JPH08242870A - 組換えベクター - Google Patents

組換えベクター

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JPH08242870A
JPH08242870A JP8052897A JP5289796A JPH08242870A JP H08242870 A JPH08242870 A JP H08242870A JP 8052897 A JP8052897 A JP 8052897A JP 5289796 A JP5289796 A JP 5289796A JP H08242870 A JPH08242870 A JP H08242870A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 高い（１０-15 Ｍ）感受性において、高分子
量および低分子量（分子量150 〜30,000ダルトン）の双
方の検体の定量的分析のための酵素相補性検定に使用す
る酵素ドナーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有
する組換えベクターを提供する。 【構成】 ＤＮＡ配列は該ＤＮＡ配列の複製及び発現を
行わせることが可能である発現調節配列が正しく配置さ
れており、酵素ドナーはスルフヒドリル、アミノおよび
カルボキシル基からなる群から選ばれた反応性基を有
し、該反応性基は活性酵素複合体を形成する酵素ドナー
複合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵
素ドナー複合体の検体結合タンパク質及び酵素アクセプ
ターへの競合結合によるいずれかの妨害なしに検体また
は検体誘導体に共有結合できるものである、酵素アクセ
プターとの相互作用によりβ−ガラクトシダーゼの活性
特性を有する活性酵素複合体を形成可能な酵素ドナーポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えベク
ター。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素相補性検定に
よる被検体の定性的および定量的分析に関する改良され
た方法に使用する酵素ドナーポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を有する組換えベクターに関するものであ
る。より詳しくは、本発明は、組換えＤＮＡ技術および
化学的ポリペプチド合成技術の双方により誘導された改
変酵素、およびこのような酵素の均質系[homogeneous］
および不均質系[heterogeneous］のエンザイム イムノ
アッセイ（酵素免疫検定法）に使用する酵素ドナーポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクタ
ーに関するものである。また組換えＤＮＡ誘導された及
び化学合成された酵素およびこのような酵素の均質系お
よび不均質系の受容体−配位子（レセプター -リガン
ド）相補性検定に使用する酵素ドナーポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を有する組換えベクターをも含むも
のである。
【０００２】
【従来の技術】免疫検定系について 先行技術は、ヤーロウとベーソン [Yalow and Berson]
（1960年，ジェイ．クリン．インベスト．，39：1157
[J.Clin.Invest.,39:1157] ）によるラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）の開拓的発展に端を発する多くの免疫検
定法（イムノアッセイ）を教示する。ＲＩＡは、所定量
の特異的抗体に対して所定量の放射性標識された検体を
未知量の標識されていない検体と競合させることによっ
て特徴づけられる。抗体に結合したあるいは溶液中に遊
離している放射性検体の量が適当なカウンターにおいて
定量されそして非放射性検体の濃度が決定される。この
一般的機構における改良は、(1) 放射性トレーサーの酵
素あるいは螢光トレーサーとの置換、(2) 多クローン性
（ポリクローナル）動物抗体の単クローン性（モノクロ
ーナル）抗体との置換、(3) 分光光度計、螢光測光計、
螢光偏光計および粒子数測定器を含む信号検知の改良さ
れた方法、ならびに(4) 結合したトレーサーの遊離トレ
ーサーからの物理的分離を必要としない均質系の検定法
の導入を含むものである。結合したトレーサーの遊離ト
レーサーからの分離は、プラスチック、紙、ガラスある
いはアクリルアミドなどのような固形支持体をしばしば
必要とするものである。慣例上抗体は、固相に結合し、
一方トレーサーと未知物は溶液中に遊離している。結合
／遊離分離は、固相の１ないしそれ以上の洗浄によって
達成される。残留する結合した活性が次に計測される。
このような検定法は、総じて不均質系の免疫検定法とし
て公知である。これに対して、均質系の検定法は、不正
確でかつ時間浪費の分離段階の必要性を除去するもので
ある。
【０００３】免疫検定法の商業化によって、ラジオイム
ノアッセイから、酵素結合イムノソルベント検定法(ELI
SA）へ、均質系の検定法へ使用されるようになった。こ
の変遷は、スピード、単純性、オートメーションおよび
放射能の不在という商業的要求によるものである。均質
系の検定法群はいくつかのタイプ、すなわち(1) 比濁分
析、(2) 粒子数測定、(3) 螢光消光、(4) 螢光偏光およ
び(5) 酵素検定法からなるものである。
【０００４】免疫反応を定量化するために光分散を測定
する最初の比濁計は、１９６０年代後半に考案された。
これらの初期の比濁計は、新しい化学をもって１０年後
に改良され、分散角を計測するための角度を下げ反応物
を混合した後の最初の数秒間の間の抗原−抗体反応速度
を計測できるようになった。（ライチェ，アルパーおよ
びグレーブス，1969年，アルスリティス リューム．1
2： 693；ディートンら，1976年，クリン．ケム．22：1
465[Ritchie，Alper and Graves,1969,Arthritis Rheu
m.12:693;Deaton et al., 1976, Clin.Chem.22:1465])
。これらの検定法は極めて感受性に貧しくそして例え
ば血清Ｉg Ｅ，Ｉg ＡおよびＩg Ｍレベルのような、１
０-8Ｍよりも大きい濃度の検体の測定に適用できるもの
である。均質系の粒子数測定検定法においては、直径
０．８μｍのポリスチレン粒子（ラテックス粒子）が抗
体により被覆される。抗原濃度は、非凝集粒子に対して
凝集粒子を識別し得る装置によって測定されるような凝
集したラテックス粒子の濃度により決定され得る（カン
ビアソら，1977年，ジェイ．イムノル．メソ．18：33[C
ambiaso et al.,1977,J.Immunol.Meth. 18：33］）均質
系の螢光消光検定法は、抗原か抗体のいずれかを螢光体
で標識する。検体- 抗体- 螢光体複合体は、抗原-螢光
体あるいは抗体- 螢光体のみのものと比較して著しくよ
り低い螢光を発する（ウルマンら，1979年，ジェイ．バ
イオル．ケム． 251：4172[Ullman et al.,1979,J.Bio
l.Chem. 251: 4172],米国特許第 3,998,943号；同第 3,
996,345号；同第4,174,384 号；同第 4,161,515号；同
第 4,208,479号および同第 4,160,016号）。これらのす
べての検定法は、消光の量が試料中の未知の検体あるい
は抗体の量に関連するような螢光を消光する種々の方法
を含むものである。これらの検定法は低い感受性のもの
である（１０-10 Ｍよりも大きな流体濃度での検体）。
この低い感受性は、内因性血清螢光および静的な非酵素
的拡大様式における螢光の使用によるものである。螢光
偏光検定法は、抗原- 螢光体に結合する抗体によって顕
著に減少する溶液における抗体- 螢光体の自由回転に基
づくものであり、そして低分子量（分子量1000ダルトン
以下）検体で重要な商業的成功を見いだしている（ダン
ドリカーら，1973年，イムノケミストリー10:219 [Dand
liker et.al.,1973,Immunochemistry 10:219] ）。
【０００５】種々の免疫検定法はそれぞれ商業的利点お
よび欠点を有している。ＲＩＡは感受性がありかつ設定
が容易であるが、放射能、分離段階および高価な器械使
用を必要とする。酵素あるいは螢光体を用いての不均質
系の検定法は、放射能およびいくつかの器械使用をなく
すものであるが、分離段階を必要とする。商業的見地か
らは、いくつかの理由のために分離段階をなくすことが
望ましい。分離は、(1) 徹底的な仕事であり、(2) 時間
浪費であり、(3) 付加的な装備を必要とし、(4) 結果の
ばらつきを増加し、そして(5) 高いレベルのオートメー
ションを妨げるものである。均質系の免疫検定法の多く
の商業的利点にもかかわらず、わずかに３つ、すなわち
ルーベンステインら[Rubenstein et al.］、米国特許第
3,817,837号の酵素標識系、バードら，1977年，クリ
ン．ケム．23：1402[Burd et al.,1977,Clin.Chem.23:1
402]の基質標識系、および螢光偏光（ダンドリカーら，
1973年，イムノケミストリー[Dandliker et al.,1973,I
mmunochemistry])が商業的成功を見い出しているにすぎ
ない。しかもなお、これらの３つの検定系は、小さな分
子量（1000以下）の検体に限定されそして検体は１０
-10 Ｍよりも大きな濃度において見出される。
【０００６】酵素免疫検定系について 酵素免疫検定法は、非常に好首尾なタイプの均質系の免
疫検定法である。均質系の酵素免疫検定法のいくつかの
別形態が、商業的成功を見出しており、(1) 酵素標識検
体系と(2) 基質標識検体系である。酵素標識検体系にお
いては、標識の酵素活性は、特異的抗体が検体- 酵素複
合体を結合した場合に減少される。計測されるべき検体
は、定められた量の検体に関して定められた量の特異的
抗体と競合する。酵素活性は、未知の検体濃度に正比例
する。以下の特許はこの免疫検定系に基づいて発行され
た：米国特許第3,817,837 号；同第 3,852,157号；同第
3,875,011号；同第3,966,556 号；同第 3,905,871号；
同第 4,065,354号；同第 4,043,872号；同第 4,040,907
号；同第 4,039,385号；同第 4,046,636号；同第 4,06
7,774号；同第 4,191,613号および同第 4,171,244号。
この技術の商業化は、低分子量検体および低感受性に限
定されている（１０-10 Ｍより大きな濃度での分子量10
00ダルトンより小さな検体）。
【０００７】基質標識螢光免疫検定法は、酵素に関して
螢光発生性の基質への検体の共有結合を含むものであ
る。この検体- 基質結合体は、螢光性ではない。抗体の
不在下においては、検体- 螢光発生性基質は酵素により
加水分解され螢光性分子種をもたらす。特異的抗体の存
在下においては、酵素による基質への接近は縮小され、
低減された螢光をもたらす（バードら，1977年，クリ
ン．ケム．23：1402；バードら，アナル．バイオケム．
77：56；ならびにコーエン，ホランダーおよびボグノラ
スキー，1979年，ジェイ．ステロイドバイオケム．11：
161[Burd et al.,1977,Clin.Chem. 23: 1402;Burd et a
l.,Aual.Biochem.77:56;and Kohen,Hollander and Bogn
olaski,1979,J.Steroid Biochem.11:161] ）。この検定
系の商業化は、立体的考慮に帰因して低分子量検体に限
定され、そして上記螢光消光検定法に関するものと同一
の考慮に帰因して１０-10 Ｍより大きな流体における濃
度での検体に限定されるものであった。
【０００８】限定された商業化に対抗した数多くの均質
系の酵素免疫検定法が述べられてきている。
【０００９】米国特許第 4,134,792号は、標識として酵
素阻害剤あるいはアロステリックエフェクターなどのよ
うな酵素モジュレーターを利用する免疫検定技術を述べ
ている。特異的抗体が酵素モジュレーター標識検体に結
合した場合、酵素モジュレーターはもはや酵素の活性を
阻害することができない。これゆえ遊離検体による酵素
モジュレーター標識検体の競合は、酵素モジュレーター
の阻害を回復させる。この分野におけるその他の特許に
は、米国特許第 3,935,074号；同第 ４，１３０，４６
２号；同第 ４，１６０，６４５号および同第 4,193，
983 号が含まれる。
【００１０】米国特許第 4,213,893号および同第 4,31
8,983号は、補因子- アポ酵素系を用いる酵素免疫検定
法を述べている。特に、ホーンバイら[Hornby et al.］
に対して発行された米国特許第 4,318,983号（1982年 3
月 9日）は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡ
Ｄ）標識された結合体とＦＡＤが補欠分子族として作用
するアポ酵素を用いる方法を述べている。コリコら[Cor
rico et al.]に対して発行された米国特許第 4,213,893
号（1980年 7月22日）は、ホーンバイらの方法において
使用するのに適した、例えばＦＡＤ標識チロキシンなど
のような特定のＦＡＤ標識結合体を述べている。ＦＡＤ
標識結合体は、このような結合体の触媒活性のためにＦ
ＡＤを必要とするアポ酵素とのインキュベーションによ
り発生するホロ酵素活性を計測することにより監視され
る。検体は、標識された補因子が脱水素酵素とのそれの
反応性を維持するように、ＦＡＤに共有結合される。脱
水素酵素活性によって形成される還元ＦＡＤの量は、検
体に関して特異的な抗体の存在下において減少される。
還元ＦＡＤの螢光定量的に監視された出現は、検体の量
に正比例するものである（コーエンら，1978年，ホルモ
ンと薬剤に関する酵素標識免疫検定法，エス．ビー．パ
ル編，ウォルター デギター，ベルリン アンドニュー
ヨーク，第67〜79頁中[Kohen et al.,1978,in Enzyme-l
abeled Immunoassay for Hormones and Drugs,S.B.Pal,
ed.,Walter deGuiter,Berlin and New York,pp.67-7
9])。乳酸脱水素酵素およびジアホラーゼを用いるビオ
チンおよび2,4-ジニトロフルオロベンゼン検体に関する
同様の系が述べられている（キャリコら，1976年，アナ
ル．バイオケム．72：271[Carrico et al.,1976,Anal.B
iochem. 72:271])。いずれの系も、分析される血清試料
中に一般に存在する内因性の補因子および酵素からの干
渉になやまされるものである。
【００１１】いくつかの酵素がペプチドフラグメントか
ら再形成されることが、観察されてきているが、例え
ば、リボヌクレアーゼＡ（リチャードとビサヤシル，19
59年，ジェイ．バイオル．ケム．249 ：1459[Richards
and Vithayathil,1959,J．Biol.Chem. 249: 1459])、ブ
ドウ球菌のヌクレアーゼ（ライトら，1974年，ジェイ．
バイオル．ケム． 249：2285 [Light el al.,1974,J.Bi
ol.Chem. 249 :2285] ）およびβ- ガラクトシダーゼ
（ラングレイとズィアビン，1976年，バイオケミストリ
ー 15：4866[Langley and Zabin,1976,Biochemistry
15: 4866])を含むほんのわずかのものしか酵素活性を回
復していない。ウシ膵臓のリボヌクレアーゼのズブチリ
シンによるタンパク質分解は、２つの成分、すなわちペ
プチド（S-ペプチド）とタンパク質（S-タンパク質）を
産する。S-ペプチドとS-タンパク質のいずれも単独で
は、評価し得るリボヌクレアーゼ活性を示さない。これ
らの成分が、等モルにおいて混合された場合、ほとんど
完全な酵素活性が回復される。S-ペプチドとS-タンパク
質はＫeq＝５×１０-9Ｍを有して非常に迅速にかつ強力
に再結合する（リチャードとビサヤシル，1959年，上
記）。ブドウ球菌のヌクレアーゼは不活性なペプチドフ
ラグメントからの生物学的に活性な酵素の再構築を示
す。完全な１４９アミノ酸ブドウ球菌のヌクレアーゼ構
造のアミノ酸６〜４８番を含むヌクレアーゼ-T-( 6〜4
8）[Nuclease-T-(6-48)］は、ヌクレアーゼ-T-(50〜14
9)[Nuclease-T-(50-149)］と再結合し、温度変化性のほ
とんどない０．０３〜０．０５／ｓの一次速度定数をも
つ活性なヌクレアーゼ -Ｔ１を形成する（ライト，上
記）。より詳細に下記で述べるように（「相補性とβ−
ガラクトシダーゼ」の節）、エシェリキア・コリ［E.
Coli］の欠失突然変異体からのポリペプチドフラグメン
ト（例えばＭ１５）は、熱的処理あるいは臭化シアン処
理されたβ- ガラクトシダーゼ酵素から誘導された小さ
なペプチドフラグメントと組合された場合に酵素活性を
回復するものであることが知られている。一方の臭化シ
アンで生成したフラグメントはＣＮＢｒ２と呼ばれ、他
方はＣＮＢｒ２４と呼ばれる。
【００１２】より最近になって、このようなポリペプチ
ドフラグメントの再結合に基づく免疫検定法が、ファリ
ナとゴルケ [Farina and Golke] （1983年 3月29日発行
の米国特許第4,378,428 号）によって、またゴネリら[G
onelli et al.]（1981年，バイオケム．アンド バイオ
フィズ．レス．コミュン． 102：917 〜923[1981,Bioch
em.and Biophys.Res．Commun , 102:917-923])によって
述べられた。これらの中に開示されたすべての実験的な
例は、リボヌクレアーゼ触媒活性を発生するためのS-ペ
プチド／S-タンパク質の再結合に基づくものであった。
１つの検体がリボヌクレアーゼの小さなズブチリシン開
裂ペプチド、すなわちS-ペプチド（アミノ酸１- ２０）
に共有結合的に付着された。これは１つの検体と共役さ
れ、そして活性なリボヌクレアーゼを再形成するために
S-タンパク質（アミノ酸２１−１２４）と組合される。
この検体に特異的な抗体はリボヌクレアーゼ活性の再形
成を阻害する。この検定法はすべてのオートクレーブ滅
菌されていない生物学的溶液における内因性リボヌクレ
アーゼ活性の存在により限定されるものである。
【００１３】この系によって決して応対されないその他
の同様な深刻な欠点としては、連結されるポリペプチド
の平衡定数を調整することの不可能性、および高分子量
タンパク質に結合し得る一方、活性な酵素を再形成をも
行ない得る免疫反応性のポリペプチドを作製することの
不可能性が挙げられる。利用されるすべてのポリペプチ
ドは活性なリボヌクレアーゼを形成するために再結合し
得る新規でない触媒的に不活性なポリペプチドであっ
た。
【００１４】ＣＮＢｒ２あるいはＭ１５に１つの検体を
付着させるためのファリナとゴルケ[Farina and Golke]
（米国特許第4,378,428 号）によって提唱された化学的
作用でのより顕著な欠点が発見されている。試験された
すべての場合において、いずれかのポリペプチド上の有
効なＮＨ2 、ＣＯＯＨおよびＳＨ基を介しての検体の付
着によって、相補し得ないペプチドが生じた。多くのア
ミノ、カルボン酸およびスルフヒドリル官能性を有する
Ｍ１５をカップリングすることによって、すべての場合
において（慎重に制御された条件ですら）Ｍ１５が不活
性化された。動力学は、活性を不活性にするのに十分で
ある単一ヒットを示す。ＣＮＢｒ２は内部のリシンを含
んでおらず、１つの非反復の[unique]スルフヒドリル基
および数個のカルボン酸基を含んでいる。ラングレー[L
angley］との一致（“β- ガラクトシダーゼ α- 相補
性の分子状態”と題された工学博士論文，ユーシーエル
エイ，1975年[Ph.D.thesis entitled "The Molecular N
ature of β-garactosidase α-complementation",UC
LA,1975]）において、N-末端α- アミノ基へのカップリ
ングによってＣＮＢｒ２の相補性活性が不活化される。
ＣＮＢｒ２の調製（ラングレー，フォウラーおよびゼビ
ン，1975年，ジェイ．バイオル．ケム． 250：2587[Lan
gley,Fowler and Zabin,1975,J.Biol.Chem. 25 0 :258
7]）において、第７６位のスルフヒドリルは、臭化シア
ン開裂に先だち、還元されそしてヨード酢酸でアルキル
化された。このスルフヒドリルがアルキル化されないと
すると、ＣＮＢｒ２活性は精製の段階の初期には維持さ
れ得るが、均質性へと精製する前に失活する。また、こ
のスルフヒドリルが、ヨード酢酸の代わりに検体のマレ
イミド誘導体でアルキル化されるとすると、結合体の不
溶性が精製をさまたげる。最後に、試験されたすべての
場合において、ＣＮＢｒ２のＣＯＯＨ部分へのカップリ
ングによって、相補性活性が不活性化された。それゆ
え、適当な免疫反応性で相補する試薬を調製するために
ＣＮＢｒ２およびＭ１５を使用することは困難なことで
あると思われる。
【００１５】相補性とβ- ガラクトシダーゼについて 酵素β- ガラクトシダーゼは、酵素結合イムノソルベン
ト検定法(ELISA)(エングバールとペールマン，1971年，
イムノケミストリー 8：871[Engvall and Perlmann,197
1,Immunochemistry 8 : 871]) および均質系の基質標識
検定法（バードら，1977年，クリン．ケム．23：1402[B
urd et al.,1977,Clin.Chem.23:1402]）において広範な
使用を見出されている。加えて、β- ガラクトシダーゼ
は、ＤＮＡクローニングおよびＤＮＡ配列に関する普及
した遺伝子系の基礎を形成する（メッシング，1983年，
メソッヅ イン エンザイモロジイ 101 ：20[Messin
g,1983,Method in Enzymology101 : 20])。
【００１６】β- ガラクトシダーゼは、５４，０００ダ
ルトンに等しい分子量（ＭＷ）を有する四量体タンパク
質である。４つの同一のモノマーは１０２１アミノ酸か
らなり、それぞれ１１６，０００ダルトンのＭＷを有す
る。図１に示すような単量体タンパク質は、３つの領
域、すなわち(1) N-末端近位セグメント（α- 領域）、
(2) 中間領域、および(3) C-末端遠位セグメント（ω-
領域）に分けられる。
【００１７】β- ガラクトシダーゼから誘導された変異
体ポリペプチドは、適当なβ- ガラクトシダーゼネガテ
ィブ変異体の抽出物に添加された場合、相補し得るある
いは酵素活性を自発的に回復し得るものとして知られて
いる。この現象は、シストロン内相補[intracistronic
complementation]として知られる。α- 相補性の一例
は、Ｍ１５／ＣＮＢｒ２相補系によって提供される。Ｍ
１５変異ポリペプチドはβ- ガラクトシダーゼのアミノ
酸１１〜４１番を欠いており、そして溶液中において酵
素的に不活性な二量体として存在する。臭化シアン（Ｃ
ＮＢｒ）開裂によりβ- ガラクトシダーゼから誘導され
たポリペプチドは、アミノ酸３〜９２番から成るもので
ある。ＣＮＢｒ２は、二量体Ｍ１５と混合された場合、
完全な酵素活性を有するβ- ガラクトシダーゼ四量体の
自発的再構築を促進する（ラングレーとゼアビン，1976
年，バイオケミストリー 15：4866[Langley and Zabi
n,1976,Biochemistry 15: 4866])。Ｍ１５ペプチドは
α- アクセプター（α- 受容体）として知られており、
またＣＮＢｒ２は、α- ドナー（α- 供与体）として知
られている。このことは、十分に研究された相補系を表
わしている一方、ＣＮＢｒ２はβ- ガラクトシダーゼ中
のアミノ酸２３〜３１番の欠失変異体であるＭ１１２二
量体に関するα- ドナーとして与えられ得る（リン，ビ
ラレジョおよびゼアビン，1970年，バイオケム．バイオ
フィズ．レス．コモン．40：249 ；セレダとゼアビン，
1979年，バイオケム．18：404 ；ウェルフィー，フォウ
ラーとゼアビン，1981年，ジェイ．バイオル．ケム． 2
56：6804；ラングレーら，1975年，プロク．ナトル．ア
カド．サイ．ユーエスエイ 72：1254[Lin,Villarejo a
nd Zabin,1970,Biochem.Biophys.Res.Commen. 40: 249;
Celeda,and Zabin, 1979,Biochem. 18: 404;Welphy,Fow
ler and Zabin,1981,J. Biol.Chem.256 : 6804;Langley
et al.,1975,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 72: 1254]
）。その他のα- ドナーとしては、β- ガラクトシダ
ーゼをオートクレーブ減菌することにより誘導されたポ
リペプチドを含むものである。このペプチドは、しかし
ながら、今だ精製されておらずまた配列も知られていな
い。Ｍ１５およびＭ１１２以外のα- アクセプターは述
べられていない。ＣＮＢｒ２によるＭ１５の相補の例に
おいて、アミノ酸配列３〜１０番および４２〜９６番は
双方とも酵素的に活性な複合体において二重に存在す
る。
【００１８】シストロン内相補はまた、β- ガラクトシ
ダーゼのC-末端（ω- 領域）で起こる。入手できる最も
よく知られた配列データは、少なくとも１０個のアミノ
酸、すなわち１０１１〜１０２１番を欠失したＸ９０ω
- アクセプターペプチドに関するものである。Ｘ９０ペ
プチドは単量体として存在し、アミノ酸９９０〜１０２
１番から成るβ- ガラクトシダーゼの臭化シアン消化産
物であるＣＮＢｒ２４によって相補され酵素的に活性な
四量体を再形成し得るものである（ウェルフィーら，19
80年，バイオケム．バイオフィズ．レス．コモン．93：
223[Welphyet al.,1980,Biochem.Biophys.Res.Common.
