dem Bestätigen der ED1-Sequenz wurde dieses Plasmid (p181, siehe Fig.13) mit BamHI und EcoRI geschnitten, was den 75 bp-ED1-N-Terminus entfernt. Dieser Bereich wurde durch ein neu synthetisiertes 30 bp-Fragment (siehe Fig. 12), das in die Bam-EcoRI- Stelle substituiert wurde, ersetzt.
Somit ist ED3 15 Aminosäuren kürzer als ED1 und besitzt einen Cysteinrest in der Nähe seines N-Terminus. ED1 besitzt kein Cystein oder Lysin in seiner Sequenz. Fig.14 zeigt die Aminosäuresequenz von ED3.

Enzymdonor 3A

Die Aminosäuresequenz von Enzymdonor 3A (ED3A) ist in Fig. 14 dargestellt. Das Peptid wird auf einem 990BN Peptide Synthesizer von Beckman (Palo Alto, CA, USA) synthetisiert. Syntheseverfahren sind wie die von Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, S.176ff, Pierce Chemical Co., Rockford, Il, USA, 1984) beschriebenen. Allgemeine Chemikalien stammen von Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Die BOC-Aminosäuren stammen von den Peninsula Laboratories (Belmont, CA, USA). Der Seitenkettenschutz sind Boc-Thr (OBzl), Boc-Glu (OBzl), Boc-Ser (OBzl), Boc-Asp (OBzl), Cys (MeOBzl), Boc-Asn/HOBT, Boc-Arg (TOS) und Boc-His (TOS). Aminomethylpolystyrol-Festphasen-Harzperlen von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA) werden zu p-Hydroxymethylphenylessigsäure- Boc-Thr (OBzl) mit Dicyclohexylcarbodiimid verestert, wie von Stewart und Young, 1984 beschrieben. Der angewendete Synthesemaßstab ist 1 mMol Boc-Thr, befestigt am Festphasenharz, und 3 mMol jeder Boc-Aminosäure. Das Synthetisiergerät wird dann zur Durchführung der Synthese programmiert. Das resultierende Peptid wird mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure vom Harz gespalten und mit Essigsäure extrahiert. Nach der Hydrierung wurde das Peptid durch eine preparative RP-HPLC mittels einer Waters- Phenylsäule mit einem 0-80% Acetonitrilgradienten in Wasser mit 0,1% TFA und 0,1% Ethanthio gereinigt. Das teilgereinigte Peptid wird gründlich gegen 1 mM NH&sub4;HCO&sub3;, 1 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert und lyophilisiert. Die Aminosäureanalyse des Peptids ist in Tabelle I veranschaulicht. TABELLE 1 AMINOSÄUREANALYSE VON ED3A
Das Molekulargewicht beträgt 4942.53, das durchschnittliche Molekulargewicht einer Aminosäure 114,943.
Zusammenfassend bieten die in Fig.4 gezeigten Polypeptide geeignete Kupplungsseitenketten in verschiedenen Abständen von der erforderlichen α-Komplementierungssequenz. Die DNA- Sequenzen, die für die durch rekombinante Verfahren hergestellte Peptide kodieren, wurden durch das Standardverfahren nach Maxam und Gilbert bestimmt, das die vorhergesagten Strukturen bestätigte. Die Aminosäurezusammensetzung von H6 wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt.

ED-Enzymdonor-Reihe

Eine Reihe von Enzymdonoren mit dem Namen ED-Reihe wurde durch rekombinante DNA- Verfahren konstruiert. ED3 wurde bereits beschrieben. Andere Bestandteile der Reihe sind ED4, ED5, ED7, ED8, ED13, ED14, ED15 und ED17. Die Aminosäuresequenzen der ED- Reihe von Enzymdonoren ist in Fig.15, A-I dargestellt.
Das für ED4 kodierende Gen wurde konstruiert, indem zunächst ein DNA-Fragment der folgenden Sequenz auf einem 280A DNA Synthesizer von Applied Biosystems, Inc. (siehe oben) synthetisiert wurde:
Das mit einem Stern versehene "T" stellt eine Änderung von einem "C" dar. Dieses Fragment wurde an das BamHI-PvuI-Stück aus Plasmid p181 (ED1) ligiert (siehe Fig.13). Das resultierende Stück wurde erneut in den Vektor ligiert (aus ED1-p181), nachdem der BamHI- SphI-Bereich entfernt wurde. Die Änderung von C zu T schafft einen Cystein- (cys) Rest und zerstört die PvuI-Stelle nach der Ligation. (Die kohesiven Enden bleiben für die Ligation die gleichen).
Das für ED5 kodierende Gen wurde konstruiert, indem zuerst ein DNA-Fragment der folgenden Sequenz synthetisiert wurde:
Das mit einem Stern versehene "T" stellt eine Änderung von einem "C" dar. Das mit zwei Sternen versehene "T" stellt eine Änderung von einem "A" dar. Die Änderung von C zu T zerstört die PvuII-Stelle. Die Änderung von A zu T macht aus einem Serinrest einen Cysteinrest. Dieses Fragment wurde an das BamHI-PvuII-Stück und PvuI-SalI-Stücke aus Plasmid p182-(ED2 oder M15) DNA ligiert (siehe Fig.13). Das ligierte Material wurde mit BamHI und SalI geschnitten und in p182 eingesetzt, wobei der BamHI-SalI-Bereich entfernt worden war.
Das für ED7 kodierende Gen wurde durch Schneiden von p183- (ED3) und p184- (ED4) Plasmiden (siehe Fig.13) mit EcoRI und SalI konstruiert. Der Vektor aus p183 wurde gelgereinigt (wodurch der EcoRI-SalI-(α)-Bereich wirkungsvoll entfernt wurde). Der kleine EcoRI-SalI-(α)-Bereich aus p184 wurde gelgereinigt. Der p184-EcoRI-SalI-Bereich wurde dann insertiert und in den p183-EcoRI-SalI-Vektor ligiert.
Das für ED8 kodierende Gen wurde mittels stellenspezifischer Mutagenese in M13mp11- Phagen-DNA hergestellt. Ein Primer wurde gebildet (Sequenz: GGT AAC GCA AGG GRT TTC CCA GTC). Dieser Primer ist komplementär zum Sense-Strang des für die Aminosäuren 15-22 kodierenden Bereichs. Die erwünschte Änderung war von G zu T in Codon 20, was ein Gly in ein Cys bei Aminosäure 20 im α-Bereich der M13mp11-DNA umwandelte. Dies wurde durch Hybridisieren des Primers an einstrangige M13mp11-Phagen-DNA und Expandieren des Primers mittels DNA-Polymerase I-"Klenow-Fragment" und T4-DNA- Ligase über Nacht bei Raumtemperatur erreicht. Diese DNA wurde mit S1-Nuklease behandelt, um nicht-doppelstrangige DNA zu eliminieren, und dann in JM103-Zellen transformiert. Phagen aus dieser Transformation wurden isoliert; die DNA wurde gereinigt und die Primerexpansion und Transformation insgesamt dreimal wiederholt. Jede Wiederholung reicherte das erwünschte Produkt an. Schließlich erfolgte eine "Mini-prep"- Analyse auf M13-RF-DNA aus einzelnen Plaques. Die erwünschte Basenänderung eliminierte die BstNI-Stelle. Die Restriktionsanalyse der Mini-prep-DNA mit BstNI identifizierte Kandidaten. Aus der doppelstrangigen, die erwünschte Änderung tragenden M13-RF-DNA wurde ein BamHI-BglI-Stück ausgeschnitten und an die Stelle eines BamHI-BglI-Stücks im für ED2 kodierenden Plasmid gesetzt.
Das für ED13 kodierende Gen (P193, siehe Fig. 16) wurde durch Synthetisieren (wie oben) eines DNA-Fragments der folgenden Sequenz konstruiert:
Dieses synthetisierte Fragment wurde wie oben bei der Konstruktion von ED3 in p182 (ED2) substituiert.
Das für ED14 kodierende Gen (p194, siehe Fig.16) wurde durch Synthetisieren (wie oben) eines DNA-Fragments der folgenden Sequenz konstruiert: Änderung
Dieses synthetisierte Fragment wurde mittels der gleichen Strategie wie bei ED4 konstruiert, doch das Ergebnis war ein Lysinrest und keine Cysteinsubstitution.
Das für ED15 kodierende Gen (p195, siehe Fig.16) wurde durch Synthetisieren (wie oben) eines DNA-Fragments der folgenden Sequenz konstruiert: Änderung
Dieses Fragment wurde in gleicher Weise wie bei der Konstruktion von ED5 in p182 (ED2 oder M15) insertiert.
Das für ED17 kodierende Gen (p197, siehe Fig.16) ist eine Kombination der ED13- und ED14-Gene die in gleicher Weise wie das für ED7 kodierende Gen konstruiert wurden.
Es folgt eine Auflistung der Enzymakzeptoren, die mit der ED-Reihe von Enzymdonoren verwendet werden können.
* Andere Enzymakzeptoren wurden nicht untersucht.

