JP2944823B2 - β−ガラクトシダーゼのオメガー領域を用いる酵素相補アッセイの方法及び組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵素標識化試薬及び分析
物の存在を指標するマーカーとして酵素活性を利用する
アッセイに関し、そして特にβ−ガラクトシダーゼを利
用する酵素相補アッセイによる分析物の定量及び定性分
析のための改良された方法及び新規組成物に関連する。

【０００２】

【従来の技術】酵素β−ガラクトシダーゼは長い間酵素
結合免疫収着アッセイ (ELISA)(Engrallと Perlman, 19
71, Immunochemistry ８:871) 及び均一系基質標識化
アッセイ(Burd ら, 1977, Clin. Chem. 23:1402)におい
て広範囲にわたる利用が見い出されている。更に、β−
ガラクトシダーゼは広範囲にわたるＤＮＡクローニング
及びＤＮＡシーケンシングについての遺伝子システムの
基礎を成す(Messing, 1983, Methods of Enzymology 10
1 :20)。

【０００３】β−ガラクトシダーゼは約５４０，０００
ダルトンの分子量（ＭＷ）を有す四量体タンパク質であ
る。この四つの同一のモノマーは１０２３個のアミノ酸
より成り、それぞれは１１６，０００ダルトンのＭＷを
有す。図１に示すこのモノマータンパク質は３つの領
域、即ち、（１）Ｎ−末端付近のセグメント（α−領
域）、（２）中間領域、及び（３）Ｃ末端末梢領域（ω
−領域）に分割される。

【０００４】適当なβ−ガラクトシダーゼ陰性突然変異
体の抽出物に加えた場合に酵素活性を相補する又は自発
的に回復せしめるβ−ガラクトシダーゼ由来の突然変異
ポリペプチドが知られている。この現象はシストロン内
相補として知られている。相補がα領域における削除又
は鎖の干渉を含む場合、この方法はα−相補と称され
る。α−相補の例はＭ１５／ＣＮＢｒ２相補システムに
より提供される。Ｍ１５突然変異ポリペプチドはβ−ガ
ラクトシダーゼの１１〜４１のアミノ酸を欠損し、そし
て酵素的に不活性な二量体として溶液中に存在する。シ
アン化臭素切断によるβ−ガラクトシダーゼ由来のポリ
ペプチドは、アミノ酸３−９２より成るＣＮＢｒ２ペプ
チド（ＣＮＢｒ２）と称される。ＣＮＢｒ２を二量体Ｍ
１５と混ぜた場合、完全な酵素活性を有するβ−ガラク
トシダーゼ四量体の自発的再構成を促進せしめる (Lang
ley とZabin, 1976, Biochemistry 15:4866)。従って
このＭ１５ペプチドはα−アセプター（受容体）とし
て、そしてＣＮＢｒ２はα−ドナー（供与体）として知
られる。

【０００５】これはよく研究されている相補システムの
代表であるが、ＣＮＢｒ２はＭ１１２二量体（β−ガラ
クトシダーゼ内のアミノ酸２３−３１の欠損したもの）
のためのα−ドナーとしても働くことができる (Lin, V
illarejoと Zabin, 1970, Biochem. Biophys. Res. Com
mon. 40:249; Celedaと Zabin, 1977, Biochem, 18:4
04; Welphy, Fowlerと Zabin, 1981, J. Biol. Chem.
256:6804; Langley ら, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 72:1254)。ＣＮＢｒ２によるＭ１５の相補の例に
おいて、アミノ酸配列３−１０及び４２−９６は両方と
も酵素的に不活性な複合体の中に二重に存在している。

【０００６】シストロン内相補はβ−ガラクトシダーゼ
のＣ−末端側（ω−領域）でも起こる。カルボキシル末
端領域におけるβ−ガラクトシダーゼの相補に関する構
造研究を詳細する初期の出版物は、M. E. Goldberg, Th
e Lactose Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1
970 である。最も広く研究されている例は、Ｘ９０−ア
セプターペプチドであって最後の１０個のアミノ酸、１
０１３−１０２３を欠失しているものである。このＸ９
０ペプチドは単量体として存在し、そしてアミノ酸９９
０−１０２３より成るβ−ガラクトシダーゼのシアン化
臭素消化生成物ＣＮＢｒ２４により相補されて酵素的に
活性な四量体を再形成することができる(Welphyら, 198
0, Biochem. Biophys. Res. Common. 93:223) 。

【０００７】本発明者の研究室から相補アッセイに関す
る多数の特許出願及び特許が出されている。β−ガラク
トシダーゼ酵素ドナー及びアセプターに関連するこれら
の出願は、現在放棄されている１９８４年１０月２９日
出願の米国出願第６６６，０８０号；１９８５年４月８
日出願の米国出願第７２１，２６７号、現在米国特許第
４，７０８，８２９号；現在係属中の１９８５年１０月
２２日出願の米国出願第７８８，３７０号；現在係属中
の１９８９年５月５日出願の米国出願第３４７，６７９
号；現在係属中の１９８９年９月２２日出願の米国出願
第４１０，９９６号；及び米国を指定している国際ＰＣ
Ｔ出願として現在係属中の１９９０年５月４日出願のＰ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２４９１号である。これ
ら全ての特許及び特許出願は本明細書に参考文献として
組入れる。特に初めのいくつかの特許及び出願はベータ
ーガラクトシダーゼ酵素の完全な遺伝子及びアミノ酸配
列を開示している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は高感度（例え
ば１０^-15 Ｍ）な、高及び低分子量両方（例えば１５０
−３００，０００ダルトンのＭＷ）の分析物の定量分析
のための、β−ガラクトシダーゼのω−領域における変
異体を用いる酵素相補性アッセイのための改善された方
法及び新規組成物を提供する。このアッセイは、「オメ
ガー−相補」を基礎とするＯＰＲＡアッセイと総称す
る。しかしながら、これらは以前から知られている、β
−ガラクトシダーゼのオメガー−領域を用いた詳細され
ている相補アッセイと混同してはならず、なぜなら従来
のアッセイはオメガー−領域の異なる部分を利用してい
るからである。

【０００９】オメガー相補は、その他のβ−ガラクトシ
ダーゼ変異体に関して従来行なわれていたのと類似の状
態において活性β−ガラクトシダーゼへと再集成される
ことを含む。前記した通り、ほとんどの従来のβ−ガラ
クトシダーゼ相補アッセイはβ−ガラクトシダーゼのα
−領域における切断により形成されるポリペプチドの再
集成を含む（完全に相補的なものの他にいくつかのフラ
グメントは重複している）；このような再集成はα−相
補と称される。他方、オメガー相補はβ−ガラクトシダ
ーゼのカルボキシル末端の再集成を含む。この２種の相
補性ポリペプチドフラグメントはオメガードナー及びオ
メガーアセプター分子として知られている。本明細書に
用いる「ドナー」分子は、大きめの「アセプター」分子
に結合する、２種の分子のうちの小さい方である。この
オメガー分子は、それがβ−ガラクトシダーゼの約１／
３であり、且つそのカルボキシル末端側を含む場合に特
に有効であることが分った。このオメガー−アセプター
はβ−ガラクトシダーゼの残りの２／３を含み、そして
いくつかの重複部分が考えられる。β−ガラクトシダー
ゼのオメガー−末端側に相補性のフラグメントを用いる
ことにより、低濃度の分析物を測定することができる多
数の有用な特性を有する診断アッセイが得られる。例え
ば、オメガー−ドナー分子は安定な、インタクトβ−ガ
ラクトシダーゼ分子のドメインの構造に近い又は同一の
折りたたみ構造を有する。この特徴は構造変化に結びつ
く遅延期を伴わない、相補性分子の速い反応速度相互作
用を可能とする。オメガー−ドナー構造の安定性は、そ
の相補性分子（オメガー−アセプター）の共抽出及びそ
の後の除去を必要とせずにこの分子を完全に精製するこ
とを可能とする。このことは、α−相補に利用するドナ
ー分子に比べて、このドナー分子の効率の高められた生
産を可能にする。本発明のオメガー−ドナー分子は更に
溶液中においてその構造を保持し、従って試薬の安定度
に伴う問題を最小にする。この問題は安定剤の適切な利
用により解決することができたが、α−相補の困難さ及
び価格を高めた。