93: 223]）。
【００１９】Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原について Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）からのＤＮＡはクローニン
グされており、そしてプラスミドあるいはλ類縁ファー
ジ（ラムドイドファージ）ベクターに連結された後に一
連のフラグメントとしておよび完全な鎖状分子としてエ
シェリキア・コリ中において増殖されている（バーレル
ら，1979年，ネイチャー（ロンドン） 279：43〜47；チ
ャルネイら，1979年，プロク．ナトル．アカド．サイ．
ユーエスエイ 76：2222〜2226；シニンスキーら，1979
年，ネイチャー（ロンドン）279：346 〜468[Burrell e
t al.,1979,Nature(London)279 : 43-47;Charnay et a
l.,1979,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 76:2222-2226;Snins
key et al.,1979,Nature(London)27 9 : 346-468]）。続
いて、ＨＢＶの表面抗原（ＨＢＶ- ＳＡg)がクローニン
グされ、そしてエシェリキア・コリにおいて（マッケイ
ら，1981年，プロク．ナトル．アカド．サイ．ユーエス
エイ 78：4510〜4514[Mckayet al.,1981,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 78:4510-4514])、酵母において（バレンゼ
ーラら，1982年，ネイチャー 298 ：347 [Valenzuela
et al.,1982,Nature 298:347] ）、および哺乳動物細胞
において（デュボイスら，1980年，プロク．ナトル．ア
カド．サイ．ユーエスエイ 77：4549〜4553[Dubois et
al.,1980,Proc.Natl.Acsd.Sci.USA 77: 4549-4553]）
発現されている。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高い
（１０-15 Ｍ）感受性において、高分子量および低分子
量（分子量150 〜30,000ダルトン）の双方の検体の定量
的分析のための酵素相補性検定に使用する酵素ドナーポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えベク
ターを提供することである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】上記諸目的は、（１）
ＤＮＡ配列は該ＤＮＡ配列の複製及び発現を行わせるこ
とが可能である発現調節配列が正しく配置されて(in op
erative associationwith) おり、酵素ドナーはスルフ
ヒドリル、アミノおよびカルボキシル基からなる群から
選ばれた反応性基を有し、該反応性基は活性酵素複合体
を形成する酵素ドナー複合体と酵素アクセプターとの相
互作用によるまたは酵素ドナー複合体の検体結合タンパ
ク質及び酵素アクセプターへの競合結合によるいずれか
の妨害なしに検体または検体誘導体に共有結合できるも
のである、酵素アクセプターとの相互作用によりβ−ガ
ラクトシダーゼの活性特性を有する活性酵素複合体を形
成可能な酵素ドナーポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を有する組換えベクターにより達成される。
【００２２】上記目的はまた、（２） ＤＮＡ配列は該
ＤＮＡ配列の複製及び発現を行わせることが可能である
発現調節配列が正しく配置されており、酵素ドナーポリ
ペプチドは下記のアミノ末端で始まるアミノ酸配列を有
するものである、酵素アクセプターとの相互作用により
β−ガラクトシダーゼの活性特性を有する活性酵素複合
体を形成可能な酵素ドナーポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を有する組換えベクターによっても達成され
る： Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Gly Ile Asp Pro Thr Glu Ser Ser Pro Gly Asn Ile Asp Pro Arg Ala Ser Ser Asn Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp -X- Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu ただし、Ｘは Cysまたは Lysである。
【００２３】上記諸目的はさらに、（３） ＤＮＡ配列
は該ＤＮＡ配列の複製及び発現を行わせることが可能で
ある発現調節配列が正しく配置されており、酵素ドナー
は以下のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を有しかつスルフヒ
ドリル、アミノおよびカルボキシル基からなる群から選
ばれた反応性基を有し、該反応性基は活性酵素複合体を
形成する酵素ドナー複合体と酵素アクセプターとの相互
作用によるまたは酵素ドナー複合体の検体結合タンパク
質及び酵素アクセプターへの競合結合によるいずれかの
妨害なしに検体または検体誘導体に共有結合できるもの
である、酵素アクセプターとの相互作用によりβ−ガラ
クトシダーゼの活性特性を有する活性酵素複合体を形成
可能な酵素ドナーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を有する組換えベクターによっても達成される。
【００２４】
【化２】
【００２５】上記諸目的はまた、（４） ＤＮＡ配列の
複製及び発現を行わせることが可能な発現調節配列が正
しく配置されている、組換えベクターｐ１６９、または
その変異体、組換え体、若しくは遺伝子操作による誘導
体によっても達成される。
【００２６】
【発明の実施の形態】本発明によると、ポリペプチド
は、組換えＤＮＡ技術によってあるいは化学的ポリペプ
チド合成技術によって製造される。［本明細書中で用い
られる場合、“ポリペプチド”なる用語は、ペプチドと
タンパク質を含めたものである。］ポリペプチドそれら
自体は、酵素的に不活性であるが、水性媒体中でいっし
ょに反応した場合、これらは結合し、相補性として知ら
れる現象を介して触媒的に活性な酵素を形成する。β-
ガラクトシダーゼは、これが分光測光法および螢光定量
法を用いて検知できる数個の基質を有しており、従来の
商業的免疫検定法において有用性が示されており、かな
り低濃度において計測可能であり、そして遺伝学的に十
分特徴づけられているゆえに、好まれる酵素である。有
意でないバックグラウンドから酵素活性を生成すること
によって、高い信号対ノイズ比が達成される。本発明の
改良された検定法において用いられる新規なポリペプチ
ドは、(a) 検体およびポリペプチドに関してコードする
配列を含む組換え遺伝子の産物である、検体がポリペプ
チドに融合されるものである融合タンパク質；(b) 検体
との最適なカップリングのために遺伝子操作されたポリ
ペプチド；(C) 検体との最適なカップリングのために化
学合成されたポリペプチド；および(d) 酸化、熱、 p
Ｈ、酵素分解などのような環境因子に対する安定性を改
良するために遺伝子操作されたあるいは化学合成された
ポリペプチドを包含するものである。
【００２７】これゆえ、方法は、(1) 相補可能であり、
(2) 再結合の平衡定数について組織的に調整され得るも
のであり、(3) 特異的結合タンパク質と相互作用し得る
ものであり、そして(4) 特異的結合タンパク質との相互
作用によって、β- ガラクトシダーゼの活性特性を有す
る活性酵素の形成を制御し得るものである適当なポリペ
プチドを提供するための組換えＤＮＡ技術あるいは化学
的ポリペプチド合成技術に基づいた免疫検定法を生み出
すことに関して述べられる。
【００２８】本発明の遺伝子操作されたおよび化学合成
されたポリペプチドは、その他の相補する酵素系以上に
独特な利点を提供する。組換えＤＮＡ技術によって製造
されるポリペプチドは、低いコストで大量に生成される
ことができ、均質性のものに容易に精製でき、そして任
意の大きさおよび配列で生成され得るものである。化学
合成されるポリペプチド、特にアミノ酸長さにおいて比
較的小さなものであるポリペプチドは、高い収率におい
て、制限のない配列変化において生成され得る。いずれ
の調製技術も、改良されたカップリング化学特性、酵素
反応動力学、酵素的検定感受性および／または安定性の
ポリペプチドを導く、アミノ酸配列の巧妙な操作を提供
するものである。
【００２９】本発明は、水性媒体中でいっしょにインキ
ュベートされた場合に相補のプロセスによって活性なβ
- ガラクトシダーゼ酵素複合体を形成するものであり組
換えＤＮＡ技術あるいは化学的ポリペプチド合成技術を
用いて調製される酵素的に不活性なポリペプチドを用い
る、種々の検体に対する改良された検定法において使用
する組換えＤＮＡベクターからなるものである。本発明
によると、組換えＤＮＡ技術は、相補に必要とされる一
方のあるいは双方を調製するために用いられ得る。この
２つのポリペプチドは、(1) 酵素アクセプター[enzyme-
acceptor］および(2) 酵素ドナー[enzyme-donor]と呼ば
れる。ＤＮＡ合成技術は、種々の長さのポリペプチドに
関してコードする遺伝子配列の調製に適用され得る。酵
素ドナーおよび酵素アクセプターは、それらの技術によ
って調製される。化学的ポリペプチド合成技術は、アミ
ノ酸長さが比較的短いポリペプチドの調製に通常適用さ
れる。この理由ゆえ、化学的技術は、β- ガラクトシダ
ーゼ系の酵素ドナーの合成に最も適したものであり、こ
れはこの系の酵素ドナーは、酵素アクセプターに比較し
てアミノ酸配列において主として短いものであるからで
ある。もちろん、これは、ペプチド合成技術によって、
機能的な酵素- アクセプターが調製できないということ
ではない。
【００３０】本明細書において定義されるように、酵素
アクセプターは、β- ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失変
異体によって生成された酵素的に不活性なポリペプチド
であって、酵素ドナーと組合された場合に相補のプロセ
スによって活性なβ- ガラクトシダーゼを形成し得るも
のである。本明細書において構成されたすべての酵素ア
クセプターは、β- ガラクトシダーゼタンパク質のN-末
端をコード化するβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のα- 領
域においての欠失である。これらの酵素アクセプターの
いくつかは、より高い安定性を与えるために、曝れたシ
ステイン残基の除去を介してさらに操作されている。
【００３１】本明細書において定義されるように、酵素
ドナーは、２つのドメイン、すなわち(1) 活性な酵素を
形成するために酵素アクセプターと組合せられ得るタン
パク質配列を含むα- ドナードメインと(2) 検体結合タ
ンパク質[analyte- bindingprotein]と相互作用し得る
検体ドメインから成る酵素的に不活性なポリペプチドで
ある。検体ドメインは、(1) 検体カップリングドメイン
あるいは(2) タンパク質ドメインのいずれかである。
【００３２】本明細書において定義されるように、検体
カップリングドメインは、検体の共有結合のために都合
のよい部位を提供するためにポリペプチド中に挿入ある
いは置換されたアミノ酸で構成される。この化学的なカ
ップリング部位は、最も頻繁には、システインあるいは
リシン残基に関連するスルフヒドリルあるいはアミノ基
であるが、(a) 相補のプロセスあるいは(b) 検体の検体
結合タンパク質との相互作用によって干渉されることな
く検体に結合し得る任意のアミノ酸の任意の適当な化学
的反応性基であり得る。化学的反応性基の位置は、検定
法の立体障害要求に合致するように変えられ得る。
【００３３】本明細書において定義されるように、タン
パク質ドメインは、タンパク質抗原あるいは抗原の免疫
反応性基（エピトープ）からなるものである。例えば、
腫瘍性、細菌性、真菌性、ウィルス性、寄生体性、マイ
コプラズマ性、組織適合性、分化およびその他の細胞膜
抗原類、病原体表面抗原、毒素類、アレルゲン類、薬剤
類ならびに、ゴナドトロピンホルモン、卵胞成熟ホルモ
ン、甲状腺刺激ホルモン、フェリチンもしくは検体に相
当するあるいは類似する任意のその他の抗原性分子を含
む（もちろんこれらに限定されるわけではない。）任意
の生物学的に活性な分子などのような抗原が、可能なも
のである。本明細書において定義されるように、検体ド
メインがタンパク質ドメインである酵素ドナーはまた
“融合タンパク質”と呼ばれる。遺伝子工学によって構
築されたすべての酵素ドナーが、α- ドナードメインと
検体ドメインを有する融合タンパク質をコード化する遺
伝子融合を表わすものであるが、本明細書において定義
されるような“融合タンパク質”なる用語は、α- ドナ
ードメインとタンパク質抗原の免疫反応性エピトープを
特異化するタンパク質ドメインとから構成されるものの
みに適用できるものである。［もちろん、タンパク質ド
メインに関して、ある抗体以外のある検体結合タンパク
質と相互作用し得る非免疫反応性タンパク質あるいはそ
のフラグメントから成ることは可能である。］融合タン
パク質のタンパク質ドメインは、検体ドメインが検体カ
ップリングドメインであるものにおいては必要であるよ
うな、検体ドメインへの検体の共有結合の必要性を除去
するものである。これは、融合タンパク質のタンパク質
ドメイン部分が、本質的に、検体結合タンパク質に関し
て遊離検体と競合し得る検体（あるいは、少なくともそ
の近類似体）であるゆえである。
【００３４】試料あるいは媒体中に含まれる検体に対す
る任意の酵素検定法におけるように、検定混合物中に試
薬として含まれる検体結合タンパク質は、遊離検体およ
び、酵素ドナーの検体ドメインにカップリングしたある
いは検体ドメインの一部として融合した検体の双方と、
競合的に相互作用するあるいは組合せするものでなけれ
ばならない。酵素ドナーにカップリングしたあるいは酵
素ドナー中に融合した検体（以下“酵素ドナー結合体[e
nzyme-donor conjugate]”と呼ぶ）との検体結合タンパ
ク質の相互作用は、酵素ドナーと酵素アクセプターとの
相補のプロセスを阻止するものでなければならない。本
明細書において定義されるように、検体結合タンパク質
は、従来の（多クローン性）および単クローン性抗体
（およびそのフラグメント）を含む特異的抗体分子、レ
セプター、輸送タンパク質、レクチン、ならびにアビジ
ン、チロキシン結合グロブリンなどを含む（もちろんこ
れらに限定されるわけではない。）その他の結合タンパ
ク質を含むものである。本明細書において定義されるよ
うに、検体結合タンパク質なる用語は、糖タンパク質、
リポタンパク質などのようなタンパク質様物質を包含す
るものである。
【００３５】本発明による改良された酵素検定法は、競
合的結合機構に基づくものである。本発明によると、カ
ップリングされたまたは融合された関心の検体（あるい
は類似検体誘導体）からなるβ- ガラクトシダーゼ系の
酵素ドナー（すなわち酵素ドナー結合体）の既知量が、
特異的検体結合タンパク質の既知量および酵素ドナーと
相補し得る酵素アクセプターの既知量を合せたもので
る。特異的検体結合タンパク質の既知量に対する試料中
の酵素ドナー結合体の検体ドメインと遊離未知検体との
競合によって、酵素ドナー結合体は酵素アクセプターに
結合するように遊離する。酵素ドナー結合体と酵素アク
セプターとの会合[association］は、触媒的に活性な酵
素複合体の形成をもたらし、これゆえ、試料中に検知で
きるβ- ガラクトシダーゼ酵素活性が監視される。結果
的に、試料中の遊離検体の量は、計測可能な酵素活性の
正比例関数として決定される。酵素活性は、酵素触媒反
応による基質転化の速度を、分光測光法および螢光定量
法などを含む（もちろんこれらに限定されるわけではな
い。）種々の技術の任意なものによって監視することに
より計測される。本発明の検定法の競合的反応は以下の
反応式(1) 〜(3) で表わされる。
【００３６】なお、以下の反応式(1) 〜(3) において、
検体、酵素- ドナー結合体、酵素アクセプター、検体結
合タンパク質、およびβ- ガラクトシダーゼ酵素はそれ
ぞれＡ；ＥＤ〜Ａ；ＥＡ；ＡbpおよびＥで表わされる。
【００３７】
【化３】
【００３８】
【化４】
【００３９】検体結合タンパク質（Ａbp）の酵素ドナー
結合体（ＥＤ〜Ａ）上の接近可能な決定基への結合は、
酵素アクセプターが不活性な二量体をとどめるように相
補性反応を阻害する。
【００４０】これゆえ以下の式の反応式(2) は、以下の
反応式(3) と競合する。
【００４１】
【化５】
【００４２】
【化６】
【００４３】Ａbp、ＥＤ、ＡおよびＥＡの既知量を用い
ると、複合されるβ- ガラクトシダーゼ［Ｅ］の活性
は、試料中の関心の遊離検体の未知濃度に正比例するで
あろう。
【００４４】従来の酵素検定法におけると同様に、十分
な感受性のためには、検体結合タンパク質にカップリン
グした酵素ドナー結合体の酵素- アクセプターとの相補
による活性な酵素の形成が最小限なものとされなければ
ならない。言い換えれば、以下の反応式(4) および(5)
のいずれかあるいは双方は、わずかに最小限で進行する
かあるいは全く進行しないものでなければならない。
【００４５】
【化７】
【００４６】十分な感受性を有する特別な検定法を設計
するための臨界成分は、(1) 酵素ドナー結合体および酵
素- アクセプターに関する会合定数（Ｋ3a）；(2) 特異
的検体結合タンパク質の濃度（［Ａbp］）；(3) 特異的
検体結合タンパク質および酵素ドナー結合体に関する会
合定数（Ｋ2a）；ならびに酵素アクセプターの濃度
（［ＥＡ］）の間の関係である。
【００４７】ファリナとゴルケ[Farina and Golke]（米
国特許第4,378,428 号）によって提唱された次の不等式
は、特別の検定法を設計することにおける指針として用
いられ得る。
【００４８】
【化８】
【００４９】ファリナとゴルケ（上記）によってより詳
細に説明されるように、式Ｋ3 ［Ａbp］／Ｋ1 が［Ｅ
Ａ］よりも約２〜１００倍、好ましくは約５〜２５倍大
きいものであるように、検定が設計されることが通常望
ましい。さらにＥＤ〜Ａの濃度は、予想される未知の検
体濃度のものの約１０〜１００倍の因子にあるべきであ
る。これは、検定されるべき試料中における変化する検
体濃度に対して満足に応答する、反応(3) において形成
される触媒的に活性な酵素の量をもたらすものである。
【００５０】本発明による酵素相補性検定法の成分は、
水性媒体あるいは凍結乾燥形態のいずれかにおけるキッ
ト中に包装され得る。それぞれの成分ないしは試薬は、
別々に、または検定の感受性が変化されずかつ成分が悪
影響を及ぼされない限りにおいて他方の成分といっしょ
に包装され得る。このキットの１つの商業的実施態様
は、クローン化酵素ドナー免疫検定法[Cloned Enzyme-D
oner Immunoassay][CEDIA TM] と呼ばれる。
【００５１】酵素ドナー 本発明によると、改良された酵素検定法は、組換えＤＮ
Ａ技術および／または化学的ポリペプチド合成技術を用
いて調製された酵素ドナーおよび酵素アクセプターの使
用により達成される。このような技術は、適当な反応性
基、例えばアミノ、スルフヒドリル、カルボキシルなど
を有するアミノ酸の挿入あるいは置換により、酵素ドナ
ーと検体の間の共有結合に関する改良された化学特性を
もたらすものである。このような技術は、相補にするポ
リペプチドのアミノ酸配列を組織的に決定することによ
り、酵素アクセプターと酵素ドナーとの間の会合定数の
より正確な制御をもたらすものである。さらに、このよ
うな技術は、これらのポリペプチドの低価格で確かな源
を産出するものである。
【００５２】酵素ドナー：改良されたカップリング化学
特性 本発明の１つの実施態様によると、１つのα- ドナード
メインと１つの検体ドメインを有する酵素- ドナーは、
検体を検体ドメインへカップリングさせるための化学特
性を改良するために、組換えＤＮＡ技術の使用によって
調製される。これらの酵素ドナーポリペプチドは、相補
に必要とされるα- ドナードメイン配列から変化される
距離で、検体の共有結合的付着のための都合のよいカッ
プリング部位を提供する。
【００５３】１つの検体カップリングドメインを含有す
るタイプの酵素ドナーポリペプチドを得るために、当業
者に公知であるプラスミド pＵＣ１３（図２Ａ参照）
が、種々の酵素を用いてα- 領域中の異なる部位で開裂
され得る。例えば、ＨaeＩＩ、ＢglＩ、ＭstＩあるいは
Ｐ vuＩでの開裂は、H-シリーズ、B-シリーズ、M-シリー
ズおよびP-シリーズ α- 領域をそれぞれ生じる。B-シ
リーズおよびH-シリーズはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼお
よびＳ１ヌクレアーゼで処理される。M-シリーズとP-シ
リーズは処理されない。ＤＮＡのそれぞれのシリーズ
は、多重クローニング部位においてＳacＩで消化され、
そしてα- 相補ペプチドをコードする小さなＤＮＡはア
ガロースゲル精製により精製され、ＤＥＡＥ- セルロー
ス紙上に電気泳動され、溶出されそしてエタノール沈澱
される。
【００５４】さらに、プラスミドを遺伝子操作し、温度
誘発性プロモーター[temperature inducible promoter]
の調節[regulatory control］下にα- ドナー配列を置
く。
【００５５】これは、温度感応性であり、タンパク質発
現の温度誘発を準備する１つのλリプレッサータンパク
質（λＣＩ遺伝子によってコードされた）と組合せて、
１つのλＰr プロモーターを用いて達成され得る。λ変
異体遺伝子ＣＩ８５７は、３７℃より高い温度で不活性
である温度感応性リプレッサータンパク質に関してコー
ドするものである。以下、λＣＩ遺伝子に関するものは
ＣＩ８５７変異体遺伝子と言及する。
【００５６】本発明の他の実施態様によると、１つのα
- ドナードメインと１つの検体ドメインを有する酵素ド
ナーは、検体を検体ドメインにカップリングするための
化学特性を改良するために、化学的ポリペプチド合成技
術の使用によって調製される。これらの酵素ドナーポリ
ペプチドは、相補に必要とされるα- ドナードメイン配
列から変化される距離で、検体の共有結合的付着のため
の都合のよいカップリング部位を提供する。化学的ポリ
ペプチド合成技術はまた、α- ドメインおよびタンパク
質ドメインからなる酵素ドナーを調製するために用いら
れ得る。酵素ドナーペプチドは、標準合成技術によって
自動化ペプチド合成器において合成される。簡単に述べ
ると、所望のペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を表わ
す保護されたアミノ酸が架橋ポリスチレンビーズに付着
される。この樹脂ビーズは、付加的なアミノ酸が、段階
的様式においてカップリングされ得る固相として機能す
る。ペプチドは、カルボキシ末端からN-末端へ連続的に
鎖を成長させることによって生成される。固相は、反応
を迅速に１００％完了に導くことを、過剰な試薬を用い
ることによって容易とする。過剰な試薬は、次に容易に
洗浄除去され得る。合成段階の完了時に、ペプチドは樹
脂より除去されそして精製される。
【００５７】本発明の方法により調製される酵素ドナー
ペプチドは、ＣＮＢｒ２／Ｍ１５、ＣＮＢｒ／Ｍ１１２
およびＣＮＢｒ２４／Ｘ９０相補系の従来のポリペプチ
ドより、検体に対する付着に関する優れたカップリング
化学特性を有するものである。
【００５８】多くのアミノ、カルボキシルおよびスルフ
ヒドリル基を有するＭ１５への検体のカップリングは、
すべての場合において（十分に制御された条件において
すら）、Ｍ１５を不活性とした。動力学実験は、活性を
不活性とするのに十分である単一ヒットを示している。
同様の結果がＭ１１９およびＸ９０でも期待されるもの
であった。
【００５９】試験されたすべての場合において、Ｎ
Ｈ2 、ＣＯＯＨおよびＳＨ基を介してＣＮＢｒ２ペプチ
ドへの検体の共有結合的付着は、相補し得ないポリペプ
チドをもたらしたＣＮＢｒ２は、内部のリシンを含んで
おらず（有効なＮＨ2 基がない）、１つの非反復のスル
フヒドリル基および数個のカルボキシル酸基を含んでい
る。最初に、ラングレーとの一致（“β- ガラクトシダ
ーゼ α- 相補性の分子状態”と題された工学博士論
文，UCLA，1975年）において、N-末端α- アミノ基への
カップリングは、ＣＮＢｒ２の相補活性を不活化するこ
とが示されている。一連の実験において、異なる分子量
の化合物のいくつかが、ＣＮＢｒ２ペプチドのN-末端に
位置する単一アミノ基に共有結合的に付着した。以下の
化合物は、このペプチドのN-末端アミノ基と反応した：
無水コハク酸（ＭＷ１００ダルトン）；ビオチン-N- ヒ
ドロキシスクシンイミド エステル（ＭＷ３４２ダルト
ン）；4-フェニルスピロ［フラン-2(3ＨＯ，-1'-フタロ
ン］-3,3'-ジオン（フルオレサミン）（ＭＷ２７８ダル
トン）；およびジクロロトリアジニルアミノフルオロセ
イン- ジヒドロクロライド（ＭＷ５６８ダルトン）。こ
れらの酵素ドナー結合体による相補は、遊離ＣＮＢｒ２
ペプチドによる相補と比較された。Ｍ１５あるいはＥＡ
２３酵素アクセプターのいずれかを相補するＣＮＢｒ２
の能力は、付着した化合物によってそれぞれ約２５％、
３９％、４６％および６３％阻害された。組み換えＤＮ
Ａ技術によって調製された酵素ドナーポリペプチドのN-
末端アミノ基へのこれらの同様の化合物の類似の共有結
合的付着は、相補を同様に阻害したことに注意すべきで
ある。これゆえ、検体、特に約５００ダルトンより大き
な分子量の検体のN-末端のアミノ基へのカップリング
は、酵素- ドナーポリペプチドによる相補をかなり制限
するものである。
【００６０】第二に、精製されたＣＮＢｒ２ペプチドに
おいては、検体の共有結合的付着のために有効な遊離ス
ルフヒドリル基がない。ＣＮＢｒ２の調製（ラングレ
ー，フォウラーおよびゼビン，1975年，ジェイ．バイオ
ル．ケム．250 ：2587[Langley,Fowler and Zabin,197
5,J.Biol.Chem. 250 :2587]）において、第７６位のス
ルフヒドリルは、臭化シアンによる開裂に先だち、還元
されそしてヨード酢酸でアルキル化される。このスルフ
ヒドリルがアルキル化されないとすると、ＣＮＢｒ２活
性は、精製の段階の初期には維持され得るが、均質性へ
の精製の前に失われる。また、このスルフヒドリルがヨ
ード酢酸の代わりに検体のマレイミド誘導体でアルキル
化されるとすると、結合体の不溶性が精製をさまたげ
る。
【００６１】第三に、試験されたすべての場合におい
て、ＣＮＢｒ２のＣＯＯＨ部分へのカップリングは相補
性活性を不活性とした。例えば、テオフィリン-8- プロ
ピルアミンが、水溶性カルボジイミド1-エチル-3-(3-ジ
メチル- アミノプロピル）カルボジイミド（EDAC，シグ
マケミカル カンパニー[Sigma Chemical Co.]、ミズー
リー州セントルイス）を用いて、テオフィリンをＣＮＢ
ｒ２にカップリングする試みにおいて用いられた。テオ
フィリン-8- プロブチレートが、クックら[Cooket al.]