Enzymakzeptoren

In einer Versuchsgruppe wurde ein Reihe "im Rahmen"-Sequenzdeletionen des β- Galactosidase-Gens konstruiert, um gemäß den oben beschriebenen Verfahren eine Reihe an Enzymakzeptoren herzustellen. pUC 3 wurde mit PvuII gespalten (ergibt ein stumpfes Ende) und an synthetische 8 bp-DNA-Linker ligiert, der eine XhoI-Restriktionsstelle enthält, um ein neues Plasmis - pUC13X - herzustellen.
Der die XhoI-Restriktionsstelle enthaltende α-Bereich wurde dann in das gesamte lacZ-Gen, das für native β-Galactosidase kodiert, wiedereingesetzt, ohne den Rest des lacZ-Gens oder das Hintergrundplasmid zu zerstören. Das Z-Gen enthält zwei BgII-Stellen. Die erste dieser BglI-Stellen ist im α-Bereich in pUC13 stromab von der PvuII-Stelle, wo der XhoI-Linker eingesetzt wurde, enthalten. Somit wurde der α-Bereich aus pUC13X vom Rest des Plasmids durch Spalten mit BamHI und BglI entfernt und das 170 bp-Fragment als B1X bezeichnet.
Der Rest des lacZ-Gens, der für β-Galactosidase kodiert, wurde aus dem Plasmid pβgal2 erhalten (Queen, 1983, J. Mol. Appl. Genet. 2:1). Dieses Plasmid wurde mit BglI und EcoRI gespalten, und zwei DNA-Fragmente, die 93% des Z-Gens ausmachen, wurden isoliert. Die Termini jedes Fragments unterschieden sich von allen anderen bei dieser Konstruktion verwendeten Termini. Die isolierten Fragmente besaßen 2115 bp (nachstehend als B2 bezeichhet) und 737 bp (nachstehend als B3 bezeichnet). Die EcoRI-Restriktionsstelle im Z- Gen befindet sich in der Nähe des C-terminalen Endes des Gens. Dieser Terminus muß vorhanden sein, wenn das eine XhoI-Stelle enthaltende Z-Gen konstruiert wird.
Das mutante Z-Gen wurde in pF29 insertiert. Das Plasmid pF29 enthält einen Z-Gen-α- Bereich der an das C-terminale Ende des Z-Gens bei der EcoRI-Stelle fusioniert ist. Dieser α- Bereich wird durch den an einer BamHI-Stelle insertierten λPr-Promotor gesteuert. Zur Konstruktion von pF29 wurden zwei Zwischenplasmide, pF15 und pF16, konstruiert. pβgal2 wurde mit AvaI gespalten und das kohäsive 3'-Ende mithilfe des Klenow-Fragments und der vier dNTPs aufgefüllt, um stumpfe Enden zu bilden. Ein SalI-Linker (GGTCGACC) (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) wurde an das linearisierte Plasmid unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende DNA wurde mit EcoRI und SalI gespalten und ein 300 bp-DNA-Fragment, das das ω-Ende des β-Galactosidase Z-Gens darstellt, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der ω-Bereich wurde wie folgt mit einem α-Bereich unter der Steuerung von λPr fusioniert. pUC12-DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) wurde mit BglI gespalten, und stumpfe Enden wurden durch die Behandlung mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs gebildet. EcoRI-Linker (GGAATTCC) (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) wurden an die stumpfen Enden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die DNA wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und ein 180 bp-Fragment, das den α-Bereich des Z-Gens darstellt, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Der zur Aufnahme der α- und ω-Genfragmente verwendete Vektor war βgal2, der mit BamHI und SalI gespalten und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt worden war, um die lac-Operon-Sequenzen zu entfernen. Der Vektor und die α-Gen- und ω-Genfragmente wurden mittels T4-DNA-Ligase miteinander ligiert. Die einzelnen Enden der DNA- Fragmente bestimmten die Reihenfolge der Klonierung dieser Fragmente. Das Plasmidprodukt wurde als pF15 bezeichnet.
pF15 wurde durch Umwandeln der einzelnen PvuII-Stelle in die Vektor-SalI-Stelle mittels SalI-Linkern, die an den stumpfen Enden, die durch Spalten von pF15 mit PvuII entstanden, ligiert waren, weiter modifiziert. Dieses modifiziere pF15 wurde dann mit BamHI und SalI gespalten und das größte DNA-Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, was die α-ω-Gensequenz und ein DNA-Fragment zwischen der SalI-Stelle und der PvuII-Stelle entfernt. Unmodifiziertes pF15 wurde auch mit BamHI und SalI gespalten und das α-ω- Fragment gereinigt. Als das große Fragment aus dem modifizierten pF15 an das α-ω- Fragment ligiert wurde, entstand das Plasmid pF16.
pF16 ist um etwa 1350 Basenpaare kleiner als pF15 und bewirkt, daß eine einzelne NdeI- Stelle viel näher zur SalI-Stelle gebracht wird. Dieses Manöver verhindert, daß unnötige DNA-Sequenzen in nachfolgende Konstruktionen mitgeschleppt werden.
Zur Konstruktion von pF29 wurde pF16 mit ClaI und NdeI gespalten und das 1400 bp-DNA- Fragment das für λCI, λPr und die α- und ω-Bereiche von β-Galactosidase kodiert, durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. pUC13 wurde mit AccI und NdeI gespalten und der Vektor durch Gelelektrophorese gereinigt. Da die AccI- und ClaI-Restriktionsstellen identische kohäsive Enden besitzen und die NdeI-Restriktionsstellen identische Termini aufweisen, kann die Ligation des DNA-Inserts aus pF16 und dem pUC13-Vektor nur in einer Ausrichtung erfolgen. Die Ligation mit T4-DNA-Ligase ergab pF29. pF29 enthält eine EcoRI-Stelle und keine ClaI-Stellen, was erwünscht war, da eine zweite EcoRI- und die ClaI- Stelle die Konstruktion der modifizierten Plasmide gestört hätten (z.B. p149 und die nachfolgende Analyse der Deletionsmutanten, die aus dem unten beschriebenem p150 gebildet wurden.
pF29 wurde mit BamHI und EcoRI gespalten, der dazwischen liegende α-Donor entfernt und dieser Vektor mittels B1X plus B2 plus B3 (B1X+B2+B3) aufgefüllt. Das einzelne einstrangige Ende jedes Stücks definiert die Reihenfolge, in der die Stücke aneinanderligiert werden können. Die B1X-, B2- und B3-Fragmente wurden in den pF29-Vektor, der mit BamHI und EcoRI (siehe oben) gespalten wurde, ligiert, womit wieder ein Z-Gen unter λPr- Steuerung mit einem XhoI-Linker an bp102, das für Aminosäure 34 kodiert, konstruiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde als p149 bezeichnet.
Zur Entwicklung eines Verfahrens zum Screenen hinsichtlich der Schaffung von fünktionsfähigen Enzymakzeptoren nach Spalten mit XhoI und Bal31 wurde ein getrennter α-Donor ohne die XhoI-Stelle in p149 insertiert. Ein FnuDII-Spaltfragment aus pUC13, das den lacZ-Operator, Promotor und α-Donor enthielt, wurde in die SaIl-Stelle von p149 insertiert, die mit Klenow-Fragment aufgefüllt worden war. Das resultierende Plasmid wurde als p150 bezeichnet. Deletionen erfolgten durch Spalten von p150 mit XhoI und anschließendes Spalten der DNA mit Bal31-Exonuklease. Nach der Bal31-Behandlung wurde das Plasmid mit T4-DNA-Ligase ligiert und in AMA1004-Wirtszellen transformiert (AMA1004 ist galU, galK, strAr, hsdR&supmin; leuB6, trpC 9830, Δ(lacIPOZ) C29 (Casadaban et al., 1983, Methods in Enzymology, 100:293) sowie auf Luria-Bertani-Platten gescreent, die den Inducer Isopropylthiogalactosid (IPTG) und das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3- indoyl-β-D-galactopyranosid (Xgal, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA) enthielten. Kolonien, die bei 30ºC weiß waren, zeigten die Bildung funktionsfähiger Enzymakzeptoren an. Kolonien wurden ausgewählt und Plasmid-DNAs hergestellt. Die Plasmid-DNAs wurden mit SalI gespalten, um den α-Donor zu entfernen, erneut ligiert und in AMA1004-Wirtszellen transformiert. Die Sequenzdeletionen wurden durch Maxam-Gilbert-Sequenzieren bestätigt und die Enzymakzeptorproteine nach dem unten beschriebenem Verfahren gereinigt. Die resultierenden Stämme sind aus Fig.5 ersichtlich.
Enzymakzeptoren wurden mittels DNA-Syntheseverfahren konstruiert. Beispielsweise wurde Enzymakzeptor 1 (EA1) aus p149 konstruiert, außer daß der α-Bereich, der den XhoI-Linker enthält, durch die folgenden synthetisierten DNA-Fragmente (5' T3') ersetzt wurde:
Diese Fragmente kodieren für eine "im Rahmen"-Deletion der Aminosäuren 26-43 des lac Z- Gens und weisen kohesive BamHI- und BglI-Ende auf. Diese Fragmente wurden anneliert, durch Gelelektrophorese gereinigt, mit BamHI behandelt und an B2 plus B3 und den pF29- Vektor ligiert. Eine positive Kolonie wurde ausgewählt und durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
In Einklang mit den obigen Fragmenten können Analyten durch Bilden eines Reaktionsgemisches bestimmt werden, indem in einem Medium (1) die Probe; (2) ein Enzymdonor-Polypeptid-Konjugat; (3) ein Analytenbindeprotein, das für den Analyten spezifisch ist; und (4) ein Enzymakzeptor-Polypeptid, das im wesentlichen aus einem Fragment von β-Galactosidase besteht, kombiniert werden. Das Enzymdonor-Polypeptid ist dadurch gekennzeichnet, daß es mit dem Enzymakzeptor-Polypeptid einen aktiven Enzymkomplex mit β-Galactosidase-Aktivität in der Abwesenheit von Analytenbindeprotein, das sich an das Konjugat bindet, gebildet wird. Das Enzymdonor-Polypeptid-Konjugat ist weiters dadurch gekennzeichnet, daß es das N-terminale Fragment von β-Galactosidase mit den Mutationen nach Anspruch 1 ist. Weiters ist ein Substrat, das mit den aktiven Enzymkomplexen reagieren kann, im Medium enthalten, sodaß die Umwandlungsrate durch den aktiven Enzymkomplex überwacht werden kann. Das Enzymdonor-Konjugat ist weiters dadurch gekennzeichnet, daß es sich kompetitiv an das Analytenbindeprotein binden kann, was zur Hemmung der Bildung des aktiven Enzymkomplexes führt. Nach dem Bilden des Reaktionsgemisches durch Kombinieren der obigen Komponenten wird die Umwandlungsrate des Substrats im Reaktionsgemisch gemessen und die Analytenmenge bestimmt, indem die Umwandlungsrate des Substrats im Probe enthaltendenden Medium mit der Umwandlungsrate des Substrats, die mittels einer bekannten Analytenkonzentration erhalten wird, verglichen wird.
Von besonderem Interesse für das Verfahren sind Enzymdonor-Zusammensetzungen mit einem Cystein an den Aminosäurepositionen 2, 20, 40 oder 46 (basierend auf der β- Galactosidase-Numerierung wie in Fig.15). Alternativ dazu kann sich ein Cystein in der N- oder C-terminalen Sequenz befinden, worin die N-terminale Sequenz bis zu einschließlich 27 Aminosäuren und die C-terminale Sequenz bis zu einschließlich 17 Aminosäuren umfaßt.
Von besonderem Interesse ist ein Enzymdonor-Polypeptid, das folgende N-terminale Sequenz:
und folgende C-terminale Sequenz aufweist:

Vergleich der Komplementierungseffizienz

Zur Beurteilung der Komplementationseffizienz der wie oben beschrieben hergestellten Enzymakzeptoren wurden repräsentative Enzymakzeptor-Präparate mittels H6 als Enzymdonor verglichen.
Ein Mikrotiterplatten-Format wurde angewendet, das ein Gesamtvolumen von 200 µl PM2- Puffer (0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7.0. 1 mM MgSO&sub4;, 0,18 mM MnSO&sub4;, 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20) mit 2,5 x 10&supmin;&sup8; M des jeweiligen Enzymakzeptor-Präparats und 1,25 mg/ml o-Nitrophenol-β-galactopyranosid-Substrat umfaßt. Eine Reihe von Verdünnungen von H6 (1:20; 1:40; 1:80) wurde zugegeben, um die Komplementierung zu initiieren. Die optische Dichte (414 nm) wurde nach 30- und 45-minütiger Inkubation bei 37ºC gemessen. Die Ergebnisse sind aus Tabelle II veranschaulicht. TABELLE II
Wie aus Tabelle II ersichtlich, unterlag die Komplementierungseffizienz der verschiedenen Enzymakzeptoren beträchtlichen Schwankungen. Die relativen Komplementierungseffizienzen waren: EA14=EA22> EA20> EA24> EA23.

BEISPIEL: ENZYMIMMUNASSAY FÜR DIGOXIN

Dieses Beispiel zeigt einen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Enzymimmunassay, worin der Analyt das kardiotonische Digitalisglycosid Digoxin ist. Das Analytenbindeprotein ist ein für Digoxin spezifischer Antikörper. Das Beispiel zeigt weiters, daß der Wirkmechanismus des Assays nicht analog zu dem sterischen Hinderungs-Enzymimmunassay unter Verwendung von β-Galactosidase ist, der durch Castro und Monji (1981, Methods in Enzymology, 73:523-42) beschrieben wurde.