【００１０】オメガー相補の特に有用な特性は、アミノ
末端側における類似の変化と比較した、初期構造変化に
対するβ−ガラクトシダーゼのカルボキシル末端側の高
い感受性に由来する。立体的阻害もカルボキシル末端に
おいてより顕著に現れる。このような特性はオメガー領
域を含むアッセイにおける相補のより迅速且つより完全
な阻害を可能とする。従って、オメガー−相補を利用す
るアッセイはα−相補と比べてより低いノイズに対する
シグナルの比及び高められた感度を有する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に従い、オメガー
−相補に有用なポリペプチドは組換ＤＮＡ技術により、
又は化学的ポリペプチド合成技術により作られる。本明
細書に用いる語「ポリペプチド」はペプチド及びタンパ
ク質を含む。該ポリペプチド自体は酵素的に不活性であ
る。しかしながら、水性媒体中で互いに反応し合うと、
それらは結合して相補することによって触媒的に活性な
酵素を形成する。β−ガラクトシダーゼは診断アッセイ
における利用のために特に好ましい酵素であり、その理
由はこれは分光光度測定法及び蛍光光度測定法を用いて
検出可能な複数の基質を有し、これは従来のイムノアッ
セイにおいて有用性が示され、これは非常に低い濃度で
測定され、そして一般的によく特徴付けられているから
である。有意でないバックグランド活性を示す成分由来
の酵素活性を生じせしめることにより、高いノイズに対
するシグナルの比が得られる。

【００１２】本発明の改良アッセイにおいて用いる新規
ポリペプチドは、（ａ）分析物がポリペプチドに融合し
ている融合タンパク質（これは該分析物及びポリペプチ
ドをコードする配列を含む組換遺伝子の生成物でありう
る）；（ｂ）該分析物との最適な結合のために遺伝子操
作されているポリペプチド；（ｃ）該分析物との最適な
結合のために化学的に合成されているポリペプチド；並
びに（ｄ）酸化、熱、pH、酵素分解等のような環境因子
に対する改善された安定性のために遺伝子操作されてい
る又は化学合成されているポリペプチド、を含む。

【００１３】従って本方法は、適正なポリペプチドであ
って、（１）相補ができ、（２）それらの再会合の平衡
定数を系統的に調整でき、（３）特異的な結合性タンパ
ク質と相互作用でき、そして（４）特異的な結合性タン
パク質と相互作用することによってβ−ガラクトシダー
ゼの活性特性を有す活性酵素の形成をコントロールでき
るようなポリペプチドを提供せしめる組換ＤＮＡ技術又
は化学的ポリペプチド合成技術の利用に基づくイムノア
ッセイの作成について説明する。

【００１４】本発明の遺伝子操作された又は化学合成さ
れたポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼを利用する
従来のオメガー−及びα−相補システムを含む、その他
の相補性酵素システムより明らかなる利点を提供する。
組換ＤＮＡ技術により作られるポリペプチドは低価格で
大量に生産でき、容易に均一なものへと精製でき、そし
て任意のサイズ及び配列において作られうる。化学合成
ポリペプチド、特にアミノ酸の長さにおいて比較的小さ
いものは、無限の配列多様性において大量生産されう
る。いづれの製造技術も、改善されたカップリング化
学、酵素反応の反応速度、酵素アッセイの感度及び／又
は安定度をもたらすアミノ酸配列の操作を提供する。

【００１５】本発明は、本発明の方法に従うアッセイの
実施のためのキットも含む。

【００１６】本発明は、組換ＤＮＡ技術又は化学ポリペ
プチド合成技術を利用して製造する酵素的に不活性な
（複数の）ポリペプチドであって、水性媒体中で一緒に
インキュベートする際に相補のプロセスによって活性な
β−ガラクトシダーゼ酵素複合体を形成するポリペプチ
ドを採用する、種々の分析物についての改良されたアッ
セイを含んで成る。特にこの技術は、β−ガラクトシダ
ーゼの初期構造におけるオメガー−領域における分断に
より形成される、β−ガラクトシダーゼ分子全体のうち
の２種のポリペプチドフラグメント間のβ−ガラクトシ
ダーゼのオメガー−領域における相補を含む。ある場合
において、この２種のフラグメントは厳密に相補性であ
って、ギャップ又は重複を伴うことのない完全なβ−ガ
ラクトシダーゼアミノ酸配列を形成するものである必要
はない。得られるフラグメントが活性なβ−ガラクトシ
ダーゼ分子へと会合できるならばギャップ及び重複の両
方の存在は可能である。この２種のポリペプチドは
（１）オメガーアセプターそして（２）オメガードナー
と称する。前記した通り、このアセプター分子はこの２
種のフラグメントのうちの大きい方であり、そして通常
天然又は改質した全長β−ガラクトシダーゼのアミノ酸
配列の約２／３を含む。このドナー分子は小さい方のフ
ラグメントであり、該アミノ酸配列の残りの（およそ）
１／３を含む。このドナー分子はβ−ガラクトシダーゼ
分子のＣ末端側に由来する。

【００１７】一般に、このアセプター分子は長さにおい
て６００〜１０１２個のアミノ酸、より好ましくは長さ
において７００〜８５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を
有するポリペプチドであろう。これはβ−ガラクトシダ
ーゼのアミノ末端側のアミノ酸配列と実質的に同一であ
る（即ち、β−ガラクトシダーゼを通常に番号付けした
場合にアミノ酸１からＸ；ここでＸはポリペプチドの長
さである）。β−ガラクトシダーゼはあらゆる起源に由
来することができるが、細菌起源、特にＥ．コリ（E. C
oli ）が好ましい。その他の起源には種々のバチルス属
（Bacillus）の株が含まれる。熱安定性β−ガラクトシ
ダーゼはストレプトマイシス コエリカラー（Streptom
yces coelicolor）及び種々のサーマス属（Thermas ）
の株から得られる。本明細書に記載の操作のためのβ−
ガラクトシダーゼを生産できる多数の細菌株（従ってβ
−ガラクトシダーゼをコード化する遺伝情報を含むも
の）は寄託所、例えばアメリカンタイプカルチャーコレ
クション、Rockville MD, USA より公共的に入手でき
る。このドナー分子は長さにおいて１０（好ましくは１
２）〜５００個のアミノ酸、好ましくは長さにおいて３
００〜４５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドであろう。これはβ−ガラクトシダーゼのカル
ボキシル末端側のアミノ酸配列と実質的に同一である
（即ち、アミノ酸ｙから１０２３；ここでｙは該β−ガ
ラクトシダーゼ配列における第１のアミノ酸の位置であ
る）。