(1976年，レス．コム．ケム．パス．ファラム．13：497
〜505[1976,Res.Comm.Chem.Path.Pharm.13:497-505])
に従い合成され、そして修正されたカーティウス[Curti
us］転位（ウォッシュボーンとペーターソン、シンステ
ィク コム．1972年，2 (4) ：227 〜230[Wash-borne a
nd Peterson,Synthetic Comm.1972,2 (4) :227-230])に
よってテオフィリン-8- プロピルアミンに転化された。
精製された生成物の構造は、デューク ユニヴァーシテ
ィ[Duke University］でティー．バナマン博士[Dr.T.Va
naman]によって質量分析学により確認された。０．１Ｍ
ＮａＰＯ4 、 pＨ７．４の０．５ml中のＣＮＢｒ２の２
×１０-11 mol とテオフィリン-8- プロピルアミンの１
×１０-5mol を含む数本の試験管に対し、ＥＤＡＣの減
少量が添加された。得られた相補活性は、酵素- アクセ
プターとしてのＭ１５および基質としてのo-ニトロフェ
ニル -β-D- ガラクトピラノシドを有する０．５Ｍ Ｐ
Ｍ２緩衝液[PM2 Buffer]中において測定された。ＥＤＡ
Ｃは使用の直前に溶解され、冷水中に希釈され、種々の
希釈の１０μｌが反応管中に添加された。１．４０３；
０．０００；０．０００；０．０１０；０．０１８；
０．１２５；および０．９８３の光学濃度（４１４nm）
がそれぞれ、０；１×１０-6；１×１０-7；１×１
０-8；１×１０-9；１×１０-10 ；１×１０-11 モルの
ＥＤＡＣの濃度を用いて計測された。これらのデータは
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ドとのカップリングを試みられたＣＮＢｒ２の迅速な不
活性化を示すものである。
【００６２】これに対して、本発明により調製される酵
素- ドナーポリペプチドは、N-末端より十分に離れたス
ルフヒドリル、アミノあるいはカルボキシル基を、酵素
ドナー結合体の触媒的に活性な酵素複合体を酵素アクセ
プターと形成する能力による干渉なく検体がこれらの基
に共有結合的に付着されるように、提供するために、遺
伝子操作されるあるいは化学的に合成される。スルフヒ
ドリルおよびアミノ基が好ましいものである。
【００６３】遊離スルフヒドリルが存在する場合、それ
は検体上に存在する反応性基と反応し得る。このような
反応性基としては、反応性ハロアルキル基および酸／ハ
ロ基、p-メルクリベンゾエート基ならびにミカエル型付
加反応[Michael-type addition reaction]し得る基（例
えば、マレイミドや，ミトラルとラウトン，1979年，ジ
ェイ．アメル．ケム．ソシ．101 ：3097〜3110[Mitral
and Lawton,1979,J.Amer.Chem.Soc.101 : 3097-3110]に
おいて述べられたタイプの基などを含む）などが含まれ
るが、もちろんこれらに限定されるわけではない。本明
細書において定義されるように、ハロアルキルは、臭
素、ヨウ素、あるいは塩素で置換された１〜３個の炭素
原子の任意のアルキル基からなる。検体が、酵素ドナー
の遊離スルフヒドリル基に対してカップリングするため
のこのような反応性基を有していない場合、検体の誘導
体が、このような反応性基を含むように調製され得る。
【００６４】酵素- ドナー：融合タンパク質 本発明の他の実施態様によると、酵素ドナーポリペプチ
ドは、α- ドナードメインをコード化する遺伝子を、検
定されるべきタンパク質検体（あるいはその一部）をコ
ード化する他の遺伝子と、連結する[ligating]あるいは
融合することにより調製される。適当な宿主細胞におけ
る連結された遺伝子の発現は、酵素アクセプターとの相
補および検体結合タンパク質への特異的結合のいずれを
もなし得る融合タンパク質産物をもたらす。これゆえ、
本発明のこの実施態様により調製された融合タンパク質
は、いずれも融合された遺伝子によりコード化された、
２つのドメイン、すなわち(1) α- ドナードメインと
(2) タンパク質ドメインとから成るものである。先に述
べたように、本発明において利用されるタンパク質ドメ
インは、タンパク質抗原の免疫反応性エピトープからな
るものである。
【００６５】融合タンパク質をコード化する遺伝子を構
築する[construct］ために、問題の２つの遺伝子は、翻
訳解読枠が維持されかつ終止コドンによって不断とされ
るように、これらのコーディング配列と連接されなけれ
ばならない。さらに、宿主がリプレッサーを含む株であ
る場合、融合タンパク質は、誘導のリプレッサーの不活
性化に対する応答してのみ産出される。融合タンパク質
は、相補性活性に関して、酵素アクセプターの生体内相
補［in vivo complementation］によって同定される。
免疫反応性およびタンパク質ドメインとの抗体の相互作
用による相補の免疫特異性阻害に関する遺伝的構造物の
スクリーニングは、試験管内的に［invitro ］行なわれ
る。
【００６６】融合タンパク質は、免疫反応性ポリペプチ
ドがα- ドナードメインのN-末端にあるいは酵素- ドナ
ーポリペプチドのC-末端に付着されることで構築される
ことができる（図４〜６参照）。α- ドナードメインと
タンパク質ドメインの間のスペーサー配列は、相補性を
高めるあるいは、相補における特異的結合タンパク質と
の相互作用の阻害効果を高めるために用いられ得る。
【００６７】さらに、特定のタンパク質検体に関してコ
ードする完全遺伝子の融合は、必要とされないものであ
る。例えば、関連ヒト糖タンパク質ルトロピン[leutrop
in](黄体化ホルモン；ＬＨ）、フォリトロピン[follitr
opin](卵胞刺激ホルモン；ＦＳＨ）、チロトロピン（甲
状腺刺激ホルモン；ＴＳＨ）およびヒド絨毛性ゴナドト
ロピン(hＣＧ）はαおよびβ- サブユニットからなる。
これらすべてのホルモンのα- サブユニットは同一のも
のである。しかしながらそれぞれの場合において、β-
サブユニットは異なっており、そしてそれぞれのホルモ
ンの独特の特異性および生物学的活性を与えるものであ
る。これゆえ、β- サブユニットのみが、このグループ
の特定のホルモンに関して特異的な免疫検定法を構成す
るために、α- ドナードメイン配列に融合される必要が
あるであろう。
【００６８】あるいはまた、α- ドナーをコードする遺
伝子配列に融合されるタンパク質ドメインに関しコード
する免疫反応性配列は、非反復の免疫反応性エピトープ
で表わされ得る。例えば hＣＧのβ- サブユニットの独
特なカルボキシ末端３０アミノ酸延長（ビルケンら，19
82年，エンドクリノロジイ 11 0：1555[Birken et al.,1
982,Endocrinology 110：1555])が hＣＧに関する検定
においてタンパク質ドメインとして用いられ得る。
【００６９】その他の例示的実施例によると、完全Ｂ型
肝炎ウィルス表面抗原に関する配列あるいはこの配列の
ほんの小さな部分が、Ｂ型肝炎ウィルスに関する免疫反
応性エピトープとして用いられることができた（レーナ
ーら，1981年，プロク．ナトル．アカド．サイ．ユーエ
スエイ 78：3403[Lernere et al.,1981,Proc.Natl.Aca
d.Soc.USA 78:3403]）。
【００７０】酵素ドナーは、市販のＤＮＡ合成器および
同様なものを用いるＤＮＡの直接合成を含む組換えＤＮ
Ａ技術を包含する種々の方法によって調製されることが
できる。
【００７１】酵素アクセプター 先に述べたように、酵素ドナーと酵素アクセプターポリ
ペプチドとの間の会合の定数は、任意の酵素相補性検定
系で満足な感受性を達成するための重要なパラメーター
である。本発明によると、酵素ドナーと酵素アクセプタ
ーとの間の会合の定数を調整するために、酵素ドナーα
- ドメイン（上記、「酵素ドナー」参照）あるいは酵素
アクセプターのいずれかのアミノ酸配列が組織的に変え
られる。酵素ドナーに対して変更された親和性を有する
酵素アクセプターは、欠失体構築あるいは、所望のアミ
ノ酸配列を有するＤＮＡの直接合成後の天然のβ- ガラ
クトシダーゼをコード化する lacＺ遺伝子のα- 領域の
ＤＮＡ配列中への枠内における連結を含む（もちろんこ
れらに限定されるものではない。）種々の組換えＤＮＡ
技術を用いて調製される。
【００７２】欠失体構築による酵素アクセプターの調製
に関する例示的技術は、下記において詳細に表わされ
る。非常に簡単にのべると欠失体構築技術は、β- ガラ
クトシダーゼＺ遺伝子のα- 領域中への特定の制限酵素
に関して特異的な部位の導入した後、例えばＢal３１消
化のような部位特異的消化をし所望のアミノ酸配列を得
ることを含むものである。適当な制限酵素での消化の後
に、生存可能な酵素アクセプターは、生体内相補能を用
いて単離される。例えば、相補は、関心の酵素ドナーな
らびに酵素アクセプターに関しコードする温度誘発性遺
伝子を持つプラスミドを、ＡＭＡ１００４（ＡＭＡ１０
０４は、 galＵ， galＫ，ＳtrＡｒ， hsdＲ- ， leuＢ
６， trpＣ，△（lac ＩＰＯＺ）Ｃ２９である。）（カ
サダバンら，1983年，メソッズインエンザイ←モロジイ
[Casadaban et al.,1983,Methods in Enzymology 100:2
93])のような株中に形質転換し、そして誘導物質イソプ
ロピルチオガラクトシドおよび色素産生性基質5-ブロモ
-4- クロロ-3- インドリル -β-D- ガラクトピラノシド
を含むプレートにおいて選択することによってスクリー
ニングされ得る。３０℃では白色であるが４２℃では青
色のコロニーは、生存可能な酵素アクセプターの産生を
示す。このような酵素アクセプターからのＤＮＡはＳal
Ｉで切断され、再連結されそしてＡＭＡ１００４中へ形
質転換される。酵素アクセプターポリペプチドは次に精
製される。
【００７３】あるいはまた、酵素- アクセプターは、任
意の市販のＤＮＡ合成器を用いるＤＮＡの直接合成によ
って調製され得る。所望の合成ＤＮＡ配列は、次にアニ
ーリングされそして適当なプラスミドベクター中へ連結
される。例えば、プラスミドp１５０はＢamＨＩおよび
ＸhoＩ制限酵素で消化される。所望の合成ＤＮＡ配列は
次にＢamＨＩ／ＸhoＩギャップ中に挿入される。
【００７４】本発明の他の実施態様によると、安定性が
向上した酵素アクセプターが、酵素相補性検定における
使用のために調製される。酵素アクセプターの不安定性
は、酸化状態によって最も顕著に影響される。エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および2-メルカプトエタノ
ールもしくはジチオトレイトールのような還元剤は、酵
素アクセプターの安定性を劇的に改良する。これらの結
果は、不安定性の原因としての酵素アクセプターにおけ
る曝れたスルフヒドリル基を指すものである。ジョルン
ヴォール、ウォウラおよびゼアビン（バイオケミストリ
ー，1978年，17：5160〜5164[Biochemistry,1978 17：
5160-5164]）によると、天然β- ガラクトシダーゼの単
量体ポリペプチド鎖の１６のシステイン残基の２つが酵
素の表面上に位置される。しかしながら、酵素- アクセ
プターＭ１５は、表面上に５つのシステイン残基を含
む。これゆえ酵素アクセプターの安定性を改良するため
に、曝されたシステイン残基は、下記において述べられ
る改良された酵素- アクセプターから組織的に除去され
る。酵素アクセプターをコード化する遺伝子は、適当な
Ｍ１３バクテリオファージ中にクローニングされ、一本
鎖ＤＮＡが単離されそしてザ アプライド バイオシス
テムズ インコーポレーション[the Applied Biosystem
s,Inc.］ＤＮＡ合成器において合成された適当なオリゴ
ヌクレオチドプライマーにアニーリングされた。ゾラー
とスミス[Zoller and Smith]（メソッズ イン エンザ
イモロジイ 1983， 100， 468〜500 ，アカデミック
プレス[Methods in Enzymology 1983, 100，468-500,Ac
ademicPress]）によって述べられるような標準的方法が
これらの構築において用いられる。
【００７５】検体 本発明の改良された方法および新規な組成物は、薬剤、
薬剤代謝産物、生物学的活性分子、ステロイド、ビタミ
ン、産業汚染物、農薬およびそれらの代謝産物、食品添
加物、除草剤およびそれらの代謝産物、風味剤および食
品毒、病原体およびこれらの産生する毒素、ならびにそ
の他の関心物質を含む種々の検体の存在および／または
量を測定するために用いられることができる。例えば、
約２，０００ダルトンより大きな分子量を有するタンパ
ク質のような、比較的高分子量の検体が、より小さな検
体と同様に、本発明の改良された検定法および組成物を
用いて検知および／または測定され得る。このような検
体の例示的な例としては、表１に示されるようなものが
含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７６】
【表１】
【００７７】酵素基質 本発明による改良された酵素検定法において、試料混合
物中の未知検体の量はβ- ガラクトシダーゼ酵素の活性
の正比例関数として測定される。酵素活性は、酵素的に
触媒された反応の産物の出現によってあるいは、酵素基
質の消失によって監視される。これは、基質の転化率で
ある。分光測光的あるいは螢光定量的検定に適したβ-
ガラクトシダーゼに関する基質としては、p-アミノフェ
ニル- β-D- ガラクトピラノシド；2'-N-(ヘキシデカノ
ール）-N-(アミノ-4'-ニトロフェニル)-β-D- ガラクト
ピラノシド；4-メチルウンベル- リフェリル -β-D- ガ
ラクトピラノシド；ナフチル-AS-B1- β-D- ガラクトピ
ラノシド；1-ナフチル -β-D- ガラクトピラノシド；2-
ナフチル -β-D- ガラクトピラノシドモノハイドレー
ト；o-ニトロフェニル -β-D- ガラクトピラノシド；m-
ニトロフェニル -β-D- ガラクトピラノシド；p-ニトロ
フェニル -β-D- ガラクトピラノシド；ならびにフェニ
ル -β-D- ガラクトピラノシド，5-ブロモ-4- クロロ-3
- インドリル -β-D- ガラクトピラノシド，レソルフィ
ン -β-D- ガラクトピラノシド，7-ヒドロキシ-4- トリ
フルオロメチルクマリン，ω- ニトロスチリル -β-D-
ガラクトピラノシド，およびフルオレセイン -β-D- ガ
ラクトピラノシドなどが含まれるが、もちろんこれらに
限定されるわけではない。
【００７８】検体結合タンパク質 本発明による酵素検定法は、遊離検体と酵素ドナー結合
体との間の検体結合タンパク質に対する競合的相互作用
を利用するものである。酵素ドナー結合体の相互作用
は、相補反応を阻害する。下記の実施例７および８にお
いて詳細に述べられるように、検体結合タンパク質に対
して特異的な抗体あるいは抗体フラグメントの付着は、
立体障害効果を高めるのに有用であり、そしてこれゆえ
検体結合タンパク質に結合した酵素ドナー結合体による
相補の阻害に寄与する。
【００７９】本発明の１つの実施態様によると、検体結
合タンパク質は、１つの抗体分子である。このような場
合においては、検定は、酵素免疫検定である。このよう
な検定に有用な抗体分子としては、測定されるべき検体
に対して特異的な従来の（多クローン性の）および単ク
ローン性の抗体（ならびに多クローン性および単クロー
ン性抗体のフラグメント）の双方が含まれる。
【００８０】本発明の他の実施態様によると、検体結合
タンパク質は、ビオチンに対して特異的親和性を有する
アビジンである。このような場合においては、酵素検定
は、ビオチンのみならず、アビジンに対する親和性を保
持するビオチンの誘導体を測定するのに有用である。
【００８１】本発明の他の実施態様によると、検体結合
タンパク質は、レセプター、レクチン、輸送タンパク質
などを含む（しかしながらこれらに限定されるわけでは
ない。）結合タンパク質である。
【００８２】
【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。
【００８３】実施例１：組み換え方法による酵素ドナー
および酵素アクセプターの調製 以下のすべての実験において、すべてのＤＮＡ制限およ
び修飾酵素は、ニューイングランド バイオラブス[New
England Biolabs]（マサチューセッツ州ベバリー）から
得られ、そして製造業者の指示に従って用いられた。
【００８４】１．酵素ドナー １．１． p１２５酵素ドナー プラスミド p１２５を遺伝子操作し、温度誘発性プロモ
ーター（λＰr ）の調節下にα- ドナー配列を置いた。
さらに、発現したα- ドナーペプチドは、C-末端近くに
システイン残基を含むものである。これは、プラスミド
pＵＣ１３をＢglＩで開裂することにより達成され、そ
して得られた一本鎖末端はＳ１ヌクレアーゼでの処理に
より除去された。プラスミドは次にＢa mＨＩで消化され
た。β-ガラクトシダーゼα- 遺伝子をコード化する約
１７０bpのＤＮＡフラグメントが次にアガロースゲル電
気泳動法によって精製された（図２参照）。
【００８５】プラスミド pβgal ２は、温度誘発性Ｐr
プロモーターの調節下に lacオペロンを有するプラスミ
ド pＣＶＱ２（クイーン，1983年，ジェイ．モレク．ア
プライド．ジュネテックス 2：1[Queen,1983,J.Molec.A
pplied Genetics 2：1]）の誘導体である。その他の遺
伝子構築のために有用なλ調節配列を形成するために、
プラスミド pβgal ２は修飾された。プラスミド pβga
l ２はＢamＨＩおよびＳa lＩで消化され、そしてlac オ
ペロンをコード化するＤＮＡ配列が除去された。 pＢＲ
３２２配列（ ampr および oriを含む）およびＣＩを含
むＤＮＡフラグメントがアガロースゲル電気泳動により
単離された。ＢamＨＩ、ＥcoＲＩ、Ｈi nd ＩＩＩ、Ｓal
ＩおよびＸbaＩに関する認識配列を含む合成ＤＮＡリン
カーが連結されそして次に、ＢamＨＩおよびＳalＩ付着
端を有するより短いマルチリンカーセグメントを作るた
めにＢamＨＩおよびＳalＩで開裂された。これらのＤＮ
Ａフラグメントは、 pβgal ２から単離されたＢamＨＩ
／ＳalＩフラグメントに連結された。得られたプラスミ
ドである p１２１Ｂは、ベクターのＢamＨＩとＳalＩの
間にＥcoＲＩおよびＸbaＩ認識部位を含んでいる。プラ
スミド p１２１ＢはＢamＨＩおよびＰvuＩＩで消化され
た。β- ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性amp r
を授与するものである。）、ファージλＣＩ遺伝子（温
度制御されたリプレッサー）および複製のプラスミド起
点(ori）を含むＢ amＨＩ／ＰvuＩＩＤＮＡフラグメント
がアガロースゲル電気泳動により精製された。 pＵＣ１
３からのＢglＩ（−）／ＢamＨＩ ＤＮＡフラグメント
と p１２１ＢからのＢamＨＩ／ＰvuＩＩ ＤＮＡフラグ
メントが図２Ｂに示されるようにＴ４ ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結された。この組換え型プラスミドは、一本
鎖ファージＭ１３およびその組換え体（β- ガラクトシ
ダーゼ変異体ポリペプチドＭ１５をコード化するもので
ある）の成長に関するエシェリキア・コリ細菌性宿主の
１つであるＪＭ８３（メッシング，1979年，レコンビナ
ント ＤＮＡ テクニカル ビュレッチン，ＮＩＨ パ
ブリケーション No.79〜99，2 ，No.2：43〜48[Messin
g,1979,Recombinant DNA Technical Bulletin,NIH Publ
ication No,79-99,2,No．2:43-48]）中に形質転換さ
れ、そしてプラスミド p１２５が選択された。生体内相
補が４２℃では起こるが３２℃では起こらず、プラスミ
ド p１２５が温度誘発性β- ガラクトシダーゼα- タン
パク質を産生することが示された。
【００８６】１．２．Ｈ，Ｂ，ＭおよびＰシリーズ酵素
ドナー 一連の実験において、検体カップリングドメインを含む
タイプの酵素ドナーペプチドを得るために、（上記「酵
素ドナー：改良されたカップリング化学特性」参照）種
々の大きさのα- 領域が、ＨqeＩＩ、ＢglＩ、Ｍ stＩあ
るいはＰvuＩで消化された pＵＣ１３（ビェイラとメッ
シング，1982年，ジーン 19：259 〜268 ；メッシン
グ，1983年，メソッズインエンザイモロジイ 101：20−
78；ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ，メリーラン
ド州ガイゼルスバーグ[Vieira andMessing,1982,Gene 1
9:259-268;Messing,1983,Methods in Enzymorogy 10
1：20-78;Bethesda Reseach Laboratories,Gaithers-be
rg,MD])から単離され、それぞれH-シリーズ、B-シリー
ズ、M-シリーズおよびP-シリーズをもたらした。B-シリ
ーズ、P-シリーズおよびH-シリーズはＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼおよびＳ１ヌクレアーゼで処理された。M-シリ
ーズは処理されなかった。それぞれのシリーズのＤＮＡ
は、多重クローニング部位に位置するＳacＩで消化さ
れ、そしてα- 相補ペプチドをコード化する小さなＤＮ
Ａ群は、製造業者によって述べられるように、アガロー
スゲル精製によって精製され、ＤＥＡＥ- セルロース紙
（シュレイサー アンド シューレル[Schleicher and
Schuell]、ニューハンプシャー州ケーン）上に電気泳動
され、溶出されそしてエタノール沈澱された。
【００８７】pＢＲ３２２の２．３kb ＥcoＲＩ−Ｐ vu
ＩＩフラグメント中にクローニングされたエシェリキア
・コリt rp プロモーター（ＥcoＲＩ−ＳstＩ、１２０b
p）を有するプラスミド p１４１がＮdeＩで消化され、
そしてＤＮＡポリメラーゼクレノウ[Klenow]フラグメン
トならびに dＡＴＰおよび dＴＴＰ（ピーエル バイオ
ケミカルズ[PL Biochemicals］ウィスコンシン州ミルウ
ォーキー）で処理された。得られたＤＮＡはＳacＩで消
化され、そして、Ｍ，Ｂ，ＨおよびＰシリーズのＤＮＡ
を受けるためのベクターとして用いられた。Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼでの処置に続き、ＤＮＡはエシェリキア・コ
リ株Ｅ９００１（Δlac pro ，thi ，ＳupＥ，Ｆ´pr
o ＡＢ， lacＩQ ，Ｚ Ｍ１５，株７１．１８とも呼ば
れる；メッシングら，1977年，プロク．ナトル．アカ
ド．サイ．ユーエスエイ 75；3642〜3646[Messinget a
l.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；3642-3646]）中
に形質転換された。これらのＤＮＡ構築物は、マキサム
とギルバート[Maxam and Gilbert] の方法（1980年，メ
ソッズ インエンザイモロジイ 67：499[1980,Methods
in Enzymology 67:499])によって配列決定され、そし
て図４および５に示される。また、（＊）で表わされる
ものは、検体の共有結合的付着のための部位である。
【００８８】エシェリキア・コリ株Ｅ９００１における
Ｔrp制御下にα- 領域をコード化する得られた株は、Ｂ
シリーズに関しては、プラスミド p１３０を有する株Ｍ
Ｇ１３０、Ｍシリーズに関してはプラスミド p１２９を
有する株ＭＧ１２９、またＨシリーズに関してはプラス
