DE19648629A1 - Verfahren zur immunologischen Erfassung und Produktion von Antikörpern - Google Patents
Verfahren zur immunologischen Erfassung und Produktion von AntikörpernInfo
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Description
Das Verfahren findet vorrangig Anwendung zum antigenspezifischen in-vitro- Nachweis oder zur Bestimmung eines
immunologisch aktiven Reaktionspartners mittels immunologischer Methoden und zur Herstellung von Testsätzen
für Immunoassays, die insbesondere in der Medizin, Pharmazie, Mikrobiologie angewendet werden.
Die Technologie wird zur Massenproduktion monoklonaler Antikörper genutzt.
Zur Massenproduktion monoklonaler Antikörper beschreiben J.H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze ("Monoklonale
Antikörper", Herstellung und Charakterisierung. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York) neben der
intraperitonealen Applikation der Hybridomzellen in syngene Mäuse und anschließender Gewinnung der
Ascitesflüssigkeit die Propagation der Hybridomzellen mittels Zellkulturtechnik.
Während die Produktion monoklonaler Antikörper in Ascitesflüssigkeit nicht frei von Bedenken ist, lassen sich in
dem Zellkulturüberstand nur relativ geringe Antikörperkonzentrationen erzielen.
Der Nachweis oder die Bestimmung von immunologisch aktiven Proteinen (wie Antigene, Haptene, Antikörper)
erfolgt vorzugsweise mittels immunologischer Methoden, die auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen, die
sich durch hohe Empfindlichkeit und Meßgenauigkeit auszeichnen.
Für solche Immunreaktionen werden spezifisch reagierende Antigene und Antikörper, ein Indikatorsystem, spezielle
Medien für die Reaktion der Reaktionspartner und in der Regel Kontrollmaterialien benötigt. Für die
Bindungsreaktionen werden Festphasentechniken bevorzugt, weil sich die Reaktionsprodukte leicht abtrennen
lassen.
Zur Erfassung des Maßes der spezifischen Bindungsreaktion wird eine Indikatorreaktion wie z. B. Farb-,
Fluoreszenz-, Bio- oder Chemilumineszenzreaktion angewendet. (E.Engvall, P.Perlmann, Immunochemistry 8, 871
(1971); B.K.van Weemen, A.H.M.Schuurs, FEBS Letters 15, 232(1971); E.Ishikawa, T.Kawai, K.Miyai,
Enzymimmunoassay, Igaku-Shoin, Tokyo, New York 1981); R.H.Yolken Rev.Infect Dis. 4, 35 (1982), ELISA and
other solid-phase immunoassays. Theoretical and practical aspects. Eds. D.M.Kemeny. S.J.Challacombe. John
Wiley and sons Ltd. Chichester, UK, 1988.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird durch eine Reihe von unspezifisch reagierenden Faktoren gestört, somit
werden falsche Ergebnisse erzielt, oder hoher Background verringert die Empfindlichkeit.
[A.H.W.M.Schuurs, B. K.van Weemen, Clinica Chimica Acta 81,1(1977); O.Meurmann, in: Current Topics in
Microbiology and Immunology, Vol. 104, New Developments in Virology; Ed.P.A.Bachmann, Berlin, Heidelberg, New
York 1983, S.101].
Solche unspezifischen Bindungen und falsche Ergebnisse können durch Rheumafaktoren, die mit aggregiertem IgG
reagieren, durch antinukleäre Antikörper, die gegen Kernmaterial verschiedener Antigene gerichtet sind, durch anti
zelluläre Antikörper, die mit Zellbestandteilen, die in Antigenpräparationen enthalten sind, Reaktionen eingehen
können und durch Protein-Rezeptor-Reaktionen während der Bindungsreaktionen der Reaktionspartner
hervorgerufen werden.
Die Reduzierung oder Eliminierung von unspezifischen Reaktionen ist deshalb für die Treffsicherheit der
Bestimmungen von großem Wert.
Um die unspezifischen Bindungen an den festen Träger zu verringern, schlagen verschiedene Autoren vor, den
Verdünnungsflüssigkeiten und Inkubationsmedien fetales Kälberserum, isolierte Proteine oder Detergenzien
in unterschiedlichen Konzentrationen zuzusetzen (S.Avrameas, in: New Developments in Diagnostic
Virology, Ed.P.A.Bachmann, Berlin, Heidelberg, New York 1983,S.93; J.Clin.Microbiol. 13, 738(1981);
Methods in Enzymology 70, 419 (1980).
Diese angeführten Zusätze während der Bindungsreaktionen reichen nicht immer aus (Berl.Münch.Tierärztl.Wschr.
94.36 (1981). um unspezifische Bindungen in genügendem Maße ohne Beeinträchtigung der spezifischen
Immunreaktion zu unterdrücken.
Einige Autoren [J.A. Stewart, D.W.Ziegler,J. Immunol.117,2006(1976); K.O.M.Kalimo, R.J. Marttila, K. Grantors,
M.K.Viljanen, Infect.Immun. 15,883 (1978); A.M.Arxin, C.M. Koropchak, J.Clin.Microbiol.12,367(1980)] empfehlen, die
im Test verwendeten Immunreaktanden in sehr hoher Reinheit einzusetzen. Dies ist allerdings mit einem sehr hohen
Arbeitsaufwand unter Einsatz mehrstufiger Reinigungsprozesse mittels spezieller Technik und in der Regel mit
beträchtlichen Ausbeuteverlusten verbunden.
Die Herstellung kompletter Testpackungen, die alle notwendigen, unter standardisierten industriellen Bedingungen
gefertigten, spezifisch reagierenden Testbestandteile enthalten und eine störungsfreie routinemäßige
Testausführung gestatten, ist für den Anwender der Immuntechniken von besonderem Vorteil, vorausgesetzt, die
empfindlichen biologischen, immunologisch aktiven Materialien reagieren mit geringer Störanfälligkeit und behalten
über einen langen Zeitraum ihre immunologische Aktivität und sind somit langzeitlager- und versandfähig.