Herstellung von Digoxin-ED&sub1;-Konjugat

Ein Urethanderivat von Digoxigenin, genauer gesagt 3-O-(m-Maleimidophenylcarbamyl)digoxigenin (nachstehend als "Digoxinmaleimidaddukt" bezeichnet) wurde wie folgt hergestellt:
Einem trockenen 10 ml-Rundhalskolben mit einer magnetischen Rührvorrichtung, einem Argoneinlaß und einem Rückflußkondensator wurden 3-Carboxylphenylmaleimid (67 mg bzw. 0.307 mMol), trockenes Benzol (3 ml) und trockenes Triethylamin (0.043 ml bzw. 0,307 mMol) zuggeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten. Eine Infrarot- Spektralanalyse (IR-Analyse) eines Aliquots zeigte eine Umwandlung zu Carbonylazid (2150 cm&supmin;¹). Digoxigenin (80 mg oder 0,205 mMol) und trockenes Tetrahydrofuran (2 ml) wurden dann dem Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 3,5 Stunden am Rückfluss wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, einmal mit 50 ml kalter, 1%-iger, wäßriger NaOH und einmal mit 50 ml gesättigtem, wäßrigem NaHCO&sub3; gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rest wurde in etwa 1-2 ml Aceton aufgelöst und auf zwei Preparativ-Dünnschichtchromatografie- (TLC) Platten (1500 µm Silikagel-Analtech Uniplate, Analtech, Newarl, DE, USA) aufgebracht. Als das Aceton verdampfte, wurden die Platten mit 80/20 Ethylacetat/Benzol eluiert. Nichtumgesetztes Digoxigenin wurde durch dreimaliges Waschen mit 30 ml Ethylacetat von der Platte entfernt. Dieses Verfahren wurde für die nächsten zwei Spots über Digoxigenin wiederholt. Dieses Reinigungsverfahren lieferte Digoxigenin (26 mg), das erwünschte Produkt Digoxinmaleimidaddukt (31 mg bzw. 37% Ausbeute, bezogen auf nichtumgesetztes Ausgangsmaterial) und 3-O-(m-Maleimidphenylcarbamyl)digoxigenin (28 mg bzw. 33% Ausbeute, bezogen auf umgesetztes Ausgangsmaterial).
Die TLC erfolgte in 2,5% MeOH-CH&sub2;Cl&sub2;, um die Reinheit des Digoxinmaleimidaddukts zu ermitteln. Wenn eine weitere Reinigung erwünscht ist, wird dies am besten durch eine preparative TLC mit 3% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (2 Elutionen) erreicht. Das Digoxinmaleimidaddukt wies die folgenden Spektraleigenschatten auf: Infrarot ("nujol mull") 3490, 3350, 1805, 1760, 1725, 1700, 1615, 1550, 1460, 1305, 1240, 1160, 960, 935, 905, 880, 840, 810, 790, 710 cm&supmin;¹. (NMR- [kernmagnetische Resonanz] Aceton d&sub6;: 0.8 (3 H,s), 3,38 (1H, brs), 3,40 (1H, q, J = 4,78 Hz), 4,84 (2H, t, J = 1,5 Hz), 5,00 (1 H, m), 5,78 (1 H, t, J = 1,5 Hz), 6,98 (s, 2 HO), 6,8- 7,7 (4 H, m), 8,75 (1 H, br s). Massenspektrum (CDI-NH&sub3;): 622 (M+NH&sub4;+) 605 (M+H³&sup0;) 587 (M+H+H&sub2;), 391, 373, 355, 337, 214, 191, 189.
Das Digoxinmaleimidaddukt wurde dann auf einer RP-8 Synchropak 250 x 10 mm I.D. (SynChrom, Inc., Linden, ID, USA) mittels eines Beckman Model 332-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatografie-Systems (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, USA) weiter gereinigt. Die Gradientenelution erfolgte mit 0-80% Acetonitril in H&sub2;O in einem Zeitraum von 60 Minuten bei einer Flußrate von 1,5 ml/min. Das Digoxinmaleimidaddukt wurde gesammelt und lyophilisiert.
Das gereinigte Digoxinmaleimidaddukt wurde dann an den Enzymdonor ED&sub4;, der nach obigem Verfahren hergestellt wurde, gekuppelt, um Digoxin-ED&sub4;, ein Enzymdonor-Analyt- Konjugat, zu bilden. ED&sub4; (1,5 mg) wurde in 240 µl Acetonitril-50 mM Natriumphosphat (3:2) bei einem pH-Wert von 6,0 aufgelöst. Digoxinmaleimidaddukt (1,0 mg) wurde dem Reaktionsgemisch direkt zugegeben, das 2 Stunden lang bei 37ºC gehalten wurde. Nach Abschluß der Kupplungsreaktion wurden 60 µl-Aliquote des Gemisches auf eine Bondapak - Phenylsäule (10 x 30 cm. Waters Associates, Milford, MA, USA) eingespritzt. Die Säule wurde mit einem 60 min-Gradienten von 0-80% Acetonitril in H&sub2;O, 0,1% Trifluoressigsäure entwickelt. Proben mit Enzymdonor-Aktivität wurden gesammelt.

Immunassay auf Digoxin

In gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellten Enzymimmunassay-Systemen können verschiedene Kombinationen von Konzentrationen des Enzymakzeptors und Enzymdonor- Konjugats (d.h. an Analyten gekuppelter Enzymdonor) verwendet werden, um eine bestimmte β-Galactosidase-Konzentration mittels des Komplementierungsvorgangs zu erzeugen. Das Massenwirkungsgesetz erfordert es, daß bei relativ hohen Enzymakzeptor-Konzentrationen der hemmende Einfluß des Antikörpers auf den Komplementierungsvorgang gemildert wird. Beweis dafür sind die flachen oder nicht vorhandenen Dosis-Reaktion-Eigenschaften bei verschiedenen Konzentrationen von Analyt, z.B. Digoxin. Bei relativ hohen Konzentrationen von Enzymdonor-Konjugat (im Vergleich zu Antikörper) wird hingegen auch der hemmende Einfluß des Antikörpers auf das Komplementierungsvorgang ausgeschaltet. Die letztere Situation spiegelt sich in den flachen oder nicht vorhandenen Dosis-Reaktion-Eigenschaften und einem erhöhten Hintergrund wider.
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß wie bei herkömmlichen Enzymimmunassays die relativen Konzentrationen von Enzymakzeptor, Enzymdonor und spezifischem Antikörper definiert sein müssen, um einen Assay mit Dosis-Reaktion-Eigenschaften zu erzielen, der eine geeignete Präzision (Kurvenneigung) und Empfindlichkeit aufweist, um in einem diagnostischen Assay auf den Analyten Verwendung zu finden.
In einer Versuchsreihe mit einem Mikrotiter-Format wurde die Empfindlichkeit des Systems mittels unterschiedlicher Kombinationen von Digoxin-ED&sub4;-Enzymdonor und EA23- Enzymakzeptor-Konzentrationen bestimmt.
Assays wurden durch vier aufeinanderfolgende Zugaben von jeweils 50 µl Digoxin (Analyt), Enzymdonor H6-Digoxin-Konjugat, für Digoxin spezifischem Antikörper (anti-Digoxin) und einer Lösung aus Enzymakzeptor (EA23) und o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG, 5 mg/l) als Substrat durchgeführt. Alle Verdünnungen erfolgten in PM2-Puffer [0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, 1 mM MgSO&sub4;, 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3; und 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA)]. Die Konzentrationen des Digoxinanalyten waren: 0, 1, 10, 100, 200, 500 und 1000 ng/ml. Für Digoxin spezifischer Antikörper wurde durch Injizieren von Digoxinkonjugat in Kaninchen wie folgt erhalten: Primäre intramuskuläre Injektionen wurden mit 50 µl Konjugat in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml vollständigem Freund-Adjuvans durchgeführt. (Intramuskuläre) Auffrischungsimpfungen wurden in 4-Wochen-Intervallen mit 25 µg Konjugat in einem Volumen von 1,0 ml vollständigem Freund-Adjuvans verabreicht. Alle 2 Wochen ab dem 90.Tag nach der primären Injektion wurde 50 ml Blut abgenommen. Die Blutabnallme erfolgte durch Phlebotomie der Mediana oder durch Aufstechen der Randohrvenen. Man ließ das Blut gerinnen; 25 ml Serum/50 ml Blut wurden nach 30-minütiger Zentrifugation bei 1000 x g als Überstand gewonnen. Die Ergebnisse wurden grafisch dargestellt. Ein Vergleich der Dosis- Reaktion-Kurven zeigte, daß die selektive Verringerung der Konzentration von Enzymakzeptor- oder Enzymdonor-Konjugat eine steilere und daher empfindlichere Dosis- Reaktion-Kurve ergibt.