【００１８】定義により、β−ガラクトシダーゼの末端
配列（いづれかの末端）と「実質的に同一」なポリペプ
チドは、天然の末端アミノ酸から始まり、そして指定す
るアミノ酸の数に関して欠失、挿入又は天然の配列の変
更を伴わずに続く配列を含むが、それに限定されない。
このような未改質配列を「同一」配列と称し、そしてこ
のようなものが好ましい。「実質的に同一」な配列にお
いて見られる典型的な改質は、１個のアミノ酸の他のも
のによる置換（通常はアッセイの他の成分の結合のため
の官能基の付与のために行う：下記参照）、天然のアミ
ノ酸の修飾（例えば酸化又はその他の工程を介する架橋
を防ぐためのスルフヒドリル基のキャッピング）、欠失
及び挿入を含む。β−ガラクトシダーゼ配列の最末端の
欠失以外（即ち、非相補性末端と称する、該アセプター
分子に関するアミノ末端及び該ドナー分子に関するカル
ボキシル末端）、ドナー又はアセプター分子の天然配列
の変更は２０個のアミノ酸以下迄（欠失、挿入、置換及
び修飾の全て）、より好ましくは１２個のアミノ酸以下
迄、更に好ましくは７個のアミノ酸以下迄、最も好まし
くは３個以下のアミノ酸に限定することが好ましい。該
非相補性末端からの欠失は好ましくは１２個以下のアミ
ノ酸、より好ましくは５個以下のアミノ酸に限定され
る。

【００１９】ポリペプチドフラグメントの長さに関して
の「約」は、好ましくは（指定するアミノ酸残基数の）
１０％の以内、更に好ましくは２％以内を意味する。例
えば「約３００個のアミノ酸」の配列は好ましくはその
長さにおいて２７０〜３００個のアミノ酸、より好まし
くはその長さにおいて２８５〜３１５個のアミノ酸、更
により好ましくはその長さにおいて２９４〜３０６個の
アミノ酸である。「約」は長さにおいて少なくとも１個
のアミノ酸の相違の可能性（短いポリペプチドでさえ
も）を含む。「約」特定の長さと示す配列は好ましくは
丁度その指定する長さのものである。

【００２０】この２種の相補性のフラグメントは最大３
００個迄、好ましくは２００個以下のアミノ酸が相補が
起こる際に重複する重複領域を含みうる。β−ガラクト
シダーゼのギャップは相補に基づいて起こることができ
うるが、好ましくない。

【００２１】どのような天然（即ち「同一」）のドナー
もしくはアセプター配列からの特定の改質、又はどのよ
うなギャップもしくは重複を伴う相補性分子が有効であ
りうるかは、試験分子として所望の改質を調製し、そし
てこの試験分子を相補性のドナー又はアセプターと結合
せしめることによって容易に試験できる。β−ガラクト
シダーゼ活性の測定は、任意の特定改質又は組合せの有
効性におけるデーターを容易に提供する。天然のβ−ガ
ラクトシダーゼの活性に等しいそれは必ずしも必要では
なく、なぜならオメガー相補アッセイは本明細書に記載
の通りのその他の利点を提供するからである。しかしな
がら、相補に基づいて高い活性を達成せしめる改質及び
組合せは、より低い活性を示す改質及び組合せよりも通
常好ましい。

【００２２】β−ガラクトシダーゼのカルボキシル末端
から数えて約３７８個迄のアミノ酸を含んで成るドナー
ポリペプチドが特に好ましい。アセプターポリペプチド
はβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端から約７８７個迄
のアミノ酸を含んで成ることが好ましい。

【００２３】本発明の方法に従い、相補のために必要な
一方又は両方のポリペプチドを製造するために組換ＤＮ
Ａ技術が利用できうる。ＤＮＡ合成技術は種々の長さの
ポリペプチドをコードする遺伝子配列の製造のために利
用される。オメガードナー及びオメガーアセプターはこ
の技術によって製造されうる。化学ポリペプチド合成技
術は一般にアミノ酸の長さにおいて比較的短いポリペプ
チドの製造に利用される。このため、化学的技術（を用
いる場合）はβ−ガラクトシダーゼのドナー分子の合成
により適しており、その理由はこのドナー分子はアセプ
ターに比べてアミノ酸配列において一般に短いからであ
る。もちろん、これは機能的アセプターがペプチド合成
技術によって作られることができないことを意味するも
のではない。

【００２４】本明細書で定義する通り、オメガーアセプ
ター分子（時折アセプターフラグメントと称する）は、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の欠失突然変異体により作
られる酵素的に不活性なポリペプチドであって、オメガ
ードナーと結合する際に相補のプロセスによってβ−ガ
ラクトシダーゼを形成せしめることができるものであ
る。ここで作製される全てのオメガーリセプターは、β
−ガラクトシダーゼタンパク質のＣ末端側をコードする
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のオメガー領域における欠
損を伴って作製されるポリペプチドである。これらのオ
メガーアセプターのいくつかは、より高い安定性又はよ
り容易なる分析類似体との結合を提供するためにその初
期配列におけるアミノ酸残基の改質を介して更に操作さ
れている。

【００２５】本明細書に定義の通り、ドナー分子（又は
フラグメント）は以下の２種のドメインを含んで成る酵
素的に不活性なポリペプチドである：即ち、（ａ）活性
酵素を形成するためにアセプターと結合することができ
るアミノ酸配列を含むオメガー−ドナードメイン、及び
（ｂ）分析物−結合性タンパク質と相互作用することが
できる分析物ドメインを含んで成る。該分析物ドメイン
は（１）種々の分析物もしくは分析物類似体への結合を
介して目的を達成できる分析物−カップリングドメイ
ン、又は（２）それ自体が分析物類似体として機能する
タンパク質ドメインのいづれかでありうる。実際に、こ
のドナードメイン及び分析物ドメインは参照し易いよう
に表示した完全なドナーポリペプチドの領域にすぎない
ことが当業者により理解されるであろう。この分析物ド
メインは、この分析物が結合している又は分析物類似体
として機能する該ドナー分子の領域（ここでドナードメ
インは該ドナー分子の残りを占める）、特に相補に不可
欠な部分を称する。

【００２６】本明細書に定義の通り、分析物−カップリ
ングドメインは、分析物の結合する箇所にてβ−ガラク
トシダーゼにおける天然のアミノ酸配列、又は分析物の
共有結合のための常用の部位を提供せしめるためにポリ
ペプチドに挿入されているもしくは置換されているアミ
ノ酸のいづれかを含んで成る。この化学結合部位は通常
シスチンもしくはリジン残基に結合しているスルフヒド
リル基又はアミノ基であるが、しかしこれは（ａ）相補
のプロセス又は（ｂ）分析物と分析物−結合性タンパク
質との相互作用を干渉することなく該分析物と結合でき
うるあらゆるアミノ酸の任意の適当なる化学反応基であ
りうる。この化学反応基の位置は本アッセイの立体障害
条件を満足せしめるために変更することができる。

【００２７】本明細書に定義の通り、タンパク質ドメイ
ンはタンパク質抗原又は抗原（エピトープ）の免疫反応
基であって、該ドナー分子の主たるアミノ酸配列の一部
として通常カルボキシル末端にてアミド結合により共有
結合しているものを含んで成る。例えば抗原、例えば腫
瘍、細菌、菌類、ウィルス、寄生虫、マイクロプラズ
マ、組織適合、分化及びその他の細胞膜抗原、病原体の
表層抗原、毒素、アレルゲン、薬剤並びにその他の生物
学的に活性な分子であってゴナドトロピンホルモン、フ
ェリチンを含むがそれらに限定されないもの、又は分析
物に相当するもしくは類似するその他の任意の抗原性分
子が考えられる。当業者により理解される通り、分析物
ドメインがタンパク質ドメインであるドナー分子も「融
合タンパク質」と称する。本明細書で用いる「融合タン
パク質」なる語は、オメガー−ドナードメイン及びタン
パク質抗原の免疫反応性エピトープに特異的なタンパク
質ドメインを含んで成る酵素ドナーのそれに用いられて
いる。もちろんこれは抗体以外の分析物結合性タンパク
質と相互作用できる非免疫反応性タンパク質又はそのフ
ラグメントを含んで成るタンパク質ドメインであること
も考えられる。融合タンパク質のタンパク質ドメイン
は、該分析物ドメインが分析物−カップリングドメイン
である場合に必要とされる、分析物の該分析物ドメイン
への共有結合を必要としない。その理由は、融合タンパ
ク質のタンパク質ドメイン領域は本質的に、分析物−結
合性タンパク質に対して遊離分析物と競合することがで
きる分析物（又は少なくともそれに近い類似体）である
からである。