Die Erfindung hat das Ziel, unspezifische Bindungswechselwirkungen in Immunoassays zur Erfassung
immunologisch aktiver Verbindungen, insbesondere klassenspezifischer Antikörper zu reduzieren oder zu
eliminieren und eine Langzeitstabilität der empfindlichen immunologisch aktiven Testbestandteile zu erreichen.
Auf effektive Weise soll eine Massenproduktion monoklonaler Antikörper ermöglicht werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Verringerung ungewollt unspezifischer Wechselwirkungen mit
koimmobilisierten Bindungsproteinen am beschichteten festen Träger, eine Erniedrigung zwischenmolekularer
Bindungsreaktionen zwischen unspezifisch reagierenden Bindungsproteinen und zugehörigen Rezeptoren zu
erreichen und Testkits mit spezifisch reagierenden, langzeitstabilisierten Bestandteilen bereitzustellen.
Es wurde überraschend erfindungsgemäß gefunden, daß durch einen synergistisch-supraadditiven Effekt eines
Gemisches mehrerer Proteine, vorwiegend von Warmblütern unterschiedlicher Species Reaktionen mit
koimmobilisierten Rezeptoren, intermolekulare Reaktionen zwischen unspezifisch reagierenden immunologisch
aktiven Proteinen verringert werden.
Hierfür eignen sich insbesondere leicht zugängliche menschliche und tierische Proteine (z. B. vom Rind, Pferd,
Schwein, Schaf, Kaninchen, von der Ziege, Maus) im optimalen Mischungsverhältnis, vorwiegend in einer
Konzentration von 0,0015 bis 0,7 mg Protein/ 100 µl-Ansatz des Testes. Ein Zusatz abgebauter Proteine, die
modifiziert sein können, vorwiegend Abbauprodukte von Proteinen des Stütz- und Bindegewebes kann den Effekt
noch steigern.
Die Testpackung enthält Bestandteile, die durch Blockierung koimmobilisierter Rezeptoren oder durch Konkurrenz-
oder Verdrängungsreaktion unspezifisch reagierender Faktoren die ungewollt unspezifischen Reaktionen
unterdrücken.
Die in der Testpackung enthaltenen immunologisch reaktiven Substanzen, insbesondere Antikörper- und
Antigenpräparationen, Verbindungen der Antikörper bzw. Antigene mit Eiweißkörpern, Kontrollmaterialien,
Detektionsproteine - flüssig oder lyophilisiert - befinden sich zwecks Langzeitstabilisierung in einem Medium aus
Polyhydroxyverbindungen, vorzugsweise monomolekularen oder in einem acetalartig verknüpften Zustand in einer
Konzentration von 0,1 bis 55 Gew.-% unter Zusatz von heterocyclischen Verbindungen der allgemeinen
Zusammensetzung [HOC9H3(R1(R2)(R3)N]⁺X⁻, vorzugsweise unter Verwendung der Alkalisalze der Sulfonate in
einer Konzentration von 0,006 bis 0,5 Gew.-%, wobei R1 für den Rest H, Cl oder F, R2 für den Rest H, Cl, J oder F
und R3 für H oder einen Oxy-benzoesäuremethylester-Rest steht. X stellt einen anorganischen Säurerest dar,
vorzugsweise das Alkalisalz der Sulfate.
Außerdem können bei Bedarf peptidartig-verknüpfte Aminocarbonsäuren (1 bis 20 mmol/l) oder peptidartig
verknüpfte Homo- oder Heteroaminosäuren (1 bis 20 mmol/l) oder abgebaute Proteine (1 bis 5 mmol/l) oder
Proteine (0.01 bis 0,5 mmol/l) zugefügt werden.
Die Aufgabe, rationell monoklonale Antikörper zu produzieren, wird überraschend durch die Expression des Röteln-
Virus-Gens, das aus den anti-Rubella sezernierenden Hybridomaklonen ZIM 0504, ZIM 0505, ZIM 0506 isoliert
wird, in einem bakteriellen Wirt wie E.coli gelöst.
Zur Antikörperproduktion erfolgt die Kultivierung der mit dem Expressionsplasmid transformierten Zellen
zunächst bei 30°C, bis die logarithmische Phase erreicht ist. Bei dieser Temperatur wird durch Bindung des im
aktiven Konformationsstadium vorliegenden Repressors an die Promotorregion die Transkription der Gene
verhindert. Durch Temperaturerhöhung auf 42°C wird der Repressor thermisch inaktiviert und die Genexpression
überraschend erfolgreich vollzogen. Ausbeuten bis zu 25% an monoklonalen anti-Rubella-Antikörpern sind
erreichbar.
- a) Gewinnung von anti-Rubella-Meerrettichperoxidase(POD)-Konjugaten:
(modifiziert nach Wilson und Nakane);
POD-Aktivierung: 10,0 mg POD in 1,0 ml bidestilliertem Wasser lösen; 42,8 mg Natriumperjodat (NaJO4) in 2,0 ml bidestilliertem Wasser lösen (0,1 mol/l); zu 1,0 ml POD-Lösung 200 µl 0,1 mol/l NaJO4 (Endkonzentration 0,0166 mol/l) hinzugeben; 20 min bei 18 bis 25°C reagieren lassen (Farbübergang von braun nach grün); Abtrennung des überschüssigen NaJO4 mittels Gelchromatographie (Sephadex G 25, Pharmacia-LKB) in 1 mmol/l Natriumacetatpuffer (pH 4,4); vor der Trennung wird im vorgelagerten Versuch das Elutionsvolumen der Komponenten mit Dextranblau und Kaliumdichromat bestimmt, dabei entspricht das Elutionsvolumen von Dextranblau (blau) dem Elutionsvolumen der aktivierten Peroxidase und das Elutionsvolumen von Kaliumdichromat (gelb) dem des NaJO4.