Mechanismus des Digoxin-Immunassays

Um zu bestimmen, ob das Umsetzen des anti-Digoxin-Antikörpers mit dem Enzymdonor- Digoxin-Konjugat den Komplementierungsprozeß und nicht die Umwandlung von Substrat durch polymerisiertes β-Galactosidase-Enzym Stört, wurde der Komplementierungsvorgang in einer Versuchsreihe bis zum Abschluß weitergeführt, bevor Antikörper zugegeben wird.
Die Arbeitsvorschrift der Versuche war wie folgt: 300 µl PM2-Puffer und das Digoxin-H6- Konjugat wurden 60 min lang mit 150 µl Enzymakzeptor EA23 (4,1 x 10&supmin;&sup6; M) umgesetzt. Dies ermöglichte die Fortsetzung der Komplementierung bis zum Abschluß. Ein Aliquot (125 µl) des obigen Reaktionsgemisches wurde entfernt und zu einem Aliquot (50 µl) Kaninchen-anti-Digoxin-Antikörper (1:100 mit PM2-Puffer verdünnt) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann 30 min lang inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wurde das ONPG-Substrat (Endkonzentration 1 mg/ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 37ºC inkubiert. Die optische Dichte des Reaktionsgemisches wurde nach 7 und 16 Minuten nach Inkubation bei 37ºC bestimmt. Vergleichsröhrchen wurden ähnlich behandelt, außer daß 50 µl normales Kaninchenserum (1:100 mit PM2-Puffer verdünnt) oder PM2-Puffer anstelle von Kaninchen-anti-Digoxin-Antiserum zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind aus Tabelle V veranschaulicht. TABELLE V
(a) Anti-Digoxin bezeichnet Kaninchen-539 (50 µl, 1:100-Verdünnung in PM2-Puffer).
(b) NRS bezeichnet normales Kaninchenserum (50 µl 1:100-Verdünnung in PM2-Puffer).
(c) PM2-Puffer: 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0,1 mM MgSO&sub4;, 0,18 mM MnSO&sub4;, 1 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3;, 0,05% Tween 20).
Wie aus Tabelle V ersichtlich, konnte der Antikörper die Umwandlung von Substrat durch die zuvor polymerisierte β-Galactosidase nicht hemmen (vollständige Komplementierung von Digoxin-ED&sub4; und EA23-Enzymakzeptor). Somit ist die verringerte Substratumwandlung, die man mit dem Enzymassay beobachtet, das Ergebnis der durch den Antikörper gehemmten Komplementierung und nicht der verringerten Enzymsubstrat-Umwandlung. Daher ist der Wirkmechanismus des erfindungsgemäßen Assay nicht identisch mit dem sterischen Hinderungs-Enzymimmunassay unter Verwendung von Galactosidase [siehe Castro und Monji (1981), Methods in Enzymology, 73:523-542].

Wirkung von anti-Digoxin-Antikörper auf die Komplementierung unter Verwendung einer Vielzahl an Enzymakzeptoren

In einer Versuchsreihe wurde die hemmende Wirkung von spezifischem Antikörper gegen Digoxin mittels dreier Enzymakzeptoren und des Enzymdonor-Digoxin-H6-Konjugats, das wie oben hergestellt wurde, bestimmt.
Das Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt: 50 µl PM2-Puffer, 50 µl der geeigneten Verdünnung (1:20, 1:40, 1:80) von Digoxin-ED&sub4;-Konjugat im PM2-Puffer; 50 µl des jeweiligen Antikörpers (d.h. beide anti-Digoxin-Antikörper gegen normales Kaninchenserum) und 50 µl des jeweiligen Gemisches aus Enzymakzeptor (1 x 10&supmin;&sup7; EA14, EA20 oder EA22) und Substrat o-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid (ONPG) (5 mg/ml) wurden einer Mikrotiterplatte zugegeben. Die Platten wurden dann bei 37ºC über spezifische Zeiträume inkubiert. Die optische Dichte bei 414 nm wurde 45 Minuten lang in 5-Minuten-Intervallen bestimmt.
Die folgende Tabelle zeigt α-Bereich-Enzymakzeptorsequenzen. Aminosäuredeletionen
Die hemmende Wirkung von Antikörper auf die Komplementierung in diesem System scheint mit der Größe der Deletion im Enzymakzeptor in Zusammenhang zu stehen. Der Enzymakzeptor EA22, dem die Aminosäuren 13-40 fehlen, wobei dies die größte in diesem Versuch getestete Deletion ist wurde durch Antikörper am wenigsten gehemmt. Der Enzymakzeptor EA14, dem die Aminosäuren 30-37 fehlen, ist die kleinste der untersuchten Gruppen und wurde am meisten durch Antikörper gehemmt. EA20, der die Aminosäuren 26- 45 umfaßt und bezüglich der Größe zwischen EA22 und EA14 liegt, wurde relativ mäßig gehemmt. Die native Komplementierungseffizienz von EA20 ist jedoch niedriger als jene von EA14 oder EA22. Der Enzymakzeptor muß zwei Kriterien erfüllen: (a) native Komplementierungseffizienz, z.B. EA14 und EA22 sind effizienter als andere Sequenzen, bezogen auf äquimolekulare Konzentrationen: und (b) die Fähigkeit des spezifischen Analytenbindeproteins zur Hemmung der Komplementierung.

BEISPIEL: WIRKUNG EINES ZWEITEN ANTIKÖRPERS AUF DEN DIGOXIN- ENZYMIMMUNASSAY

Die obigen Ergebnisse lassen vermuten. daß die Kupplung von Anti-Digoxin-Antikörper an die Enzymdonor-Digoxin-Konjugate der vorliegenden Erfindung die Komplementierungsrate des Enzymakzeptor- und Enzymdonor-Konjugats verlangsamt. Eine solche Kupplung verhindert jedoch die Komplementierung nicht vollständig. Somit weist das System, wie bereits erwähnt, seine größte Empfindlichkeit nach etwa 15-minütiger Inkubation von Enzymakzeptor- und Enzymdonor-Konjugat auf.
Das System erreicht seine maximale Absorptionsdifferenz nach etwa 15 Minuten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Konzentration von β-Galactosidase in einem System mit vorhandenem anti- Digoxin-Antikörper die gleiche wie in einem System, in dem der Antikörper fehlt oder in dem der Digoxin-Antikörper neutralisiert ist (z.B. hohe Digoxin-Werte). Da die β-Galactosidase Konzentration die gleich ist, ist auch die Rate der Substratumwandlung die gleiche. Keine zusätzliche Absorptionsdifferenz ist zu beobachten. Dieses Phänomen, das die Wirkung des Antikörpers auf den Komplementierungsvorgang einschränkt, führt zu einem schmalen Absorptionsbereich für eine Dosis-Reaktion-Kurve, zu flachen Neigungseigenschaften und einer unzulänglichen Empfindlichkeit des Assays für einige diagnostische Anwendungen.
Das folgende Beispiel zeigt, daß die Befestigung eines sekundären Antikörpers, der für den anti-Digoxin-Konjugatantikörper spezifisch ist, die Hemmung der Komplementierung steigert.