【００２８】媒体のサンプルに含まれる分析物について
の任意の酵素活性において、このアッセイ混合物中の試
薬として含まれる分析物−結合性分子（一般にはタンパ
ク質である必要はない）は該分析物及びこのオメガード
ナーの分析物ドメインの部分として結合又は融合してい
る該分析物の両者に競合的に相互作用又は結合しなくて
はならない。この分析物−結合性分子と、該オメガード
ナーに結合又は融合している分析物（以降「オメガー−
ドナーコンジュゲート」と称する）との相互作用は、オ
メガードナーとオメガーアセプターの相補のプロセスを
阻害しなくてはならない。本明細書に定義の通り、分析
物−結合性タンパク質は、常用のポリクローナル及びモ
ノクローナル抗体（並びにそのフラグメント）を含む特
異的抗体分子、リセプター、輸送たんぱく質、レクチン
並びにその他結合性タンパク質であってアビジン及びチ
ロキシン結合性グロブリンを含むがそれらに限定されな
いものを含む。本明細書に定義の通り、この広義の語、
分析物−結合性タンパク質は、タンパク質性物質例えば
糖タンパク質及びリポタンパク質、並びに非タンパク質
性物質例えば炭水化物（例えばレクチンが分析物である
場合のこのレクチンに結合するもの）及び核酸（例えば
ハイブリダイゼーションアッセイにおけるように、標的
核酸と結合するもの）を包含する。ほとんどアッセイに
おいてタンパク質が一般に分析物−結合性分子として利
用されるため、本明細書の以降に語句「分析物結合性タ
ンパク質」を利用するが、非タンパク質性結合性分子も
適当な場合に利用できることが理解されるであろう。

【００２９】本発明の酵素アッセイ法は競合結合性メカ
ニズムに基づく。本発明に従い、対象の結合又は融合し
ている分析物（もしくは類似の分析物誘導体）を含んで
成る既知量のβ−ガラクトシダーゼシステムのオメガー
−酵素ドナー（即ち、オメガー−ドナーコンジュゲー
ト）を、既知量の特異的な分析物−結合性タンパク質又
はその他の結合性分子及び該オメガー−酵素ドナーと相
補できる既知量のオメガー−アセプターと混合せしめ
る。該オメガー−ドナーコンジュゲートの分析物ドメイ
ンとサンプル中の未知の遊離分析物との、既知量の特異
的分析物−結合性タンパク質に対する競合は、該オメガ
ー−ドナーコンジュゲートが遊離したままとなることを
可能とし、従ってこれはオメガーアセプターと結合しう
る。オメガー−ドナーコンジュゲートとオメガーアセプ
ターの会合は触媒的に活性な酵素複合体の形成をもたら
し、これによって該サンプル中の検出可能なβ−ガラク
トシダーゼ酵素活性の値は変化する。この結果、このサ
ンプル中の遊離分析物の量は測定可能な酵素活性の一次
関数として測定される。酵素活性は分光光度測定法及び
蛍光光度測定法を含むがそれらに限定されないあらゆる
種々の技術による、該酵素の触媒反応による基質変換の
レートもモニターすることによって測定される。

【００３０】本アッセイの競合反応は、分析物、オメガ
ー−ドナーコンジュゲート、オメガーアセプター、分析
物−結合性タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼ酵素を
それぞれＡ，ＯＤ−Ａ，ＯＡ，Ａｂｐ及びＥとして示す
以下の式で表わされる。結合複合体はＸ−Ｙで示す（結
合をＸ−Ｙで示している）。

【００３１】

【数１】

【００３２】式中：Ｋ_2a及びＫ_2bは、オメガー−ドナー
コンジュゲートと分析物−結合性タンパク質の会合及び
解離の定数を示す。

【００３３】

【数２】

【００３４】式中：Ｋ_3a及びＫ_3bは、オメガー−ドナー
コンジュゲートと酵素−アセプターポリペプチドの会合
及び解離の定数を示す。

【００３５】オメガー−ドナーコンジュゲート（ＯＤ−
Ａ）上の接近可能な決定基への該分析物−結合性タンパ
ク質（Ａｂｐ）の結合は相補反応を阻害し、従ってオメ
ガーアセプターは不活性な二量体であり続ける。

【００３６】従って、反応（２） ＯＤ−Ａ＋Ａｂｐ→ＯＤ−Ａ−Ａｂｐ は、 ＯＤ−Ａ＋ＯＡ→Ｅ と競合する。

【００３７】既知濃度のＡｂｐ，ＯＤ−Ａ及びＯＡを用
いることにより、複合β−ガラクトシダーゼ〔Ｅ〕の活
性は、サンプル中の対象の遊離分析物の未知の濃度と正
比例するであろう。

【００３８】常用の酵素アッセイと同様に、十分な感度
のため、オメガーアセプターを伴って分析物−結合性タ
ンパク質と結合するオメガー−ドナーコンジュゲートの
相補による活性酵素の形成は最小でなくてはならない。
言い換えるなら、以下の反応（４）及び（５）の両方は
最小又は全く進行しない必要がある。 （４）ＯＤ−Ａ−Ａｂｐ＋ＯＡ→ＯＤ−Ａ−Ａｂｐ−ＯＡ

【００３９】

【数３】

【００４０】式中：ＯＤ−Ａ，Ａｂｐ及びＯＡは前記の
通り、そして基質及び活性酵素（Ｅ）により触媒される
反応の生成物はそれぞれＳ及びＰである。

【００４１】十分な感度を有する特定のアッセイをデザ
インするための有用な因子は、（１）オメガー−ドナー
コンジュゲートとオメガーアセプターの会合定数
（Ｋ_3a）；（２）特異的な分析物−結合性タンパク質の
濃度（〔Ａｂｐ〕）；（３）特異的な分析物−結合物タ
ンパク質とオメガー−ドナーコンジュゲートの会合定数
（Ｋ _2a）；及びオメガーアセプターの濃度（〔ＥＡ〕）
の間の関係である。

【００４２】本発明の酵素相補アッセイの成分は水性媒
体又は凍結乾燥形態のいづれかにおけるキットにおいて
パッケージ化されうる。各成分又は試薬は別々に、又は
アッセイの感度が変化せず且つ該成分が劣化しない限り
他の成分と一緒のいづれかにてパッケージ化されうる。