Kopplung: Einstellung der Lösung der anti-Rubella-IgG-Antikörper, die durch Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie an Mono-Q-Sepharose und hydrophober Interaktionschromatographie an Phenylsuperose in 0,02 mol/l Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-0,15 mol/l Natriumchlorid-Puffer pH 8,0 und anschließender Affinitätschromatographie an Protein-A-Sepharose 6MB in 0,02 mol/l Tris-(hydroxymethyl)- aminomaethan-HCl-0,15 mol/l-Natriumchlorid-Puffer oder alternativ durch pH-Gradientenelution an Protein A- Sepharose (Peters, Baumgarten, Schulze, "Monoklonale Antikörper", Springer Verlag 1988, S. 192) mit anschließender Chromatographie an Sephacryl S 200 (Säule 100 × 1,5 cm, Elutionsgeschwindigkeit 10 ml/h) aus Zellkulturen (Patentschrift DD 293 265, H.Musielski, R. Laue, B. Pustowoit, B. Meisegeier, B. Thiel, Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Rötelnvirus) gewonnen wurden; mit 0,2 mol/l Natriumcarbonatlösung (Na2CO3) auf pH 9,50 einstellen; mischen von IgG und aktivierter POD im molaren Verhältnis von 1 : 4 (1 mg IgG + 1 mg POD) bis zu einem molaren Verhältnis von 1 : 8 (1 mg IgG + 2 mg POD) unter strenger pH-Kontrolle und Zusetzen von Na2CO3-Lösung; unter Rühren 2 bis 4 h bei 18 bis 25°C reagieren lassen;
Reduktion: 38 mg Natriumborhydrid (NaBH4) in 2,0 ml bidestilliertem Wasser lösen; zu je 1,0 ml Konjugatgemisch jeweils 10 µl NaBH4-Lösung unter Eiskühlung zugeben (Endkonzentration 5 mmol/l); 30 bis 120 min bei 4°C rühren oder schütteln lassen.
NaBH4-Entfernung: Dialyse unter schnellem Wechsel (3-maliger Wechsel, ca. 30 min-Abstand) gegen 2 Liter 0,01 mol/l Natriumphosphat-0,15 mol/l-Natriumchlorid-Puffer (pH 7,4) oder alternativ Gelchromatographie über Sephadex G 25 (siehe POD-Aktivierung).
Charakterisierung: Bestimmung des Proteingehaltes (z. B. spektralphotometrisch durch Messung der Extinktion bei 280 nm; der Eiweißgehalt wird nach c = E×d 10-1 × e 10-1 ermittelt, wobei E = Extinktion bei 280 nm, d = Schichtdicke (cm), e = molarer Extinktionskoeffizient für 1%ige Lösung bei 1 cm Schichtdicke = 13,5 bedeuten) und der Reinheitszahl RZ (RZ = Extinktion 403 nm/Extinktion 280 nm) auf bekannte Weise.
In der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (7,5%iges Gel, nichtreduzierende Bedingungen, Coomassie- Blaufärbung Vergleich mit bekannten Markern) ist nur eine Bande bei 160.000 sichtbar
Lagerung: A. bei -70°C bzw. B: bei 4°C in einer trisgepufferten (0,020 mol/l)-0,27 mol/l-Natriumchlorid- 0,006 mol/l- Kaliumchlorid-Lösung, die 0,02 Gew.-% Gentamycin, 2,0 Gew.-% Serumprotein vom Rind, 4,6 × 10-4 mol/l C9H7NO.HSO4K, 0,01 Gew.-% Phthalein der 3.3'Dibromphenolsulfonsäure (C19H12Br2O5S), 55 Gew.-% OHCH2.CH(OH).CH2OH enthält. - b) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil sterilen
Zubereitungen (sterilfiltriert über Glasfaservorfilter und Zelluloseacetatmembranschicht, Porengröße 0,2 µm) von
inaktivierten, verdünnten, [N mit Nonidet NP-40 (1% v/v) vorbehandelten] mit 0,01% (w/v) Gentamycin, 0,01%
(w/v) Merthiolat, 0,1% (w/v) C9H7NO.HSO4K, 20,0% (w/v) alpha-beta-D-Glucopyranose versetzten, in 2,5-ml-
Braunglasflaschen, hydrolytische Klasse 1 mit Schraubverschluß abgefüllten Humanseren mit 100 Teilen
trisgepufferter (pH 7,3)-[Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,2 g/l)]-[Trinatriumcitrat-dihydrat (14,71 g/)l]-
[Merthiolat (0,1 g/l)]-[ Gentamycin (0,1 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l )]-Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,05 g/l)]-[fetalen
Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Natriumchlorid (17,53 g/l)]-Lösung hergestellt wurden und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20-(0,5 g/l)-fetalen Serums
vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung)
enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml anti-Rubella-POD-Konjugat-Lösung (0,0002 mg Konjugat/ml Ansatz) und inkubiert 30 min bei 37°C.