Befestigung von ganzem sekundärem Antikörper

In einer Versuchsreihe wurde 50 µl Kaninchen-anti-Digoxin-Antikörper (1:1000 verdünnt) in einer Gruppe an Mikrotiternäpfen mit 50 µl Digoxin-H6 (1:50 in PM2-Puffer verdünnt) und 50 µl Digoxin in einer Konzentration von 0, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 100 ng/ml kombiniert. Ein 50 µl-Aliquot eines sekundären Antikörperpräparats (Bethyl Lab, Montgomery, TX, USA, Ziegen-anti-Kaninchen-Serum 1:50-1:800) wurde jedem Napf zugegeben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen VI und VII aufgelistet. TABELLE VI EINFLUSS VON SEKUNDÄREM ANTIKÖRPER AUF DIE SUBSTRATUMWANDLUNGSRATE SUBSTRATUMWANDLUNGSRATE (OD&sub4;&sub1;&sub4;/ZEIT)(a)
(a) In allen Fällen wurde die Substratumwandlungsrate durch das Assaysystem unter Verwendung von primärem Antikörper ohne sekundären Antikörper als 100% bezeichnet. Die gemessene Rate für dieses Präparat (OD/&sub4;&sub1;&sub4;/Zeit) betrug: 0,003, 0,007, 0,013, 0,015 bei 0-16; 16-30; 30-45 bzw. 45-60 Minuten.
(b) Der verwendete sekundäre Antikörper war Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (Bethyl Labs, Montgomery, TX, USA). Alle Verdünnungen wurden mit PM2-Puffer gebildet. Der primäre Antikörper war Kaninchen-anti-Digoxin-Antikörper, der in allen Fällen 1:1000 verdünnt war.
Wie aus Tabelle VI ersichtlich, ist die Hemmwirkung auf die Komplementierung, die durch Befestigen eines sekundären Antikörpers am Antikörper-Digoxin-H6-Konjugat erzielt wird, bei einer Verdünnung von 1:50 oder weniger des sekundären Antikörpers optimal. Bei einer Verdünnung von 1:200 bis 1:300 des sekundären Antikörpers geht die gesamte synergistische Hemmwirkung verloren. Somit ist die Hemmung der Komplementierung mit oder ohne sekundären Antikörper bei dieser Verdünnung die selbe oder höher. TABELLE VII WIRKUNG VON SEKUNDÄREM ANTIKÖRPER AUF SUBSTRATUMWANDLUNG SUBSTRATUMWANDLUNGSRATE
* Fällung in Näpfen zu beobachten
(a) Primärer Antikörper war entweder Kaninchen-anti-Digoxin (Rα Dg*) oder normales Kaninchenserum (NRS), 1:1000 mit PM2-Puffer verdünnt.
(b) Sekundärer Antikörper war ein Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper.
Wie aus Tabelle VII ersichtlich, erreichte die Substratumwandlungsrate (d.h. die β-Galactosidase-Konzentration) ohne sekundären Antikörper innerhalb von 30 Minuten 70% des Maximums. Mit sekundärem Antikörper bei einer Verdünnung von 1:40 machte die Rate der Substratumwandlung etwa 25% des Maximums aus. Bei Verdünnungen von sekundärem Antikörper von mehr als 1:40 nimmt die Hemmwirkung auf die Komplementierung ab, was sich in erhöhten Raten der Substratumwandlung im Lauf der Zeit äußert.
Bei Verdünnungen von 1:40 oder mehr ist der Effekt eine Zunahme der Substratumwandlungsrate.
Bei allen untersuchten sekundären Antikörper-Konzentrationen wurde die Substratumwandlungsrate (d.h. die β-Galactosidase-Konzentration) bei Werten unterhalb der maximalen Konzentration an β-Galactosidase, die das System ermöglichen würde (z.B. ersetzt NRS sekundären Antikörper), linear (d.h. es bildete sich keine neue β-Galactosidase). Dies zeigt, daß die Bindung von sekundärem Antikörper die sterische Hinderung des primären Antikörpers steigert und die Komplementierung durch jene Enzymdonor-Population, die gebunden ist, vollkommen verhindern kann.

Befestigung von sekundärem Antikörperfragment

Zur Bestimmung, ob die verstärkte Hemmung, die beim Kuppeln eines sekundären Antikörpers an das primäre Antikörper-Enzymdonor-Konjugat festgestellt wurde und auf die sterische Hinderung oder den Einschluß von Enzymdonor-Konjugat in einem Prezipitin- Komplex zurückgeführt werden konnte, wurden einwertige Fab-Fragmente (Antigen- Bindefragmente mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton) Ziegen-anti- Kaninchen-Immunglobulin als sekundärer Antikörper verwendet. Da Fab-Fragmente Antigen nicht vemetzen können, sind sie nicht in der Lage, eine Fällungs- oder eine Agglutinierungsreaktion zu bewirken. Jede in diesem Präparat beobachtete Komplementierungshemmung steht mit verstärkter sterischer Wirkung auf die Komplementierung und nicht mit dem verstärkten Einschließen von Konjugat in Zusammenhang.
In einem Mikrotiterplatten-Format erfolgten fünf gleiche, hintereinander durchgeführte Zugaben von jeweils 50 µl: Digoxin (0, 1, 4, 10, 1000 ng/ml); Digoxin-H6-Konjugat; primärer Kaninchen-anti-Digoxin-Antikörper (1:4000) und sekundärer Ziegen-anti- Kaninchen-Antikörper (Bethyl Labs, Montgomery, TX, USA) bei einer Verdünnung von 1:80. Alle Verdünnungen erfolgten in PM2-Puffer. Der sekundäre Antikörper wurde durch normales Kaninchenserum (1:80) und das Fab-Fragment von Ziegen-anti-Kaninchen-Serum (Cappel Laboratories, West Chester, PA, USA) bei Verdünnungen von 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 und 1:320 ersetzt. Nach 10 min bei Raumtemperatur wurden 50 µl 1 x 10&supmin;&sup6; M EA14 und 5 mg/ml des Substrats ONPG zugegeben, und die Inkubationen wurden 30 Minuten lang bei 37ºC fortgesetzt. OD&sub4;&sub1;&sub4; wurde gemessen und das Verhältnis gebunden/maximal gebunden (B/Bma) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII veranschaulicht. TABELLE VIII WIRKUNG DER FAB-FRAGMENTE
(a) Alle sekundären Antikörperpräparate wurden unter Verwendung von primärem Antikörper bei einer Verdünnung von 1:4000 untersucht.
(b) Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulin-Antiserum (Bethyl Labs, Montgomery, TX, USA)
(c) "-" bedeutet daß kein sekundärer Antikörper verwendet wurde. Eine 1:80-Verdünnugn von normalem Kaninchenserum ersetzte in diesen Proben den sekundären Antikörper.
(d) Fab-Ziegen-anti-Kaninchen-IgG bezeichnet das Fab-Fragment das von H und L Sp. (Cappel 0412-0081, Charge Nr.23167) (Cappel Laboratories, West Chester, PA, USA), erhalten wurde.
Wie aus Tabelle VIII ersichtlich, ist die verringerte Komplementierung offensichtlich, wenn das Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulin (Fab-Fragment) an das primäre Antikörper- Enzymdonor-Konjugat gekuppelt wird. Die durch das Fab-Fragment bewirkte Hemmung der Komplementierung entspricht etwa der bei Verwendung von ganzem Antikörper beobachteten Hemmung.
Wie aus Tabelle VIII ersichtlich, wies der sekundäre Antikörper eine größere hemmende Wirkung auf die Komplementierung bei niedriger Dosis auf (d.h. eine größere Antikörper/Enzymdonor-Wechselwirkung wird durch überschüssigen freien Analyten bewirkt).
Eine sinkende Fab-Konzentration verursachte eine lineare Abnahme der Komplementierungshemmung. In Tabelle VI zeigen intakte Moleküle bei Verdünnungen von mehr als 1:40 eine Abnahme der sekundären Antikörperwirkung. Das gleiche Phänomen läßt sich im Fab- Präparat ab einer Verdünnung von 1:40 beobachten.