【００４３】本発明の好ましい態様に従い、改良された
相補アッセイは組換ＤＮＡ技術及び／又は化学ポリペプ
チド合成技術を利用することにより製造されるオメガー
ドナー及びオメガーリセプターの利用により成し遂げら
れ、ここでβ−ガラクトシダーゼの初期構造における分
断は従来利用しているα−ドメインの代りにオメガー−
ドメインにおいて行い、そしてβ−ガラクトシダーゼの
アミノ酸配列におけるその他の改質も行っている。この
ような技術は、適当な反応基、例えばアミノ、スルフヒ
ドリル、カルボキシル等を有すアミノ酸の挿入又は置換
を介してオメガードナーと分析物の共有結合のための改
善された化学手段を可能にする。このような技術は相補
性ポリペプチドのアミノ酸配列を系統的に決定すること
により、オメガーアセプターとオメガードナー間の会合
定数のより正確なコントロールを可能にする。更に、こ
のような技術は安価で信頼性のあるこのようなポリペプ
チドの起源をもたらす。

【００４４】本発明の一つの態様に従い、オメガー−ド
ナードメイン及び分析物ドメインを有す酵素ドナーは、
分析物を分析物ドメインに結合させるための化学性を改
善せしめる組換ＤＮＡ技術の利用により製造される。こ
れらのオメガードナーポリペプチドは、相補のために必
要なオメガー−ドナードメイン配列から種々の距離にて
分析物の共有結合のための常用の結合部位を提供する。

【００４５】分析物−カップリングドメインを含む型の
オメガー−ドナーポリペプチドを得るため、β−ガラク
トシダーゼをコードする遺伝情報を含むプラスミドを、
種々の制限酵素を用いてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
オメガー領域における異なる部位にて切断せしめること
ができる。このような遺伝子材料の多数の公共的に入手
できる起源は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレ
クション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ，ＵＳＡの寄託機
関を介して入手できる。例えばＡＴＣＣ寄託番号９６３
７号、１５２２３号、１５２２４号、２１６６６号、２
７７３７号及び３１３８２号が含まれる。β−ガラクト
シダーゼをコードするプラスミド、プラスミド２３０の
詳細について図２を参照のこと。例えばｐ２３０（及び
その他の類似のβ−ガラクトシダーゼをコードするプラ
スミド）のＢａｍ及びＳａｃ部位での切断はβ−ガラク
トシダーゼのＮ−末端アミノ酸をコードするプラスミド
の部分を切り出す。次にこのＢａｍ及びＳａｃ切断部位
を、Ｂａｍ及びＳａｃ末端を含む合成ＤＮＡリンカーを
用いて結合せしめることができる。得られる再リゲート
化プラスミドはβ−ガラクトシダーゼの１／３のカルボ
キシル末端側を含む。

【００４６】更にプラスミドは、温度誘発性プロモータ
ー又はその他のタイプの誘発性プロモーターの制御コン
トロール下にあるオメガー−ドナー配列を位置せしめる
ために遺伝子操作されうる。このことは例えばλリプレ
ッサータンパク質（λＣＩ遺伝子によりコードされる）
との組合せにおけるλＰＲプロモーターを用いることに
より成し遂げられうる。これは温度感受性であり、そし
てタンパク質発現の温度誘発を可能とする。このλ突然
変異遺伝子は温度感受性リプレッサータンパク質をコー
ドし、これは４０℃以上の温度で不活性である。

【００４７】本発明の他の態様に従い、オメガー−ドナ
ードメイン及び分析物−カップリングドメインを有する
酵素ドナーを、分析物の分析物ドメインへの結合のため
の化学性を高めるための化学的ポリペプチド合成技術の
利用により製造する。これらのオメガー−ドナーポリペ
プチドは、相補のために必要とされるオメガー−ドナー
ドメイン配列から種々の距離にて分析物の共有結合のた
めの常用の結合部位を提供する。化学ペプチド合成技術
は、オメガー−ドメイン及びタンパク質ドメインを含ん
で成る酵素ドナーを製造するためにも利用されうる。オ
メガー−ドナーペプチドは標準的な合成技術による自動
ペプチド合成装置において合成される。簡潔に述べる
と、所望するペプチドのカルボキシル化末端アミノ酸を
代表する保護アミノ酸を架橋化ポリスチレンビーズに結
合せしめる。この樹脂ビーズは固相として働き、これに
更なるアミノ酸が逐次的手段において結合しうる。この
ペプチドはカルボキシル末端からＮ−末端へと連続的に
鎖を成長せしめることによって作られる。この固相は過
剰の試薬の利用により１００％の完了迄迅速に反応を促
進せしめる。この過剰量の試薬を次に容易に洗い流すこ
とができる。この合成段階が終了したら、このペプチド
を樹脂から取り出し、そして精製する。

【００４８】本発明に従って製造されるオメガー−酵素
−ドナーポリペプチドは、Ｎ−末端から十分に離れてス
ルフヒドリル、アミノ又はカルボキシル基を提供するよ
うに遺伝子操作又は化学合成され、従ってこの分析物は
これらの基に、オメガー酵素ドナーがオメガー酵素アセ
プターと触媒的に活性な酵素複合体を形成せしめるよう
に複合する能力を妨害することなく、共有結合する。ス
ルフヒドリル及びアミノ基が好ましい。

【００４９】遊離なスルフヒドリルが存在している場
合、これは該分析物上に存在している反応基と反応しう
る。このような反応基には、反応性ハロアルキル基及び
酸／ハロ基、ｐ−マーキュリベンゾエート基並びにミハ
エル（Ｍｉｃｈａｅｌ）型付加反応（例えばマレイミド
及び、ＭｉｔｒａｌとＬａｗｔｏｎ，１９７９，Ｊ．Ａ
ｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０１：３０９７−３１
１０に詳細の型の基を含む）ができる基が含まれるが、
それらに限定はされない。本明細書で定義するハロアル
キルは、臭素、ヨウ素又は塩素により置換されている１
〜３個の炭素原子の任意のアルキル基を含んで成る。も
し該分析物が該オメガードナーの遊離スルフヒドリルと
結合するためのこのような反応基を保有しない場合、こ
のような反応基を含むように該分析物の誘導体を作るこ
とができる。

【００５０】本発明の他の態様に従い、オメガー−酵素
ドナーポリペプチドを、このオメガー−ドナードメイン
をコードする遺伝子をアッセイすべきタンパク質分析物
（又はそのタンパク質）をコードする他の遺伝子とリゲ
ート又は融合することにより調製することができる。適
切な宿主細胞におけるリゲート化遺伝子の発現はオメガ
ーアセプターと相補でき且つ該分析物−結合性タンパク
質と特異的に結合することができる融合タンパク質生成
物をもたらす。従って、本発明の本態様に従って製造さ
れる融合タンパク質は２種のドメインを含んで成る：即
ち、（１）オメガー−ドメイン及び（２）タンパク質ド
メインであり、両方とも融合遺伝子によりコードされ
る。前記した通り、本発明に有用なタンパク質ドメイン
はタンパク質抗原の免疫反応性エピトープを含んで成
る。

【００５１】融合タンパク質をコードする遺伝子を作製
するため、注目の該２種の遺伝子は、翻訳解読フレーム
が保持され且つターミネーションシグナルにより干渉さ
れないようにそれらのコード化配列は連結されねばなら
ない。更に、もしこの宿主細胞がリプレッサーを含む種
の場合、この融合タンパク質は誘発の抑制の不活性化に
対する応答においてのみ生産される。この融合タンパク
質はオメガーアセプターのインビボ（生体内）相補によ
り、相補活性について同定される。抗体とタンパク質ド
メインとの相互作用による免疫反応及び相補の免疫特異
的阻害に関する遺伝子作製体のスクリーニングはインビ
トロ（生体外）で成し遂げられる。

【００５２】融合タンパク質は、免疫反応性ポリペプチ
ドがオメガー−ドナードメインのＣ末端に結合するよう
に通常作製する。該オメガー−ドメインと融合タンパク
質との間のスペーサー配列は、相補性を高めるため、又
は相補に基づく特異的結合性タンパク質による相互作用
の阻害効果を高めるために用いられうる。