ミド p１３１を有する株ＭＧ１３１であった。
【００８９】異なるクローン化α- 領域の発現レベルを
改良するために、α- 領域は新たなプラミドへ移入さ
れ、そしてλＰr オペレーター -プロモーターの制御下
におかれた。例えばＭＧ１４１を作製するために、H-シ
リーズからのＨ６のＤＮＡ配列をコード化する遺伝子
が、以下に述べるようにλＰr およびλＣＩ遺伝子のＴ
rpプロモーターの置き換えによって、Ｐr 制御下に置か
れた。
【００９０】Ｔrpオペレーター -プロモーター制御下に
Ｈ６を含むプラスミド p１３１は、ＥcoＲＩで消化さ
れ、そして大きな方の約２．１kbフラグメントがアガロ
ースゲル電気泳動法によって単離された。λＰr および
λＣＩ遺伝子は、 p１２５のＥcoＲＩ消化の小さなフラ
グメントからゲル精製された。 p１３１の２．１kbフラ
グメントは、 p１２５からの小さなフラグメントに連結
され、事実上ＴrpプロモーターをλＰr およびλＣＩプ
ロモーター系と置き換えた。この処方がλＰr 制御下の
以下のプラスミドおよび菌株、すなわちＢシリーズに関
しては、プラスミド p１３９を有する株ＭＧ１３９；Ｍ
シリーズに関してはプラスミド p１４０を有する株ＭＧ
１４０；およびＨシリーズに関してはプラスミド p１４
１を有する株ＭＧ１４１を得るために、 p１３０および
p１２９を用いて繰返された。ＤＮＡ構造は、マキサム
とギルバート，メソッズ イン エンザイモノジイ 6
7：49(1980)[Maxam and Gilbert,Methods in Enzymolog
y 67：499(1980)]の方法によって配列決定され、そし
て図４および５に示される。
【００９１】１．３． p１４８酵素ドナー p１２５からのλＰr 配列を利用して、新たなプラスミ
ドが、ペプチドのN-末端側にシステイン残基を与えるた
めに、作製された。この新たなプラスミドである p１４
８はまた、ペプチドのC-末端近くに位置した３つのシス
テイン残基を含んでいるものであった。プラスミド p１
２５がＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化され、約１０００
bpのフラグメントが、該ベクターより切り出され、そし
てアガロースゲル電気泳動により精製された。このフラ
グメントはλＰr 配列を含むものであり、これは、 pＵ
Ｃ１２の唯一のＢamＨＩ／ＥcoＲＩ制限部位中に連結さ
れた（メッシング，1983年，メソッズ イン エンザイ
モロジイ 101 ：20〜78[Messing,1983,Methods in Enz
ymology 101：20-78]）。この組換え型プラスミドはＪ
Ｍ８３細胞中に形質転換され、そして上記に述べた p１
２５の作製と同一の様式において４２℃で生体内的に相
補することが見出された。酵素- ドナー p１４８の構造
はまた図６に示され、これは検体の付着に関して本発明
により利用されるものであるアミノおよびスルフヒドリ
ル基カップリング部位の位置を含むものである。
【００９２】１．４．酵素- ドナー３ 酵素- ドナー３（ＥＤ３）は、Ｈ６から作製された酵素
- ドナー１（ＥＤ１）から作製された。ＥＤ１は以下の
ようにして作製された。
【００９３】ＤＮＡフラグメントの合成は、アプライド
バイオシステム、インコーポレーテッド（エイビーア
イ，カリフォルニア州フォスターシティー）モデル３８
０ＡＤＮＡシンセサイザー[Applied Biosystems,Inc.(A
BI,Foster City, CA)Model380A DNA Synthesizer]にお
いて行なわれた。それぞれの配列は、プログラムメモリ
ー中に入力され、そして機械は、所望の一本鎖ＤＮＡを
自動的に製造し、孔径制御ガラス支持体からそれぞれの
フラグメントを開裂し、そしてバイアル（小瓶）中にＤ
ＮＡを集めた。ＤＮＡ試料は、濃縮ＮＨ4 ＯＨ１．５ml
で６〜２４時間、５５℃で処理され、そしてサバント
スピード ヴァク コンセントレーター[Savant Speed
Vac Concentrator] 中で乾燥状態とされた。
【００９４】それぞれのＤＮＡフラグメントの乾燥ペレ
ットは、ホルムアミドの微量（１００〜２００μｌ）に
溶解され、そして１２％アクリルアミドゲル（ＢＲＬ
Ｍodel ＳＯ，３０〜４０cm，厚さ１．６mm）上に精製
され、そして２００ボルトで一晩電気泳動された。所望
のバンドが、螢光バックグラウンドとしてベーカー -フ
レックス シリカゲル ＩＢ−Ｆ（ジェイ ティー ベ
ーカー ケミカルカンパニー）[Baker-flex sillica ge
l 1B-F(J.T.BakerChemical Co.］を用いて視識化され
た。所望のＤＮＡバンドは、カミソリ刃を用いてゲルよ
り切り出され、そして該ＤＮＡは、インターナショナル
バイオテクノロジーズインコーポレーテッド（ＩＢ
Ｉ）モデル ＵＥＡ ユニット[International Biotech
nologies Inc.(IBI)Model UEA unit］において製造業者
の指示に従いポリアクリルアミドゲル断片から電気泳動
された。ＤＮＡは、微量の緩衝液中に集められ、そして
エタノール沈澱された。該フラグメントは、製造業者の
指示に従いＴ４ ポリヌクレオチド キナーゼで処理さ
れた。相補的ＤＮＡ鎖が組合され、２分間９０℃に加熱
され、そして室温に徐冷された。アニーリングされたＤ
ＮＡは、ハイブリッド（交雑）されていない鎖を除去す
るためにアガロースゲル電気泳動によって精製され、そ
して連結反応に用いられた。
【００９５】出発プラスミドは、制限部位ＢamＨＩとＳ
a lＩとの間に挿入されたλＰr 制御下のＨ６遺伝子を含
む p１６９であった（図１５参照）。Ｈ６からＥＤ１へ
の変化は、Ｈ６のN-末端とC-末端の双方を、これらの間
のα- ドメインを完全に残しつつ、変化させることを含
むものであった。 p１６９の２つの部分標本（アリコー
ト[aliquot])が制限酵素を用いて切断された。第１の部
分標本は、ＥcoＲＩおよびＢglＩで消化され、そして小
さな１５０bp [base pair ］フラグメントがゲル精製さ
れた。 p１６９の第２の部分標本は、ＢamＨＩおよびＳ
alＩで消化された。これは、プラスミドをベクターおよ
びα- ドナー遺伝子領域に開裂する。ベクター部分がゲ
ル精製された。
【００９６】ＥＤ１の新たなN-末端コーディング領域
は、アプライドバイオシステム インコーポレーテッド
の機械によって合成された７５bp ＤＮＡフラグメント
であった（図１６参照）。新たなC-末端コーディング領
域である５０bpＤＮＡフラグメントが、また合成された
（図１６参照）。この２つの新たなＤＮＡフラグメント
が、小さなＥcoＲＩ−ＢalＩ Ｈ６ ＤＮＡフラグメン
トに連結された。この混合物は、約２７５bpの新たなＥ
Ｄ遺伝子を得るために、ＢamＨＩおよびＳalＩで切断さ
れた。このＤＮＡの断片は、ゲル精製されそしてベタク
ーＢamＨＩ−ＳalＩ ＤＮＡフラグメント中に連結され
た。
【００９７】ＥＤ１配列を確認した後に、このプラスミ
ド（ p１８１、図１７を参照のこと）は、ＢamＨＩとＥ
coＲＩで切断され、７５bp ＥＤ１ N-末端が除去され
た。この領域は、ＢamＨＩ−ＥcoＲＩスペース中に置換
された３０bpの新たな合成フラグメント（図１６参照の
こと。）によって置き換えられた。
【００９８】これゆえＥＤ３は、ＥＤ１より１５アミノ
酸短いものであり、そのN-末端近くにシステイン残基を
有する。ＥＤ１は、その配列中にシステインあるいはリ
シンのいずれも有しない。図１８はＥＤ３のアミノ酸配
列を画くものである。
【００９９】１．５．酵素ドナー ３Ａ 酵素ドナー３Ａ（ＥＤ３Ａ）のアミノ酸配列は図１８に
示される。該ペプチドは、ベックマン（カリフォルニア
州パロ アルト）９９０Ｂ ペプチド シンセサイザー
[Beckman(Palo Alto,CA)990B Peptide Synthesizer ］
において合成される。合成方法はステワートとヤング[S
tewart and Young](ソリッド フェーズペプチド シン
セシス，１７６pp，ペース ケミカル カンパニー，イ
リノイ州ロックフォード，1984年[Solid Phase Peptide
Synthesis,176bp,Pierce Chemical Co.,Rockford,Illi
nois,1984]) によって述べられるようなものである。一
般的な化学薬品は、アルドリッチ[Aldrich](ウィスコン
シン州ミルウォーキー）からのものである。ＢＯＣ- ア
ミノ酸はペニンスーラ ラボラトリーズ[Peninsula Lab
oratories]（カリフォルニア州ベルモント）からのもの
である。側鎖保護は、Ｂoc−Ｔhr（ＯＢzl）、Ｂoc−Ｃ
lu（ＯＢzl）、Ｂoc−Ｓer（ＯＢzl）、Ｂoc−Ａsp（Ｏ
Ｂzl）、Ｃys（ＭｅＯＢzl）、Ｂoc−Ａsn／ＨＯＢＴ、
Ｂoc−Ａrg（ＴＯＳ）およびＢoc−Ｈis（ＴＯＳ）であ
る。バイオ- ラッド ラボラトリーズ[Bio Rad Laborat
ories]（カリフォルニア州リッチモンド）からのアミノ
メチルポリスチレン固相樹脂ビーズは、ステワートとヤ
ング（1984年）によって述べられるようにジクロロヘキ
シル カルボジイミドを用いてp-ヒドロキシメチルフェ
ニル酢酸Ｂoc−Ｔhr（ＯＢzl）にエステル化される。用
いられた合成スケールは、固相樹脂に付着したＢoc−Ｔ
hr １ミリモルとそれぞれのＢoc- アミノ酸３ミリモル
である。合成器は次に合成を実行するためにプログラム
される。得られたペプチドは、無水フッ化水素酸を用い
て樹脂から開裂され、そして酢酸で抽出される。水素添
加に続き、ペプチドは、０．１％ＴＦＡおよび０．１％
エタンチオールを含む水中に０〜８０％のアセトニトリ
ル濃度勾配でウォーターズ[Waters]フェニルカラムを用
い調製用逆相ＨＰＬＣによって精製される。部分的に精
製されたペプチドは、lmＭ ＮＨ4 ＨＣＯ3 、lmＭ 2-
メルカプトエタノール中に徹底的に透析され、そして凍
結乾燥された。ペプチドのアミノ酸分析は表２に示され
る。
【０１００】
【表２】
【０１０１】要約すると、図４〜６に示されるポリペプ
チドは、必要とされるα- 相補する配列から、変化され
た距離に、都合のよいカップリング側鎖を与える。組換
え法により作製されたペプチドをコード化するＤＮＡ配
列は、標準的なマキサムとギルバートの技術によって決
定され、予言された構造が確認された。Ｈ６のアミノ酸
組成は、アミノ酸分析によって確認された。
【０１０２】１．６．ＥＤ酵素ドナーシリーズ ＥＤシリーズと呼ばれる一連の酵素ドナーは、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて作製された。ＥＤ３は、すでに上記
１．４において述べられている。このシリーズの他のメ
ンバーには、ＥＤ４，ＥＤ５，ＥＤ７，ＥＤ８，ＥＤ１
３，ＥＤ１５およびＥＤ１７が含まれる。酵素ドナーの
ＥＤシリーズのアミノ酸配列は図１９〜２３に表わされ
る。
【０１０３】ＥＤ４に関しコードする遺伝子は、以下の
配列のＤＮＡフラグメントをアプライド バイオシステ
ムズ、インコーポレーテッド モデル３８０Ａ ＤＮＡ
シンセサイザーにおいて（上記１．４において述べるよ
うに）最初に合成することによって作製された。
【０１０４】
【化９】
【０１０５】星印でマークされた“Ｔ”は、“Ｃ”から
の変更を表わす。このフラグメントは、プラスミド p１
８１（ＥＤ１）からのＢamＨＩ−ＰvuＩ切片に連結され
た（図１７参照のこと。）。得られた切片は、除去され
たＢamＨＩ−ＳphＩ領域を有するベクター（ＥＤ１-p１
８１からのもの）中に連結し返された。Ｃ（シトシン）
のＴ（チミン）への変更は、システイン（cys)残基を生
成し、そして連結の後にＰvuＩ部位を破壊する。（粘着
性の[sticky]端部は、連結に関しても同様に維持され
る。） ＥＤ５に関してコードする遺伝子は、以下の配列のＤＮ
Ａフラグメントを最初に合成することによって作製され
た。
【０１０６】
【化１０】
【０１０７】１つの星印でマークされた“Ｔ”は、
“Ｃ”からの変更を表わす。２つの星印でマークされた
“Ｔ”は、“Ａ”からの変更を表わす。ＣのＴへの変更
は、ＰvuＩＩ部位を破壊する。Ａ（アデニン）のＴへの
変更は、セリン残基をシステイン残基へ変更する。この
フラグメントは、プラスミド１８２（ＥＤ２ないしはＭ
１５）ＤＮＡからのＢamＨＩ−ＰvuＩＩ断片およびＰvu
Ｉ−ＳalＩ断片に連結された（図１７参照のこと。）。
連結された物質は、ＢamＨＩおよびＳalＩで切断され、
ＢamＨＩ−ＳalＩ領域が除去されたプラスミド p１８２
中に挿入された。
【０１０８】ＥＤ７に関してコードする遺伝子は、Ｅco
ＲＩおよびＳalＩの双方を用いて p１８３（ＥＤ３）お
よび p１８４（ＥＤ４）を切断することにより作製され
た。p１８３からのベクターはゲル精製（ＥcoＲＩ−Ｓa
lＩ（α）領域を有効に除去する。）された。これに対
して、 p１８４からの小さなＥcoＲＩ−ＳalＩ（α）領
域がゲル精製された。この p１８４ ＥcoＲＩ−ＳalＩ
領域が次に、 p１８３Ｅ coＲＩ−ＳalＩベクター中に挿
入され、連結された。
【０１０９】ＥＤ８に関してコードする遺伝子は、Ｍ１
３mpllファージＤＮＡにおける部位特異的変異誘発を用
いて作られた。プライマーが作製された（配列ＧＧＴ
ＡＡＣ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＲＴ ＴＴＣ ＣＣＡ Ｇ
ＴＣ）。このプライマーは、アミノ酸１５〜２２番に関
しコードするα- 領域のセンス鎖[sense strand]に相補
性である。所望される変更は、Ｍ１３mpll、ＤＮＡのα
- 領域におけるアミノ酸２０番でＧlyをＣysに変更する
コドン２０におけるＧのＴへの変更であった。これは、
プライマーを一本鎖Ｍ１３mpllファージＤＮＡにハイブ
リット形成させ、そしてＤＮＡポリメラーゼＩ“クレノ
ウ[Klenow]フラグメント”およびＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて室温にて一晩プライマーを延長させることによっ
て達成された。このＤＮＡは、非二本鎖ＤＮＡを消去す
るためにＳ１ヌクレアーゼで処理され、次にＪＭ１０３
細胞に形質転換された。この形質転換からのファージは
単離され、ＤＮＡが精製され、そしてプライマー伸長お
よび形質転換が合せて３回繰返された。それぞれの反復
は、所望される産物に関して豊かなものとした。最後に
ミニ標本分析[mini-prep analysis]が、個々のプラーク
からのＭ１３ ＲＦＤＮＡにおいて行なわれた。所望の
塩基変更は、ＢstＮＩ部位を消失した。ＢstＮＩを用い
てのミニ標本ＤＮＡの制限分析は、候補物を識別した。
所望の変更を担う二本鎖Ｍ１３ ＲＦ ＤＮＡから、Ｂ
amＨＩ−ＢglＩ断片が切り出され、そしてＥＤ２に関し
コードするプラスミドにおけるＢamＨＩ−ＢglＩ断片と
交換された。
【０１１０】ＥＤ１３（ p１９３、図２４参照のこ
と。）に関しコードする遺伝子は、以下の配列のＤＮＡ
フラグメントを最初に合成する（上記と同様）ことによ
って作製された。
【０１１１】
【化１１】
【０１１２】この合成フラグメントは、ＥＤ３を作製す
ることに関して上記１．４において述べたと同様にして
p１８２（ＥＤ２）中に置換された。
【０１１３】ＥＤ１４(p１９４、図２４参照のこと。）
に関してコードする遺伝子は、以下の配列のＤＮＡフラ
グメントを最初に合成する（上記と同様）ことにより作
製された。
【０１１４】
【化１２】
【０１１５】この合成フラグメントは、システイン置換
に代わりリシン残基という結果となる以外は、ＥＤ４に
関して用いられたものと同様の術策を用いて作製され
た。
【０１１６】ＥＤ１５(p１９５、図２４参照のこと。）
に関してコードする遺伝子は、以下の配列を有するＤＮ
Ａフラグメントを最初に合成する（上記と同様）ことに
より作製された。
【０１１７】
【化１３】
【０１１８】このフラグメントはＥＤ５を作製するため
に用いたものと同様の方法においてp１８２（ＥＤ２な
いしはＭ１５）中へ挿入された。
【０１１９】ＥＤ１７（ p１９７、図２４参照のこと）
に関してコードする遺伝子は、ＥＤ７に関しコードする
遺伝子が作製されたものと同様な方法において作製され
たＥＤ１３およびＥＤ１４遺伝子の組合せである。
【０１２０】表３に示されるものは、酵素ドナーのＥＤ
シリーズと用いられ得る酵素アクセプターの列挙であ
る。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】上記の酵素ドナーと酵素アクセプターの対
のうち、ＥＤ５とＥＡ２２の組合せが、本発明の相補性
検定法における使用に最も好ましい対である。
【０１２３】２．酵素アクセプター 実験の一群において、β- ガラクトシダーゼ遺伝子の枠
内配列欠失のシリーズが、上記実施例１、１．酵素ドナ
ーにおいて述べられた方法により酵素アクセプターのシ
リーズを調製するために構築された。 pＵＣ１３が、Ｐ
vuＩＩ（平滑末端[blunt end］を生じる）で消化され、
そしてＸhoＩ制限部位を含む８bp合成ＤＮＡリンカーに
連結され、新たなプラスミドである pＵＣ１３Ｘが生成
した。
【０１２４】ＸhoＩ制限部位を含むα- 領域が次に、天
然β- ガラクトシダーゼをコード化する完全 lacＺ遺伝
子中に lacＺ遺伝子の残余物[remainder］あるいはバッ
クグラウンドプラスミドを崩壊することなく置き換えら
れた。このＺ遺伝子は２つのＢglＩ部位を含むものであ
る。これらのＢglＩ部位の最初のものは、ＸhoＩリンカ
ーが挿入されたＰvuＩＩ部位より下流の pＵＣ１３中に
おけるα- 領域内に含まれる。これゆえ、 pＵＣ１３Ｘ
からのα- 領域は、ＢamＨＩとＢglＩでの消化によりプ
ラスミドの残余物から除去され、そしてこの１７０bpフ
ラグメントはＢ１Ｘと呼称された。
【０１２５】β- ガラクトシダーゼをコード化する lac
Ｚ遺伝子の残余物は、プラスミド pβgal ２（クイー
ン，1983年，ジェイ．モル．アプル．ジェネット． 2：
1[Queen,1983,J.Mol．Appl.Genet. 2 :1])から得られ
た。このプラスミドはＢglＩおよびＥcoＲＩで消化さ
れ、そしてＺ遺伝子の９３％を表わす２つのＤＮＡフラ
グメントが単離された。それぞれのフラグメントの末端
は、この作製において用いられるその他の末端のいずれ
とも異なるものであった。単離されたフラグメントは、
２１１５bp（以下Ｂ２と呼ぶ。）および７３７bp（以下
Ｂ３と呼ぶ。）であった。Ｚ遺伝子におけるＥcoＲＩ制
限部位は、遺伝子のC-末端近くにある。この末端はＸho
Ｉ部位を含む遺伝子が作製される場合、存在すべきであ
る。
【０１２６】変異体Ｚ遺伝子が pＦ２９中に挿入され
た。プラスミド pＦ２９は、ＥcoＲＩ部位でＺ遺伝子の
C-末端に融合されたＺ遺伝子α- 領域を含むものであ
る。このα- 領域は、ＢamＨＩ部位に挿入されたλＰr
プロモーターによって制御される。 pＦ２９を作製する
ために、２つの中間プラスミド、 pＦ１５および pＦ１
６が作製された。 pβgal ２がＡvaＩで消化され、付着
3'末端[cohesive 3' end］がクレノウ フラグメント[K
lenow fragment］および４つの dＮＴＰを用いて満たさ
れ、平滑末端が生成された。ＳalＩリンカー（ＧＧＴＣ
ＧＡＣＣ）（ニューイングランドバイオラブス[New Eng
land BioLabs］、マサチューセッツ州ベバレイ）が、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼを用いて線状化プラスミドに連結さ
れた。得られたＤＮＡはＥcoＲＩおよびＳalＩで消化さ
れ、β- ガラクトシダーゼＺ遺伝子のオメガ（ω）末端
を表わす３００bpＤＮＡフラグメントがアガロースゲル
電気泳動によって精製された。このω- 領域は以下のよ
うにしてＰr の制御下のα- 領域に融合された。 pＵＣ
１２ ＤＮＡ（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ[B
ethesda Research Laboratories]、メリーランド州ガイ
ゼルスバーグ）がＢglＩで消化され、そしてクレノウフ
ラグメントおよび４つの dＮＴＰで処理することによっ
て平滑末端が生成された。ＥcoＲＩリンカー（ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）（ニューイングランド バイオラブス、マサ
チューセッツ州ベバレイ）がＴ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて平滑末端に連結された。このＤＮＡはＢamＨＩおよ
びＥcoＲＩで消化され、Z-遺伝子のα- 領域を表わす１
８０bpフラグメントがアガロースゲル電気泳動によって
精製された。遺伝子フラグメントおよびω- 遺伝子フラ
グメントを受け入れるために用いられたベクターは、Ｂ
amＨＩおよびＳalＩで消化されそして lacオペロン配列
を除去するためにアガロースゲル電気泳動により精製さ
れた pβgal ２であった。該ベクター、α- 遺伝子フラ
グメントおよびω- 遺伝子フラグメントは、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結し合された。該ＤＮＡフラグメ
ントの非反復の末端は、これらのフラグメントがクロー
ニングされた順序を指図するものである。生成プラスミ
ドは pＦ１５と呼称された。
【０１２７】pＦ１５は、 pＦ１５をＰvuＩＩで消化す
ることによって生成した平滑末端に連結したＳalＩリン
カーを用いて、非反復のＰvuＩＩ部位をベクターＳalＩ
部位に転化することによってさらに修飾された。この修
飾 pＦ１５は、次にＢa mＨＩおよびＳalＩで消化され、
そして最も長いＤＮＡフラグメントがアガロースゲル電
気泳動によって精製されて、α- ω遺伝子配列およびＳ
alＩ部位とＰvuＩＩ部位の間に位置するＤＮＡフラグメ
ントが除去された。修飾されていない pＦ１５がまた、
ＢamＨＩおよびＳalＩで消化されα- ωフラグメントが
精製された。修飾 pＦ１５からの大きなフラグメントが
このα- ωフラグメントに連結され、プラスミド pＦ１
６が生成された。
【０１２８】pＦ１６は、 pＦ１５より約１３５０塩基
対だけ小さいものであり、非反復なＮdeＩ部位をＳalＩ
部位に極めてより近いものに移動する効果を有する。こ
の巧妙な処置は、その後の作製を通じて担われるものか
ら不必要なＤＮＡを消去する。
【０１２９】pＦ２９を作製するために、 pＦ１６はＣl
aＩおよびＮdeＩで消化され、そしてλＣＩ、λＰr な
らびにβ- ガラクトシダーゼのα- およびω- 領域をコ
ード化する１４００bp ＤＮＡフラグメントがアガロー
スゲル電気泳動法によって精製された。 pＵＣ１３をＡ
ccＩおよびＮdeＩで消化し、ベクターをアガロースゲル
電気誘導法によって精製した。ＡccＩおよびＣlaＩ制限
部位が同一の付着末端を有し、またＮdeＩ制限部位が同
一の末端を共有するゆえに、 pＦ１６からのＤＮＡ挿入
物と pＵＣ１３ベクターとの連結は、１回の配向のみで
生起する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いての連結は pＦ２
９を生成する。 pＦ２９は、１つのＥcoＲＩ部位を含
み、またＣlaＩ部位を含んでおらず、このことは、第２
のＥcoＲＩおよびＣlaＩ部位は、修飾プラスミドの作製
を阻害するであろう（例えば、以下に述べる p１４９、
および p１５０から生成される欠失変異体のその後の分
析）ゆえに望ましいものであった。
【０１３０】pＦ２９はＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化
され、間にあるα- ドナーが除去され、そしてこのベク