Leistungsvergleich von gentechnisch hergestellten und chemisch synthetisierten Enzymdonoren im Digoxin-Immunassay

Um Enzymimmunassays zu vergleichen, die mit chemisch synthetisierten bzw. gentechnisch hergestellten Komponenten durchgeführt werden, wurden zwei analoge Enzymdonoren gebildet, einer durch rekombinante DNA-Verfahren und der andere durch chemische Peptidsynthese. Die Aminosäuresequenzen von ED3 (gentechnisch hergestellt) und ED3A (durch Polypeptidsynthese hergestellt) sind wie folgt:
Die auffälligsten Merkmale dieser zwei Peptide sind der mit einem Stern versehene analoge Cysteinrest (Cys), der zur chemischen Kupplung an einen Analyten vewendet wird, und die analoge α-Donordomäne, die in ED3 zwischen den Aminosäuren 12 und einschließlich 50 sowie in ED3A zwischen den Aminosäuren 5 und einschließlich 43 angeordnet ist, wobei dies den Aminosäuren 6 bis 44 der β-Galactosidase des Wildtyps entspricht.
Die Konjugation von Digoxin an ED3 und ED3A erfolgte mit 3-O-[Maleimidophenylcarbamyl]digoxigenin, wie dies weiter oben beschrieben ist. Präparate aus ED3, ED3a, Digoxin-ED3 und Digoxin-ED3A wurden einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer preparativen HPLC-Phenylsäule (Waters µBondapak, Waters Assoc., Milford, MA, USA) mittels eines Gradienten von 0-80% Acetonitril in Wasser mit 0,1% TFA als Elutionsmittel unterzogen. Die Säulenfraktionen jedes Enzymdonors wurden wie oben mit M15 als Enzymakzeptor hinsichtlich Komplementierung untersucht. Die relative Komplementierungseffizienz von ED3-Digoxin war viermal größer als ED3A-Digoxin.
Die Säulenfraktionen, die Digoxin-ED3 und Digoxin-ED3A entsprachen, wurden getrennt gesammelt und in einem kompetitiven Enzymimmunassay auf Digoxin verglichen.
Eine 96-Napf-Mikrotiterplatte wurde für den Assay verwendet. Der Assay umfaßte 25 µl menschliche Serumstandards 0, 0,5 , 1, 2, 4, 10, 100 und 1000 ng/ml Digoxin, 100 µl Reagens I, das 4 x 10&supmin;&sup7; M M15-Enzymakzeptor und Digoxin-Antikörper enthält, sowie 130 µl Reagens II. Reagens II enthielt verschiedene Verdünnungen von Digoxin-ED3 oder Digoxin- ED3A, sekundären Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper und 1,1 mg/ml o-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid. Die Ergebnisse nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC und einer Ablesung bei 405 nm in einem Titertek-Mikrotiterplatten-Lesegerät sind in Tablelle X angeführt, wobei kompetitive Immunassays sowohl mit Digoxin-ED3 als auch mit Digoxin- ED3A gebildet wurden. Der Digoxin-Immunassay mit Digoxin-ED3 erzielte eine bessere Signalunterscheidung bei niedrigen Dosen von 0,5 und 1 ng/ml als Digoxin-ED3A. Diese Diskrepanz kann auf die Gegenwart von Verunreinigungen im ED3A-Präparat, die während HPLC-Analyse festgestellt wurden, zurückzuführen sein.
Diese Versuche zeigen die Anwendbarkeit synthetisierter Polypeptide sowie gentechnisch hergestellter Polypeptide bei der Steuerung der Komplementierung von β-Galactosidase- Polypeptiden durch die Antigen-Antikörper-Reaktion. Somit kann die chemische Polypeptidsynthese dazu dienen, Enzymdonoren zu bilden, um hochmolekulare Proteine zu detektieren. Genfusionen, die für immunologisch reaktive, mit der α-Donordomäne fusionierte Polypeptidepitope kodieren, können auch synthetisiert werden. Die Grenzen dieses Ansatzes sind nicht nur die Kapazität des Stands der Technik, immer größere Polypeptide zu synthetisieren, sondern auch die Kenntnisse über die Sequenz der erforderlichen α- Donordomäne sowie der immunologisch reaktiven Proteindomäne. TABELLE X DIGOXIN-ASSAY MIT ED3 UND ED3A
Einige zusätzliche Enzymdonorsequenzen wurden hergestellt, wonn die Grundsequenzen wie folgt sind und die folgende Tabelle die Substitutionen und Deletionen für die Enzymdonorsequenzen anzeigt:
Die Enzymdonor-Konjugate wurden charakterisiert, indem die Immunreinheit des Konjugats, die kinetische spezifische Aktivität, der Prozentsatz der Hemmung bei Halbsättigung, die maximale Komplementierungshemmung und die Affinitätskonstante für den Antikörper an den Liganden bestimmt wurden. Die Assaybedingungen - außer wo es anders angeführt ist - sind wie folgt:
Die verwendeten Reagentien waren Probenpuffer: 100 mM Natriumphosphat 20 mM Natriumazid und 0,2% BSA: Assaypuffer (pH 7,0): 10 mM Ethylenglykol, Tetraessigsäure, 2 mM Mg-Acetat, 20 mM Natriumazid, 150 mM Natriumphosphat, 100 mM Kaliumphosphat, 0,05% Tween 20, 0,05 mM Dithiothreitol.
Die Immunreinheit wurde durch Fällen des Enzymdonor-Konjugats mit anti-T4-Antikörper - TgG-Sorbheads bestimmt. Der ED wird bei Raumtemperatur 15 min lang auf einem Schaukelschüttler mit primärem Antikörper inkubiert. Sekundärer Antikörper wird zugegeben und die Inkubation 15 min lang fortgesetzt. Die Suspension wird zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands für den Assay aufgehoben. Der obige Zyklus wird mit dem verbleibenden Überstand insgesamt 5 Zyklen lang wiederholt. Eine Vergleichsprobe des ED besitzt keinen primären Antikörper. Die ED-Konzentration während der Inkubation ist 20 mM. Die Assaykonzentrationen betragen: EA - 500 nM; ED - 4 nM und ONPG - 1 mg/ml. Die Immunreinheit wird als Prozentsatz der durch primären Antikörper fällbaren ED-Aktivität ausgedrückt.
Die kinetische spezifische Aktivität wird mittels eines COBAS BIO -Assays mit Präinkubation des ED mit überschüssigem EA über einen Zeitraum von 10 min bestimmt. Die Systemkonzentrationen betragen: ED: 0,1-0,5 nM, EA: 22-500 nM und CPRG: 1,11 mM, 6 ED-Konzentrationen im obigen Bereich wurden bei 37ºC zweifach untersucht. Die Daten der Units pro Assay gegen ng Protein/Assay werden aufgetragen und eine spezifische Aktivität (U/mg) durch die Methode der kleinsten Quadrate errechnet. Ein Unit ist als 1 µMol CPRG/min definiert.
Die immunchemischen Tests erfolgten auf dem Encore. Ein Format mit zwei Reagentien wurde eingesetzt, wobei das erste Reagens den Assaypuffer, EA22 und ONPG enthielt, während das zweite Reagens den ED, anti-T4 oder anti-Digoxin-Antikörper enthielt; die Konzentrationen betrugen: EA - 560 mM, ED - 2,4 nM, ONPG - 0,58 ng/ml. Die verwendeten Ligandenkonzentrationen sind in der Legende der Tabelle angeführt. Der ED und Antikörper wurden auf dem Rotor 15 min lang bei 37ºC präinkubiert. Alle Antikörper-Konzentrationen wurden doppelt untersucht. Keine Korrekturen wurden hinsichtlich der Variationen von Gesamtprotein in den Assays vorgenommen.
Der Ka wurde wie folgt bestimmt: Zur Ermittlung der Affinitätskonstante eines Antikörpers für ein Versuchs-ED-Konjugat wird eine ED-Titration gegen einen fixen Antikörper durchgeführt. Der an konjugiertem ED bindende Antikörper wird durch die Hemmung der Bildung von aktivem Enzym überwacht, wie man an der Abnahme des Umsatzes von chromogenem Substrat erkennt. Die resultierenden Daten werden in einem Scatchard-Format aufgetragen (gebunden/frei gegen [gebunden]). Die Neigung der erstellten Linie entspricht KA in L/Mol.
Aus der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse ersichtlich. TABELLE XIII Charakterisierung von ED-Konjugaten TABELLE XIII (Fortsetzung)
* Beispiel gemäß der Erfindung TABELLE XIII Fortsetzung
1) Cys-Position bezieht sich auf den Ort des einzelnen Cys-Rests in der ED-Sequenz. Das Numerierungssystem stammt aus der Sequenz nativer β-Galactosidase.
2) Es gibt zwei Längen von ED-Molekülen. Die "kurze" Version (74-75 Aminosäuren) und die "lange" Version (89-90 Aminosäuren), die identisch mit der ersteren ist, außer daß 15 Aminosäuren im aminoterminalen Abschnitt der Sequenz zwischen den Aminosäuren 5 und 6 der kurzen Version eingsetzt sind. Die eingesetzte Sequenz is N-P-Y-G-I-D-P-T-Q-S-S-P-G-N-I.
3) Immunreinheit ist der Prozentsatz der ED-Konjugat-Aktivität, der durch spezifisches Analyten-Antiserum entfernt werden kann.
4) Die spezifische kinetische Aktivität ist ein Maß der Fähigkeit eines ED, aktives Enzym zu bilden, indem er sich innerhalb von 15 Minuten in Bezug auf ED4 mit EA verbindet. Die spezifische Aktivität des Äquilibriums ist ein Maß der Menge an aktivem Enzym, das sich nach 18-stündigem Inkubieren von ED und EA bildet.
5) %I bei halber Sättigung ist das Ausmaß an Komplementierungshemmung, das erzielt wird, wenn ein Standard-Ab (T4-Pool 393A, Digoxin-Cambridge 3429F) bei einer fixen Verdünnung (T4-1:12.000; Dig 1:10.000 Endverdünnung) gehalten und ED titriert wird, bis die Hälfte der AB-Bindungsstellen gesättigt sind.
6) Man nähert sich dem maximalen Ausmaß der Komplementierungshemmung, wenn die ED-System-Konzentration auf 0,125 nM gesenkt wird, während die Ab-Konzentration konstant bleibt.
7) Die Affinitätskonstante stammt aus einer Scatchard-Kurve einer ED-Titration gegen eine fixe Ab-Konzentatrion. Alle Messungen erfolgten in Abswesenheit von sekundärem Antikörper.
Es geht aus den obigen Ergebnissen hervor, daß das vorliegende Verfahren einen empfindlichen und genauen Assay bietet, der in einer Vielzahl an Arbeitsvorschriften zum Einsatz kommen kann. Außerdem wird die Lagerstabilität deutlich verbessert, da die Fragmente recht stabil und durch Kombination in einem wäßrigen Medium leicht aktivierbar sind. Die einzelnen Fragmente können leicht an eine Vielzahl von Liganden von Interesse konjugiert werden um aktive Konjugate bereitzustellen, was einen breiten dynamischen Bereich für verschiedene Liganden ergibt.
Obwohl die Erfindung zur Klarheit und Verständlichkeit durch Beispiele und Veranschaulichungen ausführlich beschrieben wurde, ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet hinsichtlich der Lehren der vorliegenden Erfindung offenkundig, daß zahlreiche Änderungen und Modifizierungen vorgenommen werden können.