【００５３】更に、特定のタンパク質分析物全体をコー
ドする遺伝子の融合は必ずしも必要ではない。例えば、
近親しているヒト糖タンパク質ロイトロピン（黄体形成
ホルモン：ＬＨ）、フォリトロピン（卵胞刺激ホルモ
ン：ＦＳＨ）、チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン：Ｔ
ＳＨ）及びヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）はα及
びβ−サブユニットを含んで成る。これらのホルモン全
てのα−サブユニットは同一のものである。しかし各ケ
ースにおいてβ−サブユニットは相違し、そして各ホル
モンの固有な特異性及び生物活性を授ける。従って、こ
の類の特定のホルモンに特異的なイムノアッセイを作製
するためには、このβ−サブユニットのみをこのオメガ
ー−ドナードメイン配列に融合すればよい。

【００５４】他方、該オメガー−ドナーコード化遺伝子
配列に融合しているタンパク質ドメインをコードする免
疫反応性配列は、固有の免疫反応性エピトープを示すこ
とができる。例えば、ｈＣＧのβ−サブユニットの固有
のカルボキシル末端側の３０個のアミノ酸伸長（Ｂｉｒ
ｋｅｎら、１９８２，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１
０：１５５５）は、ｈＣＧのアッセイにおけるタンパク
質ドメインとして利用できる。

【００５５】他の例として、Ｂ型肝炎ウィルス表層抗原
全体の配列又はこの配列の小さな領域のみの配列を、Ｂ
型肝炎ウィルスに対する免疫反応性エピトープとして利
用できる（Ｌｅｒｎｅｒｅら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３４０
３）。

【００５６】前記した通り、オメガードナーとオメガー
アセプターポリペプチドとの間の会合定数は、任意の酵
素相補性アッセイシステムによる十分な感度を得るため
の重要な因子である。本発明の態様に従い、オメガード
ナーとオメガーアセプター間の会合定数を調整するため
に、酵素−ドナーオメガー−ドメイン（前記を参照）又
はオメガーアセプターのいづれかのアミノ酸配列を系統
的に変えることができる。

【００５７】オメガードナーに対する変えられた親和性
を有するオメガーアセプターは、所望のアミノ酸配列を
保有するＤＮＡを欠失作製及び直接合成し、その後天然
β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子のオ
メガー領域のＤＮＡ配列にフレーム内リゲートせしめる
ことを含むがそれに限定されない種々の組換ＤＮＡ技術
を用いて作製されうる。

【００５８】欠失作製によるオメガーアセプターの製造
に関する例示的な技術を以下に示す。非常に簡潔に述べ
ると、欠失作製技術全体は、特定の制限酵素に対する特
異的な部位をβ−ガラクトシダーゼＺ遺伝子のオメガー
領域の中に導入し、その後部位特異的消化（例えばＢａ
ｌ３１消化）によって所望のアミノ酸配列をコードする
遺伝子を提供せしめる。適切な制限酵素による消化の
後、有用なオメガーリセプターをインビトロでの相補能
力を利用して単離する。例えば相補性は、対象のオメガ
ードナー及びオメガーリセプターをコードする熱誘発性
遺伝子を保有するプラスミドの、株例えばＡＭＡ１００
４（ＡＭＡ１００４はｇａｌＵ，ｇａｌＫ，Ｓｔｒ
Ａ^r ，ｈｓｄＲ^- ，ｌｅｕＢ６，ｔｒｐＣ，Ａ（ｌａｃ
ＩＰＯＺ）Ｃ２９（Ｃａｓａｄａｂａｎら、１９８
３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
００：２９３）への形質転換、そしてインデューサーイ
ソプロピルチオガラクトシド及び発色性基質５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−８−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを含むプレート上での選別によりスクリーンされ
うる。３０℃にて白色であるが４２℃にて青色を示すコ
ロニーは、有用なオメガーアセプターの作製を示唆す
る。次にこのオメガードナーＤＮＡ配列を制限酵素消化
によりこのプラスミドから取り出し、次いでこのプラス
ミドをリゲートせしめ、そしてＡＭＡ１００４の中に形
質転換せしめる。次にオメガーアセプターポリペプチド
を精製する。

【００５９】他方、該オメガーアセプターは任意の市販
されているＤＮＡ合成装置を用いるＤＮＡの直接的な合
成により作られうる。所望する合成ＤＮＡ配列を次にア
ニール化し、そして適切なプラスミドベクターの中にリ
ゲートせしめる。例えばプラスミドｐ１５１をＳａｃＩ
及びＳａｌＩ制限酵素により消化する。

【００６０】本発明の改良方法及び新規組成物は種々の
分析物、例えば薬剤及び薬剤代謝物、生物学的活性な分
子、ステロイド、ビタミン、工業汚染物、殺虫剤及びそ
の代謝物、食品添加物、除草剤及びその代謝物、風味剤
及び食品毒素、病原体及びそれらの生産する毒素、並び
にその他の対象の物質を含む種々の分析物の存在の検出
及び／又は定量に利用できる。比較的高分子量の分析
物、例えば約２，０００ダルトンより大きい分子量を有
するタンパク質、同様に小さい分析物は、本発明の改良
アッセイ並びに組成物により検出及び／又は測定されう
る。以下に例示的であるが、それらに限定されることの
ない例を挙げる。

【００６１】高分子量 癌胎児性抗原、フェリチン、ヒトＴ細胞白血病ウィル
ス、インスリン、α−フェトプロテイン、風疹ウィル
ス、ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、卵胞刺
激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、肝炎ウィルス、絨毛
膜ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、エストロゲンリ
セプター、甲状腺刺激ホルモンリセプター、ポリオウィ
ルスリセプター、インスリン輸送タンパク質、プロテイ
ンＡ、Ｃｏｎ Ａ レクチン、小麦胚芽凝集素レクチ
ン、分泌タンパク質、コレラ毒素、アビジン

【００６２】低分子量 エストリオール、ジゴキシン、チロキシン、プロプラノ
ロール、メトトレキシエート、フェンシクリジン、メタ
ドン、モルフィン、ジアゼパム、オキサゼパム、キニジ
ン、プロポキシフェン、Ｎ−アセチルプロカインアミ
ド、セコバルビタール、トブラマイシン、ゲンタマイシ
ン、テオフィリン、アンフェタミン、ベンゾイルエクゴ
ニン、フェニトイン、プロカインアミド、リドカイン、
カルバマゼピン、ピリミデン、バルプロイン酸、フェノ
バルビタール、エトスクシニミド、ビオチン

【００６３】本発明の酵素アッセイにおいて、サンプル
混合物中の未知量の分析物をβ−ガラクトシダーゼ酵素
の活性の一次関数として測定する。酵素活性は酵素触媒
反応の生成物の出現又は酵素基質の消失によりモニター
される。これは基質の変換のレートである。分光光度分
析又は蛍光光度分析に適切なβ−ガラクトシダーゼのた
めの基質にはｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド；２′−Ｎ−（ヘキサデカノール）−Ｎ−（ア
ミノ−４′−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド；４−メチルワンベリフェリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド；ナフチル−ＡＳＯＢ１−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド；１−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド；２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド一水
和物；０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド；ｍ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド；ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド；並びにフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマ
リン及びフルオレセイン−β−ガラクトピラノシドが挙
げられるが、それらに限定されない。