ターはＢ１ＸにＢ２を加え、さらにＢ３を加えたもの
（Ｂ１Ｘ＋Ｂ２＋Ｂ３）を用いて満たされた。それぞれ
の断片の非反復な一本鎖末端は、該断片が連結し合い得
る順序を定義する。Ｂ１Ｘ、Ｂ２およびＢ３は、上記に
述べたようにＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化された pＦ
２９ベクター中に連結され、これにより、λＰr 制御下
に、アミノ酸３４をコード化する塩基対１０２で、Ｘho
Ｉリンカーを用いてＺ遺伝子が再構築される。得られた
プラスミドは p１４９と呼称された。
【０１３１】ＸhoＩおよびＢal３１での消化に続く、生
存可能な酵素アクセプターの生成に関してスクリーニン
グするための方法を開発するために、ＸhoＩを有しない
別個のα- ドナーが p１４９中へ挿入された。 lacＺオ
ペレーター、プロモーターおよびα- ドナーを含む pＵ
Ｃ１３からのＦnuＤＩＩ消化フラグメントが、クレノウ
フラグメントを用いて満たされた p１４９のＳa lＩ部位
中に挿入された。得られたプラスミドは p１５０と呼称
された。欠失が、 p１５０をＸhoＩで消化し、そして次
に該ＤＮＡをＢal３１エキソヌクレアーゼで消化するこ
とによって作製された。Ｂal３１処理の後、プラスミド
はＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結され、そしてＡＭＡ１０
０４宿主細胞（ＡＭＡ１００４は、 galＵ、 galＫ、 s
trＡｒ、hsdＲ- 、 leuＢ６、 trpＣ９８３０、Δ（lac
ＩＰＯＺ）である。）Ｃ２９（カサバダンら，1983
年，メソッズ イン エンザイモロジイ 100：293[Casa
badan et al.,1983,Methods in Enzymology,100:293])
中に形質転換され、そして誘導物質イソプロピル- チオ
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）および色素産生性基質5-ブロ
モ-4- クロロ-3- インドリル -β-D- ガラクトピラノシ
ド（Ｘgal 、シグマケミカル カンパニー、ミズーリー
州セントルイス）を含むルリア‐ベルタニ[luria-Berta
ni］プレート上でスクリーニングされた。３０℃では白
色だが４２℃では青色のコロニーは、生存可能な酵素-
アクセプターの生成を示した。コロニーが選択され、プ
ラスミドＤＮＡが調製された。プラスミドＤＮＡは、α
- ドナーを除去するためにＳalＩで消化され、再連結さ
れた後、ＡＭＡ１００４宿主細胞に形質転換された。配
列欠失は、マキサムとギルバート[Maxam and Gilbert］
の配列決定法により確認され、そして酵素アクセプター
は、以下の実施例２、１．において述べるようにして精
製された。得られた株は、図７および８に示される。
【０１３２】酵素アクセプターは、ＤＮＡ合成技術を用
いて作製された。例えば酵素- アクセプター１（ＥＤ
１）は、ＸhoＩリンカーを含むα- 領域が表４に示され
る合成ＤＮＡフラグメント（５´→３´）と代えられる
ことを除いては、 p１４９から作製された。
【０１３３】
【表４】
【０１３４】これらのフラグメントは、 lacＺ遺伝子の
アミノ酸２６〜４３番の枠内欠失をコード化するもので
あり、またＢamＨＩおよびＢglＩの粘着性末端を担うも
のである。これらのフラグメントはアニーリングされ、
ゲル電気泳動により精製され、ＢamＨＩで処理され、そ
してＢ２にＢ３を加えたもの（Ｂ２＋Ｂ３）にそしてp
Ｆ２９ベクター連結された。陽性のコロニーが選択さ
れ、そしてＤＮＡ配列分析により確認された。
【０１３５】２．１．相補効率の比較 上記のようにして調製された酵素アクセプターの相補効
率を評価するために、代表的酵素アクセプター調製物が
Ｈ６を酵素- ドナーとして用いて比較された。微小力価
プレート形態が用いられ、これは２．５×１０-8Ｍの適
当な酵素アクセプター調製物および１．２５mg／ml o-
ニトロフェノール -β-D- ガラクトピラノシド基質を含
む全容量２００μｌのＰＭ２緩衝液（０．５Ｍ Ｎａ2
ＨＰＯ4 ， pＨ７．０，１ｍＭ Ｍg ＳＯ4 ，０．１８
ｍＭ Ｍn ＳＯ4 ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ Ｎ
ａＮ3 ，０．０５％ トゥイーン ２０[Tween 20]）か
ら構成された。Ｈ６の一連の希釈物（１：２０，１：４
０，１：８０）が相補を開始するために添加された。光
学濃度（４１４nm）が、３７℃での３０分間および４０
分間インキュベーションで測定された。結果は表５に示
される。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】表５に示されるように、種々の酵素- アク
セプターの相補効率は、相当異なるものであった。相対
相補効率は、ＥＡ１４＝ＥＡ２２＞ＥＡ２０＞ＥＡ２４
＞ＥＡ２３であった。
【０１３８】実施例２：チロキシンに関する酵素免疫検
定法 この実施例はチロキシンに特異的な抗体を検体結合タン
パク質として用いる、チロキシンに関する免疫検定法を
述べるものである。用いられた酵素ドナー -抗原は、Ｅ
Ｄ４であり、また酵素- アクセプターはＥＡ２２であ
る。
【０１３９】１．酵素アクセプターの調製 β- ガラクトシダーゼの欠失変異体ポリペプチドが、所
望の酵素アクセプター菌株をＴＹブロス（１リットル当
たりバクトトリプトン[Bacto tryptone]１０g、酵母抽
出物５g、ＮａＣｌ５gおよびグルコース１gを含む、 p
Ｈ７．５）中で増殖させることにより調製された。細胞
は４２℃で増殖させられた。細胞は遠心分離によって収
獲され、破壊性緩衝液（ＢＢ）（０．２Ｍ トリス（登
録商標）[Tris （登録商標）］−ＨＣｌ pＨ７．６、
０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ酢酸マグネシウム、
０．０１Ｍ 2-メルカプトエタノール ５％グリセロー
ル）で洗浄され、次に遠心分離によりペレット化され、
そして凍結された。
【０１４０】細胞ペレット（１５g）は４０mlのＢＢ中
に懸濁された。リゾチーム[Lysozyme]（シグマケミカ
ル、ミズーリー州セントルイス）が０．２０mg／mlの最
終濃度へ添加され、懸濁液は、−７０℃のアルコール浴
中で凍結され、そして３７℃の水浴中で迅速に解凍され
た。解凍される懸濁液の温度を４℃以下に保つために注
意がはらわれた。溶解物の粘度は、ビルソニック セル
ディスラプター[Virsonic cell disruptor](モデル１
６- ８５０，ビルティスカンパニー，ニューヨーク州ガ
ーディナー[Model 16-850,VirtisCo.,Gardiner,NY]）を
用いての音波処理によって低減された。フェニルメチル
スルフォニルフルオライド（PMSF，シグマケミカル）が
０．１ｍＭの最終濃度へ添加され、そして不溶性物質が
遠心分離（16,000×g ，３０分間）によって除去され
た。１／１０容量の３０％硫酸ストレプトマイシン溶液
がゆっくりと上澄液に添加された。氷上で１５分間の
後、沈澱した核酸が１６，０００×g で２０分間遠心分
離することにより除去された。清澄化された溶解物は、
ゆっくりと８０％飽和（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液の等容量
を添加することにより、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 で４０％飽
和とされた。４℃で２時間の撹拌に続き、沈澱した物質
が、１６，０００×g で３０分間遠心分離することによ
り集められた。
【０１４１】ペレットはＢＢ中に再溶解されそして、水
中に０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、 pＨ７．２、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｍg ＳＯ4 、１０ｍＭ 2-メルカ
プトエタノールを含有するものの１０００容量に対し
て、６時間後に１回交換を行なって、透析された。透析
された酵素- アクセプター抽出物は、同様の緩衝液中の
アガロースに共有結合的に付着したp-アミノフェニル-1
- チオ -β-D- ガラクトピラノシドの２．５×６cmカラ
ムに適用された。カラムは、最初に０．１Ｍ ＮａＰＯ
4 、 pＨ７．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 2-メ
ルカプトエタノールで、次に０．１Ｍ ＮａＰＯ4 、 p
Ｈ７．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ2-メルカプト
エタノールで、最後に、０．１Ｍ ＮａＰＯ4 、 pＨ
７．２、５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム pＨ９．０、１０
ｍＭ 2-メルカプトエタノール（当容量の２．５Ｍ ト
リス -ＨＣｌ pＨ７．０中）を用いて洗浄された。す
べてのカラム操作は４℃で行なわれた。
【０１４２】溶出した酵素アクセプターは直ちに、０．
１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 pＨ７．２、７０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ Ｍg ＳＯ（Ｍg ＳＯ4 ）および１０ｍＭ
2-メルカプトエタノールに対して十分に透析された。透
析の後、グリセロールが１０％まで添加され、そして抽
出物は−２０℃で保存された。これらの調製物は、ラエ
ムリの不連続ポリアクリルアミドゲル系[Laemmli dis-c
ontinuous polyacryl-amide gel system］（ラエムリ，
1980年，ネイチャー 227：690[Laemmli,1970,Nature 2
27：690]）においてシングルバンドを生じた。
【０１４３】２．酵素ドナーの調製 前記に述べた種々の酵素ドナーポリペプチドは宿主細胞
から直接精製されることが不可能であった。例えば、エ
シェリキア・コリ株ＡＭＡ１００４に見出されるこれら
のペプチドのレベルはささいなものであった。これに対
して、相補するペプチドに関しコードするプラスミド
が、菌株Ｅ９００１（Δ lac−pro ， thi， supＥ，Ｆ
´ proＡＢ， lacＩQ ，ＺＭ１５，また７１．１８とも
呼ばれる；メッシングら，1977年，プロ．ナトル．アカ
ド．サイ．ユーエスエイ 75：３６４２〜３６４６［Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｐｒｏ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 7 5：3642-3646]）に
形質転換された場合、活性なβ- ガラクトシダーゼが生
体内相補により形成された。β- ガラクトシダーゼが精
製され、そして該相補するペプチドが、６Ｍ尿素を用い
ての該酵素複合体の変性により回収された。
【０１４４】細胞は０．１％グルコース、５０μg／ml
アンピシリンおよび０．３ｍＭ ＩＰＴＧを追補された
ルリア ベルタニ[Luria Bertani］培地において４２℃
で１６時間培養された。細胞は遠心分離により収獲され
た。以下の段階は、特に記述のない限り４℃にて行なわ
れた。
【０１４５】１２リットルの全培養容量からの約４０g
の細胞が、８０mlの緩衝液Ａ（５０ml トリス（登録商
標）， pＨ７．５，５０ml ＮａＣｌ，１０ml Ｍg Ｃ
ｌ2，１０ｍＭ 2-メルカプトエタノール）に再懸濁さ
れた。リゾチーム（シグマケミカル、ミズーリー州セン
トルイス）が０．２０mg／mlの最終濃度へ添加され、そ
して該懸濁液は、−７０℃のアルコール浴中で凍結され
３７℃の水浴中で迅速に解凍された。解凍される懸濁液
の温度を４℃以下に保つように注意がはらわれた。溶解
物の濃度は、ビルソニック セル ディプラスター（Ｍ
odel １６−８５０）を用いての音波処理によって低減
された。フェニルメチルスルフォニルフルオライド（Ｐ
ＭＳＦ，シグマケミカル）が０．１ｍＭの最終濃度へ添
加され、そして不溶性物質が１６，０００×g で３０分
間遠心分離することにより除去された。１／１０容量の
３０％硫酸ストレプトマイシン溶液がゆっくりと上澄液
に添加された。氷上で１５分間の後、沈澱した核酸が１
６，０００×g で２０分間遠心分離することにより除去
された。清澄化された溶解物は、ゆっくりと８０％飽和
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液の等容量を添加することによ
り、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 で４０％飽和とされた。４℃で
２時間の撹拌に続き、沈澱した物質が１６，０００×g
で３０分間遠心分離することにより集められた。ペレッ
トは最小容量の緩衝液Ｂ（４０ｍＭ トリス（登録商
標）， pＨ７．５，０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｍ
g Ｃｌ2 ，１０ｍＭ 2-メルカプトエタノール）中に溶
解され、そして同じ緩衝液の２００容量に対して透析さ
れた。
【０１４６】透析された溶液は、緩衝液Ｂで平衡化され
たＤＥＡＥ- セルロース（ワットマン ＤＥ−５２[Wha
tman DE-52])の３０mlを充填した２．５×２０cmカラム
にかけられた。カラムは、吸着されていない物質を除去
するために１５０mlの緩衝液Ｂで洗浄された。酵素は、
ＮａＣｌの直線濃度勾配（４０ｍＭ トリス（登録商
標）， pＨ７．５，１０ｍＭ Ｍg Ｃｌ2 ，１０ｍＭ
2-メルカプトエタノール中の０．０１〜０．５０Ｍ Ｎ
ａＣｌ）で溶出された。それぞれの緩衝液成分の容量は
７５mlであり、流速は０．５０ml／分であった。分画が
前に述べられたような酵素活性に関して検定された。ピ
ーク活性は、約０．３Ｍ ＮａＣｌで表われた。酵素活
性を含む分画はプールされ、そして該プールは（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ4で４０％飽和とされた。２時間の撹拌の
後に、沈澱した物質が１２，０００×gで３０分間遠心
分離することで集められた。ペレットは、最小容量の緩
衝液Ｂに溶解され、そして次にバイオ- ゲル Ａ−１．
５ｍ[Bio-Gel A-1.5m]を充填された１．０×１２０cmカ
ラム（床容量８６ml，バイオ- ラッド ラボラトリーズ
[Bio-Rad Laboratories]，カリフォルニア州リッチモン
ド）にかけられた。カラムは０．１０ml／分の速度で緩
衝液Ｂを用いて展開された。分画は酵素活性に関して検
定され、ピーク活性を含む分画がプールされた。等容量
の１００％飽和（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 溶液がゆっくりと添
加された。氷上で２時間の後、沈澱した物質が、１２，
０００×g で３０分間遠心分離することにより集められ
た。
【０１４７】ペレットは最小容量の５０ｍＭ ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 、 pＨ７．３、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解された。
溶液１ml当たり０．４９６gの固相電気泳動純度の尿素
（バイオ- ラッド[Bio-Rad],カリフォルニア州リッチモ
ンド）がゆっくりと添加され、プールの最終尿素濃度が
６．０Ｍにされた。プールは、基質の添加後５分間の間
何らの酵素活性も視識されなくなるまで、氷上に保たれ
た。変性された酵素プールは次に、セファデックスＧ−
７５[Sephadex G-75］を充填された１．０×１２０cmカ
ラム（床容量８４ml，ファラマシア ファイン ケミカ
ルズ[Pharamacia Fine Chemicals］，ニュージャージー
州ピスカタウェイ）にかけられた。カラムは、６．０Ｍ
尿素、５０ｍＭ トリス（登録商標）、 pＨ７．６、
０．１５ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて０．１
０ml／分の流速で展開させられた。分画は、Ｍ１５との
相補活性に関して検定された。相補活性を含む分画がプ
ールされた。この分画プールは１ｍＭ ＮＨ4 ＨＣＯ3
４リットルに対して３回透析され、そして凍結乾燥さ
れた。
【０１４８】３．チロキシン免疫検定法 m-マレイミド- ベンゾイル-L- チロキシン -Ｈ６の酵素
- ドナー結合体は以下のようにして調製された。
【０１４９】L-チロキシン（遊離酸）（６８０mg）が、
無水メチルアルコール（６．０ml）を用いて転化され、
そして該溶液が乾燥塩化水素の活発な蒸気を用いて飽和
された。冷却の後、飽和手順が繰返され、そして溶媒が
減圧下に除去された。得られた結晶性の沈澱物は濾去さ
れ、無水エチルアルコールを用いて洗浄され、次にジエ
チルエーテルで洗浄され、そして最後に乾燥された。乾
燥されたチロキシンメチルエステルハイドロクロライド
は、５０％水性エチルアルコール中に溶解されそして溶
液は２Ｎ水酸化ナトリウム（１当量）で処理された。お
びただしい量の白色沈澱が直ちに形成されそして付加的
な水が、沈澱を完全にするために添加された。沈澱した
L-チロキシン メチルエステル遊離塩基を１時間冷却下
に静置した後、該生成物が遠心分離により回収されそし
て真空下に乾燥された。L-チロキシンメチルエステル遊
離塩基（１０mg）とm-マレイミドベンゾイル-N- ヒドロ
キシスクシンイミド エステル（ＭＢＳＥ）５mg（ピエ
ース ケミカル カンパニー[Pierce ChemicalCo.]，イ
リノイ州ロックフォード）が、無水テトラヒドロフラン
１．０mlに溶解され、続いて粉末無水炭酸ナトリウム１
０mgが添加された。混合物は３０分間還流された。螢光
指示薬および溶媒系としての酢酸エチルを含むＳi α
２５０Ｆ ＴＬＣ プレート ５０×２０cm（ベーカー
[Baker],ニュージャージー州フィリップスバーグ）を用
いる、シリカゲルＧを利用する薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）による反応混合物の調査は、反応が約７０％
完了したものであることを示した。L-チロキシン メチ
ルエステル遊離塩基とＭＢＳＦとの生成物である、m-マ
レイミド- ベンゾイル-L- チロキシン（ＭＢＴＭ）はク
ロロホルム：メタノール混合物を溶離溶剤として用いて
シリカゲルカラムにより精製された。単離されたＭＢＴ
Ｍの薄黄色の粉末は、ＴＬＣにより検定された場合約８
０％純度であり、そして、ＭＢＳＥあるいはL-チロキシ
ンメチルエステルのいずれとも完全に異なるＲf を有し
ていた。ＭＢＴＭによって、螢光指示薬を含むシリカゲ
ルＧにおける短波長紫外線での照射においてチロキシン
に関する特有の燈色を呈し、またニンヒドリン陰性およ
びマレイミド基の存在は、5,5'- ジチオビス-(2-ニトロ
安息香酸）を用いてシステインと反応するそれの能力に
よって確認された。
【０１５０】Ｈ６酵素- ドナー ポリペプチド（１０μ
g）が、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、 pＨ７．０
の０．１５ml中に溶解された。撹拌された上記の溶液に
対し、テトラヒドロフラン１．０ml中のm-マレイミドベ
ンゾイル-L- チロキシン メチルエステル ０．３mgの
５μｌアリコートの２つが添加された。室温で１時間撹
拌した後、反応混合物はバイオ- ゲルＰ−２カラム[Bio
-Gel P2 column](バイオ- ラッド、カリフォルニア州リ
ッチモンド）０．６×１６．０cm上で精製され、０．１
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、 pＨ９．０を用いて溶出さ
れた。１０滴分画が集められた。それぞれの分画のアリ
コートが、ＥＡ２３二量体およびO-ニトロフェニル -β
-D- ガラクトピラノシドの存在における相補活性に関し
て検定された。分画１０および１１が最も高い相補活性
を含んでおり、そしてこれらがプールされた。
【０１５１】本実施例は、酵素ドナーとしてのＨ６- チ
ロキシン結合体、酵素アクセプターとしてのＥＡ２３、
抗チロキシン抗体、および一連の濃度のチロキシンを用
いる、検体としてのチロキシンに対する免疫検定を例示
するものである。
【０１５２】該検定のための試薬は、以下のように調製
された。 L-チロキシン標準：２．６mg L-チロキシン（シグマケ
ミカル、ミズーリー州セントルイス）が無水エタノール
２００μｌに溶解された。次に０．１５Ｍ ＮａＨＣＯ
3 ８００μｌが添加されそして混合物は２５℃で保存さ
れた。チロキシンの２倍希釈が、エタノール：０．１５
Ｍ ＮａＨＣＯ3 （１：４）で調製された。
【０１５３】L-チロキシン抗体：チロキシン（Ｔ４）に
対する抗血清がウェスタン ケミカル リサーチ コー
ポレーション[Western Chemical Research Corp.］、コ
ロラド州デンバーから購入された。いくつかのロットが
力価に関して試験され、そして平衡定数がＩg Ｍ Ｓor
b （エンザイムセンター[Enzyme Center］、マサチュー
セッツ州マルデン）を用いてのラジオイムノアッセイに
おいて決定された。ロット群は、１：１００から１：８
０００の力価で変化した。平衡定数は４．５×１０8 Ｌ
／Ｍから１×１０10Ｌ／Ｍで変化した。力価１：８００
０（ゼロ結合＝６７％）で、Ｋeq＝２×１０10Ｌ／Ｍで
あるロットナンバーＡ４２０が用いられた。
【０１５４】ＥＡ２３アクセプター酵素：保存緩衝液中
の６．３×１０-7Ｍ。
【０１５５】基質：O-ニトロフェニル -β-D- ガラクト
ピラノシド（ＯＮＰＧ）は２．５ｘＺ緩衝液に溶解され
最終濃度１０mg／ml溶液とされた。
【０１５６】検定は、微小力価プレート（ダイナテック
カタログナンバー００１−０１２−９２００ アメリ
カン サイエンティフィック プロダクツ、カリフォル
ニア州サニーヴェール[Dynatech Cat# 001-012-9200 Am
erican Scientific Products,Sunnyvale CA)中で行なわ
れ、そして４１４nmフィルターを備えたティタータック
マルチスキャン微小力価プレート リーダー[Titerta
k Multiscan microtiterplate reader](フロウ ラボラ
トリーズ、メリーランド州ロックビル[Flow Laboratori
es,Rockvill,MD])において読み取られた。それぞれのウ
ェル（窪み[well]）に対し０．０５％トゥイーン ２０
[Tween 20]（ポリオキシエチレン ソルビタン モノラ
ウレート）（シグマケミカルカンパニー、ミズーリー州
リセントルイス）を含むＰＭ２緩衝液が添加された。そ
れぞれのウェルに対して、連続的に、Ｈ６- チロキシン
結合体２．５μｌ、抗チロキシン抗体２．５μｌ、チロ
キシン標準物質２．５μｌおよびＥＡ２３４０μｌが添
加された。結果は表６に示される。
【０１５７】
【表６】
【０１５８】実施例３：Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原検定 この実施例は、酵素ドナーとしてN-末端あるいはC-末端
融合タンパク質を用いての、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
（ＨＢＶ−ＳＡg)を測定するための免疫検定法を例示す
るものである。
【０１５９】１．Ｎ- 末端融合体 非反復のＥcoＲＩ部位において挿入されたＨＢＶの完全