Claims

1. Enzymassayverfahren zur Bestimmung der Menge eines vermuteten Analyten in einer Probe, worin der Analyt ein Bestandteil eines aus einem Liganden und einem Rezeptor bestehenden spezifischen Bindungspaares ist, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) das Bilden eines Reaktionsgemisches durch Kombinieren (1) einer Probe; (2) eines Enzymdonor-Polypeptids, umfassend das N-proximale Fragment von β-Galactosidase; (3) eines Analyten-Bindeproteins, wenn der Analyt kein Rezeptor ist; und (4) eines Enzymakzeptor-Polypeptids, das im wesentlichen aus einem C-proximalen Fragment von β-Galactosidase besteht, in einem Medium, worin das Enzymdonor-Polypeptid mit einem Liganden konjugiert ist, der mit Ligandenanalyt kreuzreaktiv oder zu Rezeptoranalyt komplementär ist, wobei das Enzymdonor-β-Galactosidase-Fragment modifiziert ist, um eine Stelle zur Konjugation mit dem Liganden bereitzustellen, und der Enzymdonor und der Enzymakzeptor einen aktiven Enzymkomplex mit β- Galactosidase-Aktivität bilden, die unterscheidbar ist, wenn ein Rezeptor am Konjugat aus Ligand und Enzymdonors gebunden ist;

(b) das Messen der Umwandlungsrate von Substrat im Reaktionsgemisch; und

(c) das Bestimmen der Menge an Analyt in der Probe durch Vergleichen der Umwandlungsrate von Substrat mit der Umwandlungsrate von Substrat, die unter Verwendung einer bekannten Analytenmenge erhalten wird,

dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymdonor-β-Galactosidasefragment durch Substitution von zumindest zwei Aminosäuren modifiziert wird, wobei zwei der Substitutionen zu Cystein oder Lysin erfolgen und an den Positionen 23 und 68 stattfinden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Substitution an der Position 23 zu Cystein erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyt ein Hapten ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyt ein Antigen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reaktionsgemisch weiters einen Antikörper umfaßt, der den Rezeptor bindet.

6. Enzymassayverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das modifizierte Fragment an einer Substitutionsstelle mit einem Liganden konjugiert ist.

7. Protein mit zumindest 40 Aminosäuren der folgenden Sequenz:

worin die Zahlen unter den Buchstaben die Numerierung der Wildtyp-β-Galactosidase und die Sterne die Substitutionsstellen zweier verschiedener Aminosäuren zur Konjugation mit einen Liganden kennzeichnen, wobei die Substitutionen zu Cystein oder Lysin erfolgen und an den Positionen 23 und 68 stattfinden (Wildtyp-Positionen 1 und 46).

8. Protein nach Anspruch 7, worin eine der Substitutionen zu Cystein erfolgt.

9. Protein nach Anspruch 7, worin die Sequenz an einem oder beiden Termini, mit einer Aminosäuresequenz verbunden ist, die ein Epitop eines Antigens von Interesse definiert.

10. Protein nach Anspruch 7, worin die Sequenz kovalent an einen Liganden gebunden ist.

11. Protein nach Anspruch 10, worin der Ligand Digoxin, Thyroxin, eine Mißbrauchdroge, ein Therapeutikum, ein Steroid oder eine immunologisch kreuzreaktive Verbindung davon ist.

12. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend ein Replikationssystem, das in einem Mikroorganismus-Wirt funktional ist, und eine Expressionskassette, die Transkriptions-, Translations-, initiations- und -terminationsregulationsbereiche umfaßt, die im Wirt funktional sind, und einen offenen Leserahmen, der für eine Proteinzusammensetzung nach Anspruch 7 kodiert.

13. Bakterium, umfassend einen Vektor nach Anspruch 12.

14. Bakterium nach Anspruch 13, worin das Bakterium E.coli ist.

15. Set zur Verwendung in einem Assay nach Anspruch 1, umfassend zur Verwendung als Ingredientien eines Reaktionsgemisches ein Enzymdonor-Polypeptid mit dem N- proximalen Fragment von β-Galactosidase; ein Analyt-Bindeprotein, wenn der Analyt kein Rezeptor ist; und ein Enzymakzeptor-Polypeptid, das im wesentlichen aus einem C-proximalen Fragment von β-Galactosidase besteht, worin das Enzymdonor-Polypeptid mit einem Liganden konjugiert ist, der mit Ligandenanalyt kreuzreaktiv oder zu Rezeptoranalyt komplementär ist, wobei das Enzymdonor-β-Galactosidasefragment modifiziert ist, um eine Stelle zur Konjugation mit dem Liganden bereitzustellen, und der Enzymdonor und der Enzymakzeptor einen aktiven Enzymkomplex mit β- Galactosidase-Aktivität bilden, die unterscheidbar ist, wenn ein Rezeptor am Konjugat gebunden ist;

dadurch gekennzeichnet, daß das β-Galactosidase-Fragment durch Substitution von zumindest zwei Aminosäuren modifiziert ist, wobei zwei der Substitutionen zu Cystein oder Lysin für die Konjugation mit einem Liganden erfolgen und an den Positionen 23 und 68 stattfinden.

16. Set nach Anspruch 15 zur Verwendung bei der Durchführung eines Assays nach Anspruch 1, worin der Analyt ein Bestandteil eines aus einem Liganden und einem Rezeptor bestehenden spezifischen Bindungspaares ist, weiters umfassend ein β- Galactosidase-Substrat, das mit dem aktiven Enzymkomplex reagieren kann, der aus Enzymdonor-Polypeptid und Enzymakzeptor-Polypeptid gebildet wird, sodaß die Umwandlung des Substrats durch aktives Enzym überwacht werden kann.