【００６４】本発明の酵素アッセイは遊離分析物とオメ
ガー−ドナーコンジュゲートとの間の、分析物−結合性
タンパク質に対する競合的相互作用を利用する。オメガ
ー−ドナーコンジュゲートと該分析物−結合性タンパク
質との相互作用は相補反応を阻害する。実施例において
詳細する通り、該分析物−結合性タンパク質に特異的な
抗体又は抗体フラグメントの結合は立体障害効果を高
め、そしてこのことは該分析物−結合性タンパク質に結
合しているオメガー−ドナーコンジュゲートによる相補
の阻害をもたらす。

【００６５】本発明の一態様に従い、該分析物−結合性
タンパク質は抗体分子である。このようなケースにおい
て、このアッセイは酵素イムノアッセイである。このよ
うなアッセイに有用な抗体分子は測定すべき分析物に特
異的な常用のポリクローナル及びモノクローナル抗体
（並びにこのポリクローナル又はモノクローナル抗体の
フラグメント）、又は該分析物に特異的に結合すること
ができる組換ポリペプチドフラグメントを含む。

【００６６】本発明の他の態様に従い、該分析物−結合
性タンパク質はビオチンに特異的な親和性を有するアビ
ジンである。このようなケースにおいて、この酵素アッ
セイはビオチンを測定するためにのみでなく、ビオチン
の誘導体であってアビジンに対する親和性を保持してい
るものにも有用である。

【００６７】本発明の他の態様に従い、該分析物−結合
性タンパク質は結合性タンパク質、例えばリセプター、
レクチン及び輸送タンパク質を含むがそれらに限定され
ないものである。

【００６８】

【実施例】例１ ：オメガータンパク質の作製 １．オメガー−ドナー分子；ＯＤ６ 典型的なオメガー−ドナーを、図２に図解する通り、遺
伝子操作の標準的な技術を利用して作製した。β−ガラ
クトシダーゼの１／３のカルボルキシル−末端側は、Ｄ
ＮＡ制限酵素を用い、インタクトβ−ガラクトシダーゼ
分子の配列を含むＤＮＡプラスミドから、最初の２／３
のβ−ｇａｌ ＤＮＡ配列を取り除くことにより作製し
た。その他のオメガー−ドナーは表示する制限部位にて
又はその近くにて切断する制限酵素を用いることにより
作製した。本例において、プラスミドｐ２３０を用い
た。しかしながらこのプラスミドは単に便宜上用いたに
すぎず、β−ガラクトシダーゼを含む既知配列のその他
のプラスミドも同じケートにおいて利用できうる。β−
ガラクトシダーゼ遺伝子材料の起源は本明細書に記載し
た。

【００６９】プラスミドｐ２３０をＢａｍ及びＳａｃ部
位にて制限酵素により切断せしめて２つの断片のＤＮＡ
を作製した。大きい断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。Ｂａｍ及びＳａｃ端を含む合成ＤＮＡリン
カーをこの単離せしめた大きい断片の中にリゲートせし
め、プラスミドを環状とした。この最終生成物はβ−ガ
ラクトシダーゼの１／３のカルボキシル末端側を含む。
得られたプラスミドを本明細書ではＰ７２０と称する。
宿主細菌細胞中の本プラスミドの発現はＯＤ６分子を生
産せしめ、これは３７８個アミノ酸より成り、４３，０
００ダルトンの分子量を有する。

【００７０】２．オメガー−アセプター分子；ＯＡ７２
１ 典型的なオメガーアセプターを、インタクトのβ−ガラ
クトシダーゼ分子の配列を含むプラスミドからカルボキ
シル末端側ＤＮＡ配列を除去し、７８７個のアミノ酸且
つ９４，０００ダルトンの分子量を有す短くせしめたβ
−ガラクトシダーゼを残することによって作製した。プ
ラスミドの作製は図３において図解する。起源プラスミ
ドはｐ１５１であり、これもβ−ガラクトシダーゼをコ
ードする異なるプラスミドである。このプラスミドｐ１
５１をＡｐａｌＩ及びＳａｌ部位して酵素により消化せ
しめ、２つの断片のＤＮＡを作製した。大きい断片をア
ガロースゲル電気泳動により単離せしめた。Ａｐａｌ１
及びＳａｌ端を含む合成ＤＮＡリンカーをこの単離せし
めた大きい断片の中にリゲートせしめ、このプラスミド
を環状とした。この最終生成物はβ−ガラクトシダーゼ
の２／３のアミノ末端側を含む。このオメガー−アセプ
ター分子ＯＡ７２１はβ−ガラクトシダーゼの最後の２
３６個のアミノ酸が欠失している（この部分は相補的な
３７８個のアミノ酸のオメガー−ドナー分子内に見い出
せる）。

【００７１】例２：オメガータンパク質の精製 １．オメガードナー；ＯＤ６ ＯＤ６遺伝子をコードするプラスミドを保有するＥ．コ
リ株ＭＧ７２０を、対数増殖となる迄３０℃にて増殖せ
しめた。この細胞密度がＯＤ₆₀₀ ＝１．０に到達したら
温度を４２℃に迄上げた。これは高温誘発性プロモータ
ーに由来してＯＤ６の合成を誘発せしめる。４２℃にて
４時間後、この細胞を集め、そして凍結した。この凍結
細胞を融解せしめ、そして水性緩衝液及びリゾチームの
存在下において溶解せしめた。この溶解物を遠心により
清浄化せしめ、そしてペレット化した材料を上昇する尿
素濃度中における一連の再懸濁によってＯＤ６タンパク
質について抽出せしめた。ＯＤ６タンパク質は８Ｍの尿
素抽出物中に見い出せた。この８Ｍの尿素抽出物を硫酸
アンモニウムにより１５％飽和にし、そしてこの沈殿物
を遠心により集めた。この沈殿物を６Ｍの塩酸グアニジ
ンに再懸濁し、そして８Ｍの尿素／トリス−ＨＣｌpH
７．５の緩衝液において数回交換しながら透析した。次
にこの透析材料を更に水性トリス−ＨＣｌpH７．５の緩
衝液において数回交換しながら透析した。この透析ＯＤ
６タンパク質抽出物を遠心による沈殿物を清浄せしめ、
そしてこの清浄抽出物を硫酸アンモニウムにより５０％
飽和にした。この沈殿物を遠心により集め、そして０．
５ＭのＮａＣｌ／トリス−ＨＣｌpH７．５の緩衝液に再
懸濁せしめ、そしてサイズ選別ゲルクロマトグラフィー
により精製した。活性ピークを濃縮し、そして４℃で保
存した。

【００７２】２．オメガーアセプター；ＯＡ７２１ ＯＡ７２１タンパク質（株ＭＧ７２１）をＯＤ６に説明
したのと同様の方法により発現させた。細胞溶解の後、
この細胞材料を遠心により浄清化せしめた。この清浄化
溶解物を硫酸アンモニウムにおいて２５％不飽和にし、
そしてこの沈殿物をペレットとして４℃で保存した。こ
のペレット材料を２Ｍの尿素緩衝液により２回抽出し、
そして清浄化した溶解物をプールし、そして硫酸アンモ
ニウムにおいて２５％不飽和にした。この沈殿物を再び
ペレットとして４℃で保存した。この２５％不飽和硫酸
アンモニウムペレットをトリス緩衝液に再懸濁せしめ、
そしてイオン交換クロマトグラフィーにより精製せしめ
た。ＯＤ６タンパク質を用いる相補アッセイにより検出
された活性ピークを濃縮せしめ、バッチに依存して４℃
又は−２０℃で保存した。