Nach dem Waschen werden je Vertiefung 0,1 ml einer Tetramethylbenzidin-(1 mmol/l)-Wasserstoffperoxid (2×10-3 mol/l)Lösung in 0,2 mol/l Citratpuffer (pH 4,0) pipettiert; nach einer Reaktionszeit von 30 min bei 18 bis 25°C werden je Vertiefung 0,1 ml Schwefelsäure (1 mol/l) zugefügt. Durch Vertikalphotometrie wird die Extinktion bei 450 nm ermittelt. - c) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil sterilen
Zubereitungen (sterilfiltriert über Glasfaservorfilter und Zelluloseacetatmembranschicht, Porengröße 0,2 µm) von
inaktivierten, verdünnten, N mit Nonidet NP-40 (1% v/v) vorbehandelten, mit 0,01% (w/v) Gentamycin, 0,01%
(w/v) Merthiolat, 0,1% (w/v) C9H7NO.HSO4K, 20,0% (w/v) alpha-beta-D-Glucopyranose versetzten, in 2,5-ml-
Braunglasflaschen, hydrolytische Klasse 1 mit Schraubverschluß abgefüllten Humanseren mit 100 Teilen
trisgepufferter (pH 7,3) [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,2 g/l)]-[Trinatriumcitrat-dihydrat (14,71 g/)l]-
[Merthiolat (0,1 g/l)]-[Gentamycin (0,1 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,05 g/l)]-[fetales
Serum vom Rind (20,0 g/l)]-[Serum vom Pferd (25 g/l)]-[Serum vom Schaf (50 g/l)]-[Mausserum (5 g/l]-
[Natriumchlorid (17,53 g/l]-Lösung hergestellt wurden. Die Platten werden 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20-(0,5 g/l)-fetalen Serums vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml anti-Rubella-POD-Konjugat-Lösung (0,0002 mg Konjugat" ml Ansatz) und inkubiert 30 min bei 37°C. Nach erneutem Waschen werden je Vertiefung 0,1 ml einer Tetramethylbenzidin (1 mmol/l)-Wasserstoffperoxid (2×10-3mol/l)-Lösung in 0,2 mol/l Citratpuffer (pH 4,0) pipettiert; nach einer Reaktionszeit von 30 min bei 18 bis 25°C werden je Vertiefung 0,1 ml Schwefelsäure (1 mol/l) zugefügt. Durch Vertikalphotometrie wird die Extinktion bei 450 nm ermittelt. - d) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6) 16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil resuspendierter,
lyophilisierter Präparation von Humanseren in [abgebauten Succinyl- bzw. Furfuryl-Sklero/Bindegewebsproteinen
(30,0 g/l)]-[4-(beta-D-Galaktopyranosido)-D-glucopyranose (50,0 g/l)]-[Natriumazid (1,0 g/l)]-[Natriumchlorid (8,7
g/l]-Lösung (pH 6,5 bis 7,6) mit 100 Teilen trisgepufferter (pH 7,3) [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,2 g/l)]-
[Trinatriumcitrat-dihydrat (14,71 g/)l]-[Merthiolat (0,1 g/l)]-[Gentamycin (0,1 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,05 g/l)]-[fetales Serum vom Rind (20,0 g/l)]-[Serum vom Pferd (25 g/l)]-[Serum
vom Schaf (50 g/l)]-[Mausserum (5 g/l)]-[Natriumchlorid (17,53 g/l)]-Lösung hergestellt wurden und 1 h bei 37°C
inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20-(0,5 g/l)-fetalen Serums vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml anti-Rubella-POD-Konjugat-Lösung (0,0002 mg Konjugat/ ml Ansatz) und inkubiert 30 min bei 37°C.
Nach dem Waschen werden je Vertiefung 0,1 ml einer Tetramethylbenzidin-(1 mmol/l)-Wasserstoffperoxid (2×10-3 mol/l)Lösung in 0,2 mol/l Citratpuffer (pH 4,0) pipettiert; nach einer Reaktionszeit von 30 min bei 18 bis 25°C werden je Vertiefung 0,1 ml Schwefelsäure (1 mol/l) zugefügt. Durch Vertikalphotometrie wird die Extinktion bei 450 nm ermittelt.
- a) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet in [Phosphat (0,01 mol/l)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-
[Serumproteine vom Rind (70,0 g/l)]-[alpha-D-Glucopyranosido-beta-D-fructo-furanosid (100,0 g/l)]-[Natriumazid
(1,0 g/l]-Lösung bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03/90" [B.Pustowoit,
B. Meisegeier u. a., Klin.Lab. 38, 280-285 (1992)] bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid
(0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g)]-[Tetrabromphenolsulfonphthalein; chinoide
Form, Na-Salz (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20-(0,5 g/l)-fetalen Serums vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-AntikÖrper-B1-Biotin-Derivat (0,005 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-LÖsung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und pipettiert in jede Vertiefung 0,1 ml einer Lösung von 4-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml) in Diethanolamin (1 mol/l, pH 9,8) und läßt 30 min bei 37°C reagieren. Nach Zufügen von 0,1 ml Natriumhydroxid- Lösung in jede Vertiefung wird mittels Vertikalphotometrie bei 405 nm die spezifische Extinktion ermittelt. - b) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6) 16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet in [Phosphat (0,01 mol/l)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-
[Serumproteine vom Rind (70,0 g/l)]-[alpha-D-Glucopyranosido-beta-D-fructo-furanosid (100,0 g/l)]-[Natriumazid
(1,0 g/l]-Lösung bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03190"
(B. Pustowoit, B. Meisegeier u. a., Klin.Lab. 38, 280-285 (1992) bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen
[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-LÖsung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20- (0,5 g/l)-fetalen Serums
vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung)
enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0006 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)][Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)] Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und pipettiert in jede Vertiefung 0,1 ml einer Losung von 4-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml) in Diethanolamin (1 mol/l, pH 9,8) und läßt 30 min bei 37°C reagieren. Nach Zufügen von 0,1 ml Natriumhydroxid- Lösung in jede Vertiefung wird mittels Vertikalphotometrie bei 405 nm die spezifische Extinktion ermittelt. - c) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet wie beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-
Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03/90" bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid (0,13
mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-
Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer Natriumchlorid (8,7 g/l)-Tween 20-(0,5 g/l)-fetalen Serums vom Rind (100 g/l)-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella-Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37 °C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - d) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-RÖteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet wie beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-
Vergleichsstandards (S) bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen
Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20-(0,5 g/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella- Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]- [Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g)]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - e) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6) 16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender(N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet wie beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-
Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03190" bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-
[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20- (0,5 g/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella-Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h(37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - f) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Welse werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet wie beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-Röteln-IgM-
Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03190" bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-
[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum von der Maus (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
[Tetrabromphenolphthalein (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20-(0,5 g/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[ Serum von der Maus (10,0 g/l)]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-RubelIa-Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum von der Maus (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)]-LÖsung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - g) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet, wie oben beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-
Röteln-IgM-Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03/90" bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen [Natriumchlorid
(0,13 mol/l)]-[tetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum vom Schaf (10,0 g1l)]-[Tween 20
(0,5 g/l)]-[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20- (0,5 g/l]]-[fetalen Serums
vom Rind (90,0 g/l)-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in
der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella-Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (90,0 g/l)]-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriurnchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - h) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer (0,05 mol/l, pH 9,6)16 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten in bekannter Art
und Weise werden in die Vertiefungen der Platten je 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierenden
(P) bzw. -negativ-reagierenden (N) Kontrollmaterialien pipettiert, die durch Verdünnen von 1 Teil
resuspendierter Zubereitung anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N)
Kontrollmaterialien aus Humanseren, gefriergetrocknet, wie oben beschrieben bzw. 1 Teil resuspendierten anti-
Röteln-IgM-Vergleichsstandards (S) "Leipzig 03190" bzw. 1 Teil Patientenseren (PS) mit 100 Teilen (Natriumchlorid
(0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (69,0 g/l)]-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0
g/l)][Serum vom Menschen (10,0 g/l)][Serum von der Maus (1,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-
[Tetrabromphenolsulfonphthalein (0,02 g/l)]-Lösung hergestellt wurde und 1 h (37°C) inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20- (0,5 g/l]]-[fetalen Serums vorn Rind (69,0 g/l)]-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-[Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-[Serum von der Maus (1,0 g/l]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella-Antikörper-B2- Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (69,0 g/l)]-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-[Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-[Serum von der Maus (1,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - i) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer beschichtet, inkubiert und gewaschen wie beschrieben.