ゲノムを含むプラスミド pＢＲ３２２がＨinc ＩＩで開
裂された。フラグメントＢ（スニンスキーら[Sninskey
et al.］、上記）は、 pＵＣ１３の非反復のＨinc ＩＩ
部位中にクローニングされた（メッシング[Messing］19
83年，上記）。このクローンから、ＨＢＶ−ＳＡg 遺伝
子のほとんどを含むＢamＨＩ−ＡhaＩＩＩフラグメント
が、ＢamＨＩおよびＳ maＩで消化された pＵＣ１３中に
挿入された。この組換えＤＮＡプラスミド p１２２がエ
シェリキア・コリのＪＭ８３株中へ形質転換され、そし
てＨＢＶ−ＳＡg 酵素- ドナーによる生体内相補を示
す、Ｘgal プレート上のライトブルーのコロニーが選択
された。このクローンＭＧ１２２は、アボット アウス
ザイム ＩＩ（１）試験[Abbott Auszyme II (1) test]
( アボット ラボラトリーズ，[Abbott Laboratories],
イリノイ州シカゴ）における交差反応によってＨＢＶ−
ＳＡg を含むことが明らかにされた。このＨＢＶ−ＳＡ
g α- ドナー融合体は、大量の融合体を生成するために
他の発現ベクター中へ移入されることができる。
【０１６０】２．Ｃ- 末端融合体 例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＶ−ＳＡg)は、酵素ド
ナーポリペプチドのカルボキシ末端でクローニングされ
得る。用いられ得る一つの処方は、例示的実施例として
以下に簡単に概要される。
【０１６１】１．２kb ＦnuＤＩＩフラグメントが、完
全ＨＢＶゲノムのクローンから単離されそして pＢＲ３
２２中に挿入された。Ｓ１ヌクレアーゼおよび子ウシ腸
ホスファターゼで処理された、 p１２５のＰvuＩ部分消
化物が次に、完全な長さの線状分子を得るためにアガロ
ースゲル精製された。 p１２５の線状ＤＮＡへのＦnuＤ
ＩＩフラグメントの連結に続き、このＤＮＡはエシェリ
キア・コリ（例えばＪＭ８３）中へ形質転換される。Ｘ
gal プレートにおいて３０℃で白色でかつ４２℃で青色
のアンピリシン耐性のコロニーが次に選択され、ＨＢＶ
−ＳＡg における産生に関してスクリーニングされた
（例えば、アボット アウスザイム ＩＩ試験）。融合
タンパク質は、次に相補性に関し検定する標準的イオン
交換およびアフィニティカラム技術によって精製され
た。
【０１６２】３．ＨＢＶ−ＳＡg に関する酵素免疫検定 試料中のＨＢＶ−ＳＡg の存在あるいは量を測定するた
めの免疫検定法が、関心の試料中の未知のＨＢＶ−ＳＡ
g をα- ＨＢＶ−ＳＡg 融合タンパク質と、相同性を有
する抗原に関して競合させることにより作製された。活
性なβ- ガラクトシダーゼを生成するようにＥＡ２３を
相補するのに有効な遊離α- ＨＢＶ−ＳＡg タンパク質
の量は、計測される未知の遊離ＨＢＶ−ＳＡg の量に逆
比例するであろう。
【０１６３】実施例４：肝炎Ｂ型ウィルス コア抗原検
定法（アッセイ） 肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｂ
amＨＩおよびＥcoＲＩで切断して２個の大きなＤＮＡフ
ラグメントを産生した。これらの大きなフラグメントの
１つは、コア抗原をコード化するコア遺伝子を有する
（ＨＢＶ−ＣＡg)。このフラグメントをＭ１３ mp１０
ＲＦ ＤＮＡの多クローニング部位に挿入した。このＨ
ＢＶ挿入物を有するＭ１３ファージの選択およびスクリ
ーニング後、小量のファージを精製した。コア遺伝子の
（−）極性鎖（メッセンジャーＲＮＡの反対極性）を有
する一重鎖ＤＮＡをファージから単離した。
【０１６４】大部分の遺伝子のように、コア遺伝子はＡ
ＴＧコドン（遺伝暗号）から始まる。コア遺伝子がクロ
ーニングされた発現ベクターは、すでにＡＴＧコドンを
与えられているので第２コアコドンから始まるＤＮＡフ
ラグメントを得ることが必要であった。このことは、コ
ア遺伝子のコドン２−５の（＋）鎖（メッセンジャーＲ
ＮＡと同一極性）を示す１２塩基対の一本鎖オリゴマー
を合成することにより達成された（ＧＡＧＡＴＴＧＡＣ
ＣＣＴ）。このオリゴマーは一本鎖Ｍ１３ファージＤＮ
Ａに対してハイブリッド形成され、エシェリキア・コリ
(E.Coli)ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ フラグメン
ト）により試験管内で［in vitro ］伸長された。この
調製物を、コア遺伝子の外部のＨＢＶ ＤＮＡを翻訳終
結コドンの３´側で切断するＨinc ＩＩで消化した。そ
の後に、ヌクレアーゼＳ１は、一本鎖ＤＮＡをコア遺伝
子の第２コドンの５´側を消化するために使用された。
これは、６８６塩基対フラグメントおよび多数の小さな
種々の長さの二重鎖フラグメントを残す。６８６の塩基
対フラグメントをアガロースゲル電気泳動法により精製
した。使用されたプラスミド発現ベクターは、Ｐr プロ
モーターおよび制限酵素Ｂ amＨＩの次にＡＴＧ出発コド
ンを有した。ベクターをＢamＨＩで消化し、ヌクレアー
ゼＳ１で処理し、平滑端末を有する（ブラント エンド
化）ベクターとした。
【０１６５】ブラント エンド化発現ベクターおよびコ
ア遺伝子フラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用し
て連結し、そして受容能力のあるバクテリアに形質転換
した。得られたコロニーをスクリーニングし、プラスミ
ドを同定し、通常の配向性でコア遺伝子を挿入した。ザ
アボット コア アンチゲン イーエルアエスエイテ
スト(the Abbot Core Antigen ELISA test)(アボット
ラボラトリーズ）により、コロニーは細胞溶解産物中の
抗原タンパク質の存在に関し試験された。プラスミド p
１５２を含有するＭＧ１５２として呼称される強力な免
疫反応陽性クローンが選択され、ＤＮＡ配列はマキサム
−ギルバート (Maxam-Gilbert ) ＤＮＡ配列法により確
認された。コア抗原は精製され、抗体を再産生するため
に使用された。
【０１６６】pＦ２９のα領域のアミノ末端における制
限部位のいずれもがα領域とコア遺伝子との融合に適さ
ないために、α遺伝子のアミノ末端において多クローニ
ング領域中の異なる制限部位を有する第２プラスミドを
構築することが必要であった。 pＵＣ１３をＥcoＲＩで
消化し、粘着性末端をＤＮＡポリメラーゼ ラージフラ
グメント（クレノウフラグメント）に全ての４つの dＮ
ＴＰs を加えたもので満たした。ＰvuＩＩ８bp（ＧＣＡ
ＧＣＴＧＣ）リンカーＤＮＡはこの部位に結合した。こ
の修飾プラスミドを、ＢamＨＩとＰvuＩＩで消化し、多
クローニング部位にＰvuＩＩリンカーを加えたα- 断片
のN-末端を単離した。 pＦ２９プラスミドＤＮＡを同様
にＢamＨＩとＰvuＩで消化し、 pＦ２９α- 領域を除去
し、α領域のN-末端の多クローニング領域中に新規配列
を含むα- 領域と置換した。この新しいプラスミドは、
p１５４と呼称された。
【０１６７】コア -α融合タンパク質を構築するため
に、Ｐr 制御下の p１５２からのコア遺伝子を p１５４
のα- 遺伝子の多クローニング部位に挿入した。 p１５
４ＤＮＡを制限酵素ＢclＩとＡvaＩで消化した。この切
断により生じた介在ＤＮＡフラグメントは、大部分のＣ
Ｉ遺伝子およびＰr プロモーターにコア遺伝子を加えた
ものを有するがコア遺伝子の４つの３´- 末端コドンを
有しない。このＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電
気泳動法により精製した。プラスミド p１５４を制限酵
素ＢclＩおよびＸmaＩで消化し、介在片を除去し、 p１
５２からのＢclＩ−ＡvaＩ ＤＮＡフラグメントと置換
した。これゆえ、４つの末端3'コドンのないＰr 制御下
のコア遺伝子は、ＨＢＶコア抗原 -α融合ペプチドを発
現する枠内遺伝子融合を生成する p１５４のα- 領域の
多クローニング部位に挿入された。この新しいコア -α
を発現するプラスミドをプラスミド p１５７と称する。
融合ペプチドを精製し、実施例３の方法に類似する方法
で肝炎コア抗原用イムノアッセイ (immunoassay ）を構
築するために抗体とともに使用可能である。
【０１６８】実施例５：ヒト絨毛性ゴナドトロピンのた
めの免疫検定 １．製剤 組換法によるヒト絨毛性ゴナドトロピン酵素
ドナー融合ペプチド この実施例は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β-hＣＧ）
のための免疫検定に使用するβ-hＣＧ融合ペプチドの構
築を示す。
【０１６９】hＣＧは、α（１６，０００ダルトンＭ
Ｗ）およびβ（２２，０００ダルトンＭＷ）と呼称され
る２つの非共有結合性結合サブユニットから成る糖タン
パク質である。αサブユニットは hＣＧおよび関連する
糖タンパク質、ロイトロピン（ＬＨ）、チロトロピン
（ＴＳＨ）およびフォリトロピン（ＦＳＨ）に共通であ
る。これらホルモンのβサブユニットは、別個のもので
あるけれども、高度のアミノ酸相同性を有する。しかし
ながら、 hＣＧのβサブユニットは、カルボキシ末端に
非反復の３０のアミノ延長を含んでいる。
【０１７０】この非反復配列は、組換えＤＮＡ技術によ
り構成された。４つのＤＮＡフラグメントは、アプライ
ド バイオシステムズ インコーポレーテッド(Applied
Biosystems,Inc)社のモデル３８０Ａ ＤＮＡシンセサ
イザー（実施例１、１．４で説明した）で合成され、次
の配列を有する：
【０１７１】
【化１４】
【０１７２】ＤＮＡフラグメント(a) と(b) を連結し、
フラグメント(c) と(d) を連結した。これら２つの相補
的ＤＮＡ鎖は、アニーリングされて以下に示されたβ-h
ＧＧサブユニットの３０アミノ酸カルボキシ末端延長を
コードするＤＮＡフラグメントを形成した：
【０１７３】
【化１５】
【０１７４】ＤＮＡフラグメントは、次の翻訳終止コド
ンＴＡＡの3'端に5'ＥcoＲＩ制限酵素部位およびＳalＩ
制限酵素部位を含む。
【０１７５】このＤＮＡフラグメントを実施例４で製作
したプラスミド p１５４に挿入した。プラスミド p１５
４をＥcoＲＩおよびＳalＩで切断し、酵素ドナー（Ｅ
Ｄ）遺伝子からω- 領域を除去し、アガロースゲル精製
した。ＥcoＲＩ−ＳalＩβ-hＣＧ ＤＮＡフラグメント
をゲル精製した p１５４ベクターと連結した。得られた
プラスミド、 p１６６と称するは、ＥＤ−βｈＣＧカル
ボキシ末端融合ペプチド（図２８参照）をコードする遺
伝子を含む。酵素ドナーペプチドＥＤ１６６は９３のア
ミノ酸を含む；下記のようにアミノ酸の１〜６３番目は
α- ドナードメインをコード化し、アミノ酸の６４
（＊）〜９３番目はβ-hＣＧカルボキシ末端をコード化
する：
【０１７６】
【化１６】
【０１７７】第２β-hＣＧ融合ペプチドを第１に次の配
列のＤＮＡフラグメントを合成することにより構築し
た：
【０１７８】
【化１７】
【０１７９】プラスミド p１５４をＢamＨＩとＰv uＩと
で切断し、小さなα- ドナー領域をゲル精製した。Ｂam
ＨＩ−ＰvuＩフラグメントをＤＮＡ合成フラグメントと
連結した。このフラグメントをＢamＨＩ−ＥcoＲＩで切
断し、より小さなα- 領域ドメインを p１６６のＢamＨ
Ｉ−ＥcoＲＩα- ドメインで置換した。得られたプラス
ミド、 p１７５と称するは、８５アミノ酸の酵素ドナー
（ＥＤ１７５）をコード化する。下に示すように、アミ
ノ酸の１〜５５番目はα- ドナードメインをコード化
し、アミノ酸の５６（＊）〜８５番目はβ-hＣＧペプチ
ドのタンパク質をコード化する：
【０１８０】
【化１８】
【０１８１】β-hＣＧカルボキシ末端配列に融合した他
のα- ドナードメインは、実施例１、１．４および図１
５に記載したＨ６ α- ドナードメインと同じアミノ末
端を共有する。ＥＤ Ｈ６を含むプラスミド p１６９を
ＢamＨＩとＥcoＲＩで切断し、直線状ベクターをゲル精
製した。合成ＤＮＡフラグメント、Ｈ６ＰＭ、は次の配
列であり、プラスミド p１６９に挿入された。
【０１８２】
【化１９】
【０１８３】この合成ＤＮＡフラグメントの挿入はＥco
ＲＩ部位を破壊したがアミノ酸配列を変化させなかっ
た。それゆえ、得られたプラスミドはＥcoＲＩ部位を有
しない。α- ドメインをＢamＨＩおよびＰvuＩでの消化
によりこのプラスミドから除き、 p１５４のＢamＨＩお
よびＰvuＩでの消化(p１７５の構成で上記に記述）の
後、 p１５４中へ置換して p１７４を形成した。
【０１８４】プラスミド p１７４は、５１アミノ酸のα
- ドナードメインをコード化し、酵素ドナーのαとω領
域の間にＥcoＲＩ部位を有する。α- ドナードメインを
ＢamＨＩとＥcoＲＩでの消化により p１７４から除き、
ゲル精製した。プラスミド p１６６をＢamＨＩとＥcoＲ
Ｉで消化し、 p１７４からのα- ドナードメインを p１
６６に挿入した。得られたプラスミド p１７７は、カル
ボキシ末端β-hＣＧＤＮＡ フラグメントに融合したα
- ドナードメインを含む。この酵素ドナーペプチドＥＤ
１７７は８１のアミノ酸を含む。このように、ＥＤ１７
７はＥＤ１７５より４つのアミノ酸だけ短いものであ
る。
【０１８５】２．ヒト絨毛性ゴナドトロピン検定 この実施例は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hＣＧ）のた
めの高感度な均質系のクローン化酵素ドナー免疫検定を
示す。さらに、この実施例において第２抗体（ウサギ
抗-hＣＧ）の付着はＥＡ２２との相補の抑制効果を高め
る（以下の実施例９を参照）。
【０１８６】β-hＣＧ酵素ドナーを実施例５、１．に記
載したようにして構築した。この実施例において、ＥＤ
１７５を酵素ドナーとして使用した。
【０１８７】免疫検定は微小力価形態を使用して行なっ
た。５０μｌの適切な濃度の hＣＧ（１×１０3 、３×
１０3 および５×１０3 ｍＩＵ）；５０μｌの１：１０
０希釈ポリクローナルウサギ 抗-hＣＧ抗体（ロットナ
ンバー 01-302-57，イムノサーチ ニュージャージ州ト
ムスリサーチ(Immunosearch,Toms River,NJ)）および５
０μｌのＥＤ１７５（１×１０-8Ｍ）を加えて免疫検定
を行なった。全ての希釈度はＰＭ２緩衝液におけるもの
であった。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベー
トした。５０μｌの１：１０希釈液のヤギ抗ウサギ抗体
を加え（アンチボディーズ インコーポレーテッド，カ
リフォルニア州ディビス(Antibodies,Inc.,Davis,C
A)）、そして反応混合物を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。そしてその混合物を５０μｌの酵素アクセプ
ターＥＡ２２（１×１０-7Ｍ）およびＯＮＰＧ基質（５
mg／ml）と反応させた。微小力価プレートを３７℃でイ
ンキュベートしそしてＯＤ414 を測定した。
【０１８８】結果を図２９に図面で示した。この実施例
は、均質系の免疫検定の使用に適する服用量−応答曲線
を示す。この検定は腫瘍マーカーとしてまたは妊娠の指
示薬のいずれかとしてｈＣＧ用テストとして使用し得
る。
【０１８９】実施例６：ビオチンに対する検定 この実施例は、検体結合タンパク質として糖タンパク質
アビジンを使用するビオチンに関する競合的結合検定を
示す。
【０１９０】アビジン（ＭＷ＝６７，０００ダルトン）
は、会合定数１０15Ｌ／Ｍで、ビオチン（ＭＷ＝２４４
ダルトン）と結合する。ビオチンをＨ６の６５番目のリ
シンおよびN-末端α- アミノ基と結合させた。酵素ドナ
ーにカップリングしたアビジンがＥＡ２３との相補を阻
害したかどうかを決定するために、検体結合タンパク質
として溶液中のアビジンを使用した。
【０１９１】ビオチンと酵素ドナーＨ６とのカップリン
グを次のように行なった。実施例１に記載したようにし
て調製した凍結乾燥化Ｈ６を０．１５mlの０．１Ｍリン
酸ナトリウム、 pＨ７．５で溶解し、室温で撹拌した。
N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１０mg／mlの
N-ヒドロキシヌクシニミドビオチン（シグマ ケミカ
ル，セントルイス，ミズーリー州(Sigma Chemical,St.L
ouis,MO)）の５μｌアルコート２つを加えた。室温で１
時間放置後、その溶液を遠心分離処理し、上澄液を pＨ
９．０の０．１Ｍホウ酸ナトリウムで平衡にしたバイオ
ゲルＰ−２(Bio-Gel P-2)(０．６×１６cm）サイジング
（バイオラッド ラブス，リッチモンド，カルフォルニ
ア(Bio-Rad Labs,Richmond,CA)) に加え、同じ緩衝液で
溶出させた。１０滴の分画を集め、ビオチニル -Ｈ６結
合体を含む分画（すなわち、相補活性）をプールした。
【０１９２】予備実験において、相補性の阻害に必要な
アビジン濃度を決定するために滴定が行なわれた。ＰＭ
２緩衝液、ビオチン化Ｈ６、アビジン、ＥＡ２３および
基質o-ニトロフェニル -β-D- ガラクトピラノシドを微
小力価プレートに加えた。３７℃で１５分間後、４１４
nm（ＯＤ414 ）における光学密度を測定した。表７は、
それらの結果を示す。このデータは、０．５μgのアビ
ジン（７．５×１０-12モル）が相補反応を７５％阻害
することを示す。
【０１９３】
【表７】
【０１９４】遊離D-ビオチン（シグマ ケミカル，セン
トルイス，ミズーリー州(Sigma Chemical,St.Louis,M
O)）濃度を変化させて加えて競合的結合曲線を描いた以
外は、ビオチン用競合的結合検定を予備実験用に記載し
た方法で行なった。これゆえ、各ウェルは５μｌのビオ
チン -Ｈ６：０．５μgのアビジン；２０μｌのＥＡ２
３（３．６×１０-7Ｍ）；１００μｌのＯＮＰＧ（１０
mg／ml）基質、および１〜８μｌD-ビオチン（１μg／m
l）と十分なＰＭ２緩衝液を加えて全容積約２００μｌ
としたものを含む。１５分間後、光学密度（４１４nm）
を測定した。データを図９の図面で示す。以上のように
この検定系は、１〜８mgまたは４〜３２×１０-12 Ｍの
ビオチン用の良好な検定を提供する。アビジン−ビオチ
ン系（Ｋa＝２×１０15Ｌ／Ｍ）は、１５分間検定以内
で相補性（Ｋa ＝１〜２×１０5 Ｌ／Ｍ）を制御するの
に十分な親和性を有する。
【０１９５】実施例７：ビオチンのための不均質系の相
補性検定 この実施例は、特異検体結合タンパク質としてアビジン
を使用するビオチンのための不均質系の検定系を示す。
酵素アクセプターはＥＡ２３であり、酵素ドナーはビオ
チンにカップリングしたＣＮＢｒ２である（以後、ＣＮ
Ｂｒ２- ビオチン結合体と称する）。
【０１９６】ＣＮＢｒ２- ビオチン結合体を次のように
合成した：９００μgの親水化ＣＮＢｒ２ポリペプチド
を pＨ７．５の３００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液に溶解させた。２．１mgの[N- ヒドロキシ-(d-ビ
オチン スクシミド エステル、またはN-ヒドロキシス
クシミドビオチン）スクシミド活性化ビオチン（シグマ
ケミカル コーポレーション、セント ルイス，ミズ
ーリー州[Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO])]を含む２
００μｌアリコートのN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）を室温で撹拌しながら２００μｌアリコートづつ加
えた。２時間後、反応混合物を pＨ９．０の０．１Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液を使用するバイオゲル Ｐ−２(B
iogel P-2)カラム（１．５×４８cm）のグラマトグラフ
ィーにかけた。ＣＮＢｒ２- ビオチン結合体を含む分画
をＥＡ２３との相補反応により同定した。
【０１９７】アビジン固定化アガロース（アビジン- ア
ガロース，シグマ ケミカル コーポレーション，セン
トルイス，ミズーリー州[Sigma Chemical Co.,St.Loui
s,MO]を１μｌ懸濁液当り１７．５ユニット（１ユニッ
トは１μgのビオチンを結合する。))仕入品を、低ゲル
化温度アガロース懸濁液（６mg／ml）で希釈して所定レ
ベルのアビジン- アガロースを得た。
【０１９８】１．アビジン- アガロースによるＣＮＢｒ
２- ビオチン相補活性阻害 ２０μｌのＣＮＢｒ２- ビオチン結合体貯蔵品（５×１
０-7Ｍ）、９０μｌのＰＭ２バッファーおよび２０μｌ
の各種希釈度のアビジン- アガロースをエッペルドルフ
(eppendorf）バイアル（小びん）中で充分に混合し、室
温で１０分間インキュベートした。その後、バイアルを
５分間遠心分離機にかけて１００μｌの上澄液を各バイ
アルから除いて各々１０μｌＥＡ２３貯蔵品（１．５×
１０-6Ｍ）を含む微小力価ウェルに入れ、３７℃で１５
分間インキュベートした。その後、基質ＯＮＰＧ（１０
mg／mlのものを１００μｌ）を加え、４１４nmにおいて
各ウェルの吸光度を３７℃で３０分後測定した。それら
の結果を図１０の図面で示す。
【０１９９】２．固定化アビジンに対するＣＮＢｒ２-
ビオチン 結合体とのビオチンの競合 上記のごとく決定した力価を使用して、ビオチン投与量
応答曲線は、下記のように得られる。２０μｌのアビジ
ン- アガロース懸濁液（全量０．３５ユニット）および
９０μｌの各種レベルのビオチンを含有するＰＭ２緩衝
液をエッペンドルフバイアル中で充分に混合し、室温で
１０分間インキュベートした。その後２０μｌのＣＮＢ
ｒ２- ビオチン結合体貯蔵品（５×１０-7Ｍ）を加え、
充分に混合し、室温で１０分間インキュベートした。バ
イアルを５分間遠心分離機にかけ、１００μｌの上澄液
を各バイアルから除いて各々１０μｌＥＡ２３貯蔵品
（１．５×１０-6Ｍ）を含有する微小力価ウェルに入
れ、３７℃で１５分間インキュベートした。基質 ＯＮ
ＰＧ（１０mg／mlのものを１００μｌ）を加え、各ウェ
ルの吸光度を４１４nmで、３７℃で３０分間インキュベ
ートした後に測定した。投与量応答曲線を図１１の図面
で示す。そのような曲線は、未知サンプル中のビオチン
量を定量するために使用し得る。
【０２００】実施例８：ジゴキシンのための酵素免疫検
定 この実施例は、検体が強心性ジギタリス グリコシドジ
ゴキシンであるエンザイム イムノアッセイ（酵素免疫
検定法）について示す。検体結合タンパク質は、ジゴキ
シンに特異な抗体である。さらにこの実施例は、検定の
作用機構がカストロおよびモンジ(Cartro and Monji)に
より記載されたβ- ガラクトシダーゼを使用する立体障
害エンザイムイムノアッセイとは類似していないことを
示す（1981，メソッドス イン エンザイモロジー73：
523 −42(Methods in Enzymology73:523-42))。
【０２０１】１．ジゴキシン -Ｈ６結合体の調製 下式で表わされるジゴキシゲニン、特に3-o[m-マレイミ
ドフェニルカルバミル］ジゴキシゲニンのウレタン誘導
体［以後、「ジゴキシン- マレイミド付加物」と称す
る］を次のように調製した。
【０２０２】
【化２０】
【０２０３】マグネット撹拌装置、アルゴン入口および
還流冷却器を備えた、乾燥１０ml丸底フラスコへ、3-カ
ルボキシフェニルマレイミド（６７mgまたは０．３０７
ミリモル）、乾燥ベンゼン（３ml）および乾燥トリエチ
ルアミン（０．０４３mlまたは０．３０７ミリモル）を
加えた。混合物を３０分間還流した。アリコートの赤外
線スペクトル分析（ＩＲ）はカルボニルアジド（２１５
０cm-1）への転化を示した。ジゴキシゲニン（８０mgま
たは０．２０５ミリモル）および乾燥テトラヒドラフラ
ン（２ml）をその後反応混合物に加えた。３．５時間の
還流後、反応混合物を酢酸エチル（１００ml）で希釈
し、５０mlの冷却１％ＮａＯＨ水溶液で一度洗浄し、５
０ml飽和ＮａＨＣＯ3 水溶液で一度洗浄した。その後、