【００７３】例３：オメガー相補免疫診断試験 患者血清中の低濃度の分析物を検査するためのイムノア
ッセイを実施した。検査のために選んだ分析物はテオフ
ィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）であり、これは０
−４０μｇ／mlの治療的範囲を有す。精製せしめたＯＤ
６分子を、相補性を妨害せしめない状態においてテオフ
ィリンに共有結合せしめた。

【００７４】この目的のため、精製ＯＤ６タンパク質を
セファデックスＧ−２５カラムを用いて緩衝液交換する
ことで全てのβ−メルカプトエタノールを除去した。Ｏ
Ｄ６画分の活性をＯＡ７２１によるアッセイによりモニ
ターした。プールしたＯＤ６画分に、ＤＭＦ中のテオフ
ィリン−マレイミド誘導体の溶液を加え、そしてこの反
応混合物を室温で２０分間インキュベートした。この反
応混合物を再度セファデックスＧ−２５カラムに通し、
過剰のテオフィリン−マレイミド誘導体を除去した。こ
のＯＤ６−テオフィリンコンジュゲートをプールし、そ
してＯＡ７２１により相補活性について、そして抗−テ
オフィリン抗体により免疫化学結合性についてアッセイ
した。アッセイを室温にてマイクロタイタープレートに
おいて行った。ＯＡ，ＯＤ及び基質をｔ＝０分にて混合
した。レートは１分の間融において測定される基質変換
のｍＡＵより得られる。アッセイウェル中に抗体又は薬
品は存在していなかった。

【００７５】図４は、ＯＤ６／テオフィリンコンジュゲ
ートとインキュベートせしめた基質についての時間に対
する基質変換の直線的増大を示す。しかしながら抗テオ
フィリン抗体の存在下においては、ＯＤ６／テオフィリ
ンコンジュゲートとＯＡ７２１との相補は、共有結合し
ているテオフィリンへの該抗体の結合により立体的に阻
止される（図５）。抗体結合部位の濃度（ｎＭ系）を各
データー値の横に示す。

【００７６】このアッセイの有用さを更に実証するた
め、遊離テオフィリンに応答する投与量を調べた。この
遊離テオフィリンは抗体部位に対して競合し、従ってＯ
Ａ７２１との相補に対するＯＤ６／テオフィリンコンジ
ュゲートを遊離化せしめる。従って、基質加水分解のレ
ートは存在している遊離なテオフィリンの量に直接的に
対応する。図６は０〜４μｇ／mlの範囲におけるオメガ
ーアッセイにおけるテオフィリンの直線投与量応答を示
し、吸光度は室温にて基質を添加した６〜８分後の「測
定枠」において測定した。ＯＤ濃度は４ｎＭ系であり、
抗体結合性部位濃度は８ｎＭ系であった。抗体をまず投
与物と予備インキュベートした。次にＯＤをこの混合物
に加え、更に予備インキュベーションした。次いでＯＡ
及び基質をｔ＝０分にて加えた。

【図面の簡単な説明】

【図１】特定の欠損突然変異体と一緒の、β−ガラクト
シダーゼポリペプチドの図示。

【図２】オメガードナードメインを含む組換プラスミド
の作製の図解。

【図３】オメガーアセプタードメインを含む組換プラス
ミドの作製の図解。

【図４】オメガー相補反応速度を示す図。

【図５】テオフィリンについての均一系アッセイに関す
る競合結合カーブを示す（分析物−結合性タンパク質は
抗体である）。

【図６】テオフィリンについてのアッセイに関する競合
結合性カーブ（投与量応答カーブ）を示す（分析物−結
合性タンパク質は抗−テオフィリン抗体である）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デビッド ケイツ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94520，コンコード，マウント ビュー ドライブ 2474 (56)参考文献 特表 昭62−500633（ＪＰ，Ａ) Ｐｅｒｉｏｄ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 81（1979）ｐ．625−627 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．93 （1980）ｐ．223−227 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 9/38 C12Q 1/34 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素−ドナー（供与体）ポリペプチド及
   び酵素−アクセプター（受容体）ポリペプチドを用いる
   分析物の存在又は濃度を調べるための酵素相補アッセイ
   の改良された方法であって、ここでこの両方は分離して
   いる場合は酵素的に不活性であるが、互いを有する溶液
   中に存在している場合は活性なβ−ガラクトシダーゼ酵
   素を形成せしめ、 ここで該ドナーポリペプチドとしてβ−ガラクトシダー
   ゼのカルボキシル末端側の１０〜５００個のアミノ酸と
   同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド又はドナーと
   して同一の機能を発揮する１もしくは数個のアミノ酸が
   欠失、挿入もしくは置換されたその変異体を用い、そし
   て該酵素アクセプターとしてβ−ガラクトシダーゼのア
   ミノ末端側の６００〜１０１２個のアミノ酸と同一なア
   ミノ酸配列を有するポリペプチド又はアクセプターとし
   て同一の機能を発揮する１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、挿入もしくは置換されたその変異体を用い、ここで
   該ドナーポリペプチドとしてのＸ９０と該アクセプター
   ポリペプチドとしてのＣＮＢｒ２４との組合せは除くこ
   とを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 前記の酵素−ドナーポリペプチドが３７
   ８個のアミノ酸を含んで成る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記の酵素−ドナーポリペプチドが３０
   ０〜４５０個のアミノ酸を含んで成る、請求項１に記載
   の方法。
4. 【請求項４】 前記の酵素−アクセプターポリペプチド
   が７８７個のアミノ酸を含んで成る、請求項１に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記の酵素−アクセプター受容体が７０
   ０〜８５０個のアミノ酸を含んで成る、請求項１記載の
   方法。
6. 【請求項６】 オメガー−酵素−ドナー分子であって、
   β−ガラクトシダーゼのカルボキシル末端側の１２〜５
   ００個のアミノ酸と同一なアミノ酸配列又はドナーとし
   て同一の機能を発揮する１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、挿入もしくは置換されたその変異体を有するオメガ
   ー−酵素−ドナーポリペプチドと、分析物結合性タンパ
   ク質と相互作用することのできる分析物ドメインとを含
   んで成る、オメガー−酵素−ドナー分子。
7. 【請求項７】 前記アミノ酸配列がβ−ガラクトシダー
   ゼ配列のカルボキシル末端側の６４５〜１０２３番目の
   アミノ酸と同一である又はドナーとして同一の機能を発
   揮する１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは
   置換されたその変異体である、請求項６記載のオメガー
   −酵素−ドナー分子。
8. 【請求項８】 前記のポリペプチドが、該配列のアミノ
   酸の側鎖官能基と結合している分析物又は分析類似体を
   含んで成る、請求項６に記載の分子。
9. 【請求項９】 β−ガラクトシダーゼ配列のカルボキシ
   ル末端側の６４５〜１０２３番目のアミノ酸と同一なア
   ミノ酸配列を有する、又はドナーとして同一の機能を発
   揮する１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは
   置換されたその変異体である、オメガー−酵素−ドナー
   ペプチド。
10. 【請求項１０】 β−ガラクトシダーゼ配列のアミノ末
    端側の７００〜８５０個のアミノ酸と同一なアミノ酸配
    列を有する、又はアクセプターとして同一の機能を発揮
    する１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置
    換されたその変異体である、オメガー−アクセプターポ
    リペプチド。
11. 【請求項１１】 前記のアミノ酸配列がβ−ガラクトシ
    ダーゼ配列のアミノ末端側の１〜７８７番目のアミノ酸
    と同一である、又はアクセプターとして同一の機能を発
    揮する１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは
    置換されたその変異体である、請求項１０に記載のポリ
    ペプチド。