Es werden 0,1 ml von Mischungen anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N) Kontrollmaterialien, hergestellt durch Verdünnen von 1 Teil sterilen Zubereitungen (sterilfiltriert über Glasfaservorfilter und Zelluloseacetatmembranschicht, Porengröße 0,2 µm) von inaktivierten, [N mit Nonidet NP-40 (1% v/v) vorbehandelten], mit 0,01% (w/v) Gentamycin, 0,01% (w/v) Merthiolat, 0,1% (w/v) C9H7NO.HSO4K, 30,0% (w/v) alpha-D-Glucopyranosido-beta-D-fructo-furanosid versetzten, in 2,5-ml- Braunglasflaschen, hydrolytische Klasse 1 mit Schraubverschluß abgefüllten Humanseren mit 100 Teilen trisgepufferter (pH 7,3)-[Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (1,2 g/l)]-[Trinatriumcitrat-dihydrat (14,71 g/l)]- [Merthiolat (0,1 g/l)]-[Gentamycin (0,1 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Dichlorphenolsulfonphthalein (3×10-4 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (59,0 g/l)]-[Serum vom Pferd 10,0 g/l]-[Serum von der Maus 1,0 g/l]-[Serum von der Ziege 10,0 g/l]-[Serum vom Schaf 10,0 g/l]-[Serum vom Menschen 10,0, g/l]-[Natriumchlorid (17,53 g/l)]-Lösung hergestellt wurden und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten werden 0,1 ml einer [Natriumchlorid (8,7 g/l)]-[Tween 20- (0,5 g/l)]-[fetalen Serums vom Rind (59,0 g/l)]-[Serum vorn Pferd 10,0 g/l]-[Serum von der Maus 1,0 g/l]-[Serum von der Ziege 10,0 g/l]- [Serum vom Schaf 10,0 g/l]-[Serum vom Menschen 10,0, g/l]-Lösung, die Röteln-Virus-Antigen (Hämagglutinationstiter 1 : 16 in der gebrauchsfertigen Lösung) enthält, pipettiert und 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen der Platten füllt man in jede Vertiefung 0,1 ml [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,0025 mg/ml)]-[anti-Rubella-Antikörpei-B2-Biotin-Derivat (0,0003 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (59,0 g/l)]-[Serum vom Pferd 10,0 g/l]-[Serum vom Schaf (10,0 g/l)]-[Serum von der Ziege (10,0 g/l)]-[Serum vom Menschen (10,0 g/l)]-[Serum von der Maus (1,0 g/l)]-[Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung und inkubiert 1 h (37°C).
Die Platten werden in bekannter Weise gewaschen, und jede Vertiefung wird mit 0,1 ml [Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (0,00031 mg/ml)]-[Natriumchlorid (0,13 mol/l)]-[fetalen Serums vom Rind (100,0 g/l)]- [Tween 20 (0,5 g/l)]-Lösung beschickt. Die Platten werden 1 h (37°C) inkubiert.
Man saugt ab, wäscht und ermittelt die spezifische Aktivität, wie unter Beispiel 2a beschrieben.
- a) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer beschichtet, inkubiert und gewaschen wie beschrieben.
Es werden 0,1 ml von Mischungen (1 + 100) anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N) Kontrollmaterialien inkubiert wie beschrieben.
Nach dem Waschen in üblicher Weise läßt man 0,1 ml einer Mischung aus 1 Teil Röteln-Antigen-Präparation (Hämagglutinationstiter 1 : 64), 1 Teil [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,015 mg/ml)], 1 Teil [anti-Rubella- Antikörper-B2-Biotin-Derivat (0,002 mg/ml)] und 1 Teil, bestehend aus Serum vom Menschen (anti-Rubella- negativ, 10,0 g/l), Serum von der Ziege (10,0 g/l), Serum von der Maus (0,1 g/l), Serum vom Pferd (1 g/l), Ethylendiamintetraessigsäure-di-Na-salz (0,0006 mol/l) in Natriumchlorid (0,13 mol/l)-Serum vom Rind (100,0 g/l)-Tween 20 (0,5 g/l)-Bromphenolblau (20 mg/l)-Lösung (pH 6,5 bis 7,2), 1 h bei 37°C einwirken, wäscht und weist nach Inkubation des Streptavidin-Konjugates die spezifische Aktivität nach, wie unter Beispiel 2a beschrieben. - b) Die Vertiefungen von Polystyren-Mikrotitrationsplatten werden mit je 0,1 ml einer Lösung von anti-human-IgM in
Carbonatpuffer beschichtet, inkubiert und gewaschen wie beschrieben.