有機相を無水Ｍg ＳＯ4 で乾燥し濾過し、溶媒をロータ
リーエバポレータを使用して除いた。残留物を約１〜２
mlのアセトンに溶解し、２つの調製用薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）プレート（１５００ ミクロン シリ
カゲル アナルテック ユニプレート，アナルテック，
ネワーク，デラアェアー(1500 micron silica gel Anal
techuniplate,Analtech,Newark,DE)）にかけた。アセト
ンの蒸発後、プレートを８０／２０＝酢酸エチル／ベン
ゼンで溶出した。未反応ジゴキシゲニンをプレートか
ら、プレートからの補正ＵＶ活性帯をこすり取ることに
より除き、３０mlの酢酸エチルで３回洗浄した。この方
法を上記ジゴキシゲニンの次の二つのスポットに繰り返
した。この精製は、ジゴキシゲニン（２６mg）、好適な
産品ジゴキシン- マレイミド付加物（３１mgまたは未反
応出発物質に対して３７％の収率）および12-o-(m-マレ
イミドフェニルカルバミル）- ジゴキシゲニン（２８mg
または未反応出発物質に対して３３％の収率）を与え
た。
【０２０４】薄層クロマトグラフィーは、２．５％Ｍｅ
ＯＨ- ＣＨ2 Ｃｌ2 中でジゴキシン- マレイミド付加物
純度を確かめるために実施された。もしさらに精製が必
要であれば、３％ＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 （２溶離）に
よる調製用ＴＬＣによって最高に達成される。ジゴキシ
ン−マレイミド付加物は、次のスペクトル特性を示し
た：
【０２０５】
【化２１】
【０２０６】ジゴキシン- マレイミド付加物をベックマ
ン モデル３３２高性能液体クロマトグラフィーシステ
ム（ベックマン インストルメンツ，インコーポレーテ
ッド，パロ アルト，カルフォルニア(Beckman Instrum
ent,Inc.,Polo Alto,CA)）を使用するＲＰ−８シンクロ
パック ２５０×１０mmＩ．Ｄ．（シンクロム，インコ
ーポレーテッド，リンデン，インジアナ(SynChrom,In
c.,Linden,ID))でさらに精製した。勾配溶離を１．５ml
／分の流速で６０分かけてＨ2 Ｏ中の０〜８０％アセト
ニトリルで実施した。ジゴキシン- マレイミド付加物を
プールし、凍結乾燥した。
【０２０７】その後、精製ジゴキシン- マレイミド付加
物を上記のごとく調製した酵素ドナーＨ６とカップリン
グさせ、酵素ドナー検体結合体であるジゴキシン -Ｈ６
を形成した。Ｈ６（１．５mg）を pＨ６．０で２４０μ
ｌのアセトニトニル- ５０ｍＭリン酸ナトリウム（３：
２）に溶解した。ジゴキシン- マレイミド付加物（１．
０mg）を３７℃で２時間保持した反応混合物に直接加え
た。カップリング反応が完了後、６０μｌアリコート混
合物をボンダパック（登録商標）フェニルカラム(Bonda
pak （登録商標） Phenyl column) １０×３０cm（ウォ
ーターズ アソシエーツ，ミルフォード，エムエイ(Wat
ers Associates,Milford,MA)）に注入した。カラムを６
０分間Ｈ2 Ｏ中の勾配０〜８０％のアセトニトリル、
０．１％トリフルオロ酢酸で展開した。酵素ドナー活性
を含有するサンプルをプールした。 ２．ジゴキシンのための免疫検定法 本発明の方法により調製された酵素免疫検定系におい
て、酵素アクセプターおよび酵素ドナー結合体（すなわ
ち、検体にカップリングした酵素ドナー）濃度の異なる
組合せは、相補プロセスにより与えられたβ- ガラクト
シダーゼ濃度を生じるために使用し得る。質量作用の法
則は、酵素アクセプターの比較的高濃度状態で、相補プ
ロセスにおける抗体の阻害効果が緩和されることを必要
とする。このことは、検体、例えばジゴキシンの変化す
る濃度に対し投用量応答特性が平坦またはないというこ
とにより明らかである。反対に、酵素ドナー結合体の比
較的高濃度状態（抗体に対して）で、相補プロセスにお
ける抗体の阻害効果も失なわれる。後者の状況は、投用
量応答特性が平坦またはないということにより、そして
高められたバックグラウンドによっても明らかである。
【０２０８】この実施例は、従来のエンザイムイムノア
ッセイの如く酵素アクセプター、酵素ドナー、および特
異抗体の相対濃度が検体に関する診断学的検定の使用に
好適な精度（傾き）および感度を有する服用量応答特性
を示す検定をつくり出すために規定されなければならな
いことを示す。
【０２０９】微小力価形態を使用する一連の実験におい
て、システム感度をジゴキシン -Ｈ６酵素ドナーとＥＡ
２３酵素アクセプター濃度の異なる組合せを使用して決
定した。
【０２１０】各々５０μｌのジゴキシン（検体）、酵素
ドナーＨ６ジゴキシン結合体、ジゴキシンに特異な抗体
（抗ジゴキシン）および酵素、酵素アクセプター（ＥＡ
２３）および基質としてのo-ニトロフェニル -β-D- ガ
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）５mg／リットルを含む溶
液の４つを順次加えて検定を行なった。全ての希釈はＰ
Ｍ２緩衝液［０．５Ｍ Ｎａ2 ＨＰ4 、１ｍＭ Ｍg Ｓ
Ｏ4 、０．１８ｍＭＭｎＳＯ4 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０２％ ＮａＮ3 および０．０５％のトウーン２０
(Tween 20)（ポリオキシエチレン ソルビタン モノラ
ウレート，シグマ ケミカル コーポレーション，ミズ
ーリー州セントルイス(polyoxyethylenesorbitan monol
aurate,Sigma Chemical Co.,St Louis,MO)]において行
なった。ジゴキシン検体濃度は、０，１，１０，１０
０，２００，５００および１０００ng／mlであった。ジ
ゴキシンに特異な抗体は、ジゴキシン結合体を次のよう
にウサギ中に注入することにより得られた：２．０mlの
完全フロイント(Freund)アジュバント（補助薬）の全容
積中の５０μgの結合体を使用して初回の筋内注入を行
なった。ブースター（筋内）を１．０mlの完全フロイン
トアジュバンドの全容積中の２５μgの結合体でもって
４週間間隔で投薬した。５０mlの血を初回の注入から９
０日間、２週間ごとに集めた。内側動脈の切開または耳
周縁静脈の切開により集めた。血液を凝結させ、３０分
間１０００×gで遠心分離機にかけたのち上澄液として
２５ml血清／５０ml血液を回収した。
【０２１１】結果を図１２および図１３に図面で示す。
図１２および図１３の投与量応答曲線を比較すると酵素
アクセプターまたは酵素ドナー結合体のいずれかの濃度
を選択的に減少すると急勾配となり、それゆえにさらに
感度の高い投与量応答曲線となることが判る。
【０２１２】３．ジゴキシン免疫検定の機構 抗ジゴキシン抗体と酵素ドナージゴキシン結合体との反
応が、重合したβ- ガラクトシダーゼ酵素による基質転
化よりも相補プロセスを阻害するかどうか決定するため
に、相補プロセスは一連の実験において抗体の添加前に
プロセスを完了させられた。
【０２１３】実験処方は次のようであった：３００μｌ
のＰＭ２緩衝液とジゴキシン -Ｈ６結合体を６０分間１
５０μｌの酵素アクセプターＥＡ２３（４．１×１０-6
Ｍ）と反応させた。このことは相補性が完了することが
認められた。上記反応混合物のアリコート（１２５μ
ｌ）を除き、ウサギ抗ジゴキシン抗体（ＰＭ２緩衝液で
１：１００に希釈した）のアリコート（５０μｌ）に加
えた。反応混合物をその後３０分間インキュベートし
た。この期間の終了時にＯＮＰＧ基質（最終濃度１mg／
ml）を加え、反応混合物を３７℃でインキュベートし
た。反応混合物の光学密度を３７℃でインキュベート
し、７および１６分後に測定した。（ＰＭ２緩衝液）
１：１００に希釈した正常ウサギ血清またはＰＭ２緩衝
液のいずれかの５０μｌをウサギ抗ジゴキシン抗血清の
代りに加えた以外は比較試験管を同様に処理した。結果
を表８に示す。
【０２１４】
【表８】
【０２１５】表８に示したように、あらかじめ重合した
β- ガラクトシダーゼ（ジゴキシンＨ６およびＥＡ２３
酵素アクセプターの完全相補）による基質転化を抗体は
阻害しない。このようにエンザイム アッセイを使用し
て観察された基質転化の減少は抗体の阻害による相補の
結果であり酵素基質転化の減少の結果ではない。それゆ
えに、本発明による検定法の作用機構は、カストロおよ
びモンジ(Castro andMonji)により記載されたβ- ガラ
クトシダーゼを使用する立体障害エンザイムイムノアッ
セイとは類似しない（1981，メソッズ イン エンザイ
モロジー73：523 −542(1981,Methods in Enzymology
73：523-542)）。
【０２１６】３．１．酵素アクセプターを変化させるこ
とによる抗ジゴキシン抗体の相補性におよ ぼす効果 一連の実験において、ジゴキシンに対する特異抗体の阻
害効果を実施例２、２および実施例８、１の記載のごと
く調製した３つの酵素アクセプターおよび酵素ドナージ
ゴキシン -Ｈ６結合体を使用して測定した。
【０２１７】反応混合物を次のように調製した：５０μ
ｌＰＭ２緩衝液；５０μｌのＰＭ２緩衝液中のジゴキシ
ン -Ｈ６結合体の適切な希釈度（１：２０，１：４０，
１：８０）；５０μｌの適切な抗体（すなわち抗ジゴキ
シン抗体または正常ラビット血清のいずれか）および酵
素アクセプター（１×１０-7Ｍ ＥＡ１４，ＥＡ２０ま
たはＥＡ２２）および基質o-ニトロフェノール- β-D-
ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（５mg／ml）の５０μ
ｌの適切な混合物を微小力価プレートに加えた。プレー
トを３７℃で所定期間インキュベートした。４１４nmに
おける光学密度を５分間間隔で４５分間測定した。
【０２１８】このシステムの抗体相補阻害効果は、酵素
アクセプター欠失の大きさに関係すると思われる。アミ
ノ酸の１３−４０番目（図７参照）を欠失し、かつこの
実験で試験した最も大きな欠失である酵素アクセプター
ＥＡ２２は、抗体により最も阻害されなかった。アミノ
酸の３０−３７番目（図７参照）を欠失し、かつ試験さ
れたグループの中で最も小さな欠失である酵素アクセプ
ターＥＡ１４は、抗体により最も阻害された。アミノ酸
の２６−４５番目（図７参照）から成り、大きさがＥＡ
２２とＥＡ１４の中間であるＥＡ２０は、相対的にそれ
らの中間で阻害された。しかしながら、ＥＡ２０の自然
な相補効率は、ＥＡ１４またはＥＡ２２のいずれのそれ
よりも少ない。酵素アクセプターは、２つの基準を満た
さなければならない：(a) 自然な相補効率（例えば、Ｅ
Ａ１４およびＥＡ２２は、等モル濃度において図７に示
された他のものよりさらに効果がある）；および(b) 相
補特異的検体結合タンパク質の阻害能。
【０２１９】実施例９：第２抗体のジゴキシン酵素免疫
検定における効果 上記実施例７、３に示した結果は、抗ジゴキシン抗体の
本発明による酵素ドナージゴキシン結合体へのカップリ
ングが酵素アクセプターと酵素ドナー結合体の相補速度
を遅くするということを示す。しかしながら、そのよう
なカップリングは、完全には相補を妨害しない。実施例
８、３で述べたように、このシステムは、酵素アクセプ
ターと酵素ドナー結合体のほぼ１５分間のインキュベー
ションで最も感度が高くなる。
【０２２０】そのシステムは、約１５分間で最大吸収差
に達する。その時抗ジゴキシン抗体が存在するシステム
においてβ- ガラクトシダーゼ濃度は、抗体が存在しな
いシステムまたはジゴキシン抗体が中和されるシステム
の濃度と同じである（例えば、高ジゴキシンレベル）。
β- ガラクトシダーゼ濃度が同じであるため、基質転化
率も同じである。付加的な吸収差は生じない。抗体の相
補効果を制限する現象は、投与量応答曲線に対し狭い吸
収範囲、平坦な傾き特性およびある診断法に対して不十
分な検定感度を示す方法を提供する。
【０２２１】次の実施例は、抗ジゴキシン結合体抗体に
特異な第２抗体の付着が相補阻害を強めることを示す。
【０２２２】１．完全第２抗体の付着 一連の実験において、５０μｌのウサギ抗ジゴキシン抗
体（１：１０００に希釈）を、一組の微小力価ウエル中
で５０μｌのジゴキシン -Ｈ６（ＰＨ２緩衝液中で１：
５０に希釈）および０，１，２．５，５，７．５，１
０，１００ng／mlの範囲の５０μｌのジゴキシンと結合
させた。５０μｌアリコートの第２抗体製剤（ベチル
ラボ，モントゴメリー，テキサス州，ヤギ抗ウサギ血清
１：５０〜１：８００(Bethyl Lab,Montgomery,TX,goat
anti-rabbit serum 1:50-1:800))を各ウェルに加え
た。結果を表９から表１１に一覧表にする。
【０２２３】
【表９】
【０２２４】表９に示されるように、第２抗体を抗体-
ジゴキシンＨ６結合体に付着することにより達成される
相補阻害効果は、第２抗体の１：５０希釈またはそれ以
下で最適である。第２抗体の１：２００〜１：３００の
希釈において、全ての相乗阻害が失なわれた。第２抗体
ありまたはなしの相補阻害は、この希釈においてまたは
それ以上においても同じである。
【０２２５】
【表１０】
【０２２６】
【表１１】
【０２２７】表１０および表１１で示されるように、第
２抗体なしでは基質転化率（すなわち、β- ガラクトシ
ダーゼ濃度）は３０分間以内で最大７０％に達した。
１：４０の希釈で第２抗体を有する場合には、基質転化
率は最大約２５％であった。第２抗体が１：４０希釈よ
りも大きい場合において、相補阻害効果は、時間ととも
に基質転化率が増加することによって明らかなように、
減少した。
【０２２８】１：４０またはそれ以上の希釈において、
基質転化率が増加するという効果がある。
【０２２９】試験した第２抗体の全濃度において基質転
化率（すなわちβ- ガラクトシダーゼ濃度）は、システ
ムが許容するβ- ガラクトシダーゼの最大濃度以下のレ
ベル（例えばＮＲＳは第２抗体に代わる）で直線状とな
った（すなわち、新規β- ガラクトシダーゼを産生しな
い）。このことは、第２抗体の結合が第１抗体の立体障
害を高め、かつ結合する酵素ドナー集団による相補を完
全に妨げるということを示す。
【０２３０】１．１．投与量応答：ＥＡ１４とジゴキシ
ン -Ｐ６ 他の一連の実験において、エンザイムイムノアッセイの
感度を０，１，１０，１００，１０００ng／ml範囲の濃
度のジゴキシン（検体）、酵素アクセプターＥＡ１４、
ウサギ抗ジゴキシン抗体および第２抗体としてのヤギ抗
ウサギ抗体を使用して測定した。これらの実験において
ジゴキシン -Ｈ６結合体（実施例８）およびＥＡ１４酵
素アクセプターで記載した方法と類似方法で調製した酵
素ドナージゴキシン- Ｐ６を様々な組合せの濃度で使用
した。各ケースにおいて次の方法を使用した：微小力価
形態において、各々５０μｌのジゴキシン- Ｐ６、遊離
ジゴキシン検体および抗ジゴキシン抗体を順次加えた。
その後、５０μｌのヤギ抗ラビット（１：８０）を加え
た。プレートを室温で１０分間インキュベートした。そ
の後、各々５０μｌの適切な希釈の貯蔵品ＥＡ１４
（２．６４×１０-5Ｍ）およびo-ニトロフェニル -β-D
- ガラクトピラノシド(galactopyranoside）基質（５mg
／ml）を加えた。プレートを３７℃で再びインキュベー
トし、反応混合物の吸光度を１５分、３０分に測定し
た。基質ブランクの吸光度を全サンプルから引いた。
【０２３１】図１４に示された図の結果は、ジゴキシン
検定使用に適する服用量応答曲線を示す。
【０２３２】２．第２抗体フラグメントの付着 第２抗体が第１抗体- 酵素ドナー結合体とカップリング
したときに観察された阻害の高揚が沈降素複合体中の酵
素ドナー結合体の立体障害またはエントラップメントに
帰するかどうか決定するために、ヤギ抗ウサギ免疫グロ
ブリンの単価Ｆabフラグメント（約５０，０００ダルト
ンＭＷの抗原結合フラグメント）を第２抗体として使用
した。Ｆabフラグメントが抗原と架橋できないために沈
降または凝集反応を誘導することはできない。この製剤
で観察された相補のいかなる阻害も、相補に対する高め
られた立体効果によるものであって結合体の高められた
エントラップによるものではない。
【０２３３】微小力価プレート形態において、各々５０
μｌのジゴキシン（０，１，４，１０，１０００ng／m
l）；ジゴキシン -Ｈ６結合体；ウサギ抗ジゴキシン第
１抗体（１：４０００）および１：８０希釈の第２ヤギ
抗ウサギ抗体（ベチル ラブス，モントゴメリー，テキ
サス(Bethyl Labs,Montgomery,TX))を５つ等しく加え
た。希釈はすべてＰＭ２緩衝液中であった。第２抗体を
正常ウサギ血清（１：８０）および１：１０，１：２
０，１：４０，１：８０，１：１６０，１：３２０希釈
のヤギ抗ウサギ血清のＦabフラグメント（カッペル ラ
ボラトリーズ，ウエストチェスター，ペンシルバニア(C
appel Laboratories,West Chester,PA))で置換した。１
０分間室温で放置後、５０μｌの１×１０-6Ｍ ＥＡ１
４および５mg／mlの基質ＯＮＰＧを加え、３７℃で３０
分間インキュベートした。ＯＤ414 を測定し、結合／最
大結合（Ｂ／Ｂmax)を決定した。
【０２３４】結果を表１２に示す。
【０２３５】
【表１２】
【０２３６】表１２に示すようにヤギ抗ウサギ免疫グロ
ブリン（Ｆabフラグメント）が第１抗体酵素ドナー結合
体とカップリングする際に明らかに相補性が減少する。
Ｆabフラグメントにより誘導される相補の阻害は、抗体
全部を使用する際に観察された阻害とほぼ同等である。
【０２３７】表１２に示されるように第２抗体は、高投
与量（すなわち、過剰の遊離検体により引き起こされる
より少ない抗体酵素ドナー相互作用）より小投与量（す
なわち、より大きな抗体／酵素ドナー相互作用）におい
て大きな相補阻害効果を示した。
【０２３８】Ｆab濃度が減少すると、相補阻害が直線的
に減少した。表９でそのままの分子は、１：４０より大
きな希釈で有効に第２抗体を減少することを示した。同
様に、Ｆab製剤の１：４０の希釈で同様の現象が始まる
ことが判る。
【０２３９】３．検体特異抗体による相補阻害：ＥＤ-
ジゴキシ ン結合体の比較 特異的検体抗体による相補活性の特異的阻害に関して
の、各種ＥＤ- ジゴキシン結合体の比較を行なった。下
に示す実験においてＥＡ２２をカップリングした酵素ド
ナーの相補活性を標準化した。各種ＥＤのジゴキシン結
合体を、カップリング時の pＨを pＨ９．５まで上昇さ
せてジゴキシン- マレイミドをα- アミノ基およびα-
領域へのシステイン末梢の両方へカップルするＥＤ４
（2-ジゴキシン）を用いることを除いては前記のように
調製した。抗ジゴキシン抗体およびヤギ抗ウサギ抗体濃
度の両者を標準化した。その結果を表１３に示す。
【０２４０】
【表１３】
【０２４１】実施例１０：第２抗体を使用する改良され
たチロキシンおよびジゴキシン検定 チロキシンおよびジゴキシン酵素相補性免疫検定を第２
抗体を使用して行なった。
【０２４２】さらにチロキシン（Ｔ４）検定をＥＡ２２
およびＥＤ４を使用しベーカーインスツルメンツ(Baker
Instruments）（アレンタウン，ペンシルバニア(Allen
town,PA)製遠心分離分析器、エンコアー(ENCORE （登録
商標））で改良した。その検定系は、１０μｌの患者の
サンプル、抗Ｔ４抗体およびサリチル酸塩を含んだ１０
０μｌの酵素アクセプター試薬、および第２ヤギ抗ウサ
ギ抗体および基質o-ニトロフェニル -β-D- ガラクトピ
イラノサイド（ＯＮＰＧ）を含む２９０μｌの酵素ドナ
ー試薬を含む。その最終システム濃度は表１４のようで
あった：
【０２４３】
【表１４】
【０２４４】９００秒で読みとった。各患者のＴ４サン
プルを使用する際にはO.D.／分の変化は、個々の患者の
サンプルを分けてO.D.405 で±５０ｍO.D.投入量によっ
てプロットすべきである。図２６は、すべてヒト血清中
で調製された検量物質によるＴ４検定を示す。９００秒
での検量物質間の吸光度の変化を血清Ｔ４濃度に対して
プロットする。
【０２４５】ジゴキシン検定をＥＤ５およびＥＡ２２お
よびベーカーエンコリー(Baker ENCORE （登録商標））
遠心分離分析器を用いて改善した。ジゴキシン標準がヒ
ト血清において調製された。アッセイは、３０μｌの血
清、２００μｌのＥＤ５- ジゴキシン試薬および１００
μｌのＥＡ２２試薬を含む。ＥＤ５- ジゴキシン試薬
は、基質o-ニトロフェニル -β-D- ガラクトピラノサイ
ドおよびヤギ抗ウサギ抗体を含んでいた。ＥＡ２２試薬
はウサギ抗ジゴキシン抗体を含んでいた。最終システム
濃度は表１５のようであった：
【０２４６】
【表１５】
【０２４７】この検定の標準的な曲線を図２７に示す。
【０２４８】実施例１１：遺伝子工学的および化学的に
合成された酵素ドナーのジゴキシン免疫検 定性能比較 化学に合成された成分と遺伝子操作された成分とを使用
した酵素免疫検定を比較するために、２つの類似酵素ド
ナー、すなわち１つは組換ＤＮＡ技術によるものであ
り、他は化学ペプチド合成によるもの、を調製した。遺
伝子操作により生産したＥＤ３（実施例１、１．４参
照）およびポリペプチド合成により生産したＥＤ３Ａ
（実施例１、１．５参照）のアミノ酸配列を図１８に示
す。これら２つのペプチドの顕著な特徴は、検体への化
学カップリングに使用され、図１８において星印を付し
た類似システイン残基（Ｃys）とＥＤ３のアミノ酸番号
１２と５０の間に位置し、ＥＤ３Ａのアミノ酸番号５と
４３α間に位置するものを含み野生−タイプβ- ガラク
トシダーゼの対応するアミノ酸の６〜４４番目を含む類
似α- ドナードメインである。
【０２４９】ジゴキシンαＥＤ３およびＥＤ３Ａへの結
合を実施例８、１に記載の3-o[m-マレイミドフェニルカ
ルバミル］ジゴキシゲニンを用いて行なった。ＥＤ３、
ＥＤ３Ａ、ジゴキシン -ＥＤ３およびジゴキシン -ＥＤ
３Ａ製剤を溶離液として０．１％ＴＦＡを含む水中の０
〜８０％のアセトニトリル濃度勾配を使用した調製用Ｈ
ＰＬＣヘニル カラム(henylcolumn)[ウォーターズ μ
ボンダパック，ウォーターズアソシエート，ミルフォ
ード，マサチューセッツ(Waters μ Bondapak,Water As
soc.,Milford,MA)）を有する高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）にかけた。各酵素ドナーのカラム分画を
酵素アクセプターとしてＭ１５を使用して実施例１、
２．１に記載の相補性を検定した。ＥＤ３- ジゴキシン
の相対的な相補効率はＥＤ３Ａ- ジゴキシンの４倍であ
った。
【０２５０】ジゴキシン -ＥＤ３およびジゴキシン -Ｅ
Ｄ３Ａに対応するカラム分画を別々にプールし、ジゴキ
シンに関する競合的酵素免疫検定を比較した。
【０２５１】９６ウェル微小力価プレートを使用して検
定した。検定は、２５μｌのヒト血清標準０，０．５，
１，２，４，１０，１００および１０００ng／mlジゴキ
シン、４×１０-7モル Ｍ１５酵素アクセプターおよび
ジゴキシン抗体を含む１００μｌの試薬Ｉ、および１３
０μｌの試薬ＩＩを含んでいた。試薬ＩＩは、各種希釈
されたジゴキシン -ＥＤ３またはジゴキシン -ＥＤ３
Ａ、第２ヤギ抗ウサギ抗体および１．１mg／mlのo-ニト
ロフェニル -β-D- ガラクトピラノシドを含んでいた。
３７℃において３０分間インキュベートした後の結果お
よびタイターテック(Titertek)微小力価プレートリーダ
における４０５nmの読みを表１６および表１７に示す。
【０２５２】
【表１６】
【０２５３】
【表１７】
【０２５４】表１６および表１７にみられるように、競
合的免疫検定がジゴキシン -ＥＤ３とジゴキシン -ＥＤ
３Ａの両者で生じた。ジゴキシン -ＥＤ３Ａを使用する
ジゴキシンに関する曲線を図２５に示す。ジゴキシン -
ＥＤ３を使用するジゴキシン免疫検定は、ジゴキシン -