Es werden 0,1 ml von Mischungen (1+100) anti-Röteln-IgM-positiv-reagierender (P) bzw. -negativ-reagierender (N) Kontrollmaterialien inkubiert wie beschrieben.
Nach dem Waschen läßt man 0,1 ml einer Mischung aus 1 Teil Röteln-Antigen-Präparation (Hämagglutinationstiter 1 : 64), 1 Teil [anti-Rubella-Antikörper-B1-Biotin-Derivat (0,015 mg/ml)], 1 Teil [anti-Rubella-Antikörper-B2-Biotin. Derivat (0,002 mg/ml)] und 1 Teil, bestehend aus Serum vom Menschen (anti-Rubella-negativ, 5,0 g/l), Serum von der Ziege (10,0 g/l), Serum von der Maus (0,01 g/l), Serum vom Pferd (0,1 g/l), Ethylendiamintetraessigsaure-di- Na-Salz (0,0012 mol/l) in Natriumchlorid (0,13 mol/l)-Serum vom Rind (100,0 g/l)-Tween 20 (0,5 g/l)-Lösung (pH 6,5 bis 7,2), 1 h bei 37°C einwirken, wäscht und weist nach Inkubation des Streptavidin-Konjugates die spezifische Aktivität nach, wie unter Beispiel 2a beschrieben.
Der Vergleich der Extinktionen der Vertikalphotometrie zeigt die Wirksamkeit der Verfahrensweise.
Zur Produktion der anti-Rubella-Antikörper werden die DNA aus den Hybridomzellen Sifin-Rub-A1-58E10 (ZIM-Nr.
0504), Sifin-Rub-B1-12F10 (ZIM-Nr. 0505) bzw. Sifin-Rub-B2-18D10 (ZIM-Nr. 0506) isoliert, indem 0,5 ml Puffer-
Hybridomzellgemisch mit 5 ml Isolierungspuffer (25 mM EDTA, 75 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5) gemischt und
kräftig geschüttelt werden. Man fügt 50 µl Proteinase-K-Lösung (20 mg Proteinase K in 1 ml Wasser) und 0,3 ml
einer 20%igen Natriumdodecylsulfat-Lösung zu, inkubiert über Nacht bei 37°C und zentrifugiert bei 4000 × g 10
Minuten. Der Überstand wird mit 2 Volumen absol. Ethanol versetzt. Man gewinnt die DNA und löst in 1 ml Tris/HCl-
Puffer (10 mM Tris/1mM EDTA).
Vom versierten Fachmann werden die spezifischen DNA-Fragmente gewonnen. Unter Verwendung kommerzieller
Kits erfolgt die Ligation der DNA in den Vektor entsprechend Vorschriften der Kit-Hersteller.
Anschließend wird das Transportvehikel in das Wirtssystem, Bakterienzelle E. coli, die kommerziell erhältlich sind,
bei 28-30°C transferiert, wobei der Hitzeimpuls für 5 min bei 34°C erfolgt. Diese Prozedur kann relativ leicht vom
Fachmann ausgeführt werden.
Die Kultivierung der E.coli-Bakterien wird in kommerziell erhältlichen Selektionsmedien über 5 bis 28, vorzugsweise
3-8 Stunden durchgeführt. Bei einer Zelldichte von 0,7 A (578)/ml wird die Kultur zur Induktion der Genexpression
im Wasserbad bei 42°C unter Schütteln inkubiert.
Nach ggf. Ultraschallbehandlung (20-25 Pulse/min mit jeweils 1 min Pause bei einer Leistung von 80 W) werden die
Zelltrümmer durch Zentrifugation abgetrennt.
Ein Teil Kulturlösung wird unter Rühren mit einem Teil gesättigterAmmoniumsulfat-Lösung bei 18 bis 25°C
gemischt. Nach Zentrifugation bei 2000 U/min wird der Niederschlag in Natriumchlorid-Lösung (0,9 g/l)gelöst und
gegen Tris-Puffer über 2 Tage bei 4°C dialysiert. Durch Chromatographie erfolgt auf bekannte Art und Weise die
Reindarstellung der anti-Rubella-Antikörper.
Claims (32)
1. Verfahren zum immunologischen Nachweis oder zur Bestimmung von erregerspezifischen Plasmaproteinen mit
Antikörperaktivität unterschiedlicher Isotypie, dadurch gekennzeichnet, daß durch synergistisch-supraadditive
Effekte biologischer Substanzen, vorzugsweise von Warmblütern unterschiedlicher Species auf der Basis von
Bindungs- und/oder Konkurrenz- und/oder Verdrängungs- und/oder Blockierungsreaktionen unspezifischer Faktoren
ungewollte unspezifische Reaktionen unterdrückt und eigentümliche, kennzeichnende Eigenschaften hervorgehoben
werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise isotypspezifische Antikörper gegen
Rubella-Virus erfaßt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erfassung der Antikörper gegen Rubella-Virus
ein Festphasenimmunoassay dient und an die feste Phase ein Immunglobulin mit anti-isotypischen Determinanten,
das Rezeptoren zu Antigenbindungsstellen von Substrukturen humaner Immunglobuline besitzt, gebunden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Immunoassay die monoklonalen Antikörper Sifin-
Rub B1-2 F10 [Z1], Sifin-Rub B2-18 D10 [Z2] einzeln oder als Kombination oder daß Spaltprodukte oder
Kombinationen von Spaltprodukten dieser Antikörper oder daß aus den Hybridomaursprungszellen, die diese
Antikörper produzieren, gentechnisch gewonnene Polypeptide eingesetzt werden, die die Antigen-determinierenden
analogen Strukturbereiche der Antikörper Sifin-Rub B1-2 [Z1] und Sifin-Rub B2-18[Z2] aufweisen und analoge
Bindungsreaktionen eingehen.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper
folgende Stufen umfaßt:
- a) Umsetzung der Probe mit dem nachzuweisenden klassenspezifischen Antikörper X, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und gleichzeitig Determinanten zu Epitopen der Virusantigene Y vom Rubella-Virus besitzt, mit dem festphasenfixierten Protein W auf bekannte Art und Weise;