ＥＤ３Ａより ０．５および１mg／mlの低投与量におい
てより良好な信号識別性を与える。この差異は、ＨＰＬ
Ｃ分析中に検出されたＥＤ３Ａ製剤中の不純物の存在に
よるだろう。
【０２５５】これらの実験は、抗原抗体反応によるβ-
ガラクトシダーゼポリペプチドの相補の制御に遺伝子操
作されたポリペプチドと同様に合成ペプチドが用いられ
ることを示す。化学ポリペプチド合成は、高分子量タン
パク質検出を目的とする酵素ドナーを生産するために使
用し得る。α- ドナードメインに融合した免疫学的に反
応に富むポリペプチドエピトープをコード化する遺伝子
融合物も合成し得る。この解決法の限界は、より大きな
ポリペプチドを合成する技術の可能性の状況ばかりでな
く必要としたα- ドナードメインおよび免疫学的反応性
たん白質ドメインの両者の配列に関する知識をもたない
ことである。
【０２５６】微生物の寄託について 表１８に挙げられたプラスミドを有する次のエシェリキ
ア・コリ(E.Coli)菌株は、イン ビトロ インターナシ
ョナル，インコーポレーテッド，（ＩＶＩ），アン ア
ーバー，ミシガン州(In Vitro International,Inc.(IV
I),Ann Arbor,MI）またはザ アグリカルチュラル リ
サーチ カルチャー コレクション（ＮＲＲＬ），ペオ
リア，イリノイ州(the Agricultural Reseach Culture
Collection(NRRL),Peoria,IL）に寄託され、次の受託番
号を指定された：
【０２５７】
【表１８】
【０２５８】エシェリキア・コリ(E.Coli)菌株Ｅ９００
１、ＩＶＩ １００３４および菌株ＪＭ８３、ＩＶＩ
１００３７は、それぞれプラスミド p１２２および p１
５７を含み、実施例３、１および実施例４で記載した一
部のＢ型肝炎ウィルス表面抗原およびα- ドナーの融合
タンパク質をコードする遺伝子を有する。エシェリキア
・コリ(E.Coli)菌株Ｅ９００１、ＩＶＩ １００３５
は、プラスミド p１２５を含み、実施例１、１．１に記
載のように酵素ドナーをコードする遺伝子を有する。エ
シェリキア・コリ菌株Ｅ９００１、ＩＶＩ １００３８
および菌株ＪＭ８３、ＩＶＩ １００３６は、それぞれ
プラスミド pＦ２９および p１５０を含み、実施例１、
２の記載のように p１５０が酵素アクセプターをコード
する遺伝子を有する。エシェリキア・コリ菌株ＡＭＡ
１００４、ＩＶＩ １００５０は、アミノ酸の３０〜３
７番目を欠失したβ- ガラクトシダーゼタンパク質（酵
素アクセプター）に関する遺伝子を有するプラスミド p
ＭＧ１４を含む。図７参照。エシェリキア・コリ菌株Ａ
ＭＡ １００４、ＩＶＩ １００５１は、アミノ酸の１
３−４０番目を欠失したβ- ガラクトシダーゼたん白質
（酵素アクセプター）に関する遺伝子を有するプラスミ
ド pＭＧ２２を含む。図７参照。エシェリキア・コリ菌
株Ｅ９００１、ＩＶＩ １００５２は、アミノ酸の６２
番目にシステイン残基、アミノ酸の６４番目にリシン残
基を有するβ- ガラクトシダーゼのフラグメント（ＥＤ
Ｈ６）をコードする遺伝子を有するプラスミドである
p１６９を含む。実施例１、２参照。エシェリキア・コ
リ菌株Ｅ９００１、ＩＶＩ１００５３は、アミノ酸の３
番目にシステイン残基を有するβ- ガラクトシダーゼの
フラグメント（ＥＤ３）をコードする遺伝子を有するプ
ラスミドである p１８３を含む。実施例１、１．４参
照。エシェリキア・コリ菌株Ｅ９００１、ＩＶＩ １０
０５４は、アミノ酸の３９番目にシステイン残基を有す
るβ- ガラクトシダーゼのフラグメント（ＥＤ５）をコ
ードする遺伝子を有するプラスミドである p１８５を含
む。実施例１、１．６参照。エシェリキア・コリ菌株Ａ
ＭＡ １００４、ＮＲＲＬ Ｂ−１８００６は、実施例
６および図２８に示したＢ-hＣＧタンパク質のカルボキ
シ末端およびα- ドナーの融合タンパク質をコードする
遺伝子を有するプラスミドである p１７５を含む。
【０２５９】本発明は、寄託された微生物による範囲に
限定すべきではない。なぜならば寄託された実施態様は
本発明のある態様の一例を示そうとするものであり、か
つ機能的に等価などんな微生物も本発明の範囲内である
からである。事実、さらにここに示しかつ記載する本発
明の各種の変形は当業者には前記および添付図面から明
らかになるであろう。かかる変形は添付請求の範囲の範
囲内に入ることを意味する。
【０２６０】ヌクレオチド用に与えられた塩基対（bp）
の大きさの全ては概算であり、記述のために使用される
ことも理解される。
【０２６１】
【発明の効果】上記したように、本発明の酵素ドナーポ
リペプチドおよび酵素アクセプターポリペプチドを用い
ることにより、高い感受性で、１５０〜３０，０００ダ
ルトンの広範囲の分子量を有する検体の定量分析が可能
である酵素相補性検定法が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】β- ガラクトシダーゼポリペプチドを、自然界
に知られる欠失変異体Ｍ１５、Ｍ１１２およびＸ９０と
共に図解的に表わすものである。また選択臭化シアン
（ＣＮＢｒ）開裂ペプチドＣＮＢｒ２、ＣＮＢｒ２／３
−４１およびＣＮＢｒ２４が表わされる。
【図２】検体カップリングドメインを含む種々の組換え
プラスミドの構築を表わすものである。ただし、図２Ａ
〜Ｄは一定の比率に拡大して描かれたものではない。
【図３】α- ドナードメインおよびＢ型肝炎ウィルス表
面抗原（ＨＢＶ−ＳＡg)あるいはＢ型肝炎ウィルスコア
抗原からなるタンパク質ドメインからなるN-末端および
C-末端融合タンパク質を図解的に示すものである。
【図４】本発明による典型的な新規のポリペプチド酵素
- ドナーのＤＮＡおよびアミノ酸配列を表すものであ
る。図４において、＊は、検体へカップリングするのに
有用な反応性基を有するアミノ酸を示すものである。
【図５】本発明による典型的な新規のポリペプチド酵素
- ドナーのＤＮＡおよびアミノ酸配列を表すものであ
る。図５において、＊は、検体へカップリングするのに
有用な反応性基を有するアミノ酸を示すものである。
【図６】本発明による典型的な新規のポリペプチド酵素
- ドナーのＤＮＡおよびアミノ酸配列を表すものであ
る。図６において、＊は、検体へカップリングするのに
有用な反応性基を有するアミノ酸を示すものである。
【図７】β- ガラクトシダーゼ遺伝子のα- 領域中に導
入される欠失部分を示すポリペプチド酵素- アクセプタ
ーを表わすものである。比較のために、公知の欠失変異
体Ｍ１５およびＭ１１２も示される。
【図８】天然のβ- ガラクトシダーゼ遺伝子ＤＮＡおよ
びアミノ酸配列を示すものである。
【図９】検体- 結合タンパク質がアビジンであるビオチ
ンのための均質系の検定法に関する競合的結合曲線を示
すグラフである。
【図１０】検体- 結合タンパク質がアビジンであるビオ
チンのための検定法に関する競合的結合曲線（投与量応
答曲線）を示すグラフである。
【図１１】検体- 結合タンパク質がアガロース固定化ア
ビジンである酵素- ドナーＣＮＢｒ２と酵素- アクセプ
ターＥＡ２３の相補の阻止を例示する競合的結合曲線を
示すグラフである。
【図１２】５×１０-8Ｍに固定されたＥＡ２３および
１：２０と１：３０希釈の酵素- ドナー結合体で得られ
た投与量応答曲線を表わすものである。
【図１３】１×１０-7Ｍに固定されたＥＡ２３および
１：２０と１：３０希釈の酵素- ドナー結合体で得られ
た投与量応答曲線を表わすものである。
【図１４】第二抗体、ヤギ抗ウサギ抗体が、相補プロセ
スにおいて酵素- ドナー結合体との抗体相互作用の阻害
効果を高めるために用いられるジゴキシンのための免疫
検定法に関する投与量応答曲線を表わすものである。
【図１５】種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を
示す、プラスミド p１６９の図解的表示である。ただ
し、一定の比率に拡大してしたものではない。
【図１６】ＥＤ１およびＥＤ３に関しコードする遺伝子
の部位のヌクレオチド配列を表わすものである。関連ア
ミノ酸配列および制限酵素開裂部位が示される。ＥＤ３
N-末端フラグメントのＣys（システイン）残基における
星印は検体カップリング残基を示すものである。
【図１７】種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を
示す、 p１８０シリーズのプラスミドの図解的表示であ
る。ただし、一定の比率に拡大してしたものではない。
【図１８】ＥＤ３およびＥＤ３Ａのアミノ酸配列を表わ
すものである。Ｃys残基上の星印は、検体カップリング
残基を示すものである。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、それぞれＥＤ酵素ドナ
ー、ＥＤ３およびＥＤ４のアミノ酸配列を示すものであ
る。ただし、残基上の星印は検体カップリング残基を示
す。
【図２０】図２０ＡおよびＢは、それぞれＥＤ酵素ドナ
ー、ＥＤ５およびＥＤ７のアミノ酸配列を示すものであ
る。ただし、残基上の星印は検体カップリング残基を示
す。
【図２１】図２１ＡおよびＢは、それぞれＥＤ酵素ドナ
ー、ＥＤ８およびＥＤ１３のアミノ酸配列を示すもので
ある。ただし、残基上の星印は検体カップリング残基を
示す。
【図２２】図２２ＡおよびＢは、それぞれＥＤ酵素ドナ
ー、ＥＤ１４およびＥＤ１５のアミノ酸配列を示すもの
である。ただし、残基上の星印は検体カップリング残基
を示す。
【図２３】それぞれＥＤ酵素ドナー、ＥＤ１７のアミノ
酸配列を示すものである。ただし、残基上の星印は検体
カップリング残基を示す。
【図２４】種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を
示す、 p１９０シリーズのプラスミドの図解的表示であ
る。ただし、一定の比率に拡大してしたものではない。
【図２５】ジゴキシン酵素免疫検定法におけるジゴキシ
ン -ＥＤ３Ａを用いるジゴキシンに関する滴定曲線を示
すグラフである。
【図２６】ＥＤ４−Ｔ４、ＥＡ２２および第二抗体を用
いるチロキシン（Ｔ４）検定からの標準曲線を示すグラ
フである。
【図２７】ＥＤ５- ジゴキシン、ＥＡ２２および第二抗
体を用いるジゴキシン検定からの標準曲線を示すグラフ
である。
【図２８】種々の遺伝子領域および制限酵素開裂部位を
示す、プラスミド p１６６、 p１７５、 p１７７の図解
的表示である。ただし、一定の比率に拡大してしたもの
ではない。
【図２９】ヒト絨毛性ゴナドトロピンのための均質系の
検定法に関する投与量応答曲線を表わすものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/542 Ｇ０１Ｎ 33/542 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/34 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 594134095 2341 Ｓｔａｎｗｅｌｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｃ ｏｎｃｏｒｄ， ＣＡ 94520 Ｕ．Ｓ. Ａ

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡ配列は該ＤＮＡ配列の複製及び発
    現を行わせることが可能である発現調節配列が正しく配
    置されており、酵素ドナーはスルフヒドリル、アミノお
    よびカルボキシル基からなる群から選ばれた反応性基を
    有し、該反応性基は活性酵素複合体を形成する酵素ドナ
    ー複合体と酵素アクセプターとの相互作用によるまたは
    酵素ドナー複合体の検体結合タンパク質及び酵素アクセ
    プターへの競合結合によるいずれかの妨害なしに検体ま
    たは検体誘導体に共有結合できるものである、酵素アク
    セプターとの相互作用によりβ−ガラクトシダーゼの活
    性特性を有する活性酵素複合体を形成可能な酵素ドナー
    ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えベ
    クター。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡ配列は該ＤＮＡ配列の複製及び発
    現を行わせることが可能である発現調節配列が正しく配
    置されており、酵素ドナーポリペプチドは下記のアミノ
    末端で始まるアミノ酸配列を有するものである、酵素ア
    クセプターとの相互作用によりβ−ガラクトシダーゼの
    活性特性を有する活性酵素複合体を形成可能な酵素ドナ
    ーポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換え
    ベクター： Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Gly Ile Asp Pro Thr Glu Ser Ser Pro Gly Asn Ile Asp Pro Arg Ala Ser Ser Asn Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Glu Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp -X- Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Leu Glu Ser Arg Ser Ala Gly Met Pro Leu Glu ただし、Ｘは Cysまたは Lysである。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡ配列は該ＤＮＡ配列の複製及び発
    現を行わせることが可能である発現調節配列が正しく配
    置されており、酵素ドナーは以下のＢａｍＨＩ−Ｓａｌ
    Ｉ断片を有しかつスルフヒドリル、アミノおよびカルボ
    キシル基からなる群から選ばれた反応性基を有し、該反
    応性基は活性酵素複合体を形成する酵素ドナー複合体と
    酵素アクセプターとの相互作用によるまたは酵素ドナー
    複合体の検体結合タンパク質及び酵素アクセプターへの
    競合結合によるいずれかの妨害なしに検体または検体誘
    導体に共有結合できるものである、酵素アクセプターと
    の相互作用によりβ−ガラクトシダーゼの活性特性を有
    する活性酵素複合体を形成可能な酵素ドナーポリペプチ
    ドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクター。 【化１】
  4. 【請求項４】 ＤＮＡ配列の複製及び発現を行わせるこ
    とが可能な発現調節配列が正しく配置されている、組換
    えベクターｐ１６９、またはその変異体、組換え体、若
    しくは遺伝子操作による誘導体。
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5604091A (en) * 1984-03-01 1997-02-18 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation
US4956274A (en) * 1987-04-06 1990-09-11 Microgenics Corporation Reagent stabilization in enzyme-donor and acceptor assay
IL85596A (en) * 1987-05-18 1992-06-21 Technicon Instr Method for a specific binding enzyme immunoassay
GB8717791D0 (en) * 1987-07-28 1987-09-03 Baralle F E Immunoassay method
JP3282129B2 (ja) * 1987-09-21 2002-05-13 ロシュ ダイアグノスティクス コーポレイション 固相非分離酵素分析
US5212064A (en) * 1987-09-21 1993-05-18 Microgenics Corporation Solid phase non-separation enzyme complementation assay
US5244786A (en) * 1987-10-02 1993-09-14 Microgenics Corporation Method of measuring available free thyroxine bending sites
DE3889407T2 (de) * 1987-10-02 1994-11-03 Microgenics Corp Homogenes Verfahren zur Bestimmung der T-3- oder T-4-Aufnahme und Zusammensetzung dafür.
ATE104058T1 (de) * 1988-02-02 1994-04-15 Microgenics Corp Rezeptorpreincubations-enzymtest.
ES2093026T3 (es) * 1989-05-05 1996-12-16 Microgenics Corp Procedimiento de ensayo de complementacion enzimatico de enlace e proteinas.
CA1335707C (en) * 1989-08-15 1995-05-30 Pyare Khanna Drug screening assay
US5444161A (en) * 1989-08-16 1995-08-22 Microgenics Corporation Substrates for β-galactosidase
EP0419081A3 (en) * 1989-09-22 1992-07-22 Microgenics Corporation Method for protein binding enzyme complementation assays
DE4021063A1 (de) * 1990-07-03 1992-01-09 Boehringer Mannheim Gmbh Neue ss-galactosidase-substrate fuer den cedia
US5244785A (en) * 1991-02-01 1993-09-14 Microgenics Corporation Determination of high molecular weight analytes using a β-galactosidase complementation assay
CA2068190C (en) * 1991-05-15 1996-12-17 Microgenics Corporation Methods and compositions for enzyme complementation assays using the omega region of beta-galactosidase
GB9114525D0 (en) * 1991-07-05 1991-08-21 Delnatte Sabine Homogeneous nucleic acids probe based tests and substances
CA2075858C (en) * 1991-08-15 1998-05-19 Scott J. Eisenbeis Detection of complementary nucleotide sequences
US5976857A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5763196A (en) * 1996-01-26 1998-06-09 Boehringer Mannheim Corporation Assays using cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
DE69709448T2 (de) * 1996-01-26 2002-09-19 Roche Diagnostics Corp Bismaleinsäureimid-vernetzer
EP1766095B1 (en) 2004-05-18 2013-10-23 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Detection of protein translocation by beta-galactosidase reporter fragment complementation
WO2007069604A1 (ja) * 2005-12-14 2007-06-21 National University Corporation Hokkaido University 修飾蛋白質の製造方法
JP5739807B2 (ja) * 2008-08-18 2015-06-24 ディスカヴァーエックス コーポレイション 受容体チロシンキナーゼアッセイ
US9493503B2 (en) * 2011-02-02 2016-11-15 Neupharma, Inc. Certain chemical entities, compositions, and methods
CN103717751A (zh) * 2011-05-19 2014-04-09 塞昆纳姆股份有限公司 用于多重核酸鉴定的产品和方法
US8945853B2 (en) 2012-02-06 2015-02-03 Discoverx Corporation Detection of intracellular binding events by measuring protein abundance
CN107787371B (zh) 2015-04-24 2022-02-01 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法
WO2016172571A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
CN109797143B (zh) * 2016-09-22 2021-02-12 北京九强生物技术股份有限公司 一种包含大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的试剂
CN114907472A (zh) * 2022-04-07 2022-08-16 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种精准复制抗体的方法及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
US4378428A (en) * 1981-03-30 1983-03-29 Baker Instruments Corporation Method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays
MX197183A (es) * 1982-05-05 1994-02-28 Genentech Inc Activador de plasminogeno de tejido humano
US5077195A (en) * 1985-03-01 1991-12-31 Board Of Reagents, The University Of Texas System Polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor
JPH0779717A (ja) * 1993-09-17 1995-03-28 Tokihiko Yonamine スピルナ含有穀物

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