- b) Entfernung nichtgebundener Bestandteile und Einwirkung des Virusmaterials Y oder von Spaltprodukten des Virusmaterials Y oder von chemo- oder gentechnisch gewonnenen sequenzanalogen Strukturen des Materials Y, das Epitope zu den Polypeptiden Z1/Z2 (Sifin-Rub B1-12 D10, Sifin-Rub 2-18 F10) besitzt,
- c) Entfernung nicht gebundener Bestandteile, Einwirkung markierter Polypeptide Z oder einer Kombination der markierten Polypetide Z1/Z2 oder einer Kombination von Polypeptidfragmenten Z1/Z2, die Determinanten zu Y aufweisen oder Einwirkung der Polypeptide Z1/Polypeptide Z2 (einzeln oder in Kombination) mit nachfolgender Einwirkung von Proteinen, vorzugsweise markiert, die Rezeptoren zu Determinanten der Eiweißkörper von Z [Z1/Z2] haben und Manifestation des markierten gebundenen Anteils auf bekannte Art und Weise.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper
folgende Stufen umfaßt:
- a) Umsetzung der Probe mit dem nachzuweisenden klassenspezifischen Antikörper X, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und gleichzeitig Determinanten zu Epitopen der Virusantigene Y vom Rubella-Virus besitzt, mit dem festphasenfixierten Protein W auf bekannte Art und Weise;
- b) Entfernung nichtgebundener Bestandteile und Einwirkung des Virusmaterials Y oder von Spaltprodukten des Virusmaterials Y oder von chemo- oder gentechnisch gewonnenen sequenzanalogen Strukturen des Materials Y, das Epitope zu den Polypeptiden Z1/Z2 (Sifin-Rub B1-12, Sifin-Rub 2-18) besitzt, in Kombination mit Polypeptiden Z1/Z2 (einzeln oder kombiniert) oder Polypeptid-Z1-Bindungsprotein-V-Derivaten/Polypeptiden-Z2-Bindungsprotein V-Derivaten, wobei die Polypeptide einzeln oder kombiniert eingesetzt werden, und das Bindungsprotein V Affinitäten zu einem weiteren Bindungsprotein U, das vorzugsweise markiert sein kann, aufweist.
- c) Entfernung nicht gebundener Bestandteile, Einwirkung des Bindungsproteins U, vorzugsweise markiert und Manifestation des markierten gebundenen Anteils auf bekannte Art und Weise.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper
folgende Stufen umfaßt:
- a) Umsetzung der Probe mit dem nachzuweisenden klassenspezifischen Antikörper X, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und gleichzeitig Determinanten zu Epitopen der Virusantigene Y vom Rubella-Virus besitzt, mit dem festphasenfixierten Protein W auf bekannte Art und Weise;
- b) Entfernung nichtgebundener Bestandteile und Einwirkung einer Mischung aus Virusmaterial Y oder von Spaltprodukten des Virusmaterials Y oder von chemo- oder gentechnisch gewonnenen sequenzanalogen Strukturen des Materials Y, das Epitope zu den Polypeptiden Z1/Z2 (Sifin-Rub B1-12, Sifin-Rub 2-18) besitzt, von Polypeptiden Z1/Z2 (einzeln oder kombiniert) oder Polypeptid-Z1-Bindungsprotein-V-Derivaten/Polypeptid-Z2- Bindungsprotein-V-Derivaten, und des Bindungsproteins U, das vorzugsweise markiert ist;
- c) Entfernung nicht gebundener Bestandteile, Manifestation des markierten gebundenen Anteils auf bekannte Art und Weise.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper in
folgender Weise erfolgt: Kontakt eines immobilisierten Proteins W mit einer Mischung, die aus einer Probe, die den
nachzuweisenden Antikörper X enthält, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und zu Y besitzt, einer
Virussubstanz Y oder aus dem Spaltprodukt der Virussubstanz Y und dem markierten Polypeptid Z oder einer
Kombination markierter Fragmente der Polypeptide Z besteht und Manifestation der gebundenen markierten Anteile
auf bekannte Art uns Weise.
9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der isotypspezifischen Antikörper in
folgender Weise erfolgt: Kontakt eines immobilisierten Proteins W mit einer Mischung, die aus einer Probe, die den
nachzuweisenden Antikörper X enthält, der Rezeptoren zu den Determinanten von W und zu Y besitzt, einer
Virussubstanz Y oder aus dem Spaltprodukt der Virussubstanz Y und dem Polypeptiden Z-Bindungsproteine-V-
Denvaten (Polypeptide Z: einzeln oder in Kombination bzw. als Fragmente) und dem Bindungsprotein U, das
vorzugsweise markiert ist, besteht und Manifestation der gebundenen markierten Anteile auf bekannte Art uns
Weise.
10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polypeptide Z (Sifin-Rub B1-12, Sifin-Rub B
2-18) markiert sind.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsprotein U markiert ist bzw. sich mit
einem Marker umsetzen kann.
12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen mit einem Enzym markiert
sind.
13. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen mit einem
Lumineszenzmarker markiert sind.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym alkalische Phosphatase ist.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Meerrettichperoxidase ist.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym β-Galactosidase ist.
17. Verfahren nach Ansprüchen 6, 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsprotein V vorzugsweise
Biotin ist.
18. Verfahren nach Ansprüchen 6, 7 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsprotein U vorzugsweise
Streptavidin oder ein reaktionsanaloges Protein ist.
19. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erfassung der Antikörper gegen Rubella-Virus
ein Immunoassay mit spezifischer Antigen-Antikörper-Reaktion und netzwerkartiger Verknüpfung der Reaktanden
dient.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß im Immunoassay die monoklonalen Antikörper
Sifin-Rub A1-58 E 10, Sifin-Rub B1-2 F10 [Z1], Sifin-Rub B2-18 D10 [Z2] einzeln oder als Kombination oder daß
Spaltprodukte oder Kombinationen von Spaltprodukten dieser Antikörper oder daß aus den
Hybridomaursprungszellen, die diese Antikörper produzieren, gentechnisch gewonnene Polypeptide eingesetzt
werden, die die Antigen-determinierenden analogen Strukturbereiche der Antikörper Sifin-Rub A1-58 E 10, Sifin-
Rub B1-2 [Z1] und Sifin-Rub B2-18[Z2] aufweisen und analoge Bindungsreaktionen eingehen.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Serumbestandteile unterschiedlicher
Species mit gegenseitig unterstützender Wirkung eingesetzt werden.
22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Serumbestandteile von
Warmblütern in einer Konzentration von 0,0015 mg bis 0,7 mg Protein/ 100 µl-Ansatz verwendet werden.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Serumbestandteile während der Inkubation
jedes einzelnen Reaktionspartners, vorzugsweise bei der Inkubation von Mischungen der Reaktionspartner zugesetzt
werden.
24. Verfahren zur Produktion monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß genetische Informationen
der Hybridome Sifin-Rub-A1-58E10, Sifin-Rub-B1-12, Sifin-Rub-B2-18D10, die die Synthese monoklonaler anti-
Rubella-Antikörper bewirken, auf geeignete Wirtszellen, vorzugsweise E.coli, übertragen werden und anschließend
die Wirtsstämme kultiviert, und die spezifischen Proteine isoliert werden.
25. Verfahren zum immunologischen Nachweis oder zur Bestimmung von erregerspezifischen Proteinen mit
Antikörperaktivität oder von Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt eines immobilisierten Proteins,
das Rezeptoren A zu dem nachzuweisenden Analyten aufweist, mit dem Analyten und nachfolgend mit einem
Bindungsprotein, das Epitope zu Rezeptoren B des Analyten und zu den Rezeptoren C des nachfolgenden
festphasengebundenen Bindungspolypeptids bzw. zu Bindungspolypeptiden besitzt und nachfolgend mit dem
festphasengebundenen Bindungspolypeptid/mit den Bindungspolypeptiden erfolgt oder daß ein Analyt, der Epitope
zu den Bindungspolypeptiden besitzt, mit Bindungspolypeptiden einzeln oder in Kombination umgesetzt wird, wobei
die Bindungspolypeptide aus einem Zellklon produziert wurden, und der Grad der Reaktion auf an und für sich
bekannte Art und Weise visuell oder instrumentell ausgewertet wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungspolypeptid/die Bindungspolypeptide
an Polystyrol gebunden ist/sind.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß eine Brückenbildung des multivalenten
Bindungsproteins mit den Determinanten des Bindungspolypeptids/der Bindungspolypeptide eintritt und der Grad
der gesamten Bindungsreaktionen und Vernetzungsreaktionen visuell oder instrumentell auf bekannte Art und Weise
erfaßt wird.
28. Testpackung zur Erfassung von erregerspezifischen Plasmaproteinen mit Antikörperaktivität unterschiedlicher
Isotypie, dadurch gekennzeichnet, daß sie außer den Immunreaktanden Bestandteile enthält, die durch Bindungs-
und/oder Konkurrenz- und/oder Verdrängungs- und/oder Blockierungsreaktionen unspezifischer Faktoren ungewollte
unspezifische Reaktionen unterdrücken und Substanzen A, die die allgemeinen Zusammensetzung [HOC9H3(R1)
(R2)(R3)N]⁺X⁻ haben und benzokondensierte Ringsysteme des Pyridins sind, Polyhydroxyverbindungen und
Substanzen B, die substituierte Triarylmethylderivate darstellen, enthalten sind.
29. Testpackung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß in den Substanzen A die Reste R1, R2, R3, X
folgende Substituenten repräsentieren: R1 steht für H, Cl oder F und R2 für H, Cl, J oder F und R3 für H oder einen
Oxy-benzoesäuremethylester-Rest, X stellt einen anorganischen Säurerest dar, vorzugsweise werden die
Alkalisalze der Sulfate in einer Konzentration von 0,006 bis 0,5% eingesetzt.
30. Testpackung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Substanz B die Phthaleine der Phenol- oder
Kresol- oder Thymolsulfonsäuren eingesetzt werden.
31. Testpackung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die unsubstituierten oder vorzugsweise die 3'-,
3''-, 5'-, 5''- brom- und/oder chlorsubstituierten Derivate verwendet werden.
32. Testpackung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen in der anionischen Form,
vorzugsweise als Alkalisalze in einer Konzentration von 0,001 bis 0,3% eingesetzt werden.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996148629 DE19648629A1 (de) | 1996-11-12 | 1996-11-12 | Verfahren zur immunologischen Erfassung und Produktion von Antikörpern |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996148629 DE19648629A1 (de) | 1996-11-12 | 1996-11-12 | Verfahren zur immunologischen Erfassung und Produktion von Antikörpern |
Publications (1)
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DE (1) | DE19648629A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1197227A1 (de) * | 1999-06-21 | 2002-04-17 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Verfahren zur verabreichung von arzneimitteln mit bindungsaffinität zum plasmaprotein und verwendung der zusammensetzung in dem verfahren |
-
1996
- 1996-11-12 DE DE1996148629 patent/DE19648629A1/de not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1197227A1 (de) * | 1999-06-21 | 2002-04-17 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Verfahren zur verabreichung von arzneimitteln mit bindungsaffinität zum plasmaprotein und verwendung der zusammensetzung in dem verfahren |
EP1197227A4 (de) * | 1999-06-21 | 2002-12-04 | Nihon Mediphysics Co Ltd | Verfahren zur verabreichung von arzneimitteln mit bindungsaffinität zum plasmaprotein und verwendung der zusammensetzung in dem verfahren |
US7029653B1 (en) | 1999-06-21 | 2006-04-18 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Method of the administration of drugs having binding affinity with plasma protein and preparation to be used in the method